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WO2012029434A1 - オリゴヌクレオチドおよびその利用 - Google Patents

オリゴヌクレオチドおよびその利用 Download PDF

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WO2012029434A1
WO2012029434A1 PCT/JP2011/066733 JP2011066733W WO2012029434A1 WO 2012029434 A1 WO2012029434 A1 WO 2012029434A1 JP 2011066733 W JP2011066733 W JP 2011066733W WO 2012029434 A1 WO2012029434 A1 WO 2012029434A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
oligonucleotide
carbon atoms
hydroxyl
hydrogen atom
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2011/066733
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
浩之 浅沼
梁　興国
啓 樫田
英則 西岡
大雅 藤井
顕慎 石川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nagoya University NUC
Original Assignee
Nagoya University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nagoya University NUC filed Critical Nagoya University NUC
Priority to JP2012531744A priority Critical patent/JPWO2012029434A1/ja
Priority to US13/819,954 priority patent/US9018362B2/en
Publication of WO2012029434A1 publication Critical patent/WO2012029434A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical

Definitions

  • the present invention relates to an oligonucleotide and an optical switching agent using the oligonucleotide.
  • hybridization can be controlled, for example, it can contribute to the realization of molecular devices and molecular machines using oligonucleotides, and the accuracy of gene detection, identification, and quantification.
  • an external stimulus for controlling hybridization a change in pH, a change in temperature, light irradiation, or the like is used.
  • Patent Documents 1 to 3 describe techniques for reversibly hybridizing oligonucleotides by light irradiation.
  • This oligonucleotide has a residue containing an organic group capable of performing an isomerization reaction between a cis isomer and a trans isomer by irradiation with light such as azobenzene or an azobenzene derivative.
  • the melting temperature difference ⁇ Tm which is the difference between the melting temperatures Tm of structural isomers (the temperature at which the oligonucleotide complex is denatured from a double-stranded structure to a single-stranded state), is sufficiently large.
  • Tm of structural isomers the temperature at which the oligonucleotide complex is denatured from a double-stranded structure to a single-stranded state
  • the inventors of the present invention used an oligonucleotide having an azobenzene derivative containing a sulfur atom (S) bonded to a six-membered ring of azobenzene to irradiate light having a wavelength in the visible light region. It has been found that isomers can be reversibly isomerized and the melting temperature difference ⁇ Tm of structural isomers is increased. Based on this finding, the present invention provides an oligonucleotide capable of optical control of hybridization using visible light.
  • the present invention provides an oligonucleotide containing an azobenzene derivative represented by the following formula (1) or (2).
  • a 1 and A 2 each independently represent a hydrogen atom, a nucleotide or an oligonucleotide
  • B 1 and B 2 each represent a hydroxyl group, a nucleotide or an oligonucleotide
  • R 11 And R 12 each independently represents an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms
  • R 21 and R 22 each independently represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms
  • R 13 to R 18 , R 23 are each ⁇ R 28 independently represent a hydrogen atom; an unsubstituted or a halogen atom; the unsubstituted or halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group, an alkyl group or alkoxy group of carbon atoms of 1 to 20 substituted with a carboxyl group
  • R 13 to R 18 and R 23 to R 28 is preferably a hydrogen atom.
  • R 11 and R 12 are preferably both methyl groups.
  • the present invention also provides an oligonucleotide containing an azobenzene derivative represented by the following formula (3).
  • a 3 represents a hydrogen atom, a nucleotide or an oligonucleotide
  • B 3 represents a hydroxyl group, a nucleotide or an oligonucleotide
  • R 31 and R 32 are each independently an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms.
  • R 31 and R 32 represent a cyclic alkyl group or aryl group having 5 to 40 carbon atoms together with a carbon atom bonded to each other and connected to a sulfur atom, and each of R 33 to R 40 independently represents a hydrogen atom; Or an alkyl or alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms substituted with a halogen atom, hydroxyl group, amino group, nitro group or carboxyl group; unsubstituted or substituted with a halogen atom, hydroxyl group, amino group, nitro group or carboxyl group An alkenyl or alkynyl group having 2 to 20 carbon atoms; a hydroxyl group; a halogen atom; A group; a nitro group; or a carboxyl group.
  • R 31 and R 32 preferably represent a cyclohexyl group or an adamantyl group together with a carbon atom bonded to each other and linked to a sulfur atom.
  • R 31 and R 32 are each independently an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and it is preferable that each of R 33 to R 40 is a hydrogen atom.
  • both R 31 and R 32 are particularly preferably methyl groups.
  • the present invention also provides an optical switching agent comprising the above-described oligonucleotide and capable of controlling double-strand formation and dissociation by visible light irradiation.
  • the present invention also provides a pair of oligonucleotides having a complementary sequence and forming a complex, each of the pair of oligonucleotides being represented by the following formula (2) or (4)
  • a light switching agent comprising the oligonucleotide having at least one azobenzene derivative at a pairing position and capable of controlling formation and dissociation of a double strand by irradiation with visible light.
  • a 2, A 4 each independently represent a hydrogen atom, or oligonucleotide
  • B 2, B 4 each independently represents a hydroxyl group, or oligonucleotide
  • R 21 And R 22 each independently represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms
  • R 23 to R 28 and R 41 to R 48 each independently represents a hydrogen atom; unsubstituted or halogen atom, hydroxyl group, amino
  • R 43 and R 44 are preferably methyl groups or hydrogen atoms, and R 41 , R 42 and R 45 to R 48 are all preferably hydrogen atoms.
  • Each of the pair of oligonucleotides preferably has two or more azobenzene derivatives adjacent to each other via two or more nucleotides.
  • the azobenzene derivative which can be utilized suitably for manufacture of the oligonucleotide which concerns on this invention can also be provided.
  • the present invention provides an azobenzene derivative represented by the following formula (11).
  • X 1 represents either a hydroxyl group or a group represented by the following formula (12), R 11 and R 12 each independently represents an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, 13 to R 18 are each independently a hydrogen atom; an unsubstituted or halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group or a carboxyl group, an alkyl or alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms; an unsubstituted or halogen atom Represents an alkenyl group or alkynyl group having 2 to 20 carbon atoms substituted with a hydroxyl group, an amino group, a nitro group or a carboxyl group; a hydroxyl group; a halogen atom; an amino group; a nitro group; or a carboxyl group.
  • C 1 represents a hydrogen atom or a hydroxyl protecting group
  • D 1 represents a hydrogen atom, a hydroxyl protecting group, a phosphoramidite group, or a linking group bonded to or bonded to a solid phase carrier.
  • the present invention also provides an azobenzene derivative represented by the following formula (13).
  • C 2 represents a hydrogen atom or a hydroxyl protecting group
  • D 2 represents a hydrogen atom, a hydroxyl protecting group, a phosphoramidite group, or a linking group bonded to or bonded to a solid phase carrier.
  • R 21 and R 22 each independently represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms
  • R 23 to R 28 each independently represent a hydrogen atom; unsubstituted or halogen atom, hydroxyl group, amino group, nitro Group, an alkyl or alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms substituted by a carboxyl group; an alkenyl group having 2 to 20 carbon atoms unsubstituted or substituted by a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group or a carboxyl group Or an alkynyl group; a hydroxyl group; a halogen atom; an amino group; a nitro group; or a carboxyl group.
  • the present invention also provides an azobenzene derivative represented by the following formula (14).
  • X 2 represents either a hydroxyl group or a group represented by the following formula (15), and R 31 and R 32 are each independently an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, or R 31 , R 32 represents a cyclic alkyl group or aryl group having 5 to 40 carbon atoms together with a carbon atom bonded to each other and connected to a sulfur atom, and R 33 to R 40 each independently represents a hydrogen atom; an unsubstituted or halogen atom; An alkyl or alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms substituted with a hydroxyl group, amino group, nitro group or carboxyl group; the number of carbon atoms unsubstituted or substituted with a halogen atom, hydroxyl group, amino group, nitro group or carboxyl group 2-20 alkenyl groups or alkynyl groups; hydroxyl groups; halogen atoms; amino groups; nitro groups; or carboxyl groups.
  • C 3 represents a hydrogen atom or a hydroxyl protecting group
  • D 3 represents a hydrogen atom, a hydroxyl protecting group, a phosphoramidite group, or a linking group bonded to or bonded to a solid phase carrier.
  • Example 2 is an absorption spectrum by ultraviolet / visible spectroscopy according to Example 1.
  • 4 is an absorption spectrum by ultraviolet / visible spectroscopy according to Example 2. It is a figure which shows notionally about 1 pair of oligonucleotide which concerns on Example 3, and its composite_body
  • the present invention provides an oligonucleotide and a hybridization photoswitching agent capable of controlling the isomerization reaction of structural isomers by irradiating light having a wavelength in the visible light region. More specifically, an oligonucleotide capable of reversibly isomerizing a structural isomer by irradiation with light having a wavelength in the visible light region and having a large melting temperature difference ⁇ Tm of the structural isomer is provided. To do.
  • the visible light region refers to a region having a wavelength of 400 nm or more.
  • the oligonucleotide may be a nucleotide polymer including a unit having a specific structure disclosed in the present specification, and the number of nucleotide residues is not particularly limited.
  • the nucleotides constituting the oligonucleotide may be ribonucleotides, deoxyribonucleotides, and combinations thereof. Accordingly, the oligonucleotides disclosed herein can include DNA, mRNA, tRNA, and various functional RNAs.
  • the oligonucleotide duplex includes DNA / DNA duplex, DNA / RNA duplex, and RNA / RNA duplex.
  • the oligonucleotide having a specific unit disclosed in the present specification is configured so as to be able to adopt a double-stranded structure based on its complementary base sequence, it is double-stranded at least in a portion containing the specific unit by irradiation with visible light. Formation and dissociation can be controlled.
  • the functions related to various genes such as gene expression, gene replication, and gene repair are greatly related to the formation and dissociation of DNA duplexes. The same applies to a DNA elongation reaction by a polymerase using a DNA polymerase or the like.
  • the oligonucleotide disclosed in this specification is useful as an agent for controlling the formation / dissociation of oligonucleotide duplexes, and can control the formation and dissociation of duplexes by irradiation with visible light. It is useful as a photoswitching agent and a photoswitching agent for DNA extension reaction.
  • the oligonucleotide according to the present invention has an azobenzene derivative bonded to a backbone containing a phosphate ester via a linker. Contained in nucleotides.
  • the azobenzene derivative includes an azobenzene derivative containing a sulfur atom bonded to the six-membered ring of azobenzene. Any number of oligonucleotide azobenzene derivatives may be included as long as one or more molecules are included in the oligonucleotide.
  • the ratio of one molecule per 1 to 5 bases is preferable, and the ratio of 1 molecule to 2 to 4 bases is particularly preferable.
  • the oligonucleotides represented by the above formulas (1) to (3) have a cis isomer and a trans isomer due to the azo bond of the azobenzene derivative, and are irradiated with light in the visible light region, A reversible isomerization reaction with the trans isomer can occur.
  • the oligonucleotides represented by the above formulas (1) to (3) hybridize with an oligonucleotide having a structure complementary thereto (hereinafter referred to as a complementary oligonucleotide in this specification) to form a complex
  • a complementary oligonucleotide in this specification
  • the stability of the complex differs depending on whether the azobenzene derivative possessed by the oligonucleotide according to the present invention is a cis form or a trans form. Therefore, the isomerization reaction can be controlled by irradiating visible light upon hybridization of the oligonucleotides represented by the above formulas (1) to (3) and their complementary oligonucleotides.
  • a pair of oligonucleotides can be hybridized by irradiation with specific visible light, and a complexed pair of oligonucleotides can be dehybridized by irradiation with another specific visible light. Since it is not necessary to use ultraviolet rays and only visible light is used, hybridization of a pair of oligonucleotides can be controlled without damaging cells or enzymes.
  • both of the pair of complementary oligonucleotides may be oligonucleotides represented by the above formulas (1) to (3).
  • the melting temperature of the cis isomer (the temperature at which the oligonucleotide complex denatures from the double-stranded structure to the single-stranded state) and the melting temperature of the trans isomer
  • ⁇ Tm melting temperature
  • the present inventors can realize an isomerization reaction with visible light only when both of a pair of oligonucleotides having complementary sequences have a specific azobenzene derivative. It has been found that there are cases where it can be effectively used as a switching agent. Further, it has been found that similar results can be obtained even when the oligonucleotides represented by the formula (1) or (2) are used in pairs.
  • the azobenzene derivative which can be utilized suitably for manufacture of the oligonucleotide which concerns on this invention can also be provided.
  • the azobenzene derivatives represented by the above formulas (11), (13), and (14) are intermediates of the oligonucleotides represented by the above formulas (1) to (3), respectively, and are represented by the above formulas (1) to (3). It can be suitably used for the production of oligonucleotides.
  • R 11 to R 18 , R 21 to R 28 , R 31 to R 40 etc. as the above formulas (1) to (3) in the above formulas (11), (13) and (14)
  • the configuration is the same as in the above formulas (1) to (3). Therefore, the structures applicable to the present specification in the above formulas (1) to (3) and preferred structures also apply to the above formulas (11), (13), and (14).
  • C 1 to C 3 represent a hydrogen atom or a hydroxyl protecting group.
  • the hydroxyl protecting group is not particularly limited, and a conventionally known hydroxyl protecting group can be used. Examples include fluorenylmethoxycarbonyl group (FMOC group), dimethoxytrityl group (DMT group), quaternary butyldimethylsilyl group (TBDMS group), monomethoxytrityl group, trifluoroacetyl group, levulinyl group, or silyl group. It is done.
  • a preferred protecting group is a trityl group, for example selected from monomethyltrityl (MMT) dimethoxytrityl (DMT) and quaternary butyldimethylsilyl group (TBDMS group).
  • D 1 to D 3 represent a hydrogen atom, a hydroxyl protecting group, a phosphoramidite group, or a linking group bonded to or bonded to a solid phase carrier.
  • a compound (amidite compound) in which D 1 to D 3 are phosphoamidite groups can be used as a phosphoamidite reagent by the phosphoamidite method to synthesize oligonucleotides.
  • the phosphoamidite group includes all those that can be used in the phosphoamidite method as described above, and is not particularly limited.
  • the phosphoamidite group can be represented by the following formula (16).
  • Q 1 and Q 2 each independently represents a branched or straight chain alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, which may be the same or different from each other.
  • Q 1 and Q 2 are not particularly limited, and an isopropyl group is preferable.
  • a compound in which D 1 to D 3 are linking groups bonded to a solid phase carrier is a predetermined group on the solid phase carrier such as the linking group and an amino group. By being bonded to the functional group, it is held on the solid phase carrier.
  • the compound in which D 1 to D 3 are linking groups bonded to the solid phase carrier the oligonucleotide is attached to the solid phase carrier via the linking group. Since it is bound, it can be used as a starting material for various nucleic acid solid-phase synthesis methods.
  • an oligonucleotide containing an azobenzene derivative represented by the formulas (1) to (3) can be produced.
  • a DNA synthesizer by using this starting material and using a DNA synthesizer, an oligonucleotide containing an azobenzene derivative represented by the formulas (1) to (3) can be produced.
  • the oligonucleotide according to the first embodiment includes an azobenzene derivative represented by the above formula (1) or (2).
  • the azobenzene derivative is bonded to the backbone using D-threoninol as a linker.
  • the linker and the methylthio group are bonded at positions that are symmetrical with respect to the azo group that connects the two benzene rings of the azobenzene derivative, and are bonded to the para position with respect to the azo group, respectively.
  • the azobenzene derivative further comprises two alkyl groups (R 11 and R 12 in the above formula (1)) on the benzene ring on the side to which the methylthio group is bonded. Two alkyl groups are bonded to each other.
  • the azobenzene derivative and the linker are bonded via a sulfur atom (S). The sulfur atom is bonded to the para position with respect to the azo group.
  • the azobenzene derivative may further include two alkyl groups on the benzene ring on the side to which the sulfur atom is bonded, and the two alkyl groups are in positions ortho to the azo group (in the above formula (2)).
  • R 21 and R 22 are preferably bonded to each other.
  • a 1 and A 2 each independently represent a hydrogen atom, nucleotide or oligonucleotide
  • B 1 and B 2 each independently represent a hydroxyl group, nucleotide or oligonucleotide.
  • R 13 to R 18 and R 23 to R 28 are each independently a hydrogen atom; an alkyl group or alkoxy having 1 to 20 carbon atoms that is unsubstituted or substituted by a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group, or a carboxyl group Group: unsubstituted or substituted with a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group or a carboxyl group, an alkenyl group or alkynyl group having 2 to 20 carbon atoms; a hydroxyl group; a halogen atom; an amino group; a nitro group; or a carboxyl group To express.
  • R 13 to R 18 and R 23 to R 28 are preferably a hydrogen atom or an alkyl group, and particularly preferably a hydrogen atom.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group is more preferably 1 to 8, still more preferably 1 to 4, still more preferably 1 to 3, and most preferably a methyl group.
  • R 11 and R 12 each independently represents an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms.
  • R 21 and R 22 are preferably a hydrogen atom or a linear alkyl group, and the alkyl group preferably has 1 to 8 carbon atoms, more preferably 1 to 4 carbon atoms, and still more preferably 1 to 3 carbon atoms. And most preferably a methyl group.
  • R 21 and R 22 each independently represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms.
  • R 21 and R 22 are preferably a hydrogen atom or a linear alkyl group, and the alkyl group preferably has 1 to 8 carbon atoms, more preferably 1 to 4 carbon atoms, and still more preferably 1 to 3 carbon atoms. And most preferably a methyl group.
  • the alkyl group introduced here has the effect of suppressing thermal isomerization from the cis isomer to the trans isomer as well as contributing to the stabilization of the double chain in the trans isomer, as in the case of the above formula (1).
  • R 21 and R 22 may be a hydrogen atom.
  • the oligonucleotide according to the first embodiment has a structural isomer of a cis isomer and a trans isomer due to an azo bond of an azobenzene derivative, and reversible between the cis isomer and the trans isomer by irradiation with light in the visible light region. Isomerization reaction can occur.
  • the oligonucleotide according to the first embodiment is more stable when the azobenzene derivative is a planar trans isomer, and more unstable when it is a non-planar cis isomer.
  • a complementary oligonucleotide in the present specification an oligonucleotide having a structure complementary thereto (hereinafter referred to as a complementary oligonucleotide in the present specification) are hybridized, a specific wavelength is set for the pair of oligonucleotides.
  • the azobenzene derivative of the oligonucleotide according to the first embodiment isomerizes into a trans isomer and intercalates between the base pairs of a pair of oligonucleotides.
  • a pair of oligonucleotides are stacked together by a trans azobenzene derivative, and a complex of oligonucleotides having a double-stranded structure is stabilized.
  • the azobenzene derivative of the oligonucleotide according to the first embodiment is isomerized into a cis isomer. Since the cis form has a non-planar structure, it causes steric hindrance with the base pair of a pair of oligonucleotides, and the complex of oligonucleotides having a double-stranded structure is destabilized.
  • the hybridization with the complementary oligonucleotide can be controlled by irradiating visible light to control the isomerization reaction of the azobenzene derivative of the oligonucleotide according to the first embodiment.
  • the melting temperature difference ⁇ Tm which is the difference between the melting temperature of the cis isomer and the melting temperature of the trans isomer, is sufficiently large. For this reason, the certainty of control with visible light is improved.
  • at least one of R 21 and R 22 is preferably an alkyl group from the viewpoint of increasing ⁇ Tm.
  • the melting temperature of the cis isomer is lower than the melting temperature of the trans isomer. That is, the oligonucleotides represented by the above formulas (1) and (2) are forward switches.
  • the azobenzene derivative according to the above formula (11) is an intermediate in the production process of the oligonucleotide according to the above formula (1), and can be suitably used for the production of the above formula (1).
  • X 1 in the above formula (11) is represented by the above formula (12), in which C 1 is a hydroxyl protecting group (eg, dimethoxytrityl group), and D 1 is a phosphoramidite group (eg, Q
  • C 1 is a hydroxyl protecting group
  • D 1 is a phosphoramidite group
  • Nucleotides can be preferably produced.
  • the azobenzene derivative according to the above formula (13) is an intermediate in the production process of the oligonucleotide according to the above formula (2), and can be suitably used for the production of the above formula (2).
  • C 2 is a hydroxyl protecting group (eg, dimethoxytrityl group)
  • D 2 is a phosphoramidite group (eg, Q 1 and Q 2 are isopropyl groups
  • the oligonucleotide according to the above formula (2) can be preferably produced.
  • an oligonucleotide according to the second embodiment As another embodiment of the present invention, an oligonucleotide according to the second embodiment will be described.
  • the second embodiment relates to an oligonucleotide containing an azobenzene derivative represented by the above formula (3).
  • the azobenzene derivative is bonded to the backbone using L-threoninol as a linker, and the linker and the alkylthio group are symmetrical with respect to the azo group that connects the two benzene rings of the azobenzene derivative. And each of them is bonded to the para position with respect to the azo group.
  • the alkylthio group has a CH group bonded to a sulfur atom, and the CH group is bonded to two alkyl groups R 31 and R 32 .
  • a 3 represents a hydrogen atom, nucleotide or oligonucleotide
  • B 2 represents a hydroxyl group, nucleotide or oligonucleotide
  • R 31 and R 32 each independently represents an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms.
  • R 31 and R 32 represent a cyclic alkyl group or aryl group having 5 to 40 carbon atoms together with a carbon atom bonded to each other and connected to a sulfur atom, and each of R 33 to R 40 independently represents a hydrogen atom; Or an alkyl or alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms substituted with a halogen atom, hydroxyl group, amino group, nitro group or carboxyl group; unsubstituted or substituted with a halogen atom, hydroxyl group, amino group, nitro group or carboxyl group An alkenyl or alkynyl group having 2 to 20 carbon atoms; a hydroxyl group; a halogen atom; A group; a nitro group; or a carboxyl group.
  • R 31 and R 32 may be a linear alkyl group such as a methyl group, an ethyl group or a propyl group, a CH group bonded to a sulfur atom, a cyclic alkyl group containing R 31 or R 32 or an aryl group such as a phenyl group. It may be. Since one of the alkyl groups bonded to the sulfur atom is hydrogen (CH group), even if R 31 and R 32 have such a bulky structure, a bond connecting the CH group and the sulfur atom is not present. It becomes easy to be located on the same plane as the benzene ring, and the maximum absorption wavelength of the oligonucleotide according to the above formula (3) becomes longer due to the electron donating effect.
  • the bulky structure composed of a CH group bonded to a sulfur atom, R 31 and R 32 is preferably a cyclic hydrocarbon group, more preferably a cyclic saturated hydrocarbon group.
  • a CH group bonded to a sulfur atom, R 31 and R 32 are a phenyl group, a naphthyl group, an anthryl group, a phenanthryl group, a phenalenyl group, a biphenyl group, a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, and a cyclohexyl group.
  • R 31 and R 32 are preferably more bulky. From the viewpoint of ease of production, R 31 and R 32 are those having 1 carbon number in the above formula (3).
  • the alkyl group preferably has 1 to 8 carbon atoms, more preferably 1 to 4, still more preferably 1 to 4, still more preferably 1 to 3, and most preferably a methyl group. It is.
  • R 33 to R 40 are each independently a hydrogen atom; an unsubstituted or halogenated, hydroxyl, amino, nitro, or carboxyl group-substituted alkyl group or alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms; unsubstituted or halogen An alkenyl group or alkynyl group having 2 to 20 carbon atoms substituted with an atom, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group or a carboxyl group; a hydroxyl group; a halogen atom; an amino group; a nitro group; or a carboxyl group.
  • R 33 to R 40 are preferably a hydrogen atom or an alkyl group, and particularly preferably a hydrogen atom.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group is more preferably 1 to 8, still more preferably 1 to 4, still more preferably 1 to 3, and most preferably a methyl group.
  • the oligonucleotide according to the second embodiment has a structural isomer of a cis isomer and a trans isomer due to an azo bond of an azobenzene derivative, and reversible between the cis isomer and the trans isomer by irradiation with light in the visible light region. Isomerization reaction can occur.
  • the oligonucleotide according to the second embodiment is more stable when the azobenzene derivative is a cis-form having a non-planar structure, and more unstable when the azobenzene derivative is a trans-form having a planar structure.
  • the oligonucleotide according to the second embodiment is hybridized with the complementary oligonucleotide, when the pair of oligonucleotides are irradiated with visible light having a specific wavelength, the azobenzene derivative of the oligonucleotide according to the second embodiment is obtained.
  • the azobenzene derivative of the oligonucleotide according to the second embodiment is isomerized into a trans isomer.
  • the azobenzene complex is isomerized to the trans isomer, thereby destabilizing the oligonucleotide complex.
  • the hybridization with the complementary oligonucleotide can be controlled by controlling the isomerization reaction of the azobenzene derivative of the oligonucleotide according to the second embodiment by irradiating visible light.
  • the melting temperature difference ⁇ Tm which is the difference between the melting temperature of the cis isomer and the melting temperature of the trans isomer, is sufficiently large. For this reason, the certainty of the hybridization control with visible light is improved.
  • the melting temperature of the cis isomer is higher than the melting temperature of the trans isomer. That is, unlike the above formulas (1) and (2), the oligonucleotide shown in the above formula (3) is a reverse switch.
  • the absolute value of ⁇ Tm can be increased and the light control ability is higher than in the case where the oligonucleotide shown in the above formula (2) is used. Oligonucleotides can be provided.
  • the azobenzene derivative according to the above formula (14) is an intermediate in the production process of the oligonucleotide according to the above formula (3), and can be suitably used for the production of the above formula (3).
  • X 2 in the above formula (14) is represented by the above formula (15), in which C 3 is a hydroxyl protecting group (eg, dimethoxytrityl group), and D 3 is a phosphoramidite group (eg, Q
  • C 3 is a hydroxyl protecting group
  • D 3 is a phosphoramidite group
  • Nucleotides can be preferably produced.
  • a third embodiment will be described as another embodiment of the present invention.
  • the third embodiment relates to an optical switching agent comprising a pair of oligonucleotides having a complementary sequence and forming a complex.
  • Each of the pair of oligonucleotides has a position where at least one azobenzene derivative represented by the above formula (2) or (4) is paired.
  • a pair of oligonucleotides are complexed so that their azobenzene derivatives associate.
  • Each of the pair of oligonucleotides preferably has two or more azobenzene derivatives that are adjacent via two or more nucleotides.
  • the oligonucleotide according to the above formula (2) that can be suitably used in the third embodiment is the same as the oligonucleotide that can be suitably used in the first embodiment.
  • FIG. 3 schematically shows an example of a pair of oligonucleotides and a complex thereof according to the third embodiment.
  • oligonucleotides 10 and 11 having a pair of complementary structures are composed of residue 1 of the azobenzene derivative represented by the above formula (2) or (4) and a complementary natural nucleotide 2. , 4 and complementary natural nucleotides 3,5.
  • residue 1 of the azobenzene derivative represented by the above formula (2) or (4) and a complementary natural nucleotide 2.
  • 4 and complementary natural nucleotides 3,5.
  • a 4 represents a hydrogen atom, nucleotide or oligonucleotide
  • B 4 represents a hydroxyl group, nucleotide or oligonucleotide
  • R 41 to R 48 each independently represents a hydrogen atom; an unsubstituted or halogen atom
  • R 41 to R 48 are preferably a hydrogen atom or an alkyl group, and the alkyl group preferably has 1 to 8 carbon atoms, more preferably 1 to 4 carbon atoms, still more preferably 1 to 3 carbon atoms, and still more preferably Is a methyl group.
  • R 43 and R 44 are particularly preferably a methyl group or a hydrogen atom, and all of R 41 , R 42 and R 45 to R 48 are particularly preferably a hydrogen atom.
  • the azobenzene derivative is bonded to the backbone using D-threoninol as a linker.
  • the linker and the methylthio group are bonded at positions that are symmetrical with respect to the azo group that connects the two benzene rings of the azobenzene derivative, and are bonded to the para position with respect to the azo group, respectively.
  • the pair of oligonucleotides according to the third embodiment has a cis isomer and a trans isomer due to an azo bond of the azobenzene derivative, and irradiates light in the visible light region, thereby cis isomer and trans isomer. Reversible isomerization reaction can occur.
  • oligonucleotide which concerns on the said Formula (2) since it is the same as that of 1st Embodiment, description is abbreviate
  • the pair of oligonucleotides according to the third embodiment is more stable when the azobenzene derivative is a planar trans isomer, and more unstable when it is a non-planar cis isomer.
  • the azobenzene derivative of the oligonucleotide according to the above formula (4) is isomerized into a trans isomer. And intercalates between the base pairs of a pair of oligonucleotides.
  • a pair of oligonucleotides are stacked together by a trans azobenzene derivative, and a complex of oligonucleotides having a double-stranded structure is stabilized.
  • the azobenzene derivative of the pair of oligonucleotides according to the third embodiment is isomerized into a cis isomer. Since the cis form has a non-planar structure, it causes steric hindrance with the base pair of a pair of oligonucleotides, and the complex of oligonucleotides having a double-stranded structure is destabilized.
  • the hybridization with a pair of oligonucleotides can be controlled by irradiating visible light and controlling the isomerization reaction of the azobenzene derivative of the oligonucleotide according to the above formula (4).
  • the melting temperature difference ⁇ Tm which is the difference between the melting temperature of the cis isomer and the melting temperature of the trans isomer.
  • the melting temperature of the cis isomer is lower than the melting temperature of the trans isomer. That is, the oligonucleotide shown in the above formula (4) is a forward switch as in the above formulas (1) and (2).
  • the absolute value of ⁇ Tm can be increased and the light control ability is higher than in the case where the oligonucleotide shown in the above formula (2) is used. Oligonucleotides can be provided.
  • Example 1 as an example of the oligonucleotide represented by the above formula (1), an oligonucleotide containing a methylthioazobenzene derivative represented by the following formula (1a) will be described as an example.
  • oligonucleotide according to the above formula (1a) was synthesized according to the scheme of the following formula (5).
  • Compounds 2-1 to 2-6 used for the synthesis are represented by the following formula (5).
  • Compounds 2-2 to 2-6 are examples of azobenzene derivatives according to the above formula (11).
  • FIG. 1 shows absorption spectra of 1a-SDM (solid line: Example 1) and 1a-Z (broken line: Comparative Example 1-2) by ultraviolet / visible spectroscopy (UV-Vis). The measurement was performed under the conditions of 1a-X concentration of 20 ⁇ M, sodium chloride concentration of 100 mM, and pH of 7.0 (10 mM, phosphate buffer). As shown in FIG. 1, in Example 1, the maximum absorption was around 400 nm, while in Comparative Example 1-2, the maximum absorption was less than 350 nm.
  • the oligonucleotide according to Example 1 can be isomerized from the trans isomer to the cis isomer by irradiation with light having a wavelength in the visible light region of 400 nm or more, while Comparative Example 1-2. It was found that in the oligonucleotide according to the above, it is necessary to irradiate light having a wavelength in the ultraviolet region of less than 400 nm for the isomerization reaction from the trans form to the cis form.
  • Example 1 and Comparative Example 1-1 60% or more was isomerized to the cis isomer.
  • Comparative Example 1-2 the isomerization rate to the cis form was 15% or less.
  • the xenon lamp light that passed through the UVD-36C filter was irradiated for 5 minutes, and the isomerization reaction using light in the ultraviolet region was also examined. As a result, it was confirmed from the absorption spectrum that 70% or more was isomerized to the cis form.
  • Example 1 it was also confirmed that reversible photoisomerization from the cis isomer to the trans isomer again by irradiation with light of 450 nm. As described above, the oligonucleotide according to Example 1 is reversibly photoisomerized only by visible light irradiation.
  • the melting temperature Tm of the composite according to Example 1, Comparative Example 1-1, and Comparative Example 1-2 was measured.
  • the duplex melting temperature Tm of each oligonucleotide pair is the temperature of absorbance of light at a wavelength of 260 nm using the method described in Nature Protocols, 2007, Vol. 2, pages 203-212. Obtained from change.
  • the change in melting temperature accompanying the photoisomerization of the double chain of 1a-X / 1b-0 is shown in Table 1 below.
  • the measurement conditions were oligonucleotide concentration: 5 ⁇ M, sodium chloride concentration: 100 mM, pH 7.0 (10 mM phosphate buffer).
  • the melting temperature difference ⁇ Tm (Tm of trans isomer) ⁇ (Tm of cis isomer) was calculated. The results are shown in Table 1.
  • Example 1 As shown in Table 1, in Example 1, even when the wedge-shaped complex was designed, the photoisomerization from the trans isomer to the cis isomer showed a large ⁇ Tm value of 13.4 ° C., and Comparative Example 1-1 and Comparative Example It far exceeded the value of ⁇ Tm of 1-2. Thus, it was revealed that the complex according to Example 1 was isomerized into a cis isomer with visible light of 400 nm and had high light control ability.
  • thermo isomerization rate (Chemical thermal isomerization rate) Next, for Example 1, Comparative Example 1-1, and Comparative Example 1-2, the thermal isomerization rate from the cis form to the trans form was measured.
  • the thermal isomerization rate is determined by periodically irradiating a single-stranded 1a-X buffer solution (sodium chloride 100 mM, pH 7.0 (10 mM phosphate buffer)) to isomerize to the cis isomer, and maintaining at 60 ° C.
  • the absorption spectrum was measured and calculated from the rate of increase in absorbance corresponding to the maximum absorption wavelength of the trans isomer.
  • the light irradiation was performed by irradiating with xenon lamp light passing through an interference filter of 400 nm for Example 1 and Comparative Example 1-1 for 10 minutes, and for Comparative Example 1-2, xenon passing through a UVD-36C filter. It was performed by irradiating lamp light for 5 minutes.
  • Table 2 shows the thermal isomerization rate of the cis form to the trans form.
  • 1a-SDM according to Example 1 has a methylthio group at the para position of the azo group, the thermal stability of the cis isomer is improved and the thermal isomerization rate is unsubstituted azobenzene (1a-Z ) Rather than later.
  • the oligonucleotide having the novel alkylthioazobenzene according to Example 1 it is possible to control the isomerization reaction of the structural isomer by irradiating light having a wavelength in the visible light region. More specifically, it is possible to provide an oligonucleotide capable of isomerizing a structural isomer by irradiation with light having a wavelength in the visible light region and having a large melting temperature difference ⁇ Tm between the structural isomers. it can. Furthermore, the thermoisomerization property of the cis isomer is also good, and hybridization can be well controlled using visible light.
  • Example 2 as an example of the oligonucleotide represented by the above formula (3), an oligonucleotide containing isopropylthioazobenzene represented by the following formula (3a) will be described as an example.
  • Compound 3-1-6 is an amidite monomer. Using a DNA synthesizer, an oligonucleotide containing an isopropylthioazobenzene residue (SiPr) represented by the above formula (7) was synthesized using compound 3-1-6.
  • the two-necked flask containing compound 3-2-4 and the two-necked flask containing dimethoxytrityl chloride are connected with a thin wire-like tube, and a solution containing dimethoxytrityl chloride is added to the compound in an ice bath.
  • the solution was slowly added dropwise to the solution side of the two-necked flask containing 3-2-4 and allowed to react for about 3 hours. After the reaction, this was extracted with ethyl acetate and washed once with distilled water, three times with a saturated aqueous sodium bicarbonate solution and twice with a saturated aqueous sodium chloride solution.
  • Compound 3-2-6 is an amidite monomer. Using a DNA synthesizer, an oligonucleotide containing an isobutylthioazobenzene residue (SiBu) represented by the above formula (8) was synthesized using compound 3-2-6.
  • SiBu isobutylthioazobenzene residue
  • DMT-L-threoninol was synthesized by the method described in Angewandte Chemie International Edition, 2010, Volume 49, pages 5502 to 5506. The yield was 0.17 g (0.24 mmol), and the yield was 18.9%.
  • This compound 3-3-6 is an amidite monomer.
  • an oligonucleotide containing a tertiary butylazobenzene residue (StBu) represented by the above formula (9) was synthesized using compound 3-3-6.
  • Table 3 shows the change in melting temperature of the 1a-X / 1b-0 duplex accompanying photoisomerization.
  • the measurement was performed under the conditions of an oligonucleotide concentration of 5 ⁇ M, a sodium chloride concentration of 100 mM, and a pH of 7.0 (10 mM phosphate buffer). The results are shown in Table 3.
  • ⁇ Tm has a negative value because the cis isomer is more stable and the trans isomer is more unstable.
  • the system using the oligonucleotide having isopropylthioazobenzene of Example 2 had a large absolute value of ⁇ Tm and high light control ability.
  • the system using the oligonucleotide having isobutylthioazobenzene of Comparative Example 2-1 had a small absolute value of ⁇ Tm and did not show sufficient light control ability.
  • the absolute value of ⁇ Tm is larger than Tm according to Example 2, but the maximum absorption wavelength is 350 nm as shown in FIG. It was a wavelength in the ultraviolet region.
  • the oligonucleotide having isopropylthioazobenzene according to Example 2 it is possible to control the isomerization reaction of the structural isomer by irradiating light having a wavelength in the visible light region. More specifically, an oligonucleotide capable of isomerizing a structural isomer by irradiation with light having a wavelength in the visible light region and having a large absolute value of the melting temperature difference ⁇ Tm of the structural isomer is provided. can do.
  • Example 3 a pair of oligonucleotides each including methylthioazobenzene represented by the following formula (4a) will be described as an example of the oligonucleotide represented by the above formula (4).
  • the phosphoramidite monomer corresponding to the above formula (4a) was synthesized by the method described in Chemistry A European Journal 2009, Volume 15 pages 10092 to 10102, and the oligo was synthesized by the method described therein. Introduced into nucleotides. Further, as described in the same magazine, the maximum absorption wavelength (maximum absorption wavelength of the absorption spectrum by UV-Vis) of the residue containing the azobenzene derivative of the oligonucleotide represented by the above formula (4a) was 398 nm in an aqueous solution. It was.
  • Oligonucleotide sequences 1a-S, 1b-S contain one residue S containing methylthiobenzene.
  • the sequences A4S and B4S contain four residues S.
  • the duplex melting temperature Tm of each oligonucleotide pair was determined from the change in absorbance at 260 nm by the method described in Nature Protocols, Vol. 2, pages 203 to 212.
  • the isomerization to the cis form was performed by irradiating with xenon lamp light through a 400 nm interference filter for 15 minutes while maintaining the temperature of the solution at 60 ° C. It was confirmed from the absorption spectrum that 60% or more was isomerized to the cis form by this operation.
  • Table 4 shows melting temperatures Tm of various azobenzene-introduced oligonucleotide duplexes. The measurement was performed under the conditions of a sodium chloride concentration of 100 mM and a pH of 7.0 (10 mM phosphate buffer).
  • the association type indicates a case in which a complex is formed such that residues containing methylthioazobenzene each of a pair of oligonucleotides are associated with each other.
  • the wedge shape indicates a case where a complex is formed such that residues containing methylthioazobenzene are arranged in a wedge shape alone in a complementary natural nucleotide sequence.
  • oligonucleotides 30 and 31 having a pair of complementary structures are complementary to residues 1 of the azobenzene derivative represented by the above formula (4a) and complementary natural nucleotides 2 and 4, respectively. Natural nucleotides 3 and 5.
  • the residue 1 enters the wedge shape one by one between the pair of complementary complementary nucleotides.
  • Example 4 as an example of the oligonucleotide represented by the above formula (3), an oligonucleotide containing cyclohexylthioazobenzene represented by the following formula (3b) will be described as an example.
  • Compound 1-1-6 is an amidite monomer. Using a DNA synthesizer, an oligonucleotide containing a cyclohexylthioazobenzene residue (Scyc) represented by the above formula (20) was synthesized using compound 1-1-6.
  • Example 5 an oligonucleotide containing adamantylthioazobenzene represented by the following formula (3c) will be described as an example of the oligonucleotide represented by the above formula (3).
  • Compound 2-1-6 is an amidite monomer. Using a DNA synthesizer, an oligonucleotide containing a cyclohexylthioazobenzene residue (Sadm) represented by the above formula (21) was synthesized using compound 2-1-6.
  • ⁇ Tm is a negative value.
  • the oligonucleotide having isopropylthioazobenzene according to Example 2 As described above, the absolute value of ⁇ Tm was large and the light control ability was high. According to the oligonucleotide having a cyclic hydrocarbon group according to Example 4 and Example 5, the absolute value of ⁇ Tm is larger than that of the linear hydrocarbon according to Example 2, and an oligonucleotide having a high light control capability is provided. can do.
  • SEQ ID NOs: 1 to 6 Synthetic oligonucleotide

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Abstract

下記式（１）または（２）によって示される、アゾベンゼン誘導体を含むオリゴヌクレオチド。（式中、Ａ１，Ａ２はそれぞれ独立に水素原子、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、Ｂ１およびＢ２はそれぞれ独立に水酸基、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に炭素原子数１～２０のアルキル基、Ｒ２１およびＲ２２はそれぞれ独立に水素原子または炭素原子数１～２０のアルキル基Ｒ１３～Ｒ１８、Ｒ２３～Ｒ２８はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。）

Description

オリゴヌクレオチドおよびその利用
　本発明は、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを利用した光スイッチング剤に関する。本願は、２０１０年８月３１日に出願された日本国特許出願である特願２０１０－１９４９４２に対する優先権を主張するものであり、この日本国特許出願の明細書の全内容は参照により本明細書に取り込まれる。
　相補的な構造を有するオリゴヌクレオチド同士のハイブリダイゼーションを外部刺激によって制御する技術が開発されている。ハイブリダイゼーションを制御できれば、例えば、遺伝子の検出、同定、定量の高精度化や、オリゴヌクレオチドを利用した分子デバイスや分子マシンの実現に寄与し得る。ハイブリダイゼーションを制御するための外部刺激としては、ｐＨの変化、温度変化、光の照射等が利用される。
　特許文献１～３には、光の照射によってオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可逆的に行う技術が記載されている。このオリゴヌクレオチドは、例えば、アゾベンゼンまたはアゾベンゼン誘導体等の光の照射によってシス体とトランス体との異性化反応を行うことが可能な有機基を含む残基を有する。特許文献１～３では、シス体からトランス体に異性化する反応と、トランス体からシス体に異性化する反応とのいずれか一方または双方において、４００ｎｍ未満の紫外線領域の光を用いる必要がある。
特開２００１－３４６５７９号公報 国際公開第０１／０２１６３７号パンフレット 国際公開第０５／０８３０７３号パンフレット
　紫外線を照射する場合、可視光を照射する場合よりも、生体系に与える損傷が大きい。このため、可視光を用いたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの制御が望まれていた。そのためには、第１に、可視光を用いてオリゴヌクレオチドを異性化させることが要求される。
　第２に、構造異性体の融解温度Ｔｍ（オリゴヌクレオチドの複合体が二重鎖構造から一本鎖状態に変性する温度）の差である融解温度差ΔＴｍが十分に大きいことが要求される。融解温度差ΔＴｍが小さい場合には、光照射によるハイブリダイゼーション制御の効率が低くなる。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、アゾベンゼンの六員環と結合する硫黄原子（Ｓ）を含むアゾベンゼン誘導体を有するオリゴヌクレオチドを用いることによって、可視光領域の波長を有する光を照射して構造異性体を可逆的に異性化させることが可能となり、かつ、構造異性体の融解温度差ΔＴｍが大きくなることを見出した。この知見に基づいて、本発明では、可視光を用いたハイブリダイゼーションの光制御が可能なオリゴヌクレオチドを提供する。
　本発明は、下記式（１）または（２）によって示される、アゾベンゼン誘導体を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　上記式（１）および（２）中、式中、Ａ１，Ａ２はそれぞれ独立に水素原子、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｂ１およびＢ２は水酸基、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に炭素原子数１～２０のアルキル基を表し、Ｒ２１およびＲ２２はそれぞれ独立に水素原子または炭素原子数１～２０のアルキル基を表し、Ｒ１３～Ｒ１８、Ｒ２３～Ｒ２８はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。
　Ｒ１３～Ｒ１８およびＲ２３～Ｒ２８は、いずれも水素原子であることが好ましい。　Ｒ１１およびＲ１２は、いずれもメチル基であることが好ましい。
　また、本発明は、下記式（３）によって示される、アゾベンゼン誘導体を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　上記式（３）中、Ａ３は水素原子、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｂ３は水酸基、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｒ３１およびＲ３２はそれぞれ独立に炭素原子数１～２０のアルキル基、またはＲ３１、Ｒ３２は互いに結合して硫黄原子に連結する炭素原子とともに炭素数５～４０の環状アルキル基またはアリール基を表し、Ｒ３３～Ｒ４０はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。
　Ｒ３１、Ｒ３２は互いに結合して硫黄原子に連結する炭素原子とともにシクロヘキシル基またはアダマンチル基を表すことが好ましい。もしくは、Ｒ３１およびＲ３２は、それぞれ独立に炭素原子数１～４のアルキル基であり、Ｒ３３～Ｒ４０は、いずれも水素原子であることが好ましい。この場合、Ｒ３１およびＲ３２は、いずれもメチル基であることが特に好ましい。
　また、本発明は、上記のオリゴヌクレオチドを備えた、可視光照射によって二重鎖の形成と解離とを制御できる光スイッチング剤を提供する。
　また、本発明は、相補的な配列を有し、複合体を形成する１対のオリゴヌクレオチドであって、前記１対のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、下記式（２）または（４）によって示される少なくとも１つのアゾベンゼン誘導体を対合する位置に有する、前記オリゴヌクレオチドを備える、可視光照射によって二重鎖の形成と解離とを制御できる光スイッチング剤を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　上記式（２）および（４）中、Ａ２、Ａ４はそれぞれ独立に水素原子、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｂ２、Ｂ４はそれぞれ独立に水酸基、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｒ２１およびＲ２２はそれぞれ独立に水素原子または炭素原子数１～２０のアルキル基を表し、Ｒ２３～Ｒ２８、Ｒ４１～Ｒ４８はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。
　Ｒ４３，Ｒ４４はメチル基もしくは水素原子であることが好ましく、Ｒ４１，Ｒ４２およびＲ４５～Ｒ４８は、いずれも水素原子であることが好ましい。
　前記１対のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、２つ以上のヌクレオチドを介して隣接する２つ以上の前記アゾベンゼン誘導体を有することが好ましい。
　また、本発明に係るオリゴヌクレオチドの製造に好適に利用できるアゾベンゼン誘導体を提供することもできる。本発明は、下記式（１１）によって示される、アゾベンゼン誘導体を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　上記式（１１）中、Ｘ１は、水酸基または下記式（１２）に示される基のいずれかを表し、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に炭素原子数１～２０のアルキル基を表し、Ｒ１３～Ｒ１８はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　上記式（１２）中、Ｃ１は、水素原子または水酸基保護基を表し、Ｄ１は、水素原子、水酸基保護基、ホスホアミダイト基または固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。
　また、本発明は、下記式（１３）によって示される、アゾベンゼン誘導体を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 　上記式（１３）中、Ｃ２は、水素原子または水酸基保護基を表し、Ｄ２は、水素原子、水酸基保護基、ホスホアミダイト基または固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表し、Ｒ２１およびＲ２２はそれぞれ独立に水素原子または炭素原子数１～２０のアルキル基を表し、Ｒ２３～Ｒ２８はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。
　また、本発明は、下記式（１４）によって示される、アゾベンゼン誘導体を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　上記式（１４）中、Ｘ２は、水酸基または下記式（１５）に示される基のいずれかを表し、Ｒ３１およびＲ３２はそれぞれ独立に炭素原子数１～２０のアルキル基、またはＲ３１、Ｒ３２は互いに結合して硫黄原子に連結する炭素原子とともに炭素数５～４０の環状アルキル基またはアリール基を表し、Ｒ３３～Ｒ４０はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　上記式（１５）中、Ｃ３は、水素原子または水酸基保護基を表し、Ｄ３は、水素原子、水酸基保護基、ホスホアミダイト基または固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。
実施例１に係る紫外・可視分光による吸収スペクトルである。 実施例２に係る紫外・可視分光による吸収スペクトルである。 実施例３に係る１対のオリゴヌクレオチドとその複合体について概念的に示す図である。 比較例に係る１対のオリゴヌクレオチドとその複合体について概念的に示す図である。
　本発明では、可視光領域の波長を有する光を照射することによって、構造異性体の異性化反応を制御することが可能なオリゴヌクレオチド及びハイブリダイゼーションの光スイッチング剤を提供する。より具体的には、可視光領域の波長を有する光を照射して構造異性体を可逆的に異性化させることが可能であり、かつ、構造異性体の融解温度差ΔＴｍが大きいオリゴヌクレオチドを提供する。本発明において、可視光領域とは、波長が４００ｎｍ以上の領域をいう。
　本明細書においてオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示される特定構造のユニットを含むヌクレオチドのポリマーであればよく、ヌクレオチド残基数は特に限定しない。また、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及びこれらの組み合わせであってもよい。したがって、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、各種の機能的ＲＮＡを含むことができる。また、オリゴヌクレオチドの二重鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖，ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖、及びＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を含んでいる。
　本明細書に開示される特定ユニットを有するオリゴヌクレオチドが、その相補的塩基配列に基づき二重鎖構造を採りうるよう構成されるとき、可視光照射によって、少なくとも特定ユニットを含む部分において二重鎖の形成と解離とを制御できる。遺伝子の発現、遺伝子の複製、遺伝子の修復等の種々の遺伝子に関わる機能は、ＤＮＡ二重鎖の形成や解離が大きく関わっている。また、ＤＮＡポリメラーゼ等を利用したポリメラーゼによるＤＮＡの伸長反応においても同様である。したがって、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド二重鎖の形成・解離の制御剤として有用であるとともに、可視光照射によって二重鎖の形成と解離とを制御できる、遺伝子機能の光スイッチング剤、ＤＮＡ伸長反応の光スイッチング剤として有用である。
　上記式（１）～（４）に示すように、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、リン酸エステルを含むバックボーンに、リンカーを介してアゾベンゼン誘導体が結合されており、アゾベンゼン誘導体は、側鎖としてオリゴヌクレオチドに含まれている。アゾベンゼン誘導体は、アゾベンゼンの六員環と結合する硫黄原子を含むアゾベンゼン誘導体を含んでいる。オリゴヌクレオチドアゾベンゼン誘導体は、オリゴヌクレオチド中に１分子以上含まれていれば、何分子含まれていてもよい。１塩基～５塩基に対して１分子の割合が好ましく、２塩基～４塩基に対して１分子の割合が特に好ましい。
　上記式（１）～（３）に示すオリゴヌクレオチドは、アゾベンゼン誘導体が有するアゾ結合により、シス体とトランス体の構造異性体を有し、可視光領域の光を照射することによって、シス体とトランス体との可逆的な異性化反応を起こすことができる。
　上記式（１）～（３）に示すオリゴヌクレオチドが、これと相補的な構造を有するオリゴヌクレオチド（以下、本明細書では相補的オリゴヌクレオチドという。）とハイブリダイゼーションし、複合体を形成する場合に、本発明に係るオリゴヌクレオチド有するアゾベンゼン誘導体がシス体であるか、トランス体であるかによって、複合体の安定性が相違する。このため、上記式（１）～（３）に示すオリゴヌクレオチドとその相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに際して可視光の照射を行うことによって、異性化反応を制御することができる。具体的には、特定の可視光の照射によって、１対のオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、別の特定の可視光の照射によって、複合化した１対のオリゴヌクレオチドをデハイブリダイゼーションさせることができる。紫外線を用いる必要がなく、専ら可視光を用いるため、細胞や酵素を損傷することなく１対のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを制御することができる。なお、本発明では、１対の相補的なオリゴヌクレオチドの双方が上記式（１）～（３）に示すオリゴヌクレオチドであってもよい。
　また、上記式（１）～（３）に示すオリゴヌクレオチドでは、シス体の融解温度（オリゴヌクレオチドの複合体が二重鎖構造から一本鎖状態に変性する温度）とトランス体の融解温度との差である融解温度差ΔＴｍが十分に大きい。このため、トランスーシス光異性化によって二重鎖の安定性に十分な差が生じるので、可視光でのハイブリダイゼーション制御の確実性が向上する。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、相補的な配列を有する１対のオリゴヌクレオチドの双方が特定のアゾベンゼン誘導体を有している場合にのみ、可視光での異性化反応が実現でき、光スイッチング剤として有効に利用できる場合があることを見出した。また、上記式（１）または（２）に示すオリゴヌクレオチドを対にして用いても、同様の結果が得られることを見出した。すなわち、１対のオリゴヌクレオチドのそれぞれが上記式（２）または（４）によって示される少なくとも１つのアゾベンゼン誘導体を対合する位置に有する場合には、上記（１）～（３）に示すオリゴヌクレオチドの場合と同様に、可視光での異性化反応が実現でき、融解温度差ΔＴｍが十分大きくなるという作用効果を得ることができる。
　また、本発明に係るオリゴヌクレオチドの製造に好適に利用できるアゾベンゼン誘導体を提供することもできる。上記式（１１）、（１３）、（１４）に示すアゾベンゼン誘導体は、それぞれ上記式（１）～（３）に示すオリゴヌクレオチドの中間体であり、上記式（１）～（３）に示すオリゴヌクレオチドの製造に好適に利用できる。上記式（１１）、（１３）、（１４）における上記式（１）～（３）と同一の構成（Ｒ１１～Ｒ１８、Ｒ２１～Ｒ２８、Ｒ３１～Ｒ４０等）については、上記式（１）～（３）における構成と同一である。したがって、上記式（１）～（３）において本明細書において適用可能な構造や好ましい構造は上記式（１１）、（１３）、（１４）についても適用される。
　上記式（１２）、（１３）、（１５）において、Ｃ１～Ｃ３は、水素原子または水酸基保護基を表す。水酸基保護基は、特に限定されないが、従来公知の水酸基保護基を用いることができる。例えば、フルオレニルメトキシカルボニル基（ＦＭＯＣ基）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ基）、四級ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ基）、モノメトキシトリチル基、トリフルオロアセチル基、レブリニル基、またはシリル基が挙げられる。好ましい保護基は、トリチル基であり、例えば、モノメチルトリチル（ＭＭＴ）ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及び四級ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ基）から選択される。
　また、Ｄ１～Ｄ３は、水素原子、水酸基保護基、ホスホアミダイト基または固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。Ｄ１～Ｄ３がホスホアミダイト基である化合物（アミダイト化合物）は、ホスホアミダイト法によるホスホアミダイト試薬として用いて、オリゴヌクレオチドを合成するのに用いることができる。なお、本発明において、ホスホアミダイト基とは、このようにホスホアミダイト法に使用することができるものを全て含み、特に限定されないが、例えば、下記式（１６）で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　上記式（１６）中、Ｑ１、Ｑ２はそれぞれ独立して、分枝状または直鎖状の炭素数１～５個のアルキル基を表し、同一であっても互いに異なっていてもよい。Ｑ１、Ｑ２としては、特に限定しないがイソプロピル基が好ましいものとして挙げられる。
　また、上記式（１２）、（１３）、（１５）において、Ｄ１～Ｄ３が固相担体に結合される連結基である化合物は、当該連結基とアミノ基など固相担体上の所定の官能基とを結合させることにより、固相担体に保持される。そして、上記式（１２）、（１３）、（１５）において、Ｄ１～Ｄ３が固相担体に結合された連結基である化合物は、連結基を介して本オリゴヌクレオチドが固相担体に結合されているため、各種の核酸固相合成法の出発材料として用いることができる。例えば、この出発材料を用い、ＤＮＡ合成機を使用することで、式（１）～（３）で表されるアゾベンゼン誘導体を含むオリゴヌクレオチドを製造することができる。
　以下、本発明のそれぞれの実施形態および実施例について、説明する。
　（第１実施形態）
　本発明の一実施形態として、第１実施形態に係るオリゴヌクレオチドについて説明する。第１実施形態に係るオリゴヌクレオチドは、上記式（１）または（２）によって示される、アゾベンゼン誘導体を含む。上記式（１）では、アゾベンゼン誘導体は、Ｄ－スレオニノールをリンカーとしてバックボーンに結合している。リンカーとメチルチオ基は、アゾベンゼン誘導体の２つのベンゼン環を結合するアゾ基に対して対称となる位置に結合しており、それぞれ、アゾ基に対してパラ位に結合している。アゾベンゼン誘導体は、メチルチオ基が結合する側のベンゼン環にさらに２つのアルキル基（上記式（１）中のＲ１１、Ｒ１２）を備えており、アゾ基に対してオルト位となる位置にその２つのアルキル基がそれぞれ結合している。また、上記式（２）では、アゾベンゼン誘導体とリンカーとは、硫黄原子（Ｓ）を介して結合している。硫黄原子は、アゾ基に対してパラ位に結合している。アゾベンゼン誘導体は、硫黄原子が結合する側のベンゼン環にさらに２つのアルキル基を備えていてもよく、２つのアルキル基は、アゾ基に対してオルト位となる位置（上記式（２）中のＲ２１、Ｒ２２の位置）にそれぞれ結合することが好ましい。
　上記式（１）および（２）中、Ａ１，Ａ２はそれぞれ独立に水素原子、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｂ１およびＢ２はそれぞれ独立に水酸基、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表す。Ｒ１３～Ｒ１８、Ｒ２３～Ｒ２８はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。
　Ｒ１３～Ｒ１８、Ｒ２３～Ｒ２８は、水素原子またはアルキル基が好ましく、水素原子が特に好ましい。アルキル基の炭素数は、より好ましくは１～８であり、さらに好ましくは１～４であり、一層好ましくは１～３であり、最も好ましくはメチル基である。
　Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に炭素原子数１～２０のアルキル基を表す。Ｒ２１およびＲ２２は、水素原子または直鎖のアルキル基が好ましく、アルキル基の炭素数は、より好ましくは１～８であり、さらに好ましくは１～４であり、一層好ましくは１～３であり、最も好ましくはメチル基である。
　一般にアルキルチオ基の様な電子供与性の置換基をアゾ基のパラ位に導入すると、アゾベンゼンの極大吸収波長の長波長化が実現出来るが、副作用としてシス体のトランス体への熱異性化が促進される。このような、光照射以外によるシス体からトランス体への異性化は、意図しないスイッチとなるため好ましくない。従ってシス体の熱異性化を極力抑制することが好ましい。上記式（１）で、アゾ基から見てメチルチオ基が存在する側のベンゼン環のオルト位に存在する２つのアルキル基（Ｒ１１、Ｒ１２）は、トランス体での二重鎖の安定化に寄与するとともに、シス体からトランス体への熱異性化を抑制する効果がある。
　上記式（２）中、Ｒ２１およびＲ２２はそれぞれ独立に水素原子または炭素原子数１～２０のアルキル基を表す。Ｒ２１およびＲ２２は、水素原子または直鎖のアルキル基が好ましく、アルキル基の炭素数は、より好ましくは１～８であり、さらに好ましくは１～４であり、一層好ましくは１～３であり、最も好ましくはメチル基である。ここに導入するアルキル基も、上記式（１）の場合と同様に、トランス体における二重鎖の安定化への寄与とともに、シス体からトランス体への熱異性化を抑制する効果がある。Ｒ２１およびＲ２２が水素原子であってもよい。
　第１実施形態に係るオリゴヌクレオチドは、アゾベンゼン誘導体が有するアゾ結合により、シス体とトランス体の構造異性体を有し、可視光領域の光を照射することによって、シス体とトランス体との可逆的な異性化反応を起こすことができる。
　第１実施形態に係るオリゴヌクレオチドは、アゾベンゼン誘導体が平面構造のトランス体である場合がより安定であり、非平面構造のシス体である場合がより不安定である。第１実施形態に係るオリゴヌクレオチドと、これと相補的な構造を有するオリゴヌクレオチド（以下、本明細書では相補的オリゴヌクレオチドという。）とのハイブリダイゼーションに際して、この１対のオリゴヌクレオチドに特定の波長の可視光を照射すると、第１実施形態に係るオリゴヌクレオチドのアゾベンゼン誘導体がトランス体に異性化し、１対のオリゴヌクレオチドの塩基対間にインターカレートする。トランス体のアゾベンゼン誘導体によって１対のオリゴヌクレオチドが相互的にスタッキングされ、二重鎖構造を有するオリゴヌクレオチドの複合体が安定化する。
　ハイブリダイズされた１対のオリゴヌクレオチドの複合体に対して、特定の波長の可視光を照射すると、第１実施形態に係るオリゴヌクレオチドのアゾベンゼン誘導体が、シス体に異性化する。シス体は非平面構造であるため、１対のオリゴヌクレオチドの塩基対と立体障害を生じ、二重鎖構造を有するオリゴヌクレオチドの複合体が不安定化する。
　可視光を照射して、第１実施形態に係るオリゴヌクレオチドのアゾベンゼン誘導体の異性化反応を制御することによって、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを制御することができる。
　また、上記式（１）または（２）に示すオリゴヌクレオチドでは、シス体の融解温度とトランス体の融解温度との差である融解温度差ΔＴｍが十分に大きい。このため、可視光での制御の確実性が向上する。特に、上記式（２）によって示されるアゾベンゼン誘導体を有するオリゴヌクレオチドにおいては、ΔＴｍがより大きくなるという観点から、Ｒ２１とＲ２２の少なくともいずれか一方は、アルキル基であることが好ましい。なお、上記式（１）または（２）に示すオリゴヌクレオチドでは、シス体の融解温度は、トランス体の融解温度よりも低い。すなわち、上記式（１）および（２）に示すオリゴヌクレオチドは、順スイッチとなる。
　上記式（１１）に係るアゾベンゼン誘導体は、上記式（１）に係るオリゴヌクレオチドの製造工程における中間体であり、上記式（１）の製造に好適に利用できる。例えば、上記式（１１）中のＸ１が上記式（１２）によって示され、式中のＣ１が水酸保護基（例えばジメトキシトリチル基）であり、Ｄ１がホスホアミダイト基（例えば、Ｑ１およびＱ２がイソプロピル基である、上記式（１６）に示すホスホアミダイト基）であるアゾベンゼン誘導体をアミダイトモノマーとして用いて、ＤＮＡ合成機等を使用することによって、上記式（１）に係るオリゴヌクレオチドを好適に製造することができる。
　上記式（１３）に係るアゾベンゼン誘導体は、上記式（２）に係るオリゴヌクレオチドの製造工程における中間体であり、上記式（２）の製造に好適に利用できる。例えば、上記式（１３）によって示され、式中のＣ２が水酸保護基（例えばジメトキシトリチル基）であり、Ｄ２がホスホアミダイト基（例えば、Ｑ１およびＱ２がイソプロピル基である、上記式（１６）に示すホスホアミダイト基）であるアゾベンゼン誘導体をアミダイトモノマーとして用いて、ＤＮＡ合成機等を使用することによって、上記式（２）に係るオリゴヌクレオチドを好適に製造することができる。
　（第２実施形態）
　本発明の他の実施形態として、第２実施形態に係るオリゴヌクレオチドについて説明する。第２実施形態は、上記式（３）によって示される、アゾベンゼン誘導体を含むオリゴヌクレオチドに係る。上記式（３）に示すように、アゾベンゼン誘導体は、L－スレオニノールをリンカーとしてバックボーンに結合しており、リンカーとアルキルチオ基は、アゾベンゼン誘導体の２つのベンゼン環を結合するアゾ基に対して対称となる位置に結合しており、それぞれ、アゾ基に対してパラ位に結合している。上記式（３）に示すように、アルキルチオ基は、硫黄原子に結合するＣＨ基を備えており、ＣＨ基は、２つのアルキル基Ｒ３１、Ｒ３２と結合している。
　上記式（３）中、Ａ３は水素原子、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｂ２は水酸基、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｒ３１およびＲ３２はそれぞれ独立に炭素原子数１～２０のアルキル基、またはＲ３１、Ｒ３２は互いに結合して硫黄原子に連結する炭素原子とともに炭素数５～４０の環状アルキル基またはアリール基を表し、Ｒ３３～Ｒ４０はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。
　Ｒ３１、Ｒ３２は、メチル基、エチル基、プロピル基等の直鎖アルキル基でもよいし、硫黄原子と結合するＣＨ基、Ｒ３１、Ｒ３２を含む環状アルキル基もしくはフェニル基等のアリール基であってもよい。硫黄原子に結合しているアルキル基の一つが水素であること(ＣＨ基)によって、Ｒ３１、Ｒ３２がこのような嵩高い構造を備えていても、ＣＨ基と硫黄原子とを結ぶ結合がベンゼン環と同一平面上に位置し易くなり、電子供与効果によって、上記式（３）に係るオリゴヌクレオチドの極大吸収波長が長波長化する。硫黄原子と結合するＣＨ基、Ｒ３１、Ｒ３２からなる嵩高い構造としては、環状炭化水素基が好ましく、環状飽和炭化水素基がより好ましい。具体的には、硫黄原子と結合するＣＨ基、Ｒ３１、Ｒ３２が、フェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、フェナレニル基、ビフェニル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、アダマンチル基、ジアマンチル基、トリアマンチル基等、およびその水素原子が水酸基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、アルキル基、アリール基等の置換基によって置換された基であることが好ましく、シクロヘキシル基、アダマンチル基が特に好ましい。光制御効率の向上という観点からは、Ｒ３１、Ｒ３２はより嵩高いことが好ましい一方、製造し易さという観点からは、上記式（３）中、Ｒ３１、Ｒ３２は、炭素数１～２０のアルキル基であることが好ましく、アルキル基の炭素数は、より好ましくは１～８であり、さらに好ましくは１～４であり、一層好ましくは１～３であり、最も好ましくはメチル基である。
　Ｒ３３～Ｒ４０はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。Ｒ３３～Ｒ４０は、水素原子またはアルキル基が好ましく、水素原子が特に好ましい。アルキル基の炭素数は、より好ましくは１～８であり、さらに好ましくは１～４であり、一層好ましくは１～３であり、最も好ましくはメチル基である。
　第２実施形態に係るオリゴヌクレオチドは、アゾベンゼン誘導体が有するアゾ結合により、シス体とトランス体の構造異性体を有し、可視光領域の光を照射することによって、シス体とトランス体との可逆的な異性化反応を起こすことができる。
　第２実施形態に係るオリゴヌクレオチドは、アゾベンゼン誘導体が非平面構造のシス体である場合がより安定であり、平面構造のトランス体である場合がより不安定である。第２実施形態に係るオリゴヌクレオチドと、この相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに際して、この１対のオリゴヌクレオチドに特定の波長の可視光を照射すると、第２実施形態に係るオリゴヌクレオチドのアゾベンゼン誘導体がシス体に異性化し、１対のオリゴヌクレオチド二重鎖の溝に結合（グルーブバインド）することにより、二重鎖構造を有するオリゴヌクレオチドの複合体が安定化する。一方、トランス体の場合、リンカーに使用するＬ－スレオニノールの効果と嵩高いＲ３１およびＲ３２と相補鎖側のオリゴヌクレオチドとの立体障害により、二重鎖構造を有するオリゴヌクレオチドの複合体が不安定化する。
　ハイブリダイズされた１対のオリゴヌクレオチドの複合体に対して、特定の波長の可視光を照射すると、第２実施形態に係るオリゴヌクレオチドのアゾベンゼン誘導体が、トランス体に異性化する。アゾベンゼン複合体がトランス体に異性化することによって、オリゴヌクレオチドの複合体が不安定化する。
　可視光を照射することによって、第２実施形態に係るオリゴヌクレオチドのアゾベンゼン誘導体の異性化反応を制御することによって、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを制御することができる。
　また、上記式（３）に示すオリゴヌクレオチドでは、シス体の融解温度とトランス体の融解温度との差である融解温度差ΔＴｍが十分に大きい。このため、可視光でのハイブリダイゼーション制御の確実性が向上する。なお、上記式（３）に示すオリゴヌクレオチドでは、シス体の融解温度は、トランス体の融解温度よりも高い。すなわち、上記式（３）に示すオリゴヌクレオチドは、上記式（１）および（２）の場合と異なり、逆スイッチとなる。また、上記式（３）に示すオリゴヌクレオチドを用いる場合には、上記式（２）に示すオリゴヌクレオチドを用いる場合に比べて、ΔＴｍの絶対値を大きくすることができ、光制御能力がより高いオリゴヌクレオチドを提供することができる。
　また、上記式（１４）に係るアゾベンゼン誘導体は、上記式（３）に係るオリゴヌクレオチドの製造工程における中間体であり、上記式（３）の製造に好適に利用できる。例えば、上記式（１４）中のＸ２が上記式（１５）によって示され、式中のＣ３が水酸保護基（例えばジメトキシトリチル基）であり、Ｄ３がホスホアミダイト基（例えば、Ｑ１およびＱ２がイソプロピル基である、上記式（１６）に示すホスホアミダイト基）であるアゾベンゼン誘導体をアミダイトモノマーとして用いて、ＤＮＡ合成機等を使用することによって、上記式（３）に係るオリゴヌクレオチドを好適に製造することができる。
　（第３実施形態）
　本発明の他の実施形態として、第３実施形態について説明する。第３実施形態は、相補的な配列を有し、複合体を形成する１対のオリゴヌクレオチドを備える、光スイッチング剤に係る。前記１対のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、上記式（２）または（４）によって示される少なくとも１つのアゾベンゼン誘導体を対合する位置に有する。１対のオリゴヌクレオチドは、互いのアゾベンゼン誘導体が会合するように複合化する。１対のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、２つ以上のヌクレオチドを介して隣接する２つ以上のアゾベンゼン誘導体を有することが好ましい。
　第３実施形態において好適に利用できる、上記式（２）に係るオリゴヌクレオチドについては、第１実施形態において好適に利用できるオリゴヌクレオチドと同様である。
　図３を用いて第３実施形態について具体的に説明する。図３は、第３実施形態に係る１対のオリゴヌクレオチドと、その複合体の一例を模式的に示している。図３に示すように、１対の相補的な構造を有するオリゴヌクレオチド１０，１１は、上記式（２）または（４）に示されるアゾベンゼン誘導体の残基１と、相補的な天然のヌクレオチド２，４と、相補的な天然のヌクレオチド３，５とを備えている。オリゴヌクレオチド１０，１１のように、１つのオリゴヌクレオチド中に複数の残基１が含まれている場合には、隣接する複数の残基１１は、２つ以上のヌクレオチドを介して隣接する。１対のオリゴヌクレオチド１０が複合体２０になると、オリゴヌクレオチド１０の残基１とオリゴヌクレオチド１１の残基１が会合する。
　上記式（４）中、Ａ４は水素原子、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｂ４は水酸基、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｒ４１～Ｒ４８はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。
　Ｒ４１～Ｒ４８は、水素原子またはアルキル基が好ましく、アルキル基の炭素数は、好ましくは１～８であり、より好ましくは１～４であり、さらに好ましくは１～３であり、一層好ましくはメチル基である。Ｒ４３，Ｒ４４はメチル基もしくは水素原子であることが特に好ましく、Ｒ４１，Ｒ４２およびＲ４５～Ｒ４８は、いずれも水素原子であることが特に好ましい。
　上記式（４）に示すように、アゾベンゼン誘導体は、D－スレオニノールをリンカーとしてバックボーンと結合している。リンカーとメチルチオ基は、アゾベンゼン誘導体の２つのベンゼン環を結合するアゾ基に対して対称となる位置に結合しており、それぞれ、アゾ基に対してパラ位に結合している。
　第３実施形態に係る１対のオリゴヌクレオチドは、アゾベンゼン誘導体が有するアゾ結合により、シス体とトランス体の構造異性体を有し、可視光領域の光を照射することによって、シス体とトランス体との可逆的な異性化反応を起こすことができる。上記式（２）に係るオリゴヌクレオチドについては、第１実施形態と同様であるから、以下、説明を省略する。
　第３実施形態に係る１対のオリゴヌクレオチドは、アゾベンゼン誘導体が平面構造のトランス体である場合がより安定であり、非平面構造のシス体である場合がより不安定である。第３実施形態に係る１対のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに際して、この１対のオリゴヌクレオチドに特定の波長の可視光を照射すると、上記式（４）に係るオリゴヌクレオチドのアゾベンゼン誘導体がトランス体に異性化し、１対のオリゴヌクレオチドの塩基対間にインターカレートする。トランス体のアゾベンゼン誘導体によって１対のオリゴヌクレオチドが相互的にスタッキングされ、二重鎖構造を有するオリゴヌクレオチドの複合体が安定化する。
　ハイブリダイズされた１対のオリゴヌクレオチドの複合体に対して、特定の波長の可視光を照射すると、第３実施形態に係る１対のオリゴヌクレオチドのアゾベンゼン誘導体が、シス体に異性化する。シス体は非平面構造であるため、１対のオリゴヌクレオチドの塩基対と立体障害を生じ、二重鎖構造を有するオリゴヌクレオチドの複合体が不安定化する。
　可視光を照射し、上記式（４）に係るオリゴヌクレオチドのアゾベンゼン誘導体の異性化反応を制御することによって、１対のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを制御することができる。
　また、それぞれが上記式（４）によって示される、１対のオリゴヌクレオチドでは、シス体の融解温度とトランス体の融解温度との差である融解温度差ΔＴｍが十分に大きい。このため、可視光でのハイブリダイゼーション制御の確実性が向上する。なお、上記式（４）に示すオリゴヌクレオチドでは、シス体の融解温度は、トランス体の融解温度よりも低い。すなわち、上記式（４）に示すオリゴヌクレオチドは、上記式（１）および（２）と同様に順スイッチとなる。また、上記式（４）に示すオリゴヌクレオチドを用いる場合には、上記式（２）に示すオリゴヌクレオチドを用いる場合に比べて、ΔＴｍの絶対値を大きくすることができ、光制御能力がより高いオリゴヌクレオチドを提供することができる。
　以下、本発明を具体例を挙げて説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。
　実施例１では、上記式（１）に示すオリゴヌクレオチドの一例として、下記式（１ａ）によって示される、メチルチオアゾベンゼン誘導体を含むオリゴヌクレオチドを例示して説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　（オリゴヌクレオチドの製造）
　上記式（１ａ）に係るオリゴヌクレオチドは、下記式（５）のスキームに従い合成した。合成に利用した化合物2-1～2-6は、下記式（５）に示す。なお、化合物2-2～2-6は、上記式（１１）に係るアゾベンゼン誘導体の一例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　（化合物2-1（4-メチルチオ-2,6-ジメチルアニリン）の合成）
　すりつぶした塩化アルミニウム（AlCl3）0.72g (5.40mmol)と9.84 g (0.081mol)の2,6-ジメチルアニリンを二口ナスフラスコに入れ、150℃で30分間還流した。これによって得られた懸濁液を一旦100℃程度にまで自然冷却し、ジメチルジスルフィドを7.63g加え、160℃で14時間還流した。さらに、1Nの水酸化ナトリウム水溶液を加えてから酢酸エチルで1回抽出し、さらに水相から酢酸エチルで2回抽出した。抽出に用いた全ての酢酸エチル溶液を合一させ、これを飽和塩化ナトリウム水溶液で4回洗浄した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥してから減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝20:1)で精製して化合物2-1を6.72 g得た。収率は約49.4％であり、未反応の原料との混合物であった。
　（化合物2-2の合成）
　1.08g(6.03mmol)の4-ニトロソ安息香酸エチル（4-Nitrosobenzoic acid ethyl ester） と0.87g(5.20mmol)の化合物2-1をナスフラスコに加え30 mlの酢酸に溶かし、10時間以上反応させた。反応後の反応液を、酢酸エチルで1回抽出し、得られた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、続いて飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝20:1)で精製して化合物2-2を収率66.7%で1.14 g(3.47mmol)得た。
　（化合物2-3の合成)
　1.14g(3.47mmol)の化合物2-2をナスフラスコ中で80mlのエタノールに溶かし、ここに10 mlの蒸留水に溶かした0.26g(4.45mmol)の水酸化ナトリウムを加え、10時間以上反応させた。反応液に塩酸水溶液を加えて液を酸性にし、酢酸エチルで1回抽出後し、有機層を得た。得られた有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機層を減圧濃縮することで化合物2-3を1.04g(3.47mol)で得た。収率は、ほぼ100%であった。
　（化合物2-4の合成）
　1.04g(3.47mmol)の化合物2-3、0.42g(3.99mmol)のD-スレオニノール、0.58g(4.29mmol)の1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）をナスフラスコに入れ、20mlのジメチルホルムアミド（DMF）に溶かした。0.89g(4.31mmol)のジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）を溶かした10mlのジメチルホルムアミドを準備し、このナスフラスコ中にゆっくりと加え10時間以上反応させた。その後、このナスフラスコ中の反応液に吸引ろ過を行い、固体を取り除いた後のろ液を減圧濃縮し、残渣を得た。ろ液の残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒は、クロロホルム：メタノール＝20:1）により精製し、1.34g(3.47mmol)の化合物2-4を得た。収率は、ほぼ100%であった。
　（化合物2-5の合成）
　1.34g(3.47mmol)の化合物2-4を二口ナスフラスコに入れ、二口ナスフラスコ中を窒素置換した後、20mlの脱水ピリジンに溶かし、氷浴に浸した。ここに、別の二口ナスフラスコを用いて、10mlの脱水ジクロロメタンに1.46 g(4.31mmol)のジメトキシトリチルクロリド（DMT-Cl）を溶かした溶液を準備し、この溶液を、化合物2-4を入れた側の二口ナスフラスコに、ゆっくりと滴下した。滴下が終わってから氷浴を除き、二口ナスフラスコの内容物を薄層クロマトグラフィー(TLC)で反応を追跡しながら4時間程度反応させた。反応液を減圧濃縮し、トルエンを用いて3回共沸して、反応液中に含まれるピリジンを取り除いた。得られた反応液の残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル= 1:1,トリエチルアミン＝3体積%）で精製し、収率58.8 %で化合物2-5を1.41g(2.04mmol) 得た。
　（化合物2-6の合成）
　0.14g(0.20mmol)の化合物2-5を二口ナスフラスコに入れ、窒素置換してから脱水アセトニトリルで2回共沸した。その後、0.072g(0.23mmol)のアミダイト化試薬（2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロアミダイト）を加え、さらにアセトニトリルで1回共沸した。その後、10mlのアセトニトリルに溶かして氷浴に浸して冷却した。別の二口フラスコに0.017g(0.24mmol)の1Hテトラゾールを取り、アセトニトリルで2回共沸した後、5mlのアセトニトリルに溶かした。テトラゾールの溶液をゆっくりともう一方のフラスコ中へ加え、4時間程度反応させた。続いて反応液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル=1:1,トリエチルアミン＝3体積%）で精製し、化合物2-6を0.05g(0.056mmol)得た。収率は28%であった。
　（オリゴヌクレオチドの合成）
　得られた化合物2-6を0.8mlのアセトニトリルに溶かし、オリゴヌクレオチドの合成に用いた。化合物2-6をアミダイトモノマーとして用いて、ＤＮＡ合成機を使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。以下に合成したオリゴヌクレオチドの配列を示す。ここでSDMは、下記式（６）に示すように、実施例１に係るアゾベンゼン誘導体を含む残基である。なお、比較例として、下記配列の1a-X中において、X=S（比較例１－１）である場合、X=Zである場合（比較例１－２）のオリゴヌクレオチドを準備した。S,Zについては、下記式（６）に示すとおりである。また、下記のとおり、1a-Xと相補的な配列1b-0を合成した。
1a-X:  5’-GGTATCXGCAATC-3’  (X = SDM, S, Z)　（配列番号１）
1b-0:  3’-CCATAGCGTTAG-5’　                  （配列番号２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　（光制御能力の評価）
　図１は、1a-SDM（実線：実施例１）と1a-Z（破線：比較例１－２）の紫外・可視分光（ＵＶ－Ｖｉｓ）による吸収スペクトルを示している。なお、測定は、1a-Xの濃度は20μM、塩化ナトリウムの濃度は100mM, pHは7.0(10mM,ホスフェートバッファー)の条件で行った。図１に示すように、実施例１では、400nm付近に極大吸収を持つ一方で、比較例１－２では、極大吸収は350nm未満であった。この結果より、実施例１に係るオリゴヌクレオチドは、400nm以上の可視光領域の波長を有する光を照射することで、トランス体からシス体への異性化させることができる一方、比較例１－２にかかるオリゴヌクレオチドでは、トランス体からシス体への異性化反応には400nm未満の紫外線領域の波長を有する光を照射する必要があることが分かった。
　（可視光による異性化の評価）
　（ＵＶ－Ｖｉｓスペクトル）
　次に、実施例１、比較例１－１、比較例１－２に係る1a-X配列を、1b-0配列とハイブリダイゼーションさせ、楔型に設計した二重鎖を有する複合体とした。得られた複合体に可視光を照射し、安定なトランス体から不安定なシス体への異性化について評価した。可視光による異性化の評価は、各複合体を含む溶液の温度を60℃に保ちつつ、400nmの干渉フィルターを通したキセノンランプ光を10分間照射することで行った。各複合体の吸収スペクトルを調べた結果、実施例１および比較例１－１においては、60％以上がシス体に異性化したことが確認できた。一方、比較例１－２においては、シス体への異性化率は15%以下であった。なお、比較例１－２については、ＵＶＤ－３６Ｃフィルターを通したキセノンランプ光を5分間照射し、紫外線領域の光を用いた異性化反応についても調べた。その結果、70％以上がシス体に異性化したことを吸収スペクトルより確認した。
　上記のとおり、実施例１、比較例１－１に係るオリゴヌクレオチドの複合体(X=S, SDM)は、400nmの可視光照射で十分にトランス体からシス体へ光異性化した。一方、比較例１－２に係るオリゴヌクレオチドの複合体(X=Z)は、400nmの可視光照射で十分にトランス体からシス体へ光異性化できなかった。この結果は、図１に示す吸収スペクトルと相関している。
　なお、実施例１については、450nmの光照射によりシス体から再びトランス体へ可逆的に光異性化することも確認した。このように実施例１に係るオリゴヌクレオチドは、可視光照射のみで可逆的に光異性化する。
　（ΔＴｍの評価）
　上記の実施例１、比較例１－１、比較例１－２に係る複合体の融解温度Ｔｍを測定した。各オリゴヌクレオチド対の二重鎖の融解温度Ｔｍは、ネイチャー・プロトコルズ(Nature Protocols)誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法を用いて、260nmの波長の光の吸光度の温度変化から求めた。1a-X/1b-0の二重鎖の光異性化に伴う融解温度の変化を下記の表１に示す。測定条件は、オリゴヌクレオチドの濃度：5μM、塩化ナトリウム濃度：100mM、pH7.0(10mMホスフェートバッファー)とした。また、融解温度差ΔＴｍ＝（トランス体のＴｍ）－（シス体のＴｍ）として算出した。その結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　表１に示すように、実施例１では、楔型の複合体設計でもトランス体からシス体に光異性化することで、13.4℃という大きいΔＴｍの値を示し、比較例１－１、比較例１－２のΔＴｍの値を遥かに凌駕した。このように実施例１に係る複合体は400nmの可視光でシス体に異性化し、かつ高い光制御能力を持つことが明らかとなった。
　（シス体の熱異性化速度）
　次に、実施例１、比較例１－１、比較例１－２について、シス体からトランス体への熱異性化速度を測定した。熱異性化速度は、一本鎖の1a-Xのバッファー溶液（塩化ナトリウム100mM, pH 7.0 (10mMホスフェートバッファー)）に光照射を行い、シス体へ異性化させた後、60℃に保ちつつ定期的に吸収スペクトルを測定し、トランス体の極大吸収波長に対応する吸光度の増加速度から算出した。光照射は、実施例１および比較例１－１については400nmの干渉フィルターを通したキセノンランプ光を10分間照射することで行い、比較例１－２については、ＵＶＤ－３６Ｃフィルターを通したキセノンランプ光を5分間照射することで行った。表２に、シス体のトランス体への熱異性化速度を示す。1a-X（X=SDM,Z,S）の濃度は20μMとし、測定温度は60℃とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　光によるハイブリダイゼーションの制御に際しては、熱異性化速度が遅いことが要求される。一般にアゾベンゼンのアゾ基のパラ位への電子供与性基の導入は、シス体の熱異性化を加速する。表２に示すように、比較例１－２に係る無置換のアゾベンゼンを持つ1a-Zに対し、比較例１－１に係る、アゾ基のパラ位にメチルチオ基を導入したアゾベンゼンを持つ1a-Sでは、シス体からトランス体への熱異性化速度が約１０倍加速した。このようにアゾ基のパラ位への化学修飾は一般的にシス体を熱的に不安定化する。しかしながら、実施例１に係る1a-SDMは、アゾ基のパラ位にメチルチオ基を有するにも係らず、シス体の熱安定性が向上し、熱異性化速度が無置換のアゾベンゼン（1a-Z）よりもむしろ遅くなった。
　上記のとおり、実施例１に係る新規アルキルチオアゾベンゼンを有するオリゴヌクレオチドによれば、可視光領域の波長を有する光を照射することによって、構造異性体の異性化反応を制御することが可能である。より具体的には、可視光領域の波長を有する光を照射して構造異性体の異性化させることが可能であり、かつ、構造異性体の融解温度差ΔＴｍが大きいオリゴヌクレオチドを提供することができる。さらに、シス体の熱異性化特性も良好であり、可視光を用いてハイブリダイゼーションを良好に制御することができる。
　実施例２では、上記式（３）に示すオリゴヌクレオチドの一例として、下記式（３ａ）に示す、イソプロピルチオアゾベンゼンを含むオリゴヌクレオチドを例示して説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　（イソプロピルチオアゾベンゼンを含むオリゴヌクレオチドの合成）
　上記式（３ａ）に示す、イソプロピルチオアゾベンゼンを含むオリゴヌクレオチドは下記式（７）のスキームに従って合成した。合成に利用した化合物3-1-1～3-1-6は、下記式（７）に示す。なお、化合物3-1-2～3-1-6は、上記式（１４）に係るアゾベンゼン誘導体の一例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　（化合物3-1-１の合成）
　4-アミノベンゼンチオールを0.4g(3.19mmol)とり、約20mlのエタノールに溶解させ、トリエチルアミンを8ml加えた。これに、2-ヨードプロパンを0.38ml(1.2当量)滴下して、約７時間反応させた。その後、吸引ろ過し、減圧濃縮、真空乾燥後、シリカゲルカラムトグラフィー(展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝3：1、トリエチルアミン＝3体積%)で精製し、化合物3-1-1を得た。収量は0.22g(1.32mmol)であり、収率は41.4%であった。
　（化合物3-1-2の合成）
　化合物3-1-1を0.22g、エチル-p-ニトロソベンゾエートを0.32g(1.2当量)、酢酸溶液に溶解させ、室温で約3時間反応させた。薄層クロマトグラフィー（TLC）で反応の進行を確認した。反応後の溶液を減圧濃縮し液量を減らした後、酢酸エチルで抽出し、蒸留水1回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で3回、飽和塩化ナトリウム水溶液で2回分液した。その後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過、減圧濃縮、真空乾燥後、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝12：1）で精製し、化合物3-1-2を得た。収量は0.5g (1.52mmol)、収率はほぼ100%であった。
　（化合物3-1-3の合成）
　化合物3-1-2を0.5g、エタノールに溶解させ、2N水酸化ナトリウムを3.8ml(5当量) 加え、終夜撹拌した。その後、1N塩酸を加えて酸性にし、薄層クロマトグラフィーで反応を確認した後、溶液を減圧濃縮し、酢酸エチルで抽出し、分液（蒸留水で1回、塩化ナトリウムで２回）した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過、減圧濃縮、真空乾燥させて化合物3-1-3を得た。収量は0.41g(1.36mmol)であり、収率は89.8%であった。
　（化合物3-1-4の合成）
　化合物3-1-3を0.34g、L-スレオニノールを0.14g(1.2当量)、1－ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）を0.18g (1.2当量)、フラスコにとり、ジメチルホルムアミド（DMF）に溶かした。次に、ビーカーにジシクロヘキシルカルボジイミドを0.28g(1.36mmol)とり、フマル酸ジメチルに溶解させた。ジシクロヘキシルカルボジイミドを溶かした溶液をフラスコ側へゆっくり滴下し、終夜反応させた。その後、固体をろ過で除き、ろ液を減圧濃縮、真空乾燥させ、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒は、クロロホルム：メタノール＝9：1）で精製し、化合物3-1-4を得た。収量は0.50g(1.29mmol)、収率はほぼ100%であった。
　（化合物3-1-5の合成）
　化合物3-1-4（0.5g）を二口フラスコにとり、窒素置換し、脱水ピリジンに溶解させた。これにN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）を0.26 ml (1.2当量)加えた。別のフラスコにジメトキシトリチルクロリド(DMT-Cl)を0.50 g(1.2当量)、N,N-ジメチル-4-アミノピリジン（DMAP）を0.03 g(1.2当量)とり、窒素置換し、脱水ジクロロメタンに溶解させた。ジメトキシトリチルクロリドを溶解させた側のフラスコ内の溶液を、化合物3-1-4をとった側の二口フラスコの溶液へ、氷浴中でゆっくり滴下し、そのまま氷浴中で2 時間反応させた。薄層クロマトグラフィーで反応の進行を確認し、トルエンで2回共沸後、真空乾燥させ、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、トリエチルアミン=3体積%）で精製し、化合物3-1-5を得た。収量は0.52 g (0.75 mmol)、収率は58.4 %であった。
　（化合物3-1-6の合成）
　化合物3-1-5を0.28g、二口フラスコにとり、窒素置換し、適量の脱水アセトニトリルに溶かし、二回共沸を行った。ここに、シリンジでアミダイト化試薬（2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロアミダイト）を0.16ml加え、さらに脱水アセトニトリルで二回共沸を行った。その後、適量の脱水アセトニトリルに溶かした。また、別の梨型フラスコに1H-テトラゾールを0.034g (0.49mmol)とり、窒素置換、脱水アセトニトリルで二回共沸した後に脱水アセトニトリルに溶かした。氷浴中でテトラゾールをゆっくり滴下し、1時間反応させた。その後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和塩化ナトリウム水溶液で3回分液を行い、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過し、減圧濃縮、真空乾燥させて化合物3-1-6を得た。収率は、ほぼ100%であった。
　化合物3-1-6はアミダイトモノマーである。ＤＮＡ合成機を使用して、化合物3-1-6を用いて、上記式（７）に示す、イソプロピルチオアゾベンゼン残基（SiPr）を含むオリゴヌクレオチドを合成した。
　（比較例２－１）
　（イソブチルチオアゾベンゼンを含むオリゴヌクレオチドの合成）
　比較例２－１として、イソブチルチオアゾベンゼンを含むオリゴヌクレオチドを下記式（８）のスキームに従って合成した。合成に利用した化合物3-2-1～3-2-6は、下記式（８）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　（化合物3-2-1の合成）
　4-アミノベンゼンチオールを1.0gとり、エタノールに溶かし、炭酸ナトリウム水溶液を加えて溶液を塩基性にし(pH=8)、撹拌しながら終夜反応させた。反応後、減圧濃縮し液量を減らした後、酢酸エチルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で3回、飽和塩化ナトリウム水溶液で2回洗浄した。続いて有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮し、真空乾燥させた。これをシリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝1：1、トリエチルアミン=3体積%）で精製し、化合物3-2-1を得た。収量は0.35g(1.93mmol)、収率は24.2%であった。
　（化合物3-2-2の合成）
　化合物3-2-1を0.22g、エチル-p-ニトロソベンゾエートを0.26 g (1.2当量)とり、酢酸溶液に溶かし、約20 時間反応させた。これを酢酸エチルで抽出し、蒸留水で１回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で４回、飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄した。続いて有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮、真空乾燥させた。これをシリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝14:1）で精製し、化合物3-2-2を得た。収量は0.38g(1.11mmol)であり、収率は91.7%であった。
　（化合物3-2-3の合成）
　化合物3-2-2を0.38gとり、エタノール約10 mlに溶解させ、2N水酸化ナトリウム5 mlを加え、終夜反応させた。反応後、塩酸を加え、溶液のpHを7以下にして、酢酸エチルで抽出し、蒸留水で１回、飽和塩化ナトリウム水溶液で2回洗浄した。続いて有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮、真空乾燥させ、化合物3-2-3を得た。収量は0.36g(1.14mmol)、収率はほぼ100％であった。
　（化合物3-2-4の合成）
　0.36gの化合物3-2-3、0.12gのL-スレオニノール、0.18gの１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）を、ジメチルホルムアミド（DMF）に溶かした。別のフラスコに0.28gのジシクロヘキシルカルボジイミドをジメチルホルムアミドに溶かし、これを先のフラスコに少しずつ加え、終夜反応させた。その後、析出した固体をろ過し、減圧濃縮、真空乾燥させた。これをシリカゲルカラムトグラフィー(グラジエント法により、展開溶媒は、分析の進行に従って連続的に、クロロホルム：メタノール＝40:1から10:1に変えた)で精製し、化合物3-2-4を得た。収量は0.39g(0.97mmol)、収率は85.2%であった。
　（化合物3-2-5の合成）
　二口フラスコに化合物3-2-4を0.39gとり、窒素置換し、脱水ピリジン8mlに溶かした。これにN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）を0.19 ml加えた。別の二口フラスコにジメトキシトリチルクロリドを0.40g、N,N-ジメチル-4-アミノピリジン（DMAP）を0.023 gとり、窒素置換し、脱水ジクロロメタンを4ml加えて溶かした。それぞれ溶解させた後、化合物3-2-4を入れた二口フラスコとジメトキシトリチルクロリドを入れた二口フラスコとを針金状の細い管でつなぎ、氷浴しながらジメトキシトリチルクロリドを含む溶液を化合物3-2-4を入れた二口フラスコの溶液側にゆっくり滴下し、約3時間反応させた。反応後、これを酢酸エチルで抽出し、蒸留水で1回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で3回、飽和塩化ナトリウム水溶液で2回洗浄した。続いて有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮、真空乾燥させ、シリカゲルカラムトグラフィー（グラジエント法により、展開溶媒は、分析の進行に従って連続的に、ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝200:100:9から50:50:3に変えた）で精製した。収量は0.44g(0.63mmol)であり、収率は64.4%であった。
　（化合物3-2-6の合成）
　二口フラスコiに化合物3-2-5を0.24 g(0.34mmol)とり、窒素置換した。これに適量の脱水アセトニトリルを加え、二回共沸した後、アミダイト化試薬(2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロアミダイト)を1ml加え、脱水アセトニトリルでさらに共沸した後、脱水アセトニトリルに溶かした。別のフラスコiiに1H-テトラゾール0.29g(0.41mmol)を入れ、窒素置換、脱水アセトニトリルで二回共沸後、脱水アセトニトリルに溶かした。氷浴中でフラスコiiをiにゆっくり滴下し、氷浴をはずして約1時間反応させた。薄層クロマトグラフィーで確認し、減圧濃縮、真空乾燥させ、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝２：１、トリエチルアミン3体積%）で精製し、化合物3-2-6を得た。収率はほぼ100%であった。
　化合物3-2-6はアミダイトモノマーである。ＤＮＡ合成機を使用して、化合物3-2-6を用いて、上記式（８）に示すイソブチルチオアゾベンゼン残基（SiBu）を含むオリゴヌクレオチドを合成した。
　（比較例２－２）
　（ターシャリブチルチオアゾベンゼンを含むオリゴヌクレオチドの合成）
　比較例２－２として、ターシャリブチルチオアゾベンゼンを含むオリゴヌクレオチドを下記式（９）のスキームに従って合成した。合成に利用した化合物3-3-1～3-3-6は、下記式（９）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　（化合物3-3-1の合成）
　フラスコに水酸化ナトリウム(固体)を0.1g入れ、窒素置換した。それを脱水ジメチルホルムアミドに溶かし、2-メチル-2-プロパンチオールを0.17ml加え、水酸化ナトリウムが溶けるまで撹拌し、その後、4-フルオロニトロベンゼンを0.17ml加え、終夜反応させた。これを分液漏斗に移し、酢酸エチルで抽出し、蒸留水で1回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で3回、飽和塩化ナトリウム水溶液で3回、分液漏斗を使用して洗浄した。続いて有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮、真空乾燥させた。その後、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝20：1）で精製し、化合物3-3-1を得た。収量は0.33g(1.56mmol)、収率はほぼ100％であった。
　（化合物3-3-2の合成）
　化合物3-3-1を0.33gとり、エタノールに溶解させ、パラジウム担持カーボン（Pd/C）を適量加えた。次に、窒素風船内を満たした水素で反応系を水素置換し、終夜、激しく撹拌した。その後、ろ過でパラジウム担持カーボンを除き、減圧濃縮、真空乾燥後、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝10：1）で精製し、化合物3-3-2を得た。収量は0.21g(1.16mmol)、収率は74.2 %であった。
　（化合物3-3-3の合成）
　化合物3-3-2を0.21g、エチル-p-ニトロソベンゾエートを0.25gとり、氷酢酸に溶解させ、約2 時間反応させた。進行状況をは薄層クロマトグラフィーで確認し、酢酸エチルに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で４回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回、分液漏斗を使用して洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮、真空乾燥後、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝20：1）で精製し化合物3-3-3を得た。収量は0.40g(1.17mmol)、収率は73.9 %であった。
　（化合物3-3-4）
　化合物3-3-3の0.40gをエタノールに溶解させ、2N水酸化ナトリウムを3.5 ml(5当量)加え、終夜反応させた。進行を薄層クロマトグラフィーで確認し、塩酸を加え酸性にした後、酢酸エチルに溶解させ、飽和塩化ナトリウム水溶液で２回分液漏斗を使用して洗浄し、得られた有機層を硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、減圧濃縮、真空乾燥させて化合物3-3-4を得た。収量は0.40g(1.27mmol)、収率はほぼ100％であった。
　（化合物3-3-5）
　化合物3-3-4を0.40gとり、ジメチルホルムアミドに溶解させ、ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム（PyBOP：登録商標）を0.66g加え、20分間撹拌した。これに、フマル酸ジメチルと、トリエチルアミンに溶解させた4,4’-ジメトキシトリチル（DMT）-L-スレオニノールを0.41g(1当量)加え、終夜反応させた。薄層クロマトグラフィーで、反応の進行を確認し、減圧濃縮、真空乾燥後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物3-3-5を得た。(展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝３：２、トリエチルアミン=３体積%)。なおDMT-L-スレオニノールは、アンゲバンテケミーインターナショナルエディション（Angewandte Chemie International Edition）誌２０１０年第４９巻５５０２頁から５５０６頁記載の方法で合成した。収量は0.17g(0.24mmol)であり、収率は18.9 %であった。
　（化合物3-3-6）
　二口フラスコに化合物3-3-5を0.17g入れ、窒素置換し、適量の脱水アセトニトリルで2回共沸した。これにアミダイト化試薬（2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロアミダイト）0.09mlを加え、脱水アセトニトリルに溶解させた。また、梨型フラスコに1H-テトラゾールを0.02g入れ、同様に窒素置換し、適量の脱水アセトニトリルで2回共沸したのち脱水アセトニトリルに溶かした。この二口フラスコと梨型フラスコとを針金状の細い管でつなぎ、氷浴中で梨型フラスコの内容物を二口フラスコにゆっくり滴下した。その後、氷浴をはずし、約1時間反応させた。薄層クロマトグラフィーで反応の進行を確認し、減圧濃縮後、酢酸エチルで抽出し、蒸留水で1回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で2回、飽和塩化ナトリウム水溶液で2回、分液漏斗を使用して洗浄した。続いて硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、減圧濃縮、真空乾燥させ、もう一度脱水アセトニトリルで共沸し、化合物3-3-6を得た。収率はほぼ100%であった。
　この化合物3-3-6は、アミダイトモノマーである。ＤＮＡ合成機を使用して、化合物3-3-6を用いて、上記式（９）に示すターシャリブチルアゾベンゼン残基（StBu）を含むオリゴヌクレオチドを合成した。
　以下に合成した配列を示す。
1a-X:  5’-GGTATCXGCAATC-3’  (X = SiPr, SiBu, StBu)　（配列番号１）
1b-0:  3’-CCATAGCGTTAG-5’　                         （配列番号２）
　（光制御能力の評価）
　（ＵＶ－Ｖｉｓスペクトル）
　一本鎖状態での1a-iPr（実施例２）、1a-iBu（比較例２－１）および1a-tBu（比較例２－２）について、ＵＶ－Ｖｉｓを用いて吸収スペクトルを測定した結果を図２に示す。ここで、測定は、1a-Xの濃度は20μM、 塩化ナトリウムの濃度は100mM、pHは7.0 (10mM　ホスフェートバッファー)の条件で行った。
　図２に示すように、実施例２の1a-iPrおよび比較例２－２の1a-iBuでは、400nm付近に極大吸収を持つことが分かった。一方、比較例２－２の1a-tBuでは、極大吸収波長が350nm付近であり、極大吸収波長の長波長化は実現しなかった。実施例２と比較例２－２に係るアゾベンゼン誘導体の量子化学計算（Gaussian09W）を行い、立体構造を調べた。その結果、比較例２－２に係る化合物3-3-4では、ターシャリブチル基（tBu基）と硫黄原子（Ｓ）とを結ぶ結合がベンゼン環に対して垂直方向に出ているが、実施例２に係る化合物3-1-3ではイソプロピル基（iPr基）と硫黄原子（Ｓ）を結ぶ結合がベンゼン環と同一平面内に出ていることがわかった。量子化学計算の結果から、化合物3-3-4では、tBu基が嵩高いためベンゼン環の水素原子と立体障害を起こし、tBu基と硫黄原子とを結ぶ結合がベンゼン環と同一平面上に位置しないために硫黄原子の電子配置が変わっていることがわかる。このため、比較例２－２に係る化合物3-3-4では、電子供与性の効果が弱くなって、吸収波長が短くなっていると考えられる。一方、実施例２に係る化合物3-1-3では、iPr基はtBu基ほど嵩高くないために立体障害は無く、iPr基と硫黄原子とを結ぶ結合がベンゼン環と同一平面上に位置していることがわかる。このため、化合物3-1-3では、十分な電子供与効果による極大吸収波長の長波長化が実現したと考えられる。
　（ΔＴｍの評価）
　次に1a-X/1b-0二重鎖の融解温度Ｔｍを測定した。X=iPr（実施例２）, iBu（比較例２－１）ではトランス体からシス体への異性化は、溶液の温度を60℃に保ちつつ400nmの干渉フィルターを通したキセノンランプ光を10分間照射することで行った。この操作により60％以上がシス体に異性化したことを吸収スペクトルより確認した。X=tBu（比較例２－２）では、370nmの干渉フィルターを通したキセノンランプ光を5分間照射した。表３に、1a-X/1b-0の二重鎖の、光異性化に伴う融解温度の変化を示す。測定は、オリゴヌクレオチドの濃度は5μM、塩化ナトリウム濃度は100mM、pHは7.0 (10mMホスフェートバッファー)の条件で行った。その結果を表３に示す。なお、実施例２、比較例２－１、比較例２－２では、シス体がより安定であり、トランス体がより不安定であるので、ΔＴｍは負の値となっている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　表３に示すように、実施例２のイソプロピルチオアゾベンゼンを有するオリゴヌクレオチドを用いた系ではΔＴｍの絶対値が大きく、光制御能力が高かった。これに対し、比較例２－１のイソブチルチオアゾベンゼンを有するオリゴヌクレオチドを用いた系ではΔＴｍの絶対値が小さく、十分な光制御能力を示さなかった。また、比較例２－２のターシャリブチルチオアゾベンゼンを有するオリゴヌクレオチドを用いた系ではΔＴｍの絶対値は実施例２に係るＴｍよりも大きいが、図２に示すように、極大吸収波長が350nmであり、紫外線領域の波長であった。
　上記のとおり、実施例２に係るイソプロピルチオアゾベンゼンを有するオリゴヌクレオチドによれば、可視光領域の波長を有する光を照射することによって、構造異性体の異性化反応を制御することが可能である。より具体的には、可視光領域の波長を有する光を照射して構造異性体の異性化させることが可能であり、かつ、構造異性体の融解温度差ΔＴｍの絶対値が大きいオリゴヌクレオチドを提供することができる。
　実施例３では、上記式（４）に示すオリゴヌクレオチドの一例として、下記式（４ａ）によって示されるメチルチオアゾベンゼンをそれぞれ含む１対のオリゴヌクレオチドを例示して説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　上記式（４ａ）に対応するホスホアミダイトモノマーは、ケミストリー・ア・ヨーロピアンジャーナル（Chemistry A European Journal）誌2009年第１５巻１００９２頁から１０１０２頁記載の方法で合成し、同誌に記載の方法でオリゴヌクレオチド中に導入した。また同誌に記載されているように、上記式（４ａ）に示すオリゴヌクレオチドのアゾベンゼン誘導体を含む残基の極大吸収波長（ＵＶ－Ｖｉｓによる吸収スペクトルの極大吸収波長）は、水溶液中で398nmであった。
　以下に実際に合成した配列を示す。下記の配列中、「Ｓ」は、上記式（４ａ）に係るメチルチオベンゼンを含む残基を示している。オリゴヌクレオチドの配列1a-S、1b-Sは、メチルチオベンゼンを含む残基Ｓを１つ含んでいる。配列A4S、B4Sは、残基Sを４つ含んでいる。
1a-0:  5’-GGTATCGCAATC-3’　  （配列番号３）
1a-S:  5’-GGTATCSGCAATC-3’　 （配列番号１）
1b-0:  3’-CCATAGCGTTAG-5’　  （配列番号２）
1b-S:  3’-CCATAGSCGTTAG-5’　 （配列番号４）
A4S :  5’-CGSTTSAGSTTSCA-3’　（配列番号５）
B4S :  3’-GCSAASTCSAASGT-5’　（配列番号６）
　（ΔＴｍの評価）
　各オリゴヌクレオチド対の二重鎖融解温度Ｔｍは、ネイチャー・プロトコルズ(Nature Protocols)誌２００７年第２巻２０３ページから２１２ページに記載の方法で、260nmの吸光度の変化から求めた。シス体への異性化は、溶液の温度を60℃に保ちつつ400nmの干渉フィルターを通したキセノンランプ光を15分間照射することで行った。この操作により60%以上がシス体に異性化したことを吸収スペクトルより確認した。表４に、各種アゾベンゼン導入オリゴヌクレオチド二重鎖の融解温度Ｔｍを示す。測定は、塩化ナトリウム濃度は100mM、pHは7.0 (10mM　ホスフェートバッファー)の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　表４の左から３番目の列には、会合様式が記載されている。会合体型とは、図３に示すように、１対のオリゴヌクレオチドがそれぞれ有するメチルチオアゾベンゼンを含む残基が会合するように複合体が形成される場合を示している。楔型とは、図４に示すように、メチルチオアゾベンゼンを含む残基が、相補的な天然のヌクレオチドの配列中に単独で楔状に配置されるように複合体が形成される場合を示している。図４では、１対の相補的な構造を有するオリゴヌクレオチド３０，３１は、上記式（４ａ）に示されるアゾベンゼン誘導体の残基１と、相補的な天然のヌクレオチド２、４と、相補的な天然のヌクレオチド３，５とを備えている。１対のオリゴヌクレオチド３０，３１が複合体４０になると、残基１は、結合した相補的な１対のヌクレオチドの間に１つずつ楔状に入り込む。
　表４に示すように、楔型（1a-S/1b-0）の比較例３－２ではトランス体からシス体への異性化に伴うＴｍの変化（ΔＴｍ）は0.9℃であり、光制御能力は殆どなかった。それに対し実施例３－１に係る会合体型（1a-S/1b-S）ではΔＴｍが9.3℃と大きくなっていた。残基Sを１つずつ含むオリゴヌクレオチド1a-Sとオリゴヌクレオチド1b-Sとをハイブリダイゼーションさせ、会合する残基Ｓが１対のみの場合でさえ、十分な光制御能力が得られた。さらに、実施例３－２に係る会合体型（A4S/B4S）では、ΔＴｍが54.0℃以上であり、著しく大きかった。この結果より、光制御能力は、残基Sの会合体の対の数を増やすことで飛躍的に増加することが分かった。残基Sの会合体の数を増やすことによって、二重鎖の形成と解離のほぼ完全なOn-Off光制御を実現できた。
　実施例４では、上記式（３）に示すオリゴヌクレオチドの一例として、下記式（３ｂ）に示す、シクロヘキシルチオアゾベンゼンを含むオリゴヌクレオチドを例示して説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　（シクロヘキシルチオアゾベンゼンを含むオリゴヌクレオチドの合成）
　上記式（３ｂ）に示す、シクロヘキシルチオアゾベンゼンを含むオリゴヌクレオチドは下記式（２０）のスキームに従って合成した。合成に利用した化合物1-1-1～1-1-6は、下記式（２０）に示す。なお、化合物1-1-2～1-1-6は、上記式（１４）に係るアゾベンゼン誘導体の一例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　（化合物1-1-１の合成）
4-アミノベンゼンチオールを0.64g(5mmol)とり、約10mlの脱水ジメチルホルムアミドに窒素雰囲気下で溶解させ、氷浴中で水素化ナトリウム 0.19 g(8mmol)を少しずつ加え、そのまま３０分間撹拌を続けた。これを氷浴で冷やしながらクロロシクロヘキサン0.79 mlを滴下した後、氷浴を外して温度を室温に戻して終夜反応させた。その後、減圧濃縮、真空乾燥後、シリカゲルカラムトグラフィー(展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝3：1、トリエチルアミン＝3体積%)で精製し、化合物1-1-1を得た。収量は0.58g (2.8mmol)、収率は56%であった。
　（化合物1-1-2の合成）
　化合物1-1-1を0.58g(2mmol)、エチル-p-ニトロソベンゾエートを0.6g(1.2当量)、クロロホルムに溶解させた後に、酢酸を10mL加えて室温で終夜反応させた。減圧濃縮、真空乾燥後、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝13：1）で精製し、化合物3-1-2を得た。収量は0.65g (1.77mmol)、収率は63%であった。
　（化合物1-1-3の合成）
　化合物1-1-2を0.65g、エタノールに溶解させ、水酸化ナトリウムを加えて塩基性にした後、３日間加水分解した。その後、塩酸を加えて酸性にし、薄層クロマトグラフィーで反応を確認した後、溶液を減圧濃縮し、酢酸エチルで抽出し、分液（蒸留水で1回、塩化ナトリウムで２回）した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過、減圧濃縮、真空乾燥させて化合物1-1-3を得た。収量は0.52g(1.22mmol)であり、収率は92 %であった。
　（化合物1-1-4の合成）
　化合物1-1-3を0.45g、L-スレオニノールを0.15g(1.1当量)、1－ヒドロキシベンゾトリアゾールを0.24g (1.2当量)、フラスコにとり、ジメチルホルムアミドに溶かした。次に、ビーカーにジシクロヘキシルカルボジイミドを0.32g(1.55mmol)とり、ジメチルホルムアミドに溶解させた。ジシクロヘキシルカルボジイミドを溶かした溶液をフラスコ側へゆっくり滴下し、終夜反応させた。その後、固体をろ過で除き、ろ液を減圧濃縮、真空乾燥させ、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒は、クロロホルム：メタノール＝9：1）で精製し、化合物1-1-4を得た。収量は0.52g(1.22mmol)、収率は92%であった。
　（化合物1-1-5の合成）
　化合物1-1-4を二口フラスコにとり、窒素置換し、脱水ピリジン8mlに溶解させた。これにN,N-ジイソプロピルエチルアミンを0.25 ml (1.2当量)加えた。別のフラスコにジメトキシトリチルクロリドを0.50 g(1.2当量)、N,N-ジメチル-4-アミノピリジンを0.03 g(1.2当量)とり、窒素置換し、脱水ジクロロメタンに溶解させた。ジメトキシトリチルクロリドを溶解させた側のフラスコ内の溶液を、化合物1-1-4をとった側の二口フラスコの溶液へ、氷浴中でゆっくり滴下し、そのまま氷浴中で2 時間反応させた。薄層クロマトグラフィーで反応の進行を確認し、トルエンで2回共沸後、真空乾燥させ、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、トリエチルアミン=3体積%）で精製し、化合物1-1-5を得た。収量は0.52 g (0.71mmol)、収率は58%であった。
　（化合物1-1-6の合成）
　化合物1-1-5を0.15g、二口フラスコにとり、窒素置換し、適量の脱水テトラヒドロフランに溶解させた。その後、トリエチルアミンを0.25ml（5当量）加え、これを氷浴して、アミダイト化試薬（2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロアミダイト）を0.16ml加え、氷浴をはずして室温でさらに1時間反応させた。さらに、酢酸エチルで抽出した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で1回、飽和塩化ナトリウム水溶液で1回分液を行い、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過し、減圧濃縮、真空乾燥させ、脱水アセトニトリルで共沸し、化合物1-1-6を得た。収率は、ほぼ100%であった。
　化合物1-1-6はアミダイトモノマーである。ＤＮＡ合成機を使用して、化合物1-1-6を用いて、上記式（２０）に示す、シクロヘキシルチオアゾベンゼン残基（Scyc）を含むオリゴヌクレオチドを合成した。
　実施例５では、上記式（３）に示すオリゴヌクレオチドの一例として、下記式（３ｃ）に示す、アダマンチルチオアゾベンゼンを含むオリゴヌクレオチドを例示して説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　（アダマンチルチオアゾベンゼンを含むオリゴヌクレオチドの合成）
　上記式（３ｂ）に示す、アダマンチルチオアゾベンゼンを含むオリゴヌクレオチドは下記式（２１）のスキームに従って合成した。合成に利用した化合物2-1-1～2-1-6は、下記式（２１）に示す。なお、化合物2-1-2～2-1-6は、上記式（１４）に係るアゾベンゼン誘導体の一例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　（化合物2-1-１の合成）
　4-アミノベンゼンチオールを1.56g(12.4mmol)とり、12mlの脱水ジメチルホルムアミドに窒素雰囲気下で溶解させ、氷浴中で水素化ナトリウム 0.19 g(8mmol)を少しずつ加え、そのまま３０分間撹拌を続けた。これを氷浴で冷やしながらブロモアダマンタンのジメチルホルムアミド溶液を滴下した後、氷浴を外して温度を室温に戻して２日間反応させた。その後、薄層クロマトグラフィーで反応を確認した後、減圧濃縮、真空乾燥を行い、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で分液を行った後で、シリカゲルカラムトグラフィー(展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝4：1、トリエチルアミン＝3体積%)で精製し、化合物2-1-1を得た。収量は6.9mmol、収率は56%であった。
　（化合物2-1-2の合成）
　化合物2-1-1を1.79g(6.9mmol)、エチル-p-ニトロソベンゾエートを1.36g(1.2当量)、氷酢酸に溶解させ、２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィーで反応を確認した後、減圧濃縮、真空乾燥し、酢酸エチルに溶解させた後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で2回、飽和塩化ナトリウム水溶液で1回洗浄を行い、硫酸マグネシウムで乾燥、減圧濃縮、真空乾燥させ、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝18：1）で精製し、化合物2-1-2を得た。
　（化合物2-1-3の合成）
　化合物2-1-2を0.65g、エタノールに溶解させ、水酸化ナトリウムを加えて塩基性にした後、３日間加水分解した。その後、塩酸を加えて酸性にし、薄層クロマトグラフィーで反応を確認した後、溶液を減圧濃縮し、酢酸エチルで抽出し、洗浄（蒸留水で1回、塩化ナトリウムで２回）した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過、減圧濃縮、真空乾燥させて化合物2-1-3を得た。
　（化合物2-1-4の合成）
　化合物2-1-3を1.0g、L-スレオニノールを0.29g(1.1当量)、1－ヒドロキシベンゾトリアゾールを0.47g (1.2当量)、フラスコにとり、ジメチルホルムアミドに溶かした。次に、ビーカーにジシクロヘキシルカルボジイミドを0.63g(1.2mmol)とり、ジメチルホルムアミドに溶解させた。ジシクロヘキシルカルボジイミドを溶かした溶液をフラスコ側へゆっくり滴下し、終夜反応させた。その後、固体をろ過で除き、ろ液を減圧濃縮、真空乾燥させ、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒は、クロロホルム：メタノール＝15：1）で精製し、化合物2-1-4を得た。収率はほぼ100%であった。
　（化合物2-1-5の合成）
　化合物2-1-4を二口フラスコにとり、窒素置換し、脱水ピリジンに溶解させた。これにN,N-ジイソプロピルエチルアミンを0.63 ml加えた。別のフラスコにジメトキシトリチルクロリドを1.25 g(1.2当量)、N,N-ジメチル-4-アミノピリジンを0.75 g(0.2当量)とり、窒素置換し、脱水ジクロロメタンに溶解させた。ジメトキシトリチルクロリドを溶解させた側のフラスコ内の溶液を、化合物1-1-4をとった側の二口フラスコの溶液へ、氷浴中でゆっくり滴下し、そのまま氷浴中で2 時間反応させた。薄層クロマトグラフィーで反応の進行を確認し、トルエンで2回共沸後、真空乾燥させ、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、トリエチルアミン=3体積%）で精製し、化合物2-1-5を得た。収量は1.44 g (1.84mmol)、収率は59.8%であった。
　（化合物2-1-6の合成）
　化合物2-1-5を0.23g、二口フラスコにとり、窒素置換し、適量の脱水テトラヒドロフランに溶解させた。その後、トリエチルアミンを0.21ml（5当量）加え、これを氷浴して、アミダイト化試薬（2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロアミダイト）を0.13ml加え、氷浴をはずして室温でさらに1時間反応させた。さらに、酢酸エチルで抽出した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で1回、飽和塩化ナトリウム水溶液で1回分液を行い、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過し、減圧濃縮、真空乾燥させ、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒は、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、トリエチルアミン=3体積%）で精製し、化合物2-1-6を得た。収率は、ほぼ100%であった。
　化合物2-1-6はアミダイトモノマーである。ＤＮＡ合成機を使用して、化合物2-1-6を用いて、上記式（２１）に示す、シクロヘキシルチオアゾベンゼン残基（Sadm）を含むオリゴヌクレオチドを合成した。
　以下に合成した配列を示す。
1a-X:  5’-GGTATCXGCAATC-3’  (X = Scyc, Sadm)　（配列番号１）
1b-0:  3’-CCATAGCGTTAG-5’　                    （配列番号２）
　（光制御能力の評価）
　（ＵＶ－Ｖｉｓスペクトル）
　実施例４の1a-Scycおよび実施例５の1a-Sadmでは、400nm付近に極大吸収を持つことが分かった。
　（ΔＴｍの評価）
　次に1a-X/1b-0二重鎖の融解温度Ｔｍを測定した。X= Scyc（実施例４）, Sadm（実施例５）ではトランス体からシス体への異性化は、溶液の温度を60℃に保ちつつ400nmの干渉フィルターを通したキセノンランプ光を10分間照射することで行った。この操作により60％以上がシス体に異性化したことを吸収スペクトルより確認した。表５に、1a-X/1b-0の二重鎖の、光異性化に伴う融解温度の変化を示す。測定は、オリゴヌクレオチドの濃度は5μM、塩化ナトリウム濃度は100mM、pHは7.0 (10mMホスフェートバッファー)の条件で行った。なお、実施例４、５では、シス体がより安定であり、トランス体がより不安定であるので、ΔＴｍは負の値となっている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
　表３，５に示すように、実施例４に係るシクロヘキシルチオアゾベンゼンを有するオリゴヌクレオチドおよび実施例５に係るアダマンチルチオアゾベンゼンを有するオリゴヌクレオチドによれば、実施例２に係るイソプロピルチオアゾベンゼンを有するオリゴヌクレオチド以上に、ΔＴｍの絶対値が大きく、光制御能力が高かった。実施例４および実施例５に係る環状炭化水素基を有するオリゴヌクレオチドによれば、実施例２に係る直鎖の炭化水素よりもΔＴｍの絶対値が大きくなり、光制御能力が高いオリゴヌクレオチドを提供することができる。
　以上、本発明の実施例について詳細に説明したが、これらは例示に過ぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
　本明細書または図面に説明した技術要素は、単独であるいは各種の組合せによって技術的有用性を発揮するものであり、出願時請求項記載の組合せに限定されるものではない。また、本明細書または図面に例示した技術は複数目的を同時に達成し得るものであり、そのうちの一つの目的を達成すること自体で技術的有用性を持つものである。
配列番号１～６：合成オリゴヌクレオチド

Claims (14)

  1. 　下記式（１）または（２）によって示される、アゾベンゼン誘導体を含むオリゴヌクレオチド。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ａ１，Ａ２はそれぞれ独立に水素原子、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｂ１およびＢ２はそれぞれ独立に水酸基、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に炭素原子数１～２０のアルキル基を表し、Ｒ２１およびＲ２２はそれぞれ独立に水素原子または炭素原子数１～２０のアルキル基を表し、Ｒ１３～Ｒ１８、Ｒ２３～Ｒ２８はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。）
  2. 　Ｒ１３～Ｒ１８およびＲ２３～Ｒ２８は、いずれも水素原子である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 　Ｒ１１およびＲ１２は、いずれもメチル基である、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 　下記式（３）によって示される、アゾベンゼン誘導体を含むオリゴヌクレオチド。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （Ａ３は水素原子、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｂ３は水酸基、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｒ３１およびＲ３２はそれぞれ独立に炭素原子数１～２０のアルキル基、またはＲ３１、Ｒ３２は互いに結合して硫黄原子に連結する炭素原子とともに炭素数５～４０の環状アルキル基またはアリール基を表し、Ｒ３３～Ｒ４０はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。）
  5. 　Ｒ３１、Ｒ３２は互いに結合して硫黄原子に連結する炭素原子とともにシクロヘキシル基またはアダマンチル基を表す、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 　Ｒ３１およびＲ３２は、それぞれ独立に炭素原子数１～４のアルキル基を表し、
    　Ｒ３３～Ｒ４０は、いずれも水素原子である、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
  7. 　Ｒ３１およびＲ３２は、いずれもメチル基である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを備える、可視光照射によって二重鎖の形成と解離とを制御できる光スイッチング剤。
  9. 　相補的な配列を有し、複合体を形成する１対のオリゴヌクレオチドであって、
    　前記１対のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、下記式（２）または（４）によって示される少なくとも１つのアゾベンゼン誘導体を対合する位置に有する、前記１対のオリゴヌクレオチドを備える、可視光照射によって二重鎖の形成と解離とを制御できる光スイッチング剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ａ２、Ａ４はそれぞれ独立に水素原子、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｂ２、Ｂ４はそれぞれ独立に水酸基、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｒ２１およびＲ２２はそれぞれ独立に水素原子または炭素原子数１～２０のアルキル基を表し、Ｒ２３～Ｒ２８、Ｒ４１～Ｒ４８はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。）
  10. 　Ｒ４３，Ｒ４４はメチル基もしくは水素原子を表し、Ｒ４１，Ｒ４２およびＲ４５～Ｒ４８は、いずれも水素原子である、請求項９に記載の光スイッチング剤。
  11. 　前記１対のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、２つ以上のヌクレオチドを介して隣接する２つ以上の前記アゾベンゼン誘導体を有する、請求項９または１０に記載の光スイッチング剤。
  12. 　下記式（１１）によって示される、アゾベンゼン誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、Ｘ１は、水酸基または下記式（１２）に示される基のいずれかを表し、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立に炭素原子数１～２０のアルキル基を表し、Ｒ１３～Ｒ１８はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式中、Ｃ１は、水素原子または水酸基保護基を表し、Ｄ１は、水素原子、水酸基保護基、ホスホアミダイト基または固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。）
  13. 　下記式（１３）によって示される、アゾベンゼン誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式中、Ｃ２は、水素原子または水酸基保護基を表し、Ｄ２は、水素原子、水酸基保護基、ホスホアミダイト基または固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表し、Ｒ２１およびＲ２２はそれぞれ独立に水素原子または炭素原子数１～２０のアルキル基を表し、Ｒ２３～Ｒ２８はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。）
  14. 　下記式（１４）によって示される、アゾベンゼン誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （式中、Ｘ２は、水酸基または下記式（１５）に示される基のいずれかを表し、Ｒ３１およびＲ３２はそれぞれ独立に炭素原子数１～２０のアルキル基、またはＲ３１、Ｒ３２は互いに結合して硫黄原子に連結する炭素原子とともに炭素数５～４０の環状アルキル基またはアリール基を表し、Ｒ３３～Ｒ４０はそれぞれ独立に、水素原子；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１～２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２～２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （式中、Ｃ３は、水素原子または水酸基保護基を表し、Ｄ３は、水素原子、水酸基保護基、ホスホアミダイト基または固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。）
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