JP2006309088A - 顕微鏡合焦位置高精度計測法 - Google Patents

Abstract

【課題】光照射等に弱い生物標本や低反射率の試料に対して合焦位置および試料位置を蛍光像観察時にも損失無く高精度で広範囲に計測できる試料位置高精度計測法を提供する。
【解決手段】位置計測用の光を、対物レンズの辺縁部分の全反射領域を含む高開口数の領域に通すと、試料境界面からの全反射光及び大きな照明角度からの反射光により、透明試料等で低反射率の試料においても、強い反射光を得ることができる。試料境界面が高さ方向にΔｚ変化すると、反射光は試料境界面内で横方向にΔｘ＝ ２Δｚ×ｔａｎθで与えられるΔｘずれた位置から出てくると見なされ、入射角θを大きくすることにより、Δｚの変化量に対しても、より大きなΔｘの変化量を得ることができる。蛍光用のダイクロイックミラーを位置計測用と共通に用いて、顕微鏡像の光路上に位置計測光を導入することにより、蛍光像観察にも影響無く、試料位置の高精度計測ができる。
【選択図】 図１

Description

本発明は光学顕微鏡あるいは光を用いた計測装置の試料合焦位置高精度計測法に関し、特に蛍光像観察可能な顕微鏡及び位置計測に適した試料合焦位置高精度計測法に関する。

従来、オートフォーカスや形状観察において、図４のように、サンプルとして反射する試料あるいは散乱する試料に対物レンズを介して光を照射し、反射する光を結像レンズを介してＣＣＤカメラで撮影する。試料の深さ（高さ）方向位置を知る方法として顕微鏡で用いられる方法は、図４のように、照明光の半分を遮蔽し対物レンズの片側から光を入射し、試料境界面からの反射光を光センサーで検出する方法が用いられている。光センサー上に、反射光による試料境界面の像を結像させ、センサー上における反射光の非対称な像のボケ方を利用して、試料の高さ位置の変化を求める方法である。試料への照明光を光軸に関して片側のみにすると、反射光も片側のみとなるため、試料の高さが変化すると、センサー上での反射光の像が片側のみにボケるため反射光の中心位置も片側にずれ、反対方向に試料の高さが変化するとボケ方も反対側になることを利用するものである。このようなものは特許文献にも散見される（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。
特開平８−２３４０９３号公報 特開２００５−６２５１５号公報

従来の方法は、計測用の光を顕微鏡筒内の光路に導入するのに、図４のように、計測の光専用に蛍光用とは別途ハーフミラーもしくはダイクロイックミラーを用いる。顕微鏡観察の中でも蛍光観察のように微弱な光を観察する場合には、蛍光の少しの損失も像の劣化を招く。ダイクロイックミラーを用いたとしても、計測用の余分なダイクロイックミラーを蛍光が透過する際に、最小でも５から１０％程度の蛍光のロスを生じてしまう。

また、従来の方法は金属や半導体のように反射率の高い試料では、高精度で位置を計測することが可能であるが、生物試料やガラス表面のように低反射率の試料においてはマイクロメートル程度の精度しか得ることができなかった。

また従来法では、図４のように、試料境界面に計測用の光を対物レンズで点状に集光し、光照射に弱い生物標本などには良くない。合焦位置からはずれると、集光から急激に像がボケるので、合焦位置がはっきりする反面、計測できる範囲は狭くなりやすい。遮光板で照明光を半分にする方法は、照明光束が広いため、照明角度に依存するシグナルが平均されて弱まるという問題の他にも、物体面以外や対物レンズ中心部分で光が反射し無視できない誤差を生じるといった問題が生じる。

また、通常、標本の合焦位置を微細に調節した際、装置の機構的なドラフトや温度による変動により、試料の基準位置を操作者が目的とする位置に高精度で位置決めすることは至難の技であるというよりも不可能であった。

そこで、本発明は、顕微鏡観察や対物レンズを用いた位置計測において、蛍光像観察時にも蛍光の損失無く、生物試料のように光照射等に弱い標本に対しても損傷を与えることなく、透明試料等で低反射率の試料においても、焦点位置及び試料位置を高精度で広範囲に計測することができ、試料の基準位置を操作者が目的とする位置に高精度で位置決めすることができる試料合焦位置高精度計測法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、この発明の請求項１に係る試料焦位置高精度計測法は、蛍光像観察可能な顕微鏡および位置計測において、蛍光像観察には用いない波長の光を位置計測用に用い、前記位置計測用の光を光源より、蛍光用のダイクロイックミラーを用いて顕微鏡筒の光路上に導入して試料を照射し、試料境界面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサーに結像することにより、蛍光像観察時にも蛍光の損失無く、合焦位置および試料高さ位置を計測可能にした。

これにより、蛍光像観察には用いない波長の光を位置計測用に用いることにより、蛍光の励起ならびに蛍光像ともに影響されない。また、蛍光用のダイクロイックミラーとして、蛍光励起光と位置計測用光は反射し、蛍光は透過するものを用いることにより、蛍光用と位置計測用とに共通にダイクロイックミラーを使用することができる。前記ダイクロイックミラーの波長特性に関して、蛍光の透過率と蛍光励起光の反射率を重要視し、位置計測光の反射率は優先度を下げて設計してよいので、前記ダイクロイックミラーは様々な蛍光色素に対して蛍光特性を落とさずに製作するが可能である。位置計測用の光を顕微鏡筒内の光路に導入するのに、蛍光用のダイクロイックミラーを共通に用いるので、余分な計測用のダイクロイックミラー等を蛍光が透過することが一切無いため、蛍光の損失が生じない。

この発明の請求項２に係る試料合焦位置高精度計測法は、蛍光像観察可能な顕微鏡および位置計測において、位置計測用の光を光源より、蛍光用のダイクロイックミラーを用いて顕微鏡筒の光路上に導入し、対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に位置計測用光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料境界面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサー上に結像し、試料境界面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置および試料高さ位置を蛍光像観察にも損失無く計測可能にした。

これにより、試料と支持基板（カバーガラス）との屈折率の違いから、臨界角以上の大きな角度で照明光を入射すると、試料境界面で全反射が起こる。また、臨界角以下でも臨界角近くなると反射光強度が急に強くなる（図５）。この全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、強い強度の反射光を得ることができ、位置計測用光センサーに達する光の強度が強くなるため、高精度で、試料位置および合焦位置を計測することができる。

試料境界面で計測用の光を点状に集光しないので、光照射に弱い生物標本への悪い影響を避けられる。照明光は合焦位置で点状でなく、光源のスリットの像に対応した領域を照明するため、試料高さ位置が合焦位置から変化しても照明範囲の急激な変化が無く、計測できる範囲を広くするのに適している。照明光束が対物レンズ辺縁部分の限られた領域を通って広くないので、照明角度に依存して得られるシグナルを大きくとれることに加え、物体面以外での反射や、対物レンズ中心部分での反射（図５のｄ＝０付近での反射）といった問題を避けられる。照明光と反射光が光軸を挟んで離れているので、センサー手前で反射光を照明光から損失なく全反射プリズム等のミラーで完全に分離することができ、低反射率の試料にも有利である。

この発明の請求項３に係る試料合焦位置高精度計測法は、蛍光像観察可能な顕微鏡および位置計測において、光源として、非干渉性（インコヒーレント）光源もしくは非干渉性化および低干渉性化したコヒーレント光源を用い、この光源より位置計測用の光を、蛍光用のダイクロイックミラーを用いて顕微鏡筒の光路上に導入し試料を照射し、試料境界面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサー上に結像し、より安定で高精度に合焦位置および試料位置を蛍光像観察にも損失無く計測可能にした。

これにより、光源にレーザー光を照明光として用いると、干渉が生じ、位置計測にノイズやドリフトをもたらし、計測精度が悪くなることが起こる。この場合に、非干渉性（インコヒレント）光源もしくは非干渉性化および低干渉性化したコヒーレント光源を用いて、上記請求項１に記載の試料合焦位置高精度計測法を行うと、蛍光像観察にも損失無くより安定した高精度な位置計測を行うことができる。

この発明の請求項４に係る試料合焦位置高精度計測法は、蛍光像観察可能な顕微鏡および位置計測において、位置計測用の光を光源より、蛍光用のダイクロイックミラーを用いて顕微鏡筒の光路上に導入し、対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に位置計測用光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料境界面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサー上に結像し、位置計測用光センサーからの出力を試料高さ位置の関数として求めておいて、試料位置を光センサーから計測し、さらに、直線状に配置された光センサーを用いてより広い範囲の試料高さ位置を計測可能にし、試料境界面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置および試料位置を蛍光像観察にも損失無く広範囲に計測可能にした。

これにより位置計測用光センサーからの出力を、試料高さ位置の変化Δｚの関数として求めておくことにより、試料高さ位置Δｚを光センサー出力から求めることができる。光センサー位置を試料境界面に観察の焦点を合わせた時の試料境界面と共役な位置に置けば即ちセンサー位置を試料観察面と共役な位置に置けば、試料境界面を基準点として試料位置を求めることができる。さらに、直線状に配置された光センサーを用いれば、複数のセンサーからの出力を用いることによりΔｚの計測範囲を広げることができ、より広い範囲の試料高さ位置Δｚを計測可能である。

この発明の請求項５に係る試料合焦位置高精度計測法は、蛍光像観察可能な顕微鏡および位置計測において、位置計測用の光を光源より、蛍光用のダイクロイックミラーを用いて顕微鏡筒の光路上に導入し、対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に位置計測用光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料境界面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサー上に結像し、試料境界面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置および試料位置を計測し、位置計測用結像レンズもしくは位置計測用光センサー位置を光軸方向に動かして位置計測用光センサー位置を試料観察面と共役な位置からずらすことにより、あるいは、前記結像レンズもしくは前記光センサー位置を光軸と垂直な方向に動かすことにより、試料上の異なる位置を基準位置として試料高さ位置を求めることを可能にした。

これにより、試料境界面と異なる位置を観察する場合に、結像レンズもしくは位置計測用光センサー位置を光軸方向に動かして位置計測用光センサーを試料観察面と共役な位置からずらすことにより、即ちセンサ位置を、境界面とは異なる位置を観察している時の試料観察面と共役な位置におくことにより、あるいは、前記結像レンズもしくは前記光センサー位置を光軸と垂直な方向に動かすことにより、試料境界面と異なる観察位置を基準点として試料位置および合焦位置として求めることができる。

この発明の請求項６に係る試料合焦位置高精度計測法は、蛍光像観察可能な顕微鏡および位置計測において、位置計測用の光を光源より、蛍光用のダイクロイックミラーを用いて顕微鏡筒の光路上に導入し、対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に位置計測用光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料境界面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサー上に結像し、試料境界面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度での合焦位置および試料位置を計測し、焦点駆動機構と組み合わせることにより、自動焦点合わせ、試料位置制御、対物レンズを経由して照明を行う薄層斜光照明法や全反射照明法などの照明光制御に適用可能とした。

これにより、焦点駆動機構と組み合わせることにより、自動焦点合わせ（オートフォーカス）、試料位置制御を行うことができる。また、対物レンズを経由して照明を行う薄層斜光照明法や全反射照明法などの照明法では、試料位置を正確に知り制御することが、照明光制御に必須であり、これを実現することができる。

この発明の請求項７に係る試料合焦位置高精度計測法は、蛍光像観察可能な顕微鏡および位置計測において、位置計測用の光を光源より、蛍光用のダイクロイックミラーを用いて顕微鏡筒の光路上に導入し、対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に位置計測用光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料境界面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサー上に結像し、試料境界面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置および試料位置を計測し、対物レンズと位置計測用結像レンズの間に中間レンズ群を有し、前記中間レンズ群の有無により位置計測用光センサーと試料側との共役な位置関係が変わらないように前記中間レンズ群を配置することができる。

これにより、センサー上への結像倍率は、中間レンズ群の焦点距離の比に依存するので、中間レンズ群のレンズ構成を変えることにより、結像倍率を自由に変更可能である。センサー上への結像倍率を高くすると、分解能は高いが試料高さ位置計測可能範囲は狭くなる。結像倍率を低くすると、分解能は低いが計測可能範囲は広くなる。従って、中間レンズ構成を変更することにより結像倍率を変えて、分解能と計測可能範囲を変更することができる。

また、これにより、異なる倍率の対物レンズを交換して用いる場合に、前記中間レンズ構成を換えることにより、位置計測用光源ならびに位置計測用結像レンズと光センサー側に変更を加えることなく、異なる倍率の対物レンズにも簡単に対応可能にすることができる。異なる倍率即ち異なる焦点距離の対物レンズを用いると、対物レンズ側の光路が変化するが、中間レンズ構成の変更により対物レンズ側の光路の違いを吸収することができ、従って光源側ならびに結像レンズとセンサー側の光路を同じままにすることができる。

また、これにより、対物レンズと位置計測用結像レンズ間の距離が長くなる場合に試料位置計測可能範囲が狭くなるのを防ぐことができる。対物レンズと位置計測用結像レンズ間の距離が長くなると、光路が光軸中心から遠く離れてゆくことにより視野が狭くなり、その結果試料高さ位置計測可能範囲が狭くなる。中間レンズ群の挿入により、光路が光軸中心から遠く離れるのを押さえることができるため、対物レンズと位置計測用結像レンズ間の距離の長さによる、計測可能範囲が狭くなる問題を防ぐことができる。

この発明の請求項８に係る試料合焦位置高精度計測法は、蛍光像観察可能な顕微鏡および位置計測において、位置計測用の光を光源より、蛍光用のダイクロイックミラーを用いて顕微鏡筒の光路上に導入し、対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に位置計測用光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料境界面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサー上に結像し、試料境界面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置および試料位置を計測し、対物レンズと位置計測用結像レンズの間に中間レンズ群を有し、前記中間レンズ群のうちの一部のレンズ位置を動かすことにより、試料上の異なる高さ位置を基準位置として試料高さ位置を求めることを可能にした。

これにより、対物レンズと位置計測用結像レンズの間に中間レンズ群を有し、中間レンズ群の有無により位置計測用光センサーと試料側との共役な位置関係が変わらないようにできる構成となっており、前記中間レンズ群のうちの一部のレンズ位置を動かすことにより、位置計測用光源ならびに位置計測用結像レンズと光センサー側に変更を加えることなく、試料境界面と異なる位置を基準点として試料上の異なる高さ位置を合焦位置として求めることを可能にすることができる。試料観察の高さ位置を変更すると対物レンズ側の光路が変化し、これが合焦位置計測可能な範囲を制限するが、中間レンズの移動により対物レンズ側の光路の違いを吸収し、光源側ならびに結像レンズとセンサー側の光路を同じままにすることができるため、試料観察の高さ位置に関し、広い範囲で合焦位置計測を行うことが可能である。

この発明の請求項９に係る試料合焦位置高精度計測法は、蛍光像観察可能な顕微鏡および位置計測において、位置計測用の光を光源より、蛍光用のダイクロイックミラーを用いて顕微鏡筒の光路上に導入し、対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に位置計測用光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料境界面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサー上に結像し、試料境界面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置および試料位置を計測し、焦点合わせの指定位置に連動して、位置計測用中間レンズもしくは位置計測用結像レンズを動かし、位置計測用光センサーからの出力が目的の焦点位置に対応した値になるように、対物レンズと試料間位置を合わせて焦点合わせを行うことにより、高さに関し広い範囲で合焦位置計測を可能にする。

これにより、焦点合わせの指定高さ位置に連動して、位置計測用中間レンズもしくは位置計測用結像レンズを動かし、位置計測用光センサーからの出力が目的の焦点高さ位置に対応した値になるように、対物レンズと試料間距離を合わせて焦点合わせを行うことにより、高さ位置に関し広い範囲で合焦位置計測を可能にすることが可能である。請求項８に記載の方法では、中間レンズの移動を、合焦位置基準点の変更のために行い、焦点合わせには必ずしも連動させないが、請求項９に記載の方法では、中間レンズもしくは結像レンズの位置を、焦点合わせの指定高さ位置に常に連動させるのが特徴である。

このようにすると、試料観察位置が試料境界面とは異なる高さで変わっても、位置計測用センサーと試料観察面とを常に同じ共役な位置関係に保つことになり、位置計測用光の光路の変動を常に最小化することができるため、光路の大きな変動による光路障碍を避けることができ、試料観察の高さ位置に関し、より広い範囲で合焦位置計測を行うことが可能である。

以上のように、本発明の試料合焦位置高精度計測法は顕微鏡観察や対物レンズを用いた位置計測において、生物試料のように光照射等に弱い標本に対しても損傷を与えることなく、合焦位置および試料位置を、透明試料等で低反射率の試料においても１００ｎｍ以上の高精度で計測することができる。また、焦点駆動機構と組み合わせることにより、自動焦点合わせ（オートフォーカス）、試料位置制御を行うことができる。また、蛍光像観察時にも、蛍光観察に使う波長とは異なる波長の光を位置計測用に用い、余分な計測用のダイクロイックミラー等を蛍光が透過することが一切無いので、蛍光の損失が生じない。

本発明は、蛍光像観察には用いない波長の光を位置計測用に用い、前記位置計測用の光を光源より、蛍光用のダイクロイックミラーを用いて顕微鏡筒の光路上に導入し、対物レンズの高開口数の領域のみに位置計測用光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で照射し、試料境界面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を、位置計測用光センサー上に結像し、試料境界面での全反射光を含む大きな照明角度からの反射光を利用して合焦位置および試料位置を高精度に安定に蛍光像観察にも損失無く計測するものである。

次に、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。図１は、本発明の標本合焦位置高精度計測の基本原理の説明図である。
図１において、光源よりの入射光と反射光との関係に注目する。試料境界面が高さ方向にΔｚ変化すると、反射光は試料境界面内で横方向にΔｘずれた位置から出てくるとみなされる。このΔｘを試料位置計測用光センサーで計測する。この時ΔｚとΔｘの間には次式（１）が成立する。

Δｘ ＝２Δｚ×ｔａｎθ （１）
の関係があるので、入射角θを大きくすることにより、同じΔｚの変化量に対しても、より大きなΔｘの変化量を得ることができる。即ち、より高精度でΔｚを求めることができる。従って、光源よりの入射光を対物レンズの辺縁部分の高開口数の領域に通す方が良い。そして、この理由から、透明試料等で低反射率の試料においても１００ｎｍ以上の高精度で、合焦位置および試料位置を計測することができる。

また、全反射を用いると、弱い照明光を用いても十分な強度の反射光が得られ、試料側に透過する光がおおきく減少するため、生物試料のように光反射等に弱い標本に対しても損傷を与えることなく、合焦位置および試料位置を計測することができる。それ故、光源からの入射光を対物レンズの辺縁部分の高開口数の領域に通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射する必要がある。

図５に、試料として水溶液（屈折率１.３３）、カバーガラスとして光学ガラス（屈折
率１．５２）を用いた場合の、試料境界面からの反射光強度の対物レンズへの光入射位置依存性の結果を示す。図５上図は、位置計測用センサー９での反射光強度の実測値であり、対物レンズへの入射光の中心軸からの距離ｄが１.５ｍｍより大きいところで、反射光が強くなることがわかる。下図は、上図に対応する反射率の理論計算値であり、実測値とよく一致している。本装置では入射光として直径約１ｍｍ前後の光を用いているために、理論値よりも入射位置ｄが少し小さいところで反射光強度の立ち上がりが見られる。

図５より、臨界角を超えた全反射領域で反射光強度が著しく強いこと、全反射が起こって無くとも臨界角の手前で反射光の強い領域が存在することがわかる。この入射位置ｄが大きい、即ち境界面での入射角が大きく、反射光強度が大きい領域での、全反射光及び大きな照明角度からの反射光を、本発明の合焦位置高精度計測法では用いている。

なお、図５上図の入射位置ｄが０.３ｍｍ以下の原点近傍で反射光が見られるが、これは対物レンズ中心付近や試料境界面以外などからの反射に多く起因し、従来法で計測に無視できない誤差を与えるものである。本発明では、入射位置ｄが小さいこの領域を位置計測に用いず、この問題の影響を全く受けない。

この計測原理を適用した、本説明の試料合焦位置高精度計測方法を実現する構成を図２を参照して、その作用を説明する。図２は光源に近赤外狭指向性ＬＥＤもしくは低コヒーレンス性赤外発光素子を用い、位置計測センサーに２分割フォトダイオードを用いた例を示す。

図２において、１は観察対象の試料、２は近赤外狭指向性ＬＥＤである光源とスリット、３は照明用の集光レンズ、４は蛍光用と位置計測用とに共通のダイクロイックミラー、５は対物レンズ、６は液浸液、７はカバーガラス、８は結像レンズ、９は２分割フォトダイオードを用いた位置計測用光センサー、１０は位置計測用ダイクロイックミラー、１１はミラーである。

対物レンズは開口数が試料の屈折率を越える高開口数の１００倍油浸対物レンズからなる。試料１は、対物レンズ５の上方に位置される顕微鏡本体のステージ（図なし）に載置されたカバーガラス（ガラス基板）７上に液浸液６を介在して配置されている。この場合、試料１は液浸液６およびカバーガラス（ガラス基板）７を介して対物レンズ５の焦点位置に位置される。対物レンズは１００倍あるいは液浸液タイプに限ることなく用いることができ、開口数の大きいものほど精度の良い結果が得られる。図２は倒立型顕微鏡で描いてあるが、本発明は正立型と倒立型とを問わず適用できる。

位置計測用の照明光源からスリットを経た照明光は、照明用の集光レンズ３を通り、ミラー１１で反射の後、ダイクロイックミラー１０で反射されて蛍光励起光等の観察用照明光と同じ光路に導入され、ダイクロイックミラー４で直角に曲げられて顕微鏡筒内の光路に導入され、対物レンズ５の辺縁部分の高開口数の領域を光が通り、全反射領域を含む大きな照明角度で試料１を照射する。ミラー１１は、位置計測の照明光と反射光とを分離するためであり、集光レンズ３の後には配置せず、結像レンズの手前に配置して、反射光側を曲げて使用することも可能である。

試料１の表面から対物レンズ５を通して戻ってくる反射光をダイクロイックミラー４で直角に曲げて、結像レンズ８を介して位置計測用光センサー９の上に結像する。試料１と位置計測用光センサー９が共役な位置になるように、結像レンズ８を配置する。光源のスリット２、試料１、位置計測用光センサー９が共役な位置になるように、集光レンズ３を配置すれば、より良い計測結果が得られる。ここで図１で説明した（１）に基づいて、試料境界面の高さ方向の変化量Δｚに対して、試料境界面内で横方向のずれΔｘのより大きな変化量を得ることができ、より高精度でΔｚを求めることができる。このように、試料１の表面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置および試料位置を計測することができる。

また、光源１にレーザー光を照明光として用いると、干渉が生じ、位置計測にノイズやドリフトをもたらし、計測精度が悪くなることが起こる。この場合に、非干渉性（インコヒーレント）光源もしくは非干渉性化および低干渉性化したコヒーレント光源を用いて、上記の試料合焦位置高精度計測法を行うと、より安定で高精度に位置計測を行うことができる。

また、位置計測用光センサーからの出力を試料位置の変化Δｚの関数として求めておくことにより、試料位置Δｚを光センサー出力から求めることができる。光センサー位置を試料境界面に観察の焦点を合わせた時の試料境界面と共役な位置に置けば、試料境界面を基準として試料位置を求めることができる。センサーとして直線状の多分割フォトダイオードやフォトダイオードアレイなどの直線状に配置された光センサーを用いることにより、複数のセンサーからの出力を繋げて前記関数をΔｚ方向に広げられるため、より広いΔｚの範囲を計測することが可能である。この方法によるΔｚの計測可能な範囲は、（１）式でΔｚと関係づけられるΔｘに関して対物レンズの視野の程度が目安である。

位置計測用光センサー２分割フォトダイオードを用いることにより、図３の制御フローに示すように、位置計測用光センサー９の２分割フォトダイオードの出力を合焦位置計測器１４で差分増幅し、試料位置信号として用いる。多分割フォトダイオードなどの直線状光センサーでは、合焦位置計測器１４で複数の光センサー出力を増幅後に試料位置を計算し試料位置信号として用いる。これを、薄層斜光照明法および全反射照明法を用いた蛍光観察可能な顕微鏡１５に組み込まれた焦点駆動機構１６の制御信号に利用し、自動焦点を合わせ、試料位置制御、対物レンズを経由して照明を行う薄層斜光照明法や全反射照明法などの照明光制御に適用することができる。

試料１の境界面を観察する場合には、位置計測用光センサー９を合焦時の試料境界面と共役な位置に置く。境界面と異なる位置を観察する場合には位置計測用光センサー９をその観察位置での試料境界面と共役な位置に置けば、もしくは位置計測用光中心が光軸と交わる位置と共役な位置に置けば、その観察位置を基準として位置計測を行うことができる。即ち、結像レンズ８もしくは光センサー９の位置を光軸方向に動かし、光センサー９の位置を試料面と共役な位置からずらす。あるいは、前記結像レンズもしくは前記光センサー位置を光軸と垂直な方向に動かすことにより、基準位置を変更することができる。試料境界面と異なる位置を観察する場合には、位置計測用光の光路が変化するので、位置計測用光源からの光の角度を調整すると良い結果が得られる。これにより、生物試料や透明試料で低反射率の試料においても、合焦位置および試料位置を、１００ｎｍ以上の高精度で計測することができる。

また、図７に示す例のように、光源側の集光レンズ３と結像レンズ８を共通化し、１個の結像レンズ８より構成する場合には、結像レンズ８の位置を変更することにより、光センサー９の位置を光学的に試料観察面と共役な位置からずらし、試料境界面と異なる位置を基準点として試料位置および合焦位置を求めることができる。

また、中間レンズ群を用いる場合には、中間レンズ群の有無により位置計測用光センサーと試料側との共役な位置関係が変わらないようにできる構成とする。無限遠補正光学系顕微鏡の場合の例として、図８に示すように、試料の観察位置から出た光は対物レンズ５を通った後平行光となるが、中間レンズ１２で結像したのち、中間レンズ１３により平行光に戻る構成とする。

対物レンズ、中間レンズ１２、中間レンズ１３の焦点距離を各ｆｏｂｊ、ｆ１２、ｆ１３とすると、中間レンズ１３下流の平行光の幅、すなわち中間レンズ１３よりも結像レンズ８側での照明光と反射光の間隔は、ｆｏｂｊ×ｆ１３／ｆ１２に比例する。従って、異なる倍率の対物レンズすなわち異なる焦点距離ｆｏｂｊの対物レンズを用いる場合にも、ｆｏｂｊ×ｆ１３／ｆ１２が同じになるようにｆ１２とｆ１３の組み合わせを選べば、図９に示すように、対物レンズ側の光路の違いを中間レンズ群により吸収することができ、従って光源２側ならびに結像レンズ８と光センサー９側の光路を同じままにすることができる。

また、試料境界面と異なる位置を基準点として試料上の異なる高さ位置を合焦位置として求める場合に、前記中間レンズ群のうちの一部のレンズ位置を動かすことにより、光センサー９を光学的に試料観察面と共役な位置からずらし、光源２側ならびに結像レンズ８と光センサー９側に変更を加えることなく行うことができる。図１０の例を用いて作用を説明すると、試料高さ位置の変更により、中間レンズ１２による像の位置即ち中間レンズ１２と中間レンズ１３の間で光が交差する位置がずれる。その像位置の変化量と同じ距離だけ、中間レンズのいずれかを移動し中間レンズ１２と中間レンズ１３間の距離を変更すれば、中間レンズ１３よりも光源２と結像レンズ８の側では、光路が試料高さ位置の変更前と同じとなる。

試料高さ位置を変更すると対物レンズ側の光路が変化し、これが合焦位置計測可能な範囲を制限するが、中間レンズの移動により対物レンズ側の光路の違いを吸収し、さらに、照明光と反射光の光路を光軸に関して対称に保つことができるため、試料観察の高さ位置に関し、広い範囲で合焦位置計測を行うことが可能である。

また、焦点合わせの指定高さ位置に連動して、位置計測用中間レンズもしくは位置計測用結像レンズを動かせば、試料観察の高さ位置に関し、より広い範囲で合焦位置計測を行うことが可能である。図１０の例の場合には中間レンズ１２と中間レンズ１３間の距離を、図７の例の場合には結像レンズ８の位置を、高さ位置に連動して変更する。予め、位置計測用光センサーからの出力０もしくは一定の値になるようにした時の、試料観察の高さ位置と、中間レンズもしくは結像レンズとの位置との関係を求めておく。

図１１の制御フローに示すように、顕微鏡の焦点合わせリングまたは制御ソフトウェアによる観察高さ位置の指定に対し、前記中間レンズまたは前記結像レンズを高さ位置を、予め求めてある関係に従って、試料観察の高さに対応した位置に連動して動かす。位置計測用光センサーからの出力が０もしくは一定の値になるように、顕微鏡の焦点駆動機構をフィードバックして動かし、合焦させる。このようにすると、試料観察位置が試料境界面とは異なる高さで変わっても、位置計測用光センサーと試料境界面とを常に同じ共役な位置関係に保つことになり、常に光路を光軸に関して対称に保ち光路の変動を最小化することができるため、光路の大きな変動による光路障碍を避けることができ、高さ位置に関し、より広い範囲で合焦位置計測を行うことができる。

また、合焦位置計測は、位置計測用光センサー上における像の拡大倍率に依存する。結像倍率が高ければ、分解能が高いが、計測可能な高さ位置範囲は狭くなる。結像レンズ８の焦点距離をｆｉｍａｇｅとすると、結像倍率は、
結像倍率 ＝ （ｆｉｍａｇｅ／ｆｏｂｊ）×（ｆ１２／ｆ１３） （２）
で与えられる。従って、必要とする分解能と計測範囲に応じて、対物レンズ、中間レンズ、結像レンズの焦点距離を選択して用いる。

また、位置計測光の照明範囲の大きさは、分解能と計測可能な高さ位置範囲とに関係し、光源のスリット２で規定される。光源のスリット２の径をＲｓｌｉｔとし、集光レンズ３の焦点距離をｆ３とすると、試料１でのスリット像の径すなわち位置計測用光の照明範囲の径Ｒｉｌｌｕｍは、Ｒｓｌｉｔ×（ｆｏｂｊ／ｆ３）×（ｆ１２／ｆ１３）で与えられ、センサー９でのスリット像の径すなわち位置計測用光像の径Ｒｉｍａｇｅは、Ｒｉｌｌｕｍ×（ｆｉｍａｇｅ／ｆｏｂｊ）×（ｆ１３／ｆ１２）で与えられる。

従って、センサー９での位置計測用光像の径Ｒｉｍａｇｅは、
Ｒｉｍａｇｅ＝Ｒｓｌｉｔ×（ｆｉｍａｇｅ／ｆ３） （３）
である。なお、実際には回折や像ボケがあるので、これら式で与えられるスリット像の径は厳密ではない。必要とする分解能と計測範囲に応じて、光源のスリット２の径と、集光レンズ３の焦点距離ｆ３を選択して用いる。

また、生きている生物試料に対して光照射損傷の弱い近赤外光を位置計測用光源として用いており、光照射に弱い生きている生物試料に対しても損傷をほとんど与えることなく、試料位置を知ることができる。本発明の装置は、種々の光学顕微鏡の他にも、走査型プローブ顕微鏡あるいは光を利用した計測装置にも利用できる。

本発明の第１実施例の試料合焦位置高精度計測法は、図２に示される装置において、光源２として波長８２０から８５０ｎｍの低コヒーレンス性高輝度赤外発光素子、ミラー３として直角プリズム、位置計測用ダイクロイックミラー１０として波長８００ｎｍ以上の近赤外光を反射し可視光を透過するもの、対物レンズ５として開口数１．４５の油浸１００倍対物レンズ、結像レンズ８として焦点距離３０ｍｍのレンズ、位置計測用センサー９として２分割Ｓｉフォトダイオードより構成される。ダイクロイックミラー４としては、蛍光観察用ダイクロイックミラーで波長８００ｎｍ以上の近赤外光を反射するものを蛍光色素毎に交換して用いる。例えば、緑色の蛍光タンパク質であるＧＦＰの観察用のダイクロイックミラー４として、４８８ｎｍの蛍光励起光を反射、５００ｎｍから７００ｎｍの可視光を透過、８００ｎｍ以上の近赤外光を反射するものを用いる。

図６に、本発明の試料合焦位置高精度計測法による計測結果の精度ならびに試料温度に対する安定性の実測結果を示す。試料に冷水を加えたところ、試料温度は急激に３４．５度まで冷えその後３６度台まで回復したが、これに伴い、機械的な試料高さ位置計測では温度ドリフトにより最大５マイクロメートルまで表示が変化した。しかしながら、本装置では、冷却直後の瞬間を除き、どの時間においてもプラスマイナス３０ｎｍ（０.０３マイクロメートル）以内の高精度で、試料の高さ位置を計測でき、合焦位置を保持できている。

本発明の第２実施例の試料合焦位置高精度計測法は、図２に示される装置において、結像レンズ８として焦点距離１５ｍｍのレンズを用い、他は第１実施例と同じ構成である。結像レンズ８の焦点距離を１５ｍｍとすると、焦点距離３０ｍｍの場合と比べ、位置計測用センサー９上での像の倍率が半分となる。その結果、合焦位置計測の精度は約半分に落ちるが、計測可能な高さ位置の範囲が広くなる。

本発明の第３実施例の試料合焦位置高精度計測法は、図２に示される装置において、位置計測用センサー９として直線状８分割フォトダイオードを用い、他は第１実施例と同じ構成である。試料上の異なる高さ位置を観察する場合に、反射光が変化する方向に分割フォトダイオードを並べることにより、高さ位置に関し、より広い範囲で計測が可能となる。この方法によるΔｚの計測可能な範囲は、式（１）のΔｘ＝２Δｚ×ｔａｎθで与えられるΔｘに関し、対物レンズの視野の程度が目安である。

本発明の第４実施例の試料合焦位置高精度計測法は、図７に示される装置より構成される。第１実施例（図２）の結像レンズ８と光源側の集光レンズ３とを共通化し、１個の結像レンズ８より構成する。光源２側ならびに位置計測用センサー９側の両方の光路が直角とは異なる角度で配置されるが、試料の高さ位置が変化した際に、光路の変化が光軸に関して対称となり、高さ位置に関する計測範囲が広くなる。結像レンズ８を光軸方向に変化させることにより、位置計測用光センサー位置を試料観察面と共役な位置からずらすことができ、試料上の異なる高さ位置を合焦位置として求めることができる。

本発明の第５実施例の試料合焦位置高精度計測法は、図８および９に示される装置より構成される。第１実施例（図２）の装置に、中間レンズ１２と中間レンズ１３とを加えた構成となっている。試料の観察位置から出た光は対物レンズを通った後平行光となるが、中間レンズ１２で結像したのち、中間レンズ１３により平行光に戻る配置となっている。

異なる対物レンズを用いる場合には、中間レンズの組み合わせを変更するのみで、他の光学系には何らの変更を加えることなく、簡単に対応することができる。図８で示される装置のように、１００倍対物レンズを用いる場合には、中間レンズ１２として焦点距離３０ｍｍ、中間レンズ１３として焦点距離３０ｍｍのレンズを用いる。

図９で示される装置のように、６０倍対物レンズを用いる場合には、中間レンズ１２として焦点距離３０ｍｍ、中間レンズ１３として焦点距離３０×６０／１００＝１８ｍｍのレンズを用いる。対物レンズ、中間レンズ１２、中間レンズ１３の焦点距離を各ｆｏｂｊ、ｆ１４、ｆ１５として、ｆｏｂｊ×ｆ１３／ｆ１２が同じであれば、他の組み合わせでも良い。

このようにすれば、対物レンズの違いによる光路の違いを中間レンズ群で吸収することができ、光源２側ならびに、結像レンズ８と位置計測用センサー９側は、全く同じままで計測を行うことができる。

本発明の第６実施例の試料合焦位置高精度計測法は、図１０に示される装置より構成される。第１実施例（図２）の装置に、中間レンズ１２と中間レンズ１３とを加えた構成となっている。試料の観察位置から出た光は対物レンズを通った後平行光となるが、中間レンズ１２で結像したのち、中間レンズ１３により平行光に戻る配置となっている。

試料上の異なる高さ位置を観察する場合には、中間レンズ１２と１５間の距離を変えることにより、位置計測用光センサー位置を試料観察面と共役な位置からずらすことができ、試料上の異なる高さ位置を合焦位置として求めることができる。図１０では中間レンズ１３の位置を変えているが、中間レンズ１２の位置を変えても良い。試料観察の高さ位置を変更すると、対物レンズ側の光路が変化し、これが合焦位置計測可能な範囲を制限するが、中間レンズの移動により対物レンズ側の光路の違いを吸収し、光源２側ならびに結像レンズ８と位置計測用センサー９側の光路を同じままにすることができるため、試料観察の高さ位置に関し、より広い範囲で合焦位置計測を行うことが可能である。

本発明の第７実施例の試料合焦位置高精度計測法は、第６実施例の図１０に示される装置と、図１１に示される焦点合わせ機構とより構成される。
観察高さ位置の指定に対し、中間レンズ１２もしくは中間レンズ１３の位置を連動して変更する。予め、位置計測用センサー９からの出力が０もしくは一定の値になるようにした時の、観察高さ位置と、中間レンズ１２もしくは中間レンズ１３の位置との間の関係を求めておく。図１１の制御フローに示すように、顕微鏡の焦点合わせリングまたは制御ソフトウエアによる観察高さ位置の指定１７に対し、中間レンズ１２もしくは中間レンズ１３を、予め求めてある関係に従って、中間・結像レンズ駆動機構１８は観察高さ位置の対応する位置に連動して動かす。位置計測用光センサー９からの出力が０もしくは一定の値になるように、顕微鏡の焦点駆動機構１６にフィードバックして動かし、合焦させる。

顕微鏡で試料深さ方向の異なった位置を観察する場合には、試料と対物レンズ間の距離を変える。従って、試料観察の高さ位置と、試料と対物レンズ間距離を対応させて考えるのが、顕微鏡法でこれまで一貫して行なわれてきた方法である。しかし、この従来法では、試料と対物レンズ間の距離が、設定したつもりの値と実際の値とで、熱的あるいは機械的な要因などによりずれてしまい、焦点ボケや、意図とは異なる高さ位置で試料を観察する結果となる。

これに対し、この実施例の方法では、試料観察の高さ位置の変更に対しては、位置計測用中間レンズまたは結像レンズの位置の変更をもって対応させる。しかる後、位置計測用センサーからの出力が目的の焦点位置に対応した値になるように、試料と対物レンズ間の距離を変えて焦点合わせを行なう。

このようにすると、位置計測用センサーと試料観察面とを常に同じ共役な位置関係に保つことになり、位置計測用光の光路変動を常に最小化することができるため、光路の大きな変動による光路障碍を避けることができ、試料観察の高さ位置に関し、より広い範囲で合焦位置計測を行うことが可能である。その結果、より広い高さ位置範囲で、指定された観察高さ位置とのずれなく観察を行なうことが実現する。

本発明は正立型顕微鏡と倒立型顕微鏡とを問わず適用できる。また、本発明の装置は、種々の光学顕微鏡の他にも、走査型プローブ顕微鏡あるいは光を利用した計測装置にも利用できる。

本発明の試料合焦位置高精度計測の基本原理の説明図。 本発明の試料合焦位置高精度計測方法を実現する構成。 焦点駆動機構の制御フロー。 従来の試料の深さ（高さ）方向位置を計測する概要図。 試料境界面からの反射光強度の対物レンズへの光入射位置依存性のデータ。 試料合焦位置高精度計測法の精度のデータ。 実施例４記載の試料合焦位置高精度計測方法を実現する構成。 実施例５記載の試料合焦位置高精度計測方法を実現する構成。 実施例５記載の試料合焦位置高精度計測方法を実現する構成。 実施例６記載の試料合焦位置高精度計測方法を実現する構成。 実施例７記載の焦点合わせ機構の制御フロー。

符号の説明

１ 観測対象の試料
２ 光源とスリット
３ 照明用の集光レンズ
４ ダイクロイックミラー
５ 対物レンズ
６ 液浸液
７ カバーガラス
８ 結像用レンズ
９ 位置計測用光センサー
１０ 位置計測用ダイクロイックミラー
１１ ミラー
１２ 中間レンズ
１３ 中間レンズ
１４ 合焦位置計測器
１５ 顕微鏡
１６ 焦点駆動機構
１７ 焦点合わせリング・制御ソフトによる観察高さ位置指定
１８ 中間・結像レンズ駆動機構

Claims (9)

1. 蛍光像観察可能な顕微鏡および位置計測において、蛍光像観察には用いない波長の光を位置計測に用い、前記位置計測用の光を光源より、蛍光用のダイクロイックミラーを用いて顕微鏡筒の光路上に導入することにより、蛍光像観察時にも蛍光の損失無く、合焦位置および試料高さ位置を計測可能にすることを特徴とする試料合焦位置高精度計測法。
2. 蛍光像観察可能な顕微鏡および位置計測において、光源より対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料境界面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサー上に結像し、試料境界面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置および試料高さ位置を蛍光像観察にも損失無く計測可能にしたことを特徴とする請求項１に記載の試料合焦位置高精度計測法。
3. 前記光源として、非干渉性（インコヒーレント）光源もしくは非干渉性化および低干渉性化したコヒーレント光源を用い、より安定で高精度に位置計測を行うことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の試料合焦位置高精度計測法。
4. 位置計測用光センサーからの出力を、試料高さ位置の関数として求めておくことにより、試料位置を光センサーから計測し、さらに、直線状に配置された光センサーを用いてより広い範囲の試料高さ位置を計測可能にすることを特徴とする請求項２に記載の試料合焦位置高精度計測法。
5. 位置計測用結像レンズもしくは位置計測用光センサー位置を光軸方向に動かして位置計測用光センサー位置を試料観測面と共役な位置からずらすことにより、あるいは、前記結像レンズもしくは前記光センサー位置を光軸と垂直な方向に動かすことにより、試料上の異なる高さ位置を基準位置として試料高さ位置を求めることを特徴とする請求項２に記載の試料合焦位置高精度計測法。
6. 焦点駆動機構と組み合わせることにより、自動焦点合わせ、試料位置制御、対物レンズを経由して照明を行う薄層斜光照明法や全反射照明法などの照明光制御に適用可能としたことを特徴とする請求項２記載の試料合焦位置高精度計測法。
7. 対物レンズと位置計測用結像レンズの間に中間レンズ群を有し、試料と位置計測用センサーとの共役な関係を変えることなく前記中間レンズ群を配置することができる構成であることを特徴とする請求項２記載の試料合焦位置高精度計測法。
8. 対物レンズと位置計測用結像レンズの間に中間レンズ群を有し、前記中間レンズ群のうちの一部のレンズ位置を動かすことにより、試料上の異なる高さ位置を基準位置として試料高さ位置を求めることを可能にすることを特徴とする請求項２記載の試料合焦位置高精度計測法。
9. 焦点合わせの指定高さ位置に連動して、位置計測用中間レンズもしくは位置計測用結像レンズを動かし、位置計測用光センサーからの出力が目的の焦点高さ位置に対応した値になるように、対物レンズと試料間距離を合わせて焦点合わせを行うことにより、高さ位置に関し広い範囲で合焦位置計測を可能にすることを特徴とする請求項２記載の試料合焦位置高精度計測法。
   

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