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WO2010128670A1 - フォーカス制御装置および培養観察装置 - Google Patents

フォーカス制御装置および培養観察装置 Download PDF

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Publication number
WO2010128670A1
WO2010128670A1 PCT/JP2010/057789 JP2010057789W WO2010128670A1 WO 2010128670 A1 WO2010128670 A1 WO 2010128670A1 JP 2010057789 W JP2010057789 W JP 2010057789W WO 2010128670 A1 WO2010128670 A1 WO 2010128670A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
observation
focus position
area
objective lens
fertilized embryo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2010/057789
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
泰次郎 清田
和田　陽一
宏昭 紀伊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nikon Corp
Original Assignee
Nikon Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nikon Corp filed Critical Nikon Corp
Priority to EP10772187.0A priority Critical patent/EP2447752A4/en
Priority to JP2011512361A priority patent/JP5633753B2/ja
Publication of WO2010128670A1 publication Critical patent/WO2010128670A1/ja
Priority to US13/290,565 priority patent/US8917347B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/24—Base structure
    • G02B21/241—Devices for focusing
    • G02B21/244—Devices for focusing using image analysis techniques
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/06—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for in vitro fertilization
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/01—Drops
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C12M41/14—Incubators; Climatic chambers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B7/00—Mountings, adjusting means, or light-tight connections, for optical elements
    • G02B7/28—Systems for automatic generation of focusing signals
    • G02B7/36—Systems for automatic generation of focusing signals using image sharpness techniques, e.g. image processing techniques for generating autofocus signals
    • G02B7/38—Systems for automatic generation of focusing signals using image sharpness techniques, e.g. image processing techniques for generating autofocus signals measured at different points on the optical axis, e.g. focussing on two or more planes and comparing image data

Definitions

  • the present invention relates to a focus control device and a culture observation device, and more particularly to a focus control device and a culture observation device suitable for observing an observation object floating in a medium drop.
  • the objective lens is based on the focal position specified in advance by the observer. It is often moved and a plurality of observation images are taken. That is, the cell culture system captures an observation image at each position of the objective lens while moving the objective lens in the optical axis direction around the designated focal position.
  • the object can be focused by moving the position of the objective lens and capturing a plurality of observation images.
  • the observation image There is a high possibility of obtaining an observation image that matches.
  • the observation target is a floating cell, it may not be possible to obtain an observation image in which the cell is focused even if a plurality of observation images are captured while moving the position of the objective lens.
  • a medium drop may be placed on the dish, and the fertilized embryo may be cultured in the medium drop.
  • the fertilized embryo moves freely in the medium drop, so the position of the objective lens that allows the fertilized embryo to enter the observation field and focus on the fertilized embryo can be designated in advance. Disappear. Therefore, in a cell culture system, it was difficult to automatically observe a fertilized embryo without an observer's operation.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and makes it possible to more easily and reliably detect a focus position of an objective lens on an object.
  • a focus control apparatus is a focus control apparatus that detects a focus position of an objective lens on an object, and is placed on a stage as a first target area that is a target for detection of the focus position.
  • a region setting means for selecting a region that does not include a region within a predetermined distance from the edge of the container and includes a boundary portion of the object in the container; and the objective lens of the objective lens and the stage.
  • an imaging control unit Based on a plurality of the observation images, an imaging control unit that captures a plurality of observation images of the first target region in a state where the distances are different while changing a distance in the optical axis direction, and the in-focus position And an in-focus position detecting means for detecting.
  • the culture observation apparatus of the present invention is a culture observation apparatus for observing a fertilized embryo in a medium drop and culturing the fertilized embryo, wherein an area including an edge of the medium drop in a culture container is set as a detection area Based on the focus position detected by the setting means, the focus position detection means for detecting the focus position in the detection area, and the focus position detection means, the medium drop is imaged to obtain an observation image. And a specifying means for specifying the position of the fertilized embryo in the medium drop based on the observation image, and an observation control means for observing the fertilized embryo based on the position of the fertilized embryo.
  • the in-focus position of the objective lens on the object can be detected more easily and reliably.
  • FIG. 1 is a front view showing an overall configuration of a culture observation apparatus to which the present invention is applied.
  • the solid line indicates the structure of the part that appears in the appearance
  • the broken line indicates the structure of the internal part that does not appear in the appearance.
  • the culture observation apparatus 11 includes a first casing 21 that cultures a fertilized embryo to be observed, and a second casing 22 that constitutes a focus control apparatus.
  • the first casing 21 is a second casing. 22 is used in a state of being placed on top of 22.
  • the temperature-controlled room 31 includes a front door 32 provided in front of the first case 21, and a first case. When viewed from the front of the body 21, it communicates with the outside by a carry-in / out port 33 provided on the left side surface.
  • a stocker 34 for holding a culture container (not shown) in which a fertilized embryo is placed and a container transport mechanism 35 for transporting the culture container are provided.
  • An observation unit 37 is provided for picking up an observation image by observing.
  • the display unit 36 is provided on the front-side surface of the second housing 22 and includes, for example, a liquid crystal display.
  • the observation unit 37 is made of, for example, a microscope, and is fixed so that a part of the observation unit 37 protrudes into the temperature-controlled room 31.
  • the observer can open the front door 32 to place the culture container 61 on the stocker 34 or take out the culture container 61 from the stocker 34. That is, the stocker 34 is provided with a plurality of shelves, and one or a plurality of culture vessels 61 can be stored in each shelf.
  • the culture container 61 is, for example, a dish in which a fertilized embryo to be observed is placed.
  • the observation unit 37 is provided with a stage 62 on which the culture vessel 61 is placed, and the stage 62 is provided in the vicinity of the container transport mechanism 35 in the temperature-controlled room 31.
  • the container transport mechanism 35 transports the designated culture container 61 from the stocker 34 onto the stage 62 or transports the culture container 61 on the stage 62 to a predetermined shelf of the stocker 34 under the control of the control unit 38. .
  • observation unit 37 in FIG. 2 is configured as shown in FIG. 3 in more detail.
  • the observation unit 37 includes a main body 91, a stage 62, and an arm 92.
  • the stage 62 and the arm 92 are provided on the upper side of the main body 91 in the drawing.
  • the stage 62 and the arm 92 are arranged in the temperature-controlled room 31 of the first casing 21, and the main body 91 is arranged in the second casing 22.
  • the stage 62 is made of a translucent material, and based on the control of the control unit 38, in the drawing, the vertical direction (hereinafter referred to as the z direction) and the direction perpendicular to the z direction (hereinafter referred to as the xy direction). )
  • the arm 92 has a surface facing the surface of the stage 62, and the first illumination unit 101 and the container observation unit 102 are provided at a position facing the stage 62 of the arm 92.
  • the first illumination unit 101 includes a light source that emits illumination light that illuminates a fertilized embryo to be observed, an illumination optical system that irradiates the culture vessel 61 on the stage 62 with illumination light from the light source, and the like from the upper side in the figure. Illumination light is irradiated toward the culture vessel 61.
  • the first illumination unit 101 is used when observing the phase difference of the fertilized embryo in the culture vessel 61.
  • the container observing unit 102 forms an image of the light incident from the culture vessel 61 on the stage 62, and receives and photoelectrically converts the light collected by the image forming optical system so that a fertilized embryo is obtained. And a camera that captures an observation image.
  • the container observation unit 102 is used when bright-field observation is performed on a fertilized embryo.
  • the main body 91 is provided with a microscopic observation unit 103 that faces the first illumination unit 101 and a second illumination unit 104 that faces the container observation unit 102.
  • the microscopic observation unit 103 is used when phase contrast observation is performed on the fertilized embryo, and the second illumination unit 104 is used when bright field observation is performed on the fertilized embryo.
  • the microscopic observation unit 103 includes a plurality of objective lenses 121-1 to 121-3 having different optical magnifications, and a plurality of intermediate variable lenses 122-1 to 122-3. .
  • the objective lens 121-1 and the intermediate zoom lens 122-1 observe the optical path of illumination light from the first illumination unit 101 (hereinafter referred to as a phase difference observation optical path) when observing a fertilized embryo at a magnification of 2 times.
  • the objective lens 121-2 and the intermediate variable lens 122-2 are arranged on the phase difference observation optical path when the fertilized embryo is observed at a magnification of 4 times, and the objective lens 121-3 and the intermediate variable lens 122 are used.
  • -3 is placed on the phase difference observation optical path when the fertilized embryo is observed at a magnification of 10 times.
  • the objective lens 121-1 when phase contrast observation is performed on a fertilized embryo, the objective lens 121-1, the intermediate variable lens 122-1, the objective lens 121-2, the intermediate variable lens 122-2, or the objective lens 121- according to the observation magnification. Any combination of 3 and the intermediate zoom lens 122-3 is disposed on the phase difference observation optical path.
  • the objective lens 121 when it is not necessary to individually distinguish the objective lenses 121-1 to 121-3, they are also simply referred to as the objective lens 121, and the intermediate variable lens 122-1 to the intermediate variable lens 122-3 are individually referred to. When it is not necessary to distinguish, it is also simply referred to as an intermediate variable lens 122.
  • an imaging optical system 123 and a camera 124 are provided on the lower side of the objective lens 121 and the intermediate variable magnification lens 122 in the microscope observation unit 103.
  • the imaging optical system 123 condenses the illumination light incident from the intermediate variable magnification lens 122 and causes it to enter the camera 124.
  • the camera 124 receives the illumination light incident from the imaging optical system 123 and photoelectrically converts it. Then, an observation image with the fertilized embryo as a subject is captured.
  • the illumination light from the first illumination unit 101 is irradiated onto the culture container 61 on the stage 62, and the illumination light transmitted through the culture container 61 is imaged from the objective lens 121 to the image.
  • the light is received by the camera 124 through the optical system 123.
  • the second illumination unit 104 of the main body 91 includes a light source that emits illumination light, an illumination optical system that irradiates the culture vessel 61 on the stage 62 with illumination light from the light source, and the second illumination unit 104 includes fertilization. It is used for bright field observation of the entire embryo culture vessel 61. That is, when bright field observation of the entire fertilized embryo culture vessel 61 is performed, the illumination light from the second illumination unit 104 is applied to the culture vessel 61 on the stage 62, and the illumination light that has passed through the culture vessel 61 is further emitted from the vessel. Light is received by the observation unit 102.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a functional configuration example of the culture observation apparatus 11.
  • the same reference numerals are given to the portions corresponding to those in FIG. 2 or FIG. 3, and the description thereof will be omitted as appropriate.
  • the stage 62, the first illumination unit 101 to the second illumination unit 104, the display unit 36, the container transport mechanism 35, and the touch panel 151 are connected to the control unit 38.
  • the touch panel 151 is provided so as to be superimposed on the display screen of the display unit 36, detects contact with the display screen of the viewer's display unit 36, more specifically, the touch panel 151, and outputs a signal indicating the contact position to the control unit 38.
  • the observer can perform an input operation by touching the touch panel 151, and can instruct execution of various processes by the input operation.
  • the control unit 38 displays an observation image on the display unit 36 based on a signal supplied from the touch panel 151, and controls the operation of the observation unit 37 and the container transport mechanism 35.
  • the control unit 38 includes an area setting unit 161, an observation control unit 162, a focus position detection unit 163, a macro image generation unit 164, and a recording unit 165.
  • the region setting unit 161 detects an in-focus position of the objective lens 121 that focuses on the object to be observed, that is, an AF (detection position) when the focal position of the objective lens 121 is positioned on the object. Set the Auto Focus area.
  • the AF area is an area used for detection of a focus position by autofocus control among the areas on the culture vessel 61, and the AF area has the same size and the same shape as the observation field of view of the objective lens 121. It may be a region, or may be a region smaller than the observation field of view of the objective lens 121. For example, when the AF area has the same shape and the same area as the observation field of the objective lens 121, the entire observed image is taken as the AF area, and the AF area is smaller than the observation field of the objective lens 121.
  • a predetermined area of the observation image is set as an AF area.
  • the observation control unit 162 controls each part of the observation unit 37 and the operation of the container transport mechanism 35.
  • the focal position detection unit 163 detects the in-focus position of the objective lens 121 on the target object from the AF area set by the area setting unit 161 and the captured observation image.
  • the in-focus position of the objective lens 121 on the object is the z direction with respect to the stage 62 of the objective lens 121 when the focal point (focal plane) of the objective lens 121 is located on the object (for example, a fertilized embryo). It refers to the relative position (in the optical axis direction of the objective lens 121).
  • the objective lens 121 remains fixed, and the stage 62 moves in the z direction. Therefore, the in-focus position of the objective lens 121 is, for example, when the focal point of the objective lens 121 is positioned on the object. It can be represented by the position (z coordinate) of the stage 62 in the z direction.
  • the in-focus position of the objective lens 121 is in the z direction of the objective lens 121 itself. It can be a position.
  • the macro image generation unit 164 generates, as a macro image, one image displaying the entire culture container 61 from a plurality of observation images obtained by imaging different positions of the culture container 61.
  • the recording unit 165 includes, for example, a nonvolatile memory, and records a program executed by the control unit 38, various data, an observation image, and the like. Note that a macro image is also recorded in the recording unit 165, but each of a plurality of observation images obtained by imaging different positions of the culture vessel 61 is recorded in the recording unit 165 as it is, not a macro image. You may do it. In other words, each of a plurality of observation images constituting the macro image may be recorded.
  • the control unit 38 is designated by the operation of the observer.
  • the cultured container 61 is moved onto the stage 62. That is, the observation control unit 162 controls the container transport mechanism 35 in accordance with a signal from the touch panel 151, and the container transport mechanism 35 transports the culture container 61 accommodated in the stocker 34 according to the control, so that the stage 62.
  • the culture observation apparatus 11 When the culture container 61 designated by the observer is placed on the stage 62, the culture observation apparatus 11 starts an observation process for observing the fertilized embryo in the culture container 61.
  • the observation process will be described with reference to the flowchart of FIG.
  • step S11 the container observation unit 102 captures an image of the entire culture container 61 on the stage 62.
  • the observation control unit 162 controls the stage 62 to move the stage 62 so that the culture vessel 61 on the stage 62 is arranged on the optical path of the illumination light from the second illumination unit 104. Then, the observation control unit 162 causes the second illumination unit 104 to irradiate illumination light, and causes the container observation unit 102 to capture an observation image with the entire culture vessel 61 as a subject. When the observation image is captured, the control unit 38 acquires the observation image from the container observation unit 102 and supplies it to the display unit 36 to display the observation image.
  • step S12 the control unit 38 accepts designation of a detection region in which an object to be observed is included in the observation image displayed on the display unit 36.
  • the observer when an observation image is displayed on the display unit 36, the observer performs an input operation on the display screen of the display unit 36, and is an area on the displayed observation image that is an object to be observed. Designate the area that contains as the detection area. Based on the signal from the touch panel 151, the control unit 38 selects an area designated by the observer as a detection area.
  • a circular culture vessel 61 is displayed at the center of the observation image, and the position indicated by the arrow C11 indicates the center position of the bottom of the culture vessel 61 (hereinafter referred to as the center position C11). Yes.
  • the center position C11 indicates the center position of the bottom of the culture vessel 61 (hereinafter referred to as the center position C11).
  • two medium drops D11-1 and medium drops D11-2 are formed.
  • the medium drop D11-1 is located in the upper right direction in the figure as seen from the center position C11, and the medium drop D11-2 is located in the lower left direction in the figure as seen from the center position C11. Then, for example, by an observer, a region R11-1 in the vicinity of the medium drop D11-1 including the entire medium drop D11-1 and a region R11-2 in the vicinity of the medium drop D11-2 including the entire medium drop D11-2 Is designated as the detection region.
  • the culture medium drop D11 formed in the culture vessel 61 has a certain thickness in the z direction, for example, as shown in FIG. In FIG. 7, the vertical direction indicates the z direction, that is, the optical axis direction of the objective lens in the container observation unit 102 and the objective lens 121.
  • a hemispherical medium drop D11 is formed on the bottom B11 of the culture vessel 61, and one fertilized embryo H11 to be observed floats inside the medium drop D11.
  • the medium drop D11 does not move relative to the bottom B11, but the fertilized embryo H11 moves to an arbitrary position in the medium drop D11.
  • the focus position of the objective lens 121 on the medium drop D11 is detected by autofocus control. That is, the position of the focus of the objective lens 121 in the z direction is the position of the stage 62 such that the boundary position (edge portion) of the medium drop D11 and the bottom B11 of the culture vessel 61 is indicated by the arrow A11. A position in the z direction is detected.
  • the focus position of the objective lens 121 on the fertilized embryo H11 that is, the position of the focus of the objective lens 121 in the z direction is indicated by an arrow A12 by autofocus control based on the focus position on the medium drop D11.
  • the position in the z direction of the stage 62 that is the center position of the fertilized embryo H11 is detected.
  • the fertilized embryo H11 floats in the medium drop D11, but is often located near the bottom B11 of the culture vessel 61 in the medium drop D11. Therefore, if a position within a predetermined distance from the bottom B11 in the drawing with respect to the focus position on the culture medium drop D11, that is, the bottom B11 is set as a detection target, a reference position is provided as in the past. Therefore, the in-focus position can be detected more reliably than in the case where the in-focus position to the fertilized embryo H11 is detected.
  • the boundary (surface) portion of the medium drop D11 and the bottom B11 of the culture vessel 61 that is, the portion where the hemispherical surface of the medium drop D11 and the bottom B11 in FIG. It will be referred to as the edge portion of the drop D11.
  • control unit 38 selects one of the designated detection regions as a processing target. Is selected as a detection area.
  • step S13 the region setting unit 161 of the control unit 38 sets an AF region for the medium drop in the detection region that is the processing target.
  • the region setting unit 161 is on the left side of the rectangular region R11 that is the detection region.
  • An area having a predetermined size centered on the position of the center of the side is defined as an AF area.
  • the size of the AF area is set such that the edge portion of the medium drop D11 is included in the AF area.
  • the reason why the edge portion of the medium drop D11 is included in the AF area is that the in-focus position is detected based on the contrast intensity of the edge portion.
  • the center position C21-1 of the left side in the drawing of the region R11-1 is the center.
  • a region R21-1 having a predetermined size is selected as the AF region.
  • the region R21-1 includes a left edge portion in the drawing of the medium drop D11-1.
  • the region setting unit 161 has a rectangular region R ⁇ b> 11 that is a detection region when the culture medium drop D ⁇ b> 11 in the detection region to be processed is located on the left side of the center position C ⁇ b> 11.
  • An area having a predetermined size centered on the center position of the right side of the image is defined as an AF area.
  • the size of the AF area is set such that the AF area includes the edge portion of the medium drop D11.
  • the region R11-2 in FIG. 6 is set as the detection region to be processed, as shown in FIG. 9, the center position C21-2 of the right side in the drawing of the region R11-2 is the center.
  • a region R21-2 having a predetermined size is selected as the AF region.
  • the region R21-2 includes a right edge portion in the drawing of the medium drop D11-2.
  • position C21-1 and the position C21-2 do not need to be individually distinguished, they are also simply referred to as the position C21, and when the region R21-1 and the region R21-2 do not need to be individually distinguished, they are simply the regions. Also referred to as R21.
  • the region R21 including the edge portion of the medium drop D11 is selected as the AF region with the position C21 on the boundary on the center position C11 side of the region R11 as the detection region as the center, thereby making it easier and more reliable.
  • the focus position on the medium drop D11 can be detected.
  • the in-focus position is detected by capturing a plurality of observation images while changing the distance from the objective lens 121 to the stage 62, and detecting the observation image having the maximum contrast intensity among these observation images. Is done. That is, the position of the objective lens 121 when the observation image having the maximum contrast intensity is captured is the in-focus position of the objective lens 121 on the object.
  • the illumination light applied to the culture vessel 61 is scattered on the side wall surface, resulting in uneven illumination, that is, uneven brightness.
  • uneven illumination that is, uneven brightness.
  • the contrast changes due to the illumination unevenness. Therefore, if an area including the illumination unevenness is used as the AF area, an erroneous detection of the in-focus position of the objective lens 121 on the object occurs, and the in-focus position. The detection accuracy will be reduced.
  • the culture observation apparatus 11 selects the region on the side of the center position C11 of the culture vessel 61 as the AF region as viewed from the culture medium drop D11 so that the region causing the false detection is not included in the AF region. Thereby, the focus position to a target object (medium drop D11) can be detected more easily and reliably.
  • region should just be an area
  • An area including the edge portion may be an AF area.
  • the observation control unit 162 controls the microscopic observation unit 103, and the objective lens 121-1 and the intermediate variable lens 122-1 are placed on the phase difference observation optical path.
  • the objective lens 121-1 and the intermediate variable lens 122-1 are moved so that they are arranged.
  • the observation control unit 162 controls the stage 62 and moves the stage 62 so that the culture vessel 61 on the stage 62 is arranged on the phase difference observation optical path. More specifically, the observation control unit 162 moves the stage 62 so that the center position of the AF area defined for the detection area to be processed is positioned on the phase difference observation optical path.
  • the entire observation field of view of the objective lens 121 is set to the AF area. That is, the entire observation image is the AF area.
  • observation control unit 162 controls the first illumination unit 101 to irradiate the culture vessel 61 with illumination light. As a result, phase difference observation of the culture vessel 61 at an optical magnification of 2 becomes possible.
  • step S14 the observation control unit 162 causes the camera 124 to capture an observation image at each position of the stage 62 while moving the stage 62 in the z direction. That is, the illumination light emitted from the first illumination unit 101 to the AF region of the culture vessel 61 passes through the AF region (for example, a culture medium drop) and enters the objective lens 121-1.
  • the AF region for example, a culture medium drop
  • the illumination light incident on the objective lens 121-1 is collected by the objective lens 121-1, and further enters the camera 124 through the intermediate variable magnification lens 122-1 and the imaging optical system 123.
  • the camera 124 captures an observation image of an area including the AF area by photoelectrically converting the illumination light incident from the imaging optical system 123 in accordance with the movement of the stage 62.
  • the control unit 38 acquires a plurality of observation images captured from the camera 124.
  • step S15 the focus position detection unit 163 is based on a plurality of observation images acquired from the camera 124 and focuses on the medium drop of the objective lens 121-1 (hereinafter, particularly referred to as a boundary focus position). ) Is detected. That is, the focus position detection unit 163 obtains the contrast intensity of each of the plurality of observation images, and the position in the z direction of the stage 62 when the observation image having the maximum contrast intensity is captured is set as the boundary focus position. .
  • the boundary in-focus position detected in this way is the position of the stage 62 when the focal position of the objective lens 121-1 is the boundary position between the edge portion of the medium drop and the bottom of the culture vessel 61.
  • a high NA optical system with a narrow depth of focus so that the edge portion of the medium drop can be detected more accurately when an observation image for detecting the boundary focus position is captured.
  • step S16 the observation control unit 162 performs tiling. That is, the observation control unit 162 controls the microscopic observation unit 103 so that the objective lens 121-2 and the intermediate zoom lens 122-2 are arranged on the phase difference observation optical path. The double lens 122-2 is moved. Thereby, phase difference observation of the culture vessel 61 at an optical magnification of 4 becomes possible.
  • the focal position of the objective lens 121-2 after the switching is the boundary position between the edge portion of the medium drop and the bottom of the culture vessel 61.
  • the stage 62 is moved under the control of the observation control unit 162.
  • observation control unit 162 moves the stage 62 in the xy direction and causes the camera 124 to capture each region of the stage 62 so that the entire detection region to be processed is imaged by multiple imaging. An observation image at a position is taken.
  • the entire region R11 as the detection region is imaged in multiple times.
  • one quadrangle for example, a region RS11, indicates a region included in an observation image obtained by one imaging.
  • the entire region R ⁇ b> 11 is imaged by imaging a total of 25 times, 5 times in the vertical direction and 5 times in the horizontal direction.
  • Each observation image has a portion overlapping with an adjacent observation image. That is, in the detection region, a region near the end of one region captured as an observation image is also included in a region captured as another observation image.
  • control unit 38 acquires the plurality of observation images from the camera 124.
  • the macro image generation unit 164 identifies the position of the fertilized embryo in the detection area (hereinafter referred to as the fertilized embryo position) based on the observation image of each area of the detection area obtained by tiling. For example, for each observation image, the macro image generation unit 164 obtains the shape and size of the object included in the observation image and determines whether or not the object is a fertilized embryo. Identify the embryo location.
  • the fertilized embryo H11 is located in the region RS11 in the region R11 that is the detection region, the fertilized embryo H11 is detected from the observation image of the region RS11, and the position of the fertilized embryo H11 Is the fertilized embryo position.
  • the macro image generation unit 164 generates one image by arranging each of the plurality of observation images obtained by tiling so as to be in the same positional relationship as the region that is the subject of the observation images.
  • the image is a macro image. That is, the macro image is an image of the entire detection region obtained by combining a plurality of observation images.
  • step S19 the culture observation apparatus 11 performs a rough scan process to detect an approximate focus position on the fertilized embryo in the detection area to be processed.
  • the area centered on the fertilized embryo position is set as the AF area, and the focus position on the medium drop is used as a reference, and autofocus control is performed. Details of the coarse scan process will be described later.
  • step S20 the culture observation apparatus 11 performs the main scanning process to detect a more accurate focus position on the fertilized embryo in the detection area to be processed.
  • the area centered on the fertilized embryo position is set as the AF area, and the in-focus position obtained by the coarse scanning process is used as a reference to perform autofocus control.
  • observation images at each position in the z direction of the stage 62 are captured, and the observation image, the fertilized embryo position, the in-focus position of the objective lens 121 on the fertilized embryo, and the macro image are recorded in the recording unit. 165. Details of the scan process will be described later.
  • step S ⁇ b> 21 the control unit 38 displays an observation image captured in a state where the stage 62 (objective lens 121) is positioned at the focus position of the objective lens 121 finally obtained on the fertilized embryo on the display unit 36. Then, the observation image is displayed on the display unit 36.
  • step S22 the control unit 38 determines whether or not to end the process. For example, when all of the plurality of detection areas designated by the observer are processed and the in-focus position is detected, it is determined that the process ends.
  • step S22 If it is determined in step S22 that the process is not to be terminated, the next detection area that has not yet been selected is set as a process target, the process returns to step S13, and the above-described process is repeated.
  • the container transport mechanism 35 transports the culture container 61 on the stage 62 into the shelf of the stocker 34 according to the control of the observation control unit 162, and the observation process. Ends.
  • the culture observation apparatus 11 selects a region including the edge portion of the medium drop in the culture vessel 61 and has no illumination unevenness as the AF region, and sets the boundary focus position of the medium drop for the AF region. To detect. Then, the culture observation apparatus 11 further detects the focus position on the fertilized embryo using the boundary focus position as a reference.
  • the boundary focusing position of the objective lens 121 to the culture medium drop can be determined more easily and reliably. Can be detected. Furthermore, if the focus position on the fertilized embryo is detected using the boundary focus position as a reference, the focus position on the fertilized embryo to be finally obtained can be detected more easily and reliably.
  • step S51 the observation control unit 162 changes the optical magnification at the time of observation of the culture vessel 61 in the observation unit 37.
  • the observation control unit 162 controls the microscopic observation unit 103 so that the objective lens 121-3 and the intermediate zooming lens 122-3 are arranged on the phase difference observation optical path.
  • the lens 122-3 is moved.
  • the observation control unit 162 changes the setting of the camera 124 so that the resolution of the observation image is lowered by binning, and controls the first illumination unit 101 to irradiate the culture vessel 61 with illumination light.
  • phase difference observation of the culture vessel 61 at an optical magnification of 10 is possible.
  • the optical magnification does not have to be 10 times as long as the fertilized embryo fits in the entire observation image.
  • the optical magnification may be a magnification specified in advance by the observer.
  • the observation control unit 162 controls the stage 62 and moves the stage 62 in the xy direction so that the fertilized embryo position specified in step S17 in FIG. 5 is located on the phase difference observation optical path. At the same time, the observation control unit 162 controls the stage 62 and moves the stage 62 so that the position of the stage 62 in the z direction becomes the boundary in-focus position detected in step S15 in FIG.
  • the position in the xy direction is the same as that of the fertilized embryo
  • the position in the z direction is the position of the boundary surface between the medium drop and the bottom of the culture vessel 61. Therefore, if the stage 62 (objective lens 121) is moved in the z direction from this state, the fertilized embryo can be focused.
  • the region setting unit 161 sets a region RF11 in the vicinity of the medium drop D11 including the entire medium drop D11 as an AF region, centered on the fertilized embryo position.
  • the region RF11 is set so that its boundary is close to the boundary of the medium drop D11, and the medium drop D11 is determined to occupy most of the region RF11.
  • the in-focus position on the fertilized embryo can be detected more reliably. That is, since foreign substances are mixed in the culture container 61 in addition to the medium drop D11, if the AF area is too wide, many foreign substances are included in the AF area, and the detection accuracy of the in-focus position is lowered. Therefore, by setting the area in the vicinity of the medium drop D11 as the AF area, foreign substances contained in the AF area can be reduced, and the in-focus position can be detected with higher accuracy.
  • the observation control unit 162 causes the camera 124 to capture an observation image at each position of the stage 62 while moving the stage 62 from the boundary in-focus position in the z direction. That is, the illumination light from the first illumination unit 101 enters the camera 124 through the culture vessel 61, the stage 62, the objective lens 121-3, the intermediate zoom lens 122-3, and the imaging optical system 123. An observation image is captured by 124.
  • the position shown by arrow A12 in FIG. And moved to a predetermined position on the upper side (for example, near the upper end of the medium drop D11).
  • a predetermined position on the upper side for example, near the upper end of the medium drop D11.
  • the stage 62 is moved to each position within a predetermined z-direction range including the boundary in-focus position, and an observation image is captured in a state where the stage 62 is in each position, and the in-focus position on the fertilized embryo Can be detected, the detection accuracy can be improved.
  • the range in which the stage 62 (objective lens 121) is moved in the z direction is set to a wide range to some extent so that the fertilized embryo is surely focused.
  • the control unit 38 acquires a plurality of observation images captured from the camera 124.
  • the captured observation image may be an image including the AF area, and the observation visual field of the objective lens 121-3 does not need to coincide with the AF area.
  • the focus position detection unit 163 focuses the fertilized embryo on the fertilized embryo of the objective lens 121-3 based on a plurality of observation images acquired from the camera 124 (hereinafter, referred to as the focus position detection unit). In particular, it will be referred to as a temporary fertilized embryo focusing position).
  • the focus position detection unit 163 obtains the contrast intensity in each AF area of the plurality of observation images, and determines the position in the z direction of the stage 62 when the observation image having the maximum contrast intensity is captured.
  • the embryo focus position obtained by the focus position detection unit 163 obtains the contrast intensity in each AF area of the plurality of observation images, and determines the position in the z direction of the stage 62 when the observation image having the maximum contrast intensity is captured. The embryo focus position.
  • the detected position of the provisional fertilized embryo is the position in the z direction of the stage 62 when the focal position of the objective lens 121-3 is the position of the fertilized embryo.
  • the coarse scan process since detection is performed using an observation image with low resolution, only a certain degree of detection accuracy can be obtained.
  • step S54 the observation control unit 162 calculates the exposure time of the camera 124 that should be set when the main scanning process is performed, using the observation image captured in a state where the stage 62 is located at the temporary fertilized embryo focusing position. To do. For example, the observation control unit 162 calculates the exposure time by obtaining the luminance value of each pixel of the entire observation image and multiplying the average value of the luminance values by a predetermined coefficient.
  • the exposure time calculated in this way is suitable for imaging a fertilized embryo as a subject. That is, depending on where the fertilized embryo is in the medium drop, the brightness in the vicinity of the fertilized embryo at the time of capturing the observation image changes greatly, so it is necessary to set the exposure time appropriately.
  • the state where the stage 62 is positioned at the position where the provisional fertilized embryo is in focus is a state where the fertilized embryo is roughly focused.
  • the fertilized embryo to be the subject is an image.
  • the observation image captured in this state is an image captured in substantially the same environment as the observation image captured in a state where the fertilized embryo is focused more accurately in the main scanning process. Therefore, by using the observation image captured in a state where the fertilized embryo is roughly in focus, the exposure time suitable for the imaging environment is calculated, and in this scanning process, imaging is performed with the calculated exposure time. Thus, an observation image with more appropriate brightness can be obtained.
  • the rough focus position on the fertilized embryo can be more reliably obtained by detecting the focus position on the fertilized embryo on the basis of the focus position on the medium drop. .
  • the AF region since only the region near the fertilized embryo is used as the AF region, it is possible to further improve the accuracy of detecting the in-focus position.
  • step S81 the observation control unit 162 changes the setting at the time of observation of the culture vessel 61 in the observation unit 37. That is, the observation control unit 162 changes the exposure time of the camera 124 to the exposure time calculated in the process of step S54 in FIG. 11 and sets the resolution of the observation image higher than that in the coarse scan process. Change the setting.
  • observation control unit 162 controls the first illumination unit 101 to irradiate the culture vessel 61 with illumination light. Thereby, phase difference observation of the culture vessel 61 at an optical magnification of 10 is possible.
  • the observation control unit 162 controls the stage 62 and moves the stage 62 in the xy direction so that the fertilized embryo position specified in step S17 in FIG. 5 is located on the phase difference observation optical path. At the same time, the observation control unit 162 controls the stage 62 and moves the stage 62 so that the position of the stage 62 in the z direction becomes the provisional fertilized embryo focusing position detected in step S53 of FIG.
  • the focal position of the objective lens 121 is almost the same as the fertilized embryo. Therefore, if the stage 62 is moved from within this state within a relatively narrow range in the z direction centered on the provisional fertilized embryo focusing position, the fertilized embryo can be focused more accurately.
  • the area setting unit 161 sets the area in the vicinity of the medium drop including the entire medium drop as the AF area, centering on the fertilized embryo position, as in the coarse scan process.
  • This AF area is the same area as the AF area during the rough scan process.
  • the observation control unit 162 causes the camera 124 to capture an observation image at each position of the stage 62 while moving the stage 62 in the z direction from the provisional fertilized embryo focusing position. That is, the illumination light from the first illumination unit 101 enters the camera 124 through the culture vessel 61, the stage 62, the objective lens 121-3, the intermediate zoom lens 122-3, and the imaging optical system 123. An observation image is captured by 124.
  • the focal position of the objective lens 121 in the z direction is moved from the position indicated by the arrow A12 in FIG. 7 to each position within a predetermined range centered on that position.
  • an observation image is captured.
  • the stage 62 is moved to each position within a predetermined range with the provisional fertilized embryo in-focus position as the center, and an observation image is captured.
  • the stage 62 is moved to each position within a predetermined z-direction range centered on the provisional fertilized embryo in-focus position, and an observation image is captured in a state where the stage 62 is at each position, to the fertilized embryo If the in-focus position is detected, a more accurate in-focus position can be detected.
  • the range in the z direction in which the objective lens 121 (stage 62) is moved in the main scan process is narrower than the range in which the objective lens 121 is moved in the coarse scan process. This is because a rough focus position on the fertilized embryo has already been detected by the coarse scan process, and the vicinity of the focus position may be set as a detection target.
  • the control unit 38 acquires a plurality of observation images captured from the camera 124.
  • the captured observation image may be an image including the AF area.
  • step S83 the focus position detection unit 163, based on the plurality of observation images acquired from the camera 124, focuses on the fertilized embryo of the objective lens 121-3 (hereinafter, referred to as “the focus position”). In particular, it will be referred to as the final fertilized embryo focusing position).
  • the focus position detection unit 163 obtains the contrast intensity in each AF area of the plurality of observation images, and determines the position in the z direction of the stage 62 when the observation image having the maximum contrast intensity is captured.
  • the embryo focus position obtained by the focus position detection unit 163 obtains the contrast intensity in each AF area of the plurality of observation images, and determines the position in the z direction of the stage 62 when the observation image having the maximum contrast intensity is captured. The embryo focus position.
  • the final fertilized embryo focus position detected in this way is the position of the stage 62 when the focal position of the objective lens 121-3 is the position of the fertilized embryo. Since this scan process is a detection using an observation image with higher resolution than the coarse scan process, the final fertilized embryo focus position is set to a more accurate focus position than the temporary fertilized embryo focus position. Should be showing.
  • step S84 the control unit 38 causes the recording unit 165 to record the plurality of observation images, the final fertilized embryo focusing position, the fertilized embryo position, and the macro image captured in the main scanning process. More specifically, the position of the stage 62 in the x, y, and z directions when the observation image is captured is also recorded in association with each observation image.
  • the observation image captured at the final fertilized embryo focusing position is displayed on the display unit 36 in step S21 of FIG.
  • the main scanning process ends, and then the process proceeds to step S21 in FIG.
  • the observation process is performed when the observer is instructed to observe the culture container 61 and the culture container 61.
  • the observation process is performed at regular time intervals regardless of the instructions of the observer. In such a case, each detection area specified previously is sequentially processed, and an observation image is captured.
  • 11 culture observation apparatus 37 observation unit, 38 control unit, 62 stage, 101 first illumination unit, 102 container observation unit, 103 microscopic observation unit, 104 second illumination unit, 151 touch panel, 161 area setting unit, 162 observation control unit , 163 focus position detection unit, 164 macro image generation unit, 165 recording unit

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Abstract

　本発明は、対物レンズの対象物への合焦位置をより簡単かつ確実に検出できるようにするフォーカス制御装置および培養観察装置に関する。　培養観察装置は、培養容器６１内にある培地ドロップＤ１１への対物レンズの合焦位置を検出するにあたり、培地ドロップＤ１１のエッジ部分を含み、かつ培養容器６１の端から所定距離内の領域を含まない領域を、対物レンズの培地ドロップＤ１１への合焦位置の検出の対象となるＡＦ領域として選択する。そして、培養観察装置は、ＡＦ領域の観察画像に基づいて、培地ドロップＤ１１への合焦位置を検出する。このように、培養容器６１の端近傍の照明むらが生じる領域とは異なる領域を対象として合焦位置を検出することで、検出精度を向上させることができる。本発明は、培養観察装置に適用することができる。

Description

フォーカス制御装置および培養観察装置
　本発明はフォーカス制御装置および培養観察装置に関し、特に、培地ドロップ内で浮遊する観察物を観察する場合に用いて好適なフォーカス制御装置および培養観察装置に関する。
　従来、培養容器内の細胞を培養するとともに、内蔵された顕微鏡を利用して、細胞の観察画像を撮像して記録する細胞培養システムが知られている。
　このような細胞培養システムにおいて、観察者の操作によらず、一定の時間間隔で細胞の観察画像を撮像するには、顕微鏡の対物レンズからの光が細胞に合焦するときの対物レンズの位置を検出する機構、つまりオートフォーカス機能を細胞培養システムに設ける必要がある。
　ところが、細胞培養システムにおいて、観察者の操作によらず細胞への合焦位置を検出することは困難であるため、細胞培養システムでは、観察者により予め指定された焦点位置を基準として対物レンズが移動され、複数の観察画像が撮像されることが多い。すなわち、細胞培養システムは、指定された焦点位置を中心として、対物レンズを、その光軸方向に移動させながら、対物レンズの各位置における観察画像を撮像する。
　これは、観察者が、細胞に合焦する対物レンズの位置を焦点位置として指定しておけば、その焦点位置を中心とする各位置に対物レンズを移動させて観察画像を撮像することで、細胞にピントが合った観察画像が得られると推定されるからである。
特開２００７－６８４１号公報
　ところで、細胞培養システムにおける観察対象が、接着性の細胞など、観察面が比較的安定している場合には、対物レンズの位置を移動させて複数枚の観察画像を撮像すれば、細胞にピントの合った観察画像を得ることができる可能性が高い。しかしながら、観察対象が浮遊性の細胞である場合には、対物レンズの位置を移動させながら複数の観察画像を撮像しても、細胞にピントが合った観察画像を得ることができないことがある。
　例えば、体外受精を行うクリニックなどでは、ディッシュ上に培地ドロップを配置し、その培地ドロップ内で受精胚を培養することがある。そのような場合、受精胚は、培地ドロップ内を自在に移動するため、受精胚が観察視野内に入り、かつ受精胚に合焦するような対物レンズの位置を予め指定しておくことはできなくなる。そのため、細胞培養システムにおいて、観察者の操作なしに、自動で受精胚を観察することは困難であった。
　特に、培地ドロップがディッシュの端近傍にある場合には、ディッシュの側壁面において光がけられ、照明むらが生じるため、受精胚に合焦する対物レンズの位置を検出することは、さらに困難となってしまう。
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、対物レンズの対象物への合焦位置を、より簡単かつ確実に検出することができるようにするものである。
　本発明のフォーカス制御装置は、対物レンズの対象物への合焦位置を検出するフォーカス制御装置であって、前記合焦位置の検出の対象となる第１の対象領域として、ステージに載置された容器の端から所定距離内にある領域が含まれず、かつ前記容器内の前記対象物の境界部分が含まれる領域を選択する領域設定手段と、前記対物レンズと前記ステージとの前記対物レンズの光軸方向への距離を変化させながら、前記距離が異なる状態で、複数の前記第１の対象領域の観察画像を撮像させる撮像制御手段と、複数の前記観察画像に基づいて、前記合焦位置を検出する合焦位置検出手段とを備えることを特徴とする。
　本発明の培養観察装置は、培地ドロップ内の受精胚を観察し、前記受精胚を培養する培養観察装置であって、培養容器内の前記培地ドロップのエッジを含む領域を検出領域に設定する領域設定手段と、前記検出領域において合焦位置を検出する合焦位置検出手段と、前記合焦位置検出手段によって検出された合焦位置に基づいて、前記培地ドロップを撮像して観察画像を取得し、前記観察画像に基づき、前記培地ドロップ内の受精胚の位置を特定する特定手段と、前記受精胚の位置に基づき、前記受精胚を観察する観察制御手段とを備える。
　本発明によれば、対物レンズの対象物への合焦位置を、より簡単かつ確実に検出することができる。
本発明を適用した培養観察装置の全体構成を示す正面図である。 第１筐体の内部の構成例を示す図である。 観察ユニットの構成例を示す図である。 培養観察装置の機能的な構成例を示す図である。 観察処理を説明するフローチャートである。 観察対象となる培養容器内の培地ドロップについて説明する図である。 培地ドロップおよび受精胚について説明する図である。 ＡＦ領域について説明する図である。 ＡＦ領域について説明する図である。 タイリングについて説明する図である。 粗スキャン処理について説明するフローチャートである。 ＡＦ領域について説明する図である。 本スキャン処理について説明するフローチャートである。
　以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。
［培養観察装置の構成］
　図１は、本発明を適用した培養観察装置の全体構成を示す正面図である。なお、図１において、実線は外観に表れる部位の構造を示し、破線は外観に表れない内部の部位の構造を示している。
　培養観察装置１１は、観察対象となる受精胚の培養を行う第１筐体２１と、フォーカス制御装置を構成する第２筐体２２とから構成され、第１筐体２１は、第２筐体２２の上に載せられた状態で使用される。
　第１筐体２１の内部には、断熱材で覆われた恒温室３１が形成されており、この恒温室３１は、第１筐体２１の正面に設けられた正面扉３２と、第１筐体２１の正面から見て、左側側面に設けられた搬出入口３３とによって、外部と連絡している。また、第１筐体２１の恒温室３１内には、受精胚が入れられた図示せぬ培養容器を保持するストッカ３４と、培養容器を搬送する容器搬送機構３５とが設けられている。
　さらに、第２筐体２２には、培養容器内の受精胚を撮像して得られた観察画像等が表示される表示部３６、培養観察装置１１の全体を制御する制御ユニット３８、および受精胚を観察して観察画像を撮像する観察ユニット３７が設けられている。
　表示部３６は、第２筐体２２の正面側の表面に設けられており、例えば液晶ディスプレイなどから構成される。また、観察ユニット３７は、例えば顕微鏡などからなり、その一部が恒温室３１内に突出するように固定されている。
　また、図２に示すように、観察者は正面扉３２を開けることにより、ストッカ３４に培養容器６１を載せたり、ストッカ３４から培養容器６１を取り出したりすることができる。すなわち、ストッカ３４には複数の棚が設けられており、各棚に１または複数の培養容器６１が収納可能となっている。ここで、培養容器６１は、例えば、観察対象の受精胚が入れられるディッシュなどとされる。
　また、観察ユニット３７には、培養容器６１が載置されるステージ６２が設けられており、ステージ６２は、恒温室３１内の容器搬送機構３５近傍に位置するように設けられている。容器搬送機構３５は、制御ユニット３８の制御に従って、指定された培養容器６１をストッカ３４からステージ６２上に搬送したり、ステージ６２上の培養容器６１をストッカ３４の所定の棚に搬送したりする。
　さらに、図２の観察ユニット３７は、より詳細には図３に示すように構成される。
　すなわち、観察ユニット３７は、本体９１、ステージ６２、およびアーム９２から構成され、ステージ６２およびアーム９２は、本体９１の図中、上側に設けられている。また、観察ユニット３７では、ステージ６２およびアーム９２が第１筐体２１の恒温室３１内に配置され、本体９１が第２筐体２２内に配置されるようになされている。
　ステージ６２は、透光性の材質で構成され、制御ユニット３８の制御に基づいて、図中、上下方向（以下、ｚ方向と称する）、およびｚ方向と垂直な方向（以下、ｘｙ方向と称する）に移動する。
　アーム９２は、ステージ６２の表面と対向する面を有し、アーム９２のステージ６２と対向する位置には、第１照明部１０１および容器観察部１０２が設けられている。
　第１照明部１０１は、観察対象の受精胚を照明する照明光を射出する光源、光源からの照明光をステージ６２上の培養容器６１に照射する照明光学系などからなり、図中、上側から培養容器６１に向けて照明光を照射する。この第１照明部１０１は、培養容器６１内の受精胚を位相差観察する場合に用いられる。
　また、容器観察部１０２は、ステージ６２上の培養容器６１から入射した光を結像する結像光学系、結像光学系により集光された光を受光して光電変換することで、受精胚を被写体とする観察画像を撮像するカメラなどからなる。この容器観察部１０２は、受精胚を明視野観察する場合に用いられる。
　さらに、本体９１には、第１照明部１０１と対向する顕微観察部１０３と、容器観察部１０２に対向する第２照明部１０４とが設けられている。顕微観察部１０３は、受精胚を位相差観察する場合に用いられ、第２照明部１０４は、受精胚を明視野観察する場合に用いられる。
　顕微観察部１０３には、互いに光学倍率の異なる複数の対物レンズ１２１－１乃至対物レンズ１２１－３と、複数の中間変倍レンズ１２２－１乃至中間変倍レンズ１２２－３とが設けられている。
　ここで、対物レンズ１２１－１および中間変倍レンズ１２２－１は、受精胚を２倍の倍率で観察するときに、第１照明部１０１からの照明光の光路（以下、位相差観察光路と称する）上に配置される。また、対物レンズ１２１－２および中間変倍レンズ１２２－２は、受精胚を４倍の倍率で観察するときに、位相差観察光路上に配置され、対物レンズ１２１－３および中間変倍レンズ１２２－３は、受精胚を１０倍の倍率で観察するときに、位相差観察光路上に配置される。
　つまり、受精胚を位相差観察する場合、観察倍率に応じて、対物レンズ１２１－１および中間変倍レンズ１２２－１、対物レンズ１２１－２および中間変倍レンズ１２２－２、または対物レンズ１２１－３および中間変倍レンズ１２２－３の何れかの組み合わせが、位相差観察光路上に配置されることになる。
　なお、以下、対物レンズ１２１－１乃至対物レンズ１２１－３を個々に区別する必要のない場合、単に対物レンズ１２１とも称し、中間変倍レンズ１２２－１乃至中間変倍レンズ１２２－３を個々に区別する必要のない場合、単に中間変倍レンズ１２２とも称する。
　また、顕微観察部１０３における対物レンズ１２１および中間変倍レンズ１２２の図中、下側には、結像光学系１２３およびカメラ１２４が設けられている。結像光学系１２３は、中間変倍レンズ１２２から入射した照明光を集光してカメラ１２４に入射させ、カメラ１２４は、結像光学系１２３から入射した照明光を受光して光電変換することで、受精胚を被写体とする観察画像を撮像する。
　したがって、受精胚を位相差観察する場合には、第１照明部１０１からの照明光がステージ６２上の培養容器６１に照射され、さらに培養容器６１を透過した照明光が対物レンズ１２１乃至結像光学系１２３を通って、カメラ１２４により受光されることになる。
　また、本体９１の第２照明部１０４は、照明光を射出する光源、光源からの照明光をステージ６２上の培養容器６１に照射する照明光学系などからなり、第２照明部１０４は、受精胚の培養容器６１全体を明視野観察する場合に用いられる。すなわち、受精胚の培養容器６１全体を明視野観察する場合には、第２照明部１０４からの照明光がステージ６２上の培養容器６１に照射され、さらに培養容器６１を透過した照明光が容器観察部１０２により受光されることになる。
　次に、図４は、培養観察装置１１の機能的な構成例を示す図である。なお、図４において、図２または図３における場合と対応する部分には同一の符号を付してあり、その説明は適宜省略する。
　図４の例では、制御ユニット３８に、ステージ６２、第１照明部１０１乃至第２照明部１０４、表示部３６、容器搬送機構３５、およびタッチパネル１５１が接続されている。タッチパネル１５１は、表示部３６の表示画面に重畳して設けられ、観察者の表示部３６の表示画面、より詳細にはタッチパネル１５１への接触を検出し、その接触位置を示す信号を制御ユニット３８に供給する。例えば、観察者は、タッチパネル１５１に触れることで入力操作を行うことができ、この入力操作により、各種の処理の実行を指示することができる。
　制御ユニット３８は、タッチパネル１５１から供給される信号に基づいて、表示部３６に観察画像を表示させたり、観察ユニット３７や容器搬送機構３５の動作を制御したりする。制御ユニット３８は、領域設定部１６１、観察制御部１６２、焦点位置検出部１６３、マクロ画像生成部１６４、および記録部１６５を備えている。
　領域設定部１６１は、観察対象の対象物に合焦する対物レンズ１２１の合焦位置、つまり対物レンズ１２１の焦点位置が対象物に位置するときの対物レンズ１２１の位置を検出するためのＡＦ（Auto Focus）領域を設定する。
　すなわち、ＡＦ領域は、培養容器６１上の領域のうち、オートフォーカス制御による合焦位置の検出に用いられる領域をいい、ＡＦ領域は、対物レンズ１２１の観察視野と同じ大きさ、かつ同じ形状の領域とされてもよく、対物レンズ１２１の観察視野よりも小さい領域とされてもよい。例えば、ＡＦ領域が対物レンズ１２１の観察視野と同形状かつ同面積である場合には、撮像された観察画像全体がＡＦ領域とされ、ＡＦ領域が対物レンズ１２１の観察視野よりも小さい場合には、観察画像のうちの所定の領域がＡＦ領域とされる。
　観察制御部１６２は、観察ユニット３７の各部、および容器搬送機構３５の動作を制御する。焦点位置検出部１６３は、領域設定部１６１により設定されたＡＦ領域と、撮像された観察画像とから、対物レンズ１２１の対象物への合焦位置を検出する。
　ここで、対物レンズ１２１の対象物への合焦位置とは、対物レンズ１２１の焦点（焦点面）が対象物（例えば、受精胚）に位置するときの、対物レンズ１２１のステージ６２に対するｚ方向（対物レンズ１２１の光軸方向）の相対的な位置をいう。培養観察装置１１では、対物レンズ１２１は固定されたままとされ、ステージ６２がｚ方向に移動するので、対物レンズ１２１の合焦位置は、例えば、対物レンズ１２１の焦点が対象物に位置するときのステージ６２のｚ方向の位置（ｚ座標）により表すことができる。
　なお、培養観察装置１１が、対物レンズ１２１が固定されたステージ６２に対して移動するような構成とされている場合には、対物レンズ１２１の合焦位置は、対物レンズ１２１そのもののｚ方向の位置とすることができる。
　マクロ画像生成部１６４は、培養容器６１の異なる位置を撮像して得られた複数の観察画像から、培養容器６１全体が表示される１つの画像をマクロ画像として生成する。記録部１６５は、例えば不揮発性のメモリからなり、制御ユニット３８が実行するプログラムや、各種のデータ、観察画像などを記録する。なお、記録部１６５には、マクロ画像も記録されるが、マクロ画像ではなく、培養容器６１の異なる位置を撮像して得られた複数の観察画像のそれぞれが、そのまま記録部１６５に記録されるようにしてもよい。つまり、マクロ画像を構成する複数の観察画像のそれぞれが、記録されてもよい。
［培養観察装置の動作］
　ところで、観察者がタッチパネル１５１を操作して、ストッカ３４の所定の棚に収納されている培養容器６１内の受精胚の観察の開始を指示すると、制御ユニット３８は、観察者の操作により指定された培養容器６１をステージ６２上に移動させる。すなわち、観察制御部１６２は、タッチパネル１５１からの信号に応じて、容器搬送機構３５を制御し、容器搬送機構３５は、その制御に従ってストッカ３４に収納されている培養容器６１を搬送して、ステージ６２上に載置する。
　観察者により指定された培養容器６１がステージ６２上に載置されると、培養観察装置１１は、培養容器６１内の受精胚を観察する観察処理を開始する。以下、図５のフローチャートを参照して、観察処理について説明する。
　ステップＳ１１において、容器観察部１０２は、ステージ６２上の培養容器６１全体の画像を撮像する。
　すなわち、観察制御部１６２は、ステージ６２を制御して、ステージ６２上の培養容器６１が、第２照明部１０４からの照明光の光路上に配置されるように、ステージ６２を移動させる。そして、観察制御部１６２は第２照明部１０４に照明光を照射させるとともに、容器観察部１０２に、培養容器６１全体を被写体とする観察画像を撮像させる。観察画像が撮像されると、制御ユニット３８は容器観察部１０２から観察画像を取得して表示部３６に供給し、観察画像を表示させる。
　ステップＳ１２において、制御ユニット３８は、表示部３６に表示された観察画像において、観察の対象とすべき対象物が含まれている検出領域の指定を受け付ける。
　すなわち、表示部３６に観察画像が表示されると、観察者は表示部３６の表示画面に対する入力操作を行って、表示されている観察画像上の領域であって、観察対象とすべき対象物が含まれている領域を検出領域として指定する。制御ユニット３８は、タッチパネル１５１からの信号に基づいて、観察者により指定された領域を検出領域として選択する。
　例えば、培養容器６１の底に、観察対象とされる受精胚が含まれるいくつかの培地ドロップが配置され、培養容器６１内が無色透明のミネラルオイルで満たされているものとする。そして、そのような場合に、容器観察部１０２により撮像された観察画像として、図６に示す観察画像が表示部３６に表示されたとする。
　図６の例では、観察画像の中央に円形の培養容器６１が表示されており、矢印Ｃ１１により示される位置は、培養容器６１の底の中心位置（以下、中心位置Ｃ１１と称する）を示している。また、培養容器６１内には、２つの培地ドロップＤ１１－１および培地ドロップＤ１１－２が形成されている。
　培地ドロップＤ１１－１は中心位置Ｃ１１から見て図中、右上方向に位置し、培地ドロップＤ１１－２は中心位置Ｃ１１から見て図中、左下方向に位置している。そして、例えば観察者により、培地ドロップＤ１１－１全体を含む、培地ドロップＤ１１－１近傍の領域Ｒ１１－１と、培地ドロップＤ１１－２全体を含む、培地ドロップＤ１１－２近傍の領域Ｒ１１－２とが、検出領域として指定される。
　なお、以下、培地ドロップＤ１１－１および培地ドロップＤ１１－２を個々に区別する必要のない場合、単に培地ドロップＤ１１とも称し、領域Ｒ１１－１および領域Ｒ１１－２を個々に区別する必要のない場合、単に領域Ｒ１１とも称する。
　培養容器６１内に形成された培地ドロップＤ１１は、例えば図７に示すように、ｚ方向にある程度の厚みを有している。なお、図７において、縦方向はｚ方向、つまり容器観察部１０２内の対物レンズおよび対物レンズ１２１の光軸方向を示している。
　図７の例では、培養容器６１の底Ｂ１１に半球状の培地ドロップＤ１１が形成されており、培地ドロップＤ１１の内部には、観察対象とされる１つの受精胚Ｈ１１が浮遊している。培地ドロップＤ１１は底Ｂ１１に対して移動しないが、受精胚Ｈ１１は培地ドロップＤ１１内の任意の位置に移動する。
　そのため培養観察装置１１では、対物レンズ１２１の受精胚Ｈ１１への合焦位置を検出するにあたり、まずオートフォーカス制御によって、対物レンズ１２１の培地ドロップＤ１１への合焦位置が検出される。つまり対物レンズ１２１の焦点のｚ方向の位置が、矢印Ａ１１に示される、培地ドロップＤ１１の境界部分（エッジ部分）と、培養容器６１の底Ｂ１１との境界の位置となるような、ステージ６２のｚ方向の位置が検出される。
　そして、培地ドロップＤ１１への合焦位置を基準としたオートフォーカス制御により、対物レンズ１２１の受精胚Ｈ１１への合焦位置、つまり対物レンズ１２１の焦点のｚ方向の位置が、矢印Ａ１２に示される受精胚Ｈ１１の中心の位置となるような、ステージ６２のｚ方向の位置が検出される。
　これは、移動する受精胚Ｈ１１への合焦位置に比べて、移動のない培地ドロップＤ１１への合焦位置を検出することは比較的容易であり、さらに培地ドロップＤ１１への合焦位置を基準として、受精胚Ｈ１１への合焦位置を検出すれば、より確実に受精胚Ｈ１１への合焦位置を検出できるからである。
　受精胚Ｈ１１は、培地ドロップＤ１１内を浮遊するが、培地ドロップＤ１１内における培養容器６１の底Ｂ１１付近に位置することが多い。そこで、培地ドロップＤ１１への合焦位置、つまり底Ｂ１１を基準として、底Ｂ１１から図中、上方向に所定の距離の範囲内を検出対象とすれば、従来のように、何ら基準位置を設けずに受精胚Ｈ１１への合焦位置を検出する場合と比べて、より確実に合焦位置を検出することができる。
　なお、以下において、培地ドロップＤ１１の境界（表面）部分と、培養容器６１の底Ｂ１１との境界部分、つまり図７において、培地ドロップＤ１１の半球状の表面と底Ｂ１１とが交わる部分を、培地ドロップＤ１１のエッジ部分と称することとする。
　図５のフローチャートの説明に戻り、観察者により、観察画像上のいくつかの領域Ｒ１１が検出領域として指定されると、制御ユニット３８は、指定された検出領域のうちの１つを、処理対象とする検出領域として選択する。
　そして、ステップＳ１３において、制御ユニット３８の領域設定部１６１は、処理対象とされた検出領域内の培地ドロップに対して、ＡＦ領域を設定する。
　例えば、領域設定部１６１は、図６において、処理対象とされた検出領域内の培地ドロップＤ１１が中心位置Ｃ１１よりも図中、右側に位置する場合、検出領域とされた矩形の領域Ｒ１１の左側の辺の中心の位置を中心とする、所定の大きさの領域をＡＦ領域とする。
　なお、ＡＦ領域の大きさは、ＡＦ領域に培地ドロップＤ１１のエッジ部分が含まれるような大きさとされる。ここで、ＡＦ領域に培地ドロップＤ１１のエッジ部分が含まれるようにするのは、そのエッジ部分のコントラスト強度に基づいて合焦位置を検出するからである。
　具体的には、図６の領域Ｒ１１－１が処理対象の検出領域とされた場合、図８に示すように、領域Ｒ１１－１の図中、左側の辺の中心の位置Ｃ２１－１を中心とする、所定の大きさの領域Ｒ２１－１がＡＦ領域として選択される。領域Ｒ２１－１には、培地ドロップＤ１１－１の図中、左側のエッジ部分が含まれている。
　また、例えば、領域設定部１６１は、図６において、処理対象とされた検出領域内の培地ドロップＤ１１が中心位置Ｃ１１よりも図中、左側に位置する場合、検出領域とされた矩形の領域Ｒ１１の右側の辺の中心の位置を中心とする、所定の大きさの領域をＡＦ領域とする。なお、ＡＦ領域の大きさは、ＡＦ領域に培地ドロップＤ１１のエッジ部分が含まれるような大きさとされる。
　具体的には、図６の領域Ｒ１１－２が処理対象の検出領域とされた場合、図９に示すように、領域Ｒ１１－２の図中、右側の辺の中心の位置Ｃ２１－２を中心とする、所定の大きさの領域Ｒ２１－２がＡＦ領域として選択される。領域Ｒ２１－２には、培地ドロップＤ１１－２の図中、右側のエッジ部分が含まれている。
　なお、以下、位置Ｃ２１－１および位置Ｃ２１－２を個々に区別する必要のない場合、単に位置Ｃ２１とも称し、領域Ｒ２１－１および領域Ｒ２１－２を個々に区別する必要のない場合、単に領域Ｒ２１とも称する。
　このように、検出領域とされた領域Ｒ１１の中心位置Ｃ１１側の境界上の位置Ｃ２１を中心とし、培地ドロップＤ１１のエッジ部分を含む領域Ｒ２１をＡＦ領域として選択することで、より簡単かつ確実に培地ドロップＤ１１への合焦位置を検出することができる。
　例えば、通常、合焦位置の検出は、対物レンズ１２１からステージ６２までの距離を変化させながら複数の観察画像を撮像し、それらの観察画像のうち、コントラスト強度が最大となる観察画像を検出することにより行われる。つまり、コントラスト強度が最大である観察画像が撮像されたときの対物レンズ１２１の位置が、対物レンズ１２１の対象物への合焦位置であるとされる。
　また、培養容器６１の端近傍、つまり培養容器６１の側壁面近傍においては、培養容器６１に照射された照明光が側壁面でけられて照明のむら、つまり明るさにむらが生じる。このような照明むらが生じると、照明むらによりコントラストが変化するので、照明のむらを含む領域をＡＦ領域として用いると、対物レンズ１２１の対象物への合焦位置の誤検出が生じ、合焦位置の検出精度が低下してしまう。
　そこで、培養観察装置１１は、誤検出の要因となる領域がＡＦ領域に含まれないように、培地ドロップＤ１１から見て、培養容器６１の中心位置Ｃ１１側の領域をＡＦ領域として選択する。これにより、より簡単かつ確実に対象物（培地ドロップＤ１１）への合焦位置を検出することができる。
　なお、ＡＦ領域とされる領域は、培地ドロップＤ１１のエッジ部分を含み、かつ照明むらの生じない領域であればよい。
　したがって、例えば、培養容器６１の側壁面から所定の距離Ｌ以内の領域にのみ照明むらが生じる場合には、培養容器６１の側壁面から距離Ｌ以内にある領域が含まれず、かつ培地ドロップＤ１１のエッジ部分が含まれる領域を、ＡＦ領域とすればよい。
　図５のフローチャートの説明に戻り、ＡＦ領域が設定されると、観察制御部１６２は顕微観察部１０３を制御し、対物レンズ１２１－１および中間変倍レンズ１２２－１が位相差観察光路上に配置されるように、対物レンズ１２１－１および中間変倍レンズ１２２－１を移動させる。
　また、観察制御部１６２はステージ６２を制御し、ステージ６２上の培養容器６１が位相差観察光路上に配置されるように、ステージ６２を移動させる。より詳細には、観察制御部１６２は、処理対象とされている検出領域に対して定められたＡＦ領域の中心位置が、位相差観察光路上に位置するように、ステージ６２を移動させる。この場合、例えば、対物レンズ１２１の観察視野全体がＡＦ領域となるようにされる。つまり、観察画像全体がＡＦ領域とされる。
　さらに、観察制御部１６２は第１照明部１０１を制御して、照明光を培養容器６１に照射させる。これにより、培養容器６１の光学倍率２倍での位相差観察が可能となる。
　ステップＳ１４において、観察制御部１６２は、ステージ６２をｚ方向に移動させながら、カメラ１２４にステージ６２の各位置での観察画像を撮像させる。すなわち、第１照明部１０１から培養容器６１のＡＦ領域に照射された照明光は、ＡＦ領域（例えば、培地ドロップ等）を透過して対物レンズ１２１－１に入射する。
　そして、対物レンズ１２１－１に入射した照明光は、対物レンズ１２１－１により集光され、さらに中間変倍レンズ１２２－１および結像光学系１２３を通って、カメラ１２４に入射する。カメラ１２４は、ステージ６２の移動に合わせて、結像光学系１２３から入射した照明光を光電変換することで、ＡＦ領域を含む領域の観察画像を撮像する。
　これにより、ステージ６２がｚ方向の各位置のそれぞれにある状態における観察画像のそれぞれが得られるので、制御ユニット３８は、カメラ１２４から撮像された複数の観察画像を取得する。
　ステップＳ１５において、焦点位置検出部１６３は、カメラ１２４から取得された複数の観察画像に基づいて、対物レンズ１２１－１の培地ドロップへの合焦位置（以下、特に境界合焦位置と称することとする）を検出する。すなわち、焦点位置検出部１６３は、複数の観察画像のそれぞれのコントラスト強度を求め、コントラスト強度が最大である観察画像が撮像されたときのステージ６２のｚ方向の位置を、境界合焦位置とする。
　このようにして検出された境界合焦位置は、対物レンズ１２１－１の焦点位置が、培地ドロップのエッジ部分と、培養容器６１の底との境界位置となるときのステージ６２の位置である。
　なお、境界合焦位置を検出するための観察画像の撮像時には、培地ドロップのエッジ部分をより正確に検出できるように、焦点深度が狭い高ＮＡ（Numerical Aperture）の光学系が用いられることが好ましい。
　ステップＳ１６において、観察制御部１６２はタイリングを行う。すなわち、観察制御部１６２は、顕微観察部１０３を制御し、対物レンズ１２１－２および中間変倍レンズ１２２－２が位相差観察光路上に配置されるように、対物レンズ１２１－２および中間変倍レンズ１２２－２を移動させる。これにより、培養容器６１の光学倍率４倍での位相差観察が可能となる。
　なお、より詳細には、対物レンズ１２１の切り替えに合わせて、切り替え後の対物レンズ１２１－２の焦点位置が、培地ドロップのエッジ部分と、培養容器６１の底との境界位置となるように、観察制御部１６２の制御によりステージ６２が移動される。
　さらに、観察制御部１６２は、ステージ６２をｘｙ方向に移動させながら、複数回の撮像により、処理対象となっている検出領域の全ての領域が撮像されるように、カメラ１２４にステージ６２の各位置での観察画像を撮像させる。
　これにより、例えば、図１０に示すように、検出領域とされた領域Ｒ１１の全体が複数回に分けて撮像される。なお、図１０において、１つの四角形、例えば領域ＲＳ１１は、１回の撮像により得られた観察画像に含まれる領域を示している。
　図１０の例では、縦方向に５回、横方向に５回の合計２５回の撮像により、領域Ｒ１１全体が撮像されている。また、各観察画像は、隣接する観察画像と重なる部分を有している。すなわち、検出領域において、観察画像として撮像される１つの領域の端近傍の領域は、他の観察画像として撮像される領域にも含まれる。
　このようにして検出領域内の各領域の観察画像が撮像されると、制御ユニット３８は、これらの複数の観察画像をカメラ１２４から取得する。
　ステップＳ１７において、マクロ画像生成部１６４は、タイリングにより得られた検出領域の各領域の観察画像に基づいて、検出領域内の受精胚の位置（以下、受精胚位置と称する）を特定する。例えば、マクロ画像生成部１６４は、各観察画像について、観察画像に含まれる物体の形状と大きさを求めて、その物体が受精胚であるか否かを判定することで、検出領域内の受精胚位置を特定する。
　例えば、図１０の例では、検出領域とされた領域Ｒ１１内における領域ＲＳ１１内に受精胚Ｈ１１が位置しているので、領域ＲＳ１１の観察画像から受精胚Ｈ１１が検出され、その受精胚Ｈ１１の位置が受精胚位置とされる。
　ステップＳ１８において、マクロ画像生成部１６４は、タイリングにより得られた複数の観察画像のそれぞれを、それらの観察画像の被写体となった領域と同じ位置関係となるように並べて１つの画像を生成し、その画像をマクロ画像とする。すなわち、マクロ画像は、複数の観察画像を並べて合成することにより得られた、検出領域全体の画像となる。
　なお、マクロ画像を得るための観察画像の撮像時には、検出領域全体、特に受精胚への焦点ずれをより小さくするために、焦点深度が広い低ＮＡの光学系が用いられることが好ましい。
　ステップＳ１９において、培養観察装置１１は、粗スキャン処理を行い、処理対象の検出領域内の受精胚へのおおよその合焦位置を検出する。例えば、粗スキャン処理では、受精胚位置を中心とする領域がＡＦ領域とされ、かつ培地ドロップへの合焦位置が基準とされて、オートフォーカス制御が行われる。なお、粗スキャン処理の詳細は後述する。
　ステップＳ２０において、培養観察装置１１は本スキャン処理を行い、処理対象の検出領域内の受精胚へのより正確な合焦位置を検出する。例えば、本スキャン処理では、受精胚位置を中心とする領域がＡＦ領域とされ、かつ粗スキャン処理で得られた合焦位置が基準とされてオートフォーカス制御が行われる。また、本スキャン処理では、ステージ６２のｚ方向の各位置での観察画像が撮像され、それらの観察画像、受精胚位置、対物レンズ１２１の受精胚への合焦位置、およびマクロ画像が記録部１６５に記録される。なお、本スキャン処理の詳細は後述する。
　ステップＳ２１において、制御ユニット３８は、最終的に得られた対物レンズ１２１の受精胚への合焦位置に、ステージ６２（対物レンズ１２１）が位置する状態で撮像された観察画像を表示部３６に供給し、表示部３６に観察画像を表示させる。
　ステップＳ２２において、制御ユニット３８は、処理を終了するか否かを判定する。例えば、観察者により指定された複数の検出領域の全てが処理対象とされて合焦位置が検出された場合、処理は終了すると判定される。
　ステップＳ２２において、処理を終了しないと判定された場合、まだ選択されていない次の検出領域が処理対象とされて、処理はステップＳ１３に戻り、上述した処理が繰り返される。
　これに対して、ステップＳ２２において、処理を終了すると判定された場合、容器搬送機構３５は観察制御部１６２の制御に従って、ステージ６２上の培養容器６１をストッカ３４の棚内に搬送し、観察処理は終了する。
　以上のように、培養観察装置１１は、培養容器６１内の培地ドロップのエッジ部分を含み、かつ照明むらのない領域をＡＦ領域として選択し、ＡＦ領域を対象として培地ドロップの境界合焦位置を検出する。そして、培養観察装置１１は、境界合焦位置を基準として、さらに受精胚への合焦位置を検出する。
　このように、培地ドロップのエッジ部分を含み、かつ照明むらのない領域をＡＦ領域として境界合焦位置を検出することで、より簡単かつ確実に対物レンズ１２１の培地ドロップへの境界合焦位置を検出することができる。さらに、この境界合焦位置を基準として、受精胚への合焦位置の検出を行えば、最終的に得たい受精胚への合焦位置を、より簡単かつ確実に検出することができる。
　次に、図１１のフローチャートを参照して、図５のステップＳ１９の処理に対応する粗スキャン処理について説明する。
　ステップＳ５１において、観察制御部１６２は、観察ユニット３７における培養容器６１の観察時の光学倍率を変更する。
　すなわち、観察制御部１６２は顕微観察部１０３を制御し、対物レンズ１２１－３および中間変倍レンズ１２２－３が位相差観察光路上に配置されるように、対物レンズ１２１－３および中間変倍レンズ１２２－３を移動させる。
　また、観察制御部１６２は、ビニングにより観察画像の解像度が低くなるようにカメラ１２４の設定を変更するとともに、第１照明部１０１を制御して、照明光を培養容器６１に照射させる。これにより、培養容器６１の光学倍率１０倍での位相差観察が可能となる。なお、光学倍率は、受精胚が観察画像全体に収まれば１０倍でなくてもよく、例えば観察者により予め指定された倍率とされてもよい。
　さらに、観察制御部１６２はステージ６２を制御し、図５のステップＳ１７において特定された受精胚位置が、位相差観察光路上に位置するように、ステージ６２をｘｙ方向に移動させる。同時に、観察制御部１６２はステージ６２を制御し、ステージ６２のｚ方向の位置が、図５のステップＳ１５において検出された境界合焦位置となるように、ステージ６２を移動させる。
　これにより、対物レンズ１２１の焦点位置は、ｘｙ方向の位置が受精胚と同じであり、ｚ方向の位置が培地ドロップと培養容器６１の底との境界面の位置となる。したがって、この状態からステージ６２（対物レンズ１２１）をｚ方向に移動させていけば、受精胚に合焦させることができる。
　さらに、領域設定部１６１は、例えば、図１２に示すように、受精胚位置を中心とし、培地ドロップＤ１１全体が含まれる、培地ドロップＤ１１近傍の領域ＲＦ１１をＡＦ領域として設定する。この領域ＲＦ１１は、その境界が培地ドロップＤ１１の境界と近接した位置となるようにされており、培地ドロップＤ１１が領域ＲＦ１１の殆どの領域を占めるように決定される。
　このように、培地ドロップＤ１１全体を含む、培地ドロップＤ１１近傍の領域ＲＦ１１をＡＦ領域として選択することで、より確実に受精胚への合焦位置を検出できるようになる。すなわち、培養容器６１には、培地ドロップＤ１１の他に異物が混入しているため、ＡＦ領域が広過ぎるとＡＦ領域に多くの異物が含まれ、合焦位置の検出精度が低下してしまう。そこで、培地ドロップＤ１１近傍の領域をＡＦ領域とすることで、ＡＦ領域に含まれる異物を少なくし、合焦位置をより精度よく検出することができるようになる。
　図１１のフローチャートの説明に戻り、ステップＳ５２において、観察制御部１６２は、ステージ６２を境界合焦位置からｚ方向に移動させながら、カメラ１２４にステージ６２の各位置での観察画像を撮像させる。すなわち、第１照明部１０１からの照明光は、培養容器６１、ステージ６２、対物レンズ１２１－３、中間変倍レンズ１２２－３、および結像光学系１２３を通ってカメラ１２４に入射し、カメラ１２４により観察画像が撮像される。
　例えば、対物レンズ１２１のｚ方向の焦点位置が、図７の矢印Ａ１１に示される位置に位置する状態（ステージ６２が境界合焦位置にある状態）から、矢印Ａ１２に示される位置よりも図中、上側の予め定められた位置（例えば、培地ドロップＤ１１の上側の端付近）まで移動される。そして、対物レンズ１２１がｚ方向の各位置に位置する状態のそれぞれにおいて、観察画像が撮像される。
　このように、境界合焦位置を含む所定のｚ方向の範囲内の各位置にステージ６２を移動させ、ステージ６２が各位置にある状態で観察画像を撮像して、受精胚への合焦位置を検出すれば、検出精度を向上させることができる。なお、ステージ６２（対物レンズ１２１）をｚ方向に移動させる範囲は、確実に受精胚に合焦されるように、ある程度広い範囲とされる。
　ｚ方向の各位置での観察画像が撮像されると、制御ユニット３８は、カメラ１２４から撮像された複数の観察画像を取得する。なお、撮像された観察画像は、ＡＦ領域が含まれる画像であればよく、対物レンズ１２１－３の観察視野と、ＡＦ領域とが一致している必要はない。
　図１１のフローチャートの説明に戻り、ステップＳ５３において、焦点位置検出部１６３は、カメラ１２４から取得された複数の観察画像に基づいて、対物レンズ１２１－３の受精胚への合焦位置（以下、特に仮受精胚合焦位置と称することとする）を検出する。
　すなわち、焦点位置検出部１６３は、複数の観察画像のそれぞれのＡＦ領域内におけるコントラスト強度を求め、コントラスト強度が最大である観察画像が撮像されたときのステージ６２のｚ方向の位置を、仮受精胚合焦位置とする。
　このようにして検出された仮受精胚合焦位置は、対物レンズ１２１－３の焦点位置が、受精胚の位置となるときのステージ６２のｚ方向の位置である。但し、粗スキャン処理においては、解像度の低い観察画像を用いての検出であるため、ある程度の検出精度しか得ることはできない。
　ステップＳ５４において、観察制御部１６２は、ステージ６２が仮受精胚合焦位置に位置する状態で撮像された観察画像を用いて、本スキャン処理の実行時に設定すべき、カメラ１２４の露光時間を算出する。例えば、観察制御部１６２は、観察画像全体の各画素の輝度値を求め、それらの輝度値の平均値に予め定められた係数を乗算することにより、露光時間を算出する。
　このようにして算出された露光時間は、受精胚を被写体として撮像するときに適したものである。すなわち、受精胚が培地ドロップ内のどの位置にあるかによって、観察画像の撮像時における受精胚近傍の明るさが大きく変化するため、露光時間を適切に設定する必要がある。
　ここで、ステージ６２が仮受精胚合焦位置に位置する状態は、受精胚に大まかにピントが合っている状態であり、この状態で撮像される観察画像では、被写体とすべき受精胚が画像の中央に位置している。つまり、この状態で撮像された観察画像は、本スキャン処理において、より正確に受精胚にピントが合った状態で撮像される観察画像とほぼ同じ環境で撮像される画像である。そこで、受精胚に大まかにピントが合っている状態で撮像された観察画像を用いて、その撮像環境に適した露光時間を算出し、本スキャン処理において、算出された露光時間で撮像を行えば、より適切な明るさの観察画像を得ることができる。
　このようにして露光時間が算出されると、粗スキャン処理は終了し、処理は図５のステップＳ２０に進む。
　このように、粗スキャン処理では、培地ドロップへの合焦位置を基準として、受精胚への合焦位置を検出することで、受精胚への大まかな合焦位置をより確実に得ることができる。しかも、受精胚近傍の領域のみをＡＦ領域として用いるので、さらに合焦位置の検出精度を向上させることができる。
　次に、図１３のフローチャートを参照して、図５のステップＳ２０の処理に対応する本スキャン処理について説明する。
　ステップＳ８１において、観察制御部１６２は、観察ユニット３７における培養容器６１の観察時の設定を変更する。すなわち、観察制御部１６２は、カメラ１２４の露光時間が、図１１のステップＳ５４の処理で算出した露光時間に変更され、かつ観察画像の解像度が粗スキャン処理時よりも高くなるようにカメラ１２４の設定を変更する。
　また、観察制御部１６２は、第１照明部１０１を制御して、照明光を培養容器６１に照射させる。これにより、培養容器６１の光学倍率１０倍での位相差観察が可能となる。
　さらに、観察制御部１６２はステージ６２を制御し、図５のステップＳ１７において特定された受精胚位置が、位相差観察光路上に位置するように、ステージ６２をｘｙ方向に移動させる。同時に、観察制御部１６２はステージ６２を制御し、ステージ６２のｚ方向の位置が、図１１のステップＳ５３において検出された仮受精胚合焦位置となるように、ステージ６２を移動させる。
　これにより、対物レンズ１２１の焦点位置はほぼ受精胚と同じ位置となる。したがって、この状態からステージ６２を、仮受精胚合焦位置を中心とする比較的狭いｚ方向の範囲内で移動させていけば、より正確に受精胚に合焦させることができる。
　さらに、領域設定部１６１は、粗スキャン処理時と同様に、受精胚位置を中心とし、培地ドロップ全体が含まれる、培地ドロップ近傍の領域をＡＦ領域として設定する。このＡＦ領域は、粗スキャン処理時のＡＦ領域と同じ領域である。
　ステップＳ８２において、観察制御部１６２は、ステージ６２を仮受精胚合焦位置からｚ方向に移動させながら、カメラ１２４にステージ６２の各位置での観察画像を撮像させる。すなわち、第１照明部１０１からの照明光は、培養容器６１、ステージ６２、対物レンズ１２１－３、中間変倍レンズ１２２－３、および結像光学系１２３を通ってカメラ１２４に入射し、カメラ１２４により観察画像が撮像される。
　例えば、対物レンズ１２１のｚ方向の焦点位置が、図７の矢印Ａ１２に示される位置にある状態から、その位置を中心とする予め定められた範囲内の各位置に移動される。そして、対物レンズ１２１がｚ方向の各位置に位置する状態のそれぞれにおいて、観察画像が撮像される。換言すれば、ステージ６２が仮受精胚合焦位置を中心とする所定の範囲内の各位置に移動されて、観察画像が撮像される。
　このように、仮受精胚合焦位置を中心とする所定のｚ方向の範囲内の各位置にステージ６２を移動させ、ステージ６２が各位置にある状態で観察画像を撮像して、受精胚への合焦位置を検出すれば、より正確な合焦位置を検出することができる。
　なお、本スキャン処理において対物レンズ１２１（ステージ６２）を移動させるｚ方向の範囲は、粗スキャン処理において対物レンズ１２１を移動させる範囲よりも狭い範囲とされる。これは、粗スキャン処理により、既に受精胚への大まかな合焦位置が検出されているため、その合焦位置近傍を検出対象とすればよいからである。
　ｚ方向の各位置での観察画像が撮像されると、制御ユニット３８は、カメラ１２４から撮像された複数の観察画像を取得する。なお、撮像された観察画像は、ＡＦ領域が含まれる画像であればよい。
　図１３のフローチャートの説明に戻り、ステップＳ８３において、焦点位置検出部１６３は、カメラ１２４から取得された複数の観察画像に基づいて、対物レンズ１２１－３の受精胚への合焦位置（以下、特に最終受精胚合焦位置と称することとする）を検出する。
　すなわち、焦点位置検出部１６３は、複数の観察画像のそれぞれのＡＦ領域内におけるコントラスト強度を求め、コントラスト強度が最大である観察画像が撮像されたときのステージ６２のｚ方向の位置を、最終受精胚合焦位置とする。
　このようにして検出された最終受精胚合焦位置は、対物レンズ１２１－３の焦点位置が、受精胚の位置となるときのステージ６２の位置である。本スキャン処理は、粗スキャン処理よりも、より解像度の高い観察画像を用いての検出であるため、最終受精胚合焦位置は、仮受精胚合焦位置よりも、より正確な合焦位置を示しているはずである。
　ステップＳ８４において、制御ユニット３８は、本スキャン処理において撮像された複数の観察画像、最終受精胚合焦位置、受精胚位置、およびマクロ画像を記録部１６５に記録させる。なお、より詳細には、各観察画像と関連付けられて、その観察画像が撮像されたときのｘ，ｙ，ｚ方向のステージ６２の位置も記録される。
　このようにして記録された観察画像のうち、最終受精胚合焦位置で撮像された観察画像が、図５のステップＳ２１において、表示部３６に表示されることになる。観察画像等が記録部１６５に記録されると、本スキャン処理は終了し、その後、処理は図５のステップＳ２１に進む。
　このように、本スキャン処理では、受精胚への仮受精胚合焦位置を基準として、受精胚への合焦位置を検出することで、受精胚へのより正確な合焦位置を、より簡単かつ確実に得ることができる。しかも、受精胚近傍の領域のみをＡＦ領域として用いるので、さらに合焦位置の検出精度を向上させることができる。
　なお、以上においては、観察者により培養容器６１と、その培養容器６１の観察が指示されたときに観察処理が行われると説明したが、一度、観察者により検出領域が指定された後は、観察者の指示によらず、一定の時間間隔で観察処理が行われる。そのような場合、先に指定された各検出領域が順番に処理対象とされて、観察画像が撮像される。
　また、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
　１１　培養観察装置，　３７　観察ユニット，　３８　制御ユニット，　６２　ステージ，　１０１　第１照明部，　１０２　容器観察部，　１０３　顕微観察部，　１０４　第２照明部，　１５１　タッチパネル，　１６１　領域設定部，　１６２　観察制御部，　１６３　焦点位置検出部，　１６４　マクロ画像生成部，　１６５　記録部

Claims (9)

  1. 　対物レンズの対象物への合焦位置を検出するフォーカス制御装置であって、
    　前記合焦位置の検出の対象となる第１の対象領域として、ステージに載置された容器の端から所定距離内にある領域が含まれず、かつ前記容器内の前記対象物の境界部分が含まれる領域を選択する領域設定手段と、
    　前記対物レンズと前記ステージとの前記対物レンズの光軸方向への距離を変化させながら、前記距離が異なる状態で、複数の前記第１の対象領域の観察画像を撮像させる撮像制御手段と、
    　複数の前記観察画像に基づいて、前記合焦位置を検出する合焦位置検出手段と
    　を備えることを特徴とするフォーカス制御装置。
  2. 　前記対象物は、内部に受精胚が含まれた培地ドロップとされ、
    　前記領域設定手段は、前記合焦位置の検出後、さらに前記培地ドロップ全体が含まれる、前記培地ドロップ近傍の領域を、前記受精胚への合焦位置の検出の対象となる第２の対象領域として選択し、
    　前記撮像制御手段は、前記対物レンズが前記対象物への前記合焦位置にある状態から前記距離を変化させながら、前記距離が異なる状態で、複数の前記第２の対象領域の観察画像を撮像させ、
    　前記合焦位置検出手段は、前記複数の前記第２の対象領域の観察画像に基づいて、前記対物レンズの前記受精胚への合焦位置を検出する
    　ことを特徴とする請求項１に記載のフォーカス制御装置。
  3. 　前記第１の対象領域は、前記対象物における前記容器の中心側の境界部分が含まれる領域とされる
    　ことを特徴とする請求項１に記載のフォーカス制御装置。
  4. 　前記領域設定手段は、前記対象物を含む予め指定された検出領域の境界上の点を中心とする、所定の大きさの領域を前記第１の対象領域として選択する
    　ことを特徴とする請求項１に記載のフォーカス制御装置。
  5. 　前記合焦位置検出手段は、前記複数の前記観察画像のうち、コントラスト強度が最も大きい観察画像を検出し、検出された前記観察画像が撮像されたときの、前記対物レンズの前記ステージに対する相対的な位置を前記合焦位置とする
    　ことを特徴とする請求項１に記載のフォーカス制御装置。
  6. 　培地ドロップ内の受精胚を観察し、前記受精胚を培養する培養観察装置において、
    　培養容器内の前記培地ドロップのエッジを含む領域を検出領域に設定する領域設定手段と、
    　前記検出領域において合焦位置を検出する合焦位置検出手段と、
    　前記合焦位置検出手段によって検出された合焦位置に基づいて、前記培地ドロップを撮像して観察画像を取得し、前記観察画像に基づき、前記培地ドロップ内の受精胚の位置を特定する特定手段と、
    　前記受精胚の位置に基づき、前記受精胚を観察する観察制御手段と
    　を備えることを特徴とする培養観察装置。
  7. 　前記領域設定手段により設定される前記検出領域は、前記培地ドロップのエッジの一部のみを含む領域に制限され、前記培養容器の側壁から遠い位置にある前記エッジの一部領域に設定される
    　ことを特徴とする請求項６に記載の培養観察装置。
  8. 　前記観察制御手段は、前記受精胚を観察する際に、前記特定手段によって撮像された倍率より高い倍率となるように撮影倍率を制御する
    　ことを特徴とする請求項６に記載の培養観察装置。
  9. 　前記特定手段は、前記培地ドロップを複数に分割して撮像し、複数の前記観察画像を合成して１つの観察画像を作成する
    　ことを特徴とする請求項６に記載の培養観察装置。
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