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WO2009100949A1 - Zitterionische guanidiniumverbindungen als selektive antimikrobielle wirkstoffe - Google Patents

Zitterionische guanidiniumverbindungen als selektive antimikrobielle wirkstoffe Download PDF

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WO2009100949A1
WO2009100949A1 PCT/EP2009/001075 EP2009001075W WO2009100949A1 WO 2009100949 A1 WO2009100949 A1 WO 2009100949A1 EP 2009001075 W EP2009001075 W EP 2009001075W WO 2009100949 A1 WO2009100949 A1 WO 2009100949A1
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WO
WIPO (PCT)
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formula
use according
compound
coo
hydrogen atom
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PCT/EP2009/001075
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English (en)
French (fr)
Inventor
Erwin Galinski
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Individual
Original Assignee
Individual
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/04—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton
    • C07C279/14—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups
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    • A61P31/04—Antibacterial agents
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    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A61Q17/04—Topical preparations for affording protection against sunlight or other radiation; Topical sun tanning preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin

Definitions

  • Some examples of common pathogenic bacteria that may be associated with food are Gram-positive Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, and Gram-negative Salmonella sp. and toxin producing E. coli.
  • Enterobacteriaceae family e.g. Generic Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Yersina, et al.
  • Enterobacteriaceae family e.g. Generic Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Yersina, et al.
  • Salmonella and Escherichia spp. Have been associated with food infections many times and outbreaks of poultry, meat, meat products, eggs and chocolate have been reported (Tauxe 1997).
  • Preferred substances are the zwitterions glycine betaine and ectoine or derivatives thereof.
  • imaging systems are not very specific but transport a wide range of different substances (Peddie et al., 1998).
  • the skin is populated as a relative dry site of moderate salinity from a microflora composed to a large extent of osmotolerant microorganisms, some of which (eg Corynebacterium, Propionibacterium, Staphylococcus, Micrococcus species) contribute to the formation of impure skin or even skin diseases may be involved (Woodroffe & Shaw 1974).
  • osmotolerant microorganisms some of which (eg Corynebacterium, Propionibacterium, Staphylococcus, Micrococcus species) contribute to the formation of impure skin or even skin diseases may be involved (Woodroffe & Shaw 1974).
  • the use of compatible solutes as stress relievers by microorganisms also plays an important role in the skin location, especially in connection with skin infections and irritations.
  • the diuretic agent amiloride an important inhibitor of the mammalian NaVH + antiporter, had no effect on the Nha-type antiporter of E.coli, but on the NhaB-type antiporter, but only on "inside-out” vesicles (Pinner et al., 1995).
  • 2-Aminoperimidine inhibited the Nha-type antiporter of E. coli, but again only on inverted vesicles (Dibrov et al., 2005). Both compounds have a guanidinium group as a structural element. It is therefore assumed that the guanidinium cation simulates a triply hydrated Na + ion and competes for binding sites.
  • This surprising finding applies to a wide range of organisms with suitable recording system for compatible solutes of similar type, but especially for members of the family Enterobacteriaceae (eg Escherichia, Klebsiella, Salmonella, Yersinia, Serratia species and many others).
  • Escherichia coli has been shown to enhance the antimicrobial effect with increasing salinity and increasing temperature ( Figures 2 and 3), while many Gram-positive bacteria (eg Bacillus sp., Corynebacter glutamicum, Staphylococcus carnosus) remained unaffected. By investigating mutants deleted from individual components of the sodium cycle, a specific effect on this target could be demonstrated. Using compounds of the formulas I and II, it is therefore possible for the first time to actively introduce a zwitterionic guanidinium compound into living cells and to selectively inhibit components of the Na + cycle there.
  • Gram-positive bacteria eg Bacillus sp., Corynebacter glutamicum, Staphylococcus carnosus
  • the present invention claims the use of compounds according to formula I and II which are characterized in that they have a) a zwitterionic structure and are readily soluble in water and b) under physico-chemical conditions such as those found in foods and used in the food industry ( For example, reduced water activity and / or low pH and / or high pressure) or in everyday life in the field of hygiene and personal care or in morbid situations experienced by pathogenic microbes, preferably from the group of enterobacteria, taken as alleged protective substances and accumulate and specifically inhibit the Na + cycle there.
  • R1-R5 can be: a) a hydrogen atom b) (C1-C3) -alkyl radical
  • R6 can be:
  • R 1 - R 4 may be: a) a hydrogen atom b) (C 1 -C 3) -alkyl radical
  • x can be 1, 2 or 3.
  • enterobacteria can already occur on the farm (or on the trawler) and continue through the chain of processing and sales processes. Examples at the beginning of the chain are e.g. Cattle and sheep skins, contamination of eggs in ovaries of chickens, contaminated seeds and manually treated fish and meat products. In the further processing, contact surfaces, sewers, fasteners and much more were identified as the source of enterobacteria. In many cases, an enterobacteria flora is permanently established in food factories because persistent strains survive in protected niches, often in biofilms that allow attachment to surfaces, as a nutrient source and protect against chemical and physical treatment (Holah et al., 2004).
  • the present invention pursues the goal of combatting enterobacteria in the field of food production, processing and handling (including in biofilms). Due to the zwitterionic nature and the good water solubility of the substances according to the invention, biofilms are penetrated and the antimicrobial compounds are actively absorbed into the cells.
  • the process of meat production in cattle involves skinning and the removal of the intestines after slaughter.
  • the carcass can be contaminated with enterobacteria (GiII 2005).
  • enterobacteria GiII 2005
  • the temperature of the carcasses on the surface is still close to that of the living animal and, after the above-mentioned processing, may still exceed 30 ° C. when the carcasses are transferred to the cold rooms.
  • the present invention aims to combat primarily enterobacteria and other susceptible pathogens.
  • the main factor on the growth rate is the temperature.
  • the invention will be useful because under these conditions, pathogens (in the absence of further obstacles) become increasingly competitive, while at the same time the effect of the antimicrobial substances with increased temperature increases.
  • pork, poultry and other slaughter animals are used to produce pork, poultry and other slaughter animals.
  • This procedure is an alternative to the conventional processing process and means that the bones are released in warm condition before the onset of rigor mortis and before vacuum packaging. This has economic advantages for the manufacturer, but entails additional manipulation and risk of contamination, even if it is broadly considered equivalent to the conventional hygienic procedure.
  • the present invention provides a method capable of inhibiting E. coli and other enterobacteria in the early stages of cooling when the temperature is still above 30 ° C. and the growth of this group of organisms is very rapid.
  • Fermentation of meat, fish and other foods by a mixed bacterial flora, and especially lactic acid bacteria is a traditional process that has evolved empirically and relies on favoring the replication of the desired microbial flora.
  • the classical method was replaced by the targeted use of starter cultures (Adams & Moss 2006).
  • other than lactic acid bacteria can be used (eg Staphylococcus carnosus) to achieve certain product properties (smell and taste).
  • Gram-negative enterobacteria eg, E. coli and Salmonella
  • E. coli and Salmonella are not desired and will be displaced iR over time. This process can be actively supported and accelerated by application of the present invention. It is important to mention that the substances according to the invention do not impair the development of the Gram-positive desired microorganisms and the associated properties of the product.
  • the present invention for the food sector aims to inhibit the growth of susceptible pathogenic microorganisms, mainly from the group of enterobacteria, and concomitantly to promote other organisms, mainly from the group of Gram-positive bacteria, the range of possible applications over the above Examples beyond.
  • the invention may also be used in other methods of food preservation and food safety, such as e.g. Drying, smoking, curing and high pressure treatment (HPP), in which the growth of enterobacteria must be controlled at an early stage.
  • HPP high pressure treatment
  • the substances according to the invention can likewise be used.
  • Products based on compounds of formula I and II can be designed to enhance the effectiveness of existing household cleaning and disinfecting solutions or to be self-contained, new products.
  • the human skin is an organ that requires appropriate care.
  • the air-exposed areas are usually "dry” and colonized by a bacterial flora dominated by Gram-positive organisms (Woodroffe & Shaw 1974).
  • Other areas such as armpits and toe spaces, on the other hand, are "wet” zones where colonization with Gram-negative Bacteria is favored.
  • skin care applications include skin cleansing solutions, skin care creams, moisturizers and formulations for the treatment of skin infections and irritation (eg, sunburn).
  • the risk of infection with potential pathogens also exists in the area of the oral cavity and gums (eg Porphyromonas gingivalis), as well as in the urogenital area with the known opportunistic pathogens from the group of enterobacteria.
  • the present invention can be used to specifically target enterobacteria and other potentially pathogenic species that colonize these zones. The same applies to areas that generate a moist microclimate as a result of bandages, etc.
  • Na + -dependent transport systems for amino acids and, accordingly, primary sodium pumps and Na + / H + antiporter.
  • Na + -dependent pathogenic genera are:
  • Treponema Chlamydia, Porphyromonas, Neisseria, Pasteurella, Haemophilus, Vibrio, Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Klebsiella and Yersinia.
  • creatine is therefore also the preferred
  • E. coli K12 was used to determine growth rates in glucose-mineral salts medium MM63 (modified according to Larsen et al., 1987) in the absence and in
  • the present invention further claims the use of derivatized amino acids according to formula I or cyclic variants according to formula II as selective antimicrobial substances, which are characterized in that the ⁇ - and / or another amino group of an amino acid in a simple process to a guanidinium derivative is modified.
  • guanidinium derivatives are obtained by reacting the amino group (s), if appropriate in modified form, with equimolar amounts of O-methylisourea at elevated pH and purifying them in a simple process (Example 2, FIG. 4).

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Verwendung von Verbindungen entsprechend Formel (I) und/oder eines physiologischen Salzes derselben und/oder stereoisomerer Formen derselben, als selektive antimikrobielle Wirkstoffe, wobei R1-R5 ein Wasserstoffatom oder ein (C1-C3)-Alkylrest sein können, R6 -(CH)2-COO- mit n=0-4, -(CH2)n-SO3 - mit n=0-4 oder ein Aminosäuresubstituent, dergestalt dass die Aminogruppe der Aminosäure Teil eines Guanidinium-Derivats entsprechend Formel (I) sein kann und/oder R1 und R6 ein Strukturelement der Formel (Il) bilden können, wobei R9 ein Wasserstoffatom, ein (C1-C3)-Alkylrest, -(CH2)n-COO- mit n=0-4 oder -(CH2)n-SO3 - mit n=0-4 sein kann, R7 und R8 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein (C1-C3)-Alkylrest, eine Hydroxylgruppe, -(CH2)n-COO- mit n=0-4 oder -(CH2)n-SO3 - mit n=0-4 sein können und x 1, 2 oder 3 sein kann.

Description

Zitterionische Guanidiniumverbindunαen als selektive antimikrobielle Wirkstoffe
Die Bekämpfung und Vermeidung von Infektionen und Kontaminationen durch pathogene und opportunistische Krankheitserreger aus der Gruppe der Enterobakterien ist eine vordringliche Aufgabe der Medizin, aber auch der lebensmittelverarbeitenden Industrie.
Der Verbraucher erwartet von einem Lebensmittel, dass es den Nährwert, geschmackliche Qualität, Frische und seine natürliche Beschaffenheit bewahrt. Dies erfordert neue, innovative Behandlungsmethoden, die es erlauben, den Grad antimikrobieller Zusätze bzw. die Rigorosität der Behandlungsbedingungen zu minimieren, ohne dadurch die Lebensmittelsicherheit zu beeinträchtigen. Traditionelle Methoden der Behandlung von Lebensmitteln wie z.B. Erhitzen, Trocknen, Räuchern, Pökeln, Ansäuern und Fermentieren, die schon seit Menschengedenken empirisch genutzt werden, wurden zu kontrollierten industriellen Prozessen weiterentwickelt. Weiterhin wurde die Lebensmittelkonservierung durch Kühlung Vakuum-Verpackung und Verpackung unter modifizierter Gasatmosphäre verbessert.
Als Konsequenz aus der Vorliebe des Verbrauchers für "natürliche" Nahrungsmittel sind intensiv gesalzene oder sehr saure Nahrungsmittel nicht beliebt. Die technische Lösung besteht in der Anwendung des sogenannten
"Hürden"-Konzepts, d.h. in der Einführung vieler, schonender Barrieren zur Hemmung mikrobiellen Wachstums, anstelle von einzelnen drastischen Maßnahmen (Leistner 1992; McMeekin 2007). Fermentierte Lebensmittel sind ein Beispiel für solch eine Serie von "Hürden". Eine häufig verwendete Sicherheitsmaßnahme, oft zusammen mit anderen Maßnahmen, ist die moderate Verringerung der Wasseraktivität, z.B. durch Zusatz von NaCI.
Einige Beispiele für weit verbreitete pathogene Bakterien, die mit Lebensmitteln assoziiert sein können, sind die Gram-positiven Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes und die Gram-negativen Salmonella sp. und toxinproduzierende E. coli.
Mitglieder der Familie der Enterobacteriaceae, z.B. der Genera Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Yersina u.a., stellen die Lebensmittelindustrie vor große Probleme, weil sie Spezies und Serotypen einschließen, die an Lebensmittelvergiftungen beteiligt sein können, deren Konsequenzen von milden über ernsthaften Symptomen (z.B. Nierenversagen) bis hin zum Tod reichen. Insbesondere Salmonella und Escherichiia spp., wurden schon oft mit Lebensmittelinfektionen in Zusammenhang gebracht, und immer wieder werden Ausbrüche beobachtet, die von Geflügel, Fleisch, Fleischprodukten, Eiern und Schokolade ausgehen (Tauxe 1997).
Forschungsergebnisse belegen, dass Überleben und Persistenz pathogener Enterobakterien oft mit der Fähigkeit zur Biofilmbildung und gesteigerter Virulenz korrelieren. Einige toxinproduzierende E.coli sind schon in extrem geringe Dosierung infektiös (< 10 Zellen). Dabei sind die frühen Stadien der Kompetition entscheidend, und Organismen in Überzahl mit höherer Wachstumsrate werden sehr schnell zur dominaten Mikroflora. Sofern in diesem kritischen Stadium "Hürden" appliziert werden können, die pathogene Arten der Enterobakterien hemmen, wird deren Kompetitivität gegenüber Gram-positiven Bakterien und anderen nicht beeinträchtigten Arten vermindert, was zu einer Favorisierung der gewünschten und einer Verdrängung der unerwünschten Mikroflora führt.
Die Kontrolle mikrobieller Kontamination durch physikochemische Maßnahmen wie z.B. Reduktion der Wasseraktivität wird oft duch die Anwesenheit kompatibler Solute im Lebensmittel und die Fähigkeit der Mikroben, diese als Schutzstoffe und Überlebenshilfen zu verwenden, erschwert. Es ist bekannt, dass kompatible Solute von Mikroorganismen genutzt werden, um sich in einer Umgebung niedriger Wasseraktivität anzupassen und Wachstum unter widrigen Umwelt-bedingungen zu ermöglichen (da Costa et al. 1998). Bei der Mehrheit dieser kompatibeln Solute handelt es sich um Substanzen mit zwitterionischer Struktur, die über Aufnahmesysteme für Osmolyte akkumuliert werden, wie z.B. ProU/proP in E. coli und anderen Enterobakterien oder aber über ähnliche Transportsysteme wie z.B in B.subtilis, Corynebacterium glutamicum, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes und anderen. Die Akkumulation kompatibler Solute durch Mikroorganismen kann daher als ein genereller, flexibler Mechanismus der Stressadaptation betrachtet werden, der den Bemühungen zur Lebensmittelsicherheit und Hygiene entgegen wirkt. Bevorzugte Substanzen sind die Zwitterionen Glycinbetain und Ectoin bzw. Derivate derselben. Darüber hinaus ist bekannt, dass viele Aufnahmesysteme nicht sehr spezifisch sind, sondern ein weites Spektrum unterschiedlicher Substanzen transportieren (Peddie et al. 1998).
Was für die Lebensmittelsicherheit, die Hygiene und die Kontrolle mikrobiellen Wachstums in Lebensmitteln gilt, kann zumindest teilweise auch auf die persönliche Hygiene und die menschliche Körperpflege übertragen werden. Die Haut ist als ein relative trockener Standort moderater Salinität von einer Mikroflora besiedelt, die sich zu einem sehr großen Teil aus osmotoleranten Mikroorganismen zusammensetzt, von denen einige (z.B. Corynebacterium, Propionibacterium, Staphylococcus, Micrococcus Arten) an dem Entstehen unreiner Haut oder sogar an Hautkrankheiten beteiligt sein können (Woodroffe & Shaw 1974). So wie bei den persistenten, kontaminierenden Bakterien auf Fisch- und Fleischprodukten spielt auch am Standort Haut die Nutzung kompatibler Solute als Stressschutzstoffe durch Mikroorganismen eine wichtige Rolle, insbesondere im Zusammenhang mit Infektionen und irritationen der Haut. Davon abgesehen ist eine Besiedlung der Hautoberfläche mit Organismen aus der Gruppe der Enterobakterien i.R. unerwünscht und kann, insbesondere im Bereich der Mundhöhle, der Atemwege und des Urogenitaltraktes auch schwerwiegende Infektionen nach sich ziehen. Genomsequenzvergleiche haben zu der Erkenntnis geführt, dass zwar die meisten Bakterien die protonenmotorische Kraft zur Energiegewinnung und für Transportprozesse nutzen, dass daneben aber auch zyklische Transportprozesse über Na+ Ionen bei Bakterien sehr verbreitet sind. Dazu gehören z.B. primäre Natrium-Pumpen (Dicarboxylat-Decarboxylasen, Na- transportierende Atmungsketten und Natrium-ATPasen) und Antiporter, die einen Protonengradienten in einen Natriumgradienten umwandeln und umgekehrt (NhaA-D, NhaP) (Hase et al. 2001). Darüber hinaus wurden Efflux- Pumpen entdeckt, die das Natrium-Ion als treibende Kraft nutzen und der "multiantimicrobial extrusion family" (MATE) zugerechnet werden (Brown et al. 1999). Letztlich wurde auch die Na+-abhängige Motilität vieler pathogener Mikroorganismen als wichtiger Virulenzfaktor erkannt. Primäre Natrium-Pumpen und Na+/H+-Antiporter sind daher neue potentielle Targets für antimikrobielle Wirkstoffe, die nur bestimmte Gruppen von Mikroorganismen (und das mit minimalen Nebenwirkungen) selektiv angreifen, die sogenannten "smart drugs". Einer der ersten Inhibitoren dieser Art ist Korormycin, ein Antibiotikum einer marinen Pseudoaltermonas-Aύ, das gegen die Na+-transportierende Atmungskette (NQR) anderer mariner Bakterien gerichtet ist. Der diuretische Wirkstoff Amilorid, ein wichtiger Hemmstoff des NaVH+ Antiporters von Säugern, zeigte auf den Nha-Typ Antiporter von E.coli keine Wirkung, wohl aber auf den Antiporter vom NhaB-Typ, allerdings nur an "inside-out" Vesikeln (Pinner et al. 1995). 2-Aminoperimidin dagegen inhibierte den Nha-Typ Antiporter von E.coli, allerdings wiederum nur an invertierten Vesikeln (Dibrov et al. 2005). Beide Verbindungen haben eine Guanidinium-Gruppe als Strukturelement. Es wird daher vermutet, dass das Guanidinium-Kation ein dreifach hydratisiertes Na+- lon simuliert und um entsprechende Bindungsstellen konkurriert.
Da beide Substanzen bei Bakterien aber nur an invertierten Vesikeln und nicht an lebenden Zellen wirken, ist zu vermuten, dass sie entweder nicht in die Zellen aufgenommen werden oder aber von lebenden Zellen sofort wieder exportiert werden.
Es kann daher festgehalten werden, dass es zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch keine spezifischen Inhibitoren gibt, die gezielt die bakteriellen Natrium- Transporter bzw. deren Na+/H+ Antiporter angreifen. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die natürlich vorkommende zwitterionische Guanidiniumverbindung Kreatin (C4H9N3O2) bei verringerter Wasseraktivität in E.coli über die Osmolyt-Transportsysteme proU und/oder proP akkumuliert wird. Anders als für kompatible Solute erwartet, hat Kreatin allerdings keinen positiven Einfluss auf das Wachstum, sondern führt bereits im Konzentrationsbereich von 0.1 - 2 mM zu einer drastischen Verringerung der Wachstumsrate (Beispiel 1 , Figur 1). Dieser Effekt wird mit steigender Salinität und Temperatur verstärkt (Figur 2 und 3). Da Kreatin strukturell dem bekannten kompatiblen Solut Glycinbetain ähnelt, wird es offenbar "versehentlich" als Solut im Cytoplasma akkumuliert, wo es seinen hemmenden Einfluss ausübt. Dieser überraschende Befund gilt für ein weites Spektrum von Organismen mit geeigneten Aufnahmesystem für kompatible Solute von ähnlichem Typ, insbesondere aber für Mitglieder der Familie der Enterobacteriaceae (e.g. Escherichia, Klebsiella, Salmonella, Yersinia, Serratia Arten und vielen andere). An Escherichia coli konnte gezeigt werden, dass der antimikrobielle Effekt mit zunehmender Salinität und zunehmender Temperatur verstärkt wird (Figur 2 und 3), wogegen viele Gram-positive Bakterien (z.B. Bacillus sp., Corynebactehum glutamicum, Staphylococcus carnosus) unbeeinflusst blieben. Durch Untersuchungen an Mutanten, bei denen einzelne Komponenten des Natrium- Zyklus deletiert waren, konnte eine spezifische Wirkung auf dieses Target demonstriert werden. Unter Verwendung von Verbindungen der Formel I und Il ist es daher erstmalig gelungen, eine zwitterionische Guanidiniumverbindung aktiv in lebende Zellen einzubringen und dort gezielt Komponenten des Na+- Zyklus zu inhibieren.
Die vorliegende Erfindung beansprucht die Verwendung von Verbindungen entsprechend Formel I und II, die dadurch charakterisiert sind, dass sie a) eine zwitterionische Struktur haben und gut wasserlöslich sind und b) unter physikochemischen Bedingungen wie sie z.B. in Lebensmitteln vorliegen und in der Lebensmittelindustrie angewendet werden (z.B. reduzierte Wasseraktivität und/oder niedriger pH und/oder hoher Druck) bzw. im täglichen Leben im Bereich der Hygiene und Körperpflege bzw. in krankhaften Situationen erfahren werden, von pathogenen Mikroben, vorzugsweise aus der Gruppe der Gruppe der Enterobakterien, als vermeintliche Schutzstoffe aufgenommen und akkumuliert werden und dort spezifisch den Na+-Zyklus hemmen. Aus dem Spektrum der beanspruchten Verbindungen für den Bereich der Lebensmittelsicherheit, Hygiene und Hautpflege sind vorzugsweise das natürlich vorkommende Kreatin (Wyss & Kaddurah-Daouk, 2000) sowie Stellungs- und Strukturisomere dieser Verbindungen zu nennen, im Zusammenhang mit der Behandlung von Irritationen und Erkrankungen darüber hinaus auch die nicht natürlich vorkommende 1 ,4,5,6-Tetrahydro-2-amino-4-pyrimidincarboxylsäure und deren Hydroxyderivate. Die Verbindungen sollen vorzugsweise durch Besprühen, Waschen oder Eintauchen in Lösung bzw. als Bestandteil ektopischer Formulierungen appliziert werden. Dabei wird das Ziel verfolgt, selektiv mikrobielles Wachstum von Pathogenen aus der Gruppe der Enterobakterien zu hemmen, positive Effekte zu verstärken und/oder Nebenwirkungen zu verringern.
Figure imgf000008_0001
R4 R5
Formel I
R1 - R5 können sein: a) ein Wasserstoffatom b) (C1-C3)-Alkylrest
R6 kann sein:
a) - (CH2)n-COO" mit n=0-4 b) - (CH2)n-SO3 " mit n=0-4 c) ein Aminosäuresubstituent, dergestalt dass daraus eine Verbindung entsteht, in der die Aminogruppe der Aminosäure Teil eines Guanidinium-Derivats entsprechend Formel I bildet
Figure imgf000009_0001
R3 R4
Formel
R1 - R4 können sein: a) ein Wasserstoffatom b) (C1-C3)-Alkylrest
R5 kann sein: a) ein Wasserstoffatom b) (C1-C3)-Alkylrest c) - (CH2)n-COO" mit n=0-4 d) - (CH2)n-SO3 " mit n=0-4
R6 und R7 können unabhängig voneinander sein: a) ein Wasserstoffatom b) (C1-C3)-Alkylrest c) eine Hydroxylgruppe d) - (CH2)n-COO- mit n=0-4 e) - (CH2)n-SO3 " mit n=0-4
x kann 1 ,2 oder 3 sein.
Beispiele für die Anwendung im Lebensmittelbereich, für persönliche Hygiene, Körperpflege und kosmetische Formulierungen, sowie für Medizin und Pharmazie sind nachfolgend aufgeführt: 1. Kontrolle pathogener Enterobakterien in Lebensmitteln und der lebensmittelverarbeitenden Industrie
a) Hygiene im Lebensmittelbereich
Die Kontamination von Lebensmitteln mit Enterobakterien kann bereits auf dem Bauernhof (bzw. auf dem Fischkutter) erfolgen und sich über die Kette der Verarbeitungs- und Verkaufs prozesse fortsetzen. Beispiele am Anfang der Kette sind z.B. Rinder- und Schafsfelle, die Kontamination von Eiern in den Ovarien der Hühner, kontaminierte Samen und manuell behandelte Fisch- und Fleischprodukte. Im weiteren Verarbeitungsprozess wurden Kontaktoberflächen, Abwasserleitungen, Verbindungselemente und vieles mehr als Quelle von Enterobakterien ausfindig gemacht. In vielen Fällen etabliert sich eine Enterobakterien-Flora dauerhaft in Lebensmittelfabriken, weil persistente Stämme in geschützten Nischen überleben, oft in Biofilmen, die die Anheftung an Oberflächen ermöglichen, als Nährstoffquelle dienen und vor chemischer und physikalischer Behandlung schützen (Holah et al. 2004).
Die vorliegende Erfindung verfolgt dass Ziel, Enterobakterien im Bereich der Lebensmittelherstellung, Verarbeitung und Handhabung (u.a. auch in Biofilmen) zu bekämpfen. Aufgrund der zwitterionischen Natur und der guten Wasserlöslichkeit der erfindungsgemäßen Substanzen werden Biofilme durchdrungen und die antimikrobiellen Verbindungen aktiv in die Zellen aufgenommen.
b) Konventionelle Behandlung von Schlachttierkörpern
Der Vorgang der Fleischgewinnung bei Rindern beinhaltet das Enthäuten und die Entfernung der Eingeweide nach der Schlachtung. Bei beiden Vorgängen kann der Tierkörper mit Enterobakterien kontaminiert werden (GiII 2005). Zu diesem Zeitpunkt liegt die Temperatur der Tierkörper an der Oberfläche noch nahe der des lebenden Tiers und kann nach der o.g. Verarbeitung noch über 30 0C betragen, wenn die Tierkörper in die Kühlräume überführt werden. Die vorliegende Erfindung verfolgt das Ziel, primär Enterobakterien und andere zuszeptible Pathogene zu bekämpfen. Der Hauptfaktor auf die Wachstumsrate ist die Temperatur. Insbesondere für den Fall erhöhter Temperaturen wird die Erfindung nützlich sein, da unter diesen Bedingungen Pathogene (in Abwesenheit weiterer Hürden) zunehmend kompetitiv werden, während gleichzeitig aber die Wirkung der antimikrobiellen Substanzen mit erhöhter Temperatur zunimmt. Das Gesagte gilt natürlich entsprechend für Schweinefleisch, Geflügel und andere Schlachttiere.
c) Das Entfernen von Knochen im warmen Zustand
Dieses Verfahren stellt eine Alternative zum konventionellen Verarbeitungsprozess dar und bedeutet, dass die Knochen im warmen Zustand vor Eintreten des rigor mortis und vor der Vakuumverpackung ausgelöst werden. Das hat ökonomische Vorteile für den Hersteller, bedeutet aber zusätzliche Manipulation und Kontaminationsgefahr, selbst wenn es im Großen und Ganzen als dem konventionellen Verfahren in hygienischer Hinsicht equivalent eingestuft wird.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verfahrensweise vor, die in der Lage ist, E.coli und andere Enterobakterien in den frühen Stadien des Abkühlens zu inhibieren, wenn die Temperatur noch über 30 0C liegt und das Wachstum dieser Organismengruppe sehr rasch erfolgt.
d) Fermentierte Lebensmittel
Die Fermentation von Fleisch, Fisch und anderen Nahrungsmitteln durch eine gemischte Bakterienflora, und insbesondere Milchsäurebakterien, ist ein traditionelles Verfahren, das sich empirisch entwickelt hat und darauf beruht, die Vermehrung der gewünschten Mikrobenflora zu begünstigen. In der modernen Fermentationspraxis wurde die klassische Methode durch den gezielten Einsatz von Starterkulturen verdrängt (Adams & Moss 2006). Dabei können auch andere als Milchsäurebakterien eingesetzt werden (z.B. Staphylococcus carnosus), um bestimmte Produkteigenschaften (Geruch und Geschmack) zu erzielen. Gram-negative Enterobakterien (z.B. E.coli und Salmonella), obwohl anfänglich vorhanden, sind nicht erwünscht und werden i.R. mit der Zeit verdrängt. Dieser Vorgang kann durch Anwendung der vorliegenden Erfindung aktiv unterstützt und beschleunigt werden. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die erfindungsgemäßen Substanzen die Entwicklung der Gram-positiven erwünschten Mikroorganismen und der damit verbundenen Eigenschaften des Produkts nicht beeinträchtigt.
e) Andere Anwendungen im Zusammenhang mit Lebensmitteln und lebensmittelver-arbeitenden Prozessen
Da die vorliegende Erfindung für den Lebensmittelbereich das Ziel verfolgt, das Wachstum von suszeptiblen pathogenen Mikroorganismen, im Wesentlichen aus der Gruppe der Enterobakterien, zu hemmen und damit einhergehend andere Organismen, hauptsächlich aus der Gruppe der Gram-positiven Bakterien zu fördern, geht das Spektrum der möglichen Anwendungen über die o.g. Beispiele hinaus. Die Erfindung kann auch bei anderen Verfahren der Lebensmittelkonservierung und Lebensmittelsicherheit zum Einsatz kommen, wie z.B. Trocknen, Räuchern, Pökeln und Hochdruckbehandlung (HPP), bei denen das Wachstum von Enterobakterien in einem frühen Stadium kontrolliert werden muss.
2. Persönliche Hygiene und Körperpflege
Im häuslichen Umfeld und im Bereich der persönlichen Hygiene und Körperpflege können die erfindungsgemäßen Substanzen ebenfalls zum Einsatz kommen. Produkte auf der Basis von Verbindungen der Formel I und Il können so konzipiert sein, dass sie die Wirksamkeit bereits vorhandener Haushaltsreinigungs- und Desinfektionslösungen verstärken oder eigenständige, neue Produkte darstellen.
Die menschliche Haut ist ein Organ, das entsprechender Pflege bedarf. Der Luft exponierte Bereiche sind in der Regel "trocken" und von einer Bakterienflora besiedelt, die von Gram-positiven Organismen dominiert wird (Woodroffe & Shaw 1974). Andere Bereiche wie z.B. Achselhöhlen und Zehzwischenräume sind dagegen "feuchte" Zonen, in denen die Besiedlung mit Gram-negativen Bakterien begünstigt wird. Beispiele für die Anwendung im Hautpflegebereich sind Reinigungslösungen für die Haut, Hautpflege-Cremes, Moisturizer und Formulierungen für die Behandlung von Infektionen und irritationen der Haut (z.B. Sonnenbrand). Die Gefahr der Infektion mit potentiellen Pathogenen besteht auch im Bereich der Mundhöhle und des Zahnfleisches (z.B. Porphyromonas gingivalis), sowie für den Urogenitalbereich mit den bekannten opportunistischen Krankheitserregern aus der Gruppe der Enterobakterien. Die vorliegende Erfindung kann genutzt werden, um gezielt Enterobakterien und andere potentiell Pathogene anzugreifen, die diese Zonen besiedeln. Ähnliches gilt für Bereiche, die infolge von Bandagen etc. ein feuchtes Mikroklima generieren.
3. Selektive antimikrobielle Wirkstoffe für Medizin und Pharmazie
Möglicherweise aufgrund hoher Na+ Konzentrationen in Blut und anderen Körperflüssigkeiten haben viele human- und tierpathogene Mikroorganismen Na+-abhängige Transportsysteme für Aminosäuren und dementsprechend auch primäre Natrium-Pumpen und Na+/H+ Antiporter. Beispiele für solche Na+- abhängigen pathogenen Genera sind:
Treponema, Chlamydia, Porphyromonas, Neisseria, Pasteurella, Haemophilus, Vibrio, Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Klebsiella und Yersinia.
Da die erfindungsgemäßen Substanzen entsprechend Formel I und Il von diesen Organismen akkumuliert werden und dort mit Komponenten des Na+- Zyklus interferieren (z.B. NQR und/oder Antiporter), ist ein gezielter Einsatz gegen diese Pathogenen unter Ausnutzung eines ganz neuen Targets möglich. Selbst wenn durch die Verwendung dieser antimikrobiellen Substanzen nur ein sehr limitiertes Spektrum von Organismen erreicht würde, so könnten sie doch eine sehr wirkungsvolle Ergänzung zu bestehenden Therapiekonzepten darstellen, insbesondere bei persistenten Infektionen.
Von den Verbindungen gemäß Formel I ist Kreatin auch deshalb die bevorzugte
Verbindung, für den Lebensmittelbereich, weil es ein natürlicher Bestandteil höherer Lebewesen ist. Es dient in Vertebraten als Energiespeicher (in Form von Kreatinphosphat) und ist in Fleisch und Fisch in hoher Konzentration (2-10 g/kg) enthalten. Kreatin ist international als wertvolles Nahrungsergänzungsmittel für Sportler und Vegetarier anerkannt und als Lebensmittelzusatz und für die topische Applikation unbedenklich. Von den Verbindungen der Formel Il ist 1 ,4,5,6-Tetrahydro-2-amino-4- pyrimidincarbonsäure bzw. deren 5-Hydroxy-Variante für den Bereich medizinischer und pharmazeutischer Applikationen besonders bevorzugt, weil es sich um Derivate der natürlich vorkommenden kompatiblen Solute L-Ectoin und S,S-ß- Hydroxyectoin handelt, die von zahlreichen Transportsystemen für kompatible Solute erkannt und akkumuliert werden.
Beispiel 1 :
Wirkung von Kreatin auf die Wachstumsrate von E.coli K12 in Abhängigkeit von
Salinität und Temperatur
E.coli K12 wurde zur Bestimmung der Wachstumsraten in Glucose-Mineralsalz- Medium MM63 (modifiziert nach Larsen et al. 1987) in Abwesenheit und in
Gegenwart von Kreatin bei verschiedenen Salinitäten und bei verschiedenen
Temperaturen kultiviert. Die antimikrobielle Wirkung ist im
Konzentrationsbereich von 0.1 bis 2 mM besonders ausgeprägt. Sie korreliert mit der Salinität des Mediums und wird durch Erhöhung der Temperatur überproportional verstärkt (Figur 1 , 2 und 3).
Die vorliegende Erfindung beansprucht weiterhin die Verwendung derivatisierter Aminosäuren gemäß Formel I bzw. zyklischer Varianten gemäß Formel Il als selektive antimikrobielle Substanzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die α- und/oder eine andere Aminogruppe einer Aminosäure in einem einfachen Verfahren zu einem Guanidinium-Derivat modifiziert wird. Solche Guanidinium- Dehvate werden erhalten, indem die Aminogruppe(n), ggf. In modifizierter Form, mit equimolaren Mengen an O-Methyl-Isoharnstoff bei erhöhtem pH zur Reaktion gebracht und in einem einfachen Verfahren aufgereinigt werden (Beispiel 2, Figur 4). Für die Herstellung der zyklischen Varianten wird nach bekannten Methoden entsprechend verfahren, indem z.B. bifunktionelle Diaminosäuren und Reagenzien vom Typ NH=C(RI , R2) zur Reaktion gebracht werden, wobei R1 und R2 gute Abgangsgruppen wie z.B. -O-CH3 darstellen. Beispiel 2:
Synthese von N-Amidino-Alanine, einem Strukturisomeren von Kreatin
Einer wässerigen Lösung von Alanin (1 M) wird eine equimolare Menge O-
Methyl-Isoharnstoff hinzugefügt. Der pH wird mit Ca(OH)2 auf pH 10 eingestellt und die Lösung für mind. 2 h auf 50 Grad C temperiert. Anschließend wird mit
Schwefelsäure neutralisiert und das ausgefällte CaSO4 durch Filtration und/oder
Zentrifugation abgetrennt. Das Lösungsmittel Wasser wird durch
Rotationsverdampfung (bei verringertem Druck) oder durch Gefriertrocknung entfernt. Die Reinheit des Rohprodukts bzw. des kristallisierten Produkts wird mittels HPLC oder NMR überprüft (Figur 4). Ausbeute an N-Amidino-Alanine: mindestens 80% (Rohprodukt).
- Patentansprüche -
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Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Verbindungen entsprechend Formel I und/oder eines physiologischen Salzes derselben und/oder stereoisomerer Formen derselben, als selektive antimikrobielle Wirkstoffe
Figure imgf000018_0001
Formel I
wobei R1-R5 ein Wasserstoffatom oder ein (C1-C3)-Alkylrest sein können,
R6 -(CH)2-COO- mit n=0-4, -(CH2)n-SO3 " mit n=0-4 oder ein Aminosäuresubstituent, dergestalt dass die Aminogruppe der Aminosäure Teil eines Guanidinium-Derivats entsprechend Formel I sein kann
und/oder R1 und R6 ein Strukturelement der Formel Il bilden können. R7
Figure imgf000019_0001
Formel Il
wobei R9 ein Wasserstoffatom, ein (C1-C3)-Alkylrest, -(CH2Jn- COO" mit n=0-4 oder
-(CH2)n-SO3 " mit n=0-4 sein kann,
R7 und R8 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein (C1-C3)- Alkylrest, eine Hydroxylgruppe, -(CH2)n-COO" mit n=0-4 oder -(CH2)n-SO3 " mit n=0-4 sein können und
x 1 ,2 oder 3 sein kann.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung nach Formel I Kreatin ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel I das zyklische Guanidiniumderivat der kompatiblen Solute Ectoin oder S,S-ß-Hydroxyectoin ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 im Lebensmittelbereich und in der Haushaltshygiene.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 bei der Körperpflege und in der Kosmetik.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als antimikrobieller Wirkstoff in Medizin und Pharmazie
7. Verwendung nach einem der bevorstehenden Ansprüche in Form einer wässerigen Lösung oder einer Mischung aus Wasser und Alkoholen, die die Verbindung der Formel I in einer Konzentration von 1 μM bis 100 mM enthält, ggf. zusammen mit einem physiologischen Salz, insbesondere NaCI, in einer Konzentration von 0,001 bis 5 Gew.-%.
8. Zusammensetzung zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens eine Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 in einer wässerigen Lösung oder einer Mischung aus Wasser und Alkoholen in einer Konzentration von 1 μM bis 100 mM enthält.
9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie Kreatin und/oder zyklische Guanidiniumderivate der kompatiblen Solute
Ectoin bzw. S,S-ß-Hydroxyectoin enthält.
10. Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens eine Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 in einer Konzentration von 0,1 bis 5 Gew.-% enthält.
1 1. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die wässerige Lösung bzw. die Mischung aus Wasser und Alkohol zusätzlich ein physiologisches Salz, insbesonder NaCI, in einer Konzentration von 0,01 bis 5 Gew.-% enthält.
12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 11 zur Behandlung von Infektionen und Irritationen der Haut.
- Zusammenfassung -
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