CN109336921A

CN109336921A - Dna碱基类似物、用途及其合成方法

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Publication number: CN109336921A
Application number: CN201810968214.6A
Authority: CN
Inventors: 杨朝勇; 马艳丽; 李婷玉; 吕哲豪; 邹远; 朱志
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2018-08-23
Filing date: 2018-08-23
Publication date: 2019-02-15
Anticipated expiration: 2038-08-23
Also published as: CN109336921B

Abstract

本发明涉及到一种DNA碱基类似物、用途及其合成方法，该DNA碱基类似物结构式如下所示：该DNA碱基类似物可以利用DNA合成仪嵌入修饰到DNA序列中。利用嵌入序列中的偶氮苯基团在可见光范围内(绿光和蓝光)顺反异构的变化，进行无侵入性、可逆性地调控DNA杂交，进而调控相关的酶活性等生物学反应。本发明具有合成方法简单，时间短，成本低，可见光范围内进行顺反异构体的调控及其光调控效率高等优点，在调控一些生物学酶方面具有广泛的应用前景。

Description

DNA碱基类似物、用途及其合成方法

技术领域

本发明涉及一种DNA碱基类似物、用途及其合成方法。

背景技术

偶氮苯化合物是一类偶氮基两端连接苯基的一类化合物。没有修饰的偶氮苯分子，在紫外光区域有很强的π-π*跃迁，而在可见光区域显示较弱的n-π*跃迁。偶氮苯类化合物有反式(trans)和顺式(cis)两种异构体，其中，反式异构体具有平面结构，而顺式异构体具有非平面结构。通常，反式异构体相对稳定一些，在紫外光照射条件下，可以转变为顺式异构体；反之，可见光照射或者加热条件下，热力学不稳定的顺式异构体又会转化为稳定的反式异构体。利用偶氮苯分子这种顺反异构体的光学调控性能，是生物分析研究的热点。

偶氮苯分子具有很大的共轭π体系以及大量的电子云堆积。将偶氮苯分子嵌入到DNA链中后，通过苯环上电子云与DNA碱基的电子云堆积作用，使得嵌入有偶氮苯的DNA能够很好的和其互补DNA进行杂交。当受到紫外光照射时，偶氮苯分子发生从反式异构体到顺式异构体的转变，偶氮苯分子这种构型上的变化破坏了偶氮苯分子与碱基的非共价作用，破坏DNA碱基之间的杂交，最终使得杂交的DNA链解链。而当再经过可见光光照时，偶氮苯分子又从顺式异构体转变为反式异构体，又重新使得双链DNA进行杂交。这种通过光条件的控制，可以实现DNA的杂交与解链。相比于其他调控方式，这种调控方式具有简单快捷，时空分辨率高，且非侵袭性等优点。对于光调控核酸酶相关反应体系，具有非常广泛的应用前景。

但是常规的偶氮苯分子由于光调控的条件需要紫外光作为光源，而紫外光对于生物体系具有非常大的伤害，不仅使得蛋白质变性而且会导致核酸断裂等。

发明内容

本发明的目的是提供一个具有可见光调控顺反异构的DNA碱基类似物及其合成方法。其中，所述的DNA碱基类似物结构式如下所示，

本发明中所合成的DNA碱基类似物能够方便且高效的利用DNA合成仪嵌入到DNA链中，在绿光(515～535nm)照射后，生成顺式异构体，破坏DNA杂交；而再经过蓝光(445～465nm)照射后，又回到反式异构体构象，恢复DNA杂交。本发明设计的偶氮苯DNA碱基类似物能够嵌入到DNA链中的任何位置，并通过嵌入偶氮苯分子数目和嵌入位置的设计，来最优地实现在可见光区域内对DNA杂交的光调控效果，进而对相关的生物学反应进行有效的光调控。

优选地，本发明的DNA碱基类似物的合成路线优选如下：

在四甲氧基偶氮苯羧酸类似物的基础上合成DNA碱基类似物。利用二环己基碳二亚胺(DCC)和1-羟基苯并三氮唑(HOBt)催化酰胺反应连接上D-苏氨醇，形成中间产物AZO-02；在中间产物AZO-02的基础上，引入4-4’-二甲氧基三苯基氯甲烷，以吡啶和二氯甲烷为溶剂，4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化作用下，得到中间产物AZO-03。在中间产物AZO-03的基础上，引入2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺。以N,N-二异丙基乙基胺为碱和催化剂，二氯甲烷为溶剂，在无水无氧反应条件下，得到最终产物AZO-04。其合成路线如下所示：

优选地，步骤一，在偶氮苯羧酸类似物(AZO-01)的基础上引入原料D-苏氨醇作为骨架，合成带有两个羟基的中间产物。利用N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和1-羟基苯并三氮唑(HOBt)的缩合作用形成酰胺键，得到中间产物AZO-02。

优选地，步骤一包括：AZO-01，D-苏氨醇，二环己基碳二亚胺，1-羟基苯并三唑和4-二甲氨基吡啶以摩尔比1-5:1-5:1-5:1-5:0.1-1的比例混合，并向其中加入适量的无水THF和甲醇，室温搅拌反应过夜；反应结束后，过滤除去沉淀，得到AZO-02。

优选地，步骤二，在中间产物AZO-02的基础上，引入原料4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷，以吡啶和二氯甲烷为溶剂，4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化作用下，得到中间产物AZO-03。

优选地，步骤二包括：AZO-02和4-二甲氨基吡啶以摩尔比1:0.01-0.1的比例混合，容器去除空气后，加入1-10倍体积的吡啶；得到第一溶液；

和AZO-2相比、摩尔比为1-2的4,4'-二甲氧基三苯甲基氯在另一容器中，抽排除去空气，再加入1-10倍体积二氯甲烷，得到第二溶液；之后将该第二溶液逐滴滴加到第一溶液中，避光室温搅拌反应过夜；反应结束后，用水和乙酸乙酯进行萃取，保留有机相并用干燥，而后除去有机溶剂，得到产物AZO-03。

优选地，步骤三，在中间产物AZO-03的基础上引入原料2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺；以N,N-二异丙基乙基胺为碱和催化剂，二氯甲烷为溶剂，在无水无氧反应条件下，得到最终产物AZO-04。

优选地，步骤三中：在一容器中加入AZO-03，在氮气保护下加入1-20倍体积二氯甲烷；在冰水浴条件下，逐滴加入2-10倍摩尔比的N,N-二异丙基乙基胺和0.5-2倍摩尔比的2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，冰浴中反应2～4h，得到AZO-4。

本发明具有以下优点：

1、合成原料廉价，步骤简单可行；

2、分子嵌入到DNA链中后，偶氮苯可以通过绿光和蓝光对其顺反异构体进行调控，进而对DNA杂交与解链进行调控；无需使用紫光，避免了紫光对生物体系的伤害。

3、可以根据需要利用DNA合成仪嵌入到DNA序列的任何一个位置；

4、本发明方法嵌入的偶氮苯，R位可以是-H，-OCH₃，-CH₃，-SCH₃等，不影响其对嵌入DNA的光调控效果。

附图说明

图1为最终产物AZO-04的¹H NMR谱图。

图2为最终产物AZO-04的³¹P NMR谱图。在图2中，147ppm和148ppm为phosphoramidite的特征峰，14ppm为副产物的特征峰。

图3为修饰有偶氮苯碱基类似物的DNA HPLC纯化结果。其中，①表示260nm吸收峰，②表示490nm(偶氮苯分子)吸收峰。

图4为修饰有偶氮苯碱基类似物的DNA经过不同时间的绿光(515-535nm,25mW/cm²)照射的HPLC表征结果。其中，①-⑥表示照射时间依次为0min，1.5min,3min,5min,10min,15min,30min和60min，通过积分面积计算，cis(％)含量逐渐增加，从而得到较佳的绿光光照时间为30min。

图5为修饰有偶氮苯碱基类似物的DNA先经过30min的绿光照射，然后经过不同时间蓝光(445-465nm,25mW/cm²)照射的HPLC表征结果。其中，①-④表示照射时间依次为0min，2.5min,5min和7.5min，通过积分面积计算，可得到cis(％)含量逐渐降低，从而得到较佳的蓝光光照时间为5min。

图6为修饰有偶氮苯碱基类似物的DNA先经过绿光光照(515-535nm,25mW/cm²,30min)，经过不同的时间后顺式构象的浓度逐渐降低。根据ln[cis]与时间的作图得到的斜率，即为顺式构象向反式构象转化的表观转换速率K_obs，然后根据τ_1/2＝ln 2/K_obs，进而得到顺式到反式的转化的半衰期τ_1/2＝46.2h。

具体实施方式

以R＝OCH₃为例，合成路线如下

1、合成产物AZO-02，其合成路线如下：

在一圆底烧瓶中加入AZO-01(390mg,1.0mmol)，D-苏氨醇(106mg,1.0mmol)，二环己基碳二亚胺(DCC,247mg,1.2mmol)，1-羟基苯并三唑(HOBT,162mg,1.2mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP,24mg,0.2mmol)，并向其中加入适量的无水四氢呋喃和甲醇，室温搅拌反应过夜。反应结束后，过滤除去沉淀，粗产品再用硅胶色谱柱进行分离纯化，核磁和质谱进行表征。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ＝6.97(s,2H),6.20(s,2H),4.24(m,2H),4.22(m,2H),3.88(s,3H),3.86(s,6H),3.72(s,6H),1.23(d,3H).ESI-MS Calculated for C₂₂H₃₀N₃O₈:464.2([M+H]⁺),found:464.8。

2、合成产物AZO-03，其合成路线如下：

在一圆底烧瓶中加入AZO-02(463mg,1.0mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，6.1mg,0.05mmol)抽排除去空气，而后向其中加入2mL吡啶(pyridine)。将4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(DMT-Cl,339mg,1.0mmol)称量到另外一个小圆底烧瓶中，抽排除去空气，再加入2mL二氯甲烷(DCM)。之后将DMT-Cl溶液逐滴滴加到AZO-02溶液中，避光室温搅拌反应过夜。反应结束后，用水和乙酸乙酯进行萃取，保留有机相并用无水Na₂SO₄干燥，而后除去有机溶剂，粗产品再用硅胶色谱柱进行分离纯化，核磁和质谱进行表征。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ＝7.40(m,2H),7.29(m,5H),7.19(m,2H),7.11(s,2H),6.89(d,1H),6.80(m,4H),6.22(s,2H),4.20(m,1H),3.86(m,15H),3.76(d,6H),3.55(dd,1H),3.35(dd,1H),3.22(d,1H),1.21(d,3H).ESI-MS Calculated for C₄₃H₄₇N₃O₁₀:766.3([M+H]⁺),found:766.3。

3、合成产物AZO-04，其合成路线如下：

在一圆底烧瓶中加入AZO-03(765mg,1.0mmol)，在氮气保护下加入5mL二氯甲烷。在冰水浴条件下，逐滴加入N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA,516mg,4mmol)和2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(237mg,1.0mmol)，冰浴中反应2～4h，用硅胶色谱柱进行分离纯化，核磁和质谱进行表征，如图1，2。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ＝7.43(m,2H),7.31(d,4H),7.28(m,1H),7.22(m,1H),7.09(s,1H),7.05(s,1H),6.81(m,5H),6.22(s,2H),4.48(m,1H),4.38(m,1H),3.86(m,8H),3.83(m,6H),3.77(s,6H),3.53(m,4H),1.28(m,6H),1.13(m,12H),1.01(d,2H).ESI-MS Calculated for C₅₂H₆₅N₅O₁₁P:966.4([M+H]⁺),found:966.7。

4、将最终产物AZO-04应用于DNA合成仪中合成。

设计合成一条带有产物AZO-04的DNA寡核苷酸，序列如下：5’-GGT ATC X GCCTAA-3’，其中X为产物AZO-04，该序列命名为mAZO-DNA。产物AZO-04的插入使用的是常规的DNA合成程序，只有偶联时间延长至900s。合成结束后，先用甲胺/氨水(v/v,1/1)将DNA序列从固相载体CPG上切割下来，再抽去甲胺/氨水，用0.1mol/L醋酸三乙胺(TEAA)溶解，过膜后用HPLC进行分离纯化，如图3。

5、不同时间绿光光照调控的HPLC表征实验。

将6个50μL 10μM mAZO-DNA(PBS缓冲溶液：100mM NaCl,100mM磷酸盐,5mM MgCl₂,pH 7.4)样品，在25mW/cm²功率的绿光(515nm～535nm)条件下分别照射不同时间(0,5min,10min,15min,30min,60min)，然后分别进行HPLC分析表征，结果如图4。

6、不同时间蓝光光照调控的HPLC表征实验。

将4个50μL 10μM mAZO-DNA(PBS缓冲溶液：100mM NaCl,100mM磷酸盐,5mM MgCl₂,pH 7.4)样品，先在25mW/cm²功率的绿光条件下照射30min,而后经过不同时间(0,2.5min,5min,7.5min)蓝光(445nm～465nm,25mW/cm²功率)光照，然后分别进行HPLC分析表征，结果如图5。

7、对嵌入到DNA中的偶氮苯，其顺式到反式的转化的半衰期的计算。

将8个50μL 10μM mAZO-DNA(PBS缓冲溶液：100mM NaCl,100mM磷酸盐,5mM MgCl₂,pH 7.4)样品，在25mW/cm²功率的绿光条件下照射30min，然后在光照结束后的不同时间点分别进行HPLC表征，通过峰面积的统计和计算，得到嵌入到DNA中的偶氮苯，其顺式到反式的转化的半衰期，如图6。

Claims

1.DNA碱基类似物，其结构式如下：

2.如权利要求1所述的DNA碱基类似物的用途，用于DNA杂交与解链的调控。

3.如权利要求1所述的DNA碱基类似物的使用方法，采用绿光照射，生成顺式异构体；蓝光照射，回到反式异构体构象。

4.DNA碱基类似物的制备方法，包括如下合成步骤：

5.如权利要求4所述的DNA碱基类似物的制备方法，其特征在于：

步骤一，在偶氮苯羧酸类似物的基础上引入原料D-苏氨醇作为骨架，合成带有两个羟基的中间产物；用N,N'-二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三氮唑的缩合作用形成酰胺键，得到中间产物AZO-02。

6.如权利要求4所述的DNA碱基类似物的制备方法，其特征在于：步骤一包括：AZO-01，D-苏氨醇，二环己基碳二亚胺，1-羟基苯并三唑和4-二甲氨基吡啶以摩尔比1-5:1-5:1-5:1-5:0.1-1的比例混合，并向其中加入适量的无水THF和甲醇，室温搅拌反应过夜；反应结束后，过滤除去沉淀，得到AZO-02。

7.如权利要求4所述的DNA碱基类似物的制备方法，其特征在于：步骤二，在中间产物AZO-02的基础上，引入原料4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷，以吡啶和二氯甲烷为溶剂，4-二甲氨基吡啶的催化作用下，得到中间产物AZO-03。

8.如权利要求7所述的DNA碱基类似物的制备方法，其特征在于：步骤二包括：AZO-02和4-二甲氨基吡啶以摩尔比1:0.01-0.1的比例混合，容器去除空气后，加入1-10倍体积的吡啶；得到第一溶液；

相对于AZO-2摩尔比为1-2的4,4'-二甲氧基三苯甲基氯在另一容器中，抽排除去空气，再加入1-10倍体积二氯甲烷，得到第二溶液；之后将该第二溶液逐滴滴加到第一溶液中，避光室温搅拌反应过夜；反应结束后，用水和乙酸乙酯进行萃取，保留有机相并用干燥，而后除去有机溶剂，得到产物AZO-03。

9.如权利要求4所述的DNA碱基类似物的制备方法，其特征在于：步骤三，在中间产物AZO-03的基础上引入原料2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺；以N,N-二异丙基乙基胺为碱和催化剂，二氯甲烷为溶剂，在无水无氧反应条件下，得到最终产物AZO-04。

10.如权利要求9所述的DNA碱基类似物的制备方法，其特征在于：步骤三中，在一容器中加入AZO-03，在氮气保护下加入1-20倍体积二氯甲烷；在冰水浴条件下，逐滴加入2-10倍摩尔比的N,N-二异丙基乙基胺和0.5-2倍摩尔比的2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，冰浴中反应2～4h，得到AZO-4。