[go: up one dir, main page]

WO2010109924A1 - Ｌｈ型二重特異性抗体 - Google Patents

Ｌｈ型二重特異性抗体 Download PDF

Info

Publication number
WO2010109924A1
WO2010109924A1 PCT/JP2010/050008 JP2010050008W WO2010109924A1 WO 2010109924 A1 WO2010109924 A1 WO 2010109924A1 JP 2010050008 W JP2010050008 W JP 2010050008W WO 2010109924 A1 WO2010109924 A1 WO 2010109924A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bispecific antibody
antibody
chain
humanized
type
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2010/050008
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
泉 熊谷
竜太郎 浅野
光央 梅津
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tohoku University NUC
Original Assignee
Tohoku University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tohoku University NUC filed Critical Tohoku University NUC
Priority to US13/257,614 priority Critical patent/US9315584B2/en
Priority to EP10755725.8A priority patent/EP2412808B1/en
Priority to JP2011505904A priority patent/JP5725508B2/ja
Publication of WO2010109924A1 publication Critical patent/WO2010109924A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US14/597,969 priority patent/US20150175713A1/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody

Definitions

  • the present invention relates to the bispecific antibody and the LH, wherein each polypeptide constituting the humanized diabody type bispecific antibody has an L chain variable region at the N-terminal side (LH type).
  • LH type Humanized high-functional bispecific antibodies including diabody-type bispecific antibodies (collectively, these are also simply referred to as “LH-type bispecific antibodies”)
  • the present invention relates to a peptide, a nucleic acid encoding the polypeptide, a method for producing the antibody, and a pharmaceutical composition containing them.
  • immunotherapy has been used as a safe treatment for cancer (malignant tumors) and rheumatism.
  • an antibody that specifically shows cytotoxic activity against cancer is used.
  • Antibody drugs composed of such antibodies are recognized as safe and secure with high side effects, low side effects, and high therapeutic effects. On the other hand, it is necessary to produce them using established animal cells. .
  • low-molecular-weight antibodies such as single-chain antibodies (scFv) in which the VH and VL domains of an antibody are contained in a single polypeptide chain has become a global trend.
  • Such low-molecular-weight antibodies can be produced even in inexpensive E. coli, but there is a concern that the half-life in the body decreases due to the decrease in molecular weight and the duration of drug efficacy decreases.
  • a complete antibody such as IgG binds to a target antigen in a multivalent amount, whereas a low-molecular antibody usually has a monovalent valence, so that a decrease in affinity is also a problem.
  • Non-Patent Document 1 can be referred to.
  • BiTE is a small tandem scFv-type small molecule that links two scFvs together.
  • Bispecific antibodies are the only clinical trials (Science.ci2008 Aug 15; 321 (5891): 974-7.).
  • this BiTE is prepared using animal cells, yield and production cost are problematic.
  • tandem scFv type low molecular bispecific antibodies such as BiTE are difficult to prepare from E. coli soluble fraction although they are small molecules (J Mol Biol. 2003 330 (1): 99- 111.) In fact, BiTE is prepared using animal cells.
  • Bispecific antibodies one of the multispecific antibodies, can specifically bind to two different antigens. Research has been actively conducted on the possibility that it can be used as a therapeutic agent having an antitumor effect.
  • a diabody (Dabody) is the smallest unit of such a bispecific antibody.
  • Each heavy chain (H chain) variable region (V region) (represented as “VH”) derived from the same parent antibody.
  • VH and the light chain (L chain) variable region (V region) represented as "VL” VL was devised by utilizing the property of forming a heterodimer by non-covalent bonds with each other ( Non-patent document 2).
  • Such diabody-type bispecific antibodies are characterized by low molecular weight (molecular weight of about 60,000), low immunogenicity and high permeability to tumor tissues, and, for example, microorganisms such as Escherichia coli. It can be mentioned that inexpensive mass production is possible, and that functional modification using genetic engineering is easy.
  • the present inventors have so far developed a diabody-type bispecific antibody (Ex3) prepared using an anti-human epidermal growth factor receptor 1 (Her1) antibody 528 and an anti-CD3 antibody OKT3, and the antibody as a human. It has been found that a typed diabody-type bispecific antibody (hExh3) has an extremely strong antitumor effect (Patent Document 1). Furthermore, in order to exhibit the above-mentioned excellent effects by comparing with diabody-type bispecific antibodies prepared using other antibodies, humanized 528 antibody and humanized OKT3 antibody are human. It was speculated that the structural stability of the typed variable region itself, and combinations thereof, were very important.
  • Patent Document 2 highly functional bispecific antibodies having various structures based on humanized diabody-type bispecific antibodies and the like.
  • Non-Patent Document 3 The preparation of bispecific antibodies other than diabody-type bispecific antibodies is described in Non-Patent Document 3 and Non-Patent Document 4 below.
  • Japanese Patent No. 3803790 International Publication No. WO2007 / 108152 Pamphlet Rosenburg and Moore (Ed.), “The Pharmacology of Monoclonal Antibodies”, Vol. 113, Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994) Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993 Alt M, et.al.
  • diabody-type bispecific antibodies such as Ex3 have excellent activity, but are mainly expressed in E. coli and prepared by the unwinding method from the insoluble fraction. At least at the basic research level, the yield is several mg per liter of culture medium (Biochem Soc Trans. 2002 30 (4): 507-11), and sufficient production efficiency has not been obtained yet. Accordingly, there is a need to increase added value as a pharmaceutical, such as cost reduction by reducing the dose, by further enhancing the functionality of the diabody-type bispecific antibody.
  • the present inventor has made a diabody-type double comprising the L chain at the N-terminal side in each polypeptide constituting a humanized diabody-type bispecific antibody.
  • a specific antibody (LH type diabody type bispecific antibody: LH type Ex3) was developed, and a new method for preparing the antibody from Escherichia coli, particularly its soluble fraction, was found and the present invention was completed.
  • BsAb humanized highly functional bispecific antibody
  • FIG. 1 Humanized variable region (5L) of L chain of anti-human epidermal growth factor receptor 1 antibody 528 and humanized variable region of heavy chain (OH) of anti-CD3 antibody OKT3 in order from N-terminal to C-terminal
  • a diabody-type bispecific antibody comprising a second polypeptide comprising the humanized variable region (5H).
  • Anti-human epidermal growth factor receptor 1 antibody 528 H chain humanized variable region (5H) and L chain humanized variable region (5L), and anti-CD3 antibody OKT3 H chain A humanized variable region (OH) and a humanized variable region (OL) of the light chain, and any of the following structures: (I) (5LOH)-(peptide linker)-(OL5H) or (OL5H)-(peptide linker)-(5LOH); (Ii) A humanized diabody-type bispecific antibody composed of two types of single-chain polypeptides (5LOH) and (OL5H) is inserted into one of the single-chain polypeptides via the hinge region.
  • An antibody that binds to two Fc regions of a human antibody (Iii) A single chain polypeptide consisting of (5LOH)-(peptide linker)-(OL5H) or (OL5H)-(peptide linker)-(5LOH) binds to two Fc regions of a human antibody via a hinge region
  • the humanized highly functional bispecific antibody according to Aspect 2 having the structure of (ii), wherein the humanized diabody type bispecific antibody is hinged via a protease cleavage site.
  • the humanized highly functional bispecific antibody wherein the antibody is bound to a region.
  • Aspect 4 The humanized highly functional bispecific antibody according to Aspect 2 having the structure of (iii), wherein the single-chain polypeptide is bound to the hinge region via a protease cleavage site.
  • the humanized highly functional bispecific antibody characterized by the above.
  • Aspect 5 The diabody-type bispecificity according to aspect 1 or 2, wherein the humanized variable region of the L chain and the humanized variable region of the H chain in each single-chain polypeptide are connected by a peptide linker. antibody.
  • the humanized variable region (OL) of the L chain of antibody OKT3 and the humanized variable region (OH) of the H chain of anti-CD3 antibody OKT3 are amino acids represented by SEQ ID NOs: 2, 4, 6 and 8, respectively.
  • the bispecific antibody according to any one of aspects 1 to 5, consisting of a sequence.
  • Aspect 7 A single-chain polypeptide constituting the bispecific antibody according to any one of Aspects 1 to 6.
  • Aspect 8] A nucleic acid molecule encoding the single-chain polypeptide according to Aspect 7.
  • Aspect 10 A replicable cloning vector or expression vector containing the nucleic acid molecule according to Aspect 8 or 69.
  • Aspect 11 The vector according to Aspect 10, which is a co-expression vector.
  • Aspect 12 The vector according to Aspect 10 or 11, which is a plasmid vector.
  • Aspect 13 A host cell transformed with the vector according to any one of Aspects 10 to 12.
  • Aspect 14 A host cell according to Aspect 13, which is a prokaryotic cell.
  • Aspect 15 The host cell according to Aspect 14, which is Escherichia coli.
  • the prokaryotic cell is Escherichia coli, and two types of single-chain polypeptides are recovered from the culture medium supernatant, perizuma fraction, intracellular soluble fraction, or intracellular insoluble fraction of Escherichia coli. Manufacturing method.
  • the method comprises expressing two types of single-chain polypeptides constituting an antibody, forming a diabody-type bispecific antibody in the transformed bacterium, and separating and collecting the formed bispecific antibody. , Said method.
  • the humanized highly functional bispecific antibody according to Aspect 3 or 4 is digested with protease to cleave the Fc region and the hinge region, and two types of 5LOH and OL5H, respectively.
  • a pharmaceutical composition comprising the bispecific antibody according to any one of Aspects 1 to 6 as an active ingredient.
  • [Document Name] Abstract [PROBLEMS] To provide a new diabody-type bispecific antibody that increases the added value as a pharmaceutical, such as cost reduction by reducing the dose by further enhancing the functionality of the bispecific antibody, and a method for producing the same. thing.
  • a humanized diabody-type bispecific antibody (LH-type diabody-type bispecific antibody) characterized in that each polypeptide has an L chain on the N-terminal side (LH type), and Humanized high-functional bispecific antibody including LH-type diabody-type bispecific antibody, nucleic acid molecule encoding both two kinds of single-chain polypeptides constituting the bispecific antibody, the nucleic acid
  • LH type LH-type diabody-type bispecific antibody
  • the LH diabody-type bispecific antibody of the present invention is a high-performance IgG-like bifunctional antibody in which Fc is fused to a humanized diabody-type bispecific antibody (Ex3) previously developed by the present inventors. It has a very high cytotoxic activity equivalent to that of a bispecific antibody (Ex3-scDb-Fc: Patent Document 2). Furthermore, by examining various conditions in the production method, the present inventors have succeeded in preparing a high amount of antibody that is more than double that of various conventional bispecific antibodies from the soluble fraction of bacteria. Furthermore, the humanized highly functional bispecific antibody (LH type BsAb) prepared using the LH type shows higher cytotoxicity than the above LH type diabody type bispecific antibody. It was confirmed.
  • LH type diabody type bispecific antibody against A431 cell (ATCC No. CRL-1555) which is a human squamous cell carcinoma cell line, humanized Ex3 described in Patent Document 1 and Patent Document 2
  • the result of the cell growth inhibition test by Ex3-scDb-Fc is shown.
  • LH type diabody type bispecific antibody against human breast cancer cell line SK-BR-3 cell (ATCC No. HTB-30), humanized Ex3 described in Patent Document 1 and Patent Document 2
  • the anti-EGFR antibody-producing mouse B cell hybridoma 528 has been deposited with the Medical Cell Resource Center attached to the Institute of Aging Medicine, Tohoku University (ID: TKG0555). Further, the hybridoma producing the 528 antibody is stored as ATCC No. HB-8509 in the American Type Culture Collection (ATCC) and can be easily obtained from such depository.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the anti-CD3 antibody OKT3 is also deposited at the Medical Cell Resource Center attached to the Institute for Aging Medicine, Tohoku University (ID: TKG0235).
  • the hybridoma producing the OKT3 antibody is stored as ATCC No. CRL-8001 in the American Type Culture Collection (ATCC) and can be easily obtained from such depository.
  • cDNA can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, mRNA is extracted using ISOGEN (Nippon Gene), cDNA is prepared by First-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences), and reference paper (Krebber, A. et al. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. J Immunol Methods 201, 35-55. (1997)) PCR was performed using the cloning primers synthesized to determine the sequence of the variable regions of these antibodies. can do.
  • “Humanization” of the variable region contained in the single-chain polypeptide constituting the LH-type bispecific antibody of the present invention means determination of complementation in the humanized variable region of human immunoglobulin (recipient antibody).
  • CDRs that are non-human animals (donor antibodies) such as mice, rats, or rabbits and have the desired specificity, affinity, and ability in at least some of the residues in region (complementarity-determining region; CDR) Means an antibody substituted by a residue derived from
  • human immunoglobulin Fv framework (FR) residues may be replaced by corresponding non-human residues.
  • humanized antibodies may comprise residues that are not found in either the recipient antibody and the introduced CDR sequences or framework sequences.
  • ⁇ ⁇ Humanization of such antibody humanized variable regions can be performed according to methods known to those skilled in the art.
  • humanized antibodies are prepared by analyzing various conceptual humanized products using a three-dimensional immunoglobulin model of recipient and donor antibodies. Three-dimensional immunoglobulin models are well known to those skilled in the art.
  • WO92 / 22653 and the like can be referred to.
  • humanized humanized variable regions include antibodies in which the complementarity determining region (CDR) in the humanized variable region is derived from a mouse antibody and the other part is derived from a human antibody. it can.
  • CDR complementarity determining region
  • an appropriate site in the single-chain polypeptide for example, a framework (FR) that may affect the CDR structure.
  • the function of the humanized antibody can be improved by causing site-specific mutations in the middle part, for example, canonical or vernier sequences.
  • humanization of the 528 humanized variable region was performed by the CDR-grafting method.
  • VH and VL homology searches are performed, and the human antibody sequence having the highest homology FR (frame work) is selected in consideration of the length of each CDR (complementarity determining region). It is preferable to design an amino acid sequence in which the CDR of the selected human antibody is replaced with the CDR of 528, and for the corresponding codon, it is preferable to use the E. coli optimal codon as before, and to perform total synthesis of the gene by overlap PCR method I can do it.
  • humanized OKT3 humanized variable regions have already been reported and have been confirmed to retain sufficient activity compared to mouse OKT3 (Adair, J. R. et al. Humanization of the murine anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3. Hum Antibodies Hybridomas 5, 41-7. (1994)).
  • total synthesis of the gene was performed by the overlap PCR method. At this time, it is preferable to use the optimal codon in E. coli, and the increase in the expression level in E. coli by using the total synthetic gene substituted with the optimal codon has already been reported.
  • An example of the base sequence of the typing variable region (OH) and the amino acid sequence encoded by it are represented by SEQ ID NOs: 1 and 2, SEQ ID NOs: 3 and 4, SEQ ID NOs: 5 and 6, and SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively.
  • the L chain humanized variable region and the H chain humanized variable region in each single-chain polypeptide are connected by an appropriate peptide linker.
  • the peptide linker makes it difficult for single-chain antibodies to interact with each other in the molecule, and allows the formation of multimers by a plurality of single-chain antibodies, and as a result, VHs derived from different single-chain antibodies.
  • VL are appropriately associated, so that the function of the original protein (the polypeptide is derived from the original protein or derived from the original protein), for example, part of biological activity or It is not particularly limited as long as it can take a structure that simulates or promotes all of them, and for example, it is selected from those widely known in the art or modified from the known linker. Is possible.
  • the peptide linker is preferably 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 2 to 10 amino acids in length.
  • each single-chain polypeptide may not include the peptide linker described above, and two humanized variable regions may be directly linked.
  • the C-terminal of the humanized variable region located on the N-terminal side in each single-chain polypeptide. It is preferable that 1 to several amino acids or 1 to several amino acids at the N-terminal of the humanized variable region on the C-terminal side have been removed.
  • amino acid sequence represented by each of the above SEQ ID Nos. An amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added, and the function / activity of the polypeptide comprising the original amino acid sequence
  • amino acid sequence substantially retained with the antigen specificity of the humanized variable region can also be used as the polypeptide of the single chain antibody constituting the LH type bispecific antibody of the present invention.
  • amino acids that are deleted, substituted, inserted or added are preferably substituted for homologous amino acids (polar / nonpolar amino acids, hydrophobic / hydrophilic amino acids, positive / negative charged amino acids, aromatic amino acids, etc.), Alternatively, it is preferable that amino acid deletion or addition does not cause a significant change in the three-dimensional structure and / or local charge state of the protein or that they are not substantially affected.
  • Polypeptides having such deleted, substituted or added amino acids include, for example, site-directed mutagenesis methods (such as point mutagenesis and cassette mutagenesis), gene homologous recombination methods, primer extension methods, and It can be easily prepared by appropriately combining methods known to those skilled in the art such as PCR.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more, with respect to the total length of the original amino acid sequence. It can also be said to show sequence homology.
  • LH type Ex3 scDb The first type (i) of LH type BsAb of the present invention (LH type Ex3 scDb) is represented by (5LOH)-(peptide linker)-(OL5H) or (OL5H)-(peptide linker)-(5LOH). It has a structure. That is, two types of polypeptide chains constituting LH type Ex3, 5LOH and OL5H, are further joined by a peptide linker to form a single polypeptide chain as a whole. As a result, the structure of the BsAb molecule is more stabilized than Ex3. Further, only one expression vector is required for producing this BsAb, and as a result, a more uniform BsAb molecule can be prepared as compared with LH type Ex3. “ScDb” means a single chain diabody antibody.
  • the peptide linker is not particularly limited in length or the like as long as OH and OL, and 5H and 5L are associated with each other to form an antigen binding site capable of specifically reacting with each antigen. For example, it is possible to select and use one widely known in the art or a modification of the known linker.
  • the peptide linker may be inserted between 5H and 5L, or between OH and OL.
  • the second type (ii) of LH type BsAb of the present invention is a humanized diabody type bispecific antibody (LH type) composed of two types of polypeptides, 5LOH and OL5H. Ex3) binds to two Fc regions of a human antibody via a hinge region by either polypeptide. That is, specifically, any one of the two polypeptides constituting Ex3 bound to the Fc region of a human antibody via a hinge region (for example, (OL5H) -hinge region-Fc region), And it is comprised from 2 types of polypeptide of another polypeptide (for example, (5LOH)) which comprises LH type Ex3.
  • the antibody can be produced by co-expressing these two types of single-chain polypeptides and then associating them.
  • the “Fc region” means two domains (CH2 and CH3) on the C-terminal side of the H chain constituting the constant region (C region).
  • LH type Ex3 scDb-Fc LH type Ex3 scDb-Fc
  • LH type Ex3 scDb has a structure in which it is bound to the Fc region of a human antibody via a hinge region. That is, the hinge region includes two types of H chain variable regions contained in a single-chain polypeptide consisting of (5LOH)-(peptide linker)-(OL5H) or (OL5H)-(peptide linker)-(5LOH). Alternatively, any of the L chain variable regions may be bound to the hinge region.
  • the number of domains constituting the second type (ii) and the third type (iii) of the LH type BsAb of the present invention is the same as that of an IgG type immunoglobulin molecule, and these antibodies are close to the immunoglobulin molecule. It is considered to have a three-dimensional structure. Furthermore, in the second type (ii) and the third type (iii) of these LH type BsAbs of the present invention, these are obtained by interposing a protease cleavage site between the LH type Ex3 or LH type Ex3 scDb and the hinge region.
  • LH-type Ex3 or LH-type Ex3DscDb by subjecting the LH-type BsAb to protease digestion and then appropriately performing various purification operations described below.
  • LH-type Ex3 or LH-type Ex3bscDb obtained by such protease digestion shows higher cytotoxic activity than those prepared by conventional methods.
  • the peptide linker contained in the LH type BsAb of the present invention may be, for example, a polypeptide consisting of 1 to 20 amino acids, preferably a polypeptide consisting of 1 to 15 amino acids, more preferably 2 to 10 amino acids. Polypeptides consisting of the amino acids are mentioned.
  • the constant region or Fc region contained in the LH type BsAb of the present invention is not particularly limited as long as it is derived from a human antibody.
  • CL may be derived from either ⁇ or ⁇ chain.
  • the Fc region or H chain constant region is usually derived from an IgG ⁇ chain.
  • CH1, CH2 and CH3, and CL include those having the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, and SEQ ID NO: 33 disclosed in Patent Document 2, respectively.
  • FIG. 3-4 As representative examples of amino acid sequences such as PreSission sequence, hinge region, peptide linker, signal peptide and the like contained in the single-chain polypeptide constituting the LH type BsAb of the present invention, FIG. The sequences disclosed in 3-4 can be mentioned.
  • the PreSission sequence is a sequence containing a protease cleavage site.
  • protease There are no particular limitations on the type of protease to be used.
  • enzymes known to those skilled in the art such as Thrombin and FactorFXa can be used, and an amino acid sequence including a protease cleavage site can be appropriately selected accordingly. .
  • a typical example of a nucleic acid molecule (oligonucleotide) encoding each region or sequence contained in each single-stranded polypeptide of the present invention has the base sequence shown in each of the above SEQ ID NOs.
  • a nucleic acid molecule comprising such a base sequence that exhibits a sequence homology of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more with the entire length of the base sequence described in each SEQ ID NO.
  • these nucleic acid molecules are also included in the above-described nucleic acids of the present invention because they are considered to encode polypeptides having substantially the same activity or function as the sequences.
  • Such a nucleic acid molecule contains a base sequence encoding at least one of two kinds of single-chain polypeptides constituting the diabody-type bispecific antibody of the present invention. It is preferred that the two types of single-chain polypeptides each contain both base sequences.
  • sequence homology between two amino acid sequences or base sequences are pre-processed in an optimal state for comparison. For example, by making a gap in one sequence, the alignment with the other sequence is optimized. Thereafter, the amino acid residues or bases at each site are compared. When the same amino acid residue or base as the corresponding site in the second sequence is present at a site in the first sequence, the sequences are identical at that site. Sequence homology between the two sequences is expressed as a percentage of the total number of sites (all amino acids or all bases) of the number of sites that are identical between the sequences.
  • homology refers to each amino acid residue or each base constituting the chain between two chains in a polypeptide sequence (or amino acid sequence) or polynucleotide sequence (or base sequence). It means the amount (number) of things that can be determined to be identical in each other's fitness relationship, and means the degree of sequence correlation between two polypeptide sequences or two polynucleotide sequences. Homology can be easily calculated. Many methods for measuring homology between two polynucleotide or polypeptide sequences are known, and the term “homology” (also referred to as “identity”) is well known to those skilled in the art (eg, , Lesk, A. M.
  • Preferred methods for measuring homology include those designed to obtain the largest match between the two sequences being tested. An example of such a method is one assembled as a computer program.
  • Preferred computer programming methods for measuring the homology between two sequences include GCG program package (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403 (1990)), etc., but are not limited thereto, and methods known in the art are used. be able to.
  • each nucleic acid molecule described above hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence represented by each SEQ ID NO. It includes DNA encoding a polypeptide having substantially the same function and activity as the polypeptide.
  • hybridization can be carried out according to a method known in the art or a method analogous thereto, such as the method described in Molecular cloning third.ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001). Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
  • Hybridization may be performed by a method known in the art, such as the method described in Current Protocols in Molecular Biology (edited by Frederick M, Ausubel et al, 1987), or the like. It can carry out according to the method according to it. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
  • stringent conditions in DNA hybridization are defined by an appropriate combination of salt concentration, organic solvent (eg, formamide), temperature, and other known conditions. That is, stringency increases depending on whether the salt concentration is reduced, the organic solvent concentration is increased, or the hybridization temperature is increased.
  • washing conditions after hybridization also affect stringency. This wash condition is also defined by salt concentration and temperature, and the stringency of the wash increases with decreasing salt concentration and increasing temperature.
  • “stringent conditions” means that the degree of homology between each base sequence is, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more on the average on the whole. It means that the hybrid is specifically formed only between base sequences having high homology.
  • the conditions include a sodium concentration of 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, and a pH of 6 to 8 at a temperature of 60 ° C. to 68 ° C.
  • hybridization is performed under conditions of 5 SSC (750 mM NaCl, 75 mM ⁇ trisodium citrate), 1% SDS, 5 x Denhardt solution 50% formaldehyde, and 42 ° C. Washing is carried out under the conditions of 0.1 x SSC (15 mM NaCl, 1.5 mM trisodium citrate), 0.1% SDS and 55 ° C.
  • nucleic acid when a nucleic acid encoding a humanized variable region that has been humanized in each single-chain polypeptide is prepared, it can be totally synthesized by an overlap PCR method based on a pre-designed amino acid sequence.
  • nucleic acid is a molecule that encodes a single-chain polypeptide
  • its chemical structure and acquisition route are not particularly limited, and include, for example, gDNA, cDNA, chemically synthesized DNA, mRNA, and the like. is there.
  • telomere can be isolated from a cDNA library by hybridization based on the sequence described in the literature, or by the polymerase chain reaction (PCR) technique.
  • the DNA is placed in an expression vector, which is then placed in an E. coli (C. coli) cell, COS cell, Chinese hamster ovary cell (CHO cell), or myeloma cell that does not produce immunoglobulin.
  • E. coli C. coli
  • COS cell COS cell
  • CHO cell Chinese hamster ovary cell
  • myeloma cell that does not produce immunoglobulin.
  • a host cell can be transfected and a monoclonal antibody synthesized in the recombinant host cell.
  • the PCR reaction can be carried out by a method known in the art or a method or modification method substantially similar thereto, for example, R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R.
  • the PCR method can be performed using a commercially available kit suitable for the PCR method, and can also be performed according to a protocol clarified by the kit manufacturer or the kit vendor.
  • nucleic acid encoding the single-chain polypeptide constituting the LH-type bispecific antibody of the present invention thus obtained or each region contained in the polypeptide is appropriately selected according to the purpose by means known to those skilled in the art. Alternatively, it can be modified to encode an amino acid. Techniques for genetically modifying or modifying DNA in this way are described in Mutagenesis: a Practical Approach, MJ. Mcpherson (Ed.), (IRL Press, Oxford, UK (1991) ⁇ In the review, for example, site-directed mutagenesis (site-directed mutagenesis), cassette mutagenesis and polymerase chain reaction (PCR) ) Can be mentioned mutagenesis.
  • modification of a nucleic acid means insertion, deletion or substitution of a base in at least one codon encoding an amino acid residue in the obtained original nucleic acid.
  • altering the amino acid sequence itself constituting a single-chain polypeptide by replacing a codon encoding an original amino acid residue with a codon encoding another amino acid residue.
  • a single-chain polypeptide is used so that a codon (optimum codon) suitable for a host cell such as E. coli is used without changing the amino acid itself.
  • the encoding nucleic acid can also be modified.
  • by changing to an optimal codon it is possible to improve the expression efficiency of the single-chain polypeptide in the host cell.
  • the LH type bispecific antibody of the present invention can be produced by a method known to those skilled in the art, for example, various means such as genetic engineering techniques or chemical synthesis.
  • genetic engineering techniques for example, a replicable cloning vector or expression vector containing a nucleic acid encoding the polypeptide of each single-chain antibody constituting the bispecific antibody is prepared, and this vector is used as a host. Transforming the cells, culturing the transformed host cells to express the single chain polypeptide in the host cells, recovering and purifying the polypeptide, associating the single chain polypeptides, It can be produced by separating and recovering the formed LH type bispecific antibody.
  • replicable expression vector and “expression vector” refer to a piece of DNA (usually double-stranded), in which the DNA contains Can be inserted with foreign DNA fragments.
  • Foreign DNA is defined as heterologous DNA, which is a DNA that is not found naturally in the subject host cell.
  • Vectors are used to carry foreign or heterologous DNA strands into appropriate host cells. Once in the host cell, the vector can replicate independently of the host chromosomal DNA cage, and several copies of the vector and its inserted (foreign) DNA cage can be generated.
  • the vector contains the elements essential to allow translation of the foreign DNA into a polypeptide. Thus, many molecules of polypeptides encoded by foreign DNA can be synthesized rapidly.
  • Such vectors are operably linked to an appropriate control sequence so that the DNA sequence is expressed in an appropriate host (ie, to allow expression of foreign DNA). It means a “DNA construct” containing the determined DNA sequence.
  • control sequences include a promoter for transcription transcription, any operator sequence to control such transcription, sequences encoding appropriate mRNA ribosome binding sites, enhancers, reardenylation sequences, and transcription and translation. (translation) An array for controlling the end of the cage can be mentioned.
  • the vector can appropriately contain various sequences known to those skilled in the art, for example, restriction enzyme cleavage sites, marker genes (selection genes) such as drug resistance genes, signal sequences, leader sequences, and the like as necessary.
  • sequences or elements can be appropriately selected and used by those skilled in the art depending on conditions such as the type of foreign DNA, the host cell used, the culture medium, and the like. Further, for the purpose of facilitating the detection and purification of the produced single-chain polypeptide, a sequence encoding various peptide tags known to those skilled in the art (for example, c-myc tag and His-tag) is added. It can be included at the end of the sequence corresponding to this polypeptide.
  • the vector can be in any form such as a plasmid, a phage particle, or simply a genomic insert. Once introduced into a suitable host by transformation, the vector can replicate or function independently of the resident genome. Alternatively, the vector may be one that is integrated into the genome.
  • any cell known to those skilled in the art can be used.
  • typical host cells include prokaryotic cells such as E. coli and Chinese hamster ovary cells (CHO cells).
  • Mammalian cells such as rabbits and human-derived cells, and eukaryotic cells such as yeast and insect cells.
  • the transformed bacteria can be cultured under any mortgage conditions and methods known to those skilled in the art. For example, by inducing expression with BL21 ⁇ ⁇ star (DE3) strain as a host, 2xYT medium as a medium, IPTG of about 0.5 ⁇ mM at a culture temperature of about 28 ° C, the LH type 2 of the present invention in the culture supernatant or soluble fraction is used. The yield of the bispecific antibody can be greatly improved, and the production efficiency can be increased.
  • a single-chain polypeptide obtained by such expression in a host cell is generally recovered from the culture medium as a secreted polypeptide, but if it is produced directly without a secretion signal, the host It can be recovered from cell lysates. If the single-chain polypeptide is membrane-bound, it can be released from the membrane using a suitable detergent (eg, Triton-X100).
  • a suitable detergent eg, Triton-X100
  • the purification operation can be performed by appropriately combining methods known to those skilled in the art. For example, centrifugation, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, fractionation on ion exchange columns, ethanol precipitation, reverse phase HPLC, chromatography on silica, chromatography on heparin sepharose, anion or cation It is suitably purified by resin chromatography (polyaspartic acid column etc.), chromatofocusing, SDS-PAGE, ammonium sulfate precipitation, and affinity chromatography. Affinity chromatography is one of the preferred purification techniques with high efficiency utilizing the affinity with a peptide tag of a single-chain polypeptide.
  • the purification operation is preferably performed after the single-chain polypeptide is solubilized and denatured.
  • This solubilization treatment can be performed using any agent known to those skilled in the art as a dissociating agent such as alcohols such as ethanol, guanidine hydrochloride, and urea.
  • the LH type bispecific antibody of the present invention is produced by associating (rewinding) the two kinds of single-chain polypeptides thus purified, and separating and recovering the formed antibody molecules. I can do it.
  • the association treatment means that a single single-chain polypeptide is returned to a state having a desired biological activity by returning it to an appropriate spatial arrangement. Therefore, the association treatment also has the meaning of returning the polypeptides or domains to the associated state, so it can also be referred to as “reassociation”, and in the sense of having the desired biological activity. It can also be called reconstruction, or it can be called refolding.
  • the association treatment can be performed by any method known to those skilled in the art. For example, the concentration of the denaturing agent (for example, guanidine hydrochloride) in the buffer solution containing the single-chain polypeptide is decreased stepwise by, for example, dialysis. The method is preferred.
  • the LH type bispecific antibody of the present invention is prepared from, for example, a culture medium supernatant of a cultured host cell such as Escherichia coli, a perizma fraction, an intracellular soluble fraction, or an intracellular insoluble fraction. Is possible.
  • BL21 star (DE3) strain (Invitrogen) is used as the host, and the culture is performed at 28 ° C. using 2 ⁇ YT medium. After overnight shaking culture (OD at 600 nm is approximately 5), expression was induced by IPTG with a final concentration of 0.5 mM, and after culturing for 16 hours, medium supernatant fraction and cells were treated with osmotic pressure The target protein is recovered from this fraction (periplasm fraction).
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains, as an active ingredient, one selected from the group consisting of the LH-type bispecific antibody of the present invention, a single-chain polypeptide, a nucleic acid, a vector, and a transformed host cell. It is characterized by that. As shown in the following examples, such an active ingredient has an action of significantly eliminating, killing, or damaging (positive) tumor cells expressing the epidermal growth factor receptor in vitro and in vivo. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can be used as an antitumor agent against such tumor cells.
  • the effective amount of the active ingredient of the present invention can be appropriately determined by those skilled in the art depending on, for example, the therapeutic purpose, the type of tumor, the site and size of the subject to be administered, various conditions of the patient, and the administration route.
  • a typical single dose or daily dose will depend on the above conditions and, if possible, first in vitro and then, for example, using assays known in the art for tumor cell survival or growth.
  • appropriate dose ranges can be determined with appropriate animal models that can extrapolate dose ranges for human patients.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains various pharmaceutically acceptable pharmacological agents well known to those skilled in the art in addition to the active ingredient, depending on various conditions such as the type of active ingredient, pharmaceutical form, administration method / purpose, and pathological condition of the administration target.
  • Components eg, carriers, excipients, buffers, stabilizers, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a tablet, solution, powder, gel, spray, or microcapsule, colloidal distribution system (liposome, microemulsion, etc.), macroemulsion, etc., depending on the above various conditions.
  • colloidal distribution system liposome, microemulsion, etc.
  • macroemulsion etc.
  • administration methods include intravenous, intraperitoneal, intracerebral, intraspinal, intramuscular, intraocular, intraarterial, in particular intrabiliary or intralesional injection or injection, and sustained release system formulations.
  • the active substances according to the invention can be administered continuously by infusion or by bulk injection.
  • Sustained release formulations are generally of a form from which the active substance of the present invention can be released for a period of time, and suitable examples of sustained release preparations include solid hydrophobic polymers containing proteins.
  • a semipermeable carrier is included, which is in the form of a molded product, such as a film or microcapsule.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared by methods known to those skilled in the art, for example, the Japanese Pharmacopoeia Manual Editorial Committee, 13th revision, Japanese Pharmacopoeia Manual, issued on July 10, 1996, Yodogawa Shoten Co., Ltd. In view of the description, it can be appropriately selected and manufactured from among them.
  • the LH type diabody type bispecific antibody of the present invention was prepared as follows.
  • the expression vector was prepared as follows based on the already developed humanized diabody-type expression vectors targeting EGFR and CD3 (Patent Document 1 and Reference Examples 1 to 4 of Patent Document 2).
  • h5L humanized 5L
  • hOH humanized OH
  • hOL humanized OL
  • h5H humanized 5H
  • EH primer humanized 5H
  • a NcoI-5L 5'-NNNNCCATGGCCGATATTGTGATGACCCAGAGCCCG-3 ': [SEQ ID NO: 9]
  • B 5LSG4 5′-CTGGCCACCGCCACCAGATTTAATTTCCACTTTGGTGCCACCGCC-3 ′
  • C SG4OH 5'-AAATCTGGTGGCGGTGGCCAGGTGCAACTGGTGCAGAGCGGC-3 '[SEQ ID NO: 11]
  • D OH-SacII 5′-NNNNAGCCGCGGAGCTAACGGTCACCGGGGTGCCCTGGCC-3 ′
  • E NcoI-OL 5′-NNNNCCATGGCCGATATTCAGATGACCCAGAGCCCG-3 ′
  • F OLSG4 5'-CTGGCCACCGCCACCAGAGGTAATCTGCAGTTTGGTACCCTG-3 '[SEQ ID NO: 14]
  • G SG45H 5'-
  • a c-myc peptide tag for detection and a His-tag tag (Hisx6: histidine hexamer tag) for purification are introduced in parallel.
  • E. coli was transformed with the above co-expression vector, and the transformed bacterium was cultured overnight at 28 ° C. in 2 ⁇ YT medium, and then expression was induced with 0.5 ⁇ mM IPTG.
  • the results prepared from the periplasma fraction, soluble fraction and insoluble fraction are shown in FIG. In each figure, the humanized diabody-type bispecific antibody of the present invention thus obtained is indicated as “LH type Ex3”.
  • the base sequence of the humanized variable region (OH) of the H chain of the anti-CD3 antibody OKT3 and the amino acid sequence encoded by it are respectively SEQ ID NO: 1 and 2, SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5, respectively. And 6, and those shown in SEQ ID NOs: 7 and 8.
  • human squamous cell carcinoma cell line A431 cell (ATCC No. CRL-1555), human breast cancer cell line SK-BR-3 cell (ATCC No. HTB-30), human breast cancer cell line ( Proliferation of MCF7 cells (ATCC No.HTB-22) which is a low EGFR expression strain and TFK-1 which is a human bile cancer cell line (Medical Cell Resource Center ID: TKG036) was inhibited by the LH type diabody-type bispecific antibody, humanized Ex3 described in Patent Document 1 (simply referred to as "Ex3" in the figure) and Ex3- described in Patent Document 2 Comparison with scDb-Fc.
  • the cells were counted, adjusted to 5 ⁇ 10 3 cells per 100 ⁇ L of RPMI (10% FBS), dispensed 100 ⁇ L each into a 96-well plate, and allowed to stand at 37 ° C. overnight. Dilute the target protein with RPMI to the target concentration, dispense 50 ⁇ L of antibody protein to the plate prepared the previous day, dilute T-LAK cells with RPMI to the target E / T ratio, and dispense 50 ⁇ L each (E / T ratio: effector (T-LAK cell) / target (target cancer cell) ratio) and cultured at 37 ° C. for 48 hours.
  • RPMI % FBS
  • the LH diabody-type bispecific antibody of the present invention is superior to humanized Ex3 by about one digit against any cell line. It was confirmed that the cytotoxic activity was equivalent to that of Ex3-scDb-Fc, an IgG-like highly functional bispecific antibody. Furthermore, the inhibitory effect on the proliferation of TFK-1 was compared between LH type Ex3 and LH type Ex3 scDb-Fc by the same method.
  • LH type Ex3 scDb-Fc has a more remarkable cytotoxic activity than LH type Ex3 (FIG. 7).
  • MTS reagent CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega
  • PMS CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega
  • the diabody type bispecific antibody can be further clinically applied. It is expected that development and seed search in pharmaceutical companies will be accelerated.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

【課題】二重特異性抗体の更なる高機能化によって、投与量の軽減による低コスト化など、医薬品としての付加価値を高める新たなダイアボディ型二重特異性抗体及びその製造方法を提供すること。 【解決手段】各ポリペプチドにおいてＬ鎖がＮ末側にあること（ＬＨ型）を特徴とするヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体（ＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体）及び該ＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体を含むヒト型化高機能性二重特異性抗体、該二重特異性抗体を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドを共にコードする核酸分子、該核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含む、該抗体の製造方法。

Description

ＬＨ型二重特異性抗体
　本発明は、ヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体を構成する各ポリペプチドにおいてＬ鎖可変領域がＮ末側にあること（ＬＨ型）を特徴とする該二重特異性抗体及び該ＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体を含むヒト型化高機能性二重特異性抗体（以上をまとめて、単に「ＬＨ型二重特異性抗体」ともいう）、それを構成する一本鎖ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、該抗体の製造方法、及び、それらを含む医薬組成物等に関する。
　がん（悪性腫瘍）及びリウマチ等に対する安全な治療法として、近年、免疫療法が用いられている。がんに対する免疫療法では、がんに対して特異的に細胞傷害活性を示す抗体が使用される。このような抗体から成る抗体医薬は、副作用の少ない、安心安全で治療効果の高いことが認められる一方、確立された動物細胞を用いて製造する必要があるためにコスト高が問題となっている。
　このため、ある抗体のＶＨとＶＬのドメインが一本のポリペプチド鎖中にある一本鎖抗体(scFv)のような低分子抗体の作製が世界的な潮流となっている。このような低分子抗体は安価な大腸菌でも製造可能であるが、分子量の低下によって体内半減期が低下し、薬効持続時間が減少することが懸念される。また、IgGの様な完全抗体は、標的抗原に対し多価で結合するのに対し、通常、低分子抗体は結合価が一価となるため、親和性の低下も問題となっている。更に、抗体医薬の主な作用機序はFc領域を介した抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)ともされているため、Fc領域を有さないscFvは効果の低さが懸念される。尚、scFvについては、非特許文献１を参照することができる。
このため、がん細胞と免疫細胞を架橋するよう特異付けた低分子二重特異性抗体などが開発されてきており、BiTEと呼ばれる、2つのscFv同士を連結させたtandem scFv型の低分子二重特異性抗体が唯一臨床治験に進んでいる(Science. 2008 Aug 15;321(5891):974-7.)。しかしながらこのBiTEは、動物細胞を用いて調製しているため、収量や製造コストが問題となっている。BiTEのようなtandem scFv型の低分子二重特異性抗体は、低分子であるものの大腸菌可溶性画からの調製は困難であるとの報告もあり(J Mol Biol. 2003 330(1):99-111.)、事実BiTEは動物細胞を用いて調製されている。
　多重特異性抗体のうちの一つである二重特異性抗体(Bispecific Antibody:BsAb)は２つの異なる抗原に対して特異的に結合することが可能であるため、この特性を生かして特異的な抗腫瘍効果を持った治療薬としての利用法が可能であるとして、その研究が盛んに行われている。ダイアボディ（diabody:Db）とはこのような二重特異性抗体の最小単位であり、それぞれ同じ親抗体由来の重鎖（H鎖）の可変領域（V領域）（「VH」と表わされる）VHと軽鎖（L鎖）の可変領域（V領域）（「VL」と表わされる）VLとが互いに非共有結合によりヘテロ二量体を形成するという性質を利用し考案されたものである（非特許文献２）。
　このようなダイアボディ型二重特異性抗体の特徴としては、低分子（分子量約60,000）であることによる低免疫原性及び腫瘍組織への高浸透性、更には、例えば、大腸菌等の微生物を利用した安価な大量製造が可能であること、又、遺伝子工学を利用した機能改変が容易であることを挙げることができる。
本発明者等は、これまでに、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１（Ｈｅｒ１）抗体５２８及び抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３を用いて作製したダイアボディ型二重特異性抗体(Ex3)及び該抗体をヒト型化したダイアボディ型二重特異性抗体(hExh3)は極めて強力な抗腫瘍効果を有していることを見出している（特許文献１）。更に、他の抗体を用いて作製したダイアボディ型二重特異性抗体との比較により、該が上記の優れた効果を発揮する為には、ヒト型化５２８抗体及びヒト型化ＯＫＴ３抗体のヒト型化可変領域自身の構造的安定性、及びこれらの組み合わせが非常に重要であることが推測された。
　更に、本発明者等はヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体等に基づき多様な構造を有する高機能性二重特異性抗体を開発している（特許文献２）。
又、ダイアボディ型二重特異性抗体以外の二重特異性抗体の調製等は、以下の非特許文献３及び非特許文献４に記載されている。
特許第３８０３７９０号明細書 国際公開第WO2007/108152号パンフレット Rosenburg and Moore (Ed.), "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", Vol. 113, Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994) Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993 Alt M, et. al. Novel tetravalent and bispecific IgG-like antibody molecules combining single-chain diabodies with the immunoglobulin gamma1 Fc or CH3 region. FEBS Lett., 454, 90-4. (1999) Lu D, et. al. A fully human recombinant IgG-like bispecific antibody to both the epidermal growth factor receptor and the insulin-like growth factor receptor for enhanced antitumor activity. J Biol Chem., 280, 19665-72. (2005)
このようにEx3のようなダイアボディ型二重特異性抗体は優れた活性を有しているが、主として大腸菌内で発現させて、その不溶性画分からの巻き戻し法により調製されている為に、少なくとも基礎研究レベルでは培地1Lあたり数mgの収量となっており(Biochem Soc Trans. 2002 30(4):507-11)、未だ、十分な生産効率が得られていない。従って、ダイアボディ型二重特異性抗体の更なる高機能化によって、投与量の軽減による低コスト化など、医薬品としての付加価値を高めることが求められている。
　本発明者は上記課題を解決すべく研究の結果、ヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体を構成する各ポリペプチドにおいてＬ鎖をＮ末側にすることを特徴とするダイアボディ型二重特異性抗体（ＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体：ＬＨ型Ex3）を開発し、更に、抗体の大腸菌、特にその可溶性画分からの新たな調製法を見出し、本発明を完成した。又、ＬＨ型を用いて作製した上記特許文献２に記載されているようなヒト型化高機能性二重特異性抗体（BsAb）はより高い細胞傷害性を示すことを確認した。
即ち、本発明は以下に示す各態様に係るものである。
［態様１］Ｎ末端からＣ末端の順に抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ）及び抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ）を含んで成る第一のポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端の順に抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ）及び抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ）を含んで成る第二のポリペプチドから構成されることを特徴とする、ダイアボディ型二重特異性抗体。
　［態様２］抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ）及びＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ）、並びに、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ）及びＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ）を含み、以下のいずれかの構造： 
（i）（５ＬＯＨ）－（ペプチドリンカー）－（ＯＬ５Ｈ）又は（ＯＬ５Ｈ）－（ペプチドリンカー）－（５ＬＯＨ）；
（ii）（５ＬＯＨ）及び（ＯＬ５Ｈ）の２種類の一本鎖ポリペプチドから構成されるヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体がいずれか一方の一本鎖ポリペプチドによりヒンジ領域を介してヒト抗体の２つのＦｃ領域に結合して成る抗体； 
（iii）（５ＬＯＨ）－（ペプチドリンカー）－（ＯＬ５Ｈ）又は（ＯＬ５Ｈ）－（ペプチドリンカー）－（５ＬＯＨ）から成る一本鎖ポリペプチドがヒンジ領域を介してヒト抗体の２つのＦｃ領域に結合して成る抗体； 
を有するヒト型化高機能性二重特異性抗体。
　［態様３］（ii）の構造を有する態様２記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体であって、該ヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体がプロテアーゼ切断部位を介してヒンジ領域に結合していることを特徴とする、前記ヒト型化高機能性二重特異性抗体。
［態様４］（iii）の構造を有する態様２記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体であって、一本鎖ポリペプチドがプロテアーゼ切断部位を介してヒンジ領域に結合していることを特徴とする、前記ヒト型化高機能性二重特異性抗体。
［態様５］各一本鎖ポリペプチドにおけるＬ鎖のヒト型化可変領域とＨ鎖のヒト型化可変領域がペプチドリンカーで連結されている、態様１又は２記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
［態様６］
抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ）、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ）、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ）、及び、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ）が、夫々、配列番号２，４，６及び８で示されるアミノ酸配列から成る、態様１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
［態様７］態様１ないし６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチド。
［態様８］態様７に記載の一本鎖ポリペプチドをコードする核酸分子。
［態様９］態様１ないし６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドを共にコードする核酸分子。
［態様１０］態様８又は６９記載の核酸分子を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクター。
［態様１１］共発現ベクターである、態様１０記載のベクター。
［態様１２］プラスミドベクターである、態様１０又は１１記載のベクター。
［態様１３］態様１０ないし１２のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
［態様１４］原核細胞である態様１３記載の宿主細胞。
［態様１５］大腸菌である態様１４記載の宿主細胞。
［態様１６］態様１ないし６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の製造方法であって、態様１３１５のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し該二重特異性抗体を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドを発現させ、該ポリペプチドを回収・精製し、該２種類の一本鎖ポリペプチドを会合させ、形成された二重特異性抗体を分離・回収することから成る、前記方法。
［態様１７］原核細胞が大腸菌であり、２種類の一本鎖ポリペプチドを大腸菌の培養培地上清、ペリズマ画分、菌体内可溶性画分、又は、菌体内不溶性画分から回収する、態様１６記載の製造方法。
［態様１８］態様１ないし６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の製造方法であって、態様１１記載の共発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し該二重特異性抗体を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドを発現させ、該形質転換菌内でダイアボディ型二重特異性抗体を形成せしめ、形成された二重特異性抗体を分離・回収することから成る、前記方法。
［態様１９］態様３又は４に記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体をプロテアーゼで消化することによりＦｃ領域及びヒンジ領域を切断することから成る、夫々、５ＬＯＨ及びＯＬ５Ｈの二種類のポリペプチドから構成されるヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体、又は態様２記載の（i）の構造を有するヒト型化高機能性二重特異性抗体の製造方法。
［態様２０］　態様１ないし６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
［態様２１］腫瘍細胞を排除する、殺傷する、傷害する及び／又は減少せしめるためのものであることを特徴とする態様２０記載の医薬組成物。
［書類名］　要約書　
［課題］二重特異性抗体の更なる高機能化によって、投与量の軽減による低コスト化など、医薬品としての付加価値を高める新たなダイアボディ型二重特異性抗体及びその製造方法を提供すること。
［解決手段］各ポリペプチドにおいてＬ鎖がＮ末側にあること（ＬＨ型）を特徴とするヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体（ＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体）及び該ＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体を含むヒト型化高機能性二重特異性抗体、該二重特異性抗体を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドを共にコードする核酸分子、該核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含む、該抗体の製造方法。
本発明のＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体は、以前に本発明者等が開発したヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体（Ex3）にFcが融合されたIgG様の高機能二重特異性抗体（Ex3-scDb-Fc：特許文献２）と同等の非常に高い細胞傷害活性を有する。更に、製造方法における諸条件の検討により、従来の各種二重特異性抗体の倍以上の高い抗体量を菌の可溶性画分から調製することに成功した。更に、ＬＨ型を用いて作製したヒト型化高機能性二重特異性抗体（ＬＨ型BsAb）は、上記のＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体に較べて、より高い細胞傷害性を示すことが確認された。
ＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体を大腸菌培養培地上清及び大腸菌菌体内各画分から調製した結果を示す。 ヒト扁平上皮がん細胞株であるA431細胞（ATCC No.CRL-1555）に対する、ＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体、特許文献１に記載されたヒト型化Ex3及び特許文献２に記載されたEx3-scDb-Fcによる細胞増殖阻害試験の結果を示す。 ヒト乳がん細胞株であるSK-BR-3細胞（ATCC No.HTB-30）に対する、ＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体、特許文献１に記載されたヒト型化Ex3及び特許文献２に記載されたEx3-scDb-Fcによる細胞増殖阻害試験の結果を示す。 ヒト乳がん細胞株（EGFR低発現株）であるMCF7細胞（ATCC No.HTB-22）に対する、ＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体、特許文献１に記載されたヒト型化Ex3及び特許文献２に記載されたEx3-scDb-Fcによる細胞増殖阻害試験の結果を示す。 ヒト胆がん細胞株であるTFK-1（東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センター ID：TKG036）に対する、ＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体及び特許文献１に記載されたヒト型化Ex3による細胞増殖阻害試験の結果を示す。 ヒト胆がん細胞株であるTFK-1（東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センター ID：TKG036）に対する、ＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体、特許文献１に記載されたヒト型化Ex3及び特許文献２に記載されたEx3-scDb-Fcによる細胞増殖阻害試験の結果を示す。 TFK-1に対する、ＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体（ＬＨ型Ex3）及びＬＨ型ヒト型化高機能性二重特異性抗体（ＬＨ型Ex3 scDb-Fc）による細胞増殖阻害試験の結果を示す。ここで、各抗体濃度において、左のバー（ＬＨ型Ex3）及び右のバー（ＬＨ型Ex3 scDb-Fc）を示す。
　抗EGFR抗体産生マウスB細胞ハイブリドーマ528は、東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センターに寄託されている（ＩＤ：ＴＫＧ０５５５）。更に、５２８抗体を産生するハイブリドーマはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）においてATCC No.HB-8509 として保管されており、かかる寄託機関からも容易に入手可能である。
一方、抗CD3抗体OKT3も東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センターに寄託されている（ＩＤ：ＴＫＧ０２３５）。又、OKT3抗体を産生するハイブリドーマはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）においてATCC No.CRL-8001 として保管されており、かかる寄託機関からも容易に入手可能である。
これらを用いて、当業者に公知の方法によってcDNAを調製することが出来る。例えば、ISOGEN(ニッポンジーン社)を用いmRNAを抽出、First-Strand cDNA Synthesis Kit(Amersham Biosciences社)によりcDNAを調製し、参考論文（Krebber, A. et al. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. J Immunol Methods 201, 35-55. (1997)）に基づき合成したクローニングプライマーを用いPCRを行いこれら各抗体のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域の配列を決定することができる。
　本発明のＬＨ型二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチドに含まれる可変領域の「ヒト型化」とは、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）のヒト型化可変領域における相補性決定領域 (complementarity-determining region; CDR)の残基の少なくとも一部において、マウス、ラット、またはウサギといったような非ヒト動物（ドナー抗体）であり且つ所望の特異性、親和性、および能力を有するCDR に由来する残基によって置換されている抗体を意味する。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基によって置換される場合もある。さらに、ヒト型化抗体は、レシピエント抗体および導入されたCDR またはフレームワーク配列のいずれにおいても見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに優れたものあるいは最適なものとするために行われる。更に詳しくは、Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323-329 (1988);EP-B-239400; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992); およびEP-B-451216 を参照することができる。
  このような抗体のヒト型化可変領域のヒト型化は当業者に公知の方法に従って実施することが出来る。例えば、レシピエント抗体及びドナー抗体の３次元イムノグロブリンモデルを使用し、種々の概念的ヒト型化生成物を分析する工程により、ヒト型化抗体が調製される。３次元イムノグロブリンモデルは、当業者にはよく知られている。更に詳細については、WO92/22653等を参照することができる。
　従って、ヒト型化されたヒト型化可変領域の例として、ヒト型化可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウス抗体由来であり、その他の部分がヒト抗体由来である抗体を挙げることができる。
　本発明では更に、ヒト型化によって抗体自身の機能低下等が生起する場合があるので、一本鎖ポリペプチド中の適当な部位、例えば、ＣＤＲ構造に影響を与える可能性があるフレームワーク（ＦＲ）中の部位、例えば、canonical 配列又はvernier 配列において部位特異的変異を起こさせることによってヒト型化抗体の機能の改善をすることが出来る。
　具体的には、528ヒト型化可変領域のヒト型化はCDR grafting法により行った。まずVH、VLそれぞれ相同性検索を行い、各CDR(complementarity determining region)の長さ等を考慮した上でもっとも相同性の高いFR(frame work)をもつヒト抗体配列を選択する。選択したヒト抗体のCDRを528のCDRと入れ換えたアミノ酸配列を設計し、対応するコドンについては先と同様に大腸菌至適コドンを用いることが好ましく、オーバーラップPCR法により遺伝子の全合成を行うことが出来る。
　又、ヒト型化OKT3ヒト型化可変領域はすでに報告されており、マウスOKT3に比べて十分に活性を保持していることも確かめられている(Adair, J. R. et al. Humanization of the murine anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3. Hum Antibodies Hybridomas 5, 41-7. (1994))。この文献に記載されているヒト型化OKT3ヒト型化可変領域のアミノ酸配列を基に、オーバーラップPCR法により遺伝子の全合成を行った。この際にコドンは大腸菌における至適コドンを用いることが好ましく、至適コドンに置換した全合成遺伝子を用いることでの大腸菌における発現量の増加はすでに報告されている。
　本発明のＬＨ型二重特異性抗体の構成要素である一本鎖ポリペプチドに含まれる、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ）、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ）、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ）、及び、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ）の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列の一例を、夫々、配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、並びに、配列番号７及び８で示す。
各一本鎖ポリペプチドにおけるＬ鎖ヒト型化可変領域及びＨ鎖ヒト型化可変領域は適当なペプチドリンカーで連結されていることが好ましい。該ペプチドリンカーは、一本鎖抗体の分子内での相互作用を困難にし、複数の一本鎖抗体による多量体の形成を可能ならしめ、その結果、互いに別の一本鎖抗体に由来するＶＨとＶＬが適切に会合することによって、オリジナルのタンパク質（当該ポリペプチドは該オリジナルのタンパク質に由来するものあるいは該オリジナルのタンパク質から誘導されたものである）の機能、例えば生物活性などの一部あるいはその全てを模擬又は促進する構造をとることができるようなものであれば特に限定されず、例えば当該分野で広く知られたものあるいは該公知のリンカーを改変したものの中から選択して使用することが可能である。例えば、ペプチドリンカーは１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは２～１０個のアミノ酸の長さであることが好ましい。
更に、各一本鎖ポリペプチドは上記のペプチドリンカーを含まずに、二つのヒト型化可変領域が直接結合していても良い。このような場合には、各一本鎖抗体の三次元的自由度を高めて多量体化を促進させるために、各一本鎖ポリペプチドにおいてＮ末端側にあるヒト型化可変領域のC末端の１ないし数個のアミノ酸、又は、C末端側にあるヒト型化可変領域のN末端の１ないし数個のアミノ酸が除去されていることが好ましい。
更に、上記の各配列番号で示される各アミノ酸配列において、一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列であって、元のアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能・活性、例えば、ヒト型化可変領域の抗原特異性と実質的に保持しているアミノ酸配列も本発明のＬＨ型二重特異性抗体を構成する一本鎖抗体のポリペプチドとして使用することが出来る。欠失、置換、挿入若しくは付加されるアミノ酸は、好ましくは、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士が置換されるか、又は、アミノ酸の欠失若しくは付加によって、蛋白質の三次元構造及び／又は局所的電荷状態に大きな変化が生じない、又は、実質的にそれらが影響を受けないようなものが好ましい。このような欠失、置換又は付加されるアミノ酸を有するポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入法（点突然変異導入及びカセット式変異導入等）、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作製することが可能である。尚、これらの一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列は、元のアミノ酸配列全長に対して、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の配列相同性を示すものということもできる。　
ヒト型化高機能性二重特異性抗体（BsAb）に含まれる様々な型の具体的な構造は国際公開第WO2007/108152号パンフレット（特許文献２）に記載されており、具体的には、例えば、以下に示す型を挙げることが出来る。
　本発明のＬＨ型BsAbの第一の型（i）（ＬＨ型Ex3 scDb）は、（５ＬＯＨ）－（ペプチドリンカー）－（ＯＬ５Ｈ）又は（ＯＬ５Ｈ）－（ペプチドリンカー）－（５ＬＯＨ）で示される構造を有する。即ち、ＬＨ型Ex3を構成する２種類のポリペプチド鎖である５ＬＯＨ及びＯＬ５Ｈが更にペプチドリンカーにより結合されて、全体としてシングルポリペプチド鎖となったものである。この結果、BsAb分子の構造がEx3に比べてより安定化される。更に、このBsAbを製造する際に必要な発現ベクターは一種で済み、その結果、ＬＨ型Ex3に比べてより均一なBsAb分子を調製することが可能である。尚、「scDb」は一本鎖(Single Chain) ダイアボディ抗体を意味する。
上記ペプチドリンカーは、ＯＨ及びＯＬ、並びに、５Ｈ及び５Ｌ同士を会合させて、夫々の抗原と特異的に反応し得る抗原結合部位が形成されるものである限り、その長さなどに特に制限はなく、例えば当該分野で広く知られたものあるいは該公知のリンカーを改変したものの中から選択して使用することが可能である。尚、上記ペプチドリンカーは、５Ｈ及び５Ｌの間、又は、ＯＨ及びＯＬの間のいずれかに挿入されていても良い。
　本発明のＬＨ型BsAbの第二の型（ii）（ＬＨ型Ex3-Fc）は、５ＬＯＨ及びＯＬ５Ｈの二種類のポリペプチドから構成されるヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体（ＬＨ型Ex3）がいずれか一方のポリペプチドによりヒンジ領域を介してヒト抗体の２つのＦｃ領域に結合しているものである。即ち、具体的には、ヒンジ領域を介してヒト抗体のＦｃ領域と結合したEx3を構成する２種類のポリペプチドの何れか一方のポリペプチド（例えば、（ＯＬ５Ｈ）－ヒンジ領域－Ｆｃ領域）、及び、ＬＨ型Ex3を構成するもう一方のポリペプチド（例えば、（５ＬＯＨ））の２種類のポリペプチドから構成されるものである。該抗体はこれら２種類の一本鎖ポリペプチドを共発現させた後に会合せしめることによって製造することが出来る。尚、「Ｆｃ領域」とは、定常領域（Ｃ領域）を構成するＨ鎖のＣ末端側の２個のドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）を意味する。
　本発明のＬＨ型BsAbの第三の型（iii）（ＬＨ型Ex3 scDb-Fc）は、本発明ＬＨ型BsAbの第二の型（ii）において、ＬＨ型Ex3の代わりに本発明BsAbの第一の型であるＬＨ型Ex3 scDbがヒンジ領域を介してヒト抗体のＦｃ領域に結合した構造を有している。即ち、ヒンジ領域には、（５ＬＯＨ）－（ペプチドリンカー）－（ＯＬ５Ｈ）、又は（ＯＬ５Ｈ）－（ペプチドリンカー）－（５ＬＯＨ）から成る一本鎖ポリペプチドに含まれる２種類のＨ鎖可変領域又はＬ鎖可変領域の何れがヒンジ領域と結合していても良い。
　本発明のＬＨ型BsAbの第二の型（ii）及び第三の型（iii）を構成するドメインの数はＩｇＧタイプの免疫グロブリン分子と同じであり、これらの抗体は該免疫グロブリン分子に近い立体的構造を有しているものと考えられる。更に、これら本発明ＬＨ型BsAbの第二の型（ii）及び第三の型（iii）において、ＬＨ型Ex3又はＬＨ型Ex3 scDbとヒンジ領域の間にプロテアーゼ切断部位を介在させることにより、これらのＬＨ型BsAbをプロテアーゼ消化し、その後、後述する各種精製操作を適宜行うことによって、ＬＨ型Ex3又はＬＨ型Ex3 scDbを容易に製造することが可能となる。又、こうしたプロテアーゼ消化によって得られたＬＨ型Ex3又はＬＨ型Ex3 scDbは、従来の方法で作製したものと比較してより高い細胞傷害活性を示す。
　以上の本発明の第二の型（ii）及び第三の型（iii）のＬＨ型BsAbは何れもヒトＦｃ領域を有しているために、プロテインＡによる精製が容易であり、又、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び細胞依存性サイトカイン（ＣＤＣ）を誘導することが出来、更には、各抗原に対して二価で結合することが可能、というＬＨ型Ex3には見られない効果を奏する。
尚、本発明ＬＨ型BsAbに含まれるペプチドリンカーは、例えば１～２０個のアミノ酸からなるポリペプチドであってよく、好ましくは１～１５個のアミノ酸からなるポリペプチド、さらに好ましくは２～１０個のアミノ酸からなるポリペプチドが挙げられる。
本発明のＬＨ型BsAbに含まれる定常領域又はＦｃ領域はヒト抗体に由来するものである限り特に制限はない。例えば、ＣＬはκまたはλ鎖の何れに由来するものでも良い。又、Ｆｃ領域又はＨ鎖定常領域は、通常、ＩｇＧのγ鎖に由来するものが使用される。ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、並びにＣＬの一例として、夫々、特許文献２に開示された配列番号２９及び配列番号３０、配列番号３３に示したアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。
更に、本発明のＬＨ型BsAbを構成する一本鎖ポリペプチドに含まれる、PreSission配列、ヒンジ領域、ペプチドリンカー、シグナルペプチド等のアミノ酸配列の代表例として、特許文献２の図３－３及び図３－４に開示された配列を挙げることが出来る。尚、PreSission配列はプロテアーゼ切断部位を含む配列である。使用するプロテアーゼの種類に特に制限はなく、例えば、Thrombin及びFactor Xa等の当業者に公知の酵素を使用することが出来、それに応じて、プロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸配列を適宜選択することが出来る。
本発明の各一本鎖ポリペプチドに含まれる各領域又は配列をコードする核酸分子（オリゴヌクレオチド）の代表例は、上記の各配列番号に示された塩基配列を有するものである。その他に、各配列番号に記載の塩基配列の全長と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の配列相同性を示すような塩基配列から成る核酸分子は、上記の各領域又は配列と実質的に同等の活性又は機能を有するポリペプチドをコードしていると考えられるので、これらの核酸分子も上記の本発明の核酸に含まれる。このような核酸分子には本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドの少なくともいずれか一つのポリペプチドをコードする塩基配列が含まれているが、２種類の一本鎖ポリペプチドを夫々コードする２種類に塩基配列が共に含まれていることが好ましい。
　２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行なう。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
ここで、「相同性」とは、ポリペプチド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同士の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」（「同一性」とも言われる）なる用語は、当業者には周知である (例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988);Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994);von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press,New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991) 等) 。二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Martin, J. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego, (1994); Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) 等に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。相同性を測定するための好ましい方法としては、試験する二つの配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計したものが挙げられる。このような方法は、コンピュータープログラムとして組み立てられているものが挙げられる。二つの配列間の相同性を測定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、GCG プログラムパッケージ (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)) 、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403 (1990)) 等が挙げられるが、これらに限定されるものでなく、当該分野で公知の方法を使用することができる。
　更に、上記の各核酸分子は、各配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記配列番号で示された各ポリペプチドの機能・活性と実質的に同じものを有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含むものである。
　ここで、ハイブリダイゼーションは、Molecular cloning third.ed.（Cold Spring Harbor Lab.Press，2001）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
　ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
本明細書において、ＤＮＡのハイブリダイズにおける「ストリンジェント（stringent）な条件」は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。更に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。
従って、「ストリンジェントな条件」とは、各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば、温度６０℃～６８℃において、ナトリウム濃度150～900mM、好ましくは600～900mM、pH 6～8であるような条件を挙げることが出来る。ストリンジェントな条件の一具体例としては、5 x SSC (750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム)、1% SDS、5 x デンハルト溶液50% ホルムアルデヒド、及び42℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、0.1 x SSC (15 mM NaCl、1.5 mM クエン酸三ナトリウム)、0.1% SDS、及び55℃の条件で洗浄を行うものである。
　更に、各一本鎖ポリペプチドにおけるヒト型化されたヒト型化可変領域をコードする核酸を作製する場合には、予め設計されたアミノ酸配列に基づきオーバーラップPCR法により全合成することができる。尚、「核酸」とは、一本鎖ポリペプチドをコードする分子であれば、その化学構造及び取得経路に特に制限はなく、例えば、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡ等を含むものものである。
　具体的には、cDNAライブラリーから、文献記載の配列に基づいてハイブリダイゼーションにより、あるいはポリメラーゼチェインリアクション(PCR) 技術により単離されうる。一旦単離されれば、DNA は発現ベクター中に配置され、次いでこれを、大腸菌（E. coli ）細胞、COS 細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞) 、またはイムノグロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞にトランスフェクションさせ、該組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成させることができる。PCR 反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えば R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki, et al., Science, 239: 487, 1988 ; H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed., “DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) ; M. A. Innis et al. ed., “PCR Protocols: a guide to methods and applications", Academic Press, New York (1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことができる。また、PCR 法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
DNA など核酸の配列決定は、例えばSanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977)などを参考にすることができる。また一般的な組換えDNA 技術は、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (ed.), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)及び D. M. Glover et al. (ed.), “DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) などを参考にできる。
　こうして取得された本発明のＬＨ型二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域をコードする核酸は、目的に応じて、当業者に公知の手段により適宜所望のペプチド又はアミノ酸をコードするように改変することができる。この様にDNA を遺伝子的に改変又は修飾する技術は、Mutagenesis: a Practical Approach, M.J．Mcpherson (Ed.), (IRL Press, Oxford, UK(1991) における総説において示されており、例えば、位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）、カセット変異誘発法及びポリメラーゼチェインリアクション(PCR) 変異生成法を挙げることができる。
　ここで、核酸の「改変」とは、得られたオリジナルの核酸において、アミノ酸残基をコードする少なくとも一つのコドンにおける、塩基の挿入、欠失または置換を意味する。例えば、オリジナルのアミノ酸残基をコードするコドンを、別のアミノ酸残基をコードするコドンにより置換することにより一本鎖ポリペプチドを構成するアミノ酸配列自体を改変する方法がある。
　又は、本明細書の実施例に記載されているように、アミノ酸自体は変更せずに、大腸菌等の宿主細胞にあったコドン（至適コドン）を使用するように、一本鎖ポリペプチドをコードする核酸を改変することも出来る。このように至適コドンに改変することによって、宿主細胞内における一本鎖ポリペプチドの発現効率等の向上を図ることが出来る。
　本発明のＬＨ型二重特異性抗体は、当業者に公知の方法、例えば、遺伝子工学的手法又は化学合成等の各種手段を用いて製造することが出来る。遺伝子工学的手法としては、例えば、該二重特異性抗体を構成する夫々の一本鎖抗体のポリペプチドをコードする核酸を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクターを作製し、このベクターで宿主細胞を形質転換せしめ、該形質転換された宿主細胞を培養して宿主細胞中で一本鎖ポリペプチドを発現させ、該ポリペプチドを回収・精製し、それらの一本鎖ポリペプチドを会合させ、形成されたＬＨ型二重特異性抗体を分離・回収することによって製造することが出来る。
　ここで、「複製可能な発現ベクター(replicable expression vector)」および「発現ベクター(expression vector) 」は、DNA（通常は二本鎖である）の断片(piece) をいい、該DNAは、その中に外来のDNAの断片を挿入せしめることができる。外来のDNAは、異種DNA (heterologous DNA)として定義され、このものは、対象宿主細胞においては天然では見出されないDNA である。ベクターは、外来DNAまたは異種DNA を適切な宿主細胞に運ぶために使用される。一旦、宿主細胞中に入ると、ベクターは、宿主染色体DNA とは独立に複製することが可能であり、そしてベクターおよびその挿入された（外来）DNA のいくつかのコピーが生成され得る。さらに、ベクターは外来DNAのポリペプチドへの翻訳を可能にするのに不可欠なエレメントを含む。従って、外来DNAによってコードされるポリペプチドの多くの分子が迅速に合成されることができる。
  このようなベクターは、適切な宿主中で DNA配列を発現するように、適切な制御配列(control sequence)とそれが機能するように(operably)（即ち、外来DNAが発現できるように）連結せしめられたDNA配列を含有する DNA構築物(DNA construct) を意味している。そうした制御配列としては、転写(transcription) させるためのプロモーター、そうした転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、リアデニル化配列、及び転写や翻訳(translation) の終了を制御する配列等が挙げられる。更にベクターは、、当業者に公知の各種の配列、例えば、制限酵素切断部位、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子（選択遺伝子）、シグナル配列、リーダー配列等を必要に応じて適宜含むことが出来る。これらの各種配列又は要素は、外来DNAの種類、使用する宿主細胞、培養培地等の条件に応じて、当業者が適宜選択して使用することが出来る。更に、製造した一本鎖ポリペプチドの検出及び精製等を容易にする目的のために、当業者に公知の各種のペプチドタグ（例えば、ｃ－ｍｙｃタグ及びＨｉｓ－ｔａｇ）をコードする配列を一本鎖ポリペプチドに対応する配列の末端等に含ませることが出来る。
　該ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、あるいは単純にゲノムの挿入体(genomic insert)等の任意の形態が可能である。一旦、適切な宿主の中に形質転換で導入せしめられると、該ベクターは宿住のゲノムとは独立して複製したり機能するものであり得る。又は、該ベクターはゲノムの中に組み込まれるものであってもよい。
　宿主細胞としては当業者に公知の任意の細胞を使用することができるが、例えば、代表的な宿主細胞としては、大腸菌(E. coli) 等の原核細胞、及び、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞) 、ヒト由来細胞などの哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞等の真核細胞が挙げることができる。形質転換菌は当業者に公知の任意の抵当な条件・方法で培養することができる。宿主として、例えば、BL21 star(DE3)株、培地として2xYT培地、培養温度28℃前後、0.5 mM 程度のIPTGで発現を誘導することによって、培養上清又は可溶性画分における本発明のＬＨ型二重特異性抗体の収量を大幅に向上させることができ、製造効率を高めることが可能となる。
  このような宿主細胞における発現等により得られた一本鎖ポリペプチドは一般に分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収されるが、それが分泌シグナルを持たずに直接に産生された場合には宿主細胞溶解物から回収することが出来る。一本鎖ポリペプチドが膜結合性である場合には、適当な洗浄剤（例えば、トライトン-X100) を使用して膜から遊離せしめることができる。
　精製操作は当業者に公知の任の方法を適宜組み合わせて行うことが出来る。例えば、遠心分離、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースでのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン樹脂クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム等）、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、硫酸アンモニウム沈殿、及びアフィニティクロマトグラフィーによって好適に精製される。アフィニティクロマトグラフィーは、一本鎖ポリペプチドが有するぺプチドタグとの親和力を利用した効率が高い好ましい精製技術の一つである。
　尚、回収された一本鎖ポリペプチドは不溶性画分に含まれていることも多いために、精製操作は、一本鎖ポリペプチドを可溶化し変性状態にした上で行うことが好ましい。この可溶化処理は、エタノールなどのアルコール類、グアニジン塩酸塩、尿素などの解離剤として当業者に公知の任意の薬剤を使用して行うことが出来る。更に、こうして精製された２種類の一本鎖ポリペプチドを会合（巻き戻し）せしめ、形成された抗体分子を分離して回収することによって、本発明のＬＨ型二重特異性抗体を製造することが出来る。
　会合処理は、単独の一本鎖ポリペプチドを適切な空間的配置に戻すことによって、所望の生物活性を有する状態に戻すことを意味する。従って、会合処理は、ポリペプチド同志あるいはドメイン同志を会合した状態に戻すという意味も有しているので「再会合」ともいうことができるし、所望の生物活性を有するものにするという意味で、再構成ということもでき、或いは、リフォールディング (refolding)とも呼ぶことが出来る。会合処理は当業者に公知の任意の方法で行うことが出来るが、例えば、透析操作により、一本鎖ポリペプチドを含むバッファ溶液中の変性剤（例えば、塩酸グアニジン）の濃度を段階的に下げる方法が好ましい。この過程で、凝集抑制剤、及び酸化剤を反応系に適宜添加することによって、酸化反応の促進を図ることも可能である。形成された多量体化低分子抗体の分離及び回収も当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。
　以上に示したように、本発明のＬＨ型二重特異性抗体は、例えば、大腸菌など培養宿主細胞の培養培地上清、ペリズマ画分、菌体内可溶性画分、又は、菌体内不溶性画分から調製することが可能である。
　本発明のベクターとして、本発明のＬＨ型二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチドに対応する核酸分子を共に含む共発現ベクターを用いることによって、又は、一本鎖ポリペプチドの夫々をコードする核酸分子を含む発現ベクターを同一の宿主細胞を形質転換せしめ、該形質転換菌内で夫々の一本鎖ポリペプチドが発現した後にＬＨ型二重特異性抗体が形成され、それを大腸菌など培養宿主細胞の培養培地上清又は可溶性画分から調製することが可能である。従って、このような場合には、上記の会合（巻き戻し）処理は不要となり、低コストで高生産性が得られる。
更に、該形質転換菌の菌体内可溶性画分からの調製量を向上させるためには、以下のような条件とすることが好ましい。宿主としてBL21 star(DE3)株(Invitrogen)を用い、培養は2xYT培地を用い28℃で行う。一晩振盪培養後(600 nmのO.D.が 約5)となったところで、終濃度0.5 mM のIPTGにより発現を誘導し、さらに16時間培養後に、培地上清画分と菌体を浸透圧処理後の画分(ペリプラズム画分)から目的タンパク質を回収する。
　本発明の医薬組成物は、本発明のＬＨ型二重特異性抗体、一本鎖ポリペプチド、核酸、ベクター、及び形質転換された宿主細胞から成る群から選ばれたものを有効成分として含有することを特徴とする。かかる有効成分は、以下の実施例に示されているように、インビトロ及びインビボで上皮細胞成長因子受容体を発現する（陽性）腫瘍細胞を有意に排除・殺傷・傷害する作用を有しているので、本発明の医薬組成物はこのような腫瘍細胞に対する抗腫瘍剤として使用することが出来る。
　本発明の有効成分の有効量は、例えば治療目的、腫瘍の種類、部位及び大きさ等の投与対象における病状、患者の諸条件、及び投与経路等によって当業者が適宜決めることが出来る。典型的な１回の投与量又は日用量は、上記の条件に応じ、可能ならば、例えば当分野で既知の腫瘍細胞の生存又は生長についての検定法を使用して、まずインビトロで、そして次に、人間の患者のための用量範囲を外挿し得る適切な動物モデルで、適当な用量範囲を決定することもできる。
　本発明の医薬組成物には、有効成分の種類、薬剤形態、投与方法・目的、投与対象の病態等の各種条件に応じて、有効成分に加えて当業者に周知の薬学上許容し得る各種成分（例えば、担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、等）を適宜添加することが出来る。
　本発明の医薬組成物は、上記各種条件に応じて、錠剤、液剤、粉末、ゲル、及び、噴霧剤、或いは、マイクロカプセル、コロイド状分配系（リポソーム、マイクロエマルジョン等）、及びマクロエマルジョン等の種々薬剤形態をとり得る。
　投与方法としては、静脈内、腹腔内、脳内、脊髄内、筋肉内、眼内、動脈内、特には胆管内、又は病変内経路による注入又は注射、及び持続放出型システム製剤による方法が挙げられる。本発明の活性物質は、輸液により連続的に、または大量注射により投与されることができる。尚、本発明の医薬組成物を投与する場合には、食作用又は細胞傷害活性を有する細胞と共に投与することが好ましい。或いは、投与前に本発明のＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体のような有効成分と上記細胞とを混合することによって、投与前に該抗体を予め該細胞に結合させておくことが好ましい。
  持続放出製剤は、一般的には、そこから本発明の活性物質をある程度の時間放出することのできる形態のものであり、持続放出調製物の好適な例は、蛋白質を含む固体疎水性ポリマーの半透過性担体を含み、該担体は、例えばフィルムまたはマイクロカプセル等の成型物の形態のものである。
　本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法、例えば日本薬局方解説書編集委員会編、第十三改正　日本薬局方解説書、平成８年７月10日発行、株式会社廣川書店などの記載を参考にしてそれらのうちから必要に応じて適宜選択して製造することができる。
　なお、明細書及び図面において、用語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
　以下に参考例及び実施例を参照して本発明を具体的に説明するが、これらは単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
  全ての参考例及び実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。尚、以下の実施例において、特に指摘が無い場合には、具体的な操作並びに処理条件などは、DNA クローニングでは J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, “Molecular Cloning", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) 及び D. M. Glover et al. ed., “DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) ; 特にPCR 法では、H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed.,“DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995)   及び M. A. Innis et al. ed.,“PCR Protocols", Academic Press, New York (1990)に記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書(protocols) や添付の薬品等を使用している。
ＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体の製造
　本発明のＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体を以下の概要で調製した。
発現ベクターは既に開発されているEGFR及びCD3を標的としたヒト型化ダイアボディ型発現ベクター(特許文献１、及び特許文献２の参考例１～４）を基に以下の通り作製した。
即ち、A-Bプライマーを用いPCR法によりヒト型化5L(以下h5L)を、C-Dプライマーを用いヒト型化OH(以下hOH)をそれぞれ増幅後、得られたPCR産物を混合し、さらにA-Dプライマーを用いてPCR増幅を行った。得られたPCR産物を制限酵素NcoIとSacIIで消化し、pRAベクターに挿入することで、SGGGGをリンカー配列として有するLH型ダイアボディを構成するヘテロscFvの1つh5LhOHを発現させるためのベクターpRA-h5LhOHを作製した。
E-Fプライマーを用いPCR法によりヒト型化OL(以下hOL)を、G-Hプライマーを用いヒト型化5H(以下h5H)をそれぞれ増幅後、得られたPCR産物を混合し、さらにE-Hプライマーを用いてPCR増幅を行った。得られたPCR産物を制限酵素NcoIとSacIIで消化し、pRAベクターに挿入することで、SGGGGをリンカー配列として有するLH型ダイアボディを構成するヘテロscFvの1つhOLh5Hを発現させるためのベクターpRA-hOLh5Hを作製した。
さらに、I-Jライマーを用いPCR法によりh5LhOHを増幅後、得られたPCR産物を制限酵素SpeIとBamHIで消化し、pRA-hOLh5H中のhOLh5Hの後方に挿入することで、本発明のLH型ヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体の製造用の共発現ベクターを構築した（図１）。
それぞれ、C末端側には検出のためのc-mycペプチドタグ、並びに精製のためのHis-tagが並列に導入されている。
A NcoI-5L： 5'-NNNNCCATGGCCGATATTGTGATGACCCAGAGCCCG-3'：〔配列番号：９〕
B 5LSG4： 5'-CTGGCCACCGCCACCAGATTTAATTTCCACTTTGGTGCCACCGCC-3'〔配列番号：１０〕
C SG4OH： 5'-AAATCTGGTGGCGGTGGCCAGGTGCAACTGGTGCAGAGCGGC-3'〔配列番号：１１〕
D OH-SacII：5'-NNNNAGCCGCGGAGCTAACGGTCACCGGGGTGCCCTGGCC-3'〔配列番号：１２〕
E NcoI-OL：5'-NNNNCCATGGCCGATATTCAGATGACCCAGAGCCCG-3'〔配列番号：１３〕
F OLSG4：5'-CTGGCCACCGCCACCAGAGGTAATCTGCAGTTTGGTACCCTG-3'〔配列番号：１４〕
G SG45H： 5'-ACCTCTGGTGGCGGTGGCCAGGTGCAACTGGTTCAGAGCGGC-3'〔配列番号：１５〕
H 5H-Sac II： 5'-NNNNAGCCGCGGAGCTCACGGTAACCAGCGTACC-3'〔配列番号：１６〕
I SpeI-pel-B：5'-ACTAGTTATTTCAAGGAGACAGTCATAATG-3'〔配列番号：１７〕
J His-BamHI： 5'-CACCATCATCACCACCATTAATAGCGGATTC-3'〔配列番号：１８〕
C末端側には検出のためのc-mycペプチドタグ、並びに精製のためのHis-tag (Hisx6:ヒスチジン6量体tag)が並列に導入されている。常法に従って、上記の共発現ベクターで大腸菌を形質転換し、該形質転換菌を2xYT培地中で28℃で一晩培養後、0.5 mMのIPTGで発現誘導し、培養培地上清及び大腸菌菌体内のペリプラズマ画分、可溶性画分、及び、不溶性画分から調製した結果を図１に示す。尚、各図中においては、こうして得られた本発明のヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体を「ＬＨ型Ex3」と示す。
こうして製造された本発明のＬＨ型であるヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体の構成要素である一本鎖ポリペプチドに含まれる、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ）、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ）、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ）、及び、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ）の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は、夫々、夫々、配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、並びに、配列番号７及び８で示されたものである。
ＬＨ型高機能性二重特異性抗体の製造
特許文献２の実施例１に記載の方法（第一～三の型）に準じて上記各配列及び適当なＰＣＲプライマーを用いてＬＨ型高機能性二重特異性抗体（Ex3 scDb-Fc）用の発現ベクターを作製し、次いで、特許文献２の実施例２に準じてＣＨＯ細胞を宿主として用いてEx3 scDb-Fcを調製した。但し、まず、第一の型であるＬＨ型高機能性二重特異性抗体（ＬＨ型Ex3 scDb）として、（５ＬＯＨ）の上流にペプチドリンカーを介して（ＯＬ５Ｈ）を挿入することによって、（Ｎ末側）（ＯＬ５Ｈ）－（ペプチドリンカー）－（５ＬＯＨ）（Ｃ末側）の構成を有するEx3 scDbを作製し、これに基づきEx3 scDb-Fcを作製した。その結果、精製後の抗体収量は培養液１Ｌあたり約１ｍｇであった。
ＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体及びＬＨ型高機能性二重特異性抗体（Ex3 scDb-Fc）の細胞増殖阻害試験
実施例１で作製した本発明のＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体及び実施例２で作製したＬＨ型高機能性二重特異性抗体について、以下の概要で細胞増殖阻害試験（MTS アッセイ）を実施した。
MTS assay により、ヒト扁平上皮がん細胞株であるA431細胞（ATCC No.CRL-1555）、ヒト乳がん細胞株であるSK-BR-3細胞（ATCC No.HTB-30）、ヒト乳がん細胞株（EGFR低発現株）であるMCF7細胞（ATCC No.HTB-22）、及び、ヒト胆がん細胞株であるTFK-1（東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センター ID：TKG036）の増殖がＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体によりどれほど阻害されたかを、特許文献１に記載されたヒト型化Ex3（図中、単に「Ex3」と標記）及び特許文献２に記載されたEx3-scDb-Fcと比較した。セルカウントを行い、RPMI（10 % FBS）100μLあたり細胞5×103個になるよう調整し、96穴プレートに100μLずつ分注、37℃で一晩静置した。目的蛋白質を目的濃度になるようにRPMIで希釈、前日準備したプレートに抗体蛋白質を50μLずつ分注し、T-LAK 細胞を目的E/T 比になるようにRPMIで希釈し、50μLずつ分注し(E/T 比：effector(T-LAK細胞)/target(標的がん細胞)比)、37℃で48時間培養した。プレートの培養液を取り除き、PBS により洗浄、MTS、PMS、RPMIを加え、37℃で30～60分インキュベートした後、プレートリーダーで490nm の吸光度を測定した。その結果、図２～６に表されるように、いずれの細胞株に対しても、本発明のＬＨ型ダイアボディ型二重特異性抗体は、ヒト型化Ex3に較べて約１桁も優れた細胞傷害活性を示し、IgG様の高機能二重特異性抗体であるEx3-scDb-Fcと同等の細胞傷害活性を示すことが確認された。
　更に、同様の方法でTFK-1の増殖に対する阻害作用をＬＨ型Ex3とＬＨ型Ex3 scDb-Fcとで比較した。その結果、ＬＨ型Ex3 scDb-FcはＬＨ型Ex3よりも更に顕著な細胞傷害活性を有することが示された（図７）。
 (注) MTS 試薬 (CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega社製) 、PMS(CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay,Promega 社製)
抗体医薬はコスト高が大きな問題となっており、安価な大腸菌でも製造可能な低分子抗体の作製が世界的な潮流となっている。一方で、がん治療に向けた低分子抗体の開発から優に10年以上経過しているものの、製造や実際の治療効果の問題から、なかなか臨床試験へと展開していない。しかしながら、製造コスト又は機能性の面でより改良されれば、十分に医薬として成立し得ると、考えられている。
本発明によって、ＬＨ型二重特異性抗体及びその新たな製造方法が提供されたことによって、ダイアボディ型二重特異性抗体の一層の臨床応用が図られ、今後ますます、同様の分子が脚光を浴び、製薬企業における開発やシーズ探索が加速されるものと期待される。

Claims (21)

  1. Ｎ末端からＣ末端の順に抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ）及び抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ）を含んで成る第一のポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端の順に抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ）及び抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ）を含んで成る第二のポリペプチドから構成されることを特徴とする、ダイアボディ型二重特異性抗体。
  2. 抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ）及びＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ）、並びに、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ）及びＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ）を含み、以下のいずれかの構造： 
    （i）（５ＬＯＨ）－（ペプチドリンカー）－（ＯＬ５Ｈ）又は（ＯＬ５Ｈ）－（ペプチドリンカー）－（５ＬＯＨ）；
    （ii）（５ＬＯＨ）及び（ＯＬ５Ｈ）の２種類の一本鎖ポリペプチドから構成されるヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体がいずれか一方の一本鎖ポリペプチドによりヒンジ領域を介してヒト抗体の２つのＦｃ領域に結合して成る抗体； 
    （iii）（５ＬＯＨ）－（ペプチドリンカー）－（ＯＬ５Ｈ）又は（ＯＬ５Ｈ）－（ペプチドリンカー）－（５ＬＯＨ）から成る一本鎖ポリペプチドがヒンジ領域を介してヒト抗体の２つのＦｃ領域に結合して成る抗体； 
    を有するヒト型化高機能性二重特異性抗体。
  3. （ii）の構造を有する請求項２記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体であって、該ヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体がプロテアーゼ切断部位を介してヒンジ領域に結合していることを特徴とする、前記ヒト型化高機能性二重特異性抗体。
  4. （iii）の構造を有する請求項２記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体であって、一本鎖ポリペプチドがプロテアーゼ切断部位を介してヒンジ領域に結合していることを特徴とする、前記ヒト型化高機能性二重特異性抗体。
  5. 各一本鎖ポリペプチドにおけるＬ鎖のヒト型化可変領域とＨ鎖のヒト型化可変領域がペプチドリンカーで連結されている、請求項１又は２記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
  6. 抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＬ鎖のヒト型化可変領域（５Ｌ）、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体１抗体５２８のＨ鎖のヒト型化可変領域（５Ｈ）、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＬ鎖のヒト型化可変領域（ＯＬ）、及び、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＨ鎖のヒト型化可変領域（ＯＨ）が、夫々、配列番号２，４，６及び８で示されるアミノ酸配列から成る、請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  7. 請求項１ないし６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチド。
  8. 請求項７に記載の一本鎖ポリペプチドをコードする核酸分子。
  9. 請求項１ないし６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドを共にコードする核酸分子。
  10. 請求項８又は６９記載の核酸分子を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクター。
  11. 共発現ベクターである、請求項１０記載のベクター。
  12. プラスミドベクターである、請求項１０又は１１記載のベクター。
  13. 請求項１０ないし１２のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
  14. 原核細胞である請求項１３記載の宿主細胞。
  15. 大腸菌である請求項１４記載の宿主細胞。
  16. 請求項１ないし６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の製造方法であって、請求項１３１５のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し該二重特異性抗体を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドを発現させ、該ポリペプチドを回収・精製し、該２種類の一本鎖ポリペプチドを会合させ、形成された二重特異性抗体を分離・回収することから成る、前記方法。
  17. 原核細胞が大腸菌であり、２種類の一本鎖ポリペプチドを大腸菌の培養培地上清、ペリズマ画分、菌体内可溶性画分、又は、菌体内不溶性画分から回収する、請求項１６記載の製造方法。
  18. 請求項１ないし６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の製造方法であって、請求項１１記載の共発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し該二重特異性抗体を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドを発現させ、該形質転換菌内でダイアボディ型二重特異性抗体を形成せしめ、形成された二重特異性抗体を分離・回収することから成る、前記方法。
  19. 請求項３又は４に記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体をプロテアーゼで消化することによりＦｃ領域及びヒンジ領域を切断することから成る、夫々、５ＬＯＨ及びＯＬ５Ｈの二種類のポリペプチドから構成されるヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体、又は請求項２記載の（i）の構造を有するヒト型化高機能性二重特異性抗体の製造方法。
  20. 請求項１ないし６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
  21. 腫瘍細胞を排除する、殺傷する、傷害する及び／又は減少せしめるためのものであることを特徴とする請求項２０記載の医薬組成物。
PCT/JP2010/050008 2009-03-25 2010-01-04 Ｌｈ型二重特異性抗体 Ceased WO2010109924A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/257,614 US9315584B2 (en) 2009-03-25 2010-01-04 LH-type bispecific antibody
EP10755725.8A EP2412808B1 (en) 2009-03-25 2010-01-04 Lh-type bispecific antibody
JP2011505904A JP5725508B2 (ja) 2009-03-25 2010-01-04 Ｌｈ型二重特異性抗体
US14/597,969 US20150175713A1 (en) 2009-03-25 2015-01-15 Lh-type bispecific antibody

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009-075050 2009-03-25
JP2009075050 2009-03-25
JP2009260576 2009-11-16
JP2009-260576 2009-11-16

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/257,614 A-371-Of-International US9315584B2 (en) 2009-03-25 2010-01-04 LH-type bispecific antibody
US14/597,969 Division US20150175713A1 (en) 2009-03-25 2015-01-15 Lh-type bispecific antibody

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010109924A1 true WO2010109924A1 (ja) 2010-09-30

Family

ID=42780621

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/050008 Ceased WO2010109924A1 (ja) 2009-03-25 2010-01-04 Ｌｈ型二重特異性抗体

Country Status (4)

Country Link
US (2) US9315584B2 (ja)
EP (1) EP2412808B1 (ja)
JP (1) JP5725508B2 (ja)
WO (1) WO2010109924A1 (ja)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011062112A1 (ja) * 2009-11-18 2011-05-26 国立大学法人東北大学 ヒト型化抗ｅｇｆｒ抗体可変領域の高機能性変異体
JP2014527515A (ja) * 2011-07-22 2014-10-16 アフィメート テラポイティクス アーゲー 多価抗原結合Ｆｖ分子
JP2015156836A (ja) * 2014-02-25 2015-09-03 国立大学法人東北大学 剛直なヘリックス構造を有するオリゴペプチドが導入された二重特異性抗体
WO2015146437A1 (ja) * 2014-03-25 2015-10-01 国立大学法人東北大学 高機能性ＩｇＧ２型二重特異性抗体
WO2015146438A1 (ja) * 2014-03-26 2015-10-01 国立大学法人東北大学 ヒト上皮増殖因子受容体を標的とした二重特異性抗体
US10669337B2 (en) 2014-07-25 2020-06-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Bispecific anti-CD3 antibodies, bispecific activatable anti-CD3 antibodies, and methods of using the same
WO2021038975A1 (ja) 2019-08-28 2021-03-04 株式会社アネロファーマ・サイエンス ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィドバクテリウム属細菌
US11161906B2 (en) 2013-07-25 2021-11-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
PL3653221T3 (pl) 2015-02-19 2022-12-19 Compugen Ltd. Przeciwciała anty-pvrig i sposoby ich zastosowania
ES2896055T3 (es) 2015-07-13 2022-02-23 Compugen Ltd Composiciones de HIDE1 y métodos
JP7128529B2 (ja) 2016-12-23 2022-08-31 アールイーエムディー バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド プログラム死リガンド－１（ｐｄ－ｌ１）に結合する抗体を使用する免疫

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP0239400B1 (en) 1986-03-27 1994-08-03 Medical Research Council Recombinant antibodies and methods for their production
EP0451216B1 (en) 1988-12-28 1996-01-24 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins and their production and use
JP2004242638A (ja) * 2003-02-17 2004-09-02 Tohoku Techno Arch Co Ltd 新規なダイアボディ型二重特異性抗体
WO2007108152A1 (ja) 2006-03-23 2007-09-27 Tohoku University 高機能性二重特異性抗体

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0239400B1 (en) 1986-03-27 1994-08-03 Medical Research Council Recombinant antibodies and methods for their production
EP0451216B1 (en) 1988-12-28 1996-01-24 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins and their production and use
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JP2004242638A (ja) * 2003-02-17 2004-09-02 Tohoku Techno Arch Co Ltd 新規なダイアボディ型二重特異性抗体
JP3803790B2 (ja) 2003-02-17 2006-08-02 株式会社東北テクノアーチ 新規なダイアボディ型二重特異性抗体
WO2007108152A1 (ja) 2006-03-23 2007-09-27 Tohoku University 高機能性二重特異性抗体

Non-Patent Citations (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Biocomputing: Informatics and Genome Projects", 1993, ACADEMIC PRESS
"Computational Molecular Biology", 1988, OXFORD UNIVERSITY PRESS
"Computer Analysis of Sequence Data: Part I", 1994, HUMAN PRESS
"Guide Book of Japanese Pharmacopoeia", 10 July 1996, HIROKAWA PUBLISHING COMPANY
"Guide to Huge Computers", 1994, ACADEMIC PRESS
"Molecular cloning", 2001, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
"Mutagenesis: a Practical Approach", 1991, IRL PRESS
"PCR Protocols", 1990, ACADEMIC PRESS
"PCR Protocols: a guide to methods and applications", 1990, ACADEMIC PRESS
"PCR Technology", 1989, STOCKTON PRESS
"PCR: a practical approach", 1991, IRL PRESS
"Sequence Analysis Primer", 1991, M-STOCKTON PRESS
"The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", vol. 113, 1994, SPRINGER-VERLAG, pages: 269 - 315
"The Practical Approach Series", vol. 1, 1995, OXFORD UNIVERSITY PRESS, article "DNA Cloning"
"The Practical Approach Series", vol. 1-4, 1995, OXFORD UNIVERSITY PRESS, article "DNA Cloning"
"The Practical Approach Series", vol. 4, 1995, IRL PRESS, OXFORD UNIVERSITY PRESS
ADAIR, J. R. ET AL.: "Humanization of the murine anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3", HUM ANTIBODIES HYBRIDOMAS, vol. 5, 1994, pages 41 - 7
ALT M: "Novel tetravalent and bispecific IgG-like antibody molecules combining single-chain diabodies with the immunoglobulin gammal Fc or CH3 region", FEBS LETT., vol. 454, 1999, pages 90 - 4
ATSCHUL, S. F. ET AL., J. MOLEC. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403
BIOCHEM SOC TRANS, vol. 30, no. 4, 2002, pages 507 - 11
CARILLO, H., LIPMAN, D., SIAM J. APPLIED MATH., vol. 48, 1988, pages 1073
DEVEREUX, J. ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 1984, pages 387
HOLLINGER ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 6444 - 6448
J MOL BIOL, vol. 330, no. 1, 2003, pages 99 - 111
J. SAMBROOK, E. F. FRITSCH, T. MANIATIS: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
JONES ET AL., NATURE, vol. 321, 1986, pages 522 - 525
KREBBER, A. ET AL.: "Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system", J IMMUNOL METHODS, vol. 201, 1997, pages 35 - 55
LU D. ET AL.: "The effect of variable domain orientation and arrangement on the antigen- binding activity of a recombinant human bispecific diabody", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 318, no. 2, 28 May 2004 (2004-05-28), pages 507 - 513, XP004505410 *
LU D: "A fully human recombinant IgG-like bispecific antibody to both the epidermal growth factor receptor and the insulin-like growth factor receptor for enhanced antitumor activity", J BIOL CHEM., vol. 280, 2005, pages 19665 - 72
M.A. FROHMAN, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 8998 - 9002
PRESTA, CURR. OP. STRUCT. BIOL, vol. 2, 1992, pages 593 - 596
R. SAIKI ET AL., SCIENCE, vol. 230, 1985, pages 1350
R. SAIKI ET AL., SCIENCE, vol. 239, 1988, pages 487
REICHMANN ET AL., NATURE, vol. 332, 1988, pages 323 - 329
SANGER ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 74, 1977, pages 5463 - 5467
SCIENCE, vol. 321, no. 5891, 15 August 2008 (2008-08-15), pages 974 - 7
See also references of EP2412808A4 *
TODOROVSKA A. ET AL.: "Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting", J. IMMUNOL. METHODS, vol. 248, no. 1-2, 1 February 2001 (2001-02-01), pages 47 - 66, XP002288731 *
VON HEINJE, G: "Sequence Analysis in Molecular Biology", 1987, ACADEMIC PRESS

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011062112A1 (ja) * 2009-11-18 2011-05-26 国立大学法人東北大学 ヒト型化抗ｅｇｆｒ抗体可変領域の高機能性変異体
US8921525B2 (en) 2009-11-18 2014-12-30 Tohoku University Highly-functional mutant of humanized anti-EGFR antibody variable region
JP2014527515A (ja) * 2011-07-22 2014-10-16 アフィメート テラポイティクス アーゲー 多価抗原結合Ｆｖ分子
US11161906B2 (en) 2013-07-25 2021-11-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
JP2015156836A (ja) * 2014-02-25 2015-09-03 国立大学法人東北大学 剛直なヘリックス構造を有するオリゴペプチドが導入された二重特異性抗体
WO2015146437A1 (ja) * 2014-03-25 2015-10-01 国立大学法人東北大学 高機能性ＩｇＧ２型二重特異性抗体
WO2015146438A1 (ja) * 2014-03-26 2015-10-01 国立大学法人東北大学 ヒト上皮増殖因子受容体を標的とした二重特異性抗体
US10669337B2 (en) 2014-07-25 2020-06-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Bispecific anti-CD3 antibodies, bispecific activatable anti-CD3 antibodies, and methods of using the same
US11802158B2 (en) 2014-07-25 2023-10-31 Cytomx Therapeutics, Inc. Bispecific anti-CD3 antibodies, bispecific activatable anti-CD3 antibodies, and methods of using the same
WO2021038975A1 (ja) 2019-08-28 2021-03-04 株式会社アネロファーマ・サイエンス ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィドバクテリウム属細菌

Also Published As

Publication number Publication date
EP2412808A4 (en) 2013-01-23
EP2412808B1 (en) 2016-09-07
JP5725508B2 (ja) 2015-05-27
EP2412808A1 (en) 2012-02-01
US20150175713A1 (en) 2015-06-25
US9315584B2 (en) 2016-04-19
US20120095191A1 (en) 2012-04-19
JPWO2010109924A1 (ja) 2012-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5725508B2 (ja) Ｌｈ型二重特異性抗体
JP5527627B2 (ja) 高機能性二重特異性抗体
JP3803790B2 (ja) 新規なダイアボディ型二重特異性抗体
US9139650B2 (en) Fragment of humanized anti-EGFR antibody substituted-lysine variable fragment and use thereof
WO2015146437A1 (ja) 高機能性ＩｇＧ２型二重特異性抗体
JPWO2015146438A1 (ja) ヒト上皮増殖因子受容体を標的とした二重特異性抗体
JP2014510084A (ja) 二重特異性および単一特異性の非対称な抗体ならびにそれらの作製方法
CN109476734A (zh) Cd70和cd3的抗体构建体
JP5818003B2 (ja) ヒト型化抗ｅｇｆｒ抗体可変領域の高機能性変異体
JP5614606B2 (ja) 多量体化低分子抗体
JP2005333993A (ja) 新規なダイアボディ型二重特異性抗体
JP6210455B2 (ja) 剛直なヘリックス構造を有するオリゴペプチドが導入された二重特異性抗体
WO2025218621A1 (zh) 靶向muc1的抗原结合蛋白
TW202434635A (zh) 多特異性抗體及其醫藥用途
HK1197419A (en) Antibodies against prostate-specific stem cell antigen and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10755725

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2011505904

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2010755725

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010755725

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13257614

Country of ref document: US