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WO2009141965A1 - 濾過方法 - Google Patents

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WO2009141965A1
WO2009141965A1 PCT/JP2009/001944 JP2009001944W WO2009141965A1 WO 2009141965 A1 WO2009141965 A1 WO 2009141965A1 JP 2009001944 W JP2009001944 W JP 2009001944W WO 2009141965 A1 WO2009141965 A1 WO 2009141965A1
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WO
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virus removal
virus
protein
intermediate product
filtration
Prior art date
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PCT/JP2009/001944
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English (en)
French (fr)
Inventor
柳田恒一郎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asahi Kasei Medical Co Ltd
Original Assignee
Asahi Kasei Medical Co Ltd
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Publication date
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Priority to JP2010512924A priority patent/JP5403827B2/ja
Priority to CN2009801186626A priority patent/CN102036740A/zh
Priority to US12/993,512 priority patent/US9272245B2/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • B01D2325/00—Details relating to properties of membranes
    • B01D2325/36—Hydrophilic membranes

Definitions

  • the present invention relates to a method for filtering an intermediate product of a protein preparation in a virus removal step in the production process of a protein preparation, and a virus removal filter used in this method.
  • protein drugs such as antibody drugs, recombinant protein drugs, plasma products, and plasma fractionated products may be contaminated with virus from raw materials and processes, viruses are inactivated in the process of manufacturing these protein products. Or need to be removed.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 a membrane made of a natural material such as cellulose or a virus removal membrane made of a synthetic polymer material such as polyvinylidene fluoride (PVDF) or polyethersulfone (PES) is known.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • PES polyethersulfone
  • the filtration of the intermediate product of the protein preparation by the virus removal apparatus loaded with these virus removal membranes should be able to filter a larger amount of protein in a short time and remove the virus with sufficiently high virus removal performance.
  • a cellulose membrane does not cause clogging of the membrane even at a protein concentration of 20 mg / ml or more and can be filtered.
  • the pressure resistance is low and the actual use pressure can only be increased to about 100 kPa, or a synthetic polymer.
  • the membrane has high pressure resistance, and there is no problem even if the actual working pressure is increased to about 300 kPa.
  • Patent Document 1 When the protein concentration is increased to about 20 mg / ml, there is a problem that the membrane is clogged and cannot be filtered. It was. For this reason, it was common to perform filtration at a low concentration of 10 mg / ml or less (Patent Document 1).
  • an object of the present invention is to provide a filtration method for a virus removal step in a protein preparation production process under conditions where a protein preparation intermediate product having a high protein concentration is passed through a virus removal filter at a high pressure. And to provide a virus removal filter used in this method.
  • the present inventors have a container having at least one inlet and an outlet for the intermediate product of the protein preparation and a virus removal membrane for removing viruses,
  • the inner space of the container is divided into an inlet side space and an outlet side space of the protein preparation intermediate product by a virus removal membrane, and at least one of the inlet and outlet of the protein preparation intermediate product has a fitting structure having a pressure resistance of 600 kPa or more.
  • a nozzle, using a virus removal filter effective membrane area is 0.0001 m 2 or more 0.03 m 2 or less of the virus removal membrane, in the virus removal filter, the protein concentration of 20 mg / ml or higher 100 mg / ml or less purification steps
  • the intermediate protein product with a high protein formulation has an inlet pressure of 150 kPa to 600 kPa for the average protein filtration.
  • Degree is at 1.0kg / m 2 / Hr or more conditions, flow than 5 hours or more 1 hour as the filtration time, by using a filtration method to obtain a filtrate protein preparation intermediate product of a virus removal rate LRV ⁇ 3, industrial It is possible to determine the protein concentration of the protein product intermediate product when scaled up to scale, the inlet pressure of the virus removal filter, and / or the operating conditions of the filtration time, and that it is useful for designing the equipment for the virus removal process.
  • the headline and the present invention were obtained.
  • the present invention includes the following.
  • [1] In a filtration method in which a protein preparation intermediate product is passed through a virus removal filter at a predetermined protein concentration and pressure, (1) A container having at least one inlet and an outlet for an intermediate product of a protein preparation and a virus removal membrane for removing viruses, and the inner space of the container is separated from the inlet side space of the intermediate product of the protein preparation by the virus removal film. It is partitioned into an outlet side space, and at least one of the inlet and outlet of the protein preparation intermediate product has a fitting structure with a pressure resistance of 600 kPa or more, and the effective membrane area of the virus removal membrane is 0.0001 m 2 or more.
  • a virus removal filter that is 0.03 m 2 or less
  • a protein preparation intermediate product whose protein concentration has been increased to 20 mg / ml or more and 100 mg / ml or less by the purification process is applied to the virus removal filter, the inlet pressure of the protein preparation intermediate product is 150 kPa or more and 600 kPa or less, and the average protein filtration rate Is not less than 1.0 kg / m 2 / Hr, and the flow time is 1 hour or more and 5 hours or less
  • the virus is a virus selected from any of Parvoviridae, Retroviridae, Flaviviridae, Reoviridae, Paramyxoviridae, Herpesviridae, Picornaviridae, and Papovaviridae [1] ] Or the filtration method according to [2].
  • the filtration method according to [4], wherein the immunoglobulin is immunoglobulin G.
  • [7] The filtration method according to any one of [1] to [6], wherein the virus removal membrane is a hollow fiber virus removal membrane.
  • [8] A method in which the protein concentration and the inlet pressure condition of the filtration method according to any one of [1] to [7] are employed as operating conditions when scaled up.
  • a virus removal membrane, and the inner space of the container is partitioned by the virus removal membrane into an inlet side space and an outlet side space of the protein preparation intermediate product, and at least the inlet of the protein preparation intermediate product has an inlet of 600 kPa or more.
  • a nozzle fitting structure having a pressure resistance, virus removal filters effective membrane area of the virus removal membrane is 0.0001 m 2 or more 0.03 m 2 or less.
  • the virus removal membrane is a microporous membrane containing a thermoplastic resin having a coarse structure layer having a high porosity and a dense structure layer having a low porosity, wherein the coarse structure layer is at least one of the membranes.
  • a multilayer microscopic structure in which the thickness is 5.0 ⁇ m or more on the surface, the thickness of the dense structure layer is 50% or more of the entire film thickness, and the coarse structure layer and the dense structure layer are integrated.
  • the filtration method of the present invention it is possible to determine the operating conditions of the virus removal process in the protein preparation manufacturing process under the condition that the intermediate protein product with a high protein concentration is passed through the virus removal filter at a high pressure. .
  • the scale-up only needs to increase the membrane area of the virus removal filter in proportion to the volume increase rate of the intermediate protein product.
  • it is also used to improve the virus removal process in the protein preparation manufacturing process, and therefore used to design a virus removal process that can manufacture a larger amount of protein preparation in a shorter time. Can do.
  • the important items are the average protein filtration rate of the intermediate protein preparation and the virus removal rate.
  • the filtration rate has a negative correlation with the protein concentration. If the protein concentration is increased, the filtration rate is lowered. It is not preferable to add a dilution step to lower the protein concentration because it is expensive in terms of equipment.
  • the pressure resistance of the virus removal filter itself is 600 kPa or more, but a container having at least one inlet and an outlet and a virus.
  • a virus removal membrane for removing the virus and the space inside the container is partitioned by the virus removal membrane into an inlet side space and an outlet side space of the protein preparation intermediate product, and the inlet structure has a pressure resistance of 600 kPa or more. What is necessary is just to filter using the virus removal filter which is a nozzle with a fitting structure.
  • Examples of the nozzle having a fitting structure having a pressure resistance of 600 kPa or more include, for example, a luer lock type nozzle, a one-touch connection nozzle (for example, inch size one-touch mini manufactured by SMC, inch size one-touch fitting, one-touch mini (above Etc.), coupler type nozzles, ferrule connection type nozzles, etc., and these can be used.
  • the nozzle can be applied to the present invention as long as it has a fitting structure with a pressure resistance of 600 kPa or more that can feed the filtrate without liquid leakage.
  • the effective membrane area of the virus removal membrane is required to be 0.0001 m 2 or more 0.03 m 2 or less. If it is larger than 0.03 m 2 , the amount of the protein preparation intermediate product necessary for filtration becomes large, resulting in a problem of high evaluation cost. On the other hand, when the effective membrane area is less than 0.0001 m 2, the amount of filtration is reduced, and the volume of the intermediate product of the protein preparation for evaluating the virus removal performance is too small, which makes it difficult to determine the virus. Accordingly, it is appropriate 0.0001 m 2 or more 0.03 m 2 or less. Preferably 0.0003 m 2 or more 0.02 m 2 or less, more preferably 0.0005 m 2 or more 0.01 m 2 or less, and most preferably 0.0007M 2 or more 0.002 m 2 or less.
  • the effective membrane area of the virus removal membrane refers to the area of the surface area of the virus removal membrane through which the intermediate product of the protein preparation can pass.
  • the virus removal membrane when filtering from the inside to the outside of the hollow fiber, it means the area of the inner surface of the hollow fiber where the intermediate product of protein preparation can pass, and from the outside to the inside of the hollow fiber In the case of filtration, it means the area of the portion through which the protein preparation can pass out of the surface area outside the hollow fiber.
  • the virus removal membrane is a flat membrane, it refers to the area of the surface where the protein preparation intermediate product can pass among the surface area of the surface into which the protein preparation intermediate product is poured.
  • the effective membrane area of the virus removal membrane can be adjusted easily by increasing / decreasing the number of hollow fibers in a hollow fiber filter, and there is no significant disturbance factor at the time of scaling up / down.
  • the feature is that it is easy to obtain scalability. That is, in the case of a hollow fiber filter, it may be considered that the filtration performance is maintained only by changing the filtration volume when the membrane area is changed.
  • the effect of changing the membrane area is the effect of increasing or decreasing the filtrate. As described above, if the amount is too small, the virus quantification is adversely affected. If the amount is too large, the convenience and cost of operation are affected.
  • the membrane may have a flat membrane structure or a hollow fiber structure, but preferably has a hollow fiber structure.
  • the material of the film one having a pressure resistance of 600 kPa or more can be used.
  • a membrane made of a synthetic polymer such as polyvinylidene fluoride (PVDF), polyethersulfone (PES), or polysulfone (PS) and having hydrophilicity is preferable. The important point is that it has a pressure resistance of 600 kPa or more.
  • a hydrophilic vinyl monomer having one vinyl group is grafted onto the pore surface of a microporous membrane at a graft ratio of 3% to 50%.
  • a polymerization method (WO 2004/035180 pamphlet), a method of bonding a polymer formed from a polyfunctional acrylate or methacrylate via a crosslinking agent (JP 2000-1548 A), and a polymerization initiator
  • JP 2000-1548 A a method of bonding a polymer formed from a polyfunctional acrylate or methacrylate via a crosslinking agent
  • JP 2000-1548 A crosslinking agent
  • Many methods are known, such as a method of impregnating a membrane with a solution containing a hydrophilic monomer and polymerizing in a pore (WO 91/16968 pamphlet).
  • the purpose of imparting hydrophilicity is to improve the filterability of an intermediate product of a protein preparation of a membrane made of a hydrophobic synthetic polymer. Therefore, the method for imparting hydrophilicity is not limited to that exemplified here.
  • the membrane structure has a coarse structure layer with a large pore size on the upstream side and a high porosity according to the flow direction of the intermediate product of the protein preparation, and a dense structure layer suitable for removing viruses with a small pore size on the downstream side. It is preferable that the coarse structure layer and the dense structure layer have a gradient structure in which the pore diameter is continuously changed.
  • a more preferable membrane structure is a microporous membrane containing a thermoplastic resin having a coarse structure layer having a high porosity and a dense structure layer having a low porosity, wherein the coarse structure layer is at least one of the membranes.
  • a multilayer microscopic structure in which the thickness is 5.0 ⁇ m or more on the surface, the thickness of the dense structure layer is 50% or more of the entire film thickness, and the coarse structure layer and the dense structure layer are integrated. What is a porous film is preferable. Furthermore, it is preferable that the coarse structure layer has an inclined structure in which the partial pore ratio continuously decreases from the film surface toward the dense structure layer and exists only on one film surface.
  • This film can be produced by the methods disclosed in, for example, JP-A-11-319522, JP-A-9-169867, and WO 2004/035180.
  • the virus used for the evaluation can be arbitrarily selected from related viruses, specific model viruses, and non-specific model viruses that may be mixed into protein preparations.
  • the definitions of related viruses, specific model viruses, and non-specific model viruses mentioned here are the same as those described in the Japan-US EU Pharmaceutical Regulation Harmonization International Conference (ICH) guidelines.
  • related viruses are known to be mixed in cell substrates, other reagents and various substances used in the production process of protein preparations, or the same or the same type of viruses that may exist.
  • a specific model virus is a virus that is closely related to a known or suspected virus. That is, they are defined as those of the same genus or family that have similar physical and chemical properties as the virus detected or suspected to exist.
  • Non-specific model viruses have robustness in terms of analyzing the general ability of the manufacturing process in terms of virus removal and inactivation, ie, ensuring that the process exhibits virus clearance capacity. It is defined as a virus used in a virus clearance process characterization test performed for the purpose of analysis.
  • a preparation is produced from a mouse-derived substrate such as a monoclonal antibody, as a related virus or a specific model virus, a retrovirus such as a mouse leukemia virus, a parvovirus such as a mouse minimal virus, or a flavivirus such as bovine diarrhea virus Can be used.
  • a parvovirus such as a porcine parvovirus can also be used as a minimally sized virus model.
  • human parvovirus B19 parvovirus B19
  • HIV virus Reetroviridae
  • porcine parvovirus Parvoviridae
  • bovine diarrhea virus Fraviviridae
  • herpesviridae such as herpes simplex virus and pseudorabies virus
  • paramyxoviridae such as parainfluenza virus
  • reoviridae such as reovirus type 3
  • picornaviridae such as poliovirus
  • papovaviridae such as SV40 virus.
  • the selection of the virus to be used should be determined based on known requirements such as ICH.
  • viruses used for evaluation are added to the intermediate product of the protein preparation, and the amount of virus before and after filtration by the virus removal filter is measured to measure the virus removal performance evaluation.
  • the amount of virus added at this time can be obtained by calculating backward from the required virus removal rate.
  • the amount of virus added depends on the purity of the virus solution because it may clog the filter due to impurities (impurities) mixed in the virus solution and may cause harmful effects on the filtration test. It is desirable to adjust.
  • the virus solution may be added in an amount of 10% or less, preferably up to 5% or less, more preferably 1% or less of the volume of the intermediate product of the protein preparation.
  • the virus preparation method may contain a large amount of contaminants and may greatly damage the filtration rate.
  • the virus may be purified and separated before use.
  • a virus purification method a method using ultracentrifugation is already known.
  • the removal rate of viruses larger than the pore size of the virus removal filter is usually LRV ⁇ 3, while the removal rate of viruses smaller than the pore size of the virus removal filter is usually LRV ⁇ 3 (Tatsuhiro Koizumi et al. II. Monoclonal antibody purified dry concentrated human blood coagulation factor VIII preparation (Crossate M (registered trademark)) and intramuscular human immunoglobulin preparation (anti-HBs human immunoglobulin "Nichika” (registered trademark) , Human Immunoglobulin “Nichika (Registered Trademark)” in the manufacturing process of the virus removal membrane in Japanese Journal Transfusion Medicine, (1999), Vol.45.
  • an intermediate product of a protein preparation used in the filtration method of the present invention an intermediate product of an antibody pharmaceutical, an intermediate product of a recombinant protein pharmaceutical, an intermediate product of a plasma preparation, an intermediate product of a plasma fractionation preparation, etc. can be applied. Products are preferred. More preferred is an intermediate product of an immunoglobulin G preparation, and most preferred is an intermediate product of an immunoglobulin G monoclonal antibody preparation.
  • These protein preparation intermediate products are first filtered through a virus removal filter device without adding virus, thereby evaluating the average protein filtration rate of the protein preparation intermediate products.
  • a virus removal filter device By filtering at a high concentration of 20 mg / ml or more and 100 mg / ml or less of the protein concentration, and at a high pressure of 150 kPa or more and 600 kPa or less of the intermediate product of the protein preparation, the average protein filtration rate ( kg / m 2 / Hr).
  • a predetermined amount of virus is added to the intermediate product of the protein preparation within the range of the protein concentration and pressure.
  • the virus removal performance of the virus removal step is evaluated by filtering with a virus removal filter.
  • the production amount of one batch in the production process of the protein preparation tends to increase the total weight.
  • the total amount (total weight) of one batch of protein preparation for example, in the case of antibody pharmaceutical preparations, research on improving productivity has progressed, and there is an example in which one batch shows a high production capacity of 50 kg or more.
  • the average protein filtration rate of the virus removal filter should be 1.0 kg / m 2 / Hr or more. If it is 1.0 kg / m 2 / Hr or more, 50 kg of protein intermediate product can be filtered within 12.5 hours with one 4 m 2 filter and within 6.25 hours with two. is there.
  • a predetermined amount of virus is added to the intermediate product of the protein preparation within the range of the protein concentration and pressure.
  • the virus removal performance of the virus removal step is evaluated by filtering with a virus removal filter. That is, the protein concentration condition and the inlet pressure condition of the protein preparation intermediate product satisfying the virus removal rate LRV ⁇ 3 are selected.
  • the protein concentration is filtered at a high concentration of 20 mg / ml or more and 100 mg / ml or less and the inlet pressure of the intermediate product of the protein preparation is filtered at a high pressure of 150 kPa or more and 600 kPa or less, the average of 1.0 kg / m 2 / Hr or more is similarly applied.
  • the average protein filtration rate implemented without adding a virus solution is abbreviate
  • the protein concentration is 20 mg / ml to 100 mg / ml, preferably 25 mg / ml to 100 mg / ml, more preferably 30 mg / ml to 100 mg / ml, most preferably 30 mg / ml to 50 mg / ml. Less than ml.
  • the inlet pressure at the time of filtration has the merit that high pressure can be filtered quickly in a short time, but if the pressure is too high, the risk of damage and leakage due to pressure on the device increases, so the inlet pressure is It is carried out at 150 kPa or more and 600 kPa or less.
  • the pressure is preferably 196 kPa to 500 kPa, more preferably 245 kPa to 400 kPa, further preferably 294 kPa to 400 kPa, and most preferably 294 to 300 kPa. It is preferable to evaluate the protein concentration and the inlet pressure by moving within several ranges so that the average protein filtration rate is 1.0 kg / m 2 / Hr or more and the LRV satisfies LRV ⁇ 3 simultaneously.
  • the filtration time for passing the protein product intermediate product through the virus removal filter is 1 hour or more and 5 hours or less, but the virus removal process in the protein preparation manufacturing process when the scale-up is performed, the membrane area of the virus removal filter is If it is desired to complete it in a short time even if it is large, it can be set to a long time if it is desired to reduce the effective membrane area of the virus removal membrane in a short time. Further, in order to determine a condition that satisfies LRV ⁇ 3 even after 3 hours from the start of filtration, it is also preferable that the protein preparation intermediate product is allowed to flow through the virus removal filter for 3 hours to 5 hours.
  • Example 1 As a virus removal filter, a microporous hollow fiber membrane made of polyvinylidene fluoride having a pressure resistance of 600 kPa or more is used as a hydrophilic vinyl monomer (in accordance with the method shown in Example 1 of WO 2004/035180 pamphlet). Hydrophilic microporous hollow fiber membrane grafted with hydroxypropyl acrylate) so as to have a graft ratio of 10%, and a coarse structure layer having a large porosity is present on the inner surface of the hollow fiber membrane, and its thickness is 7.
  • a filter having an effective membrane area of 0.001 m 2 a multilayer microporous hollow fiber membrane in which the thickness of the dense structure layer integrated with this is 80% of the total film thickness and the porosity is small. It has a luer lock type nozzle with pressure resistance of 600 kPa or more, and the inner space of the container is divided into an inlet side space and an outlet side space by a hollow fiber membrane.
  • the virus removal filters are used.
  • human immunoglobulin G solution 0.1M saline solution is used as a solvent
  • a concentration of 30mg / ml a concentration of 30mg / ml
  • porcine parvovirus (PPV) solution is added to this solution.
  • prefiltration was performed with a hollow fiber filter having a pore diameter of 35 nm (PLANOVA (registered trademark) 35N, manufactured by Asahi Kasei Medical Corporation).
  • the immunoglobulin concentration after prefiltration was 30 mg / ml, and the PPV concentration was 6.1 (TCID 50 / ml).
  • This 30 mg / ml human immunoglobulin G solution containing PPV was subjected to dead-end filtration for 5 hours at a pressure of 294 kPa using the above filtration device.
  • the average protein filtration rate was 1.9, 1.9, and 1.8 kg / m 2 / Hr, 3 hours, 4 hours, and 5 hours after the start of filtration, respectively.
  • the virus removal rate could be evaluated with a high-speed filtrate of 1.0 (kg / m 2 / Hr) or more.
  • the virus removal rate was LRV ⁇ 5.6 for both the filtrate up to 1 hour after the start of filtration, the filtrate up to 3 hours, and the filtrate up to 5 hours.
  • the conditions were such that the protein concentration of the intermediate product of the protein preparation was 30 mg / ml, the virus removal filter inlet pressure was 294 kPa, and the filtration time was within 5 hours.
  • a microporous hollow fiber membrane made of polyvinylidene fluoride having a pressure resistance of 600 kPa or more is used as a hydrophilic vinyl polymer (in accordance with the method shown in Example 1 of WO 2004/035180 pamphlet).
  • a filter having an effective membrane area of 0.001 m 2 a multilayer microporous hollow fiber membrane in which the thickness of the dense structure layer integrated with this is 80% of the total film thickness and the porosity is small. It has a luer lock type nozzle with pressure resistance of 600 kPa or more, and the inner space of the container is divided into an inlet side space and an outlet side space by a hollow fiber membrane.
  • the virus removal filters are used.
  • As a model of protein product intermediate product human immunoglobulin G solution with a concentration of 30 mg / ml (0.1 M saline solution is used as a solvent) was used. Three types of solutions were prepared by addition.
  • Virus solution 1 Murine leukemia virus (A-MuLV) (Example 2 virus concentration 5.0) Virus solution 2) Reovirus type 3 (Reo-3) (Example 3 Virus concentration 5.6) Virus solution 3) Mouse minimal virus (MVM) (Example 4 virus concentration 5.7)
  • A-MuLV Murine leukemia virus
  • Reo-3 Reovirus type 3
  • VMM Mouse minimal virus
  • the filtration rates up to 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours and 5 hours after the start of filtration were 2.2, 2.0 and 1.9, respectively. 1.7 and 1.6 kg / m 2 / Hr.
  • the virus removal rate could be evaluated with a high-speed filtrate of 1.0 (kg / m 2 / Hr) or more.
  • the virus removal rate was LRV ⁇ 4.5 for both the filtrate up to 1 hour after the start of filtration, the filtrate up to 3 hours, and the filtrate up to 5 hours.
  • the conditions were such that the protein concentration of the intermediate product of the protein preparation was 30 mg / ml, the virus removal filter inlet pressure was 294 kPa, and the filtration time was within 5 hours.
  • the filtration rates up to 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours and 5 hours after the start of filtration were 2.5, 2.3, 2.1, 2. 0 and 1.8 kg / m 2 / Hr.
  • the virus removal rate could be evaluated with a high-speed filtrate of 1.0 (kg / m 2 / Hr) or more.
  • the virus removal rate was LRV ⁇ 5.1 for both the filtrate up to 1 hour after the start of filtration, the filtrate up to 3 hours, and the filtrate up to 5 hours.
  • the conditions were such that the protein concentration of the intermediate product of the protein preparation was 30 mg / ml, the virus removal filter inlet pressure was 294 kPa, and the filtration time was within 5 hours.
  • the filtration rate up to 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours and 5 hours after the start of filtration was 2.4, 2.3, 2.1, 2.0, It became 2.0 kg / m 2 / Hr.
  • the virus removal rate could be evaluated with a high-speed filtrate of 1.0 (kg / m 2 / Hr) or more.
  • the virus removal rate was LRV ⁇ 5.2 for the filtrate for up to 1 hour after the start of filtration, the filtrate for up to 3 hours, and the filtrate for up to 5 hours.
  • the conditions were such that the protein concentration of the intermediate product of the protein preparation was 30 mg / ml, the virus removal filter inlet pressure was 294 kPa, and the filtration time was within 5 hours.
  • a virus removal filter As a virus removal filter, a hollow fiber membrane made of cellulose having a pressure resistance of 100 kPa and containing no thermoplastic resin is used, and a bamboo shoot type nozzle having no pressure resistance of 600 kPa or more is used at the inlet and outlet of the hollow fiber membrane. And a filtration device (Planova (registered trademark) 20N, manufactured by Asahi Kasei Medical Co., Ltd.), which is a hollow fiber membrane having an effective membrane area of 0.001 m 2 and whose inner space is partitioned into an inlet side space and an outlet side space.
  • Plantova registered trademark 20N, manufactured by Asahi Kasei Medical Co., Ltd.
  • human immunoglobulin G solution 0.1M saline solution is used as a solvent
  • a concentration of 30mg / ml 0.5% by volume of porcine parvovirus (PPV) solution is added to this solution.
  • PPV porcine parvovirus
  • prefiltration was performed with a hollow fiber filter (Planova (registered trademark) 35N) having a pore diameter of 35 nm.
  • the immunoglobulin concentration after prefiltration was 30 mg / ml, and the PPV concentration was 5.9.
  • This 30 mg / ml human immunoglobulin G solution (including PPV) was subjected to dead-end filtration for 5 hours at a pressure of 98 kPa, which is an upper limit pressure applied to the cellulose membrane, using the virus removal filter. .
  • the virus removal rate was LRV ⁇ 5.4 for both the filtrate up to 1 hour after the start of filtration and the filtrate up to 5 hours.
  • human immunoglobulin G solution (0.1M saline solution is used as a solvent) with a concentration of 30mg / ml, and 0.5% by volume of porcine parvovirus (PPV) solution is added to this solution.
  • PPV porcine parvovirus
  • prefiltration was performed with a hollow fiber filter (Planova (registered trademark) 35N) having a pore diameter of 35 nm.
  • the immunoglobulin concentration after prefiltration was 30 mg / ml, and the PPV concentration was 5.2.
  • This 30 mg / ml human immunoglobulin G solution (containing PPV) was subjected to dead-end filtration at a pressure of 294 kPa for 5 hours using the virus removal filter.
  • the filtrate for 1 hour after the start of filtration had a slow filtration rate, so the filtration volume was too small to measure the virus concentration.
  • the virus removal rate of the filtrate up to 3 hours after the start of filtration was LRV ⁇ 4.0.
  • the amount of filtration in 0.09 kg / m 2 after the start of filtration 3 hours, filtration rate of the average 1 hour was less than 0.03kg / m 2 / Hr next, 1.0kg / m 2 / Hr .
  • a microporous hollow fiber membrane made of polyvinylidene fluoride having a pressure resistance of 600 kPa or more and a hydrophilic vinyl polymer (hydroxy) according to the method shown in Example 1 of WO 2004/035180 pamphlet.
  • This is a filter having an effective membrane area of 0.001 m 2 with a microporous hollow fiber membrane consisting only of a coarse structure layer grafted with propyl acrylate to a graft ratio of 10% and having a pressure resistance of 600 kPa or more at the filter inlet.
  • a virus removal filter having a type nozzle and having a hollow fiber membrane partitioning the inner space of the container into an inlet side space and an outlet side space was used.
  • human immunoglobulin G solution 0.1M saline solution is used as a solvent
  • porcine parvovirus (PPV) solution is added to this solution.
  • the concentration of PPV was 6.0.
  • This 30 mg / ml human immunoglobulin G solution (containing PPV) was subjected to dead-end filtration at a pressure of 294 kPa for 5 hours using the virus removal filter.
  • the average protein filtration rate was 2.3, 2.2, and 2.0 kg / m 2 / Hr at 1 hour, 3 hours, and 5 hours after the start of filtration, respectively.
  • the filtration method of the present invention is useful for setting up actual operating conditions and designing facilities in a virus removal process during the production process of protein preparations such as antibody drugs, recombinant protein drugs, plasma preparations, and plasma fractionation preparations. It is very useful for the protein pharmaceutical manufacturing industry because it can collect such information on a very small scale.

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Abstract

【課題】高い蛋白質濃度の蛋白製剤中間製品を高い圧力でウイルス除去フィルターに流す条件下での、蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程の濾過方法を提供する。 【解決手段】少なくとも入口は６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造のノズルを有し、ウイルス除去膜の有効膜面積が０．０００１ｍ２以上０．０３ｍ２以下であるウイルス除去フィルターを用い、該ウイルス除去フィルターに、精製工程により蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下に高められた蛋白製剤中間製品を、蛋白製剤中間製品の入口圧力が１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下、平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上の条件で、濾過時間として１時間以上５時間以下流し、ウイルス除去率ＬＲＶ≧３の蛋白製剤中間製品の濾液を得る濾過方法。

Description

濾過方法
　本発明は、蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程における蛋白製剤中間製品の濾過方法及びこの方法に用いられるウイルス除去フィルターに関する。
　抗体医薬、組換え蛋白医薬、血漿製剤、血漿分画製剤、等の蛋白製剤には原料由来、工程由来のウイルスの混入が懸念されるため、これらの蛋白製剤を製造する過程でウイルスを不活化、あるいは除去する必要がある。
　蛋白製剤に混入するおそれのあるウイルスの不活化方法としては、加熱処理や化学薬品による処理などが行なわれているが、それら単独の処理だけではウイルスの不活化は充分でなく、またこれらの方法では蛋白製剤中の有用蛋白質そのものも変性するおそれがある。このような背景から、化学的な変性を伴わない物理的なウイルス除去手段として、濾過膜によるウイルスの分離除去が実施されている。
　ウイルス除去用の濾過膜としては、セルロースのような天然素材よりなる膜、あるいはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）のような合成高分子素材よりなるウイルス除去膜が知られている（非特許文献１～４）。
　これらのウイルス除去膜を装填したウイルス除去装置による蛋白製剤中間製品の濾過は、短時間でより多くの量の蛋白質を濾過でき、かつ充分に高いウイルス除去性能をもってウイルスを除去できることが理想である。しかし実際には、例えばセルロース膜では２０ｍｇ／ｍｌ以上の蛋白質濃度でも膜の目詰まりを起こし難く、濾過できるが、耐圧性が低く、実使用圧力を１００ｋＰａ程度までしか上げられない、あるいは合成高分子膜では、耐圧性は高く、実使用圧力を３００ｋＰａ程度まで上げても問題ないが、蛋白質濃度を２０ｍｇ／ｍｌ程度に上げると膜が目詰まりを起こし、濾過できなくなってしまうというような問題があった。そのため、１０ｍｇ／ｍｌ以下の低濃度での濾過が行なわれるのが普通だった（特許文献１）。
　これらの理由から、各種クロマトグラフィーや限外濾過などの精製工程により高められた、高い蛋白質濃度の蛋白製剤中間製品を高圧でウイルス除去装置に流す濾過条件での、濾過方法の研究は進んでおらず、またこの方法に適するウイルス除去フィルターの開発も進んでいなかった。
　また蛋白製剤中間製品は、蛋白製剤を製造するための貴重な材料であるため、製造スケールでウイルス除去工程の濾過方法、運転条件を決定することは、時間的にも経済的にも困難を伴うため、本発明者は、予め小スケールでウイルス除去工程の濾過方法、蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度、ウイルス除去フィルターの入口圧力、及び／または濾過時間の運転条件を決定しておき、これをスケールアップした蛋白製剤の製造工程に適用することの重要性を強く認識した。
特開２００４－２７７３２３号公報 Manabe.S、Removal of virus through novel membrane filtration method.、Dev. Biol. Stand.、(1996)88: 81-90. Brandwein Hら.、Membrane filtration for virus removal.、Dev Biol (Basel).、(2000)102: 157-63. Aranha-Creadoら、Clearance of murine leukaemia virus from monoclonal antibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membrane filter.、Biologicals. (1998) Jun;26(2):167-72. L. Moce-Llivinaら、Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions、Journal of Virological Methods 、(2003) April、 Vol.109, Issue 1,Pages 99-101.
　上記問題点に鑑み本発明の課題は、高い蛋白質濃度の蛋白製剤中間製品を高い圧力でウイルス除去フィルターに流す条件下での、蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程の濾過方法を提供することであり、またこの方法に用いられるウイルス除去フィルターを提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、蛋白製剤中間製品の入口と出口を夫々少なくとも一つ有する容器とウイルスを除去するためのウイルス除去膜とを有し、容器内空間がウイルス除去膜によって蛋白製剤中間製品の入口側空間と出口側空間に仕切られており、蛋白製剤中間製品の入口、出口のうち少なくとも入口は６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造のノズルであり、ウイルス除去膜の有効膜面積が０．０００１ｍ２以上０．０３ｍ２以下であるウイルス除去フィルターを用い、該ウイルス除去フィルターに、精製工程により蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下に高められた蛋白製剤中間製品を、蛋白製剤中間製品の入口圧力が１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下、平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上の条件で、濾過時間として１時間以上５時間以下流し、ウイルス除去率ＬＲＶ≧３の蛋白製剤中間製品の濾液を得る濾過方法を用いることにより、工業的スケールにスケールアップした時の蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度、ウイルス除去フィルターの入口圧力、及び／または濾過時間の運転条件を決定することができ、ウイルス除去工程の設備設計にも有用であることを見出し、本発明を得るに至った。
　即ち本発明は以下を含む。
［１］ウイルス除去フィルターに蛋白製剤中間製品を所定の蛋白質濃度および圧力で流す濾過方法において、
（１）蛋白製剤中間製品の入口と出口を夫々少なくとも一つ有する容器とウイルスを除去するためのウイルス除去膜とを有し、容器内空間がウイルス除去膜によって蛋白製剤中間製品の入口側空間と出口側空間に仕切られており、蛋白製剤中間製品の入口、出口のうち少なくとも入口は６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造のノズルであり、ウイルス除去膜の有効膜面積が０．０００１ｍ２以上０．０３ｍ２以下であるウイルス除去フィルターを用い、
（２）該ウイルス除去フィルターに、精製工程により蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下に高められた蛋白製剤中間製品を、蛋白製剤中間製品の入口圧力が１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下、平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上の条件で、濾過時間として１時間以上５時間以下流し、
（３）ウイルス除去率ＬＲＶ≧３の蛋白製剤中間製品の濾液を得る
濾過方法。
［２］［１］に記載のウイルス除去フィルターに、
（４）精製工程により蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下に高められた蛋白製剤中間製品を、蛋白製剤中間製品の入口圧力が１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下、平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上の条件で、濾過時間として３時間以上５時間以下流し、
（５）ウイルス除去率ＬＲＶ≧３の蛋白製剤中間製品の濾液を得る
　［１］に記載の濾過方法。
［３］ウイルスが、パルボウイルス科、レトロウイルス科、フラビウイルス科、レオウイルス科、パラミクソウイルス科、ヘルペスウイルス科、ピコルナウイルス科、パポーバウイルス科のいずれかより選択されるウイルスである［１］または［２］に記載の濾過方法。
［４］蛋白製剤中間製品中の蛋白質が、免疫グロブリンである［１］乃至［３］のいずれかに記載の濾過方法。
［５］免疫グロブリンが、免疫グロブリンＧである［４］に記載の濾過方法。
［６］ウイルス除去膜が、親水化された合成高分子よりなる［１］乃至［５］のいずれかに記載の濾過方法。
［７］ウイルス除去膜が、中空糸型ウイルス除去膜である［１］乃至［６］のいずれかに記載の濾過方法。
［８］［１］乃至［７］のいずれかに記載の濾過方法の蛋白質濃度および入口圧力条件を、スケールアップしたときの運転条件として採用する方法。
［９］更に、［１］乃至［７］のいずれかに記載の濾過方法の濾過時間を、スケールアップしたときの運転条件として採用する［８］に記載の方法。
［１０］［１］乃至［７］のいずれかに記載の濾過方法に用いられるウイルス除去フィルターであって、蛋白製剤中間製品の入口と出口を夫々少なくとも一つ有する容器とウイルスを除去するためのウイルス除去膜とを有し、容器内空間がウイルス除去膜によって蛋白製剤中間製品の入口側空間と出口側空間に仕切られており、蛋白製剤中間製品の入口、出口のうち少なくとも入口は６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造のノズルであり、ウイルス除去膜の有効膜面積が０．０００１ｍ２以上０．０３ｍ２以下であるウイルス除去フィルター。
［１１］ウイルス除去膜が、中空糸型ウイルス除去膜である［１０］に記載のウイルス除去フィルター。
［１２］ウイルス除去膜が、開孔率が大きい粗大構造層と、開孔率が小さい緻密構造層を有する、熱可塑性樹脂を含む微多孔膜であって、該粗大構造層が少なくとも一方の膜表面に存在し、その厚みが５．０μｍ以上であり、該緻密構造層の厚みが膜厚全体の５０％以上であって、かつ該粗大構造層と該緻密構造層が一体化している多層微多孔膜である［１０］または［１１］に記載のウイルス除去フィルター。
　本発明の濾過方法を用いることにより、高い蛋白質濃度の蛋白製剤中間製品を高い圧力でウイルス除去フィルターに流す条件下での、蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程の運転条件を決定することができる。即ち予め小スケールでウイルス除去工程の濾過方法、蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度、ウイルス除去フィルターの入口圧力、及び／または濾過時間の運転条件を決定しておき、これをスケールアップした蛋白製剤の製造工程に適用することができる。スケールアップは、蛋白製剤中間製品の体積増加割合に比例して、ウイルス除去フィルターの膜面積を増加させるだけで良い。
　また付随する効果として、蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程をより改善するためにも用いられ、もって、より短時間に、より大量の蛋白製剤を製造できるウイルス除去工程を設計するために用いることができる。
　蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程の運転条件を決定するにあたって、重要な項目は、蛋白製剤中間製品の平均蛋白濾過速度と、ウイルス除去率である。濾過速度は一般に蛋白質濃度と負の相関があり、蛋白質濃度が高くなると濾過速度が低下するため、濾過時間が長くかかってしまい好ましくない。蛋白質濃度を下げるために希釈工程を付加することは、設備面でもコストがかかることになり好ましくない。蛋白質濃度が高濃度のままで、濾過速度を低下させずに濾過するには、ウイルス除去フィルター自体の耐圧が６００ｋＰａ以上あることが前提であるが、入口と出口を夫々少なくとも一つ有する容器とウイルスを除去するためのウイルス除去膜とを有し、容器内空間がウイルス除去膜によって蛋白製剤中間製品の入口側空間と出口側空間に仕切られており、入口の構造が６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造を持つノズルであるウイルス除去フィルターを用いて濾過すればよい。
　ここで言う６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造を持つノズルには、例えばルアーロック式ノズルや、ワンタッチ接続ノズル(例えばＳＭＣ社製のインチサイズワンタッチミニ、インチサイズワンタッチ管継手、ワンタッチミニ（以上登録商標）など)、カプラー式ノズル、フェルール接続式ノズルなどがあり、これらを使用できる。これら以外でも、液漏れなく濾液を送り込むことができる、６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造を持つノズルであれば、本発明に適用できることは言うまでもない。
　また、ウイルス除去膜の有効膜面積は、０．０００１ｍ２以上０．０３ｍ２以下である必要がある。０．０３ｍ２より大きいと、濾過に必要な蛋白製剤中間製品の量が大量になってしまうため、評価コストがかかる問題点が生じる。一方、有効膜面積が０．０００１ｍ２未満と小さいと濾過量が少なくなり、ウイルス除去性能を評価するための蛋白製剤中間製品の体積が少なすぎてウイルスの定量が困難になる問題点が生じる。従って、０．０００１ｍ２以上０．０３ｍ２以下が適当である。好ましくは０．０００３ｍ２以上０．０２ｍ２以下、より好ましくは０．０００５ｍ２以上０．０１ｍ２以下であり、最も好ましくは０．０００７ｍ２以上０．００２ｍ２以下である。
　なお、ウイルス除去膜の有効膜面積とは、ウイルス除去膜の表面積のうち、蛋白製剤中間製品が通過しうる部分の面積をいう。ウイルス除去膜が中空糸の場合で、中空糸の内側から外側に濾過する場合は、中空糸内側の表面積のうち、蛋白製剤中間製品が通過しうる部分の面積をいい、中空糸の外側から内側に濾過する場合は、中空糸外側の表面積のうち、蛋白製剤が通過しうる部分の面積をいう。また、ウイルス除去膜が平膜の場合は、蛋白製剤中間製品を流しこむ側の面の表面積のうち、蛋白製剤中間製品が通過しうる部分の面積をいう。
　ウイルス除去膜の有効膜面積の調整は、中空糸型フィルターでは、中空糸の本数を増減させることによって容易にスケールアップ・スケールダウン可能であり、スケールアップ・スケールダウン時の大きな外乱因子もないため、スケーラビリティを得ることが容易であるという特徴がある。すなわち、中空糸型フィルターの場合、膜面積が変わると濾過体積が変わるのみで、濾過性能は維持されると考えてよい。膜面積が変わることによる影響は、濾液が増減することによる影響である。少なすぎると、ウイルスの定量に弊害が生じ、多すぎると操作の利便性やコストに影響がでることは前述の通りである。平膜の場合も、著しいスケールアップは膜の形状を変える（円盤型から筒型へ、など）ことになるが、同様の影響しかないと考えられる。蛋白製剤製造工程におけるウイルス除去工程の工程設計が、実生産スケールではなく、小スケールで実施できるのは、このようなスケーラビリティの信頼性によるものである。
　ウイルス除去フィルターとしては、前述の構造をもつものが利用できる。膜の形状は、平膜構造や中空糸構造のものが利用できるが、好ましくは中空糸構造のものがよい。膜の材質としては、６００ｋＰａ以上の耐圧性を有するものが利用できる。例えば、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）やポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）のような合成高分子を素材として親水性を持たせた膜が好ましい。肝要な点は６００ｋＰａ以上の耐圧性を有するという点である。
　合成高分子を素材とする膜に親水性を持たせる方法には、ビニル基を１個有する親水性ビニルモノマーを微多孔膜の細孔表面に、３％以上、５０％以下のグラフト率でグラフト重合する方法（国際公開第２００４／０３５１８０号パンフレット）や、架橋剤を介して多官能価アクリレートまたはメタクリレートから形成する高分子を結合させる方法（特開２０００－１５４８号公報）、さらに重合開始剤と親水性モノマーを含む溶液を膜に含浸させ、細孔中で重合させる方法（国際公開第９１／１６９６８号パンフレット）など多くの方法が知られる。親水性を持たせる目的は、疎水性の合成高分子を素材とする膜の蛋白製剤中間製品の濾過性を向上させることにある。したがって、親水性を持たせる方法はここに例示した限りではない。
　なお、ここでいうグラフト率とは、下記式で定義される。
　グラフト率（％）＝１００×｛（グラフト後の膜質量－グラフト前の膜質量）／グラフト前の膜質量｝
　膜の構造は、蛋白製剤中間製品を流す方向に従って、上流側に孔径が大きく、空孔率が高い粗大構造層が存在し、下流側に孔径が小さくウイルスを除去するのに適した緻密構造層が存在し、粗大構造層と緻密構造層のつながりは連続的に孔径が変化しているグラジエント構造であることが好ましい。
　また更に好ましい膜の構造は、開孔率が大きい粗大構造層と、開孔率が小さい緻密構造層を有する、熱可塑性樹脂を含む微多孔膜であって、該粗大構造層が少なくとも一方の膜表面に存在し、その厚みが５．０μｍ以上であり、該緻密構造層の厚みが膜厚全体の５０％以上であって、かつ該粗大構造層と該緻密構造層が一体化している多層微多孔膜であるものが好ましい。
　さらに、前記粗大構造層は、膜表面から緻密構造層に向かって部分開孔率が連続的に減少する傾斜構造で、一方の膜表面のみに存在するものが好ましい。この膜は、例えば特開平１１－３１９５２２号公報や、特開平９－１６９８６７号公報、国際公開第２００４／０３５１８０号パンフレットに開示される方法で製造することができる。
　評価に使用するウイルスとしては、蛋白製剤に混入する恐れのある関連ウイルスや特異的モデルウイルス、非特異的モデルウイルスの中から任意に選択することができる。ここで言う関連ウイルス、特異的モデルウイルス、非特異的モデルウイルスの定義は日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）ガイドラインに記されているものと同義である。すなわち、関連ウイルスとは、蛋白製剤の製造工程で使用される細胞基材、その他の試薬類や各種物質に混在することが知られているか、あるいは存在の可能性があるウイルス類と同一または同種のウイルスと定義される。特異的モデルウイルスとは、存在が知られている、あるいは疑われているウイルスに密接に関連しているウイルス。すなわち同一の属または科のもので、検出されたウイルスまたは存在が疑われるウイルスと類似した物理的・化学的性質を有するものと定義される。非特異的モデルウイルスは、製造工程がウイルスの除去や不活化に関して一般にどの程度の能力を有するかを解析する目的、すなわち工程が確実にウイルスクリアランス能力を発揮するという面での特性（robustness）を解析する目的で行なうウイルスクリアランス工程特性解析試験に使用されるウイルスと定義される。
　例えば、製剤がモノクローナル抗体などマウス由来基材から製造される場合、関連ウイルスや特異的モデルウイルスとして、マウス白血病ウイルスなどのレトロウイルス、マウス最小ウイルスなどのパルボウイルス、牛下痢症ウイルスなどのフラビウイルスを用いることができる。非特異的モデルウイルスとして、ブタパルボウイルスなどのパルボウイルスを最小サイズのウイルスモデルとして使用することもできる。
　また、製剤が血漿分画製剤など、ヒト血漿由来基材から製造される場合は、関連ウイルスとして、ヒトパルボウイルスＢ１９（パルボウイルス科）やＨＩＶウイルス（レトロウイルス科）などを、Ｂ１９の特異的モデルウイルスとしてブタパルボウイルス（パルボウイルス科）や、Ｃ型肝炎ウイルスの特異的モデルウイルスとしての牛下痢症ウイルス（フラビウイルス科）などを用いることができる。同様に、単純ヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルスなどヘルペスウイルス科や、パラインフルエンザウイルスなどパラミクソウイルス科、レオウイルス３型などレオウイルス科、ポリオウイルスなどピコルナウイルス科、ＳＶ４０ウイルスなどパポーバウイルス科などから選択して使用すればよい。使用するウイルスの選択については、ＩＣＨなどの公知要求事項をもとに決めるべきものである。
　これらの、評価に使用するウイルスは、蛋白製剤中間製品にある一定量添加され、ウイルス除去フィルターによる濾過前後のウイルス量を測定して、ウイルス除去性能評価を測定する。このとき添加するウイルス量は、必要となるウイルス除去率から逆算して求めることができる。しかし、ウイルス溶液に混在している夾雑物（不純物）が原因でフィルターに目詰まりを起こすことがあり、濾過試験に弊害が生じる可能性があるため、添加ウイルス量は、そのウイルス溶液の純度によって調整することが望ましい。ウイルス溶液が精製されている場合は、蛋白製剤中間製品の体積に対して１０％体積以下、好ましくは５％体積以下まで、より好ましくは１％体積以下のウイルス溶液を添加してもよいが、精製されておらず夾雑物を多く含む場合は、１％体積以下、好ましくは０．５％体積以下、より好ましくは０．１％体積以下の少ない量を添加するのが望ましい。ただし、ＬＲＶ≧３が検出可能な必要最低限の量以上の体積のウイルス溶液を添加することが望ましい。
　なお、ここで言うウイルス除去率ＬＲＶは、ウイルス除去フィルターで濾過する前の溶液のウイルス量に対する、濾過したあとの溶液のウイルス量の低下率を対数値で示したものである。例えば、下記式で計算することができる。
　ＬＲＶ＝ｌｏｇ１０Ａ－ｌｏｇ１０Ｂ
　ただし　Ａ　＝　ウイルス除去フィルターで濾過する前の溶液のウイルス濃度
　　　　　Ｂ　＝　ウイルス除去フィルターで濾過した後の溶液のウイルス濃度
　また、ウイルスの調製法によっては、大量の夾雑物を含有し、濾過速度に大きなダメージを与える場合がある。その場合は、ウイルスを精製して夾雑物を分離してから使用すればよい。ウイルスの精製法は超遠心分離を用いた方法などがすでに公知である。
　ウイルス除去フィルターのウイルスの除去率ＬＲＶは３以上であることを満たす条件を設定する。ウイルス除去フィルターの孔径よりも大きなサイズのウイルスの除去率は、通常ＬＲＶ≧３となり、一方ウイルス除去フィルターの孔径よりも小さなウイルスの除去率は通常ＬＲＶ＜３となる（ 泉 浩業ら、血漿分画製剤の安全性に関する検討II.モノクローナル抗体精製乾燥濃縮人血液凝固第VIII因子製剤（クロスエイトＭ（登録商標））及び筋注用人免疫グロブリン製剤（抗HBs人免疫グロブリン「日赤」（登録商標）,人免疫グロブリン「日赤（登録商標）」）の製造工程におけるウイルス除去膜の効果について、Japanese Journal of Transfusion Medicine 、(1999) 、 Vol.45. No.3, Pages 357-361.）。このとき、決して除去率は必ずＬＲＶ＝０となるわけではなく、３以下のある程度の除去率が得られることがあるが、それはウイルス除去フィルターのサイズ分離による本来あるべき除去率ではなく、ウイルス分子の部分的凝集や吸着によるものと考えられる。従って、フィルターの孔径以上のサイズのウイルスを意図して除去しようとする際には、ＬＲＶ≧３以上の除去率を満たすべきである。
　本発明の濾過方法に使用される蛋白製剤中間製品としては、抗体医薬中間製品、組換え蛋白医薬中間製品、血漿製剤中間製品、血漿分画製剤中間製品などが適用できるが、特に免疫グロブリン製剤中間製品が好ましい。さらに好ましくは、免疫グロブリンＧ製剤中間製品であり、最も好ましくは、免疫グロブリンＧのモノクローナル抗体製剤中間製品である。
　これら蛋白製剤中間製品を、まずはウイルス添加を行なわずに、ウイルス除去フィルター装置で濾過することにより、蛋白製剤中間製品の平均蛋白濾過速度を評価する。蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下という高濃度で、かつ蛋白製剤中間製品の入口圧力が１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下の高圧条件で、１時間以上５時間以下濾過することにより、平均蛋白濾過速度（ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ）を評価する。平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上である蛋白質濃度及び圧力の条件を確認した後、この蛋白質濃度と圧力の範囲内で、蛋白製剤中間製品に所定量のウイルスを添加して、ウイルス除去フィルターで濾過することにより、ウイルス除去工程のウイルス除去性能を評価する。
　蛋白製剤の製造工程における１バッチの製造量は、総重量拡大化の傾向にある。蛋白製剤の１バッチの総量（総重量）は、例えば抗体医薬製剤では、生産性向上の研究が進み、１バッチが５０ｋｇ以上という高い生産能力が示されている例もある。このような高い生産能力の蛋白製剤においても、ウイルス除去工程という一つの工程は１日で完了することが、蛋白製剤中間製品の安定性や、製造工程の効率の面から望ましい。そのためには、ウイルス除去フィルターの平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上であるべきである。１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上であれば、５０ｋｇの蛋白製剤中間製品の濾過を４ｍ２フィルター１本で１２．５時間以内に、２本で６．２５時間以内に濾過することが可能である。
　平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上である蛋白質濃度及び圧力の条件を確認した後、この蛋白質濃度と圧力の範囲内で、蛋白製剤中間製品に所定量のウイルスを添加して、ウイルス除去フィルターで濾過することにより、ウイルス除去工程のウイルス除去性能を評価する。すなわち、ウイルス除去率ＬＲＶ≧３を満たす蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度条件、及び入口圧力条件を選択する。蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下という高濃度で、かつ蛋白製剤中間製品の入口圧力が１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下の高圧で濾過した場合に、同様に１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上の平均蛋白濾過速度が得られ、かつＬＲＶ≧３となるウイルス除去率を確認し、スケールアップした場合の設備、操作条件等を予想する。なお、ウイルス溶液を添加しないで実施する平均蛋白濾過速度の測定は省略し、ウイルスを添加した系で同時に測定することもできる。
　また、蛋白質濃度は高濃度で濾過するほうが、濾過装置・容器・配管などのスケールアップによるコストアップを防止することができるメリットがある。その反面、高濃度になりすぎると、安定性の面から問題が生じる。したがって、蛋白質濃度は２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下で実施するが、好ましくは２５ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下、より好ましくは３０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは３０ｍｇ／ｍｌ以上５０ｍｇ／ｍｌ以下である。
　濾過の際の入口圧力は、高圧の方が短時間で迅速に濾過を行なえるメリットがあるが、圧力が高すぎると、装置への圧力によるダメージやリークのリスクが増えるため、入口圧力は、１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下で実施する。好ましくは１９６ｋＰａ以上５００ｋＰａ以下、より好ましくは２４５ｋＰａ以上４００ｋＰａ以下、さらに好ましくは２９４ｋＰａ以上４００ｋＰａ以下、最も好ましくは２９４～３００ｋＰａである。蛋白質濃度および入口圧力は、上記範囲内で、平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上であり、かつＬＲＶがＬＲＶ≧３を同時に満たせるように数点振って評価することが好ましい。
　また、蛋白製剤中間製品をウイルス除去フィルターに流す濾過時間は、１時間以上、５時間以下であるが、スケールアップしたときの蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程を、ウイルス除去フィルターの膜面積は大きくなっても短時間で完了したい場合は、短時間に、多少長くかかってもウイルス除去膜の有効膜面積を小さくしたい場合には、長時間に設定することができる。また濾過開始後３時間後もＬＲＶ≧３であることを満たす条件を決定するために、蛋白製剤中間製品をウイルス除去フィルターに３時間以上５時間以下流すことも好適である。
　以下実施例により、本発明をより詳細に説明する。
[実施例１]　 
　ウイルス除去フィルターとして、国際公開第２００４／０３５１８０号パンフレット実施例１に示される方法に準じて、すなわち、６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つポリフッ化ビニリデンよりなる微多孔中空糸膜を、親水性ビニルモノマー（ヒドロキシプロピルアクリレート）でグラフト率１０％となるようグラフト重合させた親水化微多孔中空糸膜であって、開孔率が大きい粗大構造層が中空糸膜内表面に存在し、その厚みが７．０μｍであり、これと一体化している開孔率が小さい緻密構造層の厚みが膜厚全体の８０％である多層微多孔中空糸膜を有効膜面積０．００１ｍ２有するフィルターで、フィルター入口に６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つルアーロック式ノズルを有し、中空糸膜で容器内空間が入口側空間と出口側空間に仕切られているウイルス除去フィルターを使用した。蛋白製剤中間製品のモデルとして、濃度３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（０．１Ｍ食塩水を溶媒とする）を用い、この溶液に、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）液を０．５体積％添加し、３５ｎｍの孔径を有する中空糸フィルター（旭化成メディカル社製、ＰＬＡＮＯＶＡ（登録商標）３５Ｎ）で前濾過を行なった。前濾過後の免疫グロブリン濃度は３０ｍｇ／ｍｌ、ＰＰＶの濃度は６．１（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）であった。
　このＰＰＶを含む３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液を、上記濾過装置を用いて、２９４ｋＰａの圧力でデッド－エンド（Ｄｅａｄ－ｅｎｄ）式濾過を５時間実施した。このとき、平均蛋白濾過速度は、濾過開始３時間後、４時間後、５時間後において、それぞれ１．９、１．９、１．８ｋｇ／ｍ２／Ｈｒであった。いずれの時点においても、１．０（ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ）以上の高速濾過の濾液で、ウイルス除去率を評価することができた。ウイルス除去率は、濾過開始後1時間までの濾液、３時間までの濾液、５時間までの濾液ともにＬＲＶ≧５．６となった。
　ウイルス除去工程の運転条件として、蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度３０ｍｇ／ｍｌ、ウイルス除去フィルター入口圧力２９４ｋＰａ、濾過時間５時間以内、という条件を決定できた。
[実施例２～４]
　ウイルス除去フィルターとして、国際公開第２００４／０３５１８０号パンフレット実施例１に示される方法に準じて、すなわち、６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つポリフッ化ビニリデンよりなる微多孔中空糸膜を、親水性ビニルポリマー（ヒドロキシプロピルアクリレート）でグラフト率１０％となるようグラフト重合させた親水化微多孔中空糸膜であって、開孔率が大きい粗大構造層が中空糸膜内表面に存在し、その厚みが７．０μｍであり、これと一体化している開孔率が小さい緻密構造層の厚みが膜厚全体の８０％である多層微多孔中空糸膜を有効膜面積０．００１ｍ２有するフィルターで、フィルター入口に６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つルアーロック式ノズルを有し、中空糸膜で容器内空間が入口側空間と出口側空間に仕切られているウイルス除去フィルターを使用した。蛋白製剤中間製品のモデルとして、濃度３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（０．１Ｍ食塩水を溶媒とする）を用い、この溶液に、下記の３種のウイルス液をそれぞれ０．５体積％添加して３種類の溶液を作成した。それぞれの溶液を３５ｎｍの孔径を有する中空糸フィルター（旭化成メディカル社製、ＰＬＡＮＯＶＡ（登録商標）３５Ｎ）で前濾過を行なった。
　ウイルス溶液１）　マウス白血病ウイルス（Ａ－ＭｕＬＶ）（実施例２　ウイルス濃度５．０）
　ウイルス溶液２）　レオウイルス３型　（Ｒｅｏ－３）（実施例３　ウイルス濃度５．６）
　ウイルス溶液３）　マウス最小ウイルス　（ＭＶＭ）（実施例４　ウイルス濃度５．７）
　これら３種の３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（ウイルス溶液を含む）を、上記ウイルス除去フィルターを用いて、ウイルス除去フィルター入口圧力２９４ｋＰａの圧力でデッド－エンド（Ｄｅａｄ－ｅｎｄ）式濾過を５時間実施した。
　その結果、(実施例２)Ａ－ＭｕＬＶ添加の場合、濾過開始後1時間、２時間、３時間、４時間、５時間までの濾過速度はそれぞれ、２．２、２．０、１．９、１．７、１．６ｋｇ／ｍ２／Ｈｒとなった。いずれの時点においても、１．０（ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ）以上の高速濾過の濾液で、ウイルス除去率を評価することができた。ウイルス除去率は、濾過開始後１時間までの濾液、３時間までの濾液、５時間までの濾液ともにＬＲＶ≧４．５となった。ウイルス除去工程の運転条件として、蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度３０ｍｇ／ｍｌ、ウイルス除去フィルター入口圧力２９４ｋＰａ、濾過時間５時間以内、という条件を決定できた。
　(実施例３)Ｒｅｏ－３添加の場合、濾過開始後１時間、２時間、３時間、４時間、５時間までの濾過速度はそれぞれ、２．５、２．３、２．１、２．０、１．８ｋｇ／ｍ2／Ｈｒとなった。いずれの時点においても、１．０（ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ）以上の高速濾過の濾液で、ウイルス除去率を評価することができた。ウイルス除去率は、濾過開始後1時間までの濾液、３時間までの濾液、５時間までの濾液ともにＬＲＶ≧５．１となった。ウイルス除去工程の運転条件として、蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度３０ｍｇ／ｍｌ、ウイルス除去フィルター入口圧力２９４ｋＰａ、濾過時間５時間以内、という条件を決定できた。
　(実施例４)ＭＶＭ添加の場合、濾過開始後１時間、２時間、３時間、４時間、５時間までの濾過速度はそれぞれ、２．４、２．３、２．１、２．０、２．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒとなった。いずれの時点においても、１．０（ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ）以上の高速濾過の濾液で、ウイルス除去率を評価することができた。ウイルス除去率は、濾過開始後1時間までの濾液、３時間までの濾液、５時間までの濾液ともにＬＲＶ≧５．２となった。ウイルス除去工程の運転条件として、蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度３０ｍｇ／ｍｌ、ウイルス除去フィルター入口圧力２９４ｋＰａ、濾過時間５時間以内、という条件を決定できた。
 [比較例１] 
　ウイルス除去フィルターとして、１００ｋＰａの耐圧性を持つセルロースを材質とする、熱可塑性樹脂を含まない中空糸膜を用い、中空糸膜の入口と出口に６００ｋＰａ以上の耐圧性を持たないタケノコ型のノズルを有し、有効膜面積０．００１ｍ２の中空糸膜で容器内空間が入口側空間と出口側空間に仕切られている濾過装置（旭化成メディカル社製、Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）２０Ｎ）を使用した。蛋白製剤中間製品のモデルとして、濃度３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（０．１Ｍ食塩水を溶媒とする）を用い、この溶液に、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）液を０．５体積％添加し、３５ｎｍの孔径を有する中空糸フィルター（Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）３５Ｎ）で前濾過を行なった。前濾過後の免疫グロブリン濃度は３０ｍｇ／ｍｌ、ＰＰＶの濃度は５．９であった。
　この３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（ＰＰＶを含む）を、上記ウイルス除去フィルターを用いて、セルロース膜にかけられる上限圧力９８ｋＰａの圧力でデッド－エンド（Ｄｅａｄ－ｅｎｄ）式濾過を５時間実施した。
　その結果、ウイルス除去率は、濾過開始後１時間までの濾液、５時間までの濾液ともにＬＲＶ≧５．４となった。濾過速度は、濾過開始１時間後、５時間後において、それぞれ０．８、０．７ｋｇ／ｍ２／Ｈｒとなり、１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒに満たなかった。結果として、蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程の運転条件を決定することができなかった。
 [比較例２]
　ウイルス除去フィルターとして、６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ親水化ポリフッ化ビニリデンを材質とする、特公平７－７１６２４号公報の例Ｉに記載されている方法に準じて製造された、表面に緻密なスキン層を持ち、膜の厚さに対してその緻密構造層の厚さが２０％以下の平膜を用い、平膜の入口にルアーロック式のノズルを有する、有効膜面積０．０００３ｍ２のフィルターで容器内空間が入口側空間と出口側空間に仕切られている濾過装置を使用した。蛋白製剤中間製品のモデルとして、濃度３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（０．１Ｍ食塩水を溶媒とする）を用い、この溶液に、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）液を０．５体積％添加し、３５ｎｍの孔径を有する中空糸フィルター（Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）３５Ｎ）で前濾過を行なった。前濾過後の免疫グロブリン濃度は３０ｍｇ／ｍｌ、ＰＰＶの濃度は５．２であった。
　この３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（ＰＰＶを含む）を、上記ウイルス除去フィルターを用いて、２９４ｋＰａの圧力でデッド－エンド（Ｄｅａｄ－ｅｎｄ）式濾過を５時間実施した。その結果、濾過開始後1時間までの濾液は、濾過速度が遅いため濾過体積が少なすぎて、ウイルス濃度の測定ができなかった。濾過開始後３時間までの濾液のウイルス除去率はＬＲＶ≧４．０となった。このとき、濾過量は、濾過開始３時間後において０．０９ｋｇ／ｍ２で、１時間平均の濾過速度は０．０３ｋｇ／ｍ２／Ｈｒとなり、１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒに満たなかった。
　結果として、蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程の運転条件を決定することができなかった。
 [比較例３]
　ウイルス除去フィルターとして、国際公開第２００４／０３５１８０号パンフレット実施例１に示される方法に準じてすなわち、６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つポリフッ化ビニリデンよりなる微多孔中空糸膜と、親水性ビニルポリマー（ヒドロキシプロピルアクリレート）でグラフト率１０％となるようグラフト重合させた粗大構造層のみからなる微多孔中空糸膜を有効膜面積０．００１ｍ２有するフィルターで、フィルター入口に６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つルアーロック式ノズルを有し、中空糸膜で容器内空間が入口側空間と出口側空間に仕切られているウイルス除去フィルターを使用した。蛋白製剤中間製品のモデルとして、濃度３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（０．１Ｍ食塩水を溶媒とする）を用い、この溶液に、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）液を０．５体積％添加した。ＰＰＶの濃度は６．０であった。この３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（ＰＰＶを含む）を、上記ウイルス除去フィルターを用いて、２９４ｋＰａの圧力でデッド－エンド（Ｄｅａｄ－ｅｎｄ）式濾過を５時間実施した。平均蛋白濾過速度は、濾過開始１時間後、３時間後、５時間後において、それぞれ２．３、２．２、２．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒであった。濾過開始後1時間までの濾液、３時間前の濾液、５時間までの濾液ともにウイルス除去率はＬＲＶ＝０．５となり、ＬＲＶ≧３を満たさなかった。結果として、蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程の運転条件を決定することができなかった。
　本発明の濾過方法は、抗体医薬、組換え蛋白医薬、血漿製剤、血漿分画製剤、等の蛋白製剤の製造工程中のウイルス除去工程のスケールアップされた実運転条件設定、設備設計等に有用な情報を非常に小さいスケールで収集可能なため、タンパク製剤製造産業に大変有用である。

Claims (12)

  1. 　ウイルス除去フィルターに蛋白製剤中間製品を所定の蛋白質濃度および圧力で流す濾過方法において、
    （１）蛋白製剤中間製品の入口と出口を夫々少なくとも一つ有する容器とウイルスを除去するためのウイルス除去膜とを有し、容器内空間がウイルス除去膜によって蛋白製剤中間製品の入口側空間と出口側空間に仕切られており、蛋白製剤中間製品の入口、出口のうち少なくとも入口は６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造のノズルであり、ウイルス除去膜の有効膜面積が０．０００１ｍ２以上０．０３ｍ２以下であるウイルス除去フィルターを用い、
    （２）該ウイルス除去フィルターに、精製工程により蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下に高められた蛋白製剤中間製品を、蛋白製剤中間製品の入口圧力が１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下、平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上の条件で、濾過時間として１時間以上５時間以下流し、
    （３）ウイルス除去率ＬＲＶ≧３の蛋白製剤中間製品の濾液を得る
    濾過方法。
  2. 　請求項１に記載のウイルス除去フィルターに、
    （４）精製工程により蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下に高められた蛋白製剤中間製品を、蛋白製剤中間製品の入口圧力が１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下、平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上の条件で、濾過時間として３時間以上５時間以下流し、
    （５）ウイルス除去率ＬＲＶ≧３の蛋白製剤中間製品の濾液を得る
    請求項１に記載の濾過方法。
  3. 　ウイルスが、パルボウイルス科、レトロウイルス科、フラビウイルス科、レオウイルス科、パラミクソウイルス科、ヘルペスウイルス科、ピコルナウイルス科、パポーバウイルス科のいずれかより選択されるウイルスである請求項１または２に記載の濾過方法。
  4. 　蛋白製剤中間製品中の蛋白質が、免疫グロブリンである請求項１乃至３のいずれかに記載の濾過方法。
  5. 　免疫グロブリンが、免疫グロブリンＧである請求項４に記載の濾過方法。
  6. 　ウイルス除去膜が、親水化された合成高分子よりなる請求項１乃至５のいずれかに記載の濾過方法。
  7. 　ウイルス除去膜が、中空糸型ウイルス除去膜である請求項１乃至６のいずれかに記載の濾過方法。
  8. 　請求項１乃至７のいずれかに記載の濾過方法の蛋白質濃度および入口圧力条件を、スケールアップしたときの運転条件として採用する方法。
  9. 　更に、請求項１乃至７のいずれかに記載の濾過方法の濾過時間を、スケールアップしたときの運転条件として採用する請求項８に記載の方法。
  10. 　請求項１乃至７いずれかに記載の濾過方法に用いられるウイルス除去フィルターであって、蛋白製剤中間製品の入口と出口を夫々少なくとも一つ有する容器とウイルスを除去するためのウイルス除去膜とを有し、容器内空間がウイルス除去膜によって蛋白製剤中間製品の入口側空間と出口側空間に仕切られており、蛋白製剤中間製品の入口、出口のうち少なくとも入口は６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造のノズルであり、ウイルス除去膜の有効膜面積が０．０００１ｍ２以上０．０３ｍ２以下であるウイルス除去フィルター。
  11. 　ウイルス除去膜が、中空糸型ウイルス除去膜である請求項１０に記載のウイルス除去フィルター。
  12. 　ウイルス除去膜が、開孔率が大きい粗大構造層と、開孔率が小さい緻密構造層を有する、熱可塑性樹脂を含む微多孔膜であって、該粗大構造層が少なくとも一方の膜表面に存在し、その厚みが５．０μｍ以上であり、該緻密構造層の厚みが膜厚全体の５０％以上であって、かつ該粗大構造層と該緻密構造層が一体化している多層微多孔膜である請求項１０または１１に記載のウイルス除去フィルター。
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