WO2011134599A2 - Quantitative marker zur bestimmung des mentalen status eines probanden - Google Patents

Abstract

Quantitative Marker zur Bestimmung des mentalen Status eines Probanden die in ihrer Konzentration graduell erfassbare Proteine umfassen, die von einem Antikörper mit der Bezeichnung AK 4DC1 erkannt werden, und deren Konzentration in Gewebeproben eines Probanden eine graduelle Aussage über den mentalen Status in dem Probanden ermöglicht, wobei die Konzentration mindestens eines der Markerproteine in Gewebeproben gesunder Probanden signifikant höher ist als bei erkrankten Probanden.

Description

Quantitative Marker zur Bestimmung des mentalen Status eines Probanden

Die Erfindung bezieht sich auf Marker, die eine Aussage über den mentalen Status eines Probanden erlauben.

Mit dem Begriff "mentaler Status" soll die geistig-seelische Verfassung eines Probanden bezeichnet werden.

Im wesentlichen handelt es sich bei der im Rahmen der Erfindung möglichen Aussage um eine Feststellung darüber, inwieweit ein Proband von geistigseelischer Gesundheit entfernt ist.

Typische Störungen des mentalen Status gehen auf Hirnerkrankungen beziehungsweise chronisch mentale Erkrankungen (CME) zurück.

CME wie die Schizophrenie oder die rekurrierenden affektiven Erkrankungen gehören zu den häufigsten Erkrankungen überhaupt.

BESTÄTIGUNGSKOPIE Uber die biologischen Grundlagen dieser Erkrankungen ist nicht viel bekannt und die psychiatrische Grundlagenforschung ist noch in ihren Anfängen.

Befunde, die eine biologische Ursache z.B. der Schizophrenie nahelegen sind: eine starke genetische Komponente, eine Störung des Dopaminstoffwechsels eine subtile Störung der Hirnentwicklung, sowie eine beidseitige unspezifische, leichte Erweiterung der Ventrikel (Chua, 2000; Ross et al., 2006). Wie diese Symptome zusammenhängen ist bislang nicht geklärt.

Das Fehlen eines tieferen biologischen Verständnisses chronisch mentaler Erkrankungen ist der Grund dafür, dass ihre Diagnose - in starkem Kontrast zur Vorgehensweise in anderen medizinischen und neurologischen Fachbereichen - ausschliesslich durch klinische Interviews erfolgt.

Üblicherweise werden CME oder Schizophrenien mit Hilfe operationalisierter Algorithmen diagnostiziert, bei denen verschiedene klinische Phänotypen abgerufen werden, die im klinischen Interview erfragt werden; Das Vorliegen dieser Phänotypen (meistens fünf - sechs verschiedene nach ICD- 10 oder DSM-IV) führt zu entweder einer positiven oder einer negativen Diagnose einer klinisch diagnostizierten CME, was ein ernstes mit dieser Art der Diagnose verbundenes Problem ist. Eine graduelle Diagnose bzw. eine Verlaufsdiagnose, das heißt die Bestimmung einer Verschlimmerung oder Gesundung ist auf diese Weise nicht möglich. Zwar gibt es Skalen, die versuchen - wiederum durch Befragen oder Selbsteinschätzung - solche Graduierungen auf dem Gebiet der psychologischen Beurteilung oder Diagnostik aufzustellen, diese sind aber 1. multidimensional, d.h. sie verwenden Wahrnehmungen oder intellektuelle Leistungen verschiedener Fähigkeiten und 2. sie schließen keine biologischen Variablen ein.

Ein weiteres Problem chronisch mentaler Erkrankungen ist ihre Heterogenität. Gerade Schizophrenie ist ein Beispiel für eine Erkrankung mit komplexen positi- ven und negativen Symptomen. Es ist nicht auszuschließen, dass der Krankheitsbegriff Schizophrenie Subtypen von Erkrankungen mit möglicherweise unterschiedlichen biologischen Ursachen abdeckt. Weiterhin ist es auch möglich, dass diese Subtypen auch Überschneidungsbereiche zu anderen klassisch diagnostizierten mentalen Erkrankungen wie bipolaren Störungen, Depressionen etc. umfassen. Dafür sprechen Untersuchungsergbnisse, die weiter unten diskutiert werden.

Es ist weiterhin nicht auszuschliessen, dass die rein phänotypische Diagnose "Schizophrenie" gar keinem einheitlichen biologischen Korrelat entspricht, sondern dass die Gemeinsamkeiten, aus denen der Psychiater die klinisch- phänotypische Diagnose "Schizophrenie" stellt, in der Tat ausschließlich Kon- strukte sind. Es ist somit ungenügend, Krankheitszustände ausschliesslich klinisch und als ja/nein Entscheidung zu definieren. Vielmehr ist davon auszugehen, dass es ein Kontinuum zwischen gesunden und kranken mentalen Zuständen gibt, die mit herkömmlichen diagnostischen Systemen nicht erfasst werden.

Erkenntnisse aus genetischen Studien haben in den letzten Jahren zu ersten Ansatzpunkten für die biologische Grundlagenforschung der CME geführt. Durch genetische Linkagestudien wurden die Gene disrupted-in-schizophrenia 1 (DISCl) (Miliar et al, 2000), Dysbindinl, Neuregulinl (NRG1) und andere (siehe Übersicht von: Harrison and Weinberger, 2005) als Kandidatengene für die Verursachung von Schizophrenie identifiziert. Von verschiedenen pathogenen Formen dieser Gene konnten z.T. bereits Tiermodelle generiert werden, die verhaltensbiologische Auffälligkeiten i.S. kognitiver Störungen zeigten und somit die Assoziation dieser Gene mit Verhaltensphänotypen unterstützen.

Das DISCl Gen ist das bislang am besten charakterisierte Gen, das mit CME assoziiert wurde. Das Gen wurde in einer schottischen Familie identifiziert, bei der ca 70% der Träger einer Translokationsmutation von DISCl auch an einer CME leiden (Miliar et al., 2000; St Clair et al., 1990). Diese Mutation konnte in verschiedenen Tiermodellen transgen exprimiert werden und führte hier auch zu Verhaltensauffälligkeiten, z.T. im Sinne von Schizophrenie (pre pulse Inhibition) (Clapcote et al., 2007; Hikida et al., 2007; Shen et al., 2008). Von DISCl konnte gezeigt werden, das es eine wichtige Rolle bei der Proliferation und Migration von neuronalen Vorläuferzellen spielt, und somit Funktionen in der korrekten Hirnentwicklung steuert (Duan et al., 2007; Kamiya et al., 2005).

Die Bedeutung von DISC 1 bei sporadischen Fällen von CME ist noch unklar.

Bemerkenswert ist allerdings, dass das Vorhandensein von imitiertem DISCl oder unlöslichem DISCl nicht mit spezifischen klinischen Diagnosen korreliert, sondern verschiedene klinische Diagnosekategorien überschreitet (Leliveld et al., 2008; Miliar et al., 2000).

Es gibt eine Reihe von Veröffentlichungen, die Gene oder Proteinmarker betreffen, die mit dem oben erwähnten Protein DISCl oder einem als DISC2 bezeichneten Gen korreliert sind. DISC2 ist ein Gen auf der genomischen Antisense Sequenz von DISCl (Exon 8 und Intron 9 von DISCl), das offensichtlich nicht in ein Protein translatiert wird; die Funktion dieses Gens ist bislang unbekannt.

Die WO 2004/071269 z.B. beschreibt genetische Marker und Zusammensetzungen zur Diagnose und Behandlung von neurologischen Störungen. Dazu wird die Bindung von DISCl und FEZ1 (Fasciculation and Elongation Protein Zeta 1) gemessen und abhängig von den Ergebnissen auf das Vorliegen einer Störung geschlossen.

Die WO 02/058637 betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Diagnose und Behandlung von neuropsychiatrischen Störungen. Beschrieben werden neue Polymorphismen von DISCl -Nukleinsäuresequenzen sowie die dadurch codier- ten DISC1 -Proteine. Die an einzelnen Nukleotiden Varianten Sequenzen bzw. Proteine lassen sich mit neuropsychiatri sehen Störungen korrelieren.

Die DE 102008016064 betrifft die Verwendung eines DISC1 Konfomers, insbesondere einer aggregierten Form des DISC1, als Marker für chronisch psychiatrische Erkrankungen.

Die US-Anmeldung US 2005/0255500 betrifft Verfahren zur Diagnose von psychiatrischen Störungen, bei denen die molekulare Diversität bzw. subzelluläre Verteilung von DISC1 untersucht und mit der Empfänglichkeit, bzw. Anfälligkeit für pathologische Zustände (engl, "susceptibility") korreliert wird. Ausgehend von der Beobachtung, dass die DISC1 -Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene in Lymphoblasten von insbesondere weiblichen Patienten mit bipolaren Störungen niedriger war als bei Gesunden, wird postuliert, dass die Abnahme oder der Verlust von DISC1 -Funktion bzw. Gehalt zu psychiatrischen Auffälligkeiten führen kann. Zur Untersuchung der Expression auf Protein-Ebene können DISC1 -spezifische Antikörper eingesetzt werden.

In der US 2005/0255500 wird die Empfänglichkeit/Prädisposition gemessen wird, d.h. es wird ein sogenannter "trait marker" (Wesenszug) bestimmt und kein Marker, der den gegenwärtigen, aber prinzipiell variablen mentalen Status angibt ("state marker").

Aus der US 2010/0015130 sind Verfahren zur Behandlung neurologischer Störungen bekannt, bei der u.a. DISC1 induzierende Substanzen eingesetzt werden, die z.B. die Expressionslevel von endogenem DISC1 im Sinne einer Expressionssteigerung beeinflussen. Auch hier wird eine Erkrankung mit einer Störung des DISC1 -Stoffwechselweges korreliert. Allerdings werden hier klassische positive klinische Diagnosen für Schizophrenie und andere nach klassischen Kriterien klinisch diagnostizierte Krankheiten vorausgesetzt. In der Veröffentlichung von Zhang et. al. im Neuroscience Letters 438 (2008) wurde die Expression des Neuregulin-l-Gens im peripheren Blutgewebe schizophrener Probanden untersucht. Es wurde fest gestellt, dass sich die Expression des Gens durch spezielle Antipsychotika steigern lässt. Auch diese Untersuchungen setzten eine klassische positive klinische Diagnose von Schizophrenie voraus.

Keiner der bekannten Marker oder Tests erlaubt bislang im Sinne eines "state markers", d.h. eines intraindividuell variablen Markers, eine routinemäßige sichere und von der klassischen Diagnose unabhängige Einschätzung des mentalen Status eines Probanden, bzw. die oben angesprochene re-Definition dieser und anderer chronisch psychiatrischer Erkrankungen bzw. auch eine Verlaufskontrolle.

Fasst man obiges zusammen, so ist eine eine objektive, biologisch fundierte Diagnostik erforderlich, um den betroffenen Patienten und ihren Angehörigen mehr diagnostische Sicherheit zu ermöglichen und neue, ursächlich wirkende Therapien zu entwickeln.

Dementsprechend ist es die Aufgabe der Erfindung, Marker bereitzustellen, die insbesondere im Sinne eines State-Markers eine Aussage über den mentalen Status eines Probanden erlauben, mit denen sich Störungen, in der Regel chronisch mentale Erkrankungen definieren und von anderen Erkrankungen abgrenzen lassen und die darüber hinaus eine graduelle Einschätzung der durch sie definierten Störungen bzw. Erkrankungen ermöglichen.

Gelöst wird diese Aufgabe mit Markern gemäss Anspruch 1. Die erfindungsgemäßen Marker nach Anspruch 1 umfassen Proteine, die von einem vom Anmelder gegen DISC1 generierten Antikörper mit der Bezeichnung AK 4DC1 erkannt werden. Der Antikörper AK 4DC1 wird von einer von dem Anmelder am 10. Dezember 2009 unter der Nummer DSM ACC3033 bei der DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig) hinterlegten Hybrydomazelllinie mit der internen Bezeichnung 4DC1 sekretiert.

Wesentliche Eigenschaft der erfindungsgemäßen Marker ist, dass sie eine quantitative Aussage erlauben, mit anderen Worten es handelt sich um in ihrer Konzentration graduell erfassbare Proteine, deren Konzentration in Gewebeproben eines Probanden eine graduelle Aussage über den mentalen Status in dem Patienten ermöglicht, wobei die Konzentration mindestens eines der Markerproteine in Gewebeproben gesunder Probanden signifikant höher ist als bei erkrankten Probanden.

Im Gegensatz zu der erwähnten US 2005/0255500, die Methoden zur Messung der Empfänglichkeit/Prädisposition betrifft, bei denen ein sogenannter "trait marker" (Wesenszug) bestimmt wird, bezieht sich die vorliegende Erfindung damit auf "state marker", also Marker, die den gegenwärtigen mentalen Status angeben und prinzipiell intraindividuell variabel ist.

Gemäß US 2005/0255500 wird eine nicht weiter definierte "Molekulare Diversität" oder subzelluläre Verteilung gemessen, wozu immortalisierte Zelli- nien benötigt werden, die zeitaufwändig aus Vorläuferzellen hergestellt werden müssen. Gemäss vorliegender Erfindung ist es überraschenderweise jedoch ausreichend für eine Aussage, die Quantität definierter immunreaktiver Proteinbanden zu messen. Die fraglichen Proteine lassen sich aus z.B. weissen Blutkörperchen isolieren, so dass eine unaufwändige Konzeption eines diagnostischen Tests als z.B. Bluttest möglich ist. Auch ist die Genauigkeit einer Diagnose in der vorliegenden Erfindung nicht auf weibliche Probanden eingeschränkt.

Wie erwähnt handelt es sich bei den erfindungsgemässen Markern um Marker, die bei gesunden Probanden stärker ausgeprägt sind als bei erkrankten und die darüber hinaus auch den Zwischenbereich zwischen beiden Gruppen erfassen.

Mit dem Begriff gesund sollen Probanden bezeichnet werden, bei denen die ermittelten Markerkonzentrationen auf keine vorliegende mit diesen Markern korrelierbare Störung des mentalen Status hindeuten, während bei als krank bezeichneten Probanden eine solche Störung vorliegt. Allerdings sind die quantitativ erfassten Kranken unterschiedlich krank wie durch die graduell unterschiedlichen Markerkonzentration erfasst.

Mit den erfindungsgemässen Markern kann damit nicht nur das Vorliegen bzw. Nicht- Vorliegen einer chronisch mentalen Erkrankung biologisch diagnostizieren, man kann darüber hinaus auch den Grad der Erkrankung erfassen. Die Graduierung ergibt sich aus der Menge oder der Konzentration der vorhandenen Marker in dem untersuchten Gewebe; diese ist prinzipiell variabel und vom mentalen Status des Individuums abhängig.

Bislang gab es keine konzeptionelle Grundlage zu denken, dass es der mentale Status, d.h. das Vorliegen von (chronisch) mentalen Krankheiten auch graduell sein könnte, d.h. dass es ein Kontinuum zwischen einer mentalen Krankheit, z.B. einer Schizophrenie, und dessen schrittweiser Gesundung gibt, weil bislang keine biologischen Marker existieren, die in einer Dimension (d.h. mit einer einzigen Variablen) einen solchen Übergang abbilden können.

In der vorliegenden Erfindung wird dieses Problem überraschend gelöst, in dem quantitativ und schnell messbare, eindeutige Marker beschrieben werden, deren, wie weiter unten gezeigt, Anstieg eindeutig mit der Restitution des mentalen Status, der Gesundung von einer chronisch mentalen Erkrankung korrelieren.

Das Vorliegen dieser (quantitativen) Marker begründet somit eine neue Lehre, nach der es einen graduellen Übergang des mentalen Status von krank, z.B. im Sinne einer chronisch mentalen Erkrankung, zu gesund gibt mit entsprechenden Übergangsstadien. Das Monitoring, Screenen oder Überwachen dieses Übergangs ist nützlich in der Diagnose oder Therapie des mentalen Status.

Mit der vorliegenden Erfindung kann nun erstmals eine graduelle biologische Diagnostik an Stelle der bislang verwendeten operationalisierten entweder/oder (Boole'schen) Diagnostik bei chronisch mentalen Erkrankung klassifizierten Krankheiten erfolgen. Dies hat Vorteile für die biologische Klassifizierung, in der Zuführung zu bestimmten Therapien oder in der Verlaufskontrolle der Erkrankung unter einer bestimmten Therapie.

Im Hinblick auf eingesetzten Antikörper ist davon auszugehen, dass die erfin- dungsgemässen Markerproteine mindestens teilweise aus Teilen des DISCl - Proteins bestehen.

In der vorliegenden Erfindung wird damit das Vorhandensein von DISCl, seiner Spliceformen, endogenen Fusionsproteine oder degradierten Fragmente gemessen und damit insbesondere den Status einer DISCl -assoziierten Hirnerkrankung bzw. der Status von Hirnerkrankungen untersucht, die letztlich einen dysfunktio- nalen und lokalisierten Dopamin- und/oder Serotonin- und/oder Acetylcholin- und/oder Glutamat- Stoffwechsel verursachen.

Weiter unten diskutierte Untersuchungen deuten darauf hin, dass insbesondere stark rauchende Probanden mit Schizophrenie, bzw. Probanden bei denen gleichzeitig eine Schizophrenie und eine Nikotinabhängigkeit besteht, eine grosse Un- tergruppe von chronisch mental Erkrankten darstellen, bei denen besonders gut DISC1 -verwandte Marker zur Feststellung des mentalen Status verwendet werden können. Dies mag auch an einer physiologischen Verzahnung zwischen dem DISC1 Signalweg, dem Dopamin- und insbesondere dem Acetylcholin- Neurotransmittermetabolismus bzw. -signalweg, sowie Mechanismen der Nikotinabhängigkeit begründet sein, die hier erstmals erfindungsgemäss ausgenutzt wird.

Die erwähnten Untersuchungen deuten weiter darauf hin, dass die von ihnen definierten Hirnerkrankungen zumindest Teilmengen der klassisch klinisch diagnostizierten Krankheitsbilder Schizophrenie, rekurrierende monopolare Depression, oder bipolare Erkrankung etc umfassen.

Zusammen mit anderen biologischen Variablen kann anschliessend eine quantitative biologische Diagnose erfolgen. Wenn diese Statuserhebung im Rahmen einer chronisch mentalen Erkrankung erfolgt, kann dieser Status als Variable dann im Rahmen einer Therapie überprüft werden.

Wesentlicher Vorteil gegenüber dem bisherigen Stand der Technik hierbei ist, dass eine Variable, die kausal mit dem Krankheitsmechanismus einer Hirnerkrankung verknüpft ist, gemessen werden kann und nicht auf phänotypische (mittles klinischem Interview erhobene) indirekte Merkmale zurückgegriffen werden muss. Ein weiterer wesentlicher weiterer Vorteil ist, dass die erfindungs- gemässen Marker sich problemlos in Blut nachweisen lassen, was die Konzeption eines Routinetests ermöglicht.

Andere z.B. aus der Wo 2009077763 bekannte Strategien behaupten zwar auch einen Bluttest für Schizophrenie erfunden zu haben, jedoch beruhen diese auf Shotgun Proteomics und nicht auf der Analyse von Krankheitsmechanismus- relevanten Proteinen was ihre Bedeutung letztlich zweifelhaft und zumindest un- zuverlässig bleiben lässt; auch wurde eine gradueller Zusammenhang mit dem mentalen Status und dessen Verbesserung nicht beschrieben. Des weiteren beziehen sich diese Tests auf die klinisch-phänotypische Diagnose von CME.

Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Es kann sich bei den auf die erfindungsgemäßen Marker getesteten Probanden auch um Tiere, insbesondere Säugetiere, handeln. Neuere Untersuchungen zeigen, dass Störungen im DISC1 -Stoffwechsel auch bei z.B. Mäusen zu Verhaltensauffälligkeiten führen, die gewisse Ähnlichkeiten zu Störungen des mentalen Status beim Menschen aufweisen. Denkbar wäre z.B., dass neue Therapien, beziehungsweise Medikamente, an Mäusen getestet werden und mittels der erfindungsgemäßen Marker der Erfolg dieser Maßnahmen überprüft wird.

Bevorzugt jedoch werden die erfindungsgemäßen Marker bei menschlichen Probanden ermittelt. Ein wesentlicher Aspekt dabei ist, dass sowohl gesunde als auch erkrankte menschliche Probanden als Zielobjekte in Frage kommen. Mithilfe der erfindungsgemäßen Marker kann sowohl das Vorliegen eines intakten mentalen Status bestätigt werden als auch das Gegenteil. Denkbar ist die Anwendung in Screening-Untersuchungen. Genauso gut kann man mit den Markern aber auch den Verlauf einer Erkrankung, beziehungsweise einer Therapie, kontrollieren. Hierbei können der Verlauf aller Arten von Therapien, inklusive psychotherapeutischer oder physikalischer Therapien, insbesondere jedoch Pharmakotherapien kontrolliert werden.

Bei den erfindungsgemäßen Markern handelt es sich mindestens um zwei im Western blot nachweisbare Proteine mit jeweils einer elektrophoretischen Mobilität im SDS-PAGE Gel von ca. 50 kDa oder ca. 90 kDa. Es ist seit langem bekannt, dass in der Gruppe der klinisch als Schizophrenie diagnostizierten Patienten im Vergleich zu der Normalbevölkerung übermässig geraucht wird (Leonard and Bertrand, 2001). Es wird vermutet, dass es sich bei dem vermehrten Nikotinkonsum um eine Selbstmedikation handelt, um bestimmte kognitive Defizite auszugleichen (Adler et al., 1998). Es könnte auch sein, dass die grosse Untergruppe der rauchenden Schizophrenen vulnerabler für Nikotinabhängigkeit ist, oder dass die rankheitsmechanismen der Nikotinabhängigkeit und einer Untergruppe der Schizophrenie überlappen.

Bevorzugt ist daher vorgesehen, dass als weiterer Marker die Rauchgewohnheiten eines Probanden untersucht werden.

Bei vielen Patienten mit der klinischen Diagnose einer Schizophrenie liegen abnormale elektrophysiologisch gemessene sog. Event-related potentials (ERP) vor, insbesondere des Signals P50, bei dem ein auditorischer Prästimulus einen darauffolgenden Stimulus normalerweise hemmt ("sensory gating"); diese Hemmung ist allerdings bei 85% der klinisch als Schizophrenie diagnostizierten Patienten defizitär (Dawson et al., 2000). In einer Familie mit einem genetischen P50 Defizit konnte dieser Endophenotyp mit dem al Acetylcholinrezeptoruntereinheit (a7AChR) genetisch gelinkt (Freedman et al., 1997) und assoziiert werden (De Luca et al., 2004). Dieses Defizit im P50- assoziierten Sensory Gating kann durch Nikotin ausgeglichen werden, was eine mögliche Erklärung für den übermässigen Nikotinkonsum von Patienten mit klinischer Schizophrenie bewirkt (Adler et al., 1992).

Des weiteren ist bekannt, das das Protein Neuregulin, das selbst mit klinisch diagnostizierter Schizophrenie in Zusammenhang gebracht wird, a7AChR Expression steigert (Liu et al., 2001). Es ist daher weiterhin bevorzugt vorgesehen, dass als weitere Marker der Gehalt an Acetylcholinrezeptoren bzw. das Protein Neuregulin bestimmt werden.

Es kann also vermutet werden, dass die Gruppe der Raucher innerhalb der Schizophrenien eine Untergruppe darstellt, bei der der biologische Mechanismus der Nikotinsucht auf noch ungeklärte Weise mit dem der Schizophrenie zusammenhängt. Wie Experiment 2 zeigt, lässt sich mit den erfmdungsgemässen von dem Antikörper AK 4DC1 erkannten Markerproteinen besonders diese Gruppe der rauchenden Schizophrenen von allen anderen Gruppen abgegrenzt werden kann. Um diese Diagnostik zu unterstützen und zur Erlangung grösserer Genauigkeit und Trennschärfe, können die nachfolgend noch einmal zusammengefassten Marker bzw. Umstände bestimmt werden, die speziell rauchenden Schizophrenen zuzuordnen sind:

1. die Erhebung einer entsprechenden Anamnese / Krankengeschichte über die Rauchgewonheiten oder die klinischen Kriterien der Nikotinsucht,

2. die Erfassung biologischer Marker die mit (chronischem) Rauchen assoziiert sind, wie die Konzentration von Nikotin und seiner Metabolite (z.B. Cotinin) im Blut oder anderen Geweben, oder anderer indirekter Marker

3. die Erfassung von genetischen Subtypen, Polymorphismen oder Mutationen, sowie der biologischen Funktionalität des Acetylcholinstoffwechsels und der Nikotinrezeptoren wie z.B. Acetylcholinrezeptoren, speziell dem a7-AchR.

4. die Erfassung von Molekülen, speziell Proteinen wie dem Neuregulin, die die Expression und/oder Funktionalität des Acetylcholinstoffwechsels und seiner rezetporen regulieren.

Die erfindungsgemäßen Marker lassen sich insbesondere in Geweben nachweisen, die geeignet sind, Hinweise auf die Funktionalität des Zentralen Nervensystems zu geben. Bevorzugt werden als Gewebe Serum, Plasma oder weiße Blutkörperchen untersucht. Wie oben ausgeführt, sind solche Gewebe besonders gut geeignet, um Routineverfahren zu konzipieren. Die Erfindung deckt nicht nur die Marker als solche ab, sondern auch Verfahren, in denen die erfindungsgemäßen Marker eingesetzt werden.

Es handelt sich dabei um Verfahren zur Untersuchung von Probanden auf das Vorliegen oder den Status einer Störung des mentalen Status, bei dem die Konzentration der Markerproteine gemäss Anspruch 1 in Gewebeproben ermittelt wird, und anhand der ermittelten Konzentration eine Einschätzung der Probanden in Bezug auf den Krankheitsstatus vorgenommen wird.

Bevorzugt kann die Einschätzung der Probanden durch Vergleich der bei den Probanden gemessenen Konzentrationen mit vorgegebenen Konzentrationen erfolgen kann, die jeweils für das Vorliegen bzw. Nicht- Vorliegen z.B. einer DISC1 -korrelierten chronisch mentalen Erkrankung charakteristisch sind.

Die Verfahren können insbesondere zur Diagnose von chronisch mentalen Erkrankungen, zum Screening oder zur Kontrolle des Verlaufs einer chronisch mentalen Erkrankung eingesetzt werden, die Pharmakotherapie einer chronisch mentalen Erkrankung überwachen wobei die quantitative Höhe des Markers als Aussage über den Erfolg der ( Pharmako) therapie genommen werden kann.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung können die dem Probanden entnommenen Gewebeproben, z.B. die weissen Blutkörpchen mit Nikotin oder anderen Acetylcholinrezeptor-bindenden Substanzen stimuliert werden um die Trennschärfe der genannten ca. 50 kDa / 90 kDa Banden im Rahmen der Bestimmung des mentalen Status zu erhöhen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Marker zur Diagnose von Störungen des mentalen Status, dem Screening auf solche Störungen und der Verlaufskontrolle z.B. zur

einer Pharmakotherapie.

Im folgenden soll die Erfindung anhand von Figuren und Beispielen näher erläutert werden.

Dabei zeigt:

Fig. l einen Western blot mit AK 4DClvon gereinigten menschlichen weissen Blutkörperchen / PBMC (peripheral blood mononuclear cells) (S = Schizophrenie-Patient; N = Normale Kontrolle); Man erkennt deutlich eine ca. 90 kDa Bande und eine ca. 50 kDa Bande.

Fig.2 in Form von Box plots/Balkendiagrammen die Ergebnisse der in Beispiel 2 diskutierten Quantifizierung der unterschiedlichen Immunreaktivität von Antikörper AK 4DC1 zwischen schizophrenen Probanden und Kontrollen; auf der linken Seite dargestellt sind alle Probanden und Kontrollen, auf der rechten Seite ausschliesslich die rauchenden, d.h. Nikotin-stimulierten schizophrenen Probanden und nicht-kranken Raucher. Die Unterschiede sind hochsignifikant und werden stärker wenn speziell die Raucher verglichen werden.

BEISPIELE

Beispiel 1

Herstellung des monoklonalen Antikörpers AK 4DC1 zur Detektion von DISCl Immunreaktivität in weissen Blutkörperchen

ScEv/129 Mäuse wurden nach einem Standardverfahren mit rekombinantem, humanem DISCl (598-785) Protein immunisiert. Nach erfolgter Immunisierung wurden die Milzzellen mit Myelomzellen fusioniert und die enstandenen Hybirdomzellen nach Standardverfahren auf die Erkennung des Immunogens im ELISA gescreent. Ein monoklonaler Antikörper AK 4DC1 wurde als besonders reaktiv identifiziert. Mithilfe verschieden grosser Proteine des C-terminalen DISC1 Fragments, die wie beschrieben in Escherichia coli exprimiert wurden (Leliveld et al., 2009) konnte das Epitop des Antikörpers auf die Aminosäuren 748-769 gemappt werden (Tabelle 1). Entscheidend war hier der Vergleich der Immunreaktivität von AK 4DC1 mit DISC 1(640-854) aber nicht mit einer Splicevariante, die die Aminosäurereste 748-769 nicht besitzt (DISC 1(640-854 Δ748-769); dies bedeutet, dass das Epitop von AK 4DC1 im Bereich von Exon 11 des DISC 1 Proteins, und speziell die Aminosäuren 748-769 umfasst, die Teil einer Splicevariante des DISC1 Proteins ist.

Tabelle 1. Epitopbestimmung durch positive oder negative Immunreaktivität mit C-terminalen DISCl-Fragmenten

Der positive Klon AK 4DC1 erkannte DISC1 Immunreaktivität in mit Standardverfahren gereinigten menschlichen weissen Blutkörperchen, während andere beschriebene Antikörper dieselbe Immunreaktivität nicht zeigten (Figur 1). Der AK 4DC1 besitzt also neue Eigenschaften, die bislang noch nicht beschrieben wurden. Beispiel 2

Identifizierung von Probanden mit Schizophrenie mittels AK 4DC1

Von 15 Probanden, bei denen klinisch eine Schizophrenie diagnostiziert wurde, sowie von 15 normalen Kontrollen wurden weisse Blutkörperchen nach Standardmethoden aufgereinigt. Die weissen Blutkörperchen wurden lysiert und gleiche Proteinmengen wurden mittels SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat- Polyacryiamidgelelektrophorese) getrennt. Nach dem Transfer der Proteine auf eine Nitrocellulosemembran wurde ein Western blot mit AK 4DC1 durchgeführt. Die Immunreaktivität für die ca. 90 kDa und die ca. 50 kDa Banden wurde blind inbezug auf die Diagnose der Samples densitometrisch quantifiziert und ausgewertet.

Die densitometrische Auswertung wurde mit der Freeware NIH Image durchgeführt. Zusammengefasst wird hierbei der Film, auf den der Western blot belichtet wurde, eingescannt und die Anzahl der Pixel in dem durch die Immunreaktivität definierten Material gezählt. Es wurden Normalisierungen mit Referenzwerten vorgenommen, um verschiedene Blots vergleichen zu können. Da die weissen Pixel gezählt wurden, sind diejenigen Werte höher, die eine niedrigere Immunreaktivität mit AK 4DC1 aufweisen.

Fig. 2 zeigt sogenannte Box plots/Balkendiagramme von 4 verschiedenen Gruppenvergleichen der Immunreaktivität mit AK 4DC1 im Western blot lysierter weisser Blutkörperchen (von links nach rechts): 1. alle normalen Kontrollen (N) vs. alle Schizophrenen (S) densitometrischer Vergleich der ca. 90 kDa Bande, 2. idem, aber densitometrischer Vergleich der ca. 50 kDa Bande; 3. als Untergruppe wurden 8 Schizophrene /Nikotinabhängige / Raucher vs. 8 gesunde Nikotinabhängige / Raucher verglichen in Bezug auf die Immunreaktivität der ca. 90 kDa Bande und 4. (ganz rechts) der ca. 50 kDa Bande. Es wurde aus der Anzahl der Pixel Mittelwerte (Zahl im Kasten) gebildet und die Balken geben die Standardabweichung an. Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student's t-test ermittelt und ist unten angegeben.

Es ergab sich, dass die Proben schizophrener Probanden weniger DISC1 Immunreaktivität bei ca. 90 kDa und ca. 50 kDa aufwiesen, hier allerdings durch eine höhere Zahl dargestellt, da die weissen Pixel gezählt wurden (Figur 2).

Dieser Unterschied wurde noch deutlicher, wenn nur die AK 4DC1 Immunreaktivität verglichen wurde, die von rauchenden Schizophrenen vs. rauchenden Kontrollen verliehen wurden, d.h. von solchen Individuen, die in erhöhtem Masse Nikotin konsumierten Es konnte also mit Hilfe der AK 4DC1 Immunreaktivität in weissen Blutkörperchen eine blinde Zuweisung zu einer Untergruppe von Probanden, bei denen klinisch eine Schizophrenie diagnostiziert worden war, durchgeführt werden.

Dies ist ein weiteres wichtiges Ergebnis: Probanden mit Nikotinabhängigkiet, die an klassisch diagnostizierter Schizophrenie leiden, lassen sich wie das Experiment zeigt, mit den Markern eindeutig von solchen ohne Nikotinsuchtverhalten abgrenzen. D.h. mit den Markern kann man innerhalb des Krankheitsbildes Schizophrenie eine biologische Differenzierung treffen, die dafür spricht, dass es sich um Subtypen mit unterschiedlicher biologischer Ursache handelt. Das war bislang nicht möglich.

Angaben zur Hinterlegung: gemäss Budapester Abkommen

Eine Hybridomazelllinie, die den Antikörper AK 4DC1 sekretiert, wurde am 10. Dezember 2009 unter der Nummer DSM ACC3033 und der internen Bezeichnung 4DC1 bei der DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig) hinterlegt. Referenzen:

Adler, L.E., Hoffer, L.J., Griffith, J., Waldo, M.C, and Freedman, R. (1992). Normalization by nicotine of deficient auditory sensory gating in the relatives of schizophrenics. Biol Psychiatry 32, 607-616.

Adler, L.E., Olincy, A., Waldo, M., Harris, J.G., Griffith, J., Stevens, K., Flach, K., Nagamoto, H., Bickford, P., Leonard, S., et al. (1998). Schizophrenia, sensory gating, and nicotinic receptors. Schizophr Bull 24, 189-202.

Chua, S.E., McKenna, PJ. (2000). A Sceptical View of the Neuropathology of Schizophrenia. In The Neuropathology of Schizophrenia, PJ. Harrison, Roberts G.W., ed. (Oxford, Oxford University Press), pp. 291-337.

Clapcote, S.J., Lipina, T.V., Miliar, J.K., Mackie, S., Christie, S., Ogawa, F., Lerch, J.P., Trimble, K., Uchiyama, M., Sakuraba, Y., et al. (2007). Behavioral phenotypes of Discl missense mutations in mice. Neuron 54, 387-402.

Dawson, M.E., Schell, A.M., Hazlett, E.A., Nuechterlein, K.H., and Filion, D.L. (2000). On the clinical and cognitive meaning of impaired sensorimotor gating in schizophrenia. Psychiatry Res 96, 187-197.

De Luca, V., Wong, A.H., Muller, DJ., Wong, G.W., Tyndale, R.F., and

Kennedy, J.L. (2004). Evidence of association between smoking and alpha7 nicotinic receptor subunit gene in schizophrenia patients.

Neuropsychopharmacology 29, 1522- 1526.

Duan, X., Chang, J.H., Ge, S., Faulkner, R.L., Kim, J.Y., Kitabatake, Y., Liu, X.B., Yang, C.H., Jordan, J.D., Ma, D.K., et al. (2007). Disrupted-In- Schizophrenia 1 regulates Integration of newly generated neurons in the adult brain. Cell 130, 1146-1 158.

Freedman, R., Coon, H., Myles-Worsley, M., Orr-Urtreger, A., Olincy, A., Davis, A., Polymeropoulos, M., Holik, J., Hopkins, J., Hoff, M., et al. (1997). Linkage of a neurophysiological deficit in schizophrenia to a chromosome 15 locus. Proc Natl Acad Sei U S A 94, 587-592.

Harrison, P J., and Weinberger, D.R. (2005). Schizophrenia genes, gene expression, and neuropathology: on the matter of their convergence. Mol Psychiatry 10, 40-68; image 45.

Hikida, T., Jaaro-Peled, H., Seshadri, S., Oishi, K., Hookway, C, Kong, S., Wu, D., Xue, R., Andrade, M., Tankou, S., et al. (2007). Dominant-negative DISC1 transgenic mice display schizophrenia-associated phenotypes detected by measures translatable to humans. Proc Natl Acad Sei U S A 104, 14501-14506.

Kamiya, A., Kubo, K., Tomoda, T., Takaki, M., Youn, R., Ozeki, Y., Sawamura, N., Park, U., Kudo, C, Okawa, M., et al. (2005). A schizophrenia-associated mutation of DISC1 perturbs cerebral cortex development. Nat Cell Biol 7, 1 167- 1 178.

Leliveld, S.R., Bader, V., Hendriks, P., Prikulis, I., Sajnani, G., Requena, J.R., and Korth, C. (2008). Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease. J Neurosci 28, 3839-3845.

Leliveld, S.R., Hendriks, P., Michel, M., Sajnani, G., Bader, V., Trossbach, S., Prikulis, I., Hartmann, R., Jonas, E., Willbold, D., et al. (2009). Oligomer assembly of the C-tenninal DISC1 domain (640-854) is controlled by self- association motifs and disease-associated polymoφhism S704C. Biochemistry 48, 7746-7755.

Leonard, S., and Bertrand, D. (2001). Neuronal nicotinic reeeptors: from strueture to funetion. Nicotine Tob Res 3, 203-223.

Liu, Y., Ford, B., Mann, M.A., and Fischbach, G.D. (2001). Neuregulins increase alpha7 nicotinic acetylcholine reeeptors and enhance excitatory synaptic transmission in GABAergic interneurons of the hippocampus. J Neurosci 21, 5660-5669.

Miliar, J.K., Wilson-Annan, J.C., Anderson, S., Christie, S., Taylor, M.S., Semple, CA., Devon, R.S., Clair, D.M., Muir, W.J., Blackwood, D.H., et al. (2000). Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum Mol Genet 9, 1415-1423.

Ross, CA., Margolis, R.L., Reading, S.A., Pletnikov, M., and Coyle, J.T. (2006). Neurobiology of schizophrenia. Neuron 52, 139-153.

Shen, S., Lang, B., Nakamoto, C, Zhang, F., Pu, J., Kuan, S.L., Chatzi, C, He, S., Mackie, I., Brandon, N.J., et al. (2008). Schizophrenia-related neural and behavioral phenotypes in transgenic mice expressing truncated Discl . J Neurosci 28, 10893-10904.

St Clair, D., Blackwood, D., Muir, W., Carothers, A., Walker, M., Spowart, G., Gosden, C, and Evans, HJ. (1990). Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness. Lancet 336, 13-16.

ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS ODER ANDEREM BIOLOGISCHEN MATERIAL

(Regel \3bis PCT)

A. Die nachstehenden Angaben betreffen den hinterlegten Mikroorganismus oder anderes biologisches Material, das in der Beschreibung genannt ist auf Seite 18 Zeile 25ff

B. KENNZEICHNUNG DER HINTERLEGUNG Weitere Hinterlegungen sind auf einem ι— ι

zusätzlichen Blatt gekennzeichnet '— >

Name der Hinterlegungsstelle

DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

Anschrift der Hinterlegungsstelle (einschließlich Postleitzahl und Land)

Inhoffenstr. 7B

38124 Braunschweig

Deutschland

Datum der Hinterlegung Eingangsnummer

10/12/2009 DSM ACC3033

C. WEITERE ANGABEN (falls nicht zutreffend, bitte frei lassen) Die Angaben werden auf einem | |

gesonderten Blatt fortgesetzt '— '

D. BESTIMMUNGSSTAATEN, FÜR DIE ANGABEN GEMACHT WERDEN

(falls die Angaben nicht für alle Bestimmungsstaaten gelten)

E. NACHREICHUNG VON ANGABEN (falls nicht zutreffend, bitte freilassen)

Die nachstehenden Angaben werden später beim Internationalen Büro eingereicht (bitte Art der Angaben nennen, z.B.

„ Eingangsnummer der Hinterlegung ")

Vom Anmeldeamt auszufüllen Vom Internationalen Büro auszufüllen

Dieses Blatt ist eingegangen mit der internationalen Dieses Blatt ist beim Internationalen Büro

Anmeldung eingegangen am:

Bevollmächtigter Bediensteter Bevollmächtigter Bediensteter

Büffet, Lionel

Formblatt PCT RO/134 (Juli 1998; Nachdruck Januar 2004)

Claims

PATENTANSPRÜCHE :

1.) Quantitative Marker zur Bestimmung des mentalen Status eines Probanden dadurch gekennzeichnet, dass sie in ihrer Konzentration graduell erfassbare Proteine umfassen, die von einem von einer unter der Nummer DSM ACC3033 hinterlegten Hybrydomazelllime sekretierten Antikörper mit der Bezeichnung AK 4DC1 erkannt werden, und deren Konzentration in Gewebeproben eines Probanden eine graduelle Aussage über den mentalen Status in dem Probanden ermöglicht, wobei die Konzentration mindestens eines der Markerproteine in Gewebeproben gesunder Probanden signifikant höher ist als bei erkrankten Probanden.

2) Marker nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um menschliche Probanden handelt.

3.) Marker nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um mindestens zwei im Western blot nachweisbare Proteine mit jeweils einer elektrophoretischen Mobilität im SDS-PAGE Gel von ca. 50 kDa oder ca. 90 kDa handelt

Marker nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie als zusätzliche Marker Rauchgewohnheiten oder entsprechende Marker des Probanden die mit Nikotinabhängigkeit assoziiert sind, insbesondere die Konzentration von Nikotin oder seines Metaboliten, z.B. Cotinin, im Gewebe des Probanden umfassen.

Marker nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie als zusätzliche Marker die Expression von Acetylcholinrezeptoren oder das Vorhandensein von Genotypen, insbesondere SNPs von Acetylcholinrezeptoren umfassen.

Marker nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie als zusätzlichen Marker NRG1 umfassen.

Marker nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Geweben nachweisbar sind, die geeignet sind, Hinweise auf die Funktionalität des Zentralnervensystems zu geben.

Marker nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebe Serum, Plasma oder weisse Blutkörperchen sind.

Verfahren zur Untersuchung von Probanden auf ihren mentalen Status, bei dem die Konzentration der Markerproteine gemäss Anspruch 1 in Gewebeproben ermittelt wird, und anhand der ermittelten Konzentration eine Einschätzung der Probanden in Bezug auf den mentalen Status vorgenommen wird.

10.) Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das untersuchte Gewebe nach Entnahme durch Nikotin oder an den entsprechenden Rezeptoren mit ähnlichen Liganden stimuliert wird.

11) Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Einschätzung der Probanden durch Vergleich der bei den Probanden gemessenen Konzentrationen mit vorgegebenen Werten erfolgt, die jeweils für das Vorliegen bzw. Nicht- Vorliegen einer Störung des mentalen Status charakteristisch sind.

12) Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Diagnose, zum Screening oder zur Verlaufskontrolle eingesetzt wird.

13) Verfahren nach Ansrpuch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die quantitative Höhe des Markers gemäss Anspruch 1 während einer Pharmakotherapie überwacht wird.

14) Verwendung des Markers gemäss Anspruch 1 zur Diagnose, Screening und Verlaufskontrolle von Störungen des mentalen Status.