WO2008016187A1 - Pladienolide target molecule, compound capable of binding to the target molecule, and screening method for the compound - Google Patents

Description

プラジェノライド類の夕ーゲット分子、本夕ーゲット分子に結合する化合物、 及びそのスクリーニング方法 技術分野

本発明は、 プラジェノライド類およびその誘導体のターゲット分子、 本夕ーゲ ット分子に結合する化合物及びそのスクリーニング方法に関する。 背景技術 明

近年の抗癌剤研究により、 新たなキナーゼ阻害剤が相次いで見出され、 このキ ナ一ゼ阻害剤は、 癌患者の治療や QOL の改善書に貢献している。 しかしながら、 抗癌剤による癌治療成績はいまだ決して十分ではなく、 さらに新しい抗癌剤開発 が熱望されている。 特に新しい創薬夕ーゲッ卜に基づく新規な抗癌剤の開発は、 既存薬では十分な治療効果が得られない癌患者の治療のみならず、 既存薬との併 用によって新たな治療戦略の構築が可能になると期待されている。

プラジェノライド （Pladienolide) 類は in vitroおよび in vivoにおいて優れた抗 腫瘍活性を発揮することが知られている （WO 02/060890、 WO03/099813、 WO 04/011661、 WO 04/011459)。 そして、 プラジェノライド類は既存の抗腫瘍剤と は全く異なる抗癌スペクトラムを示し、 新しい作用機序を有することが示唆され ている。 しかしながら、 生体内標的分子をはじめ詳細な作用メカニズムは未解明 であった。 発明の開示

プラジェノライド類が結合している標的分子を単離 ·同定することは、 新たな 創薬ターゲットを見出すことに他ならない。 そこで本発明者らは、 プラジェノラ ィド類を基に種々のプローブ化合物をデザイン ·合成し、 その標的的分子の同定 を試みた。

本発明は、 プラジェノライド類の生理活性を発揮する分子標的を同定するとと もに、 その同定に用いるプローブ化合物、 ならびに新たに同定された分子標的化 合物および/またはプローブ関連化合物を用いることにより、 プラジェノライド類 の標的分子に作用 （結合） する新たな活性化合物をスクリーニングする方法を提 供することを目的とする。

本発明者らは、 上記の背景からプラジェノライド類が生体内で特異的に結合し ている標的分子を同定するため鋭意研究を行なった。 その結果、 本発明者は、 プ ラジェノライド類が SAP130 (splicing factor 3b3、 SF3b3とも称する） と呼ばれ る因子に結合し、 SAP130の機能、 更には SAP130構成要素とする複合体の機能 を修飾することにより生理活性を発揮していることを解明した。ここで、 SAP130 は SF3b (splicing factor 3b, Will CI et.al, EMBO, 2001 , 20(16), 4536-46) のコン ポーネントであり、 SF3bはスプライシングマシナリーである U2 snRNPの構成 因子である。

SF3bの機能に影響を与える化合物は、

(1 )スプライシングと転写との密接な関連から （Tom Maniatis & Robin Reed, Nature, 2002， 416, 499-507、 Nick J.Proudfoot, Cell, 2002， 108, 501-512)、 転写 全般に広く影響を与える可能性があり、

(2)また、 SF3b力 Cyclin Eとの結合を介して cell cycleと関連することが示唆 されることから (Mol Cell Biol. 1998 Aug;18(8):4526-36)、 SF3bは cell cycleに も影響を及ぼすと考えられる。

これらのことから、 SF3b は、 新規な抗癌剤のターゲットとして非常に有望で あると考えられる。

さらに、 新たにデザイン ·合成したプローブ化合物を利用することにより SAP 130, SF3b、 および U2snRNPに結合する新たな生理活性物質を探索するこ とが可能であることが示され、 これらの分子と結合する抗腫瘍剤をスクリーニン グし得ることを見出し、 本発明を完成するに至った。 即ち、 本発明は下記の通りである。

( 1 ) 被検化合物と、 スプライシングファクタ一 3 b (SF3b) との結合活性を測 定する方法であって、 以下の工程： (a) 標識した下記式 (I)で表される化合物および被検化合物を、 細胞または細胞 画分と接触させ、

(b) 結合した標識化合物の分布を測定すること

を含む前記方法。

〔式 (I)中、

R²、 R^{1 Q}、 R¹²および R¹⁴は、 それぞれ独立して、 同一または異なって、 水素 またはメチルを表す；

R^3a、 R^3b、 R^5a、 R^5b、 R^6aおよび R^6bは、 それぞれ独立して、 同一または 異なって、

(1) 水素、

(2) ヒドロキシ、

(3) それぞれ置換基を有していても良い

(a) ₂₂アルキル、

(b) ₂₂アルコキシ、

(c) A r CH₂〇一 （式中、 A rはそれぞれ置換基を有していても良い C 6— ₁₄ァリールまたは 5員環〜 14員環へテロァリールを表す） 、

(d) C_{2 22}ァシロキシ、

(e) C_{3 22}不飽和ァシロキシ、

(f) -OCOR^co (式中、 R^e。はそれぞれ置換基を有していても良い

(i) C_{6 14}ァリール、

(ii) 5員環〜 14員環へテロァリール、

(iHJCL ₂₂アルコキシ、 (iV)不飽和 C ₂— ₂₂アルコキシ、

(v) C₆— ₁₄ァリールォキシまたは

(vi) 5員環〜 14員環へテロァリールォキシを表す） 、

(g) ₂₂アルキルスルホニルォキシ、

(h) ベンゼンスルホニルォキシまたは

(i) 一 OS i R^{s l}R^{s 2}R^{s 3} (式中、 R^{s l} R^{s 2}および R^{s 3}は、 それぞれ 独立して、 同一または異なってメチル、 ェチル、 i一プロピル、 t一プチ ルまたはフエニルを表す） 、

(4) 八ロゲンまたは

(5) 一 R^M— NR^N1R^N2 {式中、 R^Mは単結合もしくは一〇— C〇—を表 す； R^N1および R^N2は、

1) それぞれ独立して、 同一または異なって、

(a)水素、 または

(b)それぞれ置換基を有していても良い

(i)C ₂₂アルキル、

(ii)不飽和 C₃_₂₂アルキル、

(iii) C₂— ₂₂ァシル、

(iv)不飽和 C ₃- 2₂ァシル、

(v) C₆— ₁₄ァリール、

(vi) 5員環〜 14員環へテロァリール、

(vii)ベンジル

(viii) C卜₂₂アルキルスルホニルもしくは

(ix) ベンゼンスルホニルを表すか、 あるいは、

2) NR^N1R^N2がー緒になって置換基を有していても良い 3員環〜 14 員環の含窒素非芳香族複素環を表しても良い } を表す；

R^7aおよび R^7bは

(1) それぞれ独立して、 異なって

1) 水素、

2) 一 OR^H (式中、 R^Hは水素、 メチルまたはァセチルを表す） 、 3) 一 OR^D{式中、 R^Dはそれぞれ置換基を有していても良い

(1) ^ 2アルキル（ただし、メチルの場合は必ず置換基を有する）、

(ii) -CH₂ A r、

(iii) C₃— ₂₂ァシル、

(iv)C₃— ₂₂不飽和ァシル、

(V)— CORc。、

(vi) C卜 ₂₂アルキルスルホニル、

(vii)ベンゼンスルホニルまたは

(viii) - S i R^s iR⁵² R^{s 3}を表す }または

4) _R^M— NR^N1 R^N2であるか、 または

(2) R^7aと R^7bが一緒になつて

1) ケトン構造 （ =〇） を表すか、 または

2) ォキシム構造 （ = NOR°^x :式中、 R°^xはそれぞれ置換基を有し ていても良い

(a)C卜 ₂₂アルキル、

(b)不飽和 C ₃— ₂₂アルキル、

(c) C₆— ₁₄ァリール、

(d) 5員環〜 14員環へテロアリールまたは

(e)ベンジルを表す） を表す；

さらに、 R^3aと R^3bが一緒になつてケトン構造（ = 0)もしくはォキシム構造（= NOR^ox) を表しても良い；

さらに、 R^6aと R^6bが一緒になつてスピロォキシラン環またはェキソメチレンを 表しても良い； .

さらに、 R^6aと R^6bのどちらか一方と R^7aと R^7bのどちらか一方が一緒になつ て 1, 3—ジォキソラン環を形成しても良い；

Gは

[1]

{式中、 R^16aおよび R^16bは、 それぞれ独立して、 同一または異なって水素、 メチルまたはヒドロキシを表す；

R^17a、 R^17b、 R^18a、 R^18b、 R^19a、 R^19b、 R^20a、 R²。^b、 R^21aおよび R^21bは、 それぞれ独立して、 同一または異なって

(1) 水素、

(2) 置換基を有していても良いメチル、

(3) —〇R^H、

(4) 一 OR^D、

(δ) ハロゲンまたは

(6) 一 R^M— NR^N1R^N2を表す；

R^{21 c}は

(1) 水素または

(2)

(式中、 R^22a、 ²²¹⁵ぉょび1^²²。は、 それぞれ独立 して、 同一または異なって、

(a)水素、

(b)メチル、

(c)ヒドロキシ、

(d) - OR^H、

(e)— OR^D、

(f)一 R^M— NR^N1R^N2または

(g)ハロゲンを意味する；

さらに、

R ¹⁸³または R ^{18 b}のどちらか一方と R ¹⁹³または R ^{19 b}のどちらか一方が一緒 になって単結合を形成し、 部分構造

を表すか、 または酸素

と結合して部分構造

を表しても良い；

さらに、

R^19aまたは R^19bのどちらか一方と R^2Qaまたは R^2Qbのどちらか一方が一緒

になって単結合を形成し、 （'、

を表しても良い； さらに、

R^21aと R^21bが一緒になつて (a)ケトン構造 （-〇） を表すかまたは (b)ォキシム 構造 （ = N〇R°^X) を表しても良い；

さらに、

尺²¹³または1¾²¹¹³のどちらか一方と R^22aまたは R^22bのどちらか一方が一緒 or R^21b) になって部分構造 ^(R

を表しても良い；

さらに、

R ^{19 a}または R ^{19 b}のどちらか一方と R ^{21 a}または R^{21 b}のどちらか一方が一緒

になって部分構造

を表しても良い } 、

[2]

{式中、

R^16a R^16b R^17a R^17b R^18aおよび R^18bは式 (G— I)中の定義と同義で ある ； 水素または

(2)

（式中、 R^{f 3a}、 R^f3b、 R^f4aおよび R^f4b は、 それぞれ独立して、 同一または異なって、 水素、 メチル、 ヒドロキシ、 メト キシまたはァセ卜キシを表し、 R^f5はメチルまたはェチルを表す） を表す } で表 されるか、 または

[3]

{式中、 R^16a、 R^16b、 R^17aおよび R^17bは式 (G— I)中の定義と同義である；

R ^{17 c}は

(1) 水素または

び R^{f 4b}は、 それぞれ独立して、 同一または異なって、 水素、 メチル、 ヒドロキ シ、 メトキシまたはァセトキシを表し、 R^{f 5}はメチルまたはェチルを表す） を表 す } で表される。 〕

(2) 式 (I)で表される化合物が下記式 （IV)で表される化合物である、 （1) に記 載の方法。

〔式 (IV)中、

R^{16 c}, R¹ および R^{21 e}は、 それぞれ独立して、 同一または異なって、 水素、 ヒドロキシまたはメ卜キシメチルを表す；

R^{7 c}は、 ヒドロキシ、 ァセトキシ、 0— CO_NR^N1' R^N2' (式中、 R^{N 1}' 、 R^{N 2}'は、 それぞれ独立して、 同一または異なって、 水素、 C i ₆アルキルを表す） で表される。 〕

(3) 式 (I)で表される化合物が下記式 （V)で表される化合物である、 （1) に記載 の方法。

アルキルを表す） で表される。 〕

(4)被検化合物が SF3b中の SAP130と結合する活性を測定する、 （1) 〜（3) のいずれか 1項に記載の方法。

(5) 標識が放射性同位元素による標識である、 （1 ) 〜 （4) のいずれか 1項に 記載の方法。

(6) 標識が蛍光標識である、 （1 ) 〜 （4) のいずれか 1項に記載の方法。

(7) 標識がピオチン標識である、 （1) 〜 （4) のいずれか 1項に記載の方法。

(8) 標識が、 光照射により蛋白質と結合する化合物による標識である、 （1) 〜 (4) のいずれか 1項に記載の方法。

(9) 工程 (b)において、 標識化合物が核に分布する量を測定して、 被検化合物が SF3bと結合する活性を測定する、 （1) 〜 （4) のいずれか 1項に記載の方法。

(1 0) 工程 (b)において、 標識化合物が核スペックルに分布する量を測定して、 被検化合物が SF3bと結合する活性を測定する、 （1) 〜 （4) のいずれか 1項に 記載の方法。

(1 1) 工程 (b)において、 標識化合物が核スペックルに分布する形態から、 被検 化合物が SF3bと結合する活性を測定する、 （1) 〜 （4) のいずれか 1項に記載 の方法。

(1 2)工程 (b))において、標識化合物が SF3bに結合して分布する量を測定して、 被検化合物が SF3bと結合する活性を測定する、 （1) 〜 （4) のいずれか 1項に 記載の方法。

(13) 工程 (b)において、 標識化合物が SAP130に結合して分布する量を測定し て、 被検化合物が SF3bと結合する活性を測定する、 （1) 〜 （4) のいずれか 1 項に記載の方法。

(14) 前記 （1) 〜 （1 3) のいずれか 1項に記載の方法により SF3bと結合 する活性を有すると判定される、 SF3bと結合する抗癌剤。

(1 5) 前記 （ 1 ) 〜 （1 3) のいずれか 1項に記載の方法により SAP130と結 合する活性を有すると判定される、 SAP130と結合する抗癌剤。

(1 6) 下記式 （Π) に記載のいずれかの標識化合物

本発明により、 プラジェノライド類の標的分子に作用 （結合） する新たな活性 化合物などをスクリーニングすることができる。 図面の簡単な説明

図 1aは、 ¹ H-NMR Spectrumの図である。

図 1 bは、 ESI-MSの図である。

図 1c は、 トリチウムプローブ化合物の細胞内分布を示す図である。 グラフの 縦軸はサンプル中の放射活性値をプローブの比活性値からモル数に換算した値で 示した。

図 1dは、 トリチウムプローブ化合物の細胞内分布 (活性炭アツセィ）を示す図で ある。

図 2は、 プラジェノ類縁体および誘導体によるトリチウムプローブとの競合実 験結果 （競合化合物の生物活性値と競合率の相関） を示す図である。

図 3aは、 蛍光プローブの細胞内局在の観察結果を示す図である。

図 3b は、 蛍光プローブの細胞内局在の観察結果 （プラジェノライド化合物競 合実験結果） を示す図である。

図 4は、 トリチウムプローブ処理細胞から調整した核フラクションの免疫沈降 実験結果を示す図である。

図 5a は、 光ァフィ二ティー · ピオチンプローブ処理による結合蛋白質の検出 結果を示す図である。

図 5b は、 光ァフィ二ティー ·ピオチンプローブ処理による結合蛋白質の検出 結果 (SAP155, SAP145, SAP 130のバンド位置の比較結果)を示す図である。 図 6aは、 GFP融合 SAP145を用いたバンドシフ卜の検出実験結果を示す図で ある。

図 6bは、 GFP融合 SAP130を用いたバンドシフトの検出実験結果を示す図で ある。

図 7は、 プラジェノ化合物による光ァフィティー · ピオチンプローブとの競合 実験結果を示す図である。

図 8 aは、 画像解析に用いた蛍光プローブの画像の代表例を示す図である。 図 8bは、 画像解析結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態

以下、 本発明を詳細に説明する。 以下の実施の形態は、 本発明を説明するため の例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、 その要旨を逸脱しない限り、 さまざまな形態で実施をすることができる。

なお、 本明細書において引用した文献、 および公開公報、 特許公報その他の特 許文献は、 参照として本明細書に組み込むものとする。 また、 本明細書は、 本願 優先権主張の基礎となる、 米国仮出願 60/82 1, 1 99の開示内容を包含す る。 本発明において、上記式 (I)で表される化合物は、 WO 02/060890、 W 003/099813, WO 04/011661、 WO 04/011459に記載され、 抗腫瘍活性が認められている化合 物群であり、 本発明中における標識される化合物として使用することができる。 本明細書中では 「プラジェノライド類」 と称し、 場合によっては 「プラジェノラ イド類縁体または誘導体」 とも称する。 その好適な例は下記式 （IV) または (V) に示す化合物である。

〔式 (IV)中、

R^{16 c}, R^17cおよび R^{21 c}は、 それぞれ独立して、 同一または異なって、 水素、 ヒドロキシまたはメトキシメチルを表す；

R^7cは、 ヒドロキシ、 ァセトキシ、 0— CO— NR^N1' R^N2- (式中、 R^N1'、 R^{N 2}'は、 それぞれ独立して、 同一または異なって、 水素、 アルキルを表す） で表される。 〕

〔式 (V)中、

R ^{1 6 d}は、 水素またはヒドロキシ、 好ましくは水素を表す；

R ^{7 d}は、 ヒドロキシ、 ァセトキシ、 O— CO— NH R ^{N 1} ' (式中、 R ^{N 1} 'は ₆ アルキルを表す） で表される。 〕 また、 標識は抗腫瘍活性が消失しない限りいかなる位置に導入してもよいが、 好ましくは 7位のァセチル基を修飾 （標識） することが好ましい。 標識方法とし ては、 放射性同位元素による標識、 蛍光色素 （蛍光発色団） による標識等が挙げ られるが、 これらに限定されるものではない。 また、 標識する分子にピオチンを 結合させて、 特異的に結合するアビジンを用いて検出する方法も採用することが できる。 但し、 特異的結合は、 ピオチンとアビジンとのペアによる検出に限定さ れるものではない。

標識する分子に、 光照射により活性化して周囲の官能基と共有結合を形成する 構造 （光ァフィ二ティーモイエティ一） を導入し、 光を当てて共有結合させた後 は、 SDS等の蛋白質変性剤で処理しても標識分子が解離しないような工夫を施す ことも可能である。 標識化合物の合成方法は、 具体的には、 実施例 A 1〜A 5に記載されている。 本明細書中では、 「標識化合物」 は、 式 （I) で表される化合物を標識した化合物 であり、 その好適な例は、 式 （II) に記載されているいずれかの化合物である。 被検化合物が、 U2 snRNPと、好ましくは SF3bと、 更に好ましくは SAP130 と作用する （結合する） ことを検定するためのスクリーニング方法としては、 （a) 標識した下記式（I)で表される化合物および被検化合物を、細胞または細胞画分と 接触させ、（b) 結合した標識化合物の分布を測定することを含む方法が挙げられ、 より具体的には、 以下の方法が挙げられる。 尚、 「接触」 とは、 標識した式（I)で 表される化合物および被検化合物と細胞または細胞画分とを同一の反応系又は培 養系に存在させることを意味し、例えば、標識した式（I)で表される化合物および 被検化合物を細胞の培養容器に添加すること、標識した式（I)で表される化合物お よび被検化合物の存在下で細胞を培養すること、ならびに標識した式（I)で表され る化合物および被検化合物と細胞画分溶液とを混合することなどが含まれる。

1 . 被検化合物が、 核への標識プラジェノライド類の分布を抑制する活性を利用 して検定する方法

( 1 ) 細胞を被検化合物及び標識プラジェノライド類の存在下で培養した後、 細胞を核画分とそれ以外の画分に分画する。被検化合物が存在する場合において、 標識プラジェノライド類の核画分中の量が被件化合物の存在しない場合と比べて 少なくなつたとき、 例えば、 50%以下、 好ましくは 70%以下、 更に好ましくは 90%以下のときは、 被検化合物は、 U2 snRNPと、 好ましくは SF3bと、 更に好 ましくは SAP130と作用する （結合する） 活性を有すると判断する。

本発明においては、 細胞を核画分とそれ以外の画分に分画した後に、 被検化合 物及び標識プラジェノライド類をそれぞれの画分に加えて適当な時間ィンキュベ ーシヨンし、 その後、 核画分中の標識プラジェノライド類の量を測定することも 可能である。 また、 被検化合物と標識プラジェノライド類は、 各画分に同時に加 えてもよく、 被検化合物および標識プラジェノライド類のいずれか一方を先に加 えてもよい。 好ましくは、 被検化合物を先に加える方が良い。

実施例 B 2に記載されている通り、 被検化合物の抗腫瘍活性と、 標識プラジェ ノライド類の核画分への分布の抑制活性の間には強い相関関係が認められる。 し たがって、 本発明の方法により、 U2 snRNPと、 好ましくは SF3bと、 更に好ま しくは SAP130と作用 （結合） して抗腫瘍活性を示す化合物をスクリーニングす ることが可能である。

( 2 ) 核への標識プラジェノライド類の分布は、 細胞を光学的に解析 （例えば 顕微鏡を用いて核への分布を画像から定量）することにより調べることができる。 そして、 光学的に解析した結果を指標として、 核への標識プラジェノライド類の 分布を抑制する化合物を検定することができる。 画像解析により核への標識ブラ ジエノライド類の分布を調べる方法の例を実施例 B 9に記載した。

2 . 被検化合物が、 核スペックルへの標識プラジェノライド類の分布を抑制する 活性を利用して検定する方法

細胞を被検化合物及び標識プラジェノライド類の存在下で培養した後、 核スぺ ックルへの標識プラジェノライド類の分布を、 細胞を光学的に解析 （例えば顕微 鏡を用いて核スペックルへの分布を画像から定量） することにより調べることが できる。 そして、 光学的に解析した結果を指標として、 核スペックルへの標識プ ラジェノライド類の分布を抑制する化合物を検定することができる。

核スペックルは、核スペックルに存在する蛋白質に対する抗体、例えば抗 SC-35 抗体により染色することができ、 染色した核スペックルと同様に分布する標識プ ラジェノライド類を定量することにより、 標識プラジェノライド類の核スペック ルへの分布を測定することが可能である。

被検化合物が存在する場合において、 標識プラジェノライド類の核スペックル 中の量が被件化合物の存在しない場合と比べて少なくなつたとき、 例えば、 50% 以下、 好ましくは 70%以下、 更に好ましくは 90%以下のときは、 被検化合物は、 U2 snRNPと、 好ましくは SF3bと、 更に好ましくは SAP130と作用する （結合 する） 活性を有すると判断する。

また細胞を光学的に観察あるいは画像解析して、 標識化合物が核スペックルに 分布する形態から、被検化合物が SF3bと結合する活性を測定することもできる。 例えば、 核スペックルが凝集して大きな核スぺッグルとして観察される場合に、 被検化合物が、 U2 snRNPと、 好ましくは SF3bと、 更に好ましくは SAP130と 作用する （結合する） 活性を有すると判断することができる。

実施例 B 3に記載されている通り、 被検化合物の抗腫瘍活性と、 標識プラジェ ノライド類の核スペックルへの分布の抑制活性との間に相関が認められることか ら、 本発明の方法により、 U2 snRNPと、 好ましくは SF3bと、 更に好ましくは SAP130 と作用 （結合） して抗腫瘍活性を示す化合物をスクリーニングすること が可能である。

3 . 被検化合物が、 U2snRNP、 SF3bまたは SAP130への標識プラジェノライド 類の結合を抑制する活性を利用して検定する方法

細胞を被検化合物、 及び標識プラジェノライド類、 好ましくは光ァフィ二ティ 一標識プラジェノライド類の存在下で培養する。 標識プラジェノライド類として 光ァフィ二ティー標識プラジェノライド類を使用するときは、 培養物に光を照射 する。 そして、 光を照射した後に細胞を可溶化し、 可溶化成分中に含まれる蛋白 質を分画、好ましくは SDS-PAGEにより分画して、 SAP130が含まれる画分の標 識プラジェノライド類を定量する。

好ましくは、 被検化合物、 および光ァフィ二ティー標識プラジェノライド類存 在下で培養した細胞を可溶化して得られた可溶化成分に対して、抗 SAP155抗体、 抗 SAP145抗体、抗 SAP120抗体あるいは抗 U2B"抗体等、好ましくは抗 SAP155 抗体を処理して得た免疫沈降サンプルに対して、 光照射を行うこともできる。 ま た、 可溶化成分に抗 SAP155抗体、 抗 SAP145抗体、 抗 SAP120抗体あるいは抗 U2B"抗体等、好ましくは抗 SAP155抗体を処理して得た免疫沈降サンプルに対し て、被検化合物、および光ァフィ二ティー標識プラジェノライド類を処理した後、 光照射を行うことも出来る。

光照射の際の波長は特に限定されるものではないが、 使用する光ァフィ二ティ 一プローブを活性化する波長が好ましい。 被検化合物が存在する場合において、 標識プラジェノライド類の U2snRNP、 SF3bまたは SAP130画分中の量が被検化合物の存在しない場合と比べて少なく なったとき、 例えば 50%以下、 好ましくは 70%以下、 更に好ましくは 90%以下 のときは、 被検化合物は、 U2 snRNPと、 好ましくは SF3bと、 更に好ましくは SAP130と作用する （結合する） 活性を有すると判断する。

本発明においては、 被検化合物及び標識プラジェノライド類を、 細胞を可溶化 した後にその可溶化成分中に加えて適当な時間ィンキュベ一ションし、 その後 SAP 130画分中の標識プラジェノライド類の量を測定することも可能である。 ま た、 被検化合物と標識プラジェノライド類は、 可溶化成分中に同時に加えてもよ く、 被検化合物および標識プラジェノライド類のいずれか一方を先に加えてもよ レ^ 好ましくは被検化合物を先に加える方が良い。

SAP130を、例えば GFPの様なタグとなる蛋白質との融合蛋白として発現させ た細胞を用いると、 SAP130の分画が容易となり好適である。 また、 SAP145を 例えば GFP の様なタグとなる蛋白質との融合蛋白質として発現させた細胞に対 して、抗 GFP抗体を用いた免疫沈降実験を行うことで SF3bの分画することも出 来る。

実施例 B 7に記載されている通り、 被検化合物の抗腫瘍活性と、 標識プラジェ ノライド類の SAP130画分への分布の抑制活性の間に相関が認められることから、 この方法により SAP130に作用 （結合） して抗腫瘍活性を示す化合物をスクリー ニングすることが可能である。 本スクリーニング系により見出される化合物は、 RNAのスプライシングに影響 を与え、 抗癌剤として有用である。 更にスプライシングの異常により起こると考 えられる他の疾患、 例えば神経変性疾患（例えば家族性ァルツ八イマ一病）、 痴呆 (例えば前頭側頭型痴呆症 (Hutton, M. et al.， Nature, 393:702-705, 1998) )、 精 神疾患 （例えば家族性自律神経失調症（Hims MM et al.， J Mol Med. 2007, 85(2):149-61. Epub 2007)、 筋萎縮性および緊張性の変性疾患 （例えば脊髄性筋 萎縮症、 筋強直性ジストロフィー）、 早老症、 脳腫瘍、 家族性高コレステロール血 症、 家族性成長ホルモン単独欠乏症タイプ I I (Faust i no, N. A. et a l . , Genes Dev. , 17 : 419-437, 2006)、 及び自己免疫疾患の治療剤としても有用であると考え られる。 また、 増殖の過程でスプライシングを利用しているウィルス、 例えばレ トロウィルス （特に H I V) 感染症の治療剤としても有用であると考えられる。 ここで、 式 (I)の化合物について説明する。

式 (I)において、 R ²、 R ^{1 Q}、 R ^{1 2}および R ^{1 4}は、 それぞれ独立して、 同一また は異なって、 水素またはメチルを表す。 式 (I)において、 R^3a、 R^3b、 R^5a、 R^5b、 R^6aおよび R^6bは、 それぞれ独立 して、 同一または異なって、 次の （1) 〜 （5) のいずれかを表す。

(1) 水素、

(2) ヒドロキシ、

(3) それぞれ置換基を有していても良い、

(a) ₂₂アルキル、

(b) ₂₂アルコキシ、

(c) A r CH₂0- (式中、 A rはそれぞれ置換基を有していても良い C 6_₁₄ァリールまたは 5員環〜 14員環へテロァリールを表す） 、

(d) C₂— ₂₂ァシロキシ、

(e) C₃_₂₂不飽和ァシロキシ、

(f) -OCOR^co (式中、 R^e。はそれぞれ置換基を有していても良い (i)C₆— ₁₄ァリール、

(ii)5員環〜 14員環へテロァリール、

(iii) ^-^アルコキシ、

(iv)不飽和 C₂— ₂₂アルコキシ、

(v) C₆— ₁₄ァリールォキシまたは

(vi) 5員環〜 14員環へテロァリールォキシを表す） 、

(g) じい アルキルスルホニルォキシ、

(h) ベンゼンスルホニルォキシまたは

(i) 一 OS i R^{s l}R^{s 2}R^{s 3} (式中、 R^{s l}、 1^²ぉょび1^³は、 それぞれ 独立して、 同一または異なってメチル、 ェチル、 i一プロピル、 t一プチ ルまたはフエニルを表す） 、

(4) ハロゲンまたは

(5) -R^M-NR^N1R^N2 {式中、 R^Mは単結合もしくは _〇— C〇_。

この場合、 R^N1および R^N2は、 次の 1) 又は 2) を表す。

1) それぞれ独立して、 同一または異なって、

(a)水素、 または (b)それぞれ置換基を有していても良い

(り 卜 ₂₂アルキル、

(ii)不飽和 C₃— ₂₂アルキル、

(iii) C₂— ₂₂ァシル、

(iv)不飽和 C ₃— ₂₂ァシル、

(v) C₆— ₁₄ァリール、

(vi) 5員環〜 14員環へテロァリール、

(vii)ベンジル

(viii) C卜₂₂アルキルスルホニルもしくは

(ix) ベンゼンスルホニルを表すか、 あるいは、

2) NR^N1R^N2がー緒になって置換基を有していても良い 3員環〜 14員環の 含窒素非芳香族複素環を表しても良い。 式 (I)において、 R^7aおよび R^7bは次の （1) 又は （2) を表す。

(1) それぞれ独立して、 異なって

1) 水素、

2) —〇R^H (式中、 R^Hは水素、 メチルまたはァセチルを表す） 、

3) _OR^D{式中、 R^Dはそれぞれ置換基を有していても良い ( C^ アルキル（ただし、メチルの場合は必ず置換基を有する）、 (ii)— CH₂Ar、

(iii) C₃— ₂₂ァシル、

(iv) C₃_₂₂不飽和ァシル、

(V)— COR^c。、

(vi)C卜 ₂₂アルキルスルホニル、

(vii)ベンゼンスルホニルまたは

(viii)-S i Rs

を表す }または

4) 一 R^M— NR^N1R^N2であるか、 または

(2) R^7aと R^7bが一緒になつて

1) ケトン構造 ( =〇） を表すか、 または 2) ォキシム構造 （ = NOR。^x :式中、 R°^xはそれぞれ置換基を有し ていても良い

(3)0^ 2アルキル、

(b)不飽和 C ₃-₂₂アルキル、

(c) C₆_₁₄7リール、

(d) 5員環〜 14員環へテロァリールまたは

(e)ベンジル。 式 (I)において、 R^3aと R^3bが一緒になつてケトン構造 （==0) もしくはォキシ ム構造 （ = N〇R°^X) を表しても良い。 また、 R^6aと R^Gbが一緒になつてスピ 口ォキシラン環またはェキソメチレンを表しても良い。 さらに、 R^6aと R^6bのど ちらか一方と R^7aと R^7bのどちらか一方が一緒になつて 1， 3—ジォキソラン環 を形成しても良い。 式 (I)において、 Gは、 次の〖1]〜〖3]のいずれかを表す。

[1]

式 (G-l)中、 尺¹⁶³ぉょび!¾¹⁶¹⁵は、 それぞれ独立して、 同一または異なって水 素、 メチルまたはヒドロキシを表す。

式 (G-I)中、 R^17a、 R^17b、 R^18a、 R^18b、 R^19a、 R^{19 b}、 R²。^a、 R^{20 b}、 2¹³ぉょび1^²¹¹¹は、それぞれ独立して、 同一または異なって次の（1)〜 （6) のいずれかを表す。

(1) 水素、

(2) 置換基を有していても良いメチル、

(3) — OR^H、

(4) 一 OR^D、

(5) ハロゲンまたは (6) 一 R^M— NR^N1R^N2。

式 (G-l)中、 R^{21 c}は次の （1) または （2) を表す。

(1) 水素または

_R22b _

(2) R^22a (式中、 R^22a、 ^221]ぉょび1^²²。は、 それぞれ独立して、 同一または異なって、

(a)水素、

(b)メチル、

(c)ヒドロキシ、

(d) _〇RH、

(e)—〇R^D、

(f) _R^M— NR^N1 R^N2または

(g)ハロゲンを意味する） 。

式 (G-I)において、 さらに、 R^18aまたは R^18bのどちらか一方と R¹

9^bのどちらか一方が一緒になつて単結合を形成し、 部分構造

か、 または酸素と結合して部分構造

しても良い。

式 (G-I)において、 さらに、 R^19aまたは R^19bのどちらか一方と R^2Qaまたは R

^2Qbのどちらか一方が一緒になつて単結合を形成し、

を表 しても良い。

式 (G-I)において、 さらに、 R^21aと R^{21 b}が一緒になつて (a)ケトン構造 （ =〇） を表すかまたは (b)ォキシム構造 （ = N〇R。^X) を表しても良い。

式 (G-I)において、 さらに、 R^{21 a}または R^{21 b}のどちらか一方と R^22aまたは R ^22bのどちらか一方が一緒になつて部分構造 (^{R 3}°^r

を表 しても良い。

式 (G-I)において、 さらに、 R^19aまたは R^19bのどちらか一方と R^{21 a}または R

^{2 lb}のどちらか一方が一緒になつ

して も良い。

[2]

式 （G-ll) において、 R^16a、 R^16b、 R^17a、 R^17b、 R^18aおよび R^18bは式 (G—り中の定義と同義である。

式 （G-II) において、 R^18cは次の （1) または （2) を表す。

(1) 水素または

(2)

(式中、 R^i3a、 R^f3b、 R^f4aおよび R^f4bは、 それ ぞれ独立して、 同一または異なって、 水素、 メチル、 ヒドロキシ、 メトキシまた はァセトキシを表し、 R^f5はメチルまたはェチルを表す） 。

[3]

おいて、 R^16a、 R^{16 b}、 R^{17 a}および R^17bは式 (G— l)中の定義 と同義である。

式 （G-III) において、 R^{17 c}は次の （1) または （2) を表す。

( 1) 水素または

(2) 式

（式中、 R^{i 3 a}、 R^{f 3 b}、 R^{f 4 a}および R^{f 4 b}は、 それぞれ独立して、 同一または異なって、 水素、 メチル、 ヒドロキシ、 メトキシ またはァセトキシを表し、 R^{f 5}はメチルまたはェチルを表す） 。 ここで、 本明細書において用いる 「じ アルキル」 とは、 炭素数が 1〜2 2 個の直鎖もしくは分枝状アルキル基またはシクロアルキル基を示し、 例えばメチ ル基、 ェチル基、 n—プロピル基、 i s o _プロピル基、 n—ブチル基、 i s o —プチル基、 s e c—ブチル基、 t e r t—ブチル基、 n—ペンチル基、 1， 1 —ジメチルプロピル基、 1 , 2—ジメチルプロピル基、 2, 2—ジメチルプロピ ル基、 1一ェチルプロピル基、 n—へキシル基、 1ーェチルー 2—メチルプロピ ル基、 1 , 1 , 2—トリメチルプロピル基、 1 _プロピルプロピル基、 1—メチ ルブチル基、 2—メチルブチル基、 1 , 1ージメチルブチル基、 1， 2—ジメチ ルブチル基、 2 , 2—ジメチルブチル基、 1 , 3—ジメチルブチル基、 2， 3— ジメチルブチル基、 2 _ェチルブチル基、 2—メチルペンチル基、 3—メチルぺ ンチル基、 n—へプチル基、 n—ォクチル基、 n—ノニル基、 η—デシル基、 シ クロプロピル基、 シクロブチル基、 シクロペンチル基、 シクロへキシル基等があ げられ、 好ましくは炭素数が 1〜 6個の直鎖もしくは分枝状アルキル基またはシ クロアルキル基を示し、 例えばメチル基、 ェチル基、 η—プロピル基、 i s o_ プロピル基、 n—ブチル基、 i s o—ブチル基、 s e c—ブチル基、 t e r t _ ブチル基、 n—ペンチル基等が挙げられ、 中でも例えばメチル基、 ェチル基、 プ 口ピル基、 i s o—プロピル基、 n—ブチル基、 i s o—ブチル基、 t e r t— ブチル基、 シクロプロピル基、 シクロブチル基、 シクロペンチル基、 シクロへキ シル基等が好ましい。

本明細書において用いる 「不飽和 C₃_₂₂アルキル」 とは、 炭素数 3〜2 2個の 直鎖または分枝状アルケニル基、 あるいは炭素数が 3〜 2 2個の直鎖または分枝 状アルキニル基を示し、例えばァリル基、 1 一プロぺニル基、イソプロぺニル基、 2—メチルー 1 一プロぺニル基、 2—メチルー 2 _プロぺニル基、 1ーブテニル 基、 2—ブテニル基、 3 _ブテニル基、 1 一ペンテニル基、 1—へキセニル基、 1， 3—へキサンジェニル基、 1， 5—へキサンジェニル基、 1 _プロピニル基、 2 _プロピニル基、 1—プチニル基、 2—プチ二ル基、 3—プチニル基、 1ーェ チニルー 2—プロピニル基、 2—メチルー 3—プチピニル基、 1 一ペンチニル基、 1一へキシニル基、 1， 3—へキサンジインィル基、 1， 5—へキサンジインィ ル基等が挙げられ、 好ましくは炭素数 3〜1 0個の直鎖または分枝状アルケニル 基あるいは炭素数が 3〜 1 0個の直鎖または分枝状アルキニル基を示し、 例えば ァリル基、 1 _プロぺニル基、 2—プロぺニル基、 イソプロぺニル基、 3—メチ ル—2—ブテニル基、 3 , 7—ジメチルー 2， 6—ォク夕ジェニル基、 1 _プロ ピニル基、 2—プロピニル基、 1—プチ二ル基、 2—プチ二ル基、 3—ブチニル 基、 3—メチル _ 1一プロピニル基等である。

本明細書において用いる 「 ^ 2アルコキシ」 とは、 前記定義の 「 ^ 2ァ ルキル」 において、 その末端に酸素原子が結合した基を意味し、 好適な基として は、例えばメトキシ基、エトキシ基、 n—プロポキシ基、 i s o—プロポキシ基、 n—フ卜十シ 、 i s o—ブ キシ基、 s e c—フ卜キシ基、 t e r t—フ 卜十 シ基、 n—ペンチルォキシ基、 i s o—ペンチルォキシ基、 s e c—ペンチルォ キシ基、 n—へキソキシ基、 i s o—へキソキシ基、 1， 1—ジメチルプロピル ォキシ基、 1， 2—ジメチルプロポキシ基、 2， 2—ジメチルプロピルォキシ基、 1ーメチルー 2—ェチルプロポキシ基、 1—エヂルー 2—メチルプロポキシ基、 1 , 1 , 2—トリメチルプロポキシ基、 1， 2， 2—トリメチルプロポキシ基、 1， 1ージメチルブトキシ基、 1， 2—ジメチルブトキシ基、 2， 2—ジメチル ブトキシ基、 2， 3—ジメチルブチルォキシ基、 1， 3—ジメチルブトキシ基、 2 _ェチルブトキシ基、 2—メチルペントキシ基、 3—メチルペントキシ基、 へ キシルォキシ基等があげられ、 好ましくは例えばメトキシ基、 エトキシ基、 n— プロポキシ基、 i s o—プロポキシ基、 i s o—ブトキシ基、 2， 2—ジメチル プロピルォキシ基等である。 本明細書において用いる 「不飽和 c ₂ _ _{2 2}アルコキシ」 とは、 前記定義の 「不飽 和 c ₃— _{2 2}アルキル」 、 ビニルおよびェチルにおいて、 その末端に酸素原子が結合 した基を意味する。 好適な基としては、 例えばビニロキシ基、 ァリロキシ基、 1 一プロぺニルォキシ基、 2—プロぺニルォキシ基、 イソプロぺニルォキシ基、 2 ーメチルー 1—プロぺニルォキシ基、 2—メチルー 2—プロぺニルォキシ基、 1 ーブテニルォキシ基、 2 _ブテニルォキシ基、 3—ブテニルォキシ基、 1一ペン テニルォキシ基、 1一へキセニルォキシ基、 1， 3—へキサンジェニルォキシ基、 1 , 5—へキサンジェニルォキシ基、 プロパルギルォキシ基、 2—プチ二ルォキ シ基等が挙げられ、 好ましくは例えばァリロキシ基、 プロパルギルォキシ基、 2 一プチニルォキシ基等である。

本明細書において用いる 「C ₆ - _{1 4}ァリール」 とは、 6〜 1 4個の炭素原子で構 成された芳香族炭化水素環式基を意味し、 単環式基、 二環式基、 三環式基等の縮 合環も含まれる。 例えばフエニル基、 インデニル基、 1一ナフチル基、 2—ナフ チル基、 ァズレニル基、 ヘプ夕レニル基、 インダセニル基、 ァセナフチル基、 フ ルォレニル基、 フエナレニル基、 フエナントレニル基、 アントラセニル基等があ げられ、 好ましくは例えばフエニル基、 1—ナフチル基、 2—ナフチル基等であ る。

本明細書における 「5員環〜 1 4員環へテロァリール」 とは、 窒素原子、 硫黄 原子および酸素原子からなる群より選ばれる複素原子を 1個以上含んでなる単環 式、 二環式または三環式の 5〜 1 4員芳香族複素環式基をいう。 好適な例をあげ ると、 含窒素芳香族複素環式基としては、 例えばピロリル基、 ピリジル基、 ピリ ダジニル基、 ピリミジニル基、 ビラジニル基、 トリァゾリル基、テトラゾリル基、 ベンゾトリアゾリル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、ベンツイミダゾリル基、 インドリル基、 イソインドリル基、 インドリジニル基、 プリニル基、 インダゾリ ル基、 キノリル基、 イソキノリル基、 キノリジル基、 フタラジル基、 ナフチリジ ニル基、 キノキサリル基、 キナゾリニル基、 シンノリニル基、 プテリジニル基、 イミダゾトリアジニル基、 ビラジノピリダジニル基、 ァクリジニル基、 フエナン トリジニル基、 カルバゾリル基、 力ルバゾリニル基、 ペリミジニル基、 フエナン トロリニル基、 フエナシニル基、 イミダゾピリジニル基、 イミダゾピリミジニル 基、 ピラゾ口ピリジニル基、 ピラゾ口ピリジニル基等；含硫黄芳香族複素環式基 としては、 例えばチェニル基、 ベンゾチェ二ル基等；含酸素芳香族複素環式基と しては、 例えばフリル基、 ビラ二ル基、 シクロペン夕ビラ二ル基、 ベンゾフリル 基、 イソべンゾフリル基等； 2個以上の異種複素原子を含んでなる芳香族複素環 式基としては、 例えばチアゾリル基、 イソチアゾリル基、 ベンゾチアゾリル基、 ベンズチアジアゾリル基、 フエノチアジニル基、 イソキサゾリル基、 フラザニル 基、 フエノキサジニル基、 ォキサゾリル基、 イソキサゾィル基、 ベンゾォキサゾ リル基、ォキサジァゾリル基、 ピラゾロォキサゾリル基、ィミダゾチアゾリル基、 チェノフラニル基、 フロピロリル基、 ピリドォキサジニル基等があげられ、 好ま しくは、 例えばチェニル基、 フリル基、 ピリジル基、 ピリダジル基、 ピリミジル 基、 ビラジル基等である。

本明細書において用いる 「C ₆ _ _{1 4}ァリールォキシ」 とは、 前記定義の C e ^ ₄ァリール」 において、 その末端に酸素原子が結合した基を意味し、 具体的には、 例えばフエニルォキシ基、 インデニルォキシ基、 1一ナフチルォキシ基、 2—ナ フチルォキシ基、 ァズレニルォキシ基、 ヘプ夕レニルォキシ基、 インダセニルォ キシ基、ァセナフチルォキシ基、フルォレニルォキシ基、フエナレニルォキシ基、 フエナントレニルォキシ基、 アントラセニルォキシ基等が挙げられ、 好ましくは 例えばフエニルォキシ基、 1一ナフチルォキシ基、. 2—ナフチルォキシ基等であ る。

本明細書において用いる 「5員環〜 1 4員環へテロァリールォキシ」 とは、 前 記定義の 「5員環〜 1 4員環へテロァリール」 において、 その末端に酸素原子が 結合した基を意味し、具体的には、例えばピロリルォキシ基、 ピリジルォキシ基、 ピリダジニルォキシ基、 ピリミジニルォキシ基、 ビラジニルォキシ基、 卜リアゾ リルォキシ基、 テトラゾリルォキシ基、 ベンゾトリアゾリルォキシ基、 ビラゾリ ルォキシ基、 イミダゾリルォキシ基、 ベンツイミダゾリルォキシ基、 インドリル ォキシ基、 イソインドリルォキシ基、 インドリジニルォキシ基、 プリニルォキシ 基、 インダゾリルォキシ基、 キノリルォキシ基、 イソキノリルォキシ基、 キノリ ジルォキシ基、 フタラジルォキシ基、 ナフチリジニルォキシ基、 キノキサリルォ キシ基、キナゾリニルォキシ基、シンノリニルォキシ基、プテリジニルォキシ基、 イミダゾトリアジニルォキシ基、 ビラジノピリダジニルォキシ基、 ァクリジニル ォキシ基、 フエナントリジニルォキシ基、 カルバゾリルォキシ基、 力ルバゾリ二 ルォキシ基、 ペリミジニルォキシ基、 フエナント口リニルォキシ基、 フエナシニ ルォキシ基、 イミダゾピリジニルォキシ基、 イミダゾピリミジニルォキシ基、 ピ ラゾロピリジニルォキシ基、 ピラゾ口ピリジニルォキシ基、 チェニルォキシ基、 ベンゾチェ二ルォキシ基、 フリルォキシ基、 ビラニルォキシ基、 シクロペン夕ピ ラニルォキシ基、 ベンゾフリルォキシ基、 イソべンゾフリルォキシ基、 チアゾリ ルォキシ基、 イソチアゾリルォキシ基、 ベンゾチアゾリルォキシ基、 ベンズチア ジァゾリルォキシ基、 フエノチアジニルォキシ基、 イソキサゾリルォキシ基、 フ ラザニルォキシ基、 フエノキサジニルォキシ基、 ォキサゾリルォキシ基、 イソキ サゾィルォキシ基、 ベンゾォキサゾリルォキシ基、 ォキサジァゾリルォキシ基、 ビラゾロォキサゾリルォキシ基、 イミダゾチアゾリルォキシ基、 チェノフラニル ォキシ基、 フロピロリルォキシ基、 ピリ ドォキサジニルォキシ基等があげられ、 好ましくは、例えばチェニルォキシ基、 ピリジルォキシ基、 ピリミジルォキシ基、 ビラジルォキシ基等である。

本明細書において用いる 「C₂ - ₂₂ァシル」 とは、 炭素数が 2〜22個からなる ァシル基を示し、 好適な基としてはァセチル基、 プロピオニル基、 プチリル基、 i s o—プチリル基、 バレリル基、 i s o バレリル基、 ビバリル基、 カブロイ ル基、 デカノィル基、 ラウロイル基、 ミリストイル基、 パルミ トイル基、 ステア ロイル基、 ァラキドイル基、 等の直鎖または分枝状ァシル基があげられる。 また本明細書において用いる 「c₂_₂₂ァシロキシ」 は 「c_{2 22}ァシル」 に対 応する部分構造を有する基である。

本明細書において用いる 「不飽和 C₃_₂₂7シル」 とは、 炭素数が 3〜22個か らなり二重結合または三重結合を有するァシル基を示し、 好適な基としてはァク リル基、 プロピオル基、 クロトニル基、 i s o—クロトニル基、 ォレイノル基、 リノレノィル基、 等の直鎖または分枝状ァシル基があげられる。

また本明細書において用いる 「C_{3 22}不飽和ァシロキシ」 は 「C₃_₂₂不飽和 ァシル」 に対応する部分構造を有する基である。

本明細書において用いる 「0^22アルキルスルホニル」 とは、 前記定義の 「C ₂₂アルキル」 が結合したスルホニルを意味し、 具体的には、 例えばメチルスル ホニル基、 ェチルスルホニル基、 n—プロピルスルホニル基、 i s o—プロピル スルホニル基等が挙げられ、 好ましくは例えばメチルスルホニル基等である。 本明細書において用いる 「Ci ₂₂アルキルスルホニルォキシ」 とは、 前記定義 の 「C卜 ₂₂アルキルスルホニル」 において、 その末端に酸素原子が結合した基を 意味し、 例えばメチルスルホニルォキシ基、 ェチルスルホニルォキシ基、 n—プ 口ピルスルホニルォキシ基、 i s o _プロピルスルホニルォキシ基等が挙げられ、 好ましくは例えばメチルスルホニルォキシ基等である。

本明細書において用いる 「3員環〜 14員環の含窒素非芳香族複素」 とは、 窒 素原子 1つの他に、 窒素原子、 硫黄原子および酸素原子からなる群から選ばれる 複素原子をさらに 1個以上含んでいても良い単環式、 二環式または三環式の 3乃 至 14員非芳香族複素環式基をいう。 好適な例をあげると、 アジリジニル基、 ァ セチジル基、 ピロリジニル基、 ピロリル基、 ピペリジニル基、 ピペラジニル基、 イミダゾリル基、 ビラゾリジル基、 イミダゾリジル基、 モルホリル基、 チオモル ホリル基、 イミダゾリニル基、 ォキサゾリニル基、 等があげられる。 また、 当該 非芳香族複素環式基には、 ピリドン環から誘導される基や、 非芳香族性の縮合環 (例えばフ夕ルイミド環、スクシンイミド環、等から誘導される基）も含まれる。 本明細書において用いる 「置換基を有していても良い」 の置換基とは、 アルキル基、 C₂_₈アルケニル基 （例えばビニル基） 、 C₂-₈アルキニル基 （例 えばェチニル基） 、 C₆— ₁₄ァリール基 （例えば、 フエニル基、 等） 、 5乃至 14 員へテロァリール基 （例えば、 チェニル基、 フリル基、 ピリジル基、 ピリダジル 基、 ピリミジル基、 ビラジル基、 等） 、 水酸基、 ₈アルコキシ基、 ₈ァ シル基、 C₂-₈ァシロキシ基、 c_{2 8}アルケニルォキシカルボニル基、 c₂_₈アル キニルォキシカルボニル基、 C ₈アルコキシカルボニル基、 ハロゲン原子、 ヒ ドロキシカルボニル基、 チオール基、 アルキルチオ基、 C 1— 8アルキル スルホキサイド基、 C 1一 8アルキルスルホニル基、 C uアルキルスルホニル ォキシ基、 ヒドロキシスルホニル基、 二トリル基、 ニトロ基、 ニトロソ基、 アミ ノ基、 、 N— C卜₈アルキルアミノ基、 N， N—ジ C ₈アルキルアミノ基、 N 一 C₂— ₈ァルケニルァミノ基、 N, N—ジじ₂一 ₈アルケニルァミノ基、 N_C₂- ₈アルキニルァミノ基、 N, N—ジ C₂_₈アルキニルァミノ基、 N—ァリールアミ ノ基 （例えば、 フエニルァミノ基） 、 N_ヘテロァリールアミノ基 （例えば 2— ピリジルァミノ基、 3—ピリジルァミノ基、 1一ピロィルァミノ基、 等） 、 N— Ci-sアルキル一 N—ァリールアミノ基、 N— Ci— sアルキル一 N—へテロァリ —ルァミノ基、 ァラルキルォキシ基、 ヘテロァリールォキシ基、 C^₈アルキル スルホニルァミノ基、 c₂_₈アルケニルスルホニルァミノ基、 c₂— ₈アルキニル スルホニルァミノ基、 N— C i— 8アルキル力ルバモイル基、 N— ₈アルキル 力ルバモイル基、 N_C₂_₈アルケニルカルバモイル基、 N， N—ジC₂-₈アル キニルカルバモイル基、 C₂-₈ァシルァミノ基、 等から選ばれる 1個以上の基が あげられる。 以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例に限定されるものではない。

尚、 以下の実施例において、 プラジェノライド A、 B、 Dおよび E7107は次の 化合物である。

プラジェノライド A

プラジェノライド B

プラジェノライド D

本発明の標識化合物は、 以下に記載の方法により合成した。

実施例 A 1

(8 1 2 E. 1 4 Ξ) - 7 -、N—「G- ³ Hiェチルカルバモイルォキシ）一 3. 6. 2 1 —トリヒドロキシ一 6. 1 0. Ί 2. 1 6. 2 0 _ペンタスチル一 1 8. 1 9—エポキシトリコサー 8. 1 2. 1 4—トリェンー 1 1—オリド

( 1 ) (R . 1 2 E. 1 4 ^) _ 7— ( —〖 -³?^ェチルカルバモィルォキシ) 一 3. 6. 2 1—トリ （ 1 一エトキシエトキシ） 一 6. 1 0. ΐ 2. ΐ 6. 20 一ペンタ チルー 1 8. 1 9—エポキシトリコサー 8. 1 2. 1 4—トリェン一 1 1—オリ ド

特許文献 （WO 0 2/0 6 0 8 9 0) の実施例 Β 44に記載された （8 Ε， 1 2 E, 1 4 Ε) 一 3, 6, 2 1—トリ （1—エトキシエトキシ） 一 6， 1 0, 1 2, 1 6， 2 0—ペン夕メチルー 7— （4 _ニトロフエノキシ） カルボキシ一 1 8， 1 9 _エポキシ卜リコサー 8， 1 2, 1 4—トリェンー 1 1 _オリド （ 1 5mg) を無水 THF ( 1. 5mL) に溶解した。 反応溶液に [G— ³ H]ェチル ァミン （8. 7 C i ) を蒸留し、 滴下した。 反応溶液を室温にて 24時間攪拌し た後、 溶媒を減圧留去し、 残渣を少量の酢酸ェチルに溶解した （収量 6 8 0m C i )oシリカゲル HP L C (溶出溶媒 η—へキサン：酢酸ェチル = 1 : 4 - 1 : 1) により精製し、 表記化合物を得た （収量 1 1 3mC i )。

( 2 ) ( E. 1 2 E. 1 4 ） — 7— (7V— [G- ³H1ェチルカルバモイルォキシ） - 3. 6. 2 1—トリヒドロキシー 6. 1 0. 1 2. ΐ 6. 2 0—ペンタ チル - 1 8. 1 9—エポキシトリコサ一 8. 1 2. 1 4—トリェン一 1 1—オリ ド

(8 Ε, 1 2 Ε, 1 4 Ε) — 7— (TV— [G-³H]ェチルカルバモイルォキシ）― 3， 6， 2 1—トリ （1一エトキシエトキシ） 一 6， 1 0， 1 2, 1 6， 2 0— ペン夕メチル— 1 8, 1 9 _エポキシトリコサ— 8， 1 2, 1 4—トリェン _ 1 1—オリド（ 1 1 3mC i )およびピリジニゥム p—トルエンスルホン酸（ 0. 7 5mg) をメタノール （lmL) に溶解し、 反応液を室温にて 4. 5時間攪拌 した。 反応溶液を窒素気流下にて溶媒を蒸発させた後、 得られた残渣を酢酸ェチ ルに溶解した。この溶液をシリカゲルショートカラムに通し、粗精製物を得た（1 0 5mC i )。

得られた粗精製物をシリカゲル HPL C (溶出溶媒 n—へキサン： 2—プロ パノール = 6 ： 4) により精製した。 目的物フラクションをあわせ溶媒を留去、 乾固したのち、 エタノールに溶解した （1 0 5mC i )。 lmC i /m 1ェタノ一 ル溶液とし、 保管した。 TOF-MS m/z 590, 592 (ma i n p e a k), 594 (M + N a) +

Ra d i o c h em i c a l pu r i t y : 97. 0% (b y HPLC)、 9 7 % (b y TL C)

S p e c i f i c a c t i v i t y: 56 C i /mm o 1 (b y Ma s s S p e c t r o s c o py) 実施例 A 2

7— (TV- (2 - (2— (2 - (TV- (5— (5, 5—ジフルオロー 7， 9—ジ メチル— 5 //—ジピロ口「 1 , 2— c : 2，， 1， - 1 f 1 , 3， 2 ジァザボリ二 ンー 4一^ Γゥム _ 5—ウィドー 3—ィル） ペンタノィル） ァミノ） エトキシ） ェ トキシ） ェチル） 力ルバモイルォキシ） 一 3， 6， 2 1—トリヒドロキシ _ 6， 1 0， 1 2， 1 6,— 20—ペン夕メチル _ 1—8， 19 _エポキシトリコサ一 8 ,.

1 2， 14一トリェン一 1 1一オリ ド

( 1) (8 E, 1 2 E, 14 £") — 7— （TV— (2— （2— （2—アミノエトキシ) エトキシ） ェチル） 力ルバモイルォキシ） — 3.— 2 1—トリス （1ーェトキ シエトキシ） 一 6, 1 0, 1 2, 1 6, 2 0 _ペン夕メチルー 1 8， 1 9ーェポ キシトリコサー 8， 1 2, 1 4 _トリェンー 1 1—オリド

1 , 8—ジアミノー 3, 6—ジォキサオクタン （ 1 2 7mg, 0. 8 5mmo 1 ) を THF (5mL) に溶解し、 ここに、 特許文献 （WO 0 2/0 6 0 8 9 0) の実施例 B 44に記載された （8 E， 1 2 E, 1 4 E) — 3， 6， 2 1—ト リ （1一エトキシエトキシ） 一 6, 1 0， 1 2, 1 6， 2 0—ペン夕メチルー 7 一 （4一二トロフエノキシ） カルボキシ— 1 8， 1 9一エポキシトリコサー 8， 1 2， 1 4—トリェン一 1 1一オリド （1 5 0mg， 0. 1 7mmo 1 ) の TH F ( 1 5mL)溶解した溶液を滴下した。反応溶液を室温にて 3時間攪拌した後、 溶媒を減圧留去した。 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （F u j i S i l y s i a, NH s i l i c a g e l , CH₂C 1 ₂ : Me OH= 1 0 ： 1) にて精製し、 表記化合物 （0. 1 0 g、 6 6 %) を淡黄色油状 物として得た。

^ゝノ

1

E S I -MS m/z 8 8 5 (M + H) +.

(2) 7——(T ——（2——(2—— (2 _ (N- (5— (5 5—ジフルォロ一 7

9—ジメチル _ 5 —ジピロ口 ， 2 - c 2 ' , 1 ' _ /1『1 , 3, 21ジァザ ボリニン一 4一ィゥム— 5—ウィドー 3—ィル） ペンタノィル） ァミノ） ェトキ シ） エトキシ） ェチル） 力ルバモイルォキシ） 一 3， 6， 2 1 -トリ （1一エト キシエトキシ） 一 6， 1 0, 1 2， 1 6， 2 0—ペン夕メチルー 1 8, 1 9—ェ ポキシトリコサ— 8， 1 2， 1 4一トリェンー 1 1—オリド

(8 E, 1 2 E, 1 4 E) — 7— （TV— (2— ミノエトキシ） エトキシ） ェチル） 力ルバモイルォキシ） 一 3, 6， 2 1—卜リス （1ーェトキ シェトキシ） 一 6， 1 0， 1 2， 1 6， 2 0—ペン夕メチル— 1 8 , 1 9—ェポ キシトリコサー 8， 1 2， 1 4一トリェンー 1 1—オリ ド （ 1 0. 6mg, 1 2 mo l ) および 4， 4ージフルオロー 5, 7—ジメチル— 4—ボラ一 3 a, 4 a—ジァザ— s—インダセン一 3 _ペンタン酸 コハク酸イミドエステル （Mo l e c u l a r P r o b e s ： 5mg， 1 2 ,amo 1 ) を THF (3mL) に 溶解し、 反応液を室温にて 1 2時間攪拌した。 溶媒を減圧留去し、 得られた残渣 をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （Kan t o c h em i c a l , s p h e r i c a l , n e u r t a 1 , CH₂C 1₂ ： MeOH= 1 0 : 1) にて精製 し、 表記化合物 （1 3. lmg, 92%) をオレンジ色油状物として得た。

ES I— MS m/z 1 2 1 0 (M + N a) ⁺.

(3) 7— (N- (2 - (2 - (2 - (TV— (5一 （5, 6―ジフルオロー 7，

9一ジメチルー 5 //—ジピロロ f 1 , 2 - c ： 2 ' , 1， _ f]\ 1， 3， 2レジァザ ボリニン一 4一ィゥム一 5—ウイドー 3—ィル） ペンタノィル ') ァミノ） ェ卜キ シ） エトキシ） ェチル） 力ルバモイルォキシ） 一 3, 6, 2 1一トリヒドロキシ 一 6, 1 0， 1 2， 1 6， 20—ペン夕メチルー 1 8, 1 9 -エポキシトリコサ

— 8, 1 2, 14—トリェンー 1 1—オリド

7 - (TV— (2— （2— (2 - (7V- (5— （5， 5—ジフルォロ— 7， 9—ジ メチルー 5 //—ジピロ口 [1， 2— c : 2，， 1， - /][ 1 , 3， 2】ジァザボリ二 ン一 4一ィゥム _ 5—ウィドー 3—ィル） ペンタノィル） ァミノ） エトキシ） ェ トキシ） ェチル） 力ルバモイルォキシ） —3, 6, 2 1—トリ （1 _エトキシェ トキシ） _ 6， 1 0， 1 2, 16， 20—ペン夕メチル一 1 8， 1 9—エポキシ 卜リコサー 8， 1 2， 14一トリェン _ 1 1—オリド （ 1 3mg， 1 1 ^mo 1 ) メタノール （4mL) およびピリジニゥム p—トルエンスルホン酸 （2mg, 8 mo 1 ) をメタノール （4mL) に溶解し、 反応液を室温にて 24時間攪拌 した。 溶媒を減圧留去した後、 残渣を酢酸ェチルに溶解し、 蒸留水、 炭酸水素ナ 卜リゥム水溶液および食塩水にて順次洗浄した。 有機層を硫酸マグネシウムで乾 燥し、 溶媒を留去し、 得られた残渣をプレパラティブ TL C (Me r c k A r t 1 05628, CH₂C 1₂: Me OH二 1 0 : 1)にて精製し，表記化合物（ 9. 3mg, 87 %) をオレンジ色固体として得た。 一 NMR S p e c t r um (CD₃OD, 600 MHz) d (p pm) ： 0 9 1 (3 H, d， J =6. 8 Hz), 0. 94 (3 H, d, J = 7. 0 Hz ), 0. 9 8 (3 H， t , J = 7. 5Hz)， 1. 1 2 (3 H, d， J =6. 8 Hz ), 1. 1 8 - 1. 2 0 (4H， m)， 1. 3 0— 1. 7 0 (8 H, m) , 1. 7 2 - 1. 84 (7 H, m), 2. 2 8 - 2. 34 (oH, m)， 2. 4 6 - 2. 64 ( 7 H， m), 2. 6 9 (1 H, d d, J = 2. 1 , 8. 1 Hz), 2. 7 6 ( 1 H, d t , J d = 2. 4Hz , J t = 6. 0Hz), 2. 8 2 (2 H, b r)， 2. 9 8 (2 H， t， J = 7. 3 Hz), 3. 3 2 ( 1 H, t , J = δ. 5Hz ), 3. 3 8— 3. 42 (2 H, m)， 3. 5 2 - 3. 6 0 (5H, m), 3. 6 2 (4H, s)， 3. 7 8 - 3. 84 ( 1 H， m)， 4. 94 ( 1 H， d， J = 9. 0 H z ), 5. 0 7 ( 1 H， d， J = 1 0. 7 H z ), 5. 5 9 ( 1 H， d d， J = 1 0. 0， 1

5. 2Hz), 5. 6 9 ( 1 H, d d， 8. 4， 1 5. 1 Hz ), 5. 7 4 ( 1 H, d d， J = 1 0. 0， 1 5. 1 H z ), 6. 1 2 ( 1 H, d, J = 1 1. 1 Hz),

6. 23 ( 1 H, s)， 6. 3 5 ( 1 H， d d , J = 1 0. 9， 1 5. 2 Hz), 6. 40 ( 1 H, d, 4. 1 Hz ), 7. 0 7 ( 1 H， d, J = 3. 8 H z ), 7. 4 5 ( 1 H, s ) ; E S I -MS m/ z 9 9 3 (M + N a) +. 実施例 A 3

(8 E._ 1 2 E 4 E) 一 3. 6, 2 1—トリヒドロキシー 6， 1 0,— 1 2

1 6， 2 0—ペン夕メチルー 7— (N- (2 - (2 - (2— (TV— (5— ((3 a RA R,6 a S) 一 2—ォキソへキサヒドロ— 1 /—チエノ ί 3 , 4— οΠイミダゾ ール一 4一ィル） ペンタノィル） ァミノ） エトキシ） エトキシ） ェチル） 力ルバ モイルォキシ).—一 1 8，― 1 9—エポキシトリコサ— 8.— 1— 2， 1 4——トリエンー

1一オリ ド

実施例 A 2と同様の方法にて、 1 , 8—ジァミノ— 3， 6—ジォキサオクタン に代えて、 N— （ + ) —ピオチニル _ 1， 8—ジァミノ一 3， 6—ジォキサォク タン（P i e r c e : B i o t i n P EO— Am i n e )を用いることにより、 表記化合物 （8mg) を無色油状物として得た。

- NMR S p e c t r urn (CD ₃OD, 500MHz) δ (P pm) ： 0.

89 (3H， d, J = 5. 5Hz)， 0. 9 1 (3 H, d， J = ： 7. 0Hz), 0.

94 (3H， t , J = 7. 5 H z ), 1. 09 (3 H, d， J = :6. 8 Hz )， 1.

16一 1. 26 (4H, m), 1. 27一 1. 80 ( 1 7 H, m) .■ , 2. 22 (2

H, t , J = 7. 3Hz), 2. 42- 2. 64 (4 H, m)， 2, . 66 (1 H， d d , J = 2. 2, 8. 1 H z ) 2. 6 8 - 2. 76 (2 H, m) , 2. 93 (1

H, dd， J =4. 6， 1 2. 9Hz)， 2. 98 - 3. 25 ( 1 H, m)， 3. 28 -3. 34 (2 H, m, c o v e r d w i t h CD 3 OD), 3. 36 (2 H, t , J = 5. 6Hz), 3. 49 - 3. 58 (5 H, m), 3. 62 (4 H, s)， 3. 75— 3. 82 ( 1 H, m), 4. 3 1 ( 1 H， d d， J =4. 4， 7. 8Hz), 4. 49 ( 1 H， d d， J =4. 9， 7. 8 H z ), 4. 90 ( 1 H, d， J = 9. 8Hz)， 5. 05 ( 1 H, d， J = 1 0. 7 H z ), 5. 56 ( 1 H, d d, J = 9. 5， 1 5. 4Hz), 5. 63 - 5. 78 (2 H, m)， 6. 09 ( 1 H, d, J = 1 0. 7Hz), 6. 32 ( 1 H, d d， J = 1 1. 0， 9， 1 5. 1 H z ) ; E S I -MS m/ z 9 1 7 (M + N a) ⁺， 929 (M + C 1 ) 一 実施例 A 4

N— ( (1 ) _ 5—ァミノ一 1— (メチル （2— （メチル （5— ((3 a 7?, 4 W， 6 a 5) _ 2—ォキソへキサヒドロー 1 ーチエノ [3， 4ー ] イミダゾ 一ルー 4一ィル） ペンタノィル） ァミノ） ェチル） 力ルバモイル） ペンチル） 一 4 - (3— _ (トリフルォロメチル） —3//—ジアジレン一 3—ィル） ベンズアミ

( 1 ) ベンジル = (( 1 S) 一 5— （（terf—ブトキシカルボニル） ァミノ） 一 1一 (メチル （2— （メチルァミノ） ェチル） 力ルバモイル） ペンチル） 力ルバマー 上

1， 4ージメチルエチレンジァミン （0. 8 8 g， 1 Ommo 1 ) を THF ( 1 OmL) に溶解し、 室温攪拌しつつ市販の Z—Ly s (B〇C) 一 ONP ( 1 g, 2mmo 1 )を数回に分けて加えたのち、反応溶液を室温にて 1 2時間攪拌した。 溶媒を留去し、 残渣を酢酸ェチルにて油水分配した。 有機層をさらに蒸留水およ び食塩水で順次洗浄した後、 硫酸マグネシウムで乾燥し、 溶媒を留去した。 得ら れた残渣をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィ一 （F u j i S i 1 y s i a, NH s i l i c a g e l , A c〇 E t : M e OH= 1 0 : 1 ) にて精製し、 表記化合物 （9 0 0mg， q u a n t .) を無色油状物として得た。 ^JH-NMR S p e c t r urn (CD₃C 1₃, 400MHz) δ ( p p m) : 1.

30 - 1. 78 ( 1 δ H, m), 2. 38 - 2. 48 (3 H， m)， 2. 68 - 2. 88 (2H， m)， 2. 96 ( 1 H, s), 3. 00-3. 1 6 (4H, b r一 m)， 3. 32 - 3. 60 (2 H, m), 4. 58 -4. 76 (2H, m) , 5. 09 (3 H, s), 5. 60 (1 H, d, J = 8. 8Hz), 5. 70 ( 1 H， d, J = 8. 0Hz), 7. 28 - 7. 40 ( δ H, m) ; E S I— MS m/ z 473 (M + N a) +.

(2) ベンジル = (( 1 ) - 5 - ((te —ブトキシカルポニル） ァミノ） 一 1一 (メチル （2— （メチル （5— ((3 a R R,6 a 5) 一 2—ォキソへキサヒド ロー 1//ーチエノ [3， 4- d] イミダゾール一4—ィル） ペンタノィル） アミ ノ） ェチル） 力ルバモイル） ペンチル） 力ルバマート

上記 （1) の生成物 （0. 9 g， 2mmo 1 ) を THF— DMF (2 OmL- 1 OmL)に溶解し、室温攪拌下にピオチン N—ヒドロキシスクシンィミド（0. 7 g, 2mmo 1 )を数回に分けて加えた。反応溶液を室温で 1 2時間攪拌した。 溶媒を留去し、 残渣を酢酸ェチルにて油水分配した。 有機層をさらに蒸留水およ び食塩水で順次洗浄した後、 硫酸マグネシウムで乾燥し、 溶媒を留去した。 得ら れた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （Me r c k, A r t . 1. 0 9385， CH₂C 12 ： Me OH= 1 0 : 1) にて精製し、 表記化合物 （ 1. 2 g, 89%) を無色アモルファスとして得た。 一 NMR S p e c t r urn (DMSO-d₆, 400 MHz) δ (p pm) ： 1. 10 - 1. 6 5 (2 1 H, m)， 2. 05— 3. 65 ( 1 7 H, m)， 4. 0

4— 4. 1 5 (1 H， m), 4. 22 -4. 40 (2 H, m)， 4. 92- 5. 0 6 (2H, m)， 6. 30— 6. 48 (2H, m)， 6. 70 - 6. 80 ( 1 H, m)， 7. 22 - 7. 44 (6 H, m) ； E S I -MS m/ z 699 (M + N a) +.

(3) teri—ブチル =— ((5 S) _ 5—ァミノ— 6— — (メチル （2— （メチル （5 一 ((3 a 7?,4 i?,6 a S) 一 2—ォキソへキサヒドロ— 1 /—チエノ [3， 4— ] イミダゾ一ル一 4 _ィル） ペン夕ノィル 9ァミノ） ェチル） ァミノ） 一 6— ォキソへキシル） 力ルバマート

上記 （2) の生成物 （1. 2 g， 1. 8mmo 1 ) を Me OH (2 OmL - 1 OmL) に溶解した反応溶液に、 7Mアンモニアメタノール溶液 （2 OmL) を 加えた。 この反応溶液に 1 0 %パラジウム炭素 （0. 8 3 g) を懸濁し、 水素添 加装置にて接触還元反応を行った。 反応の収量を TLC (Me r c k A r t . 1. 0 5 7 1 9, CH₂C 1 2 ： Me OH= 1 0 : 1) にて確認した後、 触媒を濾 去し、 濾液を減圧留去した。 得られた残渣をデシケ一夕一で減圧乾固し、 表記化 合物 （0. 9 5 g, 9 8 %) を淡黄色アモルファスとして得た。

^XH-NMR S e c t r um (DMS O- d ₆, 40 0 MH z ) ό (p pm) ： 1. 0 5 - 1. 7 0 (2 1 H, m)， 2. 1 0 - 2. 4 0 (2 H, m) , 2. 5 0 一 2. 6 5 ( 1 H, m)， 2. 74— 3. 6 6 ( 1 5 H, m) , 4. 0 6 -4. 2 0 ( 1 H, m)， 4. 2 6 -4. 3 6 (1 H， m), 6. 3 3 6 ( 1 H, b r - s)， 6. 4 3 ( 1 H, b r - s ), 6. 7 0 - 6. 84 ( 1 H, m) ； NH₂は 明確なピークとして検出されなかった； E S I — MS m/z 5 6 5 ( + N a) +. (4) terf—ブチル = ((5 5) — 6— (メチル （2— （メチル （5 _ ((3 a R,

47?, 6 a 5) 一 2—ォキソへキサヒドロー 1 H -チエノ [3， 4ー ] イミダゾ —ルー 4一ィル） ペンタノィル） ァミノ） ェチル） ァミノ） 一 6—ォキソ _ 5—

((4— (3— (トリフルォロメチル） _ 3 //—ジアジレン一 3 _ィル） ベンゾィ ル） ァミノ） へキシル） 力ルバマート

上記 （3) の生成物 （0. 9 5 g， 1. 7 5mmo 1 ) および文献報告 （N a s s 1 M. L i e b i g s An n. C h em. 1 9 8 3, 1 5 1 0 - 1

5 2 3) にしたがって合成した 4— (3 - (卜リフルォロメチル） 一 3 H—ジァ ジレン一 3 _ィル） 安息香酸 （0. 44 g, 1. 93mmo 1 ) を THF— DM

F (2 OmL- 2 OmL) に溶解し、 この反応溶液に縮合剤： 4— (4， 6—ジ メトキシ [1. 3. 5] トリアジンー2—ィル） _4一メチルモルホリニゥム ク 口ライド水和物 （Wa k o, 1. 0 5 g, 3. 4 5 mm o 1 ) を数回に分けて加 えたのち、 この反応溶液を室温にて 24時間攪拌した。 溶媒を留去し、 残渣を酢 酸ェチルにて油水分配した。 有機層をさらに蒸留水および食塩水で順次洗浄した 後、 硫酸マグネシウムで乾燥し、 溶媒を留去した。 得られた残渣をシリカゲル力 ラムクロマトグラフィー （Me r c k, A r t . 1. 0 9 3 8 5， CH₂C 1 ₂ ： Me OH= 2 0 ： 1— 8 ： 1) にて精製し表記化合物 （1. 1 8， 8 9 %) を無 色アモルファスとして得た。 ^-NMR S e c t r um (DMSO-d ₆, 4 0 0 MHz) d ( p p m) ： 1. 0 5— 1. 7 0 (2 1 H, m)， 2. 1 0 - 2. 3 8 (2 H, m), 2. 44 一 2. 6 2 (1 H, m), 2. 7 0— 3. 8 0 ( 1 4 H, m), 4. 04— 4. 2 0 ( 1 H, m)， 4. 24 -4. 3 6 ( 1 H, m)， 4. 7 0 -4. 9 0 ( 1 H， m), 6. 3 0 - 6. 5 8 (2 H, m)， 6. 7 0 - 6. 84 ( 1 H, m) , 7. 3 7 (2H， d， J = 8. 0Hz), 7. 94 - 8. 0 6 (2 H, m), 8. 64 - 8. 96 ( 1 H, m) ; E S I - MS m/ z 7 7 7 (M + N a) +.

(5) N— ( ( 1 S) 一 5—ァミノ— 1 _ (メチル （2— （メチル （5— ((3 a ^,4 ^,6 a S) — 2—ォキソへキサヒドロ一 1 //—チエノ [3, 4 - d] ィ ミダゾ一ルー 4一ィル） ペンタノィル） ァミノ） ェチル） 力ルバモイル） ペンチ ル） -4 - (3 - (トリフルォロメチル） — 3 //—ジアジレン一 3 Γル） ベン ズアミド

上記 （4) の生成物 （0. 2 9 g， 0. 3 8mmo 1 ) を酢酸ェチル （2 0m L) に溶解し氷冷下攪拌し、 ここに、 4 M塩化水素一酢酸ェチル溶液 （5mL) を加え、 この反応溶液を室温にて 1 2時間攪拌した。 溶媒を留去し、 残渣を塩化 メチレンとアンモニア水にて油水分配し、 水層をさらに塩化メチレンで再抽出し た。 得られた有機層を合わせて、 食塩水で洗浄したのち、 硫酸マグネシウムで乾 燥し、 溶媒を留去し表記化合物 （0. 2 1 , 84%) を無色のアモルファスとし て得た。 ES I— MS m/z 655 (M + H) +, 689 (M+C 1 ) 一 実施例 A 5

(8 1 2 E, 14 E) 一 3， 6, 2 1 _トリヒドロキシー 6 , 1 0, 1 2,

1 6， 20—ペン夕メチル一7 _ (N- ((55) 一 6— （TV—メチル一TV— (2 一 （TV—メチル— 7V— (5 - ((3 a 7?,47?,6 a 5) 一 2—ォキソへキサヒドロ

- I H-チエノ [3， 4- d] イミダゾ一ルー 4一ィル） ペンタノィル） ァミノ） ェチル） ァミノ） 一6—ォキソ一 5_ (TV— (4— (3— (トリフルォロメチル） 一 3 //—ジアジレン _ 3 _ィル） ベンゾィル） ァミノ） へキシル） 力ルバモイル ォキシ） - 1 8, 19一エポキシトリコサー 8， 1 2， 14—トリェンー 1 1— オリ ド

実施例 A4で合成したァミン化合物を用いて、 実施例 A 2と同様の方法により表 記化合物 （40mg， 25%) を無色油状物として得た。

^-NMR S p e c t r um (CDC 1₃, 400MHz ) ： 図 la、 （CD₃

OD， 700 MHz) δ ( p m) ： 0. 83 (3H, m), 0. 90 (3H, d, J= 7Hz), 0. 93 (3H， t, J= 7 H z), 1. 07 (3H, d， ゾ =7Hz),

1. 17 (3H, s)， 1. 19 (1H， m), 1. 23 - 1. 90 (2 OH, m), 1.

71 (3 H, s)， 2. 13-2. 57 (6 H, m), 2. 62 - 2. 74 (3H, m),

2. 84 - 3. 35 (10H， m) , 3. 40-4. 10 (6 H, m), 4. 22-4. 52 (2H, m), 4. 80— 5. 10 (3H, m)， 5. 52 ( 1 H, m), 5. 62 一 5. 72 (2H, m), 6. 08 (1 H, d, ゾ =10. 4Hz), 6. 30 ( 1 H， m), 7. 30 - 7. 37 (2H, m), 7. 90 - 8. 00 (2H， m) E S I— MS m/z 1 1 97 (M + Na) ⁺ :図 lb 合成した標識プラジェノライド類を用いて、 プラジェノライド類の標的蛋白質 を以下の実施例 B 1〜B 7に記載の通りに特定した。 また標識プラジェノライド 類を用いて被検化合物が、 U2 snRNPと、 好ましくは SF3bと、 更に好ましくは SAP130と作用する （結合する） ことを検定することが可能であることを、 実施 例 B 2、 B 7、 B 8、 B 9に示した。 実施例 B 1

トリチウムプローブ化合物の細胞内分布

15cm dishに培養 （>80% confluent) したヒト乳癌細胞 MDA-MB-468 (ATCC HTB-132) に、 実施例 A1にて製造したトリチウムプローブ化合物を 3〜30 nM となるよう添加し、 37でインキュベータ一にて 1時間培養した。 培地を除去した のち、 Hanks' balanced salt solution (10mし x2) にて洗净し、 10% glycerol hypotonic buffer (10% glyrecol, 20mM NaCI, 1mM EDTA, 10mM Tris-HCI, pH=7.8, protease inhibitor cocktail) 3 mLを添加した。 しばらく静置した後、 セルスクレ ィパーにて細胞を回収し、 ダウンスホモジナイザーにて cell lysateを調整した。 この lysateを x2000g, 4°C， 10 min.の遠心分離を行い、 上清 （2000g-sup.) と 沈殿 (2000g-pellet) を得た。 2000g-sup.は、 更に x 100000 g， 4°C, 60 min. の遠 心分離を行レ 細胞質画分（cytosolfraction)を上清として、また膜画分（membrane fraction) を沈殿として得た。 2000g-pelletは 0.5 M NaCIに懸濁し、 氷冷下 30分 静置し核内蛋白を溶出した後、 X 3000 g, 4で， 10 min. の遠心分離を行い、 核画分 (nuclear fraction) を上清として、 また核ペレット （nuclear pellet) を沈殿とし て得た。

各画分中に存在するトリチウムプローブの放射活性を次の方法にて測定した。 すなわち、 細胞質画分および核画分についてはハイォニックフロー （Perkin 曰 mer) と均一に混合し、 また膜画分および核ペレツ卜は Soluene-350 (Packard) (1 mL) に溶解した後、 ハイォニックフローと混合し、 それぞれ液体シンチレ一 シヨンカウン夕一により放射活性を測定した。

同時に、 放射性同位元素非標識体プラジェノライドを用いてコールド阻害実験 を行った。 すなわち、 トリチウムプローブ処理濃度の 50倍濃度 （0.15〜1.5 M) のプラジェノライド処理し、 37でインキュベータ一にて 1時間培養した後、 トリ チウムプローブを処理し、 各画分を調整し、 放射活性を測定した。 結果を図 1 cに示した。

トリチウムプローブの放射活性は、 3-30nM いずれの処理濃度においても核画 分中に最も高く検出された。 次いで核ペレット中の放射活性が高かった。 また、 これらの放射活性はプラジェノライド B前処理によりほぼ完全に消失した。 さらに、 ここで調整した細胞質画分および核画分について活性炭アツセィ (charcoal assay) を行い、 被検体中のラベルカウントが蛋白等への結合した結 合型プローブに由来するものなのか、 あるいは非結合のフリー体に由来するもの なのかを検証した。

すなわち、 細胞質画分おより核画分に 1/10量 （体積比） の 10% 活性炭懸濁液 を添加し、数秒間ボルテックス処理したのち、 15000rpm，4 :, 5min. (TOMY mini MX-15) 遠心分離し、 上清中の放射活性を上記と同様の方法で測定した。 得られた結果を図 1 dに示した。

核画分中の放射活性は活性炭処理によっても消失しなかった。 一方、 細胞質画 分の放射活性はほぼ消失した。 以上の結果から、 プラジェノライドが結合する標的分子は核内に存在すること が示唆された。 実施例 B 2

プラジェノライド類縁体および誘導体によるトリチウムプローブとの競合実験

15cm dishに培養（>80% confluent)したヒト大腸癌 WiDr細胞（ATCC CQ_-218) に、 抗腫瘍活性を有する種々のプラジェノライド類縁体または誘導体をそれぞれ 500 nMとなるよう添加し、 37 ィンキュベー夕一にて 1時間培養した。次いで、 トリチウムプローブ化合物を 10 nMとなるよう培地に添加し、 37でィンキュベ一 夕一にてさらに 1時間培養した。 実施例 B 1と同様の方法にて各サンプルについ て核画分を調整し、 放射活性を測定した。

種々のプラジェノライド類縁体または誘導体の存在下で結合したトリチウムプ ローブ化合物のコントロール （競合なし） に対する割合 （結合％) を縦軸に、 各 化合物の in vitro細胞増殖抑制活性の IC50(nM)を横軸に、 各化合物をプロットし たグラフを図 2に示した。

各サンプル中の放射活性は、 競合させたプラジェノライド類およびその誘導体 の WiDrに対する in vitro細胞増殖抑制活性のに 50に比例した。 即ち、 強い細胞 増殖抑制活性を示す化合物でより強い競合阻害がみられた。

この結果から、 トリチウムプローブを用いて追跡することにより核内に存在す ることが示された標的分子は、 プラジェノライドの細胞増殖抑制活性に関与して いる分子であることが示された。

尚、本実施例で用いたプラジェノライド類縁体または誘導体は次のものである。

(1 )·本願実施例 A3の化合物、

(2) .WO02/060890実施例 A-3、 A-4、 A-5、 A-6、 A-7、 A-8、 B-68、 B-44、 B-50、 B36-1および B36-2の化合物

(3) .WO03/099813実施例 12および 45の化合物 実施例 B 3

蛍光プローブの細胞内局在観察

HeLa 細胞に実施例 A 2にて製造した蛍光プローブ 1 M を添加し、 1時間

37 インキュベータ一にて培養した。 その後培地を除去し、 プローブ非添加の新 たな培地中にて、 さらに 1時間培養し、 非特異的に吸着した化合物を洗浄した。 再び培地を除去し、 PBSにて洗浄したのち、 3.7%ホルムアルデヒド in PBS中で 細胞を固定した。

固定した細胞は PBS洗浄にてよく洗浄し、 0.5又は 1 %Triton X-100 in PBSに より可溶化したのち、 FBS またはブロッキング溶液によりブロッキングを行い、 一次抗体（抗 SC-35モノクローナル抗体、 シグマ； S4045) を添加し反応させた。

PBS にて洗浄したのち、 再び FBSまたはブロッキング溶液によりブロッキング を行い、 蛍光標識二次抗体 （TexasRed標識， Jackson) を添加し反応させた。 標 識したサンプルは蒸留水ですばやく リンスしたのち、 Prolong antifade 試薬 (Molecular Probes) に封入し、 蛍光顕微鏡 (Delta Vision, Applied Precision, Inc.) または共焦点顕微鏡 （LSM510, Carl Zeiss) にて蛍光プローブおよび抗 SC-35抗 体の局在を観察した。 結果を図 3aに示した。

蛍光プローブは主に核内の顆粒状構造体に局在することが確認された （図 3a 上）。 この構造体は抗 SC-35抗体の局在と一致した。 SC-35はスプライシング因 子の代表的な分子であり、 核スペックルのマーカーであることから、 プラジェノ ライド類の標的分子は核スペックルに存在することが示唆された。 さらに、 蛍光 プローブの蛍光を過度の光照射により褪色させた後に上記と同様の条件で撮影を 行うと、 蛍光プローブのチヤンネルにはシグナルが検出されなくなつたので抗 SC-35抗体染色のシグナルの漏出がないことが確かめられ、 蛍光プローブ特異的 なシグナルが検出されていることが確認された （図 3a下）。 また、 上記実験操作においてプラジェノライド類またはその誘導体を用いて競 合実験を行った。 即ち、 蛍光プローブ添加に先立ってプラジェノライド類または その誘導体 1 ^ Mを添加した条件で 1時間培養したのち、 上記と同様の操作によ り固定 ·染色し、 顕微鏡観察を行い蛍光プローブの局在を確認した。 結果を図 3 bに示した。

各サンプル中の蛍光プローブ由来の蛍光強度は、 競合させたプラジェノライド 類およびその誘導体の細胞増殖抑制活性の に 50 に比例した （プラジェノライド A>非標識トリチウムプローブ化合物 >プラジェノライド B、 D )。 即ち、 強い細 胞増殖抑制活性を示す化合物でより強く競合阻害がみられ、 プローブ由来の蛍光 はほぼ消失していた （図 3 b左段）。 また、 抗 SC-35抗体により染色される核ス ペックルは、 数が少なく大きくなつていることが観察された (図 3 b右段)。

この結果から、 蛍光プローブを用いた実験から核スペックル中に存在すること が示された標的分子は、 プラジェノライドの細胞増殖抑制活性に関与している分 子であることが示された。 また、 トリチウムプローブと同一の構造を有する非標 識卜リチウムプローブ化合物は、 その細胞増殖抑制活性に比例した強度で蛍光プ ローブと競合したことから、 これら二つのプローブの標的分子 （結合蛋白） が同 一であることが示された。 実施例 B 4

トリチウムプローブ処理細胞から調整した核フラクションの免疫沈降実験

MDA-MB-468細胞を卜リチウムプローブ 30 nM存在下で 1時間培養したのち、 実施例 B 1記載の方法と同様の方法にて核フラクションを調整した。 ここに希釈 バッファーを添加して最終濃度 0.15 M NaCI, 0.05% CA-630, 40 mM tris-HCI, pH=7.5とし、 免疫沈降溶液を調製した。

この溶液にスプライシング因子、 転写因子またはそれらに関与する分子に対す る抗体を 1 g/mLとなるよう添加し、 4で低温室にてサンプルローテ一夕一を用 いて約 12時間ゆつくりと攪拌した。 Protein A/G-ァガロースコンジユゲート 50% 懸濁液を 20 し添カ卩し、 さらに低温室にて 2時間攪拌した。

ァガロース樹脂を回収し、洗浄液（0.15 M NaCI, 0.05% CA-630, 20 mM tris-HCI, pH=7.5) にて洗浄した。 これに SDSサンプルバッファーを添加し、 ボルテック スにて攪拌したのち、 99でにて 10分間ボイルし、 免疫沈降されてきた蛋白質を 溶出した。 この溶出液をハイォニックフローと均一に混合し、 液体シンチレーシ ョンカウン夕一にて溶出液中に存在するトリチウムプローブの放射活性を測定し た。 結果を図 4に示した。

約 40 種の抗体を用いて実験を行った結果、 TMG 抗体 （Oncogene NA02)、 U1A/U2B"抗体 （Progene 57035)、 U2B"抗体 （Progen 57036)、 SM BB' & D1抗 体 （Progen 57032)、 SAP155抗体 (MBL D221-3)、 SAP145抗体 (Santa Cruiz sc-14279)、 cyclin E 抗体 (Zymed 32-1500， Santa Cruiz sc-248, Santa Cruiz sc-481 ) において特異的に放射活性が観察された。 これらの抗体は、 全て U2 snRNPの構成蛋白質、 または U2 snRNPと複合体を形成することが報告されて いる蛋白質 （cyclin E) に対する抗体であった。

以上の結果から、 プラジェノライドの標的分子は U2 snRNP複合体中に存在す る蛋白質であることが示された。 実施例 B 5

光ァフィ二ティー · ピオチンプローブ処理による結合蛋白質の検出

MDA-MB-468細胞から、 実施例 B 1 に記載の方法に従って 2000g-pelletを調製 した。 これを CSKバッファー （300 mM sucrose, 100 mM NaCI, 3 mM MgCl2, 10 mM PIPES, pH=7.0, protease inhibitor cocktail) に懸濁し、 実施例 A 3にて合成 した光ァフィ二ティー ·ピオチンプローブ 1.5 Mで処理した。 この懸濁液を 4で にて 1時間静置した後、 X 2000 g， 4 ，10分遠心分離した。 上清を除き、 得られ た沈殿物から実施例 B 1と同様の方法にて核フラクションを調整したのち、 実施 例 B 4と同様の方法にて免疫沈降溶液を調整し、 標的分子が免疫沈降されてくる ことが示されている抗体を用いて免疫沈降実験を行った。

得られた免疫沈降物（ァガロース樹脂）に対して UV照射（365nmおよび 302nm) を行い、 架橋反応を行った。 これに SDS サンプルバッファーを添加し、 ボルテ ックスにて攪拌したのち、 99でにて 10分間ボイルし、 免疫沈降されてきた蛋白 質を溶出した。 常法に従って、 この溶出液について SDS-PAGE、 PVDF膜へのブ ロッテイングを行った後、 ストレプトアビジン- HRP を処理することで、 プロ一 ブが結合した蛋白質の検出を試みた。 結果を図 5 aに示した。 いずれの抗体においても 130-140kDaに一本のバンドが検出された。 次いで、同一のサンプル（ブロッティング膜）について、 SAP155抗体、 SAP145 抗体、 SAP130抗体を用いてウエスタンプロットを行い、 それらの蛋白のバンド 位置と光ァフィ二ティープローブが結合している標的分子のバンド位置を比較し た。 結果を図 5 bに示した。

標的分子と SAP155の位置は明らかに異なった。 一方、 標的分子と SAP145お よび SAP130はほぼ同一位置に観察された。

以上の結果から、標的分子は SAP145または SAP130であることが示唆された。 実施例 B 6

GFP-145株、 GFP-130株の獲得

( 1 ) プラスミドの構築

GFP融合型 SAP130蛋白質の安定発現株を獲得するために、 pEGFP-SAP130 プラスミ ドを作製した。 pEGFP-SAP130 は、 EGFP 蛋白質コーディング配列 (PEGFP-N2由来： CLONTECH社）、 ヒト SAP130 (SF3B3) 蛋白質コーディン グ配列 （GenBank Accessions NM_012426)、 およびそれらを繋ぐリンカ一配列 から構成される配列番号 1 (GFP-SAP130 の Nhe I— Pme I フラグメント、 4432bp) に記載の約 4.4kbp の DNA フラグメントを、 pcDNA3.1 (-) ベクター (invitrogen社） の Nhe卜 Pme I サイトに挿入することによって作製した。 同プ ラスミ ドを導入した細胞では、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有する GFP-SAP130蛋白質が発現することが予想された。

GFP 融合型 SAP145 蛋白質の安定発現株を獲得するために、

PEF1-GFP-SAP145プラスミドを作製した。 pEF1-GFP-SAP145 は、 EGFP蛋白 質コーディング配列（pEGFP-N2由来： CLONTECH社）、 ヒト SAP145 (SF3B2) 蛋白質コーディング配列 （GenBank Accession#: NM_006842) 、 およびそれら を繋ぐリンカ一配列から構成される配列番号 3 (GFP-SAP145の Hind III -Pme I フラグメント、 3454-bp ) に記載の約 3.5 kbp の DNA フラグメントを、 pEF1-Myc/His A ベクター （invitrogen社） の Hind III - Pme I サイ卜に挿入する ことによって作製した。 同プラスミドを導入した細胞では、 配列番号 4に記載の アミノ酸配列を有する GFP-SAP145蛋白質が発現することが予想された。

( 2 ) 安定発現株の取得

PEF1 -GFP-SAP145 および pEGFP-SAP130 を、 Lipofectamine 2000 試薬 (invitrogen社）で HeLa細胞に導入した。遺伝子導入 40時間後に、最終濃度 500 i g/mlの Geneticin (invitrogen社） 添加によって遺伝子導入細胞の選択を開始し た。 そして、 遺伝子導入 14日後に、 蛍光顕微鏡観察によって GFP蛍光を発する クローンをマークしてピックアップした後、 さらに希釈継代してシングルコロニ ―を単離した。 pEF1 -GFP-SAP145力、ら得られた Clone#2 (GFP-145株）および、 PEGFP-SAP130由来の Clone#3 (GFP-1 30株） を、 以降の実験に供した。 実施例 B 7

GFP融合 SAP145または GFP融合 SAP130蛋白を用いたバンドシフ卜の検出実 m 標的分子と考えられる SAP145および SAP130が SDS-PAGE上でほぼ同一の 位置に検出されるため、 それぞれ GFP 融合蛋白の安定発現株を調製し、 光ァフ ィニティー ' ピオチンプローブを用いた実験を行った。

GFP-SAP145安定発現 HeLa細胞に、光ァフィ二ティー 'ピオチンプローブ 1.5 β Μを添加し 1時間培養した。 PBSにて細胞を洗浄したのち、 M-PER (PIERCE) を添加し、 4 にて 1時間振とうした。 ここに 1/10量の 1 .5M NaCI，0.5% Tween

20溶液を添加したのち、ボルテックス処理した（10秒 X 3 )後、 15000 rpm, 4 : ,

5 min.遠心分離を行った （TOMY MX-15)。 ここで得られた上清を 0.45 mメン プレンを用いてろ過し、 ろ液を免疫沈降実験に用いた。 免疫沈降溶液に GFP抗体（Q-BIOgene AFP5002)、 または SAP155抗体（MBL D221-3) を添加し （10 g/mL)、 30分間 4 :にてゆっくりと rotatorにて攪拌し た。 次いで、 protein A/G-ァガロース （50%懸濁液） を免疫沈降溶液の 1/10量加 え、 4でにてさらに 1時間、上記と同様に攪拌した。ァガロース樹脂を wash buffer にて 3回洗浄したのち、樹脂に実施例 B 5と同様の方法にて UV照射を行った後、 樹脂に結合した蛋白を溶出し、 SDS-PAGEおよびブロッテイング後、 ストレプト ァビジン -HRPを処理してプロ一ブが結合した蛋白質の検出を行った。

また、同一サンプルを用いて SAP145抗体および SAP130抗体によりそれぞれ SAP 145, SAP130の検出を行った。 糸吉果を図 6a (probe treatment： intact cell) に示した。

GFP抗体、 および SAP155抗体で免疫沈降を行ったサンプルの両方で 130〜 145 kDaの位置にプローブが結合した蛋白のバンドが検出された。 これらのバン ドはプローブ非処理サンプルでは検出されていないことから、 標的分子に結合し たプロ一ブに由来するシグナルであると判断される。

同一のサンプルを SAP145抗体、 および SAP130抗体で western blottingを行 つた。 GFP 抗体で免疫沈降を行ったサンプル中には 130〜145 kDa の位置に endogenous SAP145は全く検出されず、 SAP145-GFP fusion proteinのみが約 170 kDaのシフトした位置に存在していることが示された。 一方、 SAP130抗体 を用いた実験結果からは、 プローブが検出された位置に SAP130が存在すること が示された。

以上の結果、 標的分子のバンド位置には SAP145が存在せず、 SAP130のみが 存在することが示されたことから、 標的分子が SAP130であることが強く示唆さ れた。 また、 上記実験操作においてプロ一ブ未処理の細胞から調製したァガロース樹 脂にプローブを処理したのち、 同様の操作にて UV照射、 蛋白溶出操作を行い、 得られたサンプルにおいて同様のバンドが検出されるか否かを検証した。

結果を図 6a (probe treatment： IP beads) に示した。 予め免疫沈降を行ったサンプルにプローブを処理した場合も、 intact cellに処理 した場合と同様の結果が得られた。 したがって、 免疫沈降されてきた標的分子を 含む複合体に対しても、 プラジェノライドが親和性を有することが示された。 次に、 GFP-SAP130安定発現 HeLa細胞を用いて同様の実験を行った。

結果を図 6 bに示した。

SAP 155抗体で免疫沈降したサンプルにおいては、 約 170 kDaの位置にシフト したバンドと従来の 130〜145 kDaの二つの位置にバンドが検出された。 一方、 GFP抗体で免疫沈降したサンプルでは 170 kDaにシフトしたバンドのみが検出 された。 これらのバンドはプローブ非処理サンプルでは検出されていないことか ら、 標的分子に結合したプロ一ブに由来するシグナルであると判断された。 同一のサンプルを SAP130抗体で western blottingを行った。 SAP155抗体で 免疫沈降を行ったサンプル中にはバンドシフ卜が観察された位置と、 従来の SAP130位置にシグナルが検出された。 一方、 GFP抗体のサンプルでは、 バンド シフ卜が観察された位置にのみ SAP130シグナルが観察された。 以上の結果から、 光ァフィ二ティ一 · ピオチンプローブが結合している蛋白は SAP145ではなく、 SAP130であると判断された。

実施例 B 8

プラジェノ類縁体および誘導体による光ァフィティ一 · ピオチンプローブとの競 合実験

実施例 B 7と同様の方法で、プローブ未処理の GFP-SAP145安定発現 HeLa細 胞から GFP抗体、 および SAP155抗体を用いて免疫沈降実験を行い， 免疫沈降 サンプル （ァガローズ樹脂） を調製した。 この樹脂を wash buffer に懸濁し、 プ ラジェノライド類、 およびその誘導体 （E7107) を 75 z Mにて前処理し、 4 に て 30分 rotatorにて攪拌した。 ついで、 光ァフィ二ティー . ピオチンプローブを

1.5 // Mで処理し、 同様にさらに 30分攪拌した。 樹脂を wash bufferで洗浄した のち、 実施例 B 7と同様の方法で UV照射、 蛋白溶出を行った。 得られたサンプ ルの SDS-PAGE、 ブロッテイングを行い、 光ァフィ二ティ一 'ピオチンプローブ と前処理したプラジェノライド化合物が競合することにより、 プローブ由来のバ ンドが消失するか否かを検証した。 結果を図 7に示した。

GFP抗体サンプル、および SAP155抗体サンプルの両方において、 プラジェノ ライド化合物（プラジェノライド B、 Dおよび E7107)を競合させることにより、 プローブ由来のバンドが消失した。 したがって、 光ァフィ二ティー ' ピオチンプ ローブの結合蛋白質は、 プラジェノライド類の結合蛋白質と同一であると結論さ れた。 以上のように、 複数のプローブ化合物を用いてプラジェノライドの標的分子を 追跡した。 その結果、 プラジェノライドの標的分子は SF3bの構成蛋白質の一つ である SAP130であると結論付けられた。 実施例 B 9

SF3bに結合する化合物を多くの評価検体より効率的、定量的に探索可能とする 目的で、 High content screening machineと蛍光プローブを用いた簡便な評価法 を確立した。

90 I (1. OxlO cells/well) の HeLa細胞を蛍光測定用の 96 well plateにま き、 一晩 37で、 5¾ C0₂ インキュベーターで培養した。 培養した HeLa細胞に、 実 施例 B 8の結果から SF3bに結合することが判明している E7107の希釈系列を作り、 終濃度 （0, 0.15, 0.46， 1.4， 4.1， 12, 37, 111， 333, 1000 nM) になるように 添加し、 37°C、 5¾ C0₂ インキュベーターで 30分培養した。 次に、 3 Mに調整し た蛍光プローブを 50/^1添加 （終濃度 l^M) し 2時間 37 、 5¾ C0₂ インキュべ 一夕一で反応させた。 培地を除去後、 2%パラホルムアルデヒドで 5分間固定し、

PBSで洗浄し、 0.1% Triton X-100/PBSで 5分間処理後、 PBSで洗浄し、 g/ml の H33342 (SIGMA社) で核染色後、 INCel 1 analyzer (GE Heal thcare社) で核染 色と蛍光プローブの画像を取得した。 得られた画像を画像解析ソフトである

Deve l oper (GE Hea l thcare 社）を用いて、 核内の蛍光プローブの蛍光強度を解析 し、 SF3bに結合する E7107によって核内への蛍光プローブ集積が阻害されるか否 かを検証した。

画像解析に用いた蛍光プローブの画像 （縦 6枚は同一濃度） の代表例 （各ゥェ ル 3視野を撮影した） を図 8 aに、 画像解析のまとめを図 8 bに示した。 E7107 は濃度依存的に核内への蛍光プローブの集積を阻害しており、 この方法により、 SF3bに結合する化合物を簡便に定量的に測定できるようになった。

Claims

請 求 の 範 囲

1. 被検化合物と、 スプライシングファクター 3 b (SF3b) との結合活性を測定 する方法であって、 以下の工程：

(a) 標識した下記式 (I)で表される化合物および被検化合物を、 細胞または細胞 画分と接触させ、

(b) 結合した標識化合物の分布を測定すること

を含む前記方法。

〔式 (I)中、

R²、 R^1Q、 R¹²および R¹⁴は、 それぞれ独立して、 同一または異なって、 水素 またはメチルを表す；

R^3a、 R^3b、 R^5a、 R^5b、 R^6aおよび R^6bは、 それぞれ独立して、 同一または 異なって、

(1) 水素、

(2) ヒドロキシ、

(3) それぞれ置換基を有していても良い

(a) d ₂₂アルキル、

(b) ₂₂アルコキシ、

(c) A r CH₂〇— （式中、 A rはそれぞれ置換基を有していても良い C

₆— ₁₄ァリールまたは 5員環〜 14員環へテロァリールを表す） 、

(d) C_{2 22}ァシロキシ、

(e) C_{3 22}不飽和ァシロキシ、

(f) -OCOR^co (式中、 Rc。はそれぞれ置換基を有していても良い (i) C₆— ₁₄ァリール、

(ii) 5員環〜 14員環へテロァリール、

(iii) ^— ₂₂アルコキシ、

(iv)不飽和 C₂— ₂₂アルコキシ、

(v) C₆— ₁₄ァリールォキシまたは

(vi) 5員環〜 14員環へテロァリールォキシを表す） 、

(9)。^ ₂アルキルスルホニルォキシ、

(h) ベンゼンスルホニルォキシまたは

(i) -OS i R^s 'R^R²³ (式中、 R^s 1^²ぉょび1^³は、 それぞ れ独立して、 同一または異なってメチル、 ェチル、 i一プロピル、 t—ブ チルまたはフエニルを表す） 、

(4) ハロゲンまたは

(5) 一 R^M— NR^N1R^N2 {式中、 R^Mは単結合もしくは一 O— C〇—を表 す； R^N1および R^N2は、

1) それぞれ独立して、 同一または異なって、

(a) 水素、 または

(b)それぞれ置換基を有していても良い

(OC^ アルキル、

(ii)不飽和 C₃— ₂₂アルキル、

(iii) C₂— ₂₂ァシル、

(iv)不飽和 C₃_₂₂ァシル、

(v) C₆— ₁₄ァリール、

(vi) 5員環〜 14員環へテロァリール、

(vii)ベンジル

(viii) C 22アルキルスルホニルもしくは

(ix) ベンゼンスルホニルを表すか、 あるいは、

2) NR^N1R^N2が一緒になつて置換基を有していても良い 3員環〜 1 4員環の含窒素非芳香族複素環を表しても良い } を表す；

aおよび R^7bは (1) それぞれ独立して、 異なって

1) 水素、

2) 一 OR^H (式中、 R^Hは水素、 メチルまたはァセチルを表す） 、

3) 一 OR^D{式中、 R^Dはそれぞれ置換基を有していても良い

(i) アルキル（ただし、 メチルの場合は必ず置換基を有する）、

(ii) _CH₂Ar、

(iii) C₃— ₂₂ァシル、

(iv) C₃— ₂₂不飽和ァシル、

(V)— COR^co、

(vi) C卜 ₂₂アルキルスルホニル、

(vii)ベンゼンスルホニルまたは

(viii)— S i R^s

を表す }または

4) _R^M— NR^N1R^N2であるか、 または

(2) R^7aと R^7bが一緒になつて

1) ケトン構造 （ =〇） を表すか、 または

2) ォキシム構造 （ = N〇R°^X :式中、 R°^xはそれぞれ置換基を有し ていても良い

(a C^ ₂₂アルキル、

(b)不飽和 C₃_₂₂アルキル、

(c) C₆— ₁₄ァリ—ル、

(d) 5員環〜 14員環へテロアリールまたは

(e)ベンジルを表す） を表す；

さらに、 R^3aと R^3bが一緒になつてケトン構造（ = 0)もしくはォキシム構造（= NOR^ox) を表しても良い；

さらに、 R ^{6 a}と R ^{6 b}が一緒になつてスピロォキシラン環またはェキソメチレンを 表しても良い；

さらに、 R^6aと R^6bのどちらか一方と R^{7 a}と R^7bのどちらか一方が一緒になつ て 1， 3—ジォキソラン環を形成しても良い；

Gは [ 1 ]

{式中、 R^16aおよび R^16bは、 それぞれ独立して、 同一または異なって水素、 メチルまたはヒドロキシを表す；

R^{17 a}、 R^17b、 R^18a、 R^18b、 R^19a、 R^19b、 R^20a、 R^20b、 R^{21 a}および R^{21 b}は、 それぞれ独立して、 同一または異なって

( 1 ) 水素、

(2) 置換基を有していても良いメチル、

(3) 一 OR^H、

(4) 一 OR^D、

(δ) 八ロゲンまたは

(6) 一 R^M_NR^N1R^N2を表す；

R ^{21 c}は

(1) 水素または

_R22b , (2) ^22a (式中、 R^22a、 ²²¹⁾ぉょび1^² は、 それぞれ独 立して、 同一または異なって、

(a)水素、

(b)メチル、

(c)ヒドロキシ、

(d)—〇R^H、

(e)—〇R^D、

(f)一 R^M— NR^N1R^N2または

(g)ハロゲンを意味する ；

さらに、

尺¹⁸³または!^¹⁸¹⁵のどちらかー方と1^¹⁹³または1¾¹⁹¹^のどちらかー方がー緒 _{or R}18b) になって単結合を形成し、 部分構造 (

を表すか、 または酸素

；

さらに、

!¾¹⁹³または1^¹⁹¹³のどちらかー方と1^²⁽⁾²¹または1¾²°^1>のどちらかー方がー緖

になって単結合を形成し、

を表しても良い； さら'に、

1¾²¹³と1¾²¹¹⁾がー緖になって

(a)ケトン構造 （ =〇） を表すかまたは

(b)ォキシム構造 （ = N〇R。^X) を表しても良い； さらに、

R^{21 a}または R^21bのどちらか一方と R^{22 a}または R^{22 b}のどちらか一方が一緒 ベ (R^21aorR^21b) になって部分構造 ^{(R OTi} ) を表しても良い；

さらに、

R ^19aまたは R ^{19 b}のどちらか一方と R^{21 a}または R ^{21 b}のどちらか一方が

になっ

を表しても良い } 、

[2]

{式中、 R^16a、 R^16b、 R^17a、 R^17b、 R^18aおよび R^18bは式 (G - I)中の定義と同義で ある ；

R ¹⁸ ま

(1) 水素または

(2)

（式中、 R^{f 3a}、 R^f3b、 R^f4aおよび R^f4b は、 それぞれ独立して、 同一または異なって、 水素、 メチル、 ヒドロキシ、 メト キシまたはァセトキシを表し、 R^f5はメチルまたはェチルを表す） を表す } で表 されるか、 または

[3]

{式中、 R^16a、 R^16b、 R^17aおよび R^17bは式 (G - I)中の定義と同義である ；

R ^{1 7} cは

(1) 水素または

(2)

R^i4aおよび

R^{f 4b}は、 それぞれ独立して、 同一または異なって、 水素、 メチル、 ヒドロキシ、 メトキシまたはァセトキシを表し、 R^{f 5}はメチルまたはェチルを表す） を表す } で表される。 〕

2. 式 (I)で表される化合物が下記式 （IV)で表される化合物である、請求項 1に記載 の方法。

〔式 (IV)中、

R^16c、 R¹ および R² は、 それぞれ独立して、 同一または異なって、 水素、 ヒドロキシまたはメトキシメチルを表す；

R^7cは、 ヒドロキシ、 ァセトキシ、 0— CO— NR^N1' R^N2' (式中、 R^N1'、 R^{N 2}'は、 それぞれ独立して、 同一または異なって、 水素、 アルキルを表す） で表される。 〕

3. 式 (I)で表される化合物が下記式 （V)で表される化合物である、 請求項 1に記載 の方法。

アルキルを表す） で表される。 〕

4. 被検化合物が SF3b中の SAP130と結合する活性を測定する、請求項 1〜 3の いずれか 1項に記載の方法。

5. 標識が放射性同位元素による標識である、 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載 の方法。

6. 標識が蛍光標識である、 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。

7. 標識がピオチン標識である、 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。

8. 標識が、 光照射により蛋白質と結合する化合物による標識である、 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の方法。

9. 工程 (b)において、 標識化合物が核に分布する量を測定して、 被検化合物が SF3bと結合する活性を測定する、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。

10. 工程 (b)において、 標識化合物が核スペックルに分布する量を測定して、 被検 化合物が SF3bと結合する活性を測定する、 請求項 1〜4のいずれか 1項 に記載の方法。

11. 工程 (b)において、 標識化合物が核スペックルに分布する形態から、 被検化合 物が SF3bと結合する活性を測定する、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の 方法。

12. 工程 (b)において、 標識化合物が SF3bに結合して分布する量を測定して、 被 検化合物が SF3bと結合する活性を測定する、請求項 1〜4のいずれか 1項に 記載の方法。

13. 工程 (b)において、 標識化合物が SAP130に結合して分布する量を測定して、 被検化合物が SF3bと結合する活性を測定する、請求項 1〜4のいずれか 1項 に記載の方法。

14. 請求項 1〜 1 3のいずれか 1項に記載の方法により SF3b と結合する活性を 有すると判定される、 SF3bと結合する抗癌剤。

15. 請求項 1〜 1 3のいずれか 1項に記載の方法により SAP130と結合する活性 を有すると判定される、 SAP130と結合する抗癌剤。

16. 下記式 （II) に記載のいずれかの標識化合物。