[go: up one dir, main page]

WO2008044754A1 - Prophylactic or therapeutic agent for cancer - Google Patents

Prophylactic or therapeutic agent for cancer Download PDF

Info

Publication number
WO2008044754A1
WO2008044754A1 PCT/JP2007/069908 JP2007069908W WO2008044754A1 WO 2008044754 A1 WO2008044754 A1 WO 2008044754A1 JP 2007069908 W JP2007069908 W JP 2007069908W WO 2008044754 A1 WO2008044754 A1 WO 2008044754A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
amino acid
antibody
acid sequence
nectin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2007/069908
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shuji Sato
Tsutomu Oshima
Tomofumi Kurokawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44083820&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2008044754(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from PCT/JP2006/320429 external-priority patent/WO2007043635A1/ja
Priority to EP07829644A priority Critical patent/EP2067791A4/en
Priority to BRPI0717024-6A2A priority patent/BRPI0717024A2/pt
Priority to JP2008538759A priority patent/JPWO2008044754A1/ja
Priority to MX2009003126A priority patent/MX2009003126A/es
Priority to CNA2007800371476A priority patent/CN101541834A/zh
Priority to CA002666249A priority patent/CA2666249A1/en
Application filed by Takeda Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority to AU2007307536A priority patent/AU2007307536A1/en
Priority to US12/444,382 priority patent/US20100008928A1/en
Publication of WO2008044754A1 publication Critical patent/WO2008044754A1/ja
Priority to IL197389A priority patent/IL197389A0/en
Priority to TN2009000090A priority patent/TN2009000090A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to NO20091783A priority patent/NO20091783L/no
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody against Nectin-2 and its use, specifically, cancer preventive / therapeutic agent or diagnostic agent, cancer cell apoptosis promoter, cancer cell growth inhibitor, and Fc region of antibody.
  • the present invention relates to cancer cell damaging agents that utilize biological defense mechanisms.
  • Nectin-2 gene (RefSeq Accession No. NM_002856) and Nectin-2 ⁇ gene (EMBL Accession No. X80038) are genes cloned from cDNA derived from human leukemia cell line TF-1, each of which has 479 amino acids. It encodes a protein consisting of acids and 538 amino acids (RefSeq Accession No. NP_002847 and EMBL Accession No. CAA 5 6342).
  • Nectin-2 ⁇ gene is a splicing variant of Nectin-2 ⁇ gene, and the protein encoded by Nectin-2 ⁇ gene is It has an amino acid sequence corresponding to the 1st to 350th amino acid sequences of the protein encoded by Nectin-2 gene, but the amino acid sequence on the C-terminal side is different from the 351st.
  • mouse genes (GenBank Accession No. BC009088 and RefSeq Accession No. NM_008990) showing homology to the Nectin-2 gene and Nectin-2 ⁇ gene have been cloned from a library derived from mouse ES cells. Each encodes a protein consisting of 467 amino acids and 530 amino acids (GenBank Accession No.
  • Nectin-2 genes have about 72% and about 72% homology with the human Nectin-2 ⁇ and Nectin-2S genes, respectively, and about 69% and about 73% homology with the amino acid sequences, respectively.
  • Nectin-2 ⁇ and Nectin-2 ⁇ are protein molecules with synonyms such as PVRL2, PRR2, PVRR2, HveB, and CD112.
  • Nectin The Nectin family is one (hereinafter sometimes referred to as Nectin).
  • Necl-1, Necl-2, Necl-3, Necl-4 and Necl_5 are known as membrane proteins having a Nectin-like structure (J. Biol. Chem. (2004), 279 (17), pl8015_pl8025) .
  • Nectin belongs to the immune globulin superfamily and is a single transmembrane glycoprotein with three immunoglobulin-like loops in the extracellular domain. Nectin molecules form cis dimers on the cell membrane, and trans bonds between cis dimers on the cell membranes of adjacent cells, allowing epithelial cells to interact with each other in a manner independent of Ca 2+ concentration. Alternatively, it is thought to regulate cell-cell adhesion between Sertoli cells and sperm cells (Protein Nucleic Acid Enzyme (2003), 48 (2), ⁇ 105- ⁇ 12; Curr. Biol.
  • Nectin-1 and Nectin-3 have also been reported to be involved in neuronal synapse formation via trans-conjugation (J. Cell Biol. (2002), 156, p555-p565).
  • Nectin trans-bonds are formed homophilically between the same molecules, but Nectin-1 and Nectin-3, Nectin-1 and Nectin-4, Nectin-2 and Nectin-3, Nectin-3 and Necl- It is known that a heterophilic trans bond is also formed as in (J. Biol. Chem. (2002), 277 (30), p27006-p27013).
  • Nectin binds to alpha-adein at the C-terminal region in the cell, and through this molecule, it binds to the actin cytoskeleton. It is known to link (J. Cell Sci. (2003), 116 (1), pl7-p27).
  • Nectin-1 acts as a receptor for glycoprotein D expressed on herpesvirus and functions as a scaffold when herpesvirus enters cells.
  • Nectin-2 is one of the ligands of DNAM-1 (CD226) expressed on natural killer cells.Natural killer cells expressing DNAM-1 are cells using Nectin-2 expressed on target cells as a scaffold. It is thought to exert toxic activity (J. Exp. Med. (2003), 198 (4), ⁇ 557 - ⁇ 567 ).
  • Nectin-2 is one of the genes involved in the tumor suppressor gene p53 pathway (W0 02/99040), a protein useful for the treatment of angiogenic diseases, cancer, and viral infections. W0 02/28902), receptors involved in viral infection (W0 99/63063), one of the genes useful for diagnosis and treatment of breast and ovarian cancer (W0 02/00677), One of 16 genes that are up-regulated in various cancers and promising as a target for anti-tumor antibody drugs (W0 03/088808), and up-regulated in cancer tissues, promising for cancer diagnosis and prevention It is reported as one of the most important genes (W0 04/030615).
  • the Nectin-2 gene was found as a gene whose expression is markedly increased in cancer tissues, and it has been reported that antisense oligonucleotides of this gene promote apoptosis of cancer cells (WO 2 0 0 5 Z 0 9 7 2 0 4).
  • the present inventors have found the Nectin-2 gene as a gene whose expression is markedly increased in cancer tissues, and an antisense oligonucleotide of this gene is used in cancer cells.
  • the present inventors have succeeded in producing a monoclonal antibody against Nectin-2 and found that the monoclonal antibody has excellent cancer cell proliferation inhibitory activity and the like.
  • the present inventors have completed the present invention. That is, the present invention
  • a protein or protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Nectin-2 ⁇ ) or SEQ ID NO: 3 (Nectin-2 ⁇ ) A monoclonal antibody against the partial peptide or salt thereof,
  • [1 1] represented by SEQ ID NO: 1 (Nectin-2 ⁇ ) or SEQ ID NO: 3 (Nectin-2 ⁇ )
  • SEQ ID NO: 1 Nectin-2 ⁇
  • SEQ ID NO: 3 Nectin-2 ⁇
  • the above-mentioned monoclonal antibody that recognizes an epitope present in the amino acid sequence of amino acids 47-i42 (first IG-like domain) or 175-240 (second IG-like domain) amino acid sequence [1] The described antibodies,
  • N ec 1— 803— 2 (F ERM BP— 1 04 1 7), N ec 1-244-3 (F ERM BP— 1 0423), Ne cl— 5 30— l (F ERM B P_ 1 0424), N ec 1— 90 3— 1 (F ERM BP— 1 042 5), N ec 1— 5 20 _ 1 (F ERM BP— 1 0426), N ec 1— 845-2 (FERM B P_ 1 042 7) , N ec 1— 8 34— 1: (F ERM BP— 1 0428), N ecl-9 64- 1 (FERM BP— 1 0 6 8 3), N ec 1-1 302-2 (FERM B P- 1 06 84), Ne cl-5 54- 1 (F ER MB P
  • Ne cl_803_2 (F ERM BP—1041 7), Ne cl—24 4-3 (FERM BP—10423), N ec 1—530—1 (F ERM BP 1 10424), N ec 1 _ 903 _ 1 (FERM BP— 10425), N ec 1 -520-1 (F ERM BP_10426), Ne cl— 845— 2 (F ER MBP— 10427), N ec 1— 834— 1 (F ERM BP— 10428), Ne cl— 964— 1 (F ERM BP— 1 0683), Ne cl— 1302— 2 (FERM BP— 10684), N ec 1— 554— 1 (FERM BP— 10 681), N ec 1— 769— 2 (F ERM BP—10682) or Nec 8 -41 16-8 (FERM BP—10685) and the hybridoma cell according to [15] above,
  • the amino acid sequences of the first complementarity determining region (CDR1), second complementarity determining region (CDR2) and third complementarity determining region (CDR3) of the antibody heavy chain variable region respectively ( i) SEQ ID NO: 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280 and 296, one SEQ ID NO: selected from the group consisting of, and (ii) SEQ ID NO: 185, 201, 217, 233, 249, One sequence number selected from the group consisting of 265, 281 and 297 and (iii) one sequence number selected from the group consisting of SEQ ID NO: 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282 and 298
  • the antibody according to the above [1] comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by
  • [19a] Amino acid sequence of the first complementarity determining region (CDR1), second complementarity determining region (CDR2), and third complementarity determining region (CDR3) of the antibody heavy chain variable region, respectively SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, and the antibody according to [19] above, which comprises the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 186,
  • the amino acid sequence of the first complementarity determining region (CDR1), second phase determining region (CDR2) and third complementarity determining region (CDR3) of the antibody heavy chain variable region The antibody according to [19] above, which comprises an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, and SEQ ID NO: 234;
  • [19g] Amino acid sequences of the first complementarity determining region (CDR1), second complementarity determining region (CDR2) and third complementarity determining region (CDR3) of the antibody heavy chain variable region, respectively No. 280, SEQ ID NO: 281 and SEQ ID NO: 282
  • the amino acid sequences of the first complementarity determining region (CDR 1), the second complementarity determining region (CDR2) and the third complementarity determining region (CDR3) of the antibody light chain variable region are respectively (Iv) SEQ ID NO: 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288 and 304, one sequence number selected from the group consisting of: '(V) SEQ ID NO: 193, 209, 225, 241, 257 , 273, 289 and 305, one selected from the group consisting of: and (vi) one selected from the group consisting of: 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290 and 306
  • [20a] Amino acid sequence strength of the first complementarity determining region (CDR1), second complementarity determining region (CDR2) and third complementarity determining region (CDR3) of the antibody light chain variable region,
  • Antibody light chain variable region first complementarity determining region (CDR1), second complementarity determining region (CDR2) and third complementarity determining region (CDR3) amino acid sequences respectively SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257 and SEQ ID NO: 258, the antibody according to [2.0] above, which comprises the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by
  • [20 g] The amino acid sequence of the first complementarity determining region (CDR1), second complementarity determining region (CDR2) and third complementarity determining region (CDR3) of the antibody light chain variable region,
  • a diagnostic agent a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or a monoclonal antibody against a partial peptide or a salt thereof.
  • [2 8] A monoclonal antibody against a mammal, a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or a partial peptide thereof or a salt thereof
  • a method of preventing or treating cancer characterized by administering an effective amount of an antibody;
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or a partial peptide thereof or a salt thereof A method of promoting apoptosis of cancer cells, comprising administering an effective amount of a monoclonal antibody;
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or a partial peptide thereof, A method for inhibiting cancer cell growth, comprising administering an effective amount of a monoclonal antibody against the salt,
  • a protein containing the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or a partial peptide thereof or a salt thereof A method of cancer cell injury utilizing a biological defense mechanism via the Fc region of an antibody, comprising administering an effective amount of a monoclonal nanore antibody,
  • a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 for producing an apoptosis promoter for cancer cells, or a part thereof The use of monoclonal antibodies against peptide or its salts,
  • SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 for producing a cancer cell growth inhibitor Use of a monoclonal antibody against a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as represented by or a partial peptide or salt thereof,
  • Ne cl -803-2 (F ERM BP— 1041 7), N ec 1— 2 44-3 (FERM BP— 10423), N ec 1— 530— 1 (FE RM B P-10424), Ne cl -903- 1 (FERM BP— 10425), Ne c l-520-1 (F ERM BP— 10426), Ne c 1— 845— 2 (FE RM BP— 10427), Ne cl— 834— 1 (F ERM BP— 10428), Ne cl— 964— 1 (FERM BP— 10683), Ne cl— 1302— 2 (FERM BP— 10684), N ec 1 _ 554— 1 (F ERM BP— 10 681), N ec 1—769—2 (F ERM BP—10682) or Nec 8 -41 16-8 (FERM BP—10685) or the prevention or prevention of breast cancer comprising a monoclonal antibody produced
  • Ne c 8- 41 16- 8 (FERM BP- 10685) and the monoclonal antibody produced by High Priestess dormer cells that appear in Nect in - monoclonal antibody that competitively bind to 2, Ne c 8_3704_7 (FERM BP—10807) or N ec 8— 351 7— 1 1 (FERM BP—10806), the preventive or therapeutic agent for breast cancer according to [37] above,
  • the amino acid sequences of the first complementarity determining region (CDR1), second complementarity determining region (CDR2), and third complementarity determining region (CDR3) of the antibody heavy chain variable region (I) SEQ ID NO: 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280 and 296, selected from the group consisting of: (ii) SEQ ID NO: 185, 201, 217, 233, 249, 265, SEQ ID NO: selected from the group consisting of 281 and 297 (iii) SEQ ID NO: amino, represented by SEQ ID NO: selected from the group consisting of 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282 and 298
  • a preventive or therapeutic agent for breast cancer comprising an antibody comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the acid sequence
  • Amino acid sequence strengths of the first complementarity determining region (CDR1), second complementarity determining region (CDR2) and third complementarity determining region (CDR3) of the antibody light chain variable region respectively (iv ) SEQ ID NO: 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288 and 304 selected from the group consisting of: (V) SEQ ID NO: 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289 and 305 (Vi) SEQ ID NOs: 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290 and 306, identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by the SEQ ID NO: selected from the group consisting of A preventive or therapeutic agent for breast cancer comprising an antibody comprising the same amino acid sequence,
  • the amino acid g sequence of the first complementarity determining region (CDR1), second complementarity determining region (CDR2) and third complementarity determining region (CDR3) of the antibody heavy chain variable region is (I) SEQ ID NOs: 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280 and 296, (ii) SEQ ID NOs: 185, 201, 217, 233, 249, 265 , SEQ ID NO: selected from the group consisting of 281 and 297 and (iii) SEQ ID NO: amino acid sequence represented by SEQ ID NO: selected from the group consisting of 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282 and 298
  • Ne cl—1044—4 (FERM BP—10805), Ne c 8—3517-1 1 (F ERM BP—10806) or N ec 8—3704—7 (F ERM BP-10807) Hybridoma cells,
  • Ne cl 1 1044 1 4 (FERM BP 1 10805) ⁇ Ne c 8 1 3517-1 1 (F ERM BP—10806) or N ec 8— 3704—7 (F ERM BP—10807)
  • F ERM BP—10807 A monoclonal antibody that competitively binds to a monoclonal antibody produced from a hybridoma cell;
  • a preventive or therapeutic agent for breast cancer comprising the monoclonal antibody according to [45] or [46] above,
  • the amino acid sequence strengths of the first complementarity determining region (CDR1), second complementarity determining region (CDR2) and third complementarity determining region (CDR3) of the antibody heavy chain variable region respectively (i ) SEQ ID NO: 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280 and 296, selected from the group consisting of: (ii) SEQ ID NO: 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281 and SEQ ID NO: selected from the group consisting of 297 and (iii) SEQ ID NO: comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: selected from the group consisting of 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282 and 298
  • a prophylactic or therapeutic agent for breast cancer comprising an antibody that competitively binds to the antibody
  • the amino acid sequences of the first complementarity determining region (CDR 1), the second complementarity determining region (CDR2) and the third complementarity determining region (CDR3) of the antibody light chain variable region respectively (iv ) SEQ ID NO: 192, 208, 224, 240, 256, 272,
  • a monoclonal antibody against a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, a partial peptide thereof or a salt thereof is, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer) , Lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain tumor, blood tumor, etc.)
  • Therapeutic agents preferably, preventive / therapeutic agents for breast cancer, lung cancer, colon cancer, prostate cancer, ovarian cancer, knee cancer, etc.
  • cancer cell apoptosis promoter cancer cell proliferation inhibitor
  • cancer cell cell cycle change Inducer anti It can be safely used as a cancer cytotoxic agent that utilizes a biological defense mechanism via the Fc region of the body or an antibody-dependent cancer cytotoxic agent.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the antibody of the present invention obtained in Example 1 (SEQ ID NOs: 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283 and 299) and the light chain variable region. Amino acid sequences (SEQ ID NOs: 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291 and 307).
  • FIG. 2 shows the base sequence (SEQ ID NOs: 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287 and 303) of the heavy chain variable region of the antibody of the present invention obtained in Example 1.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the L chain variable region of the antibody of the present invention obtained in Example 1 (SEQ ID NOs: 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295 and 311).
  • FIG. 4 shows a practical change in average tumor volume after transplantation of cancer cell lines in Example 23.
  • Nectin-2 Protein comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by (hereinafter, Nectin - 2 alpha and abbreviated) or ⁇ ID NO: amino acid sequence identical or represented by 3
  • a protein containing substantially the same amino acid sequence hereinafter abbreviated as Nectin-2 ⁇
  • Nectin-2 both may be referred to as Nectin-2 or the protein of the present invention
  • Animals of animals eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, hidges, tusks, monkeys, etc.
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 is about 50% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. , Preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more. Examples include amino acid sequences.
  • Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 include, for example, the aforementioned SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence and having substantially the same quality of activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 is preferred.
  • Substantially homogeneous means that their properties are qualitatively homogeneous (eg, physiologically or pharmacologically). Therefore, the activity of the protein of the present invention is equivalent (eg, about 0.1 to 1: 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to
  • the quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • Nectin-2 includes, for example, (i) 1 or 2 or more (for example, about 1 to 50, preferably:! To 3) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. About 0, more preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5) amino acid deletion sequence, (ii) represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 1 or 2 or more (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 for example, about 1 to 50, preferably It is';! About 30 to 30 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably a number (1 to .5) amino acids, (iv) S
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the protein in the present specification has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide labeling.
  • the protein used in the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, has a C-terminal carboxyl group (-C00H) Hcarboxylate (-C00-) Any of amide (—C0NH 2 ) and ester (—C00R) may be used.
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl
  • ⁇ I 6 alkyl group such as n- butyl, for example, consequent opening pentyl
  • C 3 one s cycloalkyl group such as cyclohexyl consequent opening , for example, phenyl, C 6 _ 1 2
  • Ariru groups such as single naphthyl Le shed, for example, benzyl, such as phenethyl phenylene Lou C _ 2 alkyl or ⁇ - naphthylmethyl etc.
  • ⁇ - Nafuchiru C i -! 2 alkyl Group, bivalyloxymethyl group and the like are used.
  • Nectin-2 has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • those having a carboxyl group amidated or esterified are also included in 'Nectin-2 used in the present invention.
  • the ester in this case, for example, the aforementioned C-terminal ester or the like is used.
  • the Nectin- 2, amino acid residues (e.g., Mechionin residues) of the N-terminal amino group is protecting group (e.g., formyl groups, C such Asechiru groups - such as C ⁇ 6 Ashiru group such as s Arukanoiru ), N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo is pyroglutamine oxidized, and a substituent on the side chain of amino acid in the molecule (eg, 1 OH, 1 SH, amino) Group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc.) are suitable protecting groups (for example, C such as formyl group, acetyl group). ! _ 6 Arukanoiru such Ashiru group such group) as are protected with, or sugar chain also includes conjugated proteins such as glycoproteins bound.
  • protecting group e.g., formyl groups, C such Asechiru groups - such as C ⁇ 6 Ashiru group such as
  • Nectin-2 include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Nectin-2) and a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (Nectin-2 ⁇ ) Etc. +
  • the Nectin-2 partial peptide may be any of the above-mentioned Nectin-2 partial peptides, preferably any one having the same properties as Nectin-2.
  • the constituent amino acid sequences of Nectin-2 preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, and most preferably 200 Peptides having the above amino acid sequences are used.
  • the partial peptide of Nectin-2 used in the present invention is 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, more preferably, in the amino acid sequence.
  • a number (1-5) of amino acids are deleted, or 1 or 2 or more (preferably about 1-20, more preferably about 1-10, more preferably a number in the amino acid sequence) (1-5) amino acids are added, or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20 pieces, more preferably: about 1 to about 10 pieces, and more preferably a number to the amino acid sequence. (1-5) amino acids, or 1 or 2 (preferably about 1-20, more preferably about 1-10) in the amino acid sequence. Preferably several, more preferably about 1 to 5 amino acids are other amino acids It may be substituted.
  • the partial peptide of Nectin- 2 may be any of a carboxyl group (—C00H), a carboxylate (—C0 (T), an amide (—C0NH 2 ), or an ester (—C00R) at the C-terminus.
  • Nectin-2 partial peptides have a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminus, as well as Nectin-2, and N-terminal amino acid residues (eg, methionine residue).
  • Group is protected with a protecting group, and the glutamine residue generated by cleaving the N-terminal side in vivo is pyroglutamine oxidized, but the substituent on the amino acid side chain in the molecule is appropriately protected.
  • those protected by a group or complex peptides such as so-called sugar peptides to which sugar chains are bound.
  • Nectin-2 or its partial peptide salts include salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal salts), especially physiological.
  • the acid addition salts that are acceptable are preferred.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the monoclonal antibody against Nectin-2 or its partial peptide or its salt (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) is an antibody that can recognize Nectin-2 or its partial peptide or its salt. Any monochrome monoclonal antibody may be used. Of these, human monoclonal antibodies are preferably used.
  • the antibody of the present invention is preferably a monoclonal antibody (particularly a human monoclonal antibody) against Nectin-2 8, or a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • an antibody having at least one of the following characteristics (1) to (8) is preferably used.
  • cancer cells eg, human cancer cells O V—90.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • Nectin-2 homozygous cis dimer and Nectin-2 homozygous cis dimer inhibit trans-binding
  • Nectin- 2 alpha homo cis dimer Inhibits the trans-binding of Nectin-2 ⁇ with a homologous cis dimer
  • Nectin-2 which inhibits the trans-binding of heterozygous cis dimer with Nectin-2 ⁇ and homo cis dimer of Nectin-3,
  • Example 4 It belongs to any of the epitope groups I to VII shown in Example 4 or the epitope subgroup shown in Example 18. Preferably, it belongs to Epitorp Group IV, VI or VII of Example 4. More preferably, it belongs to the epitopic subgroup IVb, VIb or Vila of Example 18.
  • Ne cl— 803-2 (FERM BP_ 1041 7), Ne cl— 244-3 (FERM BP _ 10423), N ec 1— 53.0— 1 (FE RM BP— 10424), N ec 1— 903 — 1 (FERM BP-10425), Ne cl 1 520— 1 (F ERM BP— 10426), Ne c 1— 845— 2 (FE RM BP— 10427), Ne c 1— 834— 1 (FERM BP— 10428 , Ne cl -964-1 (F ERM BP— 1 0683), Ne cl— 1 302— 2 (FERM BP _ 10684), N ec 1— 554— 1 (F ERM BP—10 681), Ne cl— 769 — 2 (F ERM BP— 10682) or Nec 8 -41 16-8 (FERM BP— 10685)) monoclonal antibodies produced by hybridoma cells (
  • amino acid sequence of the epitope site (Ii).
  • One or more amino acids in the amino acid sequence of the epitope site (for example, about 1-10, preferably several (1-5) amino acids) are deleted.
  • About 1 to 10, more preferably a number (1 to 5) of amino acid sequences added with amino acids, (iii) 1 or more (eg, about 1 to 10) amino acid sequences in the epitope site More preferably, an amino acid sequence in which a number (1-5) amino acids are inserted, (iv) 1 or 2 or more (for example, about 1 to 10 in the amino acid sequence of the epitope site, more preferably a number ( Amino acid sequences in which 1 to 5) amino acids have been substituted with other amino acids, or (V) amino acid sequences in which (i) to (iv) above are combined.
  • the position of insertion, addition, deletion or substitution of the above amino acid sequence is not particularly limited.
  • amino acid sequence substantially identical to the epitope site includes an amino acid sequence in the vicinity of the epitope site.
  • amino acid sequences on the N-terminal side of the epitope portion For example, about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5) amino acid sequence added
  • C-terminal side of the epitope moiety (Iii) amino acid sequence on the N-terminal side of the epitope moiety (for example, about 1 to 2 or more '(for example, about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids.
  • amino acid sequences are added with one or more (for example, about 1 to 10, more preferably number (1 to 5)) amino acids (Iv)
  • One or more amino acid sequences (for example, 1 to 2) in the amino acid sequence of (iv) amino acid sequence (for example, about 1 to 10, more preferably (1 to 5)) on the C-terminal side of the epitope moiety
  • amino acid sequence with about 10 amino acids, more preferably several (1-5) amino acids attached, and the like can be mentioned.
  • Ne c .1 -769-2 (FERM BP— 10682) or.
  • an antibody that competitively binds to a monoclonal antibody produced by each hybridoma cell for Nectin-2 ⁇ or Nectin-2 ⁇ refers to any of the 12 types of antibodies described above. Refers to an antibody that competitively inhibits binding to Nectin-2 or Nectin-2 ⁇ by adding an excess amount of, for example, the above-mentioned 12 types of antibodies against the antibody. An antibody that exhibits a binding inhibition rate of about 50 to 100% when any of the antibodies is added in a 50-fold molar amount.
  • Ne c 1-76 F ERM BP— 1 0 6 8 2
  • amino acid sequence A is about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably, amino acid sequence A.
  • amino acid sequence A is about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably, amino acid sequence A.
  • Ne c 1-769-2 (FERM AB P— 10682) or.
  • an antibody that competitively binds to a monoclonal antibody produced by each hybridoma cell against Nectin-2 ⁇ or Nectin-2 ⁇ refers to any of the above 12 types of antibodies. It refers to an antibody in which binding to Nectin-2 ⁇ or Nectin-25 is competitively inhibited by adding an excess amount. Specifically, for example, any of the above 12 types of antibodies against the antibody An antibody that exhibits a binding inhibition rate of about 50 to 100% when added in a 50-fold molar amount.
  • amino acid sequence A is about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably, amino acid sequence A.
  • amino acid sequence A is about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably, amino acid sequence A.
  • amino acid sequence A is about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95%
  • an antibody containing an amino acid sequence substantially the same as amino acid sequence A examples include, for example, a protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence A and containing the amino acid sequence A.
  • An antibody having substantially the same activity as that of the antibody is preferable.
  • “Substantially homogeneous” means that their properties are homogeneous in nature (eg, physiologically or pharmacologically). Therefore, it is preferable that the activity of the antibody is equivalent (eg, about 0.1 1 to: 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). However, quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • Examples of the monoclonal antibody containing the amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence A include, for example, (i) 1 or more of amino acid sequence A (for example, about 1 to 50, Preferably about 1 to 30 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably a number (1 to 5) amino acids deleted, (ii) 1 or 2 in amino acid sequence A
  • An amino acid sequence attached with more than 1 (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids (Iii) 1 or 2 or more (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5) in amino acid sequence A Amino acid sequence in which amino acids are inserted, (i V) 1 in amino acid sequence A Or two or more (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids are other amino acids
  • the antibodies of the present invention include chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and antibody fragments.
  • “Chimeric antibody” means an antibody having a variable region derived from a heterologous antibody and a human antibody constant region (see, for example, European Patent Publication EP 0 1 2 500 23).
  • a “humanized antibody” is a modification of a heterologous antibody for humans such as mice.
  • Human antibody means a monoclonal antibody prepared using a transgenic animal into which a human antibody gene has been introduced (see European Patent Publication EP 0 5 4 6 0 7 3) and a human antibody gene as bacteriophage, E. coli Produces antibodies against the surface of cells such as yeast and animal cells and ribosomes, monoclonal antibodies (Nature Biotechnology 23, 1105 (2005)) and Nectin-2 produced using so-called antibody display technology It means a monoclonal antibody isolated from human B cells using cell fusion or fuzzy display techniques.
  • antibody fragment refers to a part of a full-length antibody, and generally includes an antigen-binding region or a variable region.
  • Antibody fragments include, for example, F ab, F ab, F (ab ′) 2 , single chain antibody (s C F v), disulfide stabilized antibody (ds FV) and the like.
  • the antibody according to a preferred embodiment of the present invention is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Nectin-2 ⁇ ) or SEQ ID NO: 3 (Nectin-2 5), of the 1st to 350th positions (extracellular region).
  • Epitopes present in amino acid sequence 47th to 142nd positions of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Nectin-2 a) or SEQ ID NO: 3 (Nectin-2 ⁇ ) (first; EG-like domain) or epitopes present in the amino acid sequence of positions 175-240 (second IG-like domain); or SEQ ID NO: 1 (Nectin-2) or SEQ ID NO: 3 (Nectin-2 ⁇ )
  • SEQ ID NO: 1 (Nectin-2) or SEQ ID NO: 3 (Nectin-2 ⁇ ) An amino acid sequence containing at least one amino acid residue at positions 75, 76, 77, 78, 95, 137, 145, 173, 184, 186, and 212 is recognized.
  • the present invention also provides a monoclonal antibody containing a specific CDR amino acid sequence or variable region amino acid sequence. Furthermore, the present invention also provides a monoclonal antibody light chain or a fragment thereof, a monoclonal antibody heavy chain or a fragment thereof comprising a specific CDR amino acid sequence.
  • variable regions at the far ends of the heavy and light chains of the antibody which are called the heavy chain variable region (VH) and the light chain variable region (VL), respectively.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • CDR complementarity determining region
  • the portion of the variable region other than the C D R has a role of maintaining the C D R structure, and is called a framework region (F R).
  • F R framework region
  • the heavy chain variable region includes three complementarity determining regions, a first complementarity determining region (CDR 1), a second complementarity determining region (CDR2), and a third complementarity determining region (CDR3). Exists.
  • the three complementarity determining regions in the heavy chain variable region are collectively called the heavy chain complementarity determining region.
  • the light chain variable region there are three complementarity determining regions: a first complementarity determining region (CDR1), a second complementarity determining region (CDR2), and a third complementarity determining region (CDR3).
  • the three complementarity determining regions in the light chain variable region are collectively referred to as the light chain complementarity determining region. .
  • the antibody comprises a first complementarity determining region (CDR 1), a second complementarity determining region (CDR 2) and a third complement of an antibody heavy chain variable region.
  • CDR 1 complementarity determining region
  • CDR 2 complementarity determining region
  • CDR 3 complementarity determining region
  • SEQ ID NO: selected from the group consisting of SEQ ID NO: 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280 and 296,
  • SEQ ID NO: SEQ ID NO: selected from the group consisting of 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281 and 297
  • the amino acid sequence is identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: selected from the group consisting of:
  • the antibody according to another preferred embodiment of the present invention comprises a first complementarity determining region (CDR 1), a second complementarity determining region (CDR2) and a third complementarity determining region (
  • the amino acid sequence of CDR 3) is selected from the group consisting of (iv) SEQ ID NO: 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288 and 304, (v) SEQ ID NO: 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289 and 305 selected from the group consisting of SEQ ID NO: opi (vi) SEQ ID NO: 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290 and 306 It contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by the selected SEQ ID NO.
  • the CDR sequence of the antibody of the present invention is not necessarily limited, preferred combinations of amino acid sequences as VH CDR1, VH CDR2 and VH CDR3, and preferred combinations of amino acid sequences as VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3 are: These are shown in Tables 21 and 22 below.
  • the amino acid sequence other than CDR is not particularly limited, and so-called CDR-grafted antibodies in which the amino acid sequence other than CDR is derived from other antibodies, particularly other types of antibodies, are included in the antibody of the present invention.
  • human-derived amino acid sequences are preferred.
  • amino acid sequences and base sequences of the antibody variable regions of the present invention are preferably those shown in Table 25.
  • a known method can be used to prepare a monoclonal antibody containing a specific CDR amino acid sequence or variable domain amino acid sequence of the present antibody.
  • the antibody of the present invention is a monoclonal antibody in which the constant region of the antibody is preferably a human antibody, more preferably a human IgG, and more preferably a human IgG1 subclass.
  • Nectin-2 An antibody against Nectin-2 or a partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter, these are simply abbreviated as Nectin-2 in the description of the antibody) is a known antibody or antiserum. Can be manufactured according to the law.
  • Examples of the antigen used for preparing the antibody of the present invention include a protein (Nectin-2) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or a partial peptide thereof, or their A cell line that naturally or artificially highly expresses a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 (Nectin-2) or a membrane fraction thereof, Nectin-2 Any protein such as a fusion protein of an extracellular domain protein and other protein or peptide or a salt thereof, or a (synthetic) peptide having one or more antigenic determinants identical to Nectin-2 may be used. (Hereinafter, these may be simply referred to as the antigen of the present invention).
  • antigen of the present invention examples include a cell line that naturally or artificially highly expresses Nectin-2 or a membrane fraction thereof, an extracellular region protein of Nectin-2 or a salt thereof, and an extracellular region of Nectin-2.
  • a fusion protein of a region and other proteins or peptides, or a (synthetic) peptide having one or more antigenic determinants identical to Nectin-2 is preferably used.
  • proteins or peptides for example, FLAG- tag, His-tag, Myc- tag, V5-tag, GST-tag, S- tag, T7-tag s Ya human antibody, Fc, such as a mouse antibody
  • the length of such a (synthetic) peptide is not particularly limited as long as it has an immunogenicity. For example, six, preferably 10, and more preferably 12 consecutive amino acid residues are present. The thing which has group is mentioned.
  • Nectin-2 or a partial peptide thereof or a salt thereof can be produced from the aforementioned human warm-blooded animal cells or tissues by a known protein purification method or a method analogous thereto, or a DNA encoding the protein. It can also be produced by culturing a transformant containing. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below. A fusion protein of the extracellular region of Nectin-2 and another protein or peptide can be produced by culturing a transformant containing DNA encoding the fusion protein.
  • the antigen of the present invention or a salt thereof is prepared from a tissue or a cell of a human warm-blooded animal (for example, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, puta, hidge, ushi, monkey, etc.)
  • a human warm-blooded animal for example, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, puta, hidge, ushi, monkey, etc.
  • the crude fraction eg, membrane fraction, soluble fraction
  • extraction with acid, surfactant or alcohol is performed, and the extracted solution is subjected to chromatography such as salting out, dialysis, gel filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. It can also be purified and isolated by combining.
  • Nectin-2 DNA completely encoding Nectin-2 or its partial peptide (hereinafter, in the description of cloning and expression of DNA encoding these, these may be simply abbreviated as Nectin-2)
  • Nectin-2 the ability to amplify by PCR using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence coding for Nectin-2 or DNA incorporated into an appropriate vector or a part of Nectin-2 Labeled with a DNA fragment encoding the entire region or synthetic DNA
  • the cage polynucleotide used for PCR may be any nucleotide as long as it contains a nucleotide sequence encoding Nectin-2.
  • any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-mentioned cell 'tissue-derived cDNA, the above-mentioned cell' tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA may be used.
  • the hybridization method can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2 ⁇ (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lao. Press, 1989).
  • it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions.
  • High stringent conditions are, for example, conditions where the sodium concentration is about 19 to 4 Om M, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. . In particular, it is most preferable that the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the DNA encoding Nectin-2c is a DN containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2) A, etc.
  • (ii) which encodes a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (Nectin-2S) D ⁇ ⁇ is a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 Etc.
  • the DNA base sequence can be converted using PCR, a known kit such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo), etc. It can be carried out according to a method known per se such as the Gapped duplex method and the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the cloned DNA encoding Nectin-2 can be used as it is depending on the purpose, or if desired, digested with a restriction enzyme or attached with a linker.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • DNA that codes for the extracellular region of Nectin-2 cloned or synthesized by the same method as described above and DNA encoding other proteins (peptides) are known per se or in accordance with them. Can be linked according to the method.
  • Nectin-2 expression vectors include, for example, (i) by cutting out the DNA fragment of interest from DNA encoding Nectin-2 and (mouth) ligating the DNA fragment downstream of the promoter in an appropriate expression vector. Can be manufactured.
  • vectors examples include plasmids derived from E. coli (eg, p BR 322, p BR 325, pUC 12, pUC 13), and plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB 110, pTP 5, pC 1 94). Plasmids derived from yeast (eg, p SH 1 9, p SH 15), bacteriophages such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus and vaccinia virus, insect viruses such as baculovirus, and p A 1— 1 1, pXT l, pR c / CMV, p R c / RSV, pc DNA I / Neo, etc. are used. ',
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SRa promoter when animal cells are mainly used, SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter motor, CMV (cytomegaloinoles) promoter, HSV ⁇ TK promoter and the like can be mentioned.
  • CMV promoter SR promoter, etc.
  • the host is Eshierihia genus bacterium, trp promoter, lac flop port motor, rec A promoter, 1 P L promoter 1 pp promoter, T 7 promoter, if the host is Bacillus, S pol promoter
  • yeast such as a promoter, a SPO2 promoter, and a pe ⁇ ⁇ promoter
  • the ⁇ 5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferred.
  • a polyhedrin mouth motor, p10 promoter, etc. are preferable.
  • the expression vector contains enhancer, splicing signal, poly A addition signal, selection marker, SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), etc. Can be used.
  • a selection marker for example, dihydrofolate reductase (hereinafter, d h f r
  • MTX metalhotrexate
  • Amp r ampicillin resistant gene
  • N eo r neomycin resistant gene
  • Nectin-2 adds a signal sequence suitable for the host to the N-terminal side of Nectin-2. If the host is a genus Escherichia, the PhoA signal sequence, ⁇ , the signal sequence, etc. If the host is a Bacillus genus, the ⁇ -amylase signal sequence, saplicin signal sequence, etc. In the case of yeast, MF a ⁇ signal sequence, SUC 2 ⁇ signal sequence, etc. If the host is an animal cell, insulin signal sequence, one interferon 'signal sequence, antibody molecule ⁇ signal sequence, etc. are used. it can.
  • hosts examples include Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, and animal cells.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli K 1 2-DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 ⁇ , 160 (1968)], JM1 0 3 [Nucleic Acids Research, 9 ⁇ , 309 (1981)], JA 2 2 1 [Journal of Molecular Biology, 120 ⁇ , 517 (1978)], HB 1 0 1 [Journal of Molecular Biology, 41 ⁇ , 459 (1969)], C 6 0 0 [Genetics, 39 ⁇ , 440 (1954)] is used.
  • Bacillus examples include Bacillus subtilis MI 1 1.4 [Gene, 24 ⁇ , 255 (1983)], 2 07-2 1 [Journal of Biochemistry, 95 95, 87 (1984)] Is used.
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH 2 2, AH 2 2 R—, NA 8 7-1 1 A, DKD— 5 D, 2 0 B— 1 2 and Schizosaccharomyces pombe ) NCY C 1 9 1 3, NCYC 2 0 3 6, Pichia pastoris KM 7
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, larvae-derived cell lines derived from night stealing (Spodoptera frugiperda cell; Sf cells), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, derived from eggs of Trichoplusia ni High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • Sf cells cocoon-derived cell lines (Bombyx mori N cells; BmN cells) are used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCCCRL1711), Sf21 cells (hereinafter, Vaughn, J.L. et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)).
  • insects examples include silkworm larvae [Maeda et al., Nature, 3 1 5 3, 5 9 2 (1 98 5)].
  • animal cells include monkey COS-7 cells, Vero cells, Chinese hamster CHO cells (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster CHO cells (hereinafter CHO (dhf ⁇ -) cells) Abbreviated), mouse L cells, mouse At ⁇ —20 cells, mouse myeloma cells, mouse ATDC 5 cells, mouse NS 0 cells, mouse FM3 A cells, rat GH3 cells, human FL cells, human fetal HE K 2 9 3 cells, human fetal cells 2 9 3 F cells, etc. are used. Transformation of Escherichia can be carried out, for example, according to the method described in Pro Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17 ⁇ , 107 (1982).
  • Transformation of Bacillus can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, I 68 ⁇ , 111 (1979).
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a liquid medium is suitable as the medium used for the cultivation, including a carbon source necessary for the growth of the transformant.
  • Nitrogen sources include, inorganic substances and the like.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn sheep 'liquor, peptone, force zein, meat extract, soybean cake, potato extract.
  • inorganic or organic substances and inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • M 9 medium containing glucose and casamino acid For example, M 9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] I like it. If necessary, in order to make the promoter work efficiently, for example, a drug such as 3 ⁇ -monodenoletalic acid can be added.
  • the culture is usually performed at about 30 to 0 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
  • examples of the medium include Burkholder minimum medium [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 ⁇ , 4505 (1980)] and 0.5. SD medium containing% casamino acid [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 ⁇ , 5330 (1984)]. It is preferable to adjust the pH of the medium to about 5-8. Cultivation is usually carried out at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and if necessary aeration and stirring are added.
  • the medium When cultivating a transformant whose host is an insect cell or an insect, the medium is an additive such as 10% urchin blood that has been inactivated to Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)). Those added as appropriate are used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Incubate at approximately 27 ° C for approximately 3-5 days, if necessary
  • examples of the medium include: MEM medium [Science, 122 ⁇ , 501 (1952)] containing about 5 to 20% fetal calf serum, DMEM medium (Virology, 8 ⁇ , 396 (1959)], RPMI 1 6 40 0 medium [The Journal of the American Medical Association, 199 ⁇ , 519 (1967), 1 9 9 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73 (1950)] etc. H is preferably about 6 to 8. Incubation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, if necessary Add aeration and agitation.
  • Nectin-2 can be generated inside the cell, the cell membrane, or extracellularly of the transformant.
  • Nectin-2 For separation and purification of Nectin-2 from the above culture, for example, the following method can be used.
  • Nectin-2 When extracting Nectin-2 from cultured cells or cells, after culturing, collect the cells or cells by a known method, suspend them in an appropriate buffer, and use ultrasound, lysozyme and Z or frozen. For example, a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration after disrupting cells or cells by thawing or the like is appropriately used.
  • the buffer solution may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X—100 ⁇ . If Nectin-2 is secreted into the culture medium, the cells or cells are separated from the supernatant by a method known per se after completion of the culture, and the supernatant is collected.
  • Nectin-2 contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be performed by appropriately combining per se known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods that utilize solubility, such as salting-out solvent precipitation methods, dialysis methods, ultrafiltration methods, and gel filtration methods that mainly use differences in molecular weight. ⁇ Methods using charge differences such as ion exchange chromatography, methods using specific affinity such as affinity chromatography, hydrophobic interactions such as hydrophobic interaction chromatography, and reverse phase chromatography The method of using the method, the method of using the difference in isoelectric point such as chromatophore force singing, etc. are used.
  • Nectin-2 obtained in this way is obtained in the free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely when obtained as a salt
  • -Nectin-2 produced by recombinants can be modified arbitrarily or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginylendopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used as protein modifying enzymes.
  • Nectin-2 thus produced can be measured by Western blotting or the like using a specific antibody.
  • Mammalian cells that express Nectin-2 themselves can also be used directly as the antigen of the present invention.
  • a mammalian cell a natural cell as described in the above section (a), a cell transformed by the method as described in the above section (b), and the like can be used.
  • the host used for transformation may be any cell collected from humans, monkeys, rats, mice, hamsters, and the like.
  • HEK293 cells, C0S7 cells, CHO-K1 cells, NIH3T3 cells, Balb3T3 cells, FM3A cells, L929 cells, SP2 / 0 cells, P3U1 cells, NS0 cells, B16 cells, or P388 cells are preferably used.
  • a (synthetic) peptide or salt thereof having one or more of the same antigenic determinants as Nectin-2 can be prepared according to a peptide synthesis method known per se, or Nectin-2 with an appropriate peptidase. It can be manufactured by cutting.
  • a peptide synthesis method for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the peptide and the remaining portion, and removing the protecting group when the product has a protecting group. Examples of known condensation methods and protecting group removal include the methods described in the following (i) to (V).
  • the partial peptide used in the present invention can be purified and isolated by combining liquid chromatography and recrystallization.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when obtained as a salt, the known method or It can be converted to a free form or other salt by a method similar to that.
  • the antigen of the present invention is administered to a warm-blooded animal.
  • an immunization method any method can be used as long as it can promote antibody production, and intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intradermal injection, footpad injection, etc. are preferably used. . '
  • Natural mammalian cells or transformed mammalian cells expressing the protein of the present invention were suspended in a medium (eg, RPMI1640) or buffer (eg, Hanks' Balanced Salt Solution) used for tissue culture.
  • the immunized animal can be injected in a state.
  • the antigen of the present invention can be directly immunized with an insoluble antigen.
  • a complex obtained by binding or adsorbing the antigen of the present invention to an appropriate carrier may be immunized.
  • the mixing ratio between the carrier (carrier) and the antigen (hapten) of the present invention is such that the antibody can be efficiently produced against the antigen of the present invention bound or adsorbed to the carrier, and what ratio is what.
  • a natural or synthetic polymer carrier usually used for the production of an antibody against a hapten antigen is bound at a ratio of 0.1 to 100 to hapten 1 by weight.
  • an adsorbed product can be used.
  • natural polymer carriers include serum albumin of mammals such as rabbits, rabbits, and humans, such as mammalian thyropurines such as rabbits and rabbits, and 11 animals such as rabbits, rabbits, humans, and hidges. Hemoglobin, keyhole limpet mosyanin, etc. are used.
  • synthetic polymer carrier for example, various latus statuses such as polymers or copolymers of polyamino acids, polystyrenes, polyataryls, polybules, polypropylenes, and the like can be used.
  • a carrier to hapten forces pulling can use various condensing agents, tyrosine, histidine, Jiazoniumu compounds such Bisujiazo of base Njijin bridging the tryptophan, such Gurutaruanore Debito bridging the Amino group comrades Dialdehyde compounds, diisocyanate compounds such as toluene-1,4-diisocyanate, N, N, 1o-phenylene dimaleimides that crosslink thiol groups, maleic groups that crosslink amino groups and thiol groups A medium active ester compound, a carboxyl compound that crosslinks an amino group and a carboxyl group, and the like are conveniently used.
  • an active ester reagent having a dithiopyridyl group on one of the amino groups for example, N-succinimidyl (SPDP) 3- (2-pyridyldithio) propionate
  • SPDP N-succinimidyl
  • a thiol group can be introduced, and after the maleimide group is introduced into the other amino group with a maleimide active ester reagent, both can be reacted.
  • the immunogen of the present invention When administering the antigen of the present invention, the immunogen of the present invention is mixed with an adjuvant such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, Alum, Ribi adjuvant or the like in order to enhance the antibody producing ability of the immunized animal. May be administered to the animal. Administration is usually once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times.
  • an adjuvant such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, Alum, Ribi adjuvant or the like in order to enhance the antibody producing ability of the immunized animal. May be administered to the animal. Administration is usually once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times.
  • DNA immunization may be used (see, for example, Nature, 356, pp. 152-154).
  • warm-blooded animals used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, hamsters, hidges, goats, camels, llamas, and chickens, but mice and rats are preferably used. .
  • These warm-blooded animals may be wild-type animals or K0 animals in which the warm-blooded animal ortholog gene of the antigen protein is knocked out in order to obtain a stronger immune response to the antigen.
  • a transgenic animal in order to prepare a human monoclonal antibody, a transgenic animal (see European Patent Publication EP0546073) knocked-in a warm-blooded animal antibody gene and introduced the human antibody gene (W0 02/098217) Gazette, W0 03/020743 gazette) or the like.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by fusing with other myeloma cells.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured by any method that can quantify the amount of antibody that specifically binds to the antigen. For example, as described below, after reacting a solid-phased protein antigen or antigen-expressing cell line with antiserum, the antibody titer is determined by i. It can be measured.
  • the fusion operation can be carried out according to known methods, for example, the method of Köhler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but preferably PEG is used.
  • myeloma cells include warm-blooded animal myeloma cells such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, and SP2 / 0 and P3U1 are preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PE G6000) is added at a concentration of about 10 to 80%.
  • the cell fusion can be efficiently carried out by incubating at 20 to 40 ° C., preferably 30 to 37 ° C. for 10 to 10 minutes.
  • an electrofusion method may be used as a cell fusion operation for producing monoclonal antibody-producing cells.
  • the selection of the hybridoma can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as the hybridoma can grow.
  • RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal calf serum, GIT medium containing 1-10% fetal calf serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or hybridoma
  • a serum-free medium for culture (S FM_101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks. Cultivation can usually be performed under 5% carbon dioxide. '' Various methods can be used to screen monoclonal antibody-producing hybridomas.For example, soluble protein antigens and protein antigen-expressing cells can be directly
  • a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) adsorbed with a carrier, and then an anti-immunoglobulin antibody (eg, for cell fusion) labeled with a radioactive biomaterial, enzyme, fluorescent substance, etc.
  • a solid phase eg, a microplate
  • an anti-immunoglobulin antibody eg, for cell fusion
  • anti-mouse immunoglobulin antibodies are used) or by reacting protein A to detect monoclonal antibodies bound to the solid phase, or by adsorbing anti-immunoglobulin antibodies or protein A
  • the antigen-specific monoclonal antibody bound to the solid phase is detected by adding the hybridoma culture supernatant to the solid phase and then reacting the soluble protein antigen labeled with a radioactive substance, enzyme, fluorescent substance, etc. The method etc. are mentioned.
  • a protein antigen-expressing cell When using a protein antigen-expressing cell, add a hybridoma culture supernatant to the cell, then react with a fluorescent-labeled anti-immunoglobulin antibody, and then use a fluorescence detector such as a flow cytometer to detect the cell. By measuring the fluorescence intensity, monoclonal antibodies bound to the protein antigen on the cell membrane can be detected.
  • a fluorescence detector such as a flow cytometer
  • the method for producing the antibody of the present invention is not limited to the method described in (a).
  • humans are warm-blooded animals (for example, monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, hamsters, Hedges,
  • An antibody gene library prepared by known methods using B lymphocytes (such as goats, camels, llamas, and chickens) as a material, cell surfaces of bacteriophage, E. coli, yeast, animal cells, etc.
  • B lymphocytes such as goats, camels, llamas, and chickens
  • the so-called antibody display technology presented in can be used.
  • the human warm-blooded animal may be a na ⁇ ve animal, a cancer patient highly expressing the antigen of the present invention, or the antigen of the present invention described in (a). It may be a warm-blooded animal immunized with Examples of antibody forms to be presented on the cell surface include, but are not limited to, IgG molecules, IgM molecules, Fab fragments, single-chain Fv (scFv) fragments, and the like.
  • the gene of the monoclonal antibody (fragment) that specifically binds to the antigen of the present invention is an antibody (fragment) presenting cell or antibody (fragment) presenting ribosome carrying the above-mentioned antibody gene library. After reacting for a certain period of time and washing away non-specifically bound ones, the one that specifically binds to the antigen of the present invention is eluted and recovered, and the antibody (fragment) -presenting cell or antibody (fragment) is recovered.
  • the antibody of the present invention can be obtained by immunizing antibody-producing cells isolated from the above-mentioned warm-blooded animals with the antigen of the present invention in a test tube by a method known per se, and then the same method as described in (a) Can also be obtained by preparing a high-pridor.
  • the monoclonal antibody of the present invention includes the monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in (a), the antibody gene isolated by a known method from the monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in (a), and (b). It can be produced by culturing a recombinant cell line in which the obtained monoclonal antibody gene is artificially expressed.
  • the antibody gene can also be produced by incorporating it into the chromosome of a warm-blooded animal or plant by a known method and producing it in the blood, milk, egg, plant body, brute, etc. of the warm-blooded animal [Curr. Op in. Biotevhnol. 7, 536 (1996), Nature Rev. Genet 4, 794 (2003), Appl.
  • the monoclonal antibody of the present invention is a known method from the above-mentioned monoclonal antibody-containing raw material, for example, an immunoglobulin separation and purification method [eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, ionic exchange method, Mouthmatography, hydrophobic interaction chromatography, reverse phase chromatography, gel filtration chromatography, hydroxyapatite chromatography, antigen or a carrier that has affinity for antibodies such as protein A or protein G Various types of chromatography such as affinity chromatography that separates and purifies only antibodies].
  • an immunoglobulin separation and purification method eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, ionic exchange method, Mouthmatography, hydrophobic interaction chromatography, reverse phase chromatography, gel filtration chromatography, hydroxyapatite chromatography, antigen or a carrier that has affinity for antibodies such as protein A or protein G
  • Examples of the medicament containing the antibody of the present invention described above include cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung).
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung.
  • Therapeutic agents preferably preventive or therapeutic agents for breast cancer, lung cancer, colon cancer, prostate cancer, ovarian cancer, knee cancer, etc.
  • cancer cell apoptosis promoter cancer cell growth inhibitor
  • cancer cell adhesion inhibitor cancer cell adhesion inhibitor
  • cancer cytotoxicity agent using biocidal mechanism through Fc region of antibody, antibody-dependent cancer cytotoxicity agent, etc. be able to.
  • Cancer cell damage methods utilizing the defense mechanism of the antibody through the Fc region include antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cell damage.
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cell damage
  • ADCC is preferably used.
  • the medicine containing the antibody of the invention has low toxicity, and can be used as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form as a human or mammal (eg, rat, rabbit, sheep, pig, ushi, cat). , Inu, monkeys, etc.) or orally (eg, intravascular administration, subcutaneous administration, etc.).
  • a human or mammal eg, rat, rabbit, sheep, pig, ushi, cat.
  • orally eg, intravascular administration, subcutaneous administration, etc.
  • the antibody of the present invention may be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the antibody of the present invention or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • injections and suppositories are used as parenterals for parenteral administration, and injections are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, etc. May be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • a method for preparing an injection it can be prepared, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody of the present invention or a salt thereof in a sterile aqueous liquid or oily liquid usually used for injection.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, etc.
  • solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (.polyoxyethylene 50mol) adduct of hydrogenated castor oilj J etc.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil or the like is used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol or the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule.
  • a suppository used for rectal administration may be prepared by mixing the above-mentioned antibody or a salt thereof with an ordinary suppository base. '
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules) ), Syrups, emulsions, suspensions, etc.
  • Such a composition is produced by a known method, and may contain a carrier, a diluent, or an excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • a carrier and excipient for tablets for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • parenteral or oral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient.
  • dosage form of such a dosage unit include fixed agents, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the content of antibody, per dosage unit form typically 5 to 500 mg, especially at the injection 5 to 100 m g, it is preferable that the antibody of 10 ⁇ 250mg is contained in the other dosage form.
  • the dose of the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent / modulating agent containing the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc. If you want to do this, use the anti-free book of the present invention as a single dose. ⁇ 20mg / kg body weight, preferably 0 :! It is convenient to administer about 10 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day. . In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
  • the antibody of the present invention can be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration comprises the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • a composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration (eg, intravascular injection, subcutaneous injection, etc.).
  • compositions may contain other active ingredients as long as they do not cause an unfavorable interaction by blending with the antibody.
  • the antibody of the present invention may be used for other drugs such as alkyl hydride (eg, cyclophosphamide, ifosfamide, etc.), antimetabolite (eg, methotrexate, 5-fluorouracil, etc.), anticancer antibiotic (eg, For example, mitomycin, adriamycin, etc.), plant-derived anticancer agents (eg, vincristine, vindesine, taxol, etc.), cisplatin, carpoplatin, etopoxide, irinotecan, etc.
  • the antibody of the present invention and the drug may be administered to the patient at the same time or at different times.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize Nectin-2, it can be used for quantification of Nectin-2 in a test solution, particularly quantification by Sandwich immunoassay.
  • the antibody of the present invention is competitively reacted with a test solution and labeled Nectin-2, and the ratio of labeled Nectin-2 bound to the antibody is measured. Quantitative determination of Nectin-2 in the test solution,
  • test solution is reacted with the antibody of the present invention insolubilized on the carrier, and the quantitative change of Nectin-2 bound to the insolubilized carrier is measured by, for example, surface plasmon resonance
  • antibodies having different binding sites for Nectin-2 are preferably used.
  • Nectin_2 In addition to quantification of Nectin_2 using the antibody of the present invention, detection by tissue staining or the like can also be performed.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ′) 2 , F ab ′, or F ab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying Nectin-2 using the antibody of the present invention is not particularly limited, and an antibody, antigen, or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, amount of protein) in the solution to be measured is not limited. Any measurement method may be used as long as it is a measurement method in which the amount is detected by a chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of an antigen. For example, nephrometry, competition method, immunometric method, SPR method and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described below is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
  • Examples of the labeling agent used in the measurement method using the labeling substance include radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, and luminescent substances.
  • radioisotopes for example, [ 1 2 5 I], [ 1 3 1 I], [ 3 H], ["C], etc. are used as the releaseable isotopes.
  • Enzymes are stable and have high specific activity.
  • ⁇ -galatatosidase, ⁇ -dalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc. are used as fluorescent substances, for example, cyanine fluorescent dyes (eg, Cy2, Cy3, Cy5).
  • insolubilization of an antigen or antibody physical adsorption may be used, or a method of using a chemical bond usually used for insolubilizing or immobilizing a protein or an enzyme may be used.
  • these proteins may be biotin-labeled and streptavidin (avidin) may be bound to a previously insolubilized carrier.
  • avidin streptavidin
  • protein A, protein G, anti-imnoggroglin antibody and the like may be bound to a carrier that has been insoluble in advance.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
  • the test solution is reacted with the insoluble antibody of the present invention (primary reaction), and another labeled antibody of the present invention is reacted (secondary reaction), and then on the insolubilized carrier.
  • primary reaction the insoluble antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled antibody of the present invention
  • the amount of the protein of the present invention in the test solution by measuring the activity of the labeling agent
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times.
  • the labeling agent and the insolubilizing method can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies for the purpose of improving measurement sensitivity or the like. May be used.
  • antibodies having different Nectin-2 binding sites are preferably used as the antibodies of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction.
  • the antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competitive method, an immunometric method, an SPR method, or nephrometry.
  • the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated.
  • B / F separation Measure the amount of either B or F label and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • a BZF separation is made of polyethylene glycol
  • a solid-phased antibody is used as the first antibody.
  • One antibody is soluble
  • the second antibody is a solid phase method using a solid phase antibody.
  • the ability to separate the solid phase from the liquid phase after competitively reacting the antigen in the test solution and the immobilized antigen to a certain amount of labeled antibody, or in the test solution After reacting this antibody with an excessive amount of labeled antibody, the solid phase antigen is added and unreacted labeled antibody is bound to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
  • nephrometry In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in gel or solution is measured. Laser nephrometry using laser scattering even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained.
  • Nectin-2 measurement system should be constructed by adding the usual technical considerations of those skilled in the art to the usual conditions and procedures for each method. For details of these general technical means, you can refer to reviews and textbooks.
  • Nectin-2 can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • Nectin-2 when an increase in the concentration of Nectin-2 is detected by quantifying the concentration of Nectin-2 using the antibody of the present invention, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus) Cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, oval cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) or may be affected in the future It can be diagnosed that 1 ⁇ 2 ⁇ is high.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus
  • stomach cancer liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, oval cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain tumor, blood tumor, etc.
  • the antibody of the present invention can also be used to detect Nectin-2 present in a subject such as a body fluid or tissue.
  • preparation of antibody ram used to purify Nectin-2, detection of Nectin-2 contained in each fraction during purification, analysis of Nectin-2 behavior in test cells, etc. Can be used for.
  • a monoclonal antibody produced by a hybridoma cell (hereinafter sometimes referred to as an antibody used in the present invention) can be used.
  • the antibodies used in the present invention include genetically engineered antibodies (including antibody fragments) having specific CDR amino acid sequences or variable region amino acid sequences of antibodies produced by these hyperides.
  • variable regions on the N-terminal side of the heavy and light chains of the antibody called the heavy chain variable region (V H ) and the light chain variable region (VJ.
  • V H variable region
  • VJ variable region
  • CDR Complementarity within the variable region.
  • the other part of the variable region other than CDR has the role of maintaining the structure of CDR, and the framework region ( FR)
  • C H heavy chain constant region
  • CL light chain constant region
  • CDR 1 complementarity determining region
  • CDR 2 complementarity determining region
  • CDR 3 complementarity determining region
  • the three complementarity determining regions in the variable region are collectively referred to as the heavy chain complementarity determining region.
  • CDR 3 complementarity determining region
  • the sex determining region is collectively referred to as the light chain complementarity determining region.
  • amino acid sequence and base sequence of CDR of the antibody used in the present invention are shown in Tables 2 to 24 described below, respectively.
  • the amino acid sequences of the first complementarity determining region (CDR1), the second complementarity determining region (CDR2) and the third complementarity determining region (CDR3) of the antibody heavy chain variable region are (I) SEQ ID NO: from 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280 and 296, (ii) SEQ ID NO: from 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281 and 297 SEQ ID NO: selected from the group consisting of (iii) SEQ ID NO: identical to the amino acid sequence represented by the SEQ ID NO: selected from the group consisting of 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282 and 298 It has the amino acid sequence of
  • the amino acid sequences of the first complementarity determining region (CDR 1), the second complementarity determining region (CDR 2) and the third complementarity determining region (CDR3) of the antibody light chain variable region respectively.
  • V SEQ ID NO: 193, 209, 225, 241, 257, 273 SEQ ID NO: selected from the group consisting of, 289 and 305
  • an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: selected from the group consisting of SEQ ID NO: 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290 and 306 Have
  • the amino acid sequence other than CDR is not particularly limited, and an amino acid sequence other than CDR is derived from another antibody, in particular, a so-called CDR-grafted antibody used in the present invention. Included in the antibody.
  • the amino acid sequence other than CDR is preferably a human-derived amino acid sequence, with one to several amino acid residues added, deleted, substituted, or inserted or inserted into the framework region (FR) as necessary. It may be.
  • the amino acid sequence and the nucleotide sequence of the antibody variable region are preferably those shown in Table 25.
  • a monoclonal antibody containing a specific CDR amino acid sequence or variable region amino acid sequence of an antibody used in the present invention can be prepared by a known method.
  • a genetically engineered antibody (including antibody fragments) having a specific CDR amino acid sequence or variable region amino acid sequence of an antibody produced by these hybridomas, and competitive with Nectin-2
  • a monoclonal antibody that binds (hereinafter also referred to as an antibody that competitively binds to the antibody used in the present invention) can be obtained as follows.
  • Examples of the antigen used for preparing an antibody that competitively binds to the antibody used in the present invention include, for example, a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or self-sequence number: 3 ( Nectin-2) or a partial peptide thereof or a salt thereof, a cell line that naturally or artificially highly expresses a protein (Nectin_2) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • Any peptide such as an animal cell expression vector containing the peptide represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a partial nucleotide sequence thereof can be used. (Hereinafter, sometimes referred to as the antigen used to simply to the present invention).
  • Fc regions such as FLAG-tag, His-tag, Myc-tag, V5-tag, GST-tag, S-tag, T7-tag, human antibody, mouse antibody, etc. Can be mentioned.
  • the length of the peptide having the same antigenic determinant as Nectin-2 used to prepare an antibody that competitively binds to the antibody used in the present invention is particularly long as long as it is immunogenic.
  • Non-limiting examples include those having 6, for example, preferably 10, and more preferably 12 consecutive amino acid residues.
  • ectin-2 at least 20 of the constituent amino acid sequences, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, most preferably 200 Peptides having more than one amino acid sequence are used.
  • Nectin-2 or a partial peptide thereof or a salt thereof can be produced from the aforementioned human warm-blooded animal cells or tissues by a known protein purification method or a method analogous thereto, or a protein encoding D It can also be produced by culturing a transformant containing NA. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • a fusion protein of the extracellular region of Nectin-2 and other protein or peptide can be produced by culturing a transformant containing DNA encoding the fusion protein.
  • the antigen described in (i) is administered to a warm-blooded animal.
  • any method can be used as long as it can promote antibody production.
  • Intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intradermal injection, or footpad injection is preferable.
  • the antigen used in the present invention can be directly immunized with an insolubilized antigen, or immunized with a complex in which the antigen is bound or adsorbed to an appropriate carrier.
  • the antigen used in the present invention is mixed with an adjuvant such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, Alum, Ribi adjuvant or the like in order to enhance the antibody-producing ability of the immunized animal.
  • an adjuvant such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, Alum, Ribi adjuvant or the like in order to enhance the antibody-producing ability of the immunized animal.
  • An emulsion may be prepared and administered to the animal.
  • warm-blooded animals that can be used include Sanore, Usagi, Inu, Monoremot, Mouse, Rat, Hamster, Hedge, Goat, Camel, Llama, and Chicken, but mouse and rat are preferred. It is done.
  • a K0 animal in which the warm-blooded animal ortholog gene of the antigen protein is knocked out in order to obtain a stronger immune response to the antigen may be used.
  • a transgenic animal European Patent Publication
  • the antibody gene of a warm-blooded animal is knocked out and the human antibody gene is introduced.
  • Knock-in animals (W0 02/098217, W0 03/020743) etc. may be used.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by fusing the antibody-producing B cells to be fused with allogeneic or xenogeneic bone marrow heavy cells.
  • myeloma cells include bone marrow cells of warm-blooded animals such as NS-1, P 3 U 1, SP 2/0, AP-1, and SP 2/0 and P 3 U 1 are preferred. Used. The selection of hypridoroma can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • the method for producing the antibody is not limited to the above-mentioned method.
  • a human-blooded animal e.g., rabbit / rabbit, rabbit, inu, monoremot, mouse, rat, hamster, hedge, h.
  • Antibody gene library prepared by known methods using B lymphocytes (eg, moths, camels, llamas, and -birds) on the surface of ribosomes, pacteriophages, Escherichia coli, fermenters, animal cells, etc.
  • B lymphocytes eg, moths, camels, llamas, and -birds
  • the so-called antibody display technology can be used.
  • the naive and warm-blooded animals may be naive, cancer patients who highly express the antigen used in the present invention, and antigens used in the present invention ( Warm blood immunized by the method described in a)
  • an antibody form to be presented on the cell surface includes, but is not limited to, an IgG molecule, an IgM molecule, a Fab fragment, and a single chain Fv (scFv) fragment.
  • the gene of the monoclonal antibody (fragment) that specifically binds to the antigen used in the present invention is the antigen (fragment) presenting cell or antibody (fragment) presenting ribosome carrying the antibody gene library described above. And then reacting for a certain period of time, washing away non-specifically bound substances, elution and recovering those that specifically bind to the antigen used in the present invention, and presenting the antibody (fragment) cells or antibodies (fragments) ) After the display ribosome is propagated by a known method, the same method is repeated several times, and finally the antibody (fragment) -presenting cell cloned or the antibody (fragment) -presenting ribosome is isolated by a known method. Is obtained. Monoclonal IgG antibody genes can be obtained by recombining the thus obtained monoclonal antibody fragment genes with the IgG antibody gene regions by a known method.
  • a monoclonal antibody containing an amino acid sequence substantially the same as the specific CDR amino acid sequence or variable region amino acid sequence of the antibody used in the present invention can also be obtained by genetic engineering.
  • amino acid sequence A substantially the same as the specific CDR amino acid sequence or variable region amino acid sequence (hereinafter referred to as amino acid sequence A) of the antibody used in the present invention is about 50% with amino acid sequence A. %, Preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more. And amino acid sequences having properties. '
  • Examples of the monoclonal antibody containing substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence A include, for example: (i) one or more of the amino acid sequence A (for example, about 1 to 50, preferably Is about 1-30, more preferably about 1-10,
  • amino acid sequence A for example, about 1 to 50, preferably 1) About 30 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably a number (1-5) amino acids added, (iii) one or more amino acid sequences A (for example 1 ⁇ 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to several (eg, 1 to 5) amino acids with an inserted amino acid Sequence, (iv) one or more of amino acid sequence A (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably 1 to An amino acid sequence in which several (for example, 1 to 5) amino acids are replaced with other amino acids, or (V) Such antibodies that contain Amino acid sequences seen combined also included.
  • the antibody used in the present invention is prepared by immunizing antibody-producing cells isolated from the above-mentioned warm-blooded animals with the antigen used in the present invention in a test tube by a method known per se, and then preparing a hyperidoma. It can also be obtained by things.
  • the monoclonal antibody used in the present invention includes the monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in (a), the antibody gene isolated by a known method from the monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in (a), and (b) It can be produced by culturing a recombinant cell line in which the monoclonal antibody gene obtained in (1) has been artificially expressed.
  • the antibody gene can also be produced by incorporating into a chromosome of a warm-blooded animal or plant by a known method and producing it in the blood, milk, egg, plant body, mold, etc. of the warm-blooded animal [Curr. Opin. Biotevhnol. 7, 536 (1996), Nature Rev. Genet 4, 794 (2003), Appl.
  • soluble protein antigens or protein antigen-expressing cells can be adsorbed directly or together with a carrier on a solid phase (eg, microplate).
  • a carrier on a solid phase eg, microplate.
  • An anti-immunoglobulin antibody for example, if the spleen cells used for cell fusion are mice, and then labeled with radioactive substances, enzymes, fluorescent substances, etc. or Bound to the solid phase by reacting protein A
  • the monoclonal antibody used in the present invention is a method known per se from the above-mentioned monoclonal antibody-containing raw material, for example, an immunoglobulin separation and purification method [eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, ion exchange method, etc. Chromatography, hydrophobic interaction chromatography, reverse phase chromatography-gel filtration chromatography, hydroxyapatite chromatography, antigen or a carrier that has affinity for antibodies such as protein A or protein G Various chromatographies such as affinity chromatography for separating and purifying only antibodies].
  • an immunoglobulin separation and purification method eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, ion exchange method, etc.
  • An antibody that competitively binds to the antibody used in the present invention can be obtained by screening by a measurement method that measures whether or not it binds competitively to Nectin-2.
  • Nectin-2 used for screening refers to an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter abbreviated as Nectin-2) or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (hereinafter referred to as Nectin- (Hereinafter abbreviated as 2 S) (hereinafter, both may be referred to as Nectin-2 or a protein used in the present invention). It may be a protein derived from human warm-blooded animal cells or tissues, or it may be a recombinant protein.
  • Nectin-2 includes those in which the C-terminal carboxyl group is esterified or amidated, the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) is protected with a protecting group, N-terminal side cleaved in vivo with a glutamine residue produced by pyroglutamate, a substituent on the amino acid side chain in the molecule protected with an appropriate protecting group, or a sugar chain attached It also includes complex peptides such as so-called glycopeptides and takes the form of salts such as physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal salts). Also good.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metal salts
  • “competitively binding antibody” refers to an antibody in which binding to Nectin-2 is competitively inhibited by adding an excess amount of any of the antibodies used in the present invention. Specifically, when the test antibody is subjected to a binding test for Nectin-2, the test is carried out when a 50-fold molar amount of any of the antibodies used in the present invention is added to the test antibody. An antibody in which the binding of the antibody to Nectin-2 is inhibited by 50% or more.
  • the antibodies used in the present invention include chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies.
  • “Chimeric antibody” means an antibody having a variable region derived from a heterologous antibody and a human antibody constant region (see, eg, European Patent Publication EP 0 1 2 5 023 etc.).
  • a “humanized antibody” is an antibody obtained by modifying an antibody that is different from that of a human, such as a mouse, and replacing the primary structure other than the complementarity determining part of the H and L chains with the corresponding primary structure of the human antibody. To tell.
  • Human antibody refers to a monoclonal antibody produced using a transgenic animal into which a human antibody gene has been introduced (see European Patent Publication EP 0 5 4 6 0 7 3) and a human antibody gene. Against the surface of cells such as pacteriophage, E. coli, yeast, animal cells, and ribosomes, monoclonal antibodies (Nature Biotechnology 23, 1105 (2005)) and Nectin-2 produced using so-called antibody display technology This means a monoclonal antibody isolated using techniques such as human B-cell fusion method that produces antibodies and fuzzy display method.
  • the antibody used in the present invention is preferably a monoclonal antibody whose antibody constant region is a human antibody, more preferably human IgG, and more preferably a human IgG1 subclass.
  • the above-mentioned pharmaceuticals containing the antibody used in the present invention or an antibody that binds to Nectin-2 competitively with the antibody used in the present invention is a preventive / therapeutic agent for breast cancer, biological defense through the Fc region of the antibody. It can be used as a preventive or therapeutic agent for breast cancer utilizing a mechanism, an antibody-dependent breast cancer cytotoxic agent, and the like.
  • Breast cancer cell damage methods using the defense mechanism through the Fc region of antibodies include antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cells. Although there is a disorder-dependent activity (Complement-Dependent Cytotoxicity; CDC), ADCC is preferably used.
  • a drug containing an antibody used in the present invention or an antibody that competitively binds to the antibody used in the present invention has low toxicity, and it is used as a solution or as a medicinal thread and compound of an appropriate dosage form as a human. Or given to mammals (eg, rats, rabbits, hidges, pigs, mice, cats, innu, monkeys, etc.) orally or parenterally (eg, intravascular, subcutaneous administration, etc.) it can.
  • mammals eg, rats, rabbits, hidges, pigs, mice, cats, innu, monkeys, etc.
  • parenterally eg, intravascular, subcutaneous administration, etc.
  • the antibody used in the present invention or the antibody that competitively binds to the antibody used in the present invention may be administered per se, or may be administered as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the antibody and its salt used in the present invention and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • injections are agents such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous infusions, etc. It may include a shape.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • a method for preparing an injection it can be prepared, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody of the present invention or a salt thereof in a sterile aqueous liquid or oily liquid usually used for injection.
  • an aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, etc.
  • solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO—50 ⁇ polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil) J, etc.
  • oily liquid and L for example, sesame oil, soybean oil or the like is used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol or the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule.
  • a suppository used for rectal administration may be prepared by mixing the above-mentioned antibody or a salt thereof with an ordinary suppository base.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules) ), Syrups, emulsions, suspensions, etc.
  • Such a composition is produced by a known method, and may contain a carrier, a diluent, or an excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • a carrier and excipient for tablets for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • the above parenteral or oral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage forms suitable for the dosage of the active ingredient.
  • Examples of the dosage form of such a dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the content of the antibody used in the present invention or the antibody that competitively binds to the antibody used in the present invention is usually 5 to 500 mg per dosage unit dosage form, especially 5 to 100 mg for injections, and other dosage forms. Then, it is preferable that 10 to 250 mg of the above antibody is contained.
  • the dose of the prophylactic / therapeutic agent and modulator containing the antibody used in the present invention or the antibody that competitively binds to the antibody used in the present invention depends on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc.
  • the dose of the antibody used in the present invention or the antibody that competitively binds to the antibody used in the present invention is usually About 0.1 ⁇ 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight, about 1 to 5 times a day, preferably 1 to 1 day It is convenient to administer about 3 times by intravenous injection. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
  • the antibody used in the present invention or the antibody that competitively binds to the antibody used in the present invention can be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration is a pharmacologically acceptable carrier with the antibody or salt thereof.
  • Such a yarn composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration (eg, intravascular injection, subcutaneous injection, etc.).
  • parenteral administration eg, intravascular injection, subcutaneous injection, etc.
  • Each of the above-described compositions may contain other active ingredients as long as they do not cause an unfavorable interaction by blending with the antibody.
  • the antibody used in the present invention or the antibody that competitively binds to the antibody used in the present invention may be other drugs such as alkylating agents (eg, cyclophosphamide, ifamide), antimetabolites ( E.g. methotrexate, 5-fluorouracil, gencitabine, etc.) stake cancer antibiotics (e.g., mitomycin, adriamycin, etc.), plant-derived anticancer agents (e.g., vincristine, vindesine, paclitaxel, docetaxel, etc.), hormone therapy (Eg, tamoxifen, anastrozole, retrozole, etc.), platinum preparations (eg, cisbratin, carbobratin, etc.), molecular targeting agents (eg, heceptin, gefitinib, imatinib, etc.), etoposide, irinotecan, etc. .
  • the antibody and the drug used in the present invention may be administered to the patient at
  • the present invention further includes the following inventions.
  • Ne cl— 1 044— 4 (FERM BP— 1 0805), N ec 8- 3 5 1 7- 1 1 (FERM BP— 1 0 806) or N ec 8— 3 7 — 4-7 (FERM BP — 1 0 80 7) Hypridoma cells, Ne c 1-1 044-4 (F ERM BP— 1 08 0 5), Ne c 8— 35 1 7— 1 1 (FERM BP— 1 0 8 0 6) or Nec 8 _ 3 704— 7 (FERM BP— 1 0807), a monoclonal antibody produced from a hybridoma cell, Ne cl— 1 044— 4 (FERM BP— 1 08 0 5), Monoc produced from high-pridoma cells displayed as Ne c 8— 3 5 1 7- 1 1 (F ERM BP— 1 08 06) or N ec 8 -'3 704-7 (FERM BP— 1 080 7)
  • the present invention relates to a monoclon
  • Hypridoma cell Ne c 8— 351 7— 1 1 is April 1, 2007 Tsukuba Rakuhito, Ibaraki Pref. 1-chome 1 1 Central No. 6 (zip code 305-8566) Independent Administrative Agency National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Deposited at the biological deposit center as deposit number FERM BP-1 0806.
  • Hypridor cell N ec 8-3704-7 is an independent administrative law of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, patented organism from 1 April 1st, Tsukuba Tohoku, Ibaraki 1st 3rd (Postal code 305-856.6) from April 3, 2007 Deposited at the Deposit Center under the deposit number FERM BP—10 807.
  • bases, amino acids, etc. are indicated by abbreviations, the labels according to the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature are based on the conventional abbreviations in f. To do.
  • optical isomers for amino acids the L form is indicated unless otherwise specified.
  • a 1 a Alanine
  • S ec selenocysteine (.selenocysteine)
  • SEQ ID NO of the sequence listing in the present specification indicates the following sequence.
  • siRNA-1 used in Reference Example 5, Reference Example 6 and Reference Example 7 is shown. [SEQ ID NO: 20]
  • siRNA-1 used in Reference Example 5, Reference Example 6 and Reference Example 7 is shown. [SEQ ID NO: 21]
  • siRNA-2 used in Reference Example 5, Reference Example 6 and Reference Example 7 is shown. [SEQ ID NO: 22]
  • siRNA-2 used in Reference Example 5, Reference Example 6 and Reference Example 7 is shown. [SEQ ID NO: 23]
  • siRNA-3 used in Reference Example 5, Reference Example 6 and Reference Example 7 is shown. [SEQ ID NO: 24]
  • siRNA-3 used in Reference Example 5, Reference Example 6 and Reference Example 7 is shown. [SEQ ID NO: 25]
  • siRNA-4 used in Reference Example 5, Reference Example 6 and Reference Example 7 is shown. [SEQ ID NO: 26]
  • siRNA-4 used in Reference Example 5, Reference Example 6 and Reference Example 7 is shown. [SEQ ID NO: 27)
  • siRNA-5 used in Reference Example 5, Reference Example 6 and Reference Example 7 is shown. [SEQ ID NO: 28]
  • SEQ ID NO: 37 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the amino acid sequence of the Nectin—2ED—hFc protein represented by SEQ ID NO: 37.
  • nucleotide sequence of the DNA encoding the amino acid sequence of the protein lacking the Igl domain of Nectin-2.
  • nucleotide sequence of the DNA encoding the amino acid sequence of the protein lacking the 3 ⁇ 42 domain of Nectin-2.
  • Reference Example ⁇ Shows the base sequence of primer A77G used in 34.
  • FIG. 8 shows the base sequence of primer 177 used in Example 19, [SEQ ID NO: 1 78]
  • Example 19 shows the base sequence of primer 179 used in 9
  • Example 1 shows the base sequence of primer 180 used in 9.
  • Example 1 shows the base sequence of primer 18 1 used in 9
  • the CDR3 (base sequence) of the heavy chain of Necl- 244-3 is shown.
  • the light chain CDR3 (amino acid sequence) of Necl-244-3 is shown.
  • the CDR1 (base sequence) of the heavy chain of Necl-530-1 is shown.
  • the light chain CDR2 (base sequence) of Necl-530-1 is shown.
  • 1 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable region of Necl-554-l.
  • the C D R 3 (amino acid sequence) of the light chain of Necl-5554-1 is shown.
  • the light chain CDR2 (base sequence) of Necl-554-1 is shown. [SEQ ID NO: 230]
  • C D R 1 amino acid sequence of the heavy chain of Necl-803-2. [SEQ ID NO: 233]
  • G D R 2 (amino acid sequence) of the heavy chain of Necl-803-2 is shown.
  • CDR 3 amino acid sequence of the heavy chain of Necl-803-2 is shown. [SEQ ID NO: 235]
  • the CDR2 (amino acid sequence) of the light chain of Necl-803-2 is shown. [SEQ ID NO: 242]
  • the C D R 3 (amino acid sequence) of the light chain of Necl-803-2 is shown. [SEQ ID NO: 243]
  • the light chain CDR2 (base sequence) of Necl-803-2 is shown. [SEQ ID NO: 246]
  • the light chain CDR3 (base sequence) of Necl-803-2 is shown.
  • the C D R 2 (amino acid sequence) of the light chain of Necl-845-2 is shown.
  • the light chain CDR2 (base sequence) of Necl-845-2 is shown. [SEQ ID NO: 278]
  • 1 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable region of Necl-903-l.
  • the light chain CDR1 (base sequence) of Necl-903-1 is shown. [SEQ ID NO: 293]
  • Necl- 3 - 1 of the CDR 3 of the light chain shows the (nucleotide sequence). '[SEQ ID NO: 295]
  • the C D R 3 (amino acid sequence) of the heavy chain of Nec8-4116-8 is shown.
  • the light chain CDR 1 (amino acid sequence) of Nec8-4116-8 is shown.
  • Nec 8 - of 4116- 8 light chain are shown a CDR 2 (amino acid sequence).
  • the light chain CDR 3 (amino acid sequence) of Nec8-4116-8 is shown.
  • the light chain CDR2 (base sequence) of Nec8-4116-8 is shown.
  • the CDR3 (base sequence) of the light chain of Nec8-4116-8 is shown.
  • SEQ ID NO: 312 shows the base sequence encoding the N-terminus of the signal sequence predicted from germline that matches the amino acid sequence of 312.
  • SEQ ID NO: 31 This shows the base sequence encoding the N-terminus of the signal sequence predicted from germline that matches the amino acid sequence of 33-3.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

明細書
癌の予防 ·治療剤 技術分野
本発明は、 Nectin - 2に対するモノクローナル抗体およびその用途、 具体的には 、 癌の予防 ·治療剤または診断薬、 癌細胞のアポトーシス促進剤、 癌細胞の増殖 阻害剤、 抗体の Fc領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害剤などに関す る。 背景技術
癌において、 遺伝子のマイクロアレイプロフアイリングデータでその病態が評 価しうることが予見され、 実際、 白血病においては遺伝子発現プロファイルによ る白血病の分類が可能であることが報告されている。 また個々の癌組織の遺伝子 発現プロファイルを明らかにし、 その分類を積み重ねることによって、 特定の癌 治療法に対する反応性を予測したり特定の癌に対する新たな創薬標的タンパク質 を発見したりすることが可能となると考えられる。 具体的には、 ある種の癌にお いてある種のタンパク質の発現亢進が認められる場合には、 新たに抗原陽性と診 断された患者に対して （i) 該タンパク質の発現量を低下させる、 （i i) 該タンパ ク質の機能を抑制する、 （i i i) 該タンパク質に対する宿主免疫応答を顕在化させ る等の方法によって抗重瘍活性を導くことが可能となる。 これと同時に、 抗原陰 性と診断された患者に対しては別の治療法への切替が迅速に行えるなど、 患者に 無用な負担をかける懸念がなくなると予想される。 以上のように発現プロフアイ ル解析は、 癌の分子診断と分子標的治療薬の開発に多大な貢献を.なしうるものと 期待されている。
Nectin - 2ひ遺伝子 （RefSeq Accession No. NM_002856) および Nectin - 2 δ遺伝 子 （EMBL Accession No. X80038) は、 ヒト白血病細胞株 TF- 1由来の cDNAからク ローニングされた遺伝子であり、 それぞれ 479ァミノ酸および 538ァミノ酸から なるタンパク質をコードしている （RefSeq Accession No. NP_002847および EMBL Accession No. CAA56342)。 Nectin- 2 δ遺伝子は、 Nectin- 2 α遺伝子のスプライシ ングバリアントであり、 Nectin- 2 δ遺伝子によってコードされるタンパク質は Nectin - 2ひ遺伝子によってコードされるタンパク質の 1番目から 350番目までの アミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有しているが、 351 番目より C末端側の アミノ酸配列が異なっている。 さらに、 Nectin - 2ひ遺伝子および Nectin- 2 δ遺伝 子に相同性を示すマウス遺伝子 （GenBank Accession No. BC009088および RefSeq Accession No. NM_008990) がマウス ES細胞由来のライブラリーからクローニン グされており、 これらはそれぞれ 467アミノ酸および 530アミノ酸からなるタン ノ ク質をコードしている （GenBank Accession No. AAH09088 およぴ Ref Seq Accession No. NP_033016)。 これらのマウス Nectin - 2遺伝子はヒト Nectin - 2 α 遺伝子および Nectin- 2 S遺伝子に対して塩基配列でそれぞれ約 72%および約 72%、 アミノ酸配列でそれぞれ約 69%および約 73%の相同性を有している。 Nectin - 2 αおよび Nectin- 2 δ (以下、 Nectin - 2と総称することもある）は PVRL2、 PRR2、 PVRR2、 HveB、 CD112 などの異名を持つタンパク分子であり、 Nectin - 1、 Nectin— 、 Nectin— 3、 および Nectin— 4の 4つのメンノ 一カ ら構成される Nectin ファミリーに属している。 Nectinファミリ一は （以下、 これらを Nectinと総称 することもある）。 また Nectin様の構造を有する膜タンパク質として Necl-1、 Necl - 2、 Necl- 3、 Necl- 4および Necl_5が知られている (J. Biol. Chem. (2004)， 279 (17) , pl8015_pl8025)。
Nectinは免疫グロプリンスーパーフアミリーに属し、細胞外領域に 3つの免疫 グロブリン様ループを有する一回膜貫通型糖タンパク質である。 Nectin分子は細 胞膜上でシス二量体を形成し、 隣接する細胞の細胞膜上のシス二量体同士がトラ ンス結合することにより、 Ca2 +濃度とは無関係な様式で上皮細胞同士、 あるいは セルトリ細胞と精子細胞との細胞間接着を制御していると考えられている （蛋白 質 核酸 酵素 （2003)， 48 (2)， ρ105-ρί12 ； Curr. Biol. (2002)， 12， pll45-pl l50) o また、 Nectin - 1 と Nectin- 3はトランス結合により神経シナプス 形成に関わるとの報告がある (J. Cell Biol. (2002) , 156, p555-p565)。 Nectin のトランス結合は同一の分子間でホモフィリックに形成されるが、 Nectin-1 と Nectin - 3、 Nectin - 1と Nectin - 4、Nectin - 2と Nectin- 3およぴ Nectin- 3と Necl-5 との間の様にヘテロフィリックなトランス結合も形成されることが知られている (J. Biol. Chem. (2002) , 277 (30) , p27006- p27013)。 また、 Nectinは細胞内に ある C末端領域でァフアデインに結合し、 この分子を介してァクチン細胞骨格に 連結することが知られている (J. Cell Sci. (2003)， 116 (1)， pl7 - p27)。
細胞接着以外の Nectinの生理的機能としては、 例えば Nectin- 1はへルぺスゥ ィルス上に発現している glycoprotein Dに対する受容体として働き、ヘルぺスゥ ィルスが細胞に侵入する際の足場として機能していると報告されている （J. Cell Sci. (2003) , 116 (1) , pl7- p27)。 また、 Nectin- 2 はナチュラルキラー細胞上に 発現する DNAM-1 (CD226) のリガンドの 1つであり、 DNAM-1を発現するナチュラ ルキラー細胞は標的細胞上に発現する Nectin - 2 を足場として細胞傷害活性を発 揮すると考えられている （J. Exp. Med. (2003) , 198 (4) , ρ557- ρ567)。 この他、 Nectin- 2は癌抑制遺伝子 p53経路に関与する遺伝子の 1つ（W0 02/99040号公報）、 血管新生疾患、癌、 ウィルス感染の治療に有用なタンパク質 Nectin- 3に結合する タンパク質 （W0 02/28902号公報）、 ウィルス感染に関与する受容体 （W0 99/63063 号公報）、 乳癌や卵巣癌の診断と治療に有用な遺伝子のうちの 1つ （W0 02/00677 号公報)、 種々の癌で発現亢進し抗腫瘍性抗体医薬の標的として有望な 16種類の 遺伝子の中の 1つ （W0 03/088808号公報）、 ならびに癌組織で発現亢進し癌の診 断、 予防に有望な遺伝子の 1つ （W0 04/030615号公報） として報告されている。 癌組織で発現が顕著に増加する遺伝子として Nectin - 2遺伝子が見出され、この遺 伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドが癌細胞のアポトーシスを促進すること が報告されている （WO 2 0 0 5 Z 0 9 7 2 0 4号公報）。
Nectin- 2に対するモノクローナル抗体としては、 ヒ 1、 Nectin-2に対するマウ スまたはラットモノクロナール抗体 (Blood (1998) , 92 (12)， p4602-p4611； J. Virol. (2000) 74 (3) pl267-pl274； Intl. Immunol. (2004) 16 (4) , p533-p538； Mol. Immunol. (2005) 42, p463-p469； JEM (2003) 198 (4)， p557-p567； Virol.
(1998) 246, P179-pl89； J. Virol. (2001) 75 (2) plll85 - plll95 ; FEBS (2005) 579， p2243-p2249) やマウス Nectin- 2に対するモノクローナル抗体 (J. Virol. (2001) 75 (2) plll85— plll95； JBC (2001) 276, p48350-p48355； Oncogene
(1999) 18, P1609-pl617； JCB (1999) 145, p539 - p549； Exp. Cell Res. (1997) 235， p374-P384) が報告されているが、 これらの抗体の癌細胞の増殖抑制活性に ついては記載されていない。 発明の開示 現行の抗がん剤はいずれも副作用を伴い、 医療現場に置いては癌細胞に対し特 異的に作用し、 正常組織への影響ができるだけ少なく癌細胞の増殖阻害のみを誘 導する安全な薬剤が切望されている。
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 癌組織で 発現が顕著に増加する遺伝子として Nectin- 2遺伝子を見出し、この遺伝子のアン チセンスオリゴヌクレオチドが癌細胞のアポトーシスを促進することも見出した, さらに、 Nectin- 2に対するモノクローナル抗体の作製に成功し、 当該モノクロ一 ナル抗体が優れた癌細胞増殖抑制活性などを有することを見出した。 本発明者ら はこの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、
〔1〕 配列番号： 1 (Nectin - 2 α )または配列番号： 3 (Nectin- 2 δ )で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質ま たはその部分べプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体、
〔2〕 配列番号： 3 (Nectin - 2 δ )で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質 またはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体である上記 〔1〕 記載の抗体、
〔 3〕 ヒトモノクローナル抗体である上記 〔 1〕 記載の抗体、
〔4〕 キメラモノクローナル抗体である上記 〔1〕 記載の抗体、
〔5〕 ヒト化モノクローナル抗体である上記 〔1〕 記載の抗体、
〔6〕 抗体の定常領域がヒト I g G 1サブクラスに属するモノクローナル抗体で ある上記 〔1〕 記載の抗体、
〔7〕 癌細胞増殖阻害活性を有する上記 〔1〕 記載の抗体、
〔 8 〕 抗体依存性細胞傷害活性 （ ADCC : Antibody- dependent cellular cytotoxicity) を有する上記 〔1〕 記載の抗体、
〔9〕 Nectin- 2/Nectin - 3または Nectin- 2ZNectin - 2 トランス結合阻害活性を 有する上記 〔1〕 記載の抗体、
〔1 0〕 配列番号： 1 (Nectin-2 o; )または配列番号： 3 (Nectin-2 δ )で表される ァミノ酸配列の、 1- 350番目 （細胞外領域） のァミノ酸配列に存在するェピト一 プを認識するモノクローナル抗体である上記 〔1〕 記載の抗体、
〔1 1〕 配列番号： 1 (Nectin - 2 α )または配列番号： 3 (Nect in- 2 δ )で表される アミノ酸配列の、 47-i42番目 （第 1の IG様ドメイン） または 175- 240番目 (第 2 の IG様ドメイン）のァミノ酸配列に存在するェピトープを認識するモノクローナ ル抗体である上記 〔1〕 記載の抗体、
〔1 2〕 配列番号： 1 (Nectin-2o または配列番号： 3 (Nectin- 2 δ )で表される アミノ酸配列の、第 75， 76， 77, 78， 95， 137, 145, 173, 184, 186及ぴ 212番目の少なく とも 1つのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体であ る上記 〔1〕 記載の抗体、
〔1 3〕 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドま たはその塩に対して、 N e c 1— 803— 2 (F ERM B P— 1 04 1 7)、 N e c 1 - 244 - 3 (F ERM B P— 1 0423)、 Ne c l— 5 30— l (F ERM B P_ 1 0424)、 N e c 1— 90 3— 1 (F ERM B P— 1 042 5)、 N e c 1— 5 20 _ 1 (F ERM B P— 1 0426 )、 N e c 1— 845 - 2 (FERM B P_ 1 042 7)、 N e c 1— 8 34— 1 :(F ERM B P— 1 0428), N e c l - 9 64- 1 (FERM B P— 1 0 6 8 3 )、 N e c 1 - 1 302-2 (FERM B P- 1 06 84), Ne c l - 5 54- 1 (F ER M B P_ 1 06 8 1)、 N e c l - 76 9- 2 (FERM B P- 1 068 2) または N e c 8 _4 1 1 6— 8 (FERM B P _ 1 06 8 5 ) で表示されるハ イブリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合する上記 〔1〕 記載の抗体、
〔1 4〕 Ne c l— 80 3— 2 (FERM B P— 1 04 1 7)、 N e c l— 24 4- 3 (FERM B P— 1 04 23)、 N e c 1— 5 30— 1 (F ERM B P - 1 0424), Ne c l - 90 3- 1 (FERM B P _ 1 0425 )、 N e c 1 - 5 20- 1 (FERM B P_ 1 042 6)、 Ne c l— 84 5— 2 (FER M B P— 1 04 27)、N e c 1— 834 _ 1 (FERM B P— 1 04 28)、 Ne c l - 964- 1 (FERM B P— 1 06 8 3)、 Ne c 1— 1 302— 2 (FERM B P— 1 06 84)、 Ne c 1— 5 54— 1 (FERM B P— 1 0 6 8 1), N e c l - 76 9-2 (F ERM BP— 1 06 8 2) または N e c 8 -4 1 1 6 -8 (FERM B P— 1 0 6 8 5 ) で表示されるハイプリ ドーマ細 胞により産生されるモノクローナル抗体が認識するァミノ酸配列と同一または実 質的に同一のアミノ酸配列を認識する上記 〔1〕 記載の抗体、
〔15〕 上記 〔1〕 記載の抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞、
〔16〕 Ne c l_803_2 (F ERM BP— 1041 7)、 Ne c l— 24 4-3 (FERM B P— 10423)、 N e c 1— 530— 1 (F ERM BP 一 10424)、 N e c 1 _ 903 _ 1 (FERM B P— 10425 )、 N e c 1 -520- 1 (F ERM BP_10426)、 Ne c l— 845— 2 (F ER M B P— 10427)、N e c 1— 834— 1 (F ERM BP— 10428)、 Ne c l— 964— 1 (F ERM BP— 1 0683)、 Ne c l— 1302— 2 (FERM B P— 10684)、 N e c 1— 554— 1 (FERM BP— 10 681)、 N e c 1— 769— 2 (F ERM B P— 10682 ) または N e c 8 -41 16-8 (FERM BP— 10685) で表示される上記 〔15〕 記載 のハイブリ ドーマ細胞、
〔17〕 上記 〔16〕 記載のハ,イブリ ドーマ細胞により産生されるモノクロ ナ ノレ抗体、
〔18〕 糸且換え型モノクローナル抗体である上記 〔1〕 記載の抗体、
〔1 9〕 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （ C D R 1 )、 第 2の相補性 決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 、 それぞれ、 （i)配列番号： 184， 200, 216， 232, 248, 264, 280および 296か らなる群より選択される 1種の配列番号、（ii)配列番号： 185， 201， 217, 233， 249, 265, 281および 297からなる群より選択される 1種の配列番号および（iii)配列 番号： 186， 202， 218， 234, 250, 266， 282および 298からなる群より選択され る 1種の配列番号、 で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含む上記 〔1〕 記載の抗体、 ' '
〔 19 a〕 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性 決定領域 (CDR 2) および第.3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 力 それぞれ、 配列番号： 184、 配列番号： 185および配列番号： 186で表される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記 〔1 9〕， 記 载の抗体、
〔 19 b〕 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （ C D R 1 )、 第 2の相補 性決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配 列が、 それぞれ、 配列番号： 200、 配列番号： 201および配列番号： 202で表され るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記 〔19〕 記載の抗体、
Cl 9c] 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性 決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 (CDR 3) のアミノ酸配列 力 それぞれ、 配列番号： 216、 配列番号： 217および配列番号： 218で表される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記 〔1 9〕 記 載の抗体、
〔 19 d〕 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相ネ 性 決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 力 それぞれ、 配列番号： 232、 配列番号： 233および配列番号： 234で表される ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含む上記 〔1 9〕 記 載の抗体、
〔 19 e〕 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性 決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 力 それぞれ、 配列番号： 248、 配列番号： 249および配列番号： 250.で表される ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含む上記 〔 1 9〕 記 載の抗体、
〔 19 f〕 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性 決定領域 （CDR2) およぴ第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 力 それぞれ、 配列番号： 264、 配列番号： 265および配列番号： 266で表される ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含む上記 〔1 9〕 記 載の抗体、
〔 19 g〕 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性 決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 、 それぞれ、 配列番号： 280、 配列番号： 281および配列番号： 282で表ざれる アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記 〔1 9〕 記 載の抗体、 ' 〔 1 9 h〕 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性 決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 力 それぞれ、 配列番号： 296、 配列番号： 297および配列番号： 298で表される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記 〔1 9〕 記 載の抗体、
〔20〕抗体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（C D R 1 )、第 2の相補性決 定領域（CDR2)および第 3の相補性決定領域（CDR3)のアミノ酸配列が、 それぞれ、 （iv)配列番号： 192， 208， 224, 240, 256, 272， 288および 304から なる群より選択される 1種の配列番号、 '（V)配列番号： 193， 209， 225, 241, 257, 273, 289および 305からなる群より選択される 1種の配列番号および (vi)配列番 号： 194， 210, 226, 242, 258， 274, 290および 306からなる群より選択される 1 種の配列番号、 で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含む上記 〔1〕 記載の抗体、
〔 20 a〕 抗体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （ C D R 1 )、 第 2の相補性 決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR 3) のアミノ酸配列 力 それぞれ、 配列番号： 192、 配列番号： 193および配列番号： 194で表される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記 〔20〕 記 載の抗体、
[2 Ob] 抗体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （ C D R 1 )、 第 2の相補性 決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 、 それぞれ、 配列番号： 208、 配列番号： 209および配列番号： 210で表される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記 〔20〕 記 載の抗体、
〔 20 c〕 抗体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （ C D R 1 )、 第 2の相補性 決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR 3) のアミノ酸配列 力 S、 それぞれ、 配列番号： 224、 配列番号： 225および配列番号： 226で表される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記 〔20〕 記 載の抗体、
〔20d〕 抗体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （CDR 1)、 第 2の相補性 決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 (CDR 3) のアミノ酸配列 1S それぞれ、 配列番号： 240、 配列番号： 241および配列番号： 242で表される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記 〔20〕 記 載の抗体、
[2 Oe] 抗体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （ C D R 1 )、 第 2の相補性 決定領域 （CDR2) およぴ第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 、 それぞれ、 配列番号： 256、 配列番号： 257および配列番号： 258で表される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記 〔2.0〕 記 載の抗体、
[2 Of] 抗体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （ C D R 1 )、 第 2の相補性 決定領域 （CDR2) およぴ第 3の相補性決定領域 （CDR 3) のアミノ酸配列 、 それぞれ、 配列番号： 272、 配列番号： 273および配列番号： 274で表される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記 〔20〕 記 載の抗体、
〔 20 g〕 抗体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （ C D R 1 )、 第 2の相補性 決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR 3) のアミノ酸配列 力 それぞれ、 配列番号： 288、 配列番号： 289および配列番号： 290で表される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む上記 〔20〕 記 載の抗体、
[2 Oh] 抗体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （ C D R 1 )、 第 2の相補性 決定領域 (CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 力 それぞれ、 配列番号： 304、 配列番号： 305および配列番号： 306で表される ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含む上記 〔20〕 記 載の抗体、
〔21〕 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドま たはその塩に対するモノクローナル抗体を含有してなる診断剤、
〔22〕 癌の診断剤である上記 〔21〕 記載の診断剤、
〔23〕 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドま たはその塩に対するモノクローナル抗体を含有してなる医薬、
〔24〕 癌の予防 '治療剤である上記 〔23〕 記載の医薬、 ·
〔25〕 癌細胞のアポトーシス促進剤である上記 〔23〕 記載の医薬、 〔2 6〕 癌細胞の増殖阻害剤である上記 〔2 3〕 記載の医薬、
〔 2 7〕抗体の Fc領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害剤である上記 〔2 3〕 記載の医薬、
〔2 8〕 哺乳動物に対して、 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質または その部分ぺプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の有効量を投与する ことを特徴とする癌の予防 ·治療方法、
〔2 9〕 哺乳動物に対して、 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質または その部分ぺプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の有効量を投与する ことを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進方法、
〔3 0〕 .哺乳動物に対して、 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に'同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質まだは その部分べプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の有効量を投与する ことを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法、
〔3 1〕 哺乳動物に対して、 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質または その部分ぺプチドまたはその塩に対するモノクローナノレ抗体の有効量を投与する ことを特徴とする、抗体の Fc領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害方 法、
〔3 2〕 癌の予防 ·治療剤を製造するための配列番号： 1または配列番号： 3で 表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタ ンパク質またはその部分ぺプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の使 用、
〔3 3〕 癌細胞のアポトーシス促進剤を製造するための配列番号： 1または配列 番号： 3で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を 含有するタンパク質またはその部分べプチドまたはその塩に対するモノクロ ナ ル抗体の使用、
〔3 4〕 癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号： 1または配列番号： 3 で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する タンパク質またはその部分べプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の 使用、
〔 35〕抗体の Fc領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害剤を製造する ための配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドまた はその塩に対するモノクローナル抗体の使用、
〔36〕 Ne c l -803-2 (F ERM B P— 1041 7 )、 N e c 1— 2 44-3 (FERM B P— 10423 )、 N e c 1— 530— 1 (F E RM B P-10424), Ne c l -903- 1 (FERM BP— 10425)、 Ne c l-520-1 (F ERM BP— 10426)、 Ne c 1— 845— 2 (F E RM BP— 10427)、Ne c l— 834— 1 (F ERM BP— 10428)、 Ne c l— 964— 1 (FERM BP— 10683)、 Ne c l— 1302— 2 (FERM B P— 10684)、 N e c 1 _ 554— 1 (F ERM BP— 10 681)、 N e c 1— 769— 2 (F ERM B P— 10682 ) または N e c 8 -41 16-8 (FERM B P— 10685 ) で表示されるハイブリ ドーマ細 胞により産生されるモノクローナル抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤、 〔37〕 Ne c l -803-2 (F ERM B P _ 1041 7 )、 N e c 1— 2 44— 3 (FERM BP- 10423), Ne c l - 530- 1 (FERM B P-1 0424), Ne c l -903-1 (FERM BP— 1 0425)、 Ne c l-520-1 (FERM BP_10426)、 Ne c l— 845— 2 (F E RM B P— 10427)、N e c 1— 834— 1 (F ERM BP— 10428)、 Ne c l— 964— 1 (FERM B P— 1 0683 )、 N e c 1— 1302— 2 (FERM B P - 10684)、 N e c 1— 554 - 1 (F ERM BP - 10 681)、 N e c 1— 769— 2 (F ERM B P— 10682 ) または N e c 8 -41 16-8 (FERM B P— 10685 ) で表示されるハイブリ ドーマ細 胞により産生されるモノクロ一ナル抗体と Nectin- 2 に対して競合的に結合する モノクローナル抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤、
〔38〕 Ne c l— 554— 1 (FERM B P— 10681 ) で表示される ハイプリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体と Nectin- 2 に対して 競合的に結合するモノクローナル抗体が、 Ne c l— 1044— 4 (FERM B P- 10805) または N e e l— 1 302— 2 (FERM BP-1068.4) で ある上記 〔37〕 に記載の乳癌の予防または治療剤、
〔39〕 Ne c 8— 41 16— 8 (FERM BP— 10685) で表示され るハイプリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体と Nect in -2に対して 競合的に結合するモノクローナル抗体が、 Ne c 8_3704_7 (FERM B P— 10807) または N e c 8— 351 7— 1 1 (FERM BP— 10806) である上記 〔37〕 に記載の乳癌の予防または治療剤、
〔40〕 抗体の F c領域を介した生体防御機構を利用するものである上記 〔3 6〕 または 〔37〕 に記載の乳癌の予防または治療剤、
〔41〕 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性 決定領域 (CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 力 そ ぞれ、 （i)配列番号： 184， 200, 216, 232, 248, 264, 280および 296か らなる群より選択される配列番号、 （ii)配列番号： 185， 201, 217， 233, 249, 265, 281 および 297 からなる群より選択される配列番号おょぴ（iii)配列番号： 186， 202, 218, 234, 250, 266， 282および 298からなる群より選択される配列番号で 表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含む抗体を 含有してなる乳癌の予防または治療剤、
〔42〕 抗体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性 決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 力 それぞれ、 （iv)配列番号： 192， 208， 224, 240, 256, 272， 288および 304 からなる群より選択される配列番号、 (V)配列番号： 193, 209, 225, 241, 257， 273, 289および 305からなる群より選択される配列番号および (vi)配列番号： 194， 210， 226， 242, 258, 274, 290および 306からなる群より選択される配列番号で表さ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含む抗体を含有 してなる乳癌の予防または治療剤、
〔43〕 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性 決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸 g己列 が、 それぞれ、 (i)配列番号： 184, 200, 216， 232， 248， 264, 280および 296か らなる群より選択される配列番号、 （ii)配列番号： 185， 201， 217， 233， 249, 265, 281 および 297 からなる群より選択される配列番号および（iii)配列番号： 186， 202, 218, 234, 250， 266, 282および 298からなる群より選択される配列番号で 表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列、 抗体軽鎖可 変領域の第 1の相補性決定領域 （ C D R 1 )、 第 2の相補性決定領域 （ C D R 2 ) およぴ第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列が、 それぞれ、 （iv)配 列番号： 192, 208, 224, 240， 256, 272, 288および 304からなる群より選択さ れる配列番号、 （V)配列番号： 193， 209， 225, 241, 257, 273, 289および 305か らなる群より選択される配列番号および (vi)配列番号： 194, 210, 226， 242， 258， 274， 290および 306からなる群より選択される配列番号で表されるァミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、 及び抗体定常領域含む抗体を含有 してなる乳癌の予防または治療剤、
〔44〕 Ne c l— 1044— 4 (FERM BP— 10805) 、 Ne c 8— 3517- 1 1 (F ERM BP— 10806)または N e c 8— 3704— 7 (F ERM BP-10807) で表示されるハイブリ ドーマ細胞、
〔45〕 上記 〔44〕 に記載のハイプリ ドーマ細胞から産生されるモノクロ一 ナル抗体、
〔46〕 Ne c l一 1044一 4 (FERM BP一 10805) ヽ Ne c 8一 3517- 1 1 (F ERM BP— 10806)または N e c 8— 3704— 7 (F ERM BP— 10807) で表示されるハイプリ ドーマ細胞から産生されるモノ クローナル抗体と競合的に結合するモノクローナル抗体、
〔47〕 上記 〔45〕 または 〔46〕 に記載のモノクローナル抗体を含有して なる、 乳癌の予防または治療剤、
〔48〕 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性 決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 力 それぞれ、 （i)配列番号： 184, 200, 216, 232, 248， 264, 280および 296か らなる群より選択される配列番号、 (ii)配列番号: 185， 201， 217, 233, 249, 265, 281 および 297 からなる群より選択される配列番号および（iii)配列番号： 186， 202, 218， 234, 250, 266, 282および 298からなる群より選択される配列番号で 表されるァミノ酸配列を含む抗体と競合的に結合する抗体を含有してなる乳癌の 予防または治療剤、 〔49〕 抗体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性 決定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 力 それぞれ、 （iv)配列番号： 192， 208， 224， 240, 256， 272, 288および 304 からなる群より選択される配列番号、（V)配列番号： 193， 209, 225， 241， 257， 273, 289および 305からなる群より選択される配列番号および (vi)配列番号：194, 210， 226, 242, 258, 274, 290および 306からなる群より選択される配列番号で表さ れるァミノ酸配列を含む抗体と競合的に結合する抗体を含有してなる乳癌の予防 または治療剤、
〔50〕 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性 決定領域 （CDR 2).およぴ第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 力 それぞれ、 （i)配列番号： 184， 200， 216， 232, 248, 264, 280および 296か らなる群より選択される配列番号、 (ii)配列番号： 185， 201, 217, 233, 249, 265, 281 および 297 からなる群より選択される配列番号および（iii)配列番号： 186， 202， 218, 234, 250， 266， 282および 298からなる群より選択される配列番号で 表されるアミノ酸配列、 抗体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （CDR 1)、 第 2の相補性決定領域 (CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) の アミノ酸配列が、 それぞれ、 （iv)配列番号： 192， 208, 224, 240, 256， 272, 288 および 304からなる群より選択される配列番号、（V)配列番号： 193, 209， 225， 241, 257, 273， 289および 305からなる群より選択される配列番号および (vi)配列番 号： 194， 210， 226, 242, 258， 274, 290および 306からなる群より選択される 配列番号で表されるアミノ酸配列、 及び抗体定常領域を含む抗体と競合的に結合 する抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤である。 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩 に対するモノクローナル抗体は例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣 癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 ·治療剤 （好ましく 、 乳癌、 肺癌、 大腸癌、 前立腺癌、 卵巣癌、 膝臓癌などの予防 ·治療剤）、 癌細胞の アポトーシス促進剤、 癌細胞の增殖阻害剤、 癌細胞の細胞周期変化の誘発剤、 抗 体の Fc領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害剤、抗体依存性の癌細胞 傷害剤などとして安全に使用することができる。 · 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1で得られた本発明の抗体の H鎖可変領域のアミノ酸配列 （配 列番号： 187、 203、 219、 235、 251、 267、 283及ぴ 299) および L鎖可変領域のァ ミノ酸配列 (配列番号： 195、 211、 227、 243、 259、 275、 291及び 307) を示す。 図 2は、 実施例 1で得られた本発明の抗体の H鎖可変領域の塩基配列 （配列番 号： 191、 207、 223、 239、 255、 271、 287及び 303) を示す。
図 3は、実施例 1で得られた本発明の抗体の L鎖可変領域の塩基配列（配列番号 ： 199、 215、 231、 247、 263、 279、 295及び 311) を示す。
図 4は、 実施例 2 3における癌細胞株移植後の腫瘍体積平均値の経実的変化を 示す。 ， 発明の実施形態
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質 （以下、 Nectin -2 αと略記する） または酡列番号： 3 で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する タンパク質 （以下、 Nectin- 2 δと略記する） （以下、 両者を併せて Nectin - 2また は本発明のタンパク質と称することもある） は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モル モット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 i3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細 胞、 平滑筋細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マ クロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好 塩基球、 好酸球、 単球）、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨 細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細 胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳 皮質、 延髄、 小脳）、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆 のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸)、 血管、 心臓、 胸 腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 ·骨格 筋などに由来するタンパク質であってもよく、 合成タンパク質であってもよい。 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のァ ミノ酸配列としては、 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ酸配列 と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 より好ましくは約 7 0 %以上、 さら に好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 特に好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1または 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ酸配列を含有するタンパク質 と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology information Basic Local Al ignment Search Too丄) を用い、 以下の条件 （期待値 = 10；ギヤップを許す；マトリタス =BL0SUM62； フ ィルタリング = 0FF) にて計算することができる。
実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理学 的に）同質であることを示す。したがって、本発明のタンパク質の活性が同等 (例、 約 0 . 0 1〜： 1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1 ~ 1 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜
2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク質の分子量など の量的要素は異なっていてもよい。
また、 Nectin- 2としては、 例えば、 （i) 配列番号： 1または配列番号： 3で表 されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0個程度、 好ましくは ：!〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数（ 1〜 5 ) 個） のアミノ酸が欠失したァミノ酸配列、 （i i) 配列番号： 1または配列番号： 3 で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜5 0個程度、 好ましく は 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1 ~ 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜
5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 1または配列番 号： 3で表されるァミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0個程度、 好 ましくは' ;！〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 ( 1〜.5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 1または 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0個 程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ま しくほ数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換きれたアミノ酸配列、 または（V)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわ ゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が揷入、欠失または置換されている場合、その揷入、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、ぺプチド標記の慣例に従って左端が N末端（ァ ミノ末端）、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1で表わされ るアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、.本発明で用いられるタン パク質は、 C末端がカルボキシル基 (-C00H)ヽ カルボキシレ一ト（- C00- )、 アミ ド (-C0NH2 ) またはエステル (-C00R) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、例えば、メチル、ェチル、 n—プロピル、 イソプロピル、 n—ブチルなどの〇ぃ6 アルキル基、 例えば、 シク口ペンチル、 シク口へキシルなどの C3一 s シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 ひ一ナフチ ルなどの C 6 _ 1 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー C ! _2 アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチルー C i - 2 アルキ ル基、 ビバロイルォキシメチル基などが用いられる。
Nectin- 2が C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレート） を有して いる場合、 カルボキシル基がアミ ド化またはエステルイ匕されているものも本発明 で用いられる' Nectin - 2に含まれる。 この場合のエステルとしては、例えば上記し た C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 Nectin- 2には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のアミ ノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C - s アルカノィルなど の C ^ 6 ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断されて生成する N 末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のァミノ酸の側鎖 上の置換基（例えば一 O H、 一 S H、 ァミノ基、イミダゾール基、ィンドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C ! _6アルカノィル基などの ァシル基など） で保護されているもの、 あるいは 糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
Nectin-2の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質 （Nectin - 2 ）、配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有 するタンパク質 (Nectin-2 δ ) などがあげられる。 +
■ Nectin-2 部分ぺプチドとしては、 前記した Nectin- 2の部分べプチドであつ て、好ましくは、前記した Nectin- 2と同様の性質を有するものであればいずれの ものでもよい。
例えば、 Nectin- 2の構成ァミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましく は 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上、 最 も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ酸配列を有するぺプチドなどが用いられる。 また、本発明で用いられる Nectin - 2の部分べプチドは、そのァミノ酸配列中の 1または 2個以上（好ましくは 1〜2 0個程度、より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸 配列に 1または 2個以上 （好ましくは 1〜 2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0 個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加し、 または、 その ァミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは 1〜 2 0個程度、 より好ましくは ：!〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が揷入され、 ま たは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜2 0個程度、 よ り好ましくは 1〜1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜5個 程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、 Nectin- 2の部分ペプチドは C末端がカルボキシル基 （- C00H)、 カルボキ シレート （- C0(T )、 アミ ド （- C0NH2 ) またはエステル （- C00R) の何れであっても よい。
さらに、 Nectin- 2の部分ペプチドには、 前記した Nectin-2と同様に、 C末端 以外にカルボキシル基 (またはカルボキシレート) を有しているもの、 N末端の ァミノ酸残基（例、メチォニン残基）のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化し^も の、 分子内のアミノ酸側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あ るいは糖鎖が結合したいわゆる糖ぺプチドなどの複合べプチドなども含まれる。 Nectin - 2またはその部分べプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、 無機酸 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩が用いられ、 とりわ け生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩としては、 例えば、 無機酸 （例、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例、 酢酸、' ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コノヽク酸、 酒石酸、 クェン 酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との 塩などが用いられる。
本 ¾明の Nectin - 2 もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するモノクロ ーナル抗体 （以下、 本発明の抗体と略記することがある） は、 Nectin - 2もしくは その部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、 いかなるモノクロ一 ナル抗体であってもよい。 なかでも、 ヒトモノクローナル抗体が好ましく用いら れる。
また、 本発明の抗体としては、 Nectin-2 8、 もしくはその部分ぺプチドまたは その塩に対するモノクローナル抗体 (特に、 ヒトモノクローナル抗体） が好まし い。
さらに、 本発明の抗体としては、 以下の （1 ) 〜 （8 ) の特徴の少なくとも 1 づを有する抗体が好ましく用いられる。
( 1 ) 癌細胞 （例えば、 ヒ ト癌細胞 O V— 9 0 ) の増殖阻害活性を有する。
( 2 )抗体依存性細胞傷害活性 ( ADCC : Antibody- dependent cellular cytotoxicity) を有する。
( 3 ) Nectin- 2のシス結合阻害活性を有する。 具体的には、
( i ) Nectin- 2 αのホモなシス結合を阻害する、
(ii) Nectin- 2 δのホモなシス結合を阻害する、 または
(iii) Nectin-2 aと Nectin - 2 δとのへテロなシス結合を阻害する。
( 4 ) Nectin— 2/Nectin一 3または Nectin- 2/Nectin - 2 のトランス結合阻害活性 を有する。 具体的には、
( i ) Nectin - 2ひのホモなシス二量体と、 Nectin - 2ひのホモなシス二量体との トランス結合を阻害する、 ' (ii) Nectin - 2 αのホモなシス二量体と、 Nectin - 2 δのホモなシス二量体との トランス結合を阻害する、 (iii) Nectin - 2αのホモなシス二量体と、 Nectin- 2 と Nectin- 2 δとのへテ 口なシス二量体とのトランス結合を阻害する、 ，
(iv) Nectin - 2αのホモなシス二量体と、. Nectin - 3のホモなシス二量体とのト ランス結合を阻害する、
(V) Nectin- 2 δのホモなシス二量体と、 Nectin- 2 δのホモなシス二量体との トランス結合を阻害する、
(vi) Nectin- 2 δのホモなシス二量体と、 Nectin- 2ひと Nectin - 2 δとのへテロ なシス二量体のトランス結合を阻害する、
(vii) Nectin-2Sのホモなシス二量体と、 Nectin-3 のホモなシス二量体との トランス結合を阻害する、
(viii) Nectin - 2ひと Nectin - 2 δとのへテロなシス二量体と、 Nectin-3のホモ なシス二量体とのトランス結合を阻害する、
(ix) Nectin - 2αと Nectin— 2 δ とのへテロなシス二量体と、 Nectin— 2ひと Nectin-2 δとのへテロなシス二量体とのトランス結合を阻害する。
(5)実施例 4で示したェピトープグループ I〜VIIまたは実施例 18で示したェ ピトープサブグループの何れかに属する。 好ましくは、 実施例 4のェピトープグ ループ IV、 VIまたは VIIに属する。 より好ましくは実施例 18のェピトープサブ グループ IVb、 VIbまたは Vilaに属する。
(6) Ne c l -803-2 (FERM BP— 1041 7)、
N e c 1一 2 4 4 ― 3 (F ERM B P— 1 0 4 2 3)、
N e c 1一 5 3 0一 1 (F ERM B P— 1 0 4 2 4)、
N e c 1一 9 0 3一 1 (F ERM B P— 1 0 4 2 5)、
N e c 1 -5 2 0一 1 (F ERM B P— 1 0 4 2 6)、
N e c 1一 8 4 5一 2 (FERM B P— 1 0 4 2 7)、
N e c 1.一 8 3 4一 1 (FERM B P- 1 0 4 2 8)
N e c 1一 9 6 4 ― 1 (FERM B P— 1 0 6 8 3)
N e c 1一 1 3 0 2 2 (FERM B P一 1 0 6 84)
N e c 1一 5 5 4一 1 (FERM B P- 1 0 6 8 1)
N e c 1一 7 6 9一 2 (FERM B P— 1 0 6 8 2) または
N e c 8一 4 1 1 6 ― 8 (FERM B P ― 1 0 6 85) で表示されるハイブリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体 （表 4の ェピトープグループ I、 IV、 V、 VI、 VIIに属する抗体） が認識するアミノ酸配列 と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を認識する。
ここで、 「Ne c l— 803— 2 (FERM BP_ 1041 7)、 Ne c l— 244-3 (FERM B P _ 10423 )、 N e c 1— 53.0— 1 (F E RM B P— 10424)、 N e c 1— 903— 1 (FERM BP-10425), Ne c l一 520— 1 (F ERM BP— 10426)、 Ne c 1— 845— 2 (F E RM BP— 10427)、Ne c 1— 834— 1 (FERM BP— 10428、 Ne c l -964-1 (F ERM BP— 1 0683)、 Ne c l— 1 302— 2 (FERM B P _ 10684)、 N e c 1— 554— 1 (F ERM BP—10 681)、 Ne c l— 769— 2 (F ERM BP— 10682) または N e c 8 -41 16-8 (FERM B P— 10685 ))で表示されるハイブリ ドーマ細 胞により'産生されるモノクローナル抗体 （表 4のェピトープ 1、 IV、 V、 VI、 VII に属する抗体） が認識するアミノ酸配列 （以下、 ェピトープ部位と略記する） と 同一または実質的に同一のアミノ酸配列」 の 「ェピトープ部位と実質的に同一の アミノ酸配列」 とは、 （i) 当該ェピトープ部位のアミノ酸配列中の 1または 2個 以上 （例えば 1〜 10個程度、 好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が欠失し たァミノ酸配列、（ii).当該ェピトープ部位のァミノ酸配列に 1または 2個以上 (例 えば 1〜 10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が付加した ァミノ酸配列、（iii)当該ェピトープ部位のァミノ酸配列に 1または 2個以上（例 えば 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が挿入され たアミノ酸配列、 （iv)当該ェピトープ部位のアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (例えば 1〜 10個程度、 さらに好ましくば数 （1〜5) 個） のアミノ酸が他の アミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （V) 上記 （i ) 〜 （iv) を組み合 わせたァ.ミノ酸配列などが挙げられる。 上記のアミノ酸配列の挿入、 付加、 欠失 または置換の位置としては、 とくに限定されない。
より具体的には、 「ェピトープ部位と実質的に同一のアミノ酸配列」 としては、 ェピトープ部位の近傍のァミノ酸配列が挙げられ、例えば、 （ i )ェピトープ部分 の N末端側に 1または 2個以上（例えば 1〜 10個程度、さらに好ましくは数（ 1 〜 5) 個） のアミノ酸が付加したァミノ酸配列、 （ii) ェピトープ部分の C末端側 に 1または 2個以上 '(例えば 1〜 10個程度、 さらに好ましくは数 （ 1〜 5 ) 個） のァミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （iii) ェピトープ部分の N末端側のアミノ 酸配列 （例えば 1〜 10個程度、 さらに好ましくは数 （ 1〜 5 ) 個） のアミノ酸 配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 10個程度、 さらに好ましくは数（ 1〜 5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （iv) ェピトープ部分の C末端側のアミ ノ酸配列 （例えば 1〜 10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のァミノ 酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 10個程度、 さらに好ましくは数 （ 1〜 5) 個） のアミノ酸が付カ卩したアミノ酸配列などが挙げられる。
例えば、 「Ne c 1— 803— 2 (F ERM BP— 1041 7)、 Ne c l— 244-3 (F ERM B P— 10423 )、 N e c 1— 530— 1 (F E RM B P_10424)、 Ne c l— 903— 1 (F ERM BP— 10425)、 Ne c l -520-1 (FERM B P— 10426 )、 N e c 1 _ 845— 2 (FE RM BP— 10427)、N e c 1— 834— 1 (F ERM BP— 10428、 Ne c l - 964- 1 (FERM B P— 10683 )、 N e c 1— 1 302— 2 (FERM B P_ 10684)、 N e c 1— 554— 1 (FERM BP— 10 681)、 Ne c l— 769— 2 (F ERM BP— 10682) または N e c 8 -41 16 - 8 (F ERM BP— 10685))で表示されるハイブリ ドーマ細 胞により産生される各モノクローナル抗体と、 該モノクローナル抗体の属するグ ループと同じグループに属する他のモノクローナル抗体は、 該モノクローナル抗 体と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を認識すると考えられる。
(7) Nectin- 2αまたは Nectin-2 δに対して、
N e c 1一 803 ― 2 (F ERM BP— 1 04 17)、
N e c 1一 244一 3 (F ERM B P- 1 04 23)、
N e c 1一 530 ― 1 (FERM B P— 1 04 2.4)、
N e c 1.一 903 ― 1 (F ERM BP— 1 04 25)、
N e c 1一 520 ― 1 (FERM BP— 1 04 26)、
N e c 1一 845 ― 2 (F ERM BP— 1 04 27)、
N e c 1一 834一 1 (F ERM BP— 1 04 28)、
N e c 1一 964 ― 1 (FERM BP— 1 06 83)、
N e c 1一 1302一 2 (FERM B P一 10 684)、 Ne c l-554-ί (FERM BP— 10681)、
Ne c .1 -769-2 (FERM BP— 10682) または .
Ne c 8— 41 1 6— 8 (FERM B P— 10685)
で表示されるハイプリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体と競合的 に結合する。
• ここで、 「Nectin- 2 αまたは Nectin- 2 δに対して、 各ハイプリ ドーマ細胞によ り産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合する抗体」 とは、上記の 12種類 の抗体のいずれかを過剰量添加することにより Nectin- 2ひまたは Nectin- 2 δに 対する結合が競合的に阻害される抗体を指しており、 具体的には、 例えば、 該抗 体に対して上記の 12種類の抗体のいずれかを 50倍モル量添加した時に約 50 〜 100 %の結合阻害率を示す抗体をいう。
(8) N e c 1 -80 3-2 (FERM B P ― 1 041 7)、
Ne c 1 - 24 (FERM B P- 1 0 4 2 3)、
Ne c 1一 53 0-1 (FERM B P— 1 0 4 2 4)、
Ne c 1一 90 3-1 (F ERM BP— 1 0 4 2 5)、
Ne c 1 - 52 0- 1 (FERM BP— 1 0 4 2 6)、
Ne c 1一 84 5-2 (F ERM BP— 1 0 4 2 7)、
Ne c 1 - 83 4-1 (FERM BP— 1 0 4 2 8)、
Ne c 1一 96 4-1 (FERM BP— 1 0 6 8 3)、
Ne c 1一 13 02- 2 (FERM B P 1 0 6 84)、
Ne c 1一 55 4-1 (FERM BP— 1 0 6 8 1)、
Ne c 1 - 76 (F ERM BP— 1 0 6 8 2)、 または
Ne c 8一 41 1 6- 8 (FERM B P ― 1 0. 6 85)
で表示されるハイプリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体のァミノ 酸配列と.同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するモノクローナル抗 体。
ここで、 上記のモノクローナル抗体のアミノ酸配列 （以下、 アミノ酸配列 A) と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列としては、 アミノ酸配列 Aと約 5 0 %以上、 好ましくは約 60 %以上、 より好ましくは約 Ί 0 %以上、 さらに好ま しくは約 80 %以上、 さらに好ましくは約 90 %以上、 特に好ましくは約 95 % Ne c l— 554— 1 (FERM ABP— 10681)、
Ne c 1-769-2 (FERM AB P— 10682) または .
Ne c 8— 41 1 6 - 8 (FERM ABP— 10685)
で表示されるハイプリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体と競合的 に結合する。 '
ここで、 「Nectin - 2 αまたは Nectin - 2 δに対して、 各ハイプリ ドーマ細胞によ り産生されるモノクローナル抗体と競合的に結合する抗体」 とは、上記の 12種類 の抗体のいずれかを過剰量添加することにより Nectin- 2αまたは Nectin- 25に 対する結合が競合的に阻害される抗体を指しており、 具体的には、 例えば、 該抗 体に対して上記の 12種類の抗体のいずれかを 50倍モル量添加した時に約 50 〜 100 %の結合阻害率を示す抗体をいう。
(8) N e c 1一 80 3-2 (FERM BP— 1 041 7),
N e c 1一 2 44一 3 (FERM B P— 1 04 2 3)、
N e c 1一 5 30 ― 1 (F ERM B P— 1 04 2 4)、
N e c 1一 9 03一 1 (FERM B P- 1 04 2 5)、
N e c 1 5 20一 1 (FERM B P— 1 04 2 6)、
N e c 1一 8 45一 2 (FERM B P- 1 04 2 7)、
N e c 1一 8 34 ― 1 (F ERM B P- 1 04 2 8)、
N e c 1一 9 64 ― 1 (FERM AB P- 10 6 83)、
N e c 1一 1 302 ― 2 (FERM AB P一 1 0 684)、
N e c 1一 5 54 ― 1 (FERM ABP— 10 6 81)、
N e c 1一 7 69一 2 (F ERM ABP— 10 6 82)、 または
N e c 8一 4 1 1 6 8 (FERM ABP一 1 0 685) '
で表示されるハイプリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体のァミノ 酸配列と.同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するモノクローナル抗 体。
ここで、 上記のモノクローナル抗体のアミノ酸配列 （以下、 アミノ酸配列 A) と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列としては、 アミノ酸配列 Aと約 5 0 %以上、 好ましくは約 60 %以上、 より好ましくは約 70 %以上、 さらに好ま しくは約 80 %以上、 さらに好ましくは約 90 %以上、 特に好ましくは約 95 %
23 以上の相词性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列 Aと実質的に同一のアミノ酸配列を含有する抗体としては、' 例え ば、 前記のァミノ酸配列 Aと実質的に同一のァミノ酸配列を含有し、 ァミノ酸配 列 Aを含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有する抗体などが好ましい。 アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Al i nment Search 1 00I) を用い、 以下の条件 （期待値 = 10；ギヤップを許す；マトリクス =BL0SUM62； フ ィルタリング = 0FF) にて計算することができる。
実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理学 的に） 同質であることを示す。 したがって、 抗体の活性が同等 （例、 約 0 . 0 1 〜： I 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜： 1 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜2倍） であ ることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク質の分子量などの量的要素 は異なっていてもよい。
また、 ァミノ酸配列 Aと同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する モノクローナル抗体としては、 例えば、 （i) アミノ酸配列 A中の 1または 2個以 上 （例えば 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配 列、 （i i) アミノ酸配列 Aに 1または 2個以上 （例えば 1〜5 0個程度、 好ましく は 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜 5 ) 個） のアミノ酸が付カ卩したアミノ酸配列、 （iii) アミノ酸配列 Aに 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が揷入されたァ ミノ酸配列、（i V)ァミノ酸配列 A中の 1または 2個以上 (例えば 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは 数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または (v) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する抗体なども含まれる。
なお、 本発明の抗体は、 キメラ抗体 、 ヒト化抗体 、 ヒ ト抗体 および抗体断片 を含む。 「キメラ抗体」 とは、 異種抗体由来の可変領域とヒ ト抗体定常領域と 有 する抗体を意味する（例えば、欧州特許公開公報 E P 0 1 2 5 0 2 3等参照)。「ヒ ト化抗体」 とはマウス等のヒトにとつて異種の抗体 を改変して、 H鎖と L鎖の
24 相補性決定部以外の一次構造をヒ トの抗体 の対応する一次構造で置き換えた抗 体 を言う。 「ヒト抗体」 とは、 ヒトの抗体遺伝子を導入したトランスジエ ック 動物を用いて作製したモノクローナル抗体.（欧州特許公開公報 E P 0 5 4 6 0 7 3参照） およびヒト抗体遺伝子をバクテリオファージ、 大腸菌、 酵母、 動物細胞 等の細胞表面やリボソーム上に提示させたライブラリー、 いわゆる抗体ディスプ レー技術を用いて作製したモノクローナル抗体 （Nature Biotechnology 23， 1105 (2005) )および Nectin - 2に対する抗体を産生するヒト B細胞から細胞融合法ゃフ ァージディスプレー法等の技術を用いて単離されたモノクローナル抗体を意味す る。
本発明において、 「抗体断片」 とは、 全長抗体の一部を指し、 一般に、 抗原結 合領域または可変領域を含むものをいう。 抗体断片には、 例えば、 F a b、 F a b， 、 F ( a b ' ) 2、 一本鎖抗体 （s C F v ) 、 ジスルフィド安定化抗体 （d s F V ) などが含まれる。
本発明の好ましい態様に係る抗体は、 配列番号： 1 (Nectin- 2 α )または配列番 号： 3 (Nectin-2 5 )で表されるアミノ酸配列の、 1-350番目 （細胞外領域） のァ ミノ酸配列に存在するェピト—プ；配列番号： 1 (Nectin-2 a )または配列番号： 3 (Nectin-2 δ )で表されるァミノ酸配列の、 47 - 142番目 （第 1の； EG様ドメィン） または 175- 240番目 （第 2の IG様ドメイン） のアミノ酸配列に存在するェピトー プ；又は配列番号： 1 (Nectin- 2ひ）または配列番号： 3 (Nectin- 2 δ )で表される アミノ酸配列の、第 75， 76, 77， 78, 95, 137， 145, 173， 184, 186， 212番目の少なくとも 1つのァミノ酸残基を含むァミノ酸配列を認識する。
また、 本発明は、 特定の C D Rァミノ酸配列または可変領域ァミノ酸配列を含 有するモノクローナル抗体を提供する。 さらに、 本発明は、 特定の C D Rァミノ 酸配列を含むモノクローナル抗体軽鎖またはその断片、 モノクローナル抗体重鎖 またはその断片をも提供する。
抗体の重鎖および軽鎖の Ν末端側には可変領域が存在し、 それぞれ重鎖可変領 域 （VH) 、 軽鎖可変領域 （VL) と呼ばれる。 可変領域内には相補性決定領域 (.complementarity determining region; CDR) 力 S存在し、 この咅 |5分力 S几原認識の 特異性を担っている。 可変領域の C D R以外の部分は、 C D Rの構造を保持する 役割を有し、 フレームワーク領域 （F R ) と呼ばれる。 重鎖および軽鎖の C末端
25 側には定常領域が存在し、 それぞれ重鎖定常領域 （CH) 、 軽鎖定常領域 （CL) と呼ばれる。 重鎖可変領域中には、 第 1の相補性決定領域 （CDR 1) 、 第 2の 相補性決定領域 （CDR2) およぴ第 3の相補性決定領域 （CDR3) の 3つの 相補性決定領域が存在する。 重鎖可変領域中の 3つの相補性決定領域をまとめて 重鎖相補性決定領域と呼ぶ。 軽鎖可変領域中にも同様に、 第 1の相補性決定領域 (CDR1) 、 第 2の相補性決定領域 (CDR2) および第 3の相補性決定領域 (CDR3) の 3つの相補性決定領域が存在する。 軽鎖可変領域中の 3つの相補 性決定領域をまとめて軽鎖相補性決定領域と呼ぶ。 .
具体的には、 本発明の好ましい態様に係る抗体は、 抗体重鎖可変領域の第 1の 相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性決定領域（ C D R 2 ) および第 3の相 補性決定領域（CDR 3) のアミノ酸配列が、 それぞれ、 (i)配列番号： 184， 200, 216, 232, 248, 264, 280および 296からなる群より選択される配列番号、 （ii) 配列番号： 185， 201, 217, 233, 249, 265， 281および 297からなる群より選択 される配列番号および（iii)配列番号： 186， 202, 218， 234, 250, 266, 282およ ぴ 298からなる群より選択される配列番号で表されるァミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含む。
また本発明の他の好ましい態様に係る抗体は、 抗体軽鎖可変領域の第 1の相補 性決定領域 （CDR 1)、第 2の相補性決定領域 （CDR2) および第 3の相補性 決定領域（CDR 3)のアミノ酸配列が、それぞれ、（iv)配列番号： 192, 208， 224, 240, 256, 272, 288および 304からなる群より選択される配列番号、 （v)配列番 号： 193, 209， 225， 241, 257， 273， 289および 305からなる群より選択される 配列番号おょぴ（vi)配列番号： 194， 210, 226, 242， 258， 274, 290 および 306 力 なる群より選択される配列番号で表されるァミノ酸配列と同'一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を含む。
本発明の抗体の CDR配列は必ずしも限定されないが、 VH CDR1、 VH CDR2及び VH CDR3としてのアミノ酸配列の好適な組合せ、 VL CDR1、 VL CDR2及び VL CDR3と してのアミノ酸配列の好適な組合せは、 後述する表 21および 22に示されてい る。 CDR以外のアミノ酸配列は特に限定されず、 CDR以外のアミノ酸配列が 他の抗体、 特に、 他種の抗体由来である、 いわゆる CD R移植抗体が本発明の抗 体に包含される。 CDR以外のアミノ酸配列はヒト由来のアミノ酸配列が好まし
26 —く、 必要に応じてフレームワーク領域 （F R) に 1ないし数個のアミノ酸残基の 付加、 欠失、 置換及び/または揷入を伴っていてもよい。 . なお、 本発明の抗体可変領域のアミノ酸配列および塩基配列は、 表 2 5に記載 のものが好ましい。
本宪明の抗体の特定の C D Rァミノ酸配列または可変領¾ァミノ酸配列を含有 するモノクローナル抗体の作製は、 公知の方法を用いることができる。
本発明の抗体は、 抗体の定常領域が好ましくはヒト抗体、 より好ましくはヒト I g G、さらに好ましくはヒト I g G lサブクラスに属するモノクローナル抗体で ある。
Nectin-2もしくはその部分べプチドまたはそれらの塩 （以下、抗体の説明にお いては、 これらを単に Nectin- 2と略記する場合がある） に対する抗体は、 自体公 知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
以下に、本発明の抗体の抗原 製法、およぴ該抗体の作製法について説明する。 ( 1 ) 抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、 例えば、 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（Nectin - 2) もしくはその部分ぺプチドまたはそれらの塩、 配列番号： 1または配列番号：. 3 で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質 （Nectin - 2) を天然にあるいは人 為的に高発現する細胞株またはその膜画分、 Nectin-2の細胞外領域タンパク質と その他のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質またはその塩、 または Nectin - 2と同一の抗原決定基を 1種あるいは 2種以上有する （合成）ペプチドな ど何れのものも使用することができる （以下、 これらを単に本発明の抗原と称す ることあある）。
本発明の抗原の具体例としては、 Nectin-2を天然にあるいは人為的に高発現す る細胞株またはその膜画分、 Nectin - 2 の細胞外領域タンパク質またはその塩、 Nectin-2 の細胞外領域とその他のタンパク質またはぺプチドとの融合タンパク 質、 または Nectin-2 と同一の抗原決定基を 1種あるいは 2種以上有する（合成) ぺプチドなどが好ましく用いられる。
その他のタンパク質またはペプチドとしては、 例えば、 FLAG- tag、 His-tag, Myc- tag、 V5-tag, GST-tag, S- tag、 T7-tags ゃヒト抗体、 マウス抗体などの Fc
27 領域などが挙げられる。
かかる（合成)ぺプチドの長さは免疫原性を有するような長さである限り特に限 定されないが、 例えば 6個、 好ましくは 1 0個、 より好ましくは 1 2個の連続す るアミノ酸残基を有するものが挙げられる。
Nectin-2もしくはその部分ぺプチドまたはその塩は、前述したヒトゃ温血動物 の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法あるいはそれに準ずる方 法によって製造することもできるし、 タンパク質をコードする D N Aを含有する 形質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のぺプ チド合成法に準じて製造することもできる。また Nectin - 2の細胞外領域とその他 のタンパク質またはぺプチドとの融合タンパク質はその融合タンパク質をコード する D N Aを含有する形質転換体を培養することによつて製造することができる。
(a) 本発明の抗原またはそれらの塩をヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラ ット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 プタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の組織また は細胞から調製する場合、 その組織または細胞をホモジナイズした後、 粗分画物 (例、 膜画分、 可溶性画分） をそのまま抗原として用いることができる。 あるい は酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、 ゲル濾過、 逆相クロマトグラフィ一、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二 ティ一クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより 精製単離することもできる。
(b) D N Aを含有する形質転換体を用いて Nectin-2、 もしくは Nectin- 2の細胞 外領域とその他のタンパク質 (ぺプチド）との融合タンパク質またはその塩を製造 する場合、 該 D N Aは、 公知のクローユング方法 〔例えば、 Molecular Cloning (2nd ed. ； J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) (こ § 載の方法など〕 に従って作製することができる。
Nectin - 2またはその部分ペプチド （以下、 これらをコードする D N Aのクロー 二ングぉよび発現の説明においては、これらを単に Nectin-2と略記する場合があ る） を完全にコードする D N Aのクローニングの手段としては、 Nectin-2をコー ドする塩基配列の一部分を有する合成 D N Aプライマーを用いて P C R法によつ て増幅する力 または適当なベクターに組み込んだ D N Aを Nectin - 2の一部ある いは全領域をコードする D N A断片もしくは合成 D N Aを用いて標識したものと
28 のハイブリダィゼ一シヨンによって選別することができる。 PCR に用いる铸型ポ リヌクレオチドとしては、 Nectin-2をコードする塩基配列を含有するものであれ ばいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ 一、 前記した細胞 '組織由来の cDNA、 前記した細胞 '組織由来の c DNAラ イブラリー、 合成 DN Aのいずれでもよい。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例 ば、 Molecular Cloning 2ηα (J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lao. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライ ブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことが できる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従つて行なうことがで きる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜4 Om M、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 °C、 好ましくは約 60 〜65°Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 19 mMで温度が約 65°Cの 場合が最も好ましい。
より具体的には、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパ ク質 （Nectin - 2c をコードする DNAとしては、 配列番号： 2で表される塩基 配列を含有する DN Aなどが、 （ii)配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有 するタンパク質 （Nectin - 2S) をコードする D Ν Αとしては、 配列番号： 4で表 される塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
DNAの塩基配列の変換は、 PCR、 公知のキット、 例えば、 MutanTM- super Express Km (宝酒造 （株））、 Mutan™-K (宝酒造 （株）） 等を用いて、 0M- LA PCR 法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方 法に従って行なうことができる。
クローン化された Nectin- 2をコードする DNAは目的によりそのまま、または 所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付カ卩したりして使用することがで きる。 該 DNAはその 5， 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また. 3 ' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有してい てもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAァダ プターを用いて付加することもできる。 Nectin - 2の細胞外領域とその他のタンパ ク質 (ペプチド）との融合タンパク質またはその塩をコードする DNAを得る場合
29 には、上記と同様の方法によりクローニングするか合成した Nectin- 2細胞外領域 をコ一.ドする D N Aとその他のタンパク質（ぺプチド）をコードする D N Aとを自 体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従つて連結する事ができる。
Nectin- 2の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） Nectin-2をコードする D N Aから 目的とする DNA断片を切り出し、 （口）該 DNA断片を適当な発現ベクター中の プロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例、 p BR 322， p BR 32 5， pUC 12, pUC 1 3)、 枯草菌由来のプラスミ ド （例、 pUB 1 10， p TP 5, pC 1 94)、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 1 9， p SH 1 5)、 λ ファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルスなど の動物ゥィルス、バキュロウィルスなどの昆虫ウィルスなどの他、 p A 1— 1 1、 pXT l、 pR c/CMV、 p R c/R S V、 p c DNA I /N e oなどが用い られる。 ' ，
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRaプロモーター、 SV40プロモーター、 LTRプ 口モーター、 CMV (サイ トメガロウイノレス） プロモーター、 HSV^TKプロモ 一ターなどが挙げられる。
これらのうち、 CMVプロモーター、 SRひプロモーターなどを用いるのが好 ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプ 口モーター、 r e c Aプロモーター、 1 PL プロモーター、 1 p pプロモーター、 T 7プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 S POlプロモー ター、 S PO 2プロモーター、 p e η Ρプロモ ターなど、 宿主が酵母である場 合は、 ΡΗΟ 5プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 AD Hプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプ 口モーター、 p 1 0プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ グナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 S V40複製オリジン (以下: S V40 o r i と略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f r
30 と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕、 アンピシリ ン耐性遺伝子 （以下、 Amp r と略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子 (以下、 N e o r と略称する場合がある、 G 4 1 8耐性）等が挙げられる。特に、 d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて d h f r遺伝子を選択 マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても 選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 Nectin- 2の N端末側に付 加する。 宿主がェシェリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シグナル配列、 ΟπιρΑ ·シ グナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミラーゼ 'シグナ ル配列、サプチリシン ·シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、 MF a · シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 ひ一インターフェロン'シグナル配列、抗体分子 · シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された Nectin- 2 をコードする D N Aを含有するベクター を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシヱリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒァ属菌の具体例としては、例えば、ェシエリヒア ·コリ (Escherichia coli) K 1 2 - DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60卷， 160 (1968)〕， JM1 0 3 [Nucleic Acids Research, 9 卷， 309 (1981)〕， J A 2 2 1 [Journal of Molecular Biology, 120 卷， 517 (1978)〕， H B 1 0 1 [Journal of Molecular Biology, 41卷， 459 (1969)〕, C 6 0 0 [Genetics, 39卷， 440 (1954)〕 などが用いら れる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス 'サブチルス （Bacillus subtilis) M I 1 1.4 〔Gene， 24卷， 255(1983)〕， 2 0 7 - 2 1 [Journal of Biochemistry, 95 卷， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) AH 2 2, AH 2 2 R—， NA 8 7 - 1 1 A, DKD— 5 D， 2 0 B— 1 2、 シゾサッカロマイセス ポンべ (Schizosaccharomyces pombe) NCY C 1 9 1 3， NCYC 2 0 3 6、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) KM 7
31 1などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが A c NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 （Spodoptera frugiperda cell； Sf細胞）、 Trichoplusia niの中腸由 来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae 由来の細胞または Estigmena acrea 由来の細胞などが用いられる。 ウィルスが BmNPV の場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N細胞； BmN細胞） などが用 いられる。 該 Sf細胞としては、 例えば、 Sf9細胞 （ATCCCRL1711)、 Sf21細胞 （以 上、 Vaughn, J.L.ら、 イン ' ヴイボ (In Vivo) ，13， 213 - 217，（1977)) などが用 レヽられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー (Nature) , 3 1 5卷， 5 9 2 (1 98 5)〕。 . 動物細胞としては、 例えば、 サル COS— 7細胞、 Ve r o細胞、 チヤィニー ズハムスター CHO細胞 （以下、 CHO細胞と略記）、 d h f r遺伝子欠損チヤィ ニーズハムスター CHO細胞 （以下、 CHO (d h f χ - ) 細胞と略記）、 マウス L細胞、 マウス A t Τ— 20細胞、 マウスミエローマ細胞、 マウス ATDC 5細 胞、マウス NS 0細胞、マウス FM3 A細胞、 ラット GH3細胞、 ヒ ト F L細胞、 ヒト胎児 HE K 2 9 3細胞、 ヒト胎児細胞 2 9 3 F細胞、 などが用いられる。 ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, 69巻， 2110 (1972)や Gene, 17卷， 107(1982)などに記載の方法に従って行なうこと ができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General Genetics, I68 卷， 111 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換する には、 例えば、 Methods in Enzymology, 194 巻， 182 - 187 (1991)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75卷， 1929 (1978)などに記載の 方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology, 6, 47 - 55 (1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコール. 263-267(1995) (秀潤社発行）、 Virology, 52 卷， 456 (1973)に記載の方 法に従って行なうことができる。 .
32 このようにして、 Nectin - 2をコードする D N Aを含有する発現ベクターで形質 転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシヱリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、 例えば、 グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ' リカー、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としては、 例えば、 塩ィ匕カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシ ゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 成長促進因子などを添 加してもよい。 培地の p Hは約 5〜8が望ましい。
工シエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 [ Mi ller , Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431— 433， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 力好ましレヽ。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 β一^ fン ドリノレアタリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシェリヒァ属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 4 3 DCで約 3〜 2 4時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0 - 0 °Cで約 6〜 2 4時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ルダー (Burkholder)最小培地 [Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 77卷， 4505 (1980)〕 や 0 . 5 %カザミノ酸を含有する S D培地 〔Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 81 卷， 5330 (1984)〕 が挙げられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整するのが好ましレ、。 培養は通常約 2 0 °C〜 3 5 °Cで約 2 4〜 7 2時間行ない、 必要に応じて通気ゃ撹 拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace' s Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962) ) に非働化した 1 0 %ゥシ血 等 の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の p Hは約 6 . 2〜6 . 4に 調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 7 °Cで約 3〜 5日間行ない、 必要に応じ
33 て通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、.約 5 〜2 0 %の胎仔牛血清を含む MEM培地 [Science, 122卷， 501 (1952)〕， DME M培地 (Virology, 8卷， 396 (1959)〕， R P M I 1 6 4 0培地 [The Journal of the American Medical Association, 199卷， 519 (1967〕， 1 9 9培地 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73巻，.1 (1950)〕 などが用いられる。 H は約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 1 5〜 6 0時間 行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に Nectin-2を生 成せしめることができる。
上記培養物から Nectin- 2を分離精製するには、例えば、下記の方法により行な ゔことができる。
Nectin-2を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方 法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチ一 ムおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、 遠心 分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。 緩衝 液の中に尿素や塩酸グァ-ジンなどのタンパク質変性剤や、 トリ トン X— 1 0 0 τ Μなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に Nectin - 2が分泌される 場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離 し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる Nectin- 2の精 製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 これ らの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方 法、 透析法、 限外ろ過法、 およびゲルろ過法などの主として分子量の差を利用す る方法、 .イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ 二ティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、 疎水性相互作 用クロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方 法、クロマトフォー力シングなどの等電点の差を利用する方法などが用いら†Lる。 ' かくして'得られる Nectin- 2が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法ある いはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場合
34 には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に変 換することができる。 - なお、組換え体が産生する Nectin- 2を、精製前または精製後に適当なタンパク 質修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部 分的に除去することもできる。 タンパク質修飾酵素としてほ、 例えば、 トリプシ ン、 キモトリプシン、 アルギニルェンドぺプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グ リコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する Nectin-2の存在は、特異抗体を用いたェンザィムィムノアツ セィゃウェスタンプロッティングなどにより測定することができる。
(c)Nectin-2 を発現する哺乳動物細胞自体を、 本発明の抗原として直接用いるこ ともできる。 哺乳動物細胞としては、 上記 （a) 項で述べたような天然の細胞、 上 記（b)項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形 質転換に用いる宿主としては、 ヒト、 サル、 ラット、 マウス、 ハムスターなどか ら採取した細胞であれば何れのものでも良く、 HEK293細胞、 C0S7細胞、 CHO- K1 細胞、 NIH3T3細胞、 Balb3T3細胞、 FM3A細胞、 L929細胞、 SP2/0細胞、 P3U1細胞、 NS0細胞、 B16細胞、 または P388細胞などが好ましく用いられる。
(d) Nectin-2 と同一の抗原決定基を 1種あるいは 2種以上有する（合成)ぺプチ ドまたはその塩は、 自体公知のペプチドの合成法に従って、 あるいは Nectin - 2 を適当なぺプチダーゼで切断することによつて製造することができる。 ぺプチド の合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 該ぺプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分と を縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的の ぺプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例 えば、 以下の （i) 〜 （V) に記載された方法が挙げられる。
( i ) M. . Bodanszky および M. A. 0ndetti、 ペプチド ' シンセシス （Peptide Synthesis) , Interscience Publishers, New York (1966年)
(ii) Schroederおよび iebke、ザ ·ペプチド (The Peptide)， Academic Press, New York (1965年） '
(i i i) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(iv)矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、タンパク質の化学 IV、 205、
35 (1977年） ■ (v) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14卷、 ペプチド合成、 広川書店- また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 '蒸留 'カラムクロマトダラ フィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明で用いられ る部分ペプチドを精製単離することができる。 上記方法で獰られる部分ペプチド が遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によつて適当な塩 に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれ に準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
( 2 ) モノクローナル抗体の作製
( a ) ハイプリドーマ法によるモノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原は、 温血動物に対して投与される。 免疫方法としては、 抗体産生 を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、 筋肉内注射、 皮下注射、 皮内注射、 またはフットパッド注射などが好ましく用い られる。 '
本発明のタンパク質を発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した哺乳動 物細胞は、組織培養に用いられる培地（例、 RPMI1640) または緩衝液（例、 Hanks ' Balanced Salt Solution)に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。 本発明の抗原は、 不溶ィ匕したものを直接免疫することもできる。 また、 本発明 の抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体（キ ャリア一） と本発明の抗原 （ハプテン） との混合比は、 担体に結合あるいは吸着 させた本発明の抗原に対して抗体が効率よくできれば、 どのようなものをどのよ うな比率で結合あるレヽは吸着させてもよく、 通常ハプテン抗原に対する抗体の作 製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテン 1 に対し 0 . 1〜1 0 0の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することがで きる。 天然の高分子担体としては、 例えばゥシ、 ゥサギ、 ヒトなどの哺乳動物の 血清アルブミンゃ例えばゥシ、 ゥサギなどの哺乳動物のチログロプリン、 例えば ゥシ、 ゥサギ、 ヒト、 ヒッジなどの 11甫 動物のヘモグロビン、 キーホールリンぺ ットへモシァニンなどが用いられる。 合成の高分子担体としては、 例えばポリア ミノ酸類、 ポリスチレン類、 ポリアタリル類、 ポリビュル類、 ポリプロピレン類 などの重合物または供重合物などの各種ラテツタスなどを用いることができる。
36 また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できる 6 例えば、 チロシン、 ヒスチジン、 トリプトファンを架橋するビスジァゾ 化べンジジンなどのジァゾニゥム化合物、 ァミノ基同志を架橋するグルタルァノレ デビトなどのジアルデヒド化合物、 トルエン一 2 , 4—ジイソシァネートなどの ジイソシァネート化合物、 チオール基同志を架橋する N， N， 一 o—フエ二レン ジマレイミ ドなどのジマレイミ ド化合物、 ァミノ基とチオール基を架橋するマレ ィミ ド活性エステル化合物、 ァミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルポジィ ミ ド化合物などが好都合に用いられる。 また、 アミノ基同志を架橋する際にも、 一方のァミノ基にジチォピリジル基を有する活性エステル試薬 (例えば、 3- (2 - ピリジルジチォ）プロピオン酸 N -スクシンィミジル （SPDP) など） を反応させた 後還元することによりチオール基を導入し、 他方のァミノ基にマレイミ ド活性ェ ス'テル試薬によりマレイミ ド基を導入後、 両者を反応させることもできる。
本発明の抗原を投与する際には、 免疫動物の抗体産生能を高めるため、 本発明の 免疫原をフロインド完全アジュバントゃフロインド不完全アジュバント、 Alum、 Ribi アジュバント等のアジュバントと混合もしくはエマルシヨンを調製して該 動物に投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行 われる。 また、 本発明のモノクローナル抗体の作製に際しては、 D NA免疫法を 利用してもよい (例えば、 Nature、 356卷、 152頁 - 154頁参照）。 用いられる温血 動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ハ ムスター、 ヒッジ、 ャギ、 ラクダ、 ラマ、 エワトリが挙げられるが、 マウスおよ ぴラットが好ましく用いられる。 これらの温血動物は野生型のものであっても良 いし、 また抗原に対してより強い免疫反応を得るために抗原たんぱく質の該温血 動物オルソローグ遺伝子をノックアウトした K0動物であっても良い。またヒ トモ ノクローナル抗体を作製する為には、 温血動物の抗体遺伝子をノックアウトし、 ヒ ト抗体遺伝子を導入したトランスジエニック動物（欧州特許公開公報 EP0546073参照）ゃノックイン動物（W0 02/098217号公報、 W0 03/020743号公報） 等を用いればよい。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生 B細胞を同種または異種動
37 物の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドー マを調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 抗原に特異的に結合す る抗体量を定量できるどんな方法であっても良い。 例えば後記のように、 固相化 したタンパク質抗原や抗原発現細胞株と抗血清とを反応させたのち、 これらに結 合した抗体量を標識抗免疫グロプリン抗体により検出する i.とにより抗体価を測 定することができる。 融合操作は既知の方法、. 例えば、 ケ一ラーとミルスタイン の方法〔ネイチヤー (Nature)、 256、 495 (1975)] に従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) やセンダイゥ ィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 S P 2/0、 AP— 1な どの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 S P 2/0や P 3U1が好ましく用 いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい 比率は 1 ： 1〜 20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG1000〜PE G6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加され、 20〜 40 °C、 好ましくは 30〜37°〇で1〜1 0分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を 実施できる。
また、 モノクローナル抗体産生細胞の作製の為の細胞融合操作として電気融合 法を用いても良い。
ハイプリ ドーマの選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なう ことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添' 加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別およぴ育種用培地としては、 ハイブリ ドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、 1〜 20 %、好ましくは 10〜 20 %の牛胎仔血清を含む R PM I 1640培地、 1〜10%の牛胎仔血清を含む G I T培地（和光純薬工業（株)） あるいはハイブ リ ドーマ培養用無血清培地 （S FM_ 101、 日水製薬（株)） などを用いること ができる。 培養温度は、 通常 20〜40°C、 好ましくは約 37 °Cである。 培養時 間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 % 炭酸ガス下で行なうことができる。 ' モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 可溶性のタンパク質抗原やタンパク質抗原発現細胞を直接
38 あるいは担体とともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリ ドー マ培養上清を添加し、 次に放射†生物質、 酵素、 蛍光物質などで標識した抗免疫グ ロブリン抗体 （例えば細胞融合に用いられる脾臓細胞がマウスの場合、 抗マウス 免疫グロプリン抗体が用いられる）またはプロテイン Aを反応させることにより、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 あるいは抗免疫グロブリン 抗体またはプロティン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質、 酵素、 蛍光物質などで標識した可溶性のタンパク質抗原を反応 させることにより、 固相に結合した抗原特異的なモノクローナル抗体を検出する 方法などが挙げられる。 タンパク質抗原発現細胞を用いる場合には、 該細胞にハ イブリ ドーマ培養上清を添加し、 '次に蛍光標識抗免疫グロブリン抗体を反応させ た後、 フローサイトメータ一等の蛍光検出装置で該細胞の蛍光強度を測定するこ とにより、 該細胞膜上のタンパク質抗原に結合したモノクローナル抗体を検出す ることができる。
( b ) その他の方法によるモノクローナル抗体作製
本発明の抗体の作製方法は（a) に記載の方法に限定されるものではなく、例え ばヒトゃ温血動物（例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ヒッジ、 ャギ、 ラクダ、 ラマ、 ニヮトリなど）の Bリンパ球を材料と して公知の方法により作製された抗体遺伝子ライブラリーを、 バクテリオファー ジ、 大腸菌、 酵母、 動物細胞等の細胞表面やリボソーム上等に提示させた、 いわ ゆる抗体ディスプレー技術を用いる事ができる。 [Nature Biotechnology 23, 1105 (2005) ] ヒトゃ温血動物はナイーブなものであっても良いし、 本発明の抗原を高 発現した癌の患者や本発明の抗原を（a)に記載の方法で免疫された温血動物であ つても良い。 細胞表面に提示させる抗体の形態としては IgG分子、 IgM分子、 Fab フラグメント、一本鎖 Fv (scFv)フラグメント等が挙げられるがこれに限定される ものではない。
本発明の抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体（フラグメント）の遺伝子 は、 上述の抗体遺伝子ライブラリ一を担いだ抗体（フラグメント）提示細胞もしく は抗体（フラグメント）提示リボソームを本発明の抗原に対し一定時間反応させ、 非特異的に結合するものを洗浄除去した後、 本発明の抗原に特異的に結合するも のを溶出回収し、 その抗体（フラグメント）提示細胞もしぐは抗体（フラグメント）
39 提示リボソームを公知の方法により増殖させた後、 数回同様の方法を繰り返し、 最終的にクローン化した抗体（フラグメント）提示細胞もしくは抗体（フラグメン ト）提示リポソームから公知の方法により単離することにより得られる。こうして 得たモノクローナル抗体フラグメント遺伝子は公知の方法により IgG抗体遺伝子 の該領域と組替えることにより、 モノクローナノレ IgG抗体遺伝子を得ることがで きる。 .
また、 本発明の抗体は、 ヒトゃ上述の温血動物から単離した抗体産生細胞を試 験管内において本発明の抗原により自体公知の方法により免疫した後、（a)に記載 と同様の方法によりハイプリ ドーマを作製する事により得ることもできる。
( c ) モノクローナル抗体の製造
本発明のモノクローナル抗体は（a)で得られたモノクローナル抗体産生ハイブ リ ドーマや、（a)で得られたモノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマから公知の方 法で単離された抗体遺伝子や (b)で得られたモノクローナル抗体遺伝子を人為的 に発現させた組換え細胞株を培養することにより製造する事ができる。 また該抗 体遺伝子を公知の方法により温血動物や植物の染色体に組み込み、 温血動物の血 液、乳汁、卵や植物体、力ビ等に生産させることにより製造する事もできる〔Curr. Op in. Biotevhnol. 7， 536 (1996)、 Nature Rev. Genet 4, 794 (2003)、Appl. Environ. Microbiol. 70, 2567 (2004)〕。 温血動物としては例えばゥシ、 ャギ、 ヒッジ、 ブ タ、 ニヮトリ、 マウス、 ゥサギ等が用いられる。 また植物体としてはタバコ、 ト ゥモロコシ、 ジャガイモ、 ゥキクサ等が用いられる。
本発明のモノク口ーナル抗体は、 上記のモノクローナル抗体含有原料から自体 公知の方法、 例えば、 免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈 殿法、 等電点沈殿法、 ィオン交換ク口マトグラフィ一、 疎水性相互作用クロマト グラフィー、 逆相クロマトグラフィー、 ゲルろ過クロマトグラフィー、 ヒドロキ シァパタイトクロマトグラフィー、 抗原あるいはプロテイン Aやプロティン Gな どの抗体に親和性のある物質を固定化した担体により抗体のみを分離精製するァ フィニティークロマトグラフィ一等の各種クロマトグラフィ一等〕 に従って行な うことができる。 ' ( 3 ) 本発明の抗体を含有する医薬
上記した本発明の抗体を含有する医薬は、 例えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺
40 癌、前立腺癌、食道癌、 胃癌、 肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、 腎癌、膀胱癌、子宮癌、 卵巣癌、.精巣癌、 甲状腺癌、膝臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など） の予防 ·治療剤 （好 ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膝臓癌などの予防 ·治療剤）、 癌細胞のアポトーシス促進剤、 癌細胞の増殖阻害剤、 癌細胞の細胞周期変化の誘 発剤、癌転移抑制剤、癌細胞の接着阻害剤、抗体の Fc領域を介した生体防御機構 を利用する癌細胞障害剤、 抗体依存性の癌細胞傷害剤などとして使用することが できる。抗体の Fc領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害方法としては、 生体のエフェクタ一細胞による抗体依存性細胞障害活性 (Antibody- Dependent Cell-mediated Cytotoxicity ； ADCC) や補体依存性細胞 障害活性 (Complement - Dependent Cytotoxicity； CDC) が挙げられるが、 好ましくは ADCC が用いられる。
発明の抗体を含有する医薬は低毒性であり、 そのまま液剤として、 または適 当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺轧動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッ ジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的 (例、 血管内投与、 皮下投与など） に投与することができる。
本発明の抗体は、 それ自体を投与しても良いし、 または適当な医薬組成物とし て投与しても良い。 投与に用いられる医薬組成物としては、 本発明の抗体または その塩と薬理学的に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであ つても良い。 このような医薬組成物は、 経口または非経口投与に適する剤形とし て提供される。
非経口投与のための糸且成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤等が用いられ、 注 射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤等の剤形 を包含しても良い。 このような注射剤は、 公知の方法に従って調製できる。 注射 剤の調製方法としては、 例えば、 上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に 用いられる無菌の水性液、 または油性液に溶解、 懸濁または乳化することによつ て調製できる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその 他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例、 エタノール）、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレン グリコール）、 非ィオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 8 0、 H C O - 5 0 (.polyoxyethylene 50mol) adduct of hydrogenated castor oilj J 等と併用し
41 てもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が用いられ、 溶解補助剤 として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等を併用してもよい。 調製された 注射液は、 適当なアンプルに充填されることが好ましい。 直腸投与に用いられる 坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製 されても良い。 '
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖 衣錠、 フィルムコーティング錠を含む）、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフ トカプセル剤を含む）、 シロップ剤、 乳剤、懸濁剤等が挙げられる。 このような組 成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用いられる担体、 希 釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 例 えば、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 このような投薬単位の剤形 としては、 例えば、 定剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル）、 坐剤が挙げら れる。 抗体の含有量としては、 投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射 剤では 5〜100mg、その他の剤形では 10〜250mgの上記抗体が含有されていること が好ましい。
本発明の抗体を含有する上記予防 ·治療剤、 調節剤の投与量は、 投与対象、 対 象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療 · 予防のために使用する場合には、 本発明の抗 ί本を 1 回量として、 通常 0. 0：！〜 20mg/kg体重程度、 好ましくは 0.：！〜 10mg/kg体重程度、 さらに好ましくは 0. 1〜 5mg/kg体重程度を、 1日 1〜5回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度、 静脈注射に より投与するのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の場合もこれに 準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合には、 その症状に応じて 増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができ る。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的に許 容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口または非経口投与 （例、 血管内注射、 皮下注射など） に適する剤形として提 供される。
42 なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。
さらに、 本発明の抗体は、 他の薬剤、 例えばアルキルィヒ剤 （例、 サイクロフォ スフアミ ド、 ィフォスフアミ ド等）、 代謝拮抗剤 (例、 メソトレキセ一ト、 5—フ ルォロウラシル等）、抗癌性抗生物質 (例、マイトマイシン、ァドリアマイシン等）、 植物由来抗癌剤 （例、 ビンクリスチン、 ビンデシン、 タキソール等）、 シスプラチ ン、 カルポプラチン、 エトポキシド、 ィリノテカンなどと併用してもよい。 本発 明の抗体および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。
( 4 ) 本発明の抗体を用いる Nectin- 2の定量法
本 明の抗体は、 Nectin - 2を特異的に認識することができるので、被検液中の Nectin-2の定量、特にサンドィツチ免疫測定法による定量などに使用することが できる。
すなわち、 本発明は、
( i )本発明の抗体と、被検液および標識化された Nectin - 2とを競合的に反応さ せ、該抗体に結合した標識化された Nectin - 2の割合を測定することを特徴とする 被検液中の Nectin- 2の定量法、
(ii) 被検液と担体上に不溶ィヒした本発明の抗体および標識化された本発明の別 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の Nectin- 2の定量法、 および
(ii i)被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体とを反応させ、不溶化担体に結合 した Nectin- 2 の量的な変化を例えば表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon
Resonance ； SPR)等の検出法により測定することを特徴とする被検液中の
Nectin-2の定量法
を提供する。
上記 （ii) の定量法においては、 Nectin- 2の結合する部位が相異なる抗体が好 ましく用いられる。
また、本発明の抗体を用いて Nectin_2の定量を行えるほか、組織染色等による 検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いて'もよ く、また、抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよ い。
43 本発明の抗体を用いる Nectin-2の定量法は、特に制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗 体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗 原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれ の測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメ トリー、 競合法、 ィムノメ トリック 法、 SPR法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドィツチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放封性同位元素としては、 例 えば、 〔1 2 5 I〕、 〔1 3 1 I〕、 〔3 H〕、 〔" C〕 などが用いられる。 酵素としては、 安定で 比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 β—ガラタトシダーゼ、 β一ダルコシ ダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素な どが用いられる。蛍光物質としては、例えば、 シァニン蛍光色素（例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバイォサイエンス社製)など）、 フルォレスカミン、 フノレ才レツセンイソテ才シァネート、 Alexa Fluor色泰 (Invitrogen社)、 ユーロ ピゥム蛍光錯体 (Perkin Elmer社）などが用いられる。発光物質としては、例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビォチン一アビジン系を用いるこ ともできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常タ ンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用レ、る 方法でもよい。 抗原あるいは抗体の不溶化はこれらのタンパク質をビォチン標識 し、 ストレブトァビジン（アビジン）を予め不溶化した担体に結合させてもよい。 抗体の不溶化はプロテイン A、 プロテイン G、 抗ィムノグログリン抗体などを予 め不溶ィヒした担体に結合させても良い。 担体としては、 ァガロース、 デキストラ ' ン、 セルロースなどの不溶 ¾多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミ ド、 シリ コン等の合成樹脂、 あるいはガラス等が挙げられる。
サンドィツチ法においては不溶ィヒした本発明の抗体に被検液を反応させ （1次 反応)、 さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ （2次反応） たのち、 不溶 化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量
44 を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同 時に行なつてもよいし時間をずらして行なってもよい。 標識化剤および不溶化の 方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測 定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種 類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合 物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法による Nectin- 2の測定法においては、 1次反応と 2次 反応に用いられる本発明の抗体は、 Nectin - 2の結合する部位が相異なる抗体が好 ましく用いられる。
本発明の抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノ メ トリック法、 SPR法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原（F )と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （B / F分離）、 B , Fいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。 本 反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエチレングリコー ル、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固 相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体として 固相化抗体を用レヽる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する力、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
SPR法ではガラス基板上に形成した金の薄膜表面上に抗体を不溶化させ、 この 薄膜上に^ ¾検液を通液させて薄膜上の抗体に結合した被検たんぱく質の量的な変 化を、 表面プラズモン共鳴（ SPR )の原理 （蛋白質 核酸 酵素， 37， 2977-2984 (1992) ) を用いて定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメ トリーな
45 どが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて Nectin- 2 の測定系を構築すればよ い。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照するこ とができる。
例えば、 入江寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行）、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行）、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行）、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 (第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行)、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3 版） （医学書院、 昭和 6 2年発行）、 「 Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) ) 、 同 Vol. 73 (Iramunochemical Techniques (Part B) ) ^ Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) ) Λ |PJ 書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D : Selected Immunoassays) ) |P] 書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods) ) 、 同 書 Vol. 121 (Immunochemical fechniques (Part I -' Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) ) (以上、 アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、 Nectin - 2を感度良く 定量することができる。
( 5 ) 本発明の抗体を用いる診断剤 ·診断方法
さらには、 本発明の抗体を用いて Nectin- 2 の濃度を定量することによって、 Nectin- 2 の濃度の増加が検出された場合、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵 巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） である、 または将来 罹患する可能 ½Ξが高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する Nectin-2を検出 するために使用することができる。 また、 Nectin - 2を精製するために使用す ¾抗 体力ラムの作製、精製時の各分画中に含まれる Nectin - 2の検出、被検細胞内にお ける Nectin- 2の挙動分析などのために使用することができる。
46 (6) 本発明の乳癌の予防 ·治療剤に用いられる抗体
N e c 1 -80 3 - 2 FERM B P— 1 0 4 1 7)、 '
N e c 1 -24 4- 3 FERM B P - 1 0 4 23)、
N e c 1 -53 0- 1 F ERM B P— 1 0 4 24)、
N e c 1 -90 3 - 1 FERM B P— 1 0 4 2 5)、
N e c 1 -52 0 - 1 F ERM B P - 1 0 4 26)、
N e c 1 -84 5-2 F ERM B P— 1 0 4 27)、
N e c 1 -8 3 4- 1 F ERM B P- 1 0 4 28)、
N e c 1 - 96 4- 1 FERM B P— 1 0 6 8 3)、
N e c 1 - 1 3 0 2- 2 (F ERM B P— 1 0 6 84)、
N e c 1 - 55 4- 1 FERM B P— 1 0 6 8 1)、
Ne c 1 - 76 9 - 2 FERM B P- 1 0 6 8 2)、 または
N e c 8-41 1 6 - 8 (F ERM B P— 1 0 6 8 5)、
で表示されるハイプリ ド一マ細胞により産生されるモノクローナル抗体 (以下、 本発明に用いられる抗体と呼ぶことがある。） を使用することができる。
また、 本発明に用いられる抗体は、 これらのハイプリ ドー が産生する抗体の 特定の C D Rァミノ酸配列または可変領域ァミノ酸配列を有する遺伝子工学的に 産生された抗体 （抗体断片を含む） を含む。
抗体の重鎖および軽鎖の N末端側には可変領域が存在し、 それぞれ重鎖可変領 域 （VH) 、 軽鎖可変領域 （VJ と呼ばれる。 可変領域内には相補性決定領域 (complementarity determining region; CDR) か存在し、 この咅分が饥原 或の 特異性を担っている。 可変領域の CD R以外の部分は、 CD Rの構造を保持する 役割を有し、 フレームワーク領域 （F R) と呼ばれる。 重鎖および軽鎖の C末端 側には定常領域が存在し、 それぞれ重鎖定常領域 （CH) 、 軽鎖定常領域 （CL) と呼ばれる。 重鎖可変領域中には、 第 1の相補性決定領域 （CDR 1 ) 、 第 2の 相補性決定領域 （CDR 2) およぴ第 3の相補性決定領域 (CDR 3) の 3つの 相補性決定領域が存在する。 重鎖可変領域中の 3つの相補性決定領域をまとめて 重鎖相補性決定領域と呼ぶ。 軽鎖可変領域中にも同様に、 第 1の相補性決定 域 (CDR 1 ) 、 第 2の相補性決定領域 （CDR 2) およぴ第 3の相補性決定領域 (CDR 3) の 3つの相補性決定領域が存在する。 軽鎖可変領域中の 3つの相補
47 性決定領域をまとめて軽鎖相補性決定領域と呼ばれる。
本発明に用いられる抗体の CD Rのアミノ酸配列と塩基配列は、 後述する表 2 ：!〜 24に各々示されている。
抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性決定領域 (CDR2) およぴ第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列が、 それ ぞれ、 （i)配列番号： 184， 200， 216， 232， 248, 264， 280および 296から選択さ れる配列番号、 （ii)配列番号： 185, 201, 217, 233， 249， 265, 281 および 297 からなる群より選択される配列番号おょぴ（iii)配列番号： 186， 202, 218, 234, 250, 266, 282および 298からなる群より選択される配列番号で表されるァミノ 酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。
抗体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性決定領域 (CDR 2) およぴ第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列が、 それ ぞれ、 （iv)配列番号： 192， 208, 224, 240, 256, 272， 288および 304力 らなる 群より選択される配列番号、 （V)配列番号： 193, 209, 225, 241， 257, 273， 289 および 305 からなる群より選択される配列番号および (vi)配列番号： 194， 210, 226, 242, 258, 274, 290および 306からなる群より選択される配列番号で表さ れるアミノ酸配列を有する。
本発明に用いられる抗体において、 C D R以外のァミノ酸配列は特に限定され ず、 CDR以外のアミノ酸配列が他の抗体、 特に、 他種の抗体由来である、 いわ ゆる CDR移植抗体が本発明に用いられる抗体に包含される。 CDR以外のアミ ノ酸配列はヒト由来のアミノ酸配列が好ましく、 必要に応じてフレームワーク領 域 （FR) に 1ないし数個のアミノ酸残基の付加、 欠失、 置換及ぴノまたは挿入 を伴っていてもよい。
本発明に用いられる抗体において、 抗体可変領域のアミノ酸配列おょぴ塩基配 列は、 表 25に記載のものが好ましい。 本発明に用いられる抗体の特定の CDR ァミノ酸配列または可変領域ァミノ酸配列を含有するモノクローナル抗体は、 公 知の方法を用いて作製することができる。
(7) 本発明の乳癌の予防 ·治療剤に用いられる抗体と Nectin - 2に対して鐃合 的に結合するモノクローナル抗体
Ne c l -803-2 (FERM BP— 10417)、
48 N e c 1 -244- 3 (F ERM BP— 10423 )、
N e c 1 -530- 1 (F ERM BP— 1 04 24 )、
N e c 1 -903- 1 (FERM BP— 1 04 25 )、
N e c 1 -520- 1 (F ERM B P- 1 04 26 )、
N e c 1 -845- 2 (FERM B P- 1 04 27 )、 .
N e c 1 -834- 1 (F ERM B P— 1 04 28 )、
N e c 1 -964- 1 (F ERM BP— 1 06 83 )、
N e c 1 -1 302 ― 2 (FERM B P一 10 68 4)、
N e c 1 -554- 1 (F ERM BP— 1 06 81 )、
N e c 1 -769- 2 (F ERM B P- 1 06 82 )、 または
N e c 8 -41 1 6一 8 (FERM B P一 10 685)
で表示されるハイブリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体、 または
、 これらのハイブリ ドーマが産生する抗体の特定の CD Rアミノ酸配列または可 変領域ァミノ酸配列を有する遺伝子工学的に産生された抗体 （抗体断片を含む） と、 Nectin- 2に対して競合的に結合するモノクローナル抗体（以下、本発明に用 いられる抗体と競合的に結合する抗体ともいう。）は、以下のとおり得ることがで きる。
(7) _(i) 抗原の調製
本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体を調製するために使用される 抗原としては、 例えば、 配列番号： 1または酉己列番号： 3で表されるアミノ酸配 列を含有するタンパク質 （Nectin- 2) もしくはその部分ペプチドまたはそれらの 塩、 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ酸配列を含有するタンパ ク質 (Nectin_2)を天然にあるいは人為的に高発現する細胞株またはその膜画分、 Nectin-2 の細胞外領域タンパク質とその他のタンパク質またはべプチドとの融 合タンパク質またはその塩、または Nectin- 2と同一の抗原決定基を 1種あるいは 2種以上有する （合成） ペプチド、 配列番号： 2または配列番号： 4で表される 塩基配列もしくはその部分塩基配列を含有する動物細胞発現べクタ一など何れの ものも使用することができる （以下、 これらを単に本発明に用いられる抗原と称 することもある）。
Nectin-2 の細胞外領域との融合タンパク質を作製するための「その他のタンパ
49 ク質またはペプチド」'としては、 例えば、 FLAG- tag、 His- tag、 Myc- tag、 V5- tag、 GST-tag, S - tag、 T7 - tag、ゃヒト抗体、 マウス抗体などの Fc領域などが挙げられ る。
本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体を調製するために使用される Nectin-2 と同一の抗原決定基を有するペプチドの長さは免疫原性を有するよう な長さである限り特に限定されないが、 例えば 6個、 好ましくは 1 0個、 より好 ましくは 1 2個の連続するアミノ酸残基を有するものが挙げられる。
本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体を調製するために使用される 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質 (Nectin-2) もしくはその部分べプチドとしては、 ectin-2の構成ァミノ酸配列 のうち少なくども 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個 以上、 より好ましくは 1 0 0個以上、 最も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ酸配 列を有するペプチドなどが用いられる。
なお、 本発明に用いられる抗体の抗原決定基は、 本願の基礎出願である P C T Z J P 2 0 0 6 Z 3 2 0 4 2 9に説明されている。 本発明では P C TZ J P 2 0 0 6 / 3 2 0 4 2 9の記載をも引用する。
Nectin-2もしくはその部分べプチドまたはその塩は、前述したヒトゃ温血動物 の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法あるいはそれに準ずる方 法によって製造することもできるし、 タンパク質をコードする D NAを含有する 形質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のぺプ チド合成法に準じて製造することもできる。また Nectin- 2の細胞外領域とその他 のタンパク質またはべプチドとの融合タンパク質はその融合タンパク質をコード する D N Aを含有する形質転換体を培養することによって製造することができる。
( 7 ) - (ii)モノクローナル抗体の作製
( a ) ハイプリ ドーマ法によるモノクローナル抗体産生細胞の作製
( 2 ) - (i)に記載の抗原は、温血動物に対して投与される。免疫方法としては、 抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、 静脈内注射、 腹 腔内注射、 筋肉内注射、 皮下注射、 皮内注射、 またはフットパッド注射など 好 ましく用いられる。 本発明に用いられる抗原は、 不溶化したものを直接免疫する こともでき、 また抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫しても
50 よい。
本発明に用いられる抗原を投与する際には、 免疫動物の抗体産生能を高めるた め、 本発明に用いられる抗原をフロインド完全アジュバントやフロインド不完全 アジュバント、 Alum、 Ribiアジュバント等のアジュバントと混合もしくはェマル シヨンを調製して該動物に投与してもよい。 用いられる温血動物としては、 例え ば、 サノレ、 ゥサギ、 ィヌ、 モノレモット、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター、 ヒッジ、 ャギ、 ラクダ、 ラマ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおょぴラットが好ましく 用いられる。 また、 抗原に対してより強い免疫反応を得るために抗原たんぱく質 の該温血動物オルソローグ遺伝子をノックアウトした K0動物であつても良い。ま たヒトモノクロ一ナル抗体を作製する為には、 温血動物の抗体遺伝子をノックァ ゥトし、 ヒト抗体遺伝子を導入したトランスジ ニック動物（欧州特許公開公報
ΕΡΌ546073参照）ゃノックイン動物（W0 02/098217号公報、 W0 03/020743号公報） 等を用いればよい。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生 B細胞を同種または異種動 物の骨髄重細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイブリ ドー マを調製することができる。骨髄腫細胞としては、例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2 / 0、 A P— 1などの温血動物の骨髄重細胞が挙げられるが、 S P 2 / 0 や P 3 U 1が好ましく用いられる。 ハイプリ ドーマの選別は、 自体公知あるいは それに準じる方法に従って行なうことができる。
( b ) その他の方法によるモノクローナル抗体作製
抗体の作製'方法は上記の方法に限定されるものではなく、 例えばヒトゃ温血動 物（例えば、 サ /レ、 ゥサギ、 ィヌ、 モノレモット、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ヒ ッジ、 ャ.ギ、 ラクダ、 ラマ、 -ヮトリなど）の Bリンパ球を材料として公知の方法 により作製された抗体遺伝子ライプラリーを、 パクテリオファージ、 大腸菌、 酵 母、 動物細胞等の細胞表面やリボソーム上等に提示させた、 いわゆる抗体ディス プレー技術を用いる事ができる。 〔Nature Biotechnology 23， 1105 (2005)〕 kト や温血動物はナイーブなものであっても良いし、 本発明に用いられる抗原を高発 現した癌の患者や本発明に用いられる抗原を（a)に記載の方法で免疫された温血
51 動物であっても良い。'細胞表面に提示させる抗体の形態としては IgG分子、 IgM 分子、 Fabフラグメント、 一本鎖 Fv (scFv)フラグメント等が挙げられるがこれに 限定されるものではない。
本発明に用いられる抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体（フラグメン ト）の遺伝子は、上述の抗体遺伝子ライプラリーを担いだ抗体（フラグメント）提示 細胞もしくは抗体（フラグメント）提示リボソームを本発明に用いられる抗原に対 し一定時間反応させ、 非特異的に結合するものを洗浄除去した後、 本発明に用い られる抗原に特異的に結合するものを溶出回収し、 その抗体（フラグメント）提示 細胞もしくは抗体（フラグメント）提示リボソームを公知の方法により増殖させた 後、 数回同様の方法を繰り返し、 最終的にクローン化した抗体（フラグメント）提 示細胞もしくは抗体（フラグメント）提示リボソームから公知の方法により単離す ることにより得られる。 こうして得たモノクローナル抗体フラグメント遺伝子は 公知の:^法により IgG抗体遺伝子の該領域と組替えることにより、 モノクローナ ル IgG抗体遺伝子を得ることができる。
本発明に用いられる抗体の特定の C D Rアミノ酸配列または可変領域アミノ酸 配列と実質的に同一のァミノ酸配列を含有するモノク口 ナル抗体を遺伝子工学 的に取得することもできる。
ここで、 上記の本発明に用いられる抗体の特定の C D Rアミノ酸配列または可 変領域アミノ酸配列 （以下、 アミノ酸配列 A) と実質的に同一のアミノ酸配列と しては、 アミノ酸配列 Aと約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 より好まし くは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 % 以上、 特に好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げら れる。 '
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search fool) を用い、 以下の条件 （期待値 =10；ギヤップを許す；マトリタス =BL0SUM62；フ ィルタリング = 0FF) にて計算することができる。
また、 ァミノ酸配列 Aと実質的に同一のァミノ酸配列を含有するモノクローナ ル抗体としては、 例えば、 （i) アミノ酸配列 A中の 1または 2個以上 （例えば 1 〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さ
52 らに好ましくは 1〜数個（例えば 1〜 5個））のァミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 (i i) アミノ酸配列 Aに 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数（ 1〜 5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i) アミノ酸配列 Aに 1または 2個 以上 （例えば 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、' より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは 1〜数個（例えば 1〜 5個）） のァミノ酸が挿入さ れたアミノ酸配列、 （iv) アミノ酸配列 A中の 1または 2個以上（例えば 1〜5 0 個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好 ましくは 1〜数個（例えば 1〜5個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたァ ミノ酸配列、 または（V) それらを組み合わせたァミノ酸配列を含有する抗体など も含まれる。
また、 本発明に用いられる抗体は、 ヒトゃ上述の温血動物から単離した抗体産 生細胞を試験管内において本発明に用いられる抗原により自体公知の方法により 免疫した後、 ハイプリ ドーマを作製する事により得ることもできる。
本発明に用いられるモノクローナル抗体は（a)で得られたモノクローナル抗体 産生ハイブリ ドーマや、（a)で得られたモノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマか ら公知の方法で単離された抗体遺伝子や (b)で得られたモノクローナル抗体遺伝 子を人為的に発現させた組換え細胞株を培養することにより製造する事ができる。 また該抗体遺伝子を公知の方法により温血動物や植物の染色体に組み込み、 温血 動物の血液、 乳汁、 卵や植物体、 カビ等に生産させることにより製造する事もで きる [Curr. Opin. Biotevhnol. 7， 536 (1996)、 Nature Rev. Genet 4, 794 (2003)、 Appl. Environ. Microbiol. 70， 2567 (2004)〕。 温血動物としては例えばゥシ、 ャギ、 ヒッジ、 ブタ、 ニヮトリ、 マウス、 ゥサギ等が用いられる。 また植物体と してはタバコ、 トウモロコシ、 ジャガイモ、 ゥキクサ等が用いられる。
抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、 例 えば、 可溶性のタンパク質抗原ゃタンパク質抗原発現細胞を直接あるいは担体と ともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清を添 加し、次に放射性物質、酵素、蛍光物質などで標識した抗免疫グロプリン抗体'（例 えば細胞融合に用いられる脾臓細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロプリン抗 体が用いられる） またはプロテイン Aを反応させることにより、 固相に結合した
53 モノクローナル抗体を検出する方法、 あるいは抗免疫グロブリン抗体またはプロ ティン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質、 酵素、蛍光物質などで標識した可溶性のタンパク質抗原を反応させることにより、 固相に結合した抗原特異的なモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられ る。 タンパク質抗原発現細胞を用いる場合には、 該細胞にハイプリ ドーマ培養上 清を添加し、 次に蛍光標識抗免疫グロブリン抗体を反応させた後、 フローサイト メ一ター等の蛍光検出装置で該細胞の蛍光強度を測定することにより、 該細胞膜 上のタンパク質抗原に結合したモノクローナル抗体を検出することができる。 本発明に用いられるモノクローナル抗体は、 上記のモノクローナル抗体含有原 料から自体公知の方法、 例えば、 免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 ァ ルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水性相互作 用クロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィ一ゲルろ過クロマトグラフィー、 ヒドロキシァパタイトクロマトグラフィー、 抗原あるいはプロティン Aやプロテ イン Gなどの抗体に親和性のある物質を固定化した担体により抗体のみを分離精 製するァフィ二ティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー等〕 に従 つて行なうことができる。
( 7 ) - (i ii) 本発明の乳癌の予防 ·治療剤に用いられる抗体と競合的に結合す る抗体のスクリーニング
本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗体は、 Nectin- 2に対して競合的 に結合するかどうかを測定する測定法によってスクリーユングすることにより得 ることができる。
スクリーニングに用いられる「Nectin - 2」とは、 配列番号： 1で表されるァミノ 酸配列 （以下、 Nectin- 2ひと略記する） または配列番号： 3で表'されるアミノ酸 配列 （以下、 Nectin-2 Sと略記する） （以下、 両者を併せて Nectin-2または本発明 に用いら.れるタンパク質と称することもある） である。 ヒトゃ温血動物の細胞も しくは組織に由来するタンパク質であってもよく、 組換えタンパク質であっても よい。 また、 配列番号 1または配列番号 3で表されるァミノ酸配列の部分配列で 表されるぺプチドであってもよく、 例えば、 配列番号： 1 (Nectin- 2 α )また 配 列番号： 3 (Nectin - 2 δ )で表されるアミノ酸配列の、 1 - 350番目 （細胞外領域） の ァミノ酸配列で表されるぺプチド、 配列番号： 1 (Nectin - 2 α )または配列番号：
54 3 (Nectin- 2 δ )で表きれるアミノ酸配列の 47 - 142番目 （第 1の IG様ドメイン）また は 175- 240番目 （第 2の IG様ドメイン） のアミノ酸配列で表されるペプチドなどを 用いることができる。 さらに、 Nectin- 2には、 C末端のカルボキシル基がエステ ル化またはアミ ド化したもの、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） の ァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したグ ルタミン残基がピログルタミン酸ィ匕したもの、 分子内のアミノ酸側鎖上の置換基 が適当な保護基で保護されているもの、 .あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ぺプ チドなどの複合ペプチドなども含まれ生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有 機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などの塩の形態をとつていてもよい。
ここで、 「競合的に結合する抗体」とは、 本発明に用いられる抗体のいずれかを 過剰量添加する'ことにより Nectin - 2に対する結合が競合的に阻害される抗体を指 している。 具体的には、 被試験抗体を Nectin - 2に対する結合試験に供したとき、 該被試 抗体に対して本発明に用いられる抗体のいずれかを 5 0倍モル量を添加 した場合に、 該試験抗体の Nectin- 2に対する結合が 5 0 %以上阻害される抗体を いう。
ここで、 本発明に用いられる抗体には、 キメラ抗体 、 ヒト化抗体、 ヒ ト抗体 を含む。 「キメラ抗体」 とは、異種抗体由来の可変領域とヒト抗体定常領域とを有 する抗体を意味する（例えば、欧州特許公開公報 E P 0 1 2 5 0 2 3等参照)。「ヒ ト化抗体」 とはマウス等のヒトにとって異種の抗体 を改変して、 H鎖と L鎖の 相補性決定部以外の一次構造をヒトの抗体 の対応する一次構造で置き換えた抗 体 を言う。 「ヒ ト抗体」 とは、 ヒトの抗体遺伝子を導入したトランスジェユック 動物を用いて作製したモノクローナル抗体 （欧州特許公開公報 E P 0 5 4 6 0 7 3参照） およ'ぴヒ ト抗体遺伝子をパクテリオファージ、 大腸菌、 酵母、 動物細胞 等の細胞表面やリボソーム上に提示させたライプラリー、 いわゆる抗体デイスプ レー技術を用いて作製したモノクローナル抗体 （Nature Biotechnology 23， 1105 (2005) )および Nectin - 2に対する抗体を産生するヒ ト B細胞かち細胞融合法ゃフ ァージディスプレー法等の技術を用いて単離されたモノクローナル抗体を意味す る。 本発明に用いられる抗体は、 好ましくは抗体の定常領域がヒ ト抗体、 よ'り好 ましくはヒト I g G、 さらに好ましくはヒト I g G l サブクラスに属するモノク ローナル抗体である。
55 ( 8 ) 本発明の乳癌の予防'治療剤
上記.した本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競合的に Nectin-2に結合する抗体を含有する医薬は、 乳癌の予防 ·治療剤、 抗体の Fc領 域を介した生体防御機構を利用する乳癌の予防または治療剤、 抗体依存性の乳癌 細胞傷害剤などとして使用することができる。抗体の Fc領域を介した生体防御機 構を利用する乳癌細胞障害方法としては、 生体のエフェクター細胞による抗体依 存个生細胞障害活性（Antibody- Dependent Cellular Cytotoxicity； ADCC)や補体依 存性細胞障害活性（Complement- Dependent Cytotoxicity； CDC)が挙げられるが、 好ましくは ADCCが用いられる。
本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗 体を含有する医薬は低毒性であり、 そのまま液剤として、 または適当な剤型の医 薬糸且成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的 （例、 血管内投与、 皮下投与など） に投与することができる。
本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗 体は、 それ自体を投与しても良いし、 または適当な医薬組成物として投与しても 良い。 投与に用いられる医薬組成物としては、 本発明に用いられる抗体およびそ の塩と薬理学的に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであつ ても良い。 このような医薬組成物は、 経口または非経口投与に適する剤形として 提供される。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤等が用いられ、 注 射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤等の剤形 を包含しても'良い。 このような注射剤は、 公知の方法に従って調製できる。 注射 剤の調製方法としては、 例えば、 上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に 用いられる無菌の水性液、 または油性液に溶解、 懸濁または乳化することによつ て調製できる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその 他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例、 エタノール）、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコーノレ、 ポリエチレン グリコール）、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 8 0、 H C O— 5 0 ^polyoxyethylene (50mol) adduct of hydrogenated castor oil) J 等と併用し
56 てもよレ、。 油性液と Lては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が用いられ、 溶解補助剤 として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等を併用してもよい。 調製された 注射液は、 適当なアンプルに充填されることが好ましい。 直腸投与に用いられる 坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製 されても良い。
経口投与'のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖 衣錠、 フィルムコーティング錠を含む）、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフ トカプセル剤を含む）、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等が挙げられる。 このような組 成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用いられる担体、 希 釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 例 えば、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬 位の剤形に調製されることが好都合である。 このような投薬単位の剤形 としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル）、 坐剤が挙げら れる。 本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競合的に結合す る抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤で は 5〜100mg、その他の剤形では 10〜250mgの上記抗体が含有されていることが好 ましい。
本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競合的に結合する抗 体を含有する上記予防 ·治療剤、調節剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 成人の乳癌の治療.予防のために 使用する場合には、' 本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競 合的に結合する抗体を 1回量として、 通常 0. 01^20mg/kg体重程度、 好ましくは 0. l〜10mg/kg体重程度、 さらに好ましくは 0. l〜5mg/kg体重程度を、 1 日 1〜5 回程度、好ましくは 1日 1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重 、場合には、 その症状に応じて増量してもよい。
本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競合的に結合する ' 抗 体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。 上記投与 に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担
57 体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる糸且成物は、 経口または非 経口投与 （例、 血管内注射、 皮下注射など） に適する剤形として提供される。 なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。
さらに、 本発明に用いられる抗体または本発明に用いられる抗体と競合的に結 合する抗体は、 他の薬剤、 例えばアルキル化剤 （例、 サイクロフォスフアミド、 ィフォスフアミ ド等）、代謝拮抗剤 (例、 メソトレキセ一ト、 5—フルォロゥラシ ル、 ゲンシタビン等）、 杭癌性抗生物質 (例、 マイトマイシン、 アドリアマイシン 等）、植物由来抗癌剤 (例、 ビンクリスチン、 ビンデシン、 パクリタキセル、 ドセ タキセル等）、 ホルモン療法剤 (例、 タモキシフェン、 ァナストロゾノレ、 レトロゾ ル等）、 白金製剤 （例、 シスブラチン、 カルボブラチン等）、 分子標的剤 （例、 ハ 一セプチン、 ゲフイチニブ、 イマチニブ等）、 ェトポシド、 ィリノテカンなどと併 用してもよい。 本発明に用いられる抗体および上記薬剤は、 同時または異なった 時間に、 患者に投与すればよい。
(9) 本発明は、 更に以下の発明を包含する。
すなわち、 Ne c l— 1 044— 4 (FERM B P— 1 0805) 、 N e c 8- 3 5 1 7- 1 1 (FERM B P— 1 0 806 ) または N e c 8— 3 7ひ 4 - 7 (FERM B P— 1 0 80 7) で表示されるハイプリ ドーマ細胞、 Ne c 1 - 1 044-4 (F ERM B P— 1 08 0 5) 、 Ne c 8— 35 1 7— 1 1 (FERM B P— 1 0 8 0 6) または N e c 8 _ 3 704— 7 (FERM B P— 1 0807) で表されるハイプリ ドーマ細胞から産生されるモノクローナル 抗体、 Ne c l— 1 044— 4 (FERM B P— 1 08 0 5) 、 Ne c 8— 3 5 1 7- 1 1 (F ERM B P— 1 08 06) または N e c 8 -'3 704- 7 ( FERM B P— 1 080 7) で表示されるハイプリ ドーマ細胞から産生される モノクロ.ーナル抗体と競合的に結合するモノクローナル抗体、 及びこれらのモノ ク口ーナル抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤にかかる発明である。 かかる発明は、 前記 （6) 〜 （8) に記載された実施態様と同様に実施するこ とができる。 ' ハイプリドーマ細胞 N e c 一 1 044— 4は 200 7年 4月 3日から茨城県
58 つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566)の独立行政法 人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号 F ERM BP— 10 805として寄託されている。
ハイプリ ドーマ細胞 Ne c 8— 351 7— 1 1は 2007年 4月 3日から茨城 県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566)の独立行政 法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号 FERM BP— 1 0806として寄託されている。
ハイプリ ドーマ細胞 N e c 8-3704— 7は 2007年 4月 3日から茨城県 つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 856.6) の独立行政法 人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号 FERM BP— 10 807として寄託されている。 本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による田各号めるレヽは当 分里 fにお る 慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学異性 体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA デォキシリボ核酸
c DNA 相補的デォキシリボ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C シトシン
RNA リボ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸
d AT P デォキシアデノシン三リン酸
d TT P デォキシチミジン三リン酸
d GT P デォキシグアノシン三リン酸
d CT P デォキシシチジン三リン酸
AT P アデノシン三リン酸
EDTA. エチレンジァミン四酢酸
59 SD S ： ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y ： グリシン
A 1 a ： ァラニン
V a 1 ：バリン
L e u ： ロイシン
I 1 e ： ィソロイシン
S e r ：セリン .
T h r ： スレオニン
C y s ： システィン
Me t ：.メチォニン
G 1 u ： グノレタミン酸
As ： ァスパラギン酸
L y s ： リジン
A r g ： ァノレギニン
H i s ： ヒスチジン
P h e ： フエ-ルァラニン
T y r ： チロシン
T r p ： トリブトファン
P r o ： プロリン
A s n ： ァスパラギン
G 1 n ： グルタミン
p G 1 u ： ピログノレタミン酸
S e c ：セレノシスアイン (.selenocysteine) 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
Nectin-2 αのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕 ' 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を有する Nectin- 2 をコードする DNAの塩 基配列を示す。
60 〔配列番号： 3〕
Nectin-2 δのアミノ酸配列を示す。 . 〔配列番号： 4〕
配列番号： 3で表されるァミノ酸配列を有する Nectin- 2 δをコードする DNAの塩 基配列を示す。
'〔配列番号： 5〕
Nectin- 3のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 6〕
配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を有する Nectin- 3をコードする DNAの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 7〕
参考例 1および参考例 2で用いられたァンチセンスオリゴヌクレオチド 1の塩基 配列を示す。
〔配列番号： 8〕
参考例 1および参考例 2で用いられたコント口ールォリゴヌクレオチド 1の塩基 配列を示す。
〔配列番号： 9〕
参考例 2で用いられたプライマー 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 0〕
参考例 2で用いられたプライマー 2の塩基配歹 Uを示す。
〔配列番号： 1 1〕
参考例 2で用いられた TaqManプローブ 1の塩基配列を示す。
〔配列番号：' 1 2〕 . '
参考例 2で用いられたプライマー 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 3〕
参考例 2で用いられたプライマー 4の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 4〕
参考例 2で用いられた TaqManプローブ 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 5〕
参考例 3および参考例 4で用いられたプライマー 5の塩基配列を示す。
61 〔配列番号： 16〕
参考例 3で用いられたプライマー 6の塩基配列を示す。 '
〔配列番号： 17〕
参考例 4で用いられたプライマー 7の塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
参考例 5で用いられたプライマー 8の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 9〕
参考例 5、 参考例 6および参考例 7で用いた s i RNA- 1の塩基配列を示す。 〔配列番号： 20〕
参考例 5、 参考例 6およぴ参考例 7で用いた s i RNA- 1の塩基配列を示す。 〔配列番号： 21〕
参考例 5、 参考例 6および参考例 7で用いた s i RNA- 2の塩基配列を示す。 〔配列番号： 22〕
参考例 5、 参考例 6およぴ参考例 7で用いた s i RNA- 2の塩基配列を示す。 〔配列番号： 23〕
参考例 5、 参考例 6および参考例 7で用いた s i RNA- 3の塩基配列を示す。 〔配列番号： 24〕
参考例 5、 参考例 6および参考例 7で用いた s i RNA- 3の塩基配列を示す。 〔配列番号： 25〕
参考例 5、 参考例 6および参考例 7で用いた s i RNA- 4の塩基配列を示す。 〔配列番号： 26〕
参考例 5、 参考例 6および参考例 7で用いた s i RNA- 4の塩基配列を示す。 〔配列番号： 27)
参考例 5、 参考例 6および参考例 7で用いた s i RNA- 5の塩基配列を示す。 〔配列番号： 28〕
参考例 5、 参考例 6および参考例 Ίで用いた s i RNA- 5の塩基配列を示す。 〔配列番号： 29〕
参考例 12で用いられたプライマー 33の塩基配列を示す。 ' 〔配列番号： 30〕
参考例 12で用いられたプライマー 34の塩基配列を示す。
62 〔配列番号： 31〕
Nectin- 2ED- FLAGタンパク質のァミノ酸配列を示す。 ' 〔配列番号： 32〕
配列番号： 3 1で表される Nectin - 2ED- FLAGタンパク質のァミノ酸配列をコード する DNAの塩基配列を示す。 .
〔配列番号： 33〕
参考例 15で用いられたプライマー 33の塩基配列を示す。
〔配列番号： 34〕
参考例 1 5で用いられたプライマー 34の塩基配列を示す。
〔配列番号： 35〕
参考例 1 5で用いられたプライマー 35の塩基配列を示す。
〔配列番号： 36〕
参考例 15で用いられたプライマー 36の塩基配列を示す。
〔配列番号： 37〕
Ne c t i n— 2 ED— hF cタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 38〕
配列番号： 37で表される Ne c t i n— 2 ED— hF cタンパク質のアミノ酸 配列をコードする D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 39〕
参考例 17で用いられたぺプチド 1のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 40〕
参考例 17で用いられたぺプチド 2のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 41〕 '
参考例 17で用いられたぺプチド 3のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 42〕
参考例 18、 およぴ参考例 1 9で用いられたプライマー 42の塩基配列を示す。
〔配列番号： 43〕
参考例 18、 およぴ参考例 1 9で用いられたプライマー 43の塩基配列を示す。 '〔配列番号： 44〕
参考例 18、 およぴ参考例 19で用いられた T a q M a nプローブ 3の塩基配列
63 を示す。 ·
〔配列番号： 45〕 . 参考例 21で用いられたプライマー 45の塩基配列を示す。
〔配列番号： 46〕
参考例 21で用いられたプライマー 46の塩基配列を示す。 +
•〔配列番号： 47〕
参考例 21で用いられたプライマー 47'の塩基配列を示す。
〔配列番号： 48〕
参考例 21で用いられたプライマー 48の塩基配列を示す。
〔配列番号： 49〕 .
Nectin- 3ED - hFcタンパク質のァミノ酸配列を示す。
〔'配列番号： 50〕
配列番号： 49で表される Nectin-3ED - hFcタンパク質のアミノ酸配列をコードす る DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 51〕
Nectin- 3ED-mFcタンパク質のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 52〕
配列番号： 51で表される Nectin - 3ED - mFcタンパク質のアミノ酸配列をコードす る DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 53〕
参考例 25で用いられた FLAGタンパク質（FLAG - FSALNOT)のァミノ酸配列をコー ドする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号 : 54〕
参考例 25で用いられた FLAGタンパク質（FLAG- RSALNOT)のァミノ酸配列をコー ドする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 55〕
参考例 25で用いられたプライマー 55の塩基配列を示す。
〔配列番号： 56〕 ' 参考例 25で用いられたプライマー 56の塩基配列を示す。
〔配列番号： 57〕
64 Nectin- 3ED- FLAGタンパク質のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 58〕 . Nectin - 3ED - FLAGタンパク質のアミノ酸配列をコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 59〕
参考例 29で用いられたプライマー 59の塩基配列を示す。'
〔配列番号： 60〕
参考例 29で用いられたプライマー 60の塩基配列を示す。
〔配列番号： 6 1〕
Nectin - 1タンパク質のァミノ酸配列をコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 62〕
Nectin- 1タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 63〕
参考例 29で用いられたプライマー 63の塩基配列を示す。
〔配列番号： 64〕
参考例 29で用いられたプライマー 64の塩基配列を示す。
〔配列番号： 65〕
参考例 29で用いられたプライマー 65の塩基配列を示す。
〔配列番号： 66〕
参考例 29で用いられたプライマー 66の塩基配列を示す。
〔配列番号： 67〕
Nectin- 4タンパク質のァミノ酸配列をコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 68〕
Nectin- 4タンパク質のアミノ酸配列を示す。 '
〔配列番号： 69〕
参考例 2.9で用いられたプライマー 69の塩基配列を示す。
〔配列番号： 70〕
参考例 29で用いられたプライマー Ί 0の塩基配列を示す。
〔配列番号： 71〕 ' Necl-5タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 72〕
65 Necl-5タンパク質のァミノ酸配列をコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 73〕 ' 参考例 30で用いられたプライマー 73の塩基配列を示す。
〔配列番号： 74〕
参考例 30で用いられたプライマー 74の塩基配列を示す。 +
'〔配列番号： 75〕
参考例 30で用いられたプライマー Ί 5の塩基配列を示す。
〔配列番号： 76〕
参考例 30で用いられたプライマー 76の塩基配列を示す。
〔配列番号： 77〕
参考例 30で甩いられたプライマー 77の塩基配列を示す。
〔配列番号： 78〕
Nectin-2の Igl ドメインを欠損させたタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 79〕
Nectin - 2 の Igl ドメインを欠損させたタンパク質のアミノ酸配列をコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 80〕
Nectin-2の Ig2 ドメインを欠損させたタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8 1〕
Nectin - 2 の ¾2 ドメインを欠損させたタンパク質のアミノ酸配列をコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 82〕
参考例 31で用いられたプライマー 82の塩基配列を示す。
〔配列番号： 83〕
参考例 3.1で用いられたプライマー 83の塩基配列を示す。
〔配列番号： 84〕
参考例 31で用いられたプライマー 84の塩基配列を示す。
〔配列番号： 85〕 ' 参考例 31で用いられたプライマー 85の塩基配列を示す。
〔配列番号： 86〕
66 力二クイザル Nectin- 2タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 87〕 ' 力二クイザル Nectin- 2タンパク質のアミノ酸配列をコードする DNAの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 88〕 '
参考例 32で用いられたプライマー 88の塩基配列を示す。
〔配列番号： 89〕
参考例 32で用いられたプライマー 89の塩基配列を示す。
〔配列番号： 90〕
参考例 33で用いられたプライマー 90の塩基配列を示す。
〔配列番号： 91〕
参考例 33で用いられたプライマー 91の塩基配列を示す。
〔配列番号： 92〕
参考例 33で用いられたプライマ一 9· 2の塩基配列を示す。 '
〔配列番号： 93〕
参考例 33で用いられたプライマー 93の塩基配列を示す。
〔配列番号： 94〕
参考例 33で用いられたプライマー 94の塩基配列を示す。
〔配列番号： 95〕
参考例 33で用いられたプライマー 95の塩 ¾配列を示す。
〔配列番号： 96〕
参考例 33で用いられたプライマー 96の塩基配列を示す。
〔配列番号： 97〕
参考例 33で用いられたプライマー 97の塩基配列を示す。
〔配列番号： 98〕
参考例 34で用いられたプライマー Q37Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 99〕
参考例 34で用いられたプライマー Q37A Rの塩基配列を示す。 ' 〔配列番号： 100〕
参考例 34で用いられたプラィマー P40Gの塩基配列を示す。
67 〔配列番号： 101〕
参考例.34で用いられたプライマー P40G Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 102〕
参考例 34で用いられたプライマー Q45Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 103〕 ' 参考例 34で用いられたプライマー Q45A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 104〕
参考例 34で用いられたプライマー H55Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 105〕
参考例 34で用いられたプライマー H55A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 106〕
参考例 34で用いられたプライマー V60Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 107〕
参考例 34で用いられたプライマー V60A Rの塩基配列を示す。 〔配列番号： 108〕
参考例 34で用いられたプライマー Y64Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 109〕
参考例 34で用いられたプライマー Y64A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 10〕
参考例 34で用いられたプライマー Q71Aの塩 配列を示す。
〔配列番号： 1 1 1〕
参考例 34で用いられたプライマ一 Q71A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号：' 1 1 2〕
参考例 34で用いられたプライマー A75Gの塩基配列を示す。 〔配列番号： 11 3〕 ' 参考例 34で用いられたプライマー A75G Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 114〕
参考例 34で用いられたプライマー P76Gの塩基配列を示す。
'〔配列番号： 1 15〕
参考例 34で用いられたプライマー P76G Rの塩基配列を示す。
68 〔配列番号： 1 1 6〕
参考例 ·34で用いられたプライマー A77Gの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 1 7〕
参考例 34で用いられたプライマー A77G Rの塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 1 8〕
参考例 34で用いられたプライマー Ν78Αの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 1 9〕
参考例 34で用いられたプライマー Ν78Α Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 120〕
参考例 34で用いられたプライマー Η79Αの塩基配列を示す。
〔配列番号： 121〕
参考例 34で用いられたプライマー Η79Α Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 122〕 ,
参考例 34で用いられたプライマー Q80Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 23〕
参考例 34で用いられたプライマー Q80A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 124〕
参考例 34で用いられたプライマー N81Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 125〕
参考例 34で用いられたプライマー N81A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 126〕
参考例 34で用いられたプライマー Κ88Αの塩基配列を示す。
〔配列番号'：' 127〕
参考例 34で用いられたプライマー Κ88Α Rの塩基配列を示す。 〔配列番号： 128〕
参考例 34で用いられたプライマー S95Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 129〕
参考例 34で用いられたプライマー S95A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 130〕
参考例 34で用いられたプライマー K109Aの塩基配列を示す。
69 〔配列番号： 131〕 .
参考例 34で用いられたプライマー K109A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 32〕
参考例 34で用いられたプライマー El 17Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 133〕 ' 参考例 34で用いられたプライマー E117A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 134〕
参考例 34で用いられたプライマ一 D122Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 135〕
参考例 34で用いられたプライマ一 D122A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 136〕
参考例 34で用いられたプライマー H128Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 137〕
参考例 34で用いられたプライマー H128A Rの塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 38〕
参考例 34で用いられたプライマー N137Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 139〕
参考例 34で用いられたプライマー N137A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 140〕
参考例 34で用いられたプライマー F145Aの塩碁配列を示す。
〔配列番号： 141〕
参考例 34で用いられたプライマー F145A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号：' 142〕
参考例 34で用いられたプライマー K147Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 143〕
参考例 34で用いられたプライマー K147A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 144〕
参考例 34で用いられたプライマー V150Aの塩基配列を示す。
'〔配列番号： 145〕
参考例 34で用いられたプライマー V150A Rの塩基配列を示す。
70 〔配列番号： 146〕
参考例 34で用いられたプライマー M153Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 147〕
参考例 34で用いられたプライマー M153A Rの塩基配列を示す。 〔配列番号： 148〕
参考例 34で用いられたプライマー T154Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 149〕
参考例 34で用いられたプライマー T154A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 150〕
参考例 35で用いられたプライマー Q165Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 151〕
参考例 35で用いられたプライマー Q165A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 152〕
参考例 35で用いられたプライマー K170Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 53〕
参考例 35で用いられたプライマー K170A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 154〕
参考例 35で用いられたプライマー F173Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 155〕
参考例 35で用いられたプライマー F173A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 156〕
参考例 35で用いられたプライマー P177Gの塩基配列を示す。
〔配列番号'： 157〕
参考例 35で用いられたプライマー P177G Rの塩基配列を示す。 〔配列番号： 158〕
参考例 35で用いられたプライマー I184Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 59〕
参考例 35で用いられたプライマー I184A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 160〕
参考例 35で用いられたプライマー K186Aの塩基配列を示す。
71 〔配列番号： 16 1〕
参考例'.35で用いられたプライマー K186A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 162〕
参考例 35で用いられたプライマー L197Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 163〕
参考例 35で用いられたプライマー L197A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 164〕
参考例 35で用いられたプライマー W202Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 165〕
参考例 35で用いられたプライマー W202A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1'66〕
参考例 35で用いられたプライマー E206Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 167〕
参考例 35で用いられたプライマー E206A Rの塩基配列を示す。 〔配列番号： 168〕
参考例 35で用いられたプライマー T212Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 169〕
参考例 35で用いられたプライマー T212A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 170〕
参考例 35で用いられたプライマー T235Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 71〕
参考例 35で用いられたプライマー T235A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 72〕
参考例 35で用いられたプライマー K239Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 73〕
参考例 3'5で用いられたプライマー K239A Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 174〕
参考例 35で用いられたプライマー A249Gの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 75〕
参考例 35で用いられたプライマ一 A249G Rの塩基配列を示す。
72 〔配列番号： 176〕
実施例.19で用いられたプライマー 1 76の塩基配列を示す,
〔配列番号： 1 77〕
実施例 19で用いられたプライマー 177の塩基配列を示す , 〔配列番号： 1 78〕
実施例 19で用いられたプライマー 1 78の塩基配列を示す,
〔配列番号： 1 79〕
実施例 1 9で用いられたプライマー 179の塩基配列を示す
〔配列番号： 180〕
実施例 1 9で用いられたプライマー 180の塩基配列を示す,
〔配列番号： 181〕
実施例 1 9で用いられたプライマー 18 1の塩基配列を示す,
〔配列番号： 182〕
実施例 19で用いられたプライマー 182の塩基配列を示す, 〔配列番号： 183〕
実施例 19で用いられたプライマー 183の塩基配列を示す,
〔配列番号： 184〕
Necl-2443の重鎖の C D R 1 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 185〕
Necl-244-3の重鎖の C D R 2 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 186〕
Necl-244-3の重鎖の C D R 3 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号：' 187〕
Necl-244-3の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 188〕
Necl-244-3の重鎖の C D R 1 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 189〕
Necl- 244- 3の重鎖の C D R 2 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 190〕
Necl- 244- 3の重鎖の CDR 3 (塩基配列） を示す。
73 〔配列番号： 191〕
Necl-244-3の重鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 92〕
Necl-244-3の軽鎖の C D R 1 (ァミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 1 93〕
Necl-244-3の軽鎖の C D R 2 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 194〕
Necl-244-3の軽鎖の C DR 3 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 195〕
Necl-244-3の軽鎖可変領域のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 196〕
Necl- 244- 3の軽鎖の CDR 1 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 1 97〕
Necl-244-3の軽鎖の C D R 2 (塩基配列） を示す。 〔配列番号： 1 98〕
Necl- 244- 3の軽鎖の C D R 3 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 1 99〕
Necl-244-3の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号： 200〕
Necl- 530 1の重鎖の C D R 1 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 201〕
Necl- 530-1の重鎖の C DR 2 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 202〕
Necl-530-lの重鎖の C D R 3 (ァミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 203〕
Necl-530-lの重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 204〕
Necl- 530- 1の重鎖の CDR 1 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 205〕
Necl- 530- 1の重鎖の CDR 2 (塩基配列） を示す。
74 〔配列番号： 20 6〕
Necl- 530- 1の重鎖の CDR 3 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 207〕
Necl- 530- 1の重鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号： 208〕
Necl- 530-1の軽鎖の C D R 1 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 20 9〕
Necl- 530-1の軽鎖の C D R 2 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 2 1 0〕
Necl- 530-1の軽鎖の C D R 3 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 2 1 1〕
Necl-530-lの軽鎖可変領域のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2 1 2〕
Necl-530-lの軽鎖の C D R 1 (塩基配列） を示す。 〔配列番号： 2 1 3〕
Necl- 530- 1の軽鎖の CDR 2 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 2 14〕
Necl- 530- 1の軽鎖の CDR 3 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 2 1 5〕
Necl- 530- 1の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 1 6〕
Necl-554-lの重鎖の C D R 1 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号 : 2 1 7〕
Necl - 554-1の重鎖の C D R 2 (ァミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 2 1 8〕
Necl - 554-1の重鎖の C D R 3 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 2 1 9〕
Necl-554-lの重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 220〕
Necl-554- 1の重鎖の CDR 1 (塩基配列） を示す。
75 ^ 〔配列番号： 221〕
Necl- 554- 1の重鎖の CDR 2 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 222〕
Necl- 554-1の重鎖の CDR 3 (塩基配列） を示す。 〔配列番号： 223〕
Necl-554-lの重鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号： 224〕
Necl-554-lの軽鎖の C D R 1 (ァミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 225〕
Necl - 554-1の軽鎖の C D R 2 (ァミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 226〕
Necl - 554- 1の軽鎖の C D R 3 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 227〕
Necl- 554- 1の軽鎖可変領域のァミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 228〕
Necl- 554- 1の軽鎖の CDR 1 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 229〕
Necl- 554- 1の軽鎖の CDR 2 (塩基配列） を示す。 〔配列番号： 230〕
Necl- 554- 1の軽鎖の CDR 3 (塩基配列） を示す。 〔配列番号： 231〕
Necl- 554- 1の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号：' 232〕
Necl - 803 - 2の重鎖の C D R 1 (ァミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 233〕
Necl - 803 - 2の重鎖の G D R 2 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 234〕
Necl- 803- 2の重鎖の CD R 3 (アミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 235〕
Necl - 803 - 2の重鎖可変領域のァミノ酸配列を示す。
76 〔配列番号： 236〕
Necl-803-2の重鎖の C D R 1 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 237〕
Necl-803-2の重鎖の C D R 2 (塩基配列） を示す。 〔配列番号： 238〕
Necl- 803- 2の重鎖の C D R 3 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 239〕
Necl-803-2の重鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号： 240〕
Necl-803-2の軽鎖の C D R 1 (ァミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 241〕
Necl- 803 - 2の軽鎖の CDR 2 (アミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 242〕
Necl-803-2の軽鎖の C D R 3 (ァミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 243〕
Necl-803-2の軽鎖可変領域のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 244〕
Necl- 803- 2の軽鎖の CDR 1 (塩基配列） を示す。 . 〔配列番号： 245〕
Necl- 803- 2の軽鎖の CDR 2 (塩基配列） を示す。 〔配列番号： 246〕
Necl- 803- 2の軽鎖の CDR 3 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 247〕
Necl-803-2の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号： 248〕
Necl-834-lの重鎖の C DR 1 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 249〕
Necl- 834- 1の重鎖の C D R 2 (ァミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 250〕
Necl - 834-1の重鎖の C D R 3 (ァミノ酸配列） を示す。
77 〔配列番号： 25 1〕
Necl-834-lの重鎖可変領域のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 252〕
Necl-834-lの重鎖の C D R 1 (塩基配列） を示す。 〔配列番号： 253〕
Necl- 834- 1の重鎖の CDR 2 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 254〕
Necl- 834- 1の重鎖の CDR 3 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 255〕
Necl- 834- 1の重鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号： 2'56〕
Necl-834-lの軽鎖の C D R 1 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 257〕
Necl- 834- 1の軽鎖の C D R 2 (ァミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 258〕
Necl- 834- 1の軽鎖の C D R 3. (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 259〕
Necl- 834-1の軽鎖可変領域のァミノ酸配列を示す。 .
〔配列番号： 260〕
Necl- 834- 1の軽鎖の C D R 1 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 26 1〕
Necl- 834- 1の軽鎖の CDR 2 (塩基配列） を示す。
〔配列番号：' 262〕
Necl-834-lの軽鎖の C D R 3 (塩基配列） を示す。 〔配列番号： 263〕
Necl- 834- 1の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号： 264〕
Necl-845-2の重鎖の C D R 1 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 265〕
Necl- 845 - 2の重鎖の C D R 2 (アミノ酸配列） を示す。
78 〔配列番号： 266〕
Necl- 845- 2の重鎖の C D R 3 (アミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 267〕
Necl-845-2の重鎖可変領域のァミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 268〕
Necl- 845-2の重鎖の CDR 1 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 269〕
Necl- 845- 2の重鎖の C D R 2 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 270〕
Necl- 845- 2の重鎖の CDR 3 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 2'71〕
Necl-845-2の重鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号： 272〕
Necl-845-2の軽鎖の C D R 1 (ァミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 273〕
Necl-845-2の軽鎖の C D R 2 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 274〕
Necl-845-2の軽鎖の C D R 3 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 275〕
Necl-845-2の軽鎖可変領域のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 276〕
Necl- 845- 2の軽鎖の C D R 1 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 277〕
Necl- 845- 2の軽鎖の CDR 2 (塩基配列） を示す。 〔配列番号： 278〕
Necl- 845- 2の軽鎖の CDR 3 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 279〕
Necl-845-2の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号： 280〕
Necl-903-lの重鎖の C D R 1 (ァミノ酸配列） を示す。
79 〔配列番号： 281〕
Necl-903-lの重鎖の C D R 2 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 282〕
Necl-903-lの重鎖の C D R 3 (ァミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 283〕
Necl-903-lの重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 284〕
Necl-903-lの重鎖の C D R 1 (塩基配列） を示す。 〔配列番号： 285〕
Necl- 903- 1の重鎖の CDR 2 (塩基配列） を示す。 〔配列番号： 2'86〕
Necl- 903- 1の重鎖の CDR 3 (塩基配列） を示す。 〔配列番号： 287〕
Necl- 903- 1の重鎖可変領域の塩基配列を示す。
〔配列番号： 288〕
Necl - 903-1の軽鎖の C D R 1. (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 289〕
Necl- 903-1の軽鎖の C D R 2 (ァミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 290〕
Necl- 903-1の軽鎖の C D R 3 (ァミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 29 1〕
Necl- 903- 1の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 292〕
Necl- 903- 1の軽鎖の CDR 1 (塩基配列） を示す。 〔配列番号： 293〕
Necl-903-lの軽鎖の C D R 2 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 294〕
Necl- 3- 1の軽鎖の CDR 3 (塩基配列） を示す。 '〔配列番号： 295〕
Necl- 903- 1の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
80 〔配列番号： 296〕
Nec8- 4116- 8の重鎖の C D R 1 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 297〕
Nec8- 4116 - 8の重鎖の C D R 2 (ァミノ酸配列） を示す。 〔配列番号： 298〕
Nec8 - 4116 - 8の重鎖の C D R 3 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 299〕
Nec8- 4116-8の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 300〕
Nec8- 4116- 8の重鎖の CDR 1 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 301〕
Nec8- 4116- 8の重鎖の CDR 2 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 302〕
Nec8- 4116- 8の重鎖の CDR 3 (塩基配列） を示す.。 〔配列番号： 303〕
Nec8- 4116- 8の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 304〕
Nec8 - 4116 - 8の軽鎖の C D R 1 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 305〕
Nec8 - 4116- 8の軽鎖の CDR 2 (アミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 306〕
Nec8-4116-8の軽鎖の C D R 3 (ァミノ酸配列） を示す。
〔配列番号： 307〕
Nec8-4116-8の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 308〕
Nec8- 4116- 8の軽鎖の CDR 1 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 309〕
Nec8- 4116- 8の軽鎖の CDR 2 (塩基配列） を示す。
〔配列番号： 310〕
Nec8- 4116- 8の軽鎖の CDR 3 (塩基配列） を示す。
81 〔配列番号： 31 1〕
Nec8- 4116- 8の軽鎖可変領域のァミノ酸配列を示す。 ■
〔配列番号： 312〕
参考例 38で得られた抗体標品の H鎖の N末端ァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3 13〕 '
参考例 38で得られた抗体標品の L鎖の N末端アミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 314〕
配列番号： 312のアミノ酸配列と合致する germlineから予測されるシグナル配 列の N末端をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 315〕
配列番号： 31 3のアミノ酸配列と合致する germlineから予測されるシグナル配 列の N末端をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 316〕 ，
参考例 38で使用されたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 31 7〕
参考例 38で使用されたプライマーの塩基配列を示す。 後述の実施例 1で得られたハイブリ ドーマ細胞 N e e l— 803— 2は 200 5年 9月 16日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 - 8566)の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番 号 FERM B P— 1041 7として寄託されている。
後述の実施例 1で得られたハイブリ ドーマ細胞 N e c 1— 244— 3は 200 5年 10月 4日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 -8566)の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番 号 FERM B P— 10423として寄託されている。
後述の実施例 1で得られたハイブリ ドーマ細胞 N e c l_5'30— 1は 200 5年 10月 4日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 -8566)の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番 号 FERM B P— 10424として寄託されている。
後述の実施例 1で得られたハイプリ ドーマ細胞 N e c l— 903— :U 200
82 5年 10月 4日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 -8566)の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番 号 FERM B P— 10425として寄託されている。
後述の実施例 1で得られたハイブリ ドーマ細胞 N e e l— 520— 1は 200 5年 10月 4日カゝら茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 -8566 )の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一に寄託番 号 FERM B P— 10426として寄託されている。
後述の実施例 1で得られたハイプリ ドーマ細胞 N e e l— 845— 2は 200 5年 0月 4日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 -8566)の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番 号 FERM BP— 10427として寄託されている。
後述の実施例 1で得られたハイブリ ドーマ細胞 N e e l— 834— 1は 200 5年 10月 4日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 -8566)の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番 号 FERM B P— 10428として寄託されている。
後述の実施例 8で得られたハイブリ ドーマ細胞 N e e l— 554— 1ほ 200 6年 9月 20.日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 -8566)の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番 号 FERM B P— 10681として寄託されている。
後述の実施例 8で得られたハイブリ ドーマ細胞 N e e l— 769— 2は 200 6年 9月 20日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 -8566)の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番 号 FERM B P— 10682として寄託されている。
後述の実施例 8で得られたハイブリ ドーマ細胞 N e e l— 964— 1は 200 6年 9月.20日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 -8566 )の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番 号 FERM B P— 10683として寄託されている。
後述の実施例 8で得られたハイブリ ドーマ細胞 N e e l— 1 302— 2は 20 06年 9月 20日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 30 5 - 8566)の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託
83 番号 F E RM B P— 1 0 6 8 4として寄託されている。
後述の実施例 8で得られたハイブリ ドーマ細胞 N e c 8— 4 1 1 6— 8は 2 0 0 6年 9月 2 0日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 3 0 5 - 8 5 6 6 )の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託 番号 F E RM B P— 1 0 6 8 5として寄託されている。 . 実施例
以下において、 参考例および実施例により本発明をより具体的にするが、 この 発明はこれらに限定されるものではない。
参考例 1 Nectin- 2 αおよび Nectin- 2 δ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチ ドによるヒ ト大月暴癌細胞株 ΗΤ-29のアポトーシス誘導
Nectin-2 a遺伝子の翻訳領域もしくは Nectin- 2 δ遺伝子のィントロン領域に ハイプリダイズするァンチセンスオリゴヌクレオチド配列 （配列番号： 7 ) を設 計後、 phosphorothioate化オリゴヌクレオチドを合成し、 HPLC精製標品を得た（以 下、 アンチセンスオリゴヌクレオチド 1と略する）。 コントロールとしては、 配列 番号： 7で示される塩基配列のリバース配列を有するオリゴヌクレオチド （配列 番号： 8 ) を同様に phosphorothioate化し、 HPLC精製標品を得た （以下、 コン トロールオリゴヌクレオチド 1と略する）。
American Type Culture Collection (ATCC)より購入したヒ ト大腸癌細胞株 HT - 29 を、. 10%牛胎児血清（FBS) (JRH社） 含有 McCoy' s 5A培地 （Invitrogen社） 〔以 下、 M5培地と略することもある〕 で懸濁し、 1ゥエル当たり 1 X 104個の細胞密 度で 96穴平底組織培養プレート （Becton Dickinson社） に播種し、 5%炭酸ガス 気流中 37。Cでー晚培養した。 200 ngのアンチセンスオリゴヌクレオチド 1、 また は 200 ng のコン トロ ーノレオリ ゴヌクレオチド 1 を Lipof ectamine 2000 (Invitrogen社） 0. 5 μ Lと共に Opti- MEM I (Invitrogen社） 50 μ ίと混合し、 室温で 20分間放置した。 上述の ΗΤ- 29培養細胞の培養上清を予め Opti- MEM I 50 μ ΐ に培地交換しておき、 これに上記オリゴヌクレオチド混合液を全量添加して 5%炭酸ガス気流中 37°Cで 3時間培養を継続した後、再度 Μ5培地に培地交換じた。 更に 2日間培養を継続した後、 Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega社） を用いて添 付プロトコールに従い、 上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定
84 した。 その結果、 Nectin- 2ひ遺伝子および Nectin- 2 δ遺伝子のアンチセンスオリ ゴヌクレオチド 1 (配列番号： 7 ) はコント口ールォリゴヌクレオチド 1 (配列番 号： 8) に比べて約 1.9倍のアポトーシス誘導活性を示し、 統計学的に有意な差 (Ρ<0.05) を示した。 参考例 2 Nectin - 2ひ遺伝子および Nectin- 2 δ遺伝子のアンチセンスオリゴヌク レオチドによるヒ ト大腸癌細胞株 ΗΤ- 29の Nectin - 2α遺伝子および Nectin- 2 δ遺 伝子の mRNA発現量低下
参考例 1で用いたヒト大腸癌細胞株 HT-29を M5培地に懸濁し、 1ゥヱノレ当たり 6 X 104個の細胞密度で 24穴平底組織培養プレート （Becton Dickinson社） に播 種し、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cでー晚培養した後、参考例 1の方法に従ってアン チセンスオリゴヌクレオチド 1およびコントロールオリゴヌクレオチド 1をトラ ンスフヱクションした。 伹し細胞播種数に比例して全ての添加物量あるいは溶液 量を 6倍にスケールアップした。 これらの細胞を 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 24 時間培養した後、 RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN社） を用いてトータル RNA を抽出した。 約 400 ng のトータル RNA を錡型として、 TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosysteras x を用レヽ '添付プロトコーノレ！1こ 従い逆転写反応を行って cDNAを調製した。 Nectin - 2α遺伝子の発現量はトータノレ RNAにして 5 ngに相当する cDNAを鎵型とし、 TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems社） 7.5 μΐ, プライマー 1 (配列番号： 9) およびプライ マー 2 (配列番号： 1 0) を各 500 nM、 FAM標識した TaqManプローブ 1 (配列番 号： 1 1) を 100nMとなるように加え反応液量 15/iLとし、 定量的 PCRを行って 測定した。 PCR反応は、 50°C ♦ 2分、 95°C · 10分の後、 95°C · 15秒、 60。C · 1分 のサイクルを 40回繰り返した。 Nectin- 2 δ遺伝子の発現量はトータル RNAにして 5 ngに相当する cDNAを鎳型とし、 TaqMan Universal PCR Master Mix 7.5/ L、 プライマー 3 (配列番号： 1 2)およぴプライマー 4 (配列番号： 1 3)を各 500nM、 FAM標識した TaqManプローブ 2 (配列番号： 1 4) を 100 nMとなるように加え反 応液量 15 μ Lとし、 Nectin - 2 a遺伝子と同様に定量的 PCRを行つて測定した。 PCR は、 50°C · 2分、 95°C · 10分の後、 95°C · 15秒、 60°C · 1分のサイクルを 40回繰 り返した。 同量の踌型 cDNA 中に含まれる -ァクチン遺伝子の mRNA発現量を
85 TaqMan - act in Control Reagents (Applied Biosystems社) を用いて測定しこ れを内部標準とした。 · オリゴヌクレオチドをトランスフエクションしない場合には、 Nectin - 2 α遗伝 子、 および Nectin- 2 δ遺伝子の発現量はそれぞれ; 8 -ァクチン遺伝子発現量の 0. 15%、 0. 76%であった。 これに対しアンチセンスオリゴヌクレオチド 1 (配列番 号： 7 )投与群では Nectin- 2 α遺伝子おょぴ Nectin- 2 δ遺伝子の発現量はそれぞ れ iS -ァクチン遺伝子発現量の 0. 095%、 0. 45%と、 オリゴヌクレオチドをトランス フエクションしない場合と比べて統計学的に有意（P< 0. 01)な発現量低下が認め られた。 一方、 陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチド 1 (配列 番号： 8 )投与群では Nectin- 2 a遺伝子および Nectin- 2 δ遺伝子の発現量はそれ ぞれ β -ァクチン遺伝子発現量の 0· 18%、 0. 76%であり、 オリゴヌクレオチドをト ランスフエクションしない場合と同等であった。
これらの結果と参考例 1の結,果から、 Nectin - 2 α遺伝子および Nectin- 2 δ遺伝 子の発現量の低下によりヒト大腸癌細胞株 ΗΤ- 29のアポトーシスが誘発されたこ とが示唆された。 参考例 3 Nectin - 2 αをコードする cDNAのクローユングと塩基配列の決定 ヒト肺癌細胞株 A549の Marathon- Ready cDNA (BD Biosciences社）を铸型とし、 制限酵素 EcoRIの認識配列を付加したプライマー 5 (配列番号： 1 5 )、 および制 限酵素 EcoRVの認識配列を付加したプライマー 6 (配列番号： 1 6 ) を用いて PCR を行つた。該反応における反応液の組成は上記 cDNA 1 μ L、 Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE社） 1U、 プライマー 5 (配列番号： 1 5 )、 およぴプライ マー 6 (配列番号： 1 6 ) 各 l z M、 dNTPs 200 μ Μ, および 2xGC Buf f er I (TaKaRa Bio社） 10 /z Lの合計 20 μ Lとした。 PCRは、 94°C · 1分の後、 94°C · 5秒、 72°C · 4分のサイクルを 5回、 94°C · 5秒、 70°C · 4分のサイクルを 5回、 94°C · 5秒、 68。C · 4分のサイクルを 35回操り返した。 次に PCR Purification Kit (QIAGEN 社） にて該 PCR産物を精製した後、 制限酵素 EcoRIおよぴ EcoRVにて消化した。 pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen社）も同様に制限酵素 EcoRIおよび EcoRVにて処理し、 これらを PCR Purification Kitにて精製した。 両 DNA断片を DNA Ligation Kit ver. 2 (TaKaRa Bio社）を用いてライゲーシヨンした後、大腸菌 T0P10 (Invitrogen
86 社）に導入し、 アンピシリンを含む LB寒天培地中で選択培養した。 増殖した大腸 菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析した結果、 Neotin - 2 ひタンパク質 （配列番号： 1 ) をコードする cDNA配列 （配列番号： 2 ) を有する 動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin-2 を得た。 参考例 4 Nectin-2 δをコードする cDNAのクローニングと塩基配列の決定 ヒト肺癌細胞株 A549の Marathon - Ready cDNA (BD Biosciences社）を錄型とし、 制限酵素 EcoRIの認識配列を付加したプライマー 5 (配列番号： 1 5 )、 およぴ制 限酵素 EcoRVの認識配列を付加したプライマー 7 (配列番号： 1 7 ) を用いて PCR を行った。該反応における反応液の組成は上記 cDNA溶液 1 μ Lを铸型として使用 し、 Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE社） 1U、 プライマー 5 (配 列番号： 1 5 ) およぴプライマー 7 (配列番号： 1 7 ) 各 1 ^ Μ、 dNTPs 200 μ Μ、 およぴ 2xGC Buffer I (TaKaRa Bio社） 10 μ Lの合計 20 μ Lとした。 PCRは、 94°C · 1分の後、 94°C · 5秒、 72°C · 4分のサイクルを 5回、 94°C · 5秒、 70°C · 4分の サイクルを 5回、 94°C ' 5秒、 68°C · 4分のサイクルを 35回繰り返した。次に PCR Purification Kit (QIAGEN社） にて該 PCR産物を 50 μ Lの水にて溶出し、 これを 鎵型として PGR反応を行つた。該反応における反応液の組成は上記 PCR産物 1 L を鎵型として使用し、 Pfu Turbo Hotstart DNA PolyraeraselU, プライマー 5 (配 列番号： 1 5 )、 および制限酵素 EcoRVの認識配列を付加したプライマ一 8 (配列 番号： 1 8 ) を各 1 Μ、 dNTPsを 200 / Μ、 および 2xGC Buffer Iを 10 ^ L加え、 合計 20 μ Lの液量とした。 PCRは、 94°C · 1分の後、 94°C · 20秒、 60°C · 15秒、 72°C · 2分のサイクルを 25回繰り返し 。 次に PCR Purification Kitにて該 PCR 産物を精製し、制限酵素 EcoRI、および EcoRVにて消化した。 同様に PcDNA3. 1 (+) (Invitrogen社） も制限酵素 EcoRI、 および EcoRVにて消化した。 これらを PCR Purification Kitにて精製し、 両 DNA断片を DNA Ligation Kit ver. 2 (TaKaRa Bio 社） を用いてライゲーシヨンさせた後、 大腸菌 T0P10 (Invitrogen社）に導入し、 アンピシリンを含む LB寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コ口ニーから 回収した個々の遺伝子ク口一ンの配列を解析した結果、 Nectin-2 δタンパク食 (配 列番号： 3 ) をコードする cDNA配列 （配列番号： 4 ) を有する動物細胞用発現べ クタ一 pcDNA3. 1 (+) - Nectin - 2 δを得た。 '
87 参考例 5 Nectin-2 si RNAによるヒト大腸癌細胞株 HT - 29の細胞増殖抑制 '
Nectin - 2 α遺伝子、 もしくは Nectin-2 δ遺伝子 （以下、 これらを総称して Nectin-2遺伝子と称する） の mR Aに対する 5種類の siRNA (siRNA- 1、 siRNA - 2、 siRNA- 3、 siRNA- 4、および siRNA-5) を等量ずつ混合したもめを作製した（以下、 これを Nectin - 2-siR Aと称する）。 siRNA- 1、 siRNA - 2、 siRNA - 3、 siRNA - 4、 およ び siRNA-5は、 それぞれ 2種類の RNA断片 （siRNA- 1は配列番号： 1 9で表され る塩基配列を有する RNAと配列番号： 2 0で表される塩基配列を有する RNAとを、 siRNA- 2は配列番号： 2 1で表される塩基配列を有する RNAと配列番号： 2 2で 表される塩基配列を有する RNAとを、 siRNA - 3は配列番号： 2 3で表される塩基 配列を有する R と配列番号： 2 4で表される塩基配列を有する RNAとを、 siRNA-4 は配列番号： 2 5で表される塩基配列を有する R Aと配列番号： 2 6で表される 塩基配列を有する RNAとを、 siRNA - 5は配列番号： 2 7で表される塩基配列を有 する RNAと配列番号： 2 8で表される塩基配列を有する RNAとを） をハイブリダ ィズさせることにより作製した。 陰性コントロールとしては、 Dharmacon社より 購入した Non- specific Control IX (以下、 これを non-silencing dsRNAと称す る） を用いた。
具体的には、 American Type Culture Collection (ATCC) より購入したヒト大 腸癌細胞株 HT- 29を、 10%FBS ( JRH社） を含む M5A培地で懸濁し、 1枚あたり 5 x 105個の細胞密度で 10 cm組織培養シャーレ（Becton Dickinson社）に播種した。 これを 5%炭酸ガス気流中、 37°Cでー晚培養した後、 トリプシン - EDTA溶液を用い て細胞を剥離し、 遠心分離操作により回収した。 この HT- 29 細胞 1 X 106 個を Nectin- 2 - siRNA 150 pmolもしく ttn m-silencing dsRNA 150 pmolを含む Cell Line Nucleofector Kit V(Amaxa社）に付属の solution V lOO^Lに懸濁し、 Nucleof ector のプログラム T - 20にてトランスフエクシヨンし、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 24 時間培養を行った。 これらの細胞を 3， 000個/ゥエルで 96穴平底組織培養プレー トに再播種し、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 5日間培養した。各ゥヱルから培地を 除去後、プレートを- 80°Cで 5分間冷却し、次いで室温で 5分間放置し細胞を 壊 した。次に各ゥヱルに l%PicoGreen (Invitrogen社）および 1% IGEPAL-CA630 (ICN 社） を含む水溶液 100 μ 1を添加し室温 20分間放置した後、 Multilabel Counter
88 (Perkin Elmer ¾：) を用いて蛍光強度 （励起波長 485nm、 発光波長 535nm) を計 測し、 .細胞内 DNA 含量を測定した。 その結果、 Nectin- 2- siRNA 添加群は non-si lencing dsRNA添加群に比べて約 38%蛍光強度が低下し、 両者は統計学的 に有意な差 (Pく 0. 001)を示した。このことから、 Nectin - 2-siRNA添加により HT-29 細胞株の増殖が有意に抑制される事が明らかとなった。 ' 参考例 6 Nectin - 2 siRNAによるヒ ト大腸癌細胞株 HT- 29の細胞周期の変化 参考例 1で用いたヒト大腸癌細胞株 HT-29を M5A培地に懸濁し、 1枚あたり 5 x 105個の細胞密度で 10 cm組織培養シャーレに播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°C でー晚培養した後、 参考例 5の方法に準じて Nectin - 2-siRNA、 もしくは陰性コン トロールとして non_si lencing dsRNAをトランスフエクションし、 5%炭酸ガス気 流中、 37°Cで 24時間培養を継続した。 これらの細胞を 2 X 105個/ゥヱルで 6穴 平底組織培養プレート （Becton Dickinson社） に再播種し、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 5 日間培養した。 各ゥヱルの培養細胞をトリプシン- EDTA処理により剥離 した後、 CycleTEST Plus DNA Reagent Kit (Becton Dickinson ¾fc)を用いて、 FACScan (Becton Dickinson社） により細胞周期を解析した。 その結果、 Nectin- 2- siRNA 添加群では陰性コントローノレとして用いた non - silencing dsRNA添加群に比べ、 G0/G1期にある細胞の比率が約 13%上昇し、 S期にある細胞の比率が約 11%低下し ていた。 このことから、 Nectin - 2 - siRNAによりヒト大腸癌細胞株 HT - 29の細胞周 期の変化が誘導されることが示唆された。 参考例 7 Nectin - 2 siRNAによるヒト大腸癌細胞株 HT- 29の Nectin - 2 mR A発現 量低下 '
参考例 1で用いたヒト大腸癌細胞株 HT-29を M5A培地に懸濁し、 1枚あたり 5 x 105個の細胞密度で 10 cm組織培養シャーレに播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°C でー晚培養した後、参考例 5の方法に準じて Nectin- 2 - siRNAもしくは陰性コント ロールとして non - silencing dsRNAをトランスフエクションし、 5%炭酸ガス気流 中、 37°Cで 24時間培養した。 これらの細胞をより RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN社） を用いてトータル RNAを抽出した。 約 100 ngのトータル RNAを錶 型として、 TaqMan Reverse franscription Reagents (Applied Biosystems社)
89 を用いて逆転写反応を行った。 Nectin-2 遺伝子の mRNAの発現量はトータル RNA にして.10 ng に相当する cDNA を铸型とし、 TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems社） 5 /i l、 プライマー 1 (配列番号： 9 ) およびプライマ 一 2 (配列番号： 1 0 ) を各 500 nM、 FAM標識した TaqManプローブ 1 (配列番号： 1 1 )'を 100 nMとなるように加え、反応液量 10 μ Lとし定量的 PCR法を用いて測 定した。 一方、 Nectin - 2 δ遺伝子の mRNAの発現量はトータル RNAにして 10 ng に相当する cDNAを铸型とし、 TaqMan Universal PCR Master Mix 5 μ L、 プライマ 一 3 (配列番号： 1 2 ) およびプライマー 4 (配列番号： 1 3 ) を各 500 nM、 FAM 標識した TaqManプローブ 2 (配列番号： 1 4 ) を 100 nMとなるように加え、 反 応液量 10 Lとし定量的 PCRを行って測定した。 PCRは、 50°C · 2分、 95°C · 10 分の後、 95°C · 15秒、 60°C · 1分のサイクルを 40回繰り返した。 同量の歸型 cDNA 中に含まれる /3 -ァクチン遺伝子の mRNA 発現量を TaqMan β -actin Control Reagents (Applied Biosystems社） を用いて測定しこれを内部標準とした。
Nectin-2-siRNA添加群では、 陰性コントロールとして用いた non- silencing dsR A添加群に比べ Nectin- 2ひの mRNA発現量は 69%、 Nectin- 2 δの mRNA発現量 は 73%低下しており、 いずれも両者の間に統計学的に有意な差 （P< 0. 001) が見 られた。 これらの結果より、 Nectin- 2-siRNA により Nectin- 2 α遺伝子、 および Nectin - 2 δ遺伝子の mRNA発現量の低下が誘導されたことが示された。 参考例 8 ヒト癌組織における Nectin_2 mRNAの発現亢進
ヒト癌組織とヒト正常組織における Nectin - 2遺伝子の mRNA発現量を定量的 PCR法により比較検討した。 PCRの錡型としては cDNA CeHAT- SD Breast Tumor 1 (Cosmo Bio社）、 cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 2 (Cosmo Bio社)'、 Human Colon Matched cDNA Pair Panel (BD Biosciences社)、 Human Lung Matched cDNA Pair Panel (BD Biosciences社）、 およぴ Human Ovary Matched cDNA Pair Panel (BD Biosciences社）を用いた。 Nectin- 2 α遺伝子の mRNA発現量の測定は 1 / Lの cDNA を銹型とし、 TaqMan Universal PCR Master Mix (Appl ied Biosystems社) 7. 5 μ レ プライマー 1 (配列番号： 9 ) およびプライマー 2 (配列番号： 1 0 ) を各' 500 nM、 FAM標識した TaqManプローブ 1 (配列番号： 1 1 ) を 100 nMとなるように加 え反応液量を 15 /i Lとした。 Nectin - 2 δ遺伝子の mRNA発現量の測定は 1 Lの cDNA
90 を铸型とし、 TaqMan Universal PCR Master Mix 7. 5 ^ L プライマー 3 (配列番号： 1 2 ) およぴプライマー 4 (配列番号： 1 3 ) を各 500 nM、 FAM標識した TaqMan プローブ 2 (配列番号： 1 4 ) を ΙΟΟ ηΜとなるように加え反応液量を とし た。 但し、 cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 1 (Cosmo Bio社）、 および cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 2 (Cosmo Bio社）については铸型量を 0. 2 Lとした。 PCRは、 50°C · 2分、 95°C · 10分の後、 95°C · 15秒、 60°C · 1分のサイクルを 40回繰り返した。 一方、 同量の錡型 cDNA中に含まれる ]3 -ァクチン遺伝子の mRNA発現量を測定し、 これを内部標準とした。その結果、 ヒト癌組織における Nectin- 2 α遺伝子の mRNA 発現量はヒト正常組織の発現量に比べ、 cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 1 (Cosmo Bio 社）に含まれる 3人のドナーで各々 1. 1倍、 10倍、 4. 3倍、また cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 2 (Cosmo Bio社） に含まれる 3人のドナーで各々 12倍、 3. 5倍、 21倍であ つた。 同様にして、 Nectin- 2 α遺伝子の mRNA発現量は Human Colon Matched cDNA Pair Panel (BD Biosci ences社） に含まれる 5人のドナーの癌組織では正常組織 の各々 4. 8倍、 3. 2倍、 2. 6倍、 1. 9倍、 1. 8倍、 Human Lung Matched cDNA Pair Panel (BD Biosciences社） に含まれる 5人のドナーの癌組織では正常組織の各々 11 倍、 3. 7倍、 4. 1倍、 3. 2倍、 1. 3倍、 また Human Ovary Matched cDNA Pair Panel (BD Biosciences社） に含まれる 5人のドナーのうち 4人の癌組織では正常組織 の各々 1. 3倍、 1. 8倍、 2. 6倍、 2. 4倍であった。 癌組織における Nectin- 2 δ遺伝 子の mRNA発現量は正常組織の発現量に比べ、 cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 1 (Cosmo Bio社社）に含まれる 3人のドナーのうち 2人で各々 1. 1倍、 5. 3倍、 cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 2 (Cosmo Bio社） に含まれる 3人のドナーのうち 2人で各々 2. 0 倍、 2. 5倍であった。。同様にして、 Nectin-2 δ遺伝子の mRNA発現量は Human Colon Matched cDNA Pair Panel (BD Biosciences社社） に含まれる 5人のドナーのう ち 3人の癌組織では正常組織の各々 1. 3倍、 1. 8倍、 1. 5倍、 Human Lung Matched cDNA Pair Panel (BD Biosciences社） に含まれる 5人のドナーのうち 4人の癌 組織では正常組織の各々 4. 8倍、 3. 7倍、 1. 1倍、 1· 3倍、また Human Ovary Matched cDNA Pair Panel (BD Biosci ences社） に含まれる 5人のドナーのうち 4人の癌 組織では正常組織の各々 4. 2倍、 2. 1倍、 2. 4倍、 4. 2倍であった。 これらの結果 より、癌組織では正常組織に比べ Nectin- 2 a遺伝子、およぴ Nectin- 2 δ遺伝子の mRNAの発現が亢進していることが確認された。
91 参考例.9 ヒ ト癌細胞株における Nect in - 2遺伝子の mR Aの発現量比較 ' 骨肉種細胞株 Saos- 2、 脳腫瘍細胞株 SK- N- MC、 SK-N- AS、 SK- N- BE、 SK- N - DZ、 SK - N- FI、 SK- N- SH、 D341 Med, Daoy、 DBTRG- 05MG、 U- 118 MG、 U- 87 MG、 CCF- STTG1、 SW 1088、 乳癌細胞株 HCC1937、 ZR- 75- 1、 AU565、 MCF-7、 MDA- MB- 231、 SKBR- 3、 BT474, MDA- MB- 435s、 MDA- MB- 436、 MDA- MB- 468、 MDA- MB- 175VII、 T- 47D大腸癌細 胞株 Caco- 2、 COLO 201、 COLO 205、 COLひ 320DM、 DLD- 1、 HCT- 15、 HCT-8、 HT- 29、 LoVo、 LS180、 LS123、 LS174T、 NCI- H548、 NCI-SMJ- Cl、 SK-C0- 1、 SW 403, SW 48, SW 480、 SW 620、 SW 837、 SW 948、 HCT 116、 WiDr、 非小細胞肺癌細胞株 A549、 NCI- H23、NCI_H226、NCI- H358、NCI- H460、NCI- H522、NCI- H661、NCI- H810、NCI-H1155、 NCI- H1299、 NCI-H1395, NCI- H1435、 NCI- H1581、 NCI- H1651、 NCI- H1703、 NCI- H1793、 NCI— H2073、 NCI - H2085、 NCI- H2106、 NCI_H2228、 NCI-H2342, NCI— H2347、 SK— LU - 1、 NCI-H2122, SK-MES-U NCI-H292,小細胞肺癌細胞株 NCI- H187、 NCI- H378、 NCI- H526、 NCI— H889、 NCI— H1417、 NCI-H1672, NCI- H1836、 NCI— H1963、 NCI- H2227、 NCI— N417、 SHP- 77、 卵巣癌細胞株 ES- 2、 Caov- 3、 MDAH2774、 NIH : 0VCAR3、 0V- 90、 SK- 0V - 3、 T0V- 112D、 T0V- 21G、前立腺癌細胞株 DU 145、 LNCaP、網膜芽腫細胞株 WERI- Rb - 1、 Y79、精巣癌細胞株 Gates- IB (以上 ATCCより購入）、 大腸癌細胞株 C0CM1、 非小細 胞肺癌細胞株 VMRC-LCDおよび前立腺癌細胞株 PC3 (以上 Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB) より購入） を、 それぞれ ATCCあるいは JCRBが推 奨している培養方法に従って培養し、 培養細胞から RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN社） を用いてトータル RNAを調製した。 このトータル RNAを鑤型として 逆転写反応を行レ、 cDNAを調製し、これを铸型として定量的 PCRを行うことにより、 Nectin-2遺伝子の mRNA発現量を測定した。 '
Nectin - 2遺伝子の mRNA発現量の定量は上記トータル RNA 5 ngより得られた cDNAを铸型とし、参考例 2に記載の方法に従って行つた。一方、 同量の錄型 cDNA 中に含まれる J3 -ァクチン遺伝子の mRNA発現量を測定し、 これを内部標準とした。 各癌細胞株における Nectin - 2 a遺伝子おょぴ Nectin- 2 δ遺伝子の mRNA発現量 を β -ァクチン遺伝子の mRNA発現量で標準化した相対的発現量を〔表 1〕に示す。 調べた全癌細胞株のうち 2株が] 3 -ァクチン mRNAの 1%以上の Nectin- 2ひ mRNA を発現し、 また 12株が ァクチン遺伝子の mRNAの 1°/。以上の Nectin- 2 δ mRNA
92 を発現していることが明らかとなった, 表 1 .
Figure imgf000095_0001
93 参考例 10 Nect i n-2 δ cDNA免疫による抗 Nect in- 2ゥサギポリクローナル抗体の 作製 - ジーンガンを用いた DNA免疫法による抗 Nectin- 2ゥサギポリクローナル抗体作 製を、 Genovac社（日本農産工業㈱）に委託して行った。 Nect in- 2 δ (配列番号： 3 ) のアミノ酸配列をコードする cDNA を組み込んだ動物鈿胞用発現ベクターを Genovac社出願の特許文献（TO 00/29442号公報） に記載されている方法に従いマ イク口パーティクルに塗布し、これをジーンガンを用いてゥサギ 2羽に免疫した。 耳静脈より試験採血して得た血清の抗体価上昇を確認した後、 麻酔下類動脈採血 を行ってそれぞれ 127 mL、 および 115 mLの抗血清を得た。 '
これらの抗血清を PBSで 2倍希釈し、 遠心分離した上澄液を Nectin-2ED- FLAG タンパク質を HiTrap NHS-Act ivated HP (Amersham Biosci ences社） に固定ィ匕し 作製した抗原カラムに供した。 同カラムを PBSで洗浄後、 0· 15 M NaCl含有 0. 1 M Glyc ine - HC1 (PH3)で溶出し、溶出液を lM Tri s - HC1 (PH8)で速やかに中和した後、 PBSに対して 4°Cで終夜透析して抗 Nect in- 2ゥサギポリクローナル抗体を精製取 得した。ここで得られた抗 Nect in- 2ゥサギポリクローナル抗体をそれぞれ N2- Rl、 および N2-R2と命名した。 参考例 11 ヒ ト癌細胞株における Nect in- 2タンパク質の発現量
ヒト癌細胞における Nect in- 2 タンパク質の発現量をフローサイトメトリーに より調べた。ヒト癌細胞株、 NCI- H1703、HT-29、0V- 90、SKBR_3、SK- 0V- 3、NCI- H2342、 T0V-112D, NCI— H2122、 NCI- H292、 Capan- 2、 MDA— MB— 231、 BxPC - 3、 HCT- 8、 SK - N_DZ、 Caov- 3、 DU 145、 A549、 Caco - 2、 WiDr、 ZR- 75- 1、 HCT- 15、 NCI- H1299、 NCI-H2228、 BT474 (以上、 ATCC より購入）をそれぞれ ATCC推奨の方法により培養し、 Stain buffer (BD Biosc i ences社） を用いてそれぞれ 1 x 106個 /mLとなるように細胞 の懸濁液を作製した。 細胞懸濁液に参考例 10で作製した抗 Nectin- 2ゥサギポリ ク口ーナル抗体 (N2一 R2)を最終濃度 3 g/mLとなるよう添加し、 4°Cで 1時間反応 させた。 同様の手法により、 非免疫ゥサギ IgG ( Jackson ImmunoResearch Laboratories社）を最終濃度 3 μ g/mLとなるように添加し陰性コント口ールとし た。 この細胞懸濁液を遠心分離操作後、 Stain bufferにて洗浄し、 Alexa488標識 抗ゥサギ IgG抗体（Invitrogen社）を最終濃度 10 g/mLどなるように添カ卩し、 4°C
94 で 1 時間反応させた。 再度 Stain buffer で洗浄した細胞を FACScan (Becton Dickinson社） に供し、 各細胞の Nectin- 2タンパク質発現レベルを測定した。 各 細胞株の陰性コントロールの蛍光強度中央値に対する N2- R2染色細胞の蛍光強度 中央値の比を 〔表 2〕 に示した。 この結果から、 肺癌、 乳癌、 卵巣癌など複数の 癌種に由来するヒト癌細胞株において Nectin- 2 タンパク貧が高発現しているこ とが明らかとなった。
表 2
Figure imgf000097_0001
参考例 12 組換え型 Nectin-2細胞外領域一 FLAGタンパク質の動物細胞用発現べ クタ一の構築
参考例 4で作製した動物細胞用発現べクタ一 （pcDNA3. 1 (+) -Nectin-2 δ ) を铸 型とし、 制限酵素 EcoRIの認識配列を付加したプライマー 33 (配列番号： 2 9 )、 および制限酵素 Xholの認識配列を付加したプライマー 34 (配列番号： 3 0 ) を用 いて PCRを行った。 該反応における反応液の組成は pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2 δ 10 ngヽ PfuUltra Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE社） 2. 5U、 プライマー 33 (配 列番号： 2 9 )、 およぴプライマー 34 (配列番号： 3 0 ) 各 0. 2 M、 dNTPs 200 μ Μ、 および 10χ Pfu Ultra Buffer (STRATAGENE社） 5 Lの合計 50 Lとした。 PCR は、 95°C · 2分の後、 95°C · 30秒、 60°C · 30秒、 72°C · 1分 15秒のサイクルを
95 30回繰り返した後に、 72。C · 10分の反応を行った。 次に PCR Purification Kit (QIAGEN社） にて該 PCR産物を精製した後、制限酵素 EcoRI、および Xholにて消 化した。 同様に pCMV - Tag4 (STRATAGENE社）も制限酵素 EcoRIと Xholにて消化し た。 Wizard SV Gel and PCR Clean- Up System (Promega社）を用いてそれぞれの DNA断片を精製した後、 Ligation High (TOYOBO社） を用い T"両 DNA断片をライゲ ーシヨンさせた。 得られたプラスミドを大腸菌 T0P10 (Invitrogen社）に導入し、 カナマイシンを含む LB寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから 回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析した結果、 Nectin- 2 δタンパク質の 細胞外領域（配列番号： 3で表される Nectin - 2 δのァミノ酸配列の 1番目から 361 番目） の C末端に FLAGタグが融合した Nectin - 2ED - FLAGタンパク質（配列番号： 3 1 ) をコードする cDNA配列 （配列番号： 3 2 ) を有する動物細胞用発現べクタ 一 pCMV-Tag4- Nectin- 2ED- FLAGを得た。 参考例 13 組換え型 Nectin- 2ED - FLAGタンパク質の調製
参考例 12にて作製した動物細胞用発現べクター（pCMV- Tag4- Nectin-2ED- FLAG) によりコードされる Nectin- 2ED - FLAGタンパク質を FreeStyle293発現システム (Invitrogen |±) を用いて調製した。具体的には、 293F細胞株に動物細胞用発現 ベクター pCMV-Tag4_Nect in- 2ED- FLAGを 293フエクチン（Invitrogen社）を用いて トランスフエクシヨンし、 この細胞を 8%炭酸ガス気流中、 37°Cで 3日間旋回培養 した。 細胞懸濁液を遠心分離して得た培養上清を 0·45 μ πιのフィルターを用いろ 過した後、 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で平衡化した抗 FLAG抗体カラム（Sigma 社）に供した。 PBSで力ラムを洗浄した後、 FLAGぺプチドを 0. 1 mg/mLの濃度で含 有する PBS にて Nectin - 2ED-FLAG タンパク質を溶出した。 この溶出画分を Vivaspin (VIVA SCIENCE社） を用いて限外濃縮した後、 PBSで平衡化したゲルろ 過カラム PD- 10 (Amershara Biosciences |± GE Healthcare社に社名変更） を用 いて混入する FLAG ペプチドを除去し、 再度濃縮して高純度の組換え型 Nectin-2ED- FLAGタンパク質を取得した。 参考例 14 抗 Nectin - 2ゥサギポリク口ーナル抗体の作製
参考例 13で調製した組換え型 Nectin- 2ED - FLAGタンパク質を免疫原として抗
96 Nectin-2ゥサギポリクローナル抗体を作製した。 Nectin- 2ED- FLAGタンパク質の PBS溶液とフロインド完全ァジュバントとを等量混合して作製したエマルション を、 家兎 （日本白色種、 雌、 3 kg) 3 羽の背部皮下および皮内に 1 羽あたり Nectin-2ED- FLAGタンパク質として 0. 1 mgずつ免疫した。 2回目以降の免疫には フロインド不完全アジュバントを用いたタンパク質エマルシヨンを同様に調製し、 2週間毎に 7回追加免疫した。
免疫前および 4 回目と 6 回目の免疫 1 週間後に耳静脈より試験採血し、 Nectin- 2ED- FLAGタンパク質をコートしたィムノプレートを用いた ELISAにより 血清抗体価の上昇を確認した。 最終免疫の 1週間後に 3羽のゥサギより麻酔下類 動脈採血を行い、 それぞれ 78. 9 ml、 78. 2 ml、 78. 8 mlの抗血清を取得した。 これらの抗血清を PBSで 2倍希釈し遠心分離した上澄液を、 Nectin-2ED - FLAG ダンパク質を HiTrap NHS-Activated HP (Amersham Biosciences社 GE Healthcare 社に社名変更）に固定化し作製した抗原力ラムに供した。カラムを PBSで洗浄後、 0. 15M NaCl を含む 0. 1M Glycine- HC1 (pH3)で溶出し、 溶出液を速やかに 1M Tris-HCl (PH8)で中和した後、 PBSに対して 4°Cで終夜透析し、 抗 Nectin- 2ゥサ ギポリクローナル抗体 （N2 - Νο· 1、 Ν2 - No. 2、 および N2 - No. 3) を取得した。 参考例 15 組換え型 Nectin-2細胞外領域一 Fcタンパク質の動物細胞用発現べク ターの構築
(1) ヒ ト IgGl · Fcフラグメント遺伝子のクローニング
ヒト脾臓由来 Marathon - Ready cDNA (BD BIOSCIENCES社） を錄型とし、 制限酵 素 EcoRIの認識配列を付加したプライマー 3 3 (配列番号： 3 3 )、および制限酵 素 Xhol の認識配列を付カ卩したプライマー 3 4 (配列番号： 3 4 ) を用いて PCR を行つた。該反応における反応液の組成は上記 cDNA 1 μレ Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE社） 1U、 プライマー 3 3 (配列番号： 3 3 ) およぴプラ イマ一 3 4 (配列番号： 3 4 )各 1 M、 dNTPs 200 M、および 2xGC Buffer I (TaKaRa Bio社） 10 / Lの合計 20 z Lとした。 PCR反応は、 95°C · 1分の後、 95°C · 20秒、 60°C ' 15秒、 72°C ' 2分のサイクルを 30回繰り返した。次に PCR Purification Kit (QIAGEN社） にて該 PCR産物を精製し、制限酵素 EcoRI、および Xholにて消化し た。 同様に pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen社) も制限酵素 EcoRI、 および Xholにて消
97 化した。 'これらを PCR Pur ication Kitにて精製し、 両 DNA断片を DNA Ligation Kit ver. 2 ( TaKaRa Bio 社） を用いてライゲーシヨ ンさせた後、 大腸菌 T0P10 (Invitrogen社）に導入し、アンピシリンを含む LB寒天培地中で選択培養し た。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子ク口ーンの配列を解析し、 ヒ ト IgGl の Fc領域をコードする cDNA配列を有する動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - hFcを得た。
(2) Nectin-2細胞外領域-ヒト Fcキメラタンパク質発現ベクターの構築 参考例 4で作製した PcDNA3. 1 (+) -Nectin-2 δを铸型とし、制限酵素 Hindlllの 認識配列を付加したプライマー 3 5 (配列番号： 3 5 )、 および制限酵素 EcoRI の認識配列を付加したプライマー 3 6 (配列番号： 3 6 )を用いて PCRを行つた。 該反応における反応液の組成は pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2 δ 10 ng、 Pfu Turbo Hot start DNA Polymerase 2. 5U、 プライマー 3 5 (配列番号： 3 5 ) およぴプラ イマ一 3 6 (配列番号： 3 6 ) 各 0. 2 Μ、 dNTPs 200 μ M, 2xGC Buffer 110 / L の合計 20 /i Lとした。 PCRは、 95°C · 1分の後、 95°C · 20秒、 60°C · 15秒、 72°C · 2分 30秒のサイクルを 35回繰り返した。 反応産物をァガロースゲル電気泳動で 分離後、 Gel Extraction Kit (QIAGEN社）を用いて精製し、 制限酵素 HindIII、 お よび EcoRIにて消化した。 同様に PcDNA3. 1 (+) - hFcも制限酵素 Hindlll と EcoRI にて消ィ匕した。 両 DNA断片を DNA Ligation Kit ver. 2を用いてライゲーションさ せた後、大腸菌 T0P10に導入し、アンピシリンを含む LB寒天培地中で選択培養し た。 増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し た結果、 Nectin- 2 δタンパク質の細胞外領域 （配列番号： 3で表される Nectin- 2 δのァミノ酸配列の 1番目から 350番目） とヒ ト IgGlの Fc領域が融合したタン パク質 （配列番号： 3 7 ) をコードする cDNA配列 （配列番号： 3 ' 8 ) を有する動 物細胞用発現ベクター （pcDNA3. 1 (+) - Nectin - 2ED - hFc) を得た。
.
参考例 16 組換え型 Nectin - 2ED-Fcタンパク質の調製
FreeStyle293発現システム （Invitrogen社） を用い、 参考例 15にて作製した 動物細胞用発現ベクター （pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED- hFc) によりコードされる Nectin- 2ED- hFc タンパク質を調製した。 具体的には、 293F 細胞株に pcDNA3. 1 (+) - Nectin - 2ED- hFcを 293フエクチン（Invitrogen社）を用いてトラン
98 スフヱクシヨンし、 8%炭酸ガス気流中、 37°Cで 3 日間旋回培養した。 細胞懸濁液 を遠心分離して得た培養上清を 0. 22 ^ ]!のフィルターを用いろ過した後、 PBSで 平衡化した rProteinA Sepharose FF カフム (.Amershara Biosciences 社 GE Healthcare社に社名変更） に供した。 PBSでカラムを洗浄した後、 0. 15 M NaCl を 含む 0. 1 M Glycine- HC1 (pH 3. 5) で溶出し、溶出液を速やかに 1 M Tris-HCl ( H 8) で中和した。 Nectin- 2ED- hFc溶出画分を 4°Cで PBSに対して終夜透析した後、 Ami con Ultral5 30MWCO ( MILLIP0RE 社） を用いて限外濃縮し、 組換え型 Nectin- 2ED-Fcタンパク質を取得した。 参考例 17 ぺプチド抗原を用いた抗 Nectin- 2ゥサギポリクローナル抗体の作製 Nectin- 2 αダンパク質 （配列番号： 1 ) および Nectin- 2 δタンパク質 （配列番 号： 3 )のアミノ酸配列に基づき、 15アミノ酸からなる以下の 3種のぺプチド（ぺ プチド 1〜3) を合成した。
ペプチド 1のアミノ酸配列
LCys-Lys-Met-Gly-Pro-Ser-Phe-Pro-Ser- Pro-Lys-Pro-(jly-Ser-Glu
(配列番号： 3 9 )〕 は、 Nectin- 2 αタンパク質（配列番号： 1 )、および Nectin - 2 δタンパク質（配列番号： 3 ) の 88番目から 101番目までのアミノ酸配列の Ν末 端に Cys残基を付加した配列である。
ペプチド 2のアミノ酸配列
し Arg— Glu—Thr— Pro— Arg— Ala—Ser— Pro— Arg— Asp— Va丄ー Gly— Pro~Leu— Cys
(配列番号： 4 0 )〕 は、 Nectin - 2 ひタンパク質 （配列番号： 1 ) の 347番目から 360番目までのァミノ酸配列の C末端に、 Cys残基を付加した配列である。
ペプチド 3のアミノ酸配列
LCys-Thr-Leu-Gly-Ala-Ser-Glu-His-Ser-Pro-Leu-Lys-Thr-Pro-Tyr
(配列番号： 4 1 )〕 は、 Nectin - 2 δタンパク質 （配列番号： 3 ) の 426番目から 439番目までのァミノ酸配列の Ν末端に、 Cys残基を付加した配列である。
上記ぺプチド 1、 ぺプチド 2およびぺプチド 3を、 それぞれキヤリァータンパ ク質；マレイミ ド化 Keyhole limpet hemocyanin (KLH) (Pierce社） に化学結合 させたものを免疫原とした。 免疫動物は雄性ゥサギ K B L : J W (11 週齢、 北山 ラベス） を用い、 初回は上記免疫原とフロインド完全アジュバンド （Difco社）
99 とから成るエマルシヨンを、 2 回目以降は同免疫原とフロインド不完全アジュバ ンド （Mfco社） とから成るエマルシヨンをそれぞれタンパク量として各 0. 5 mg ずつ背部皮下に 2週間毎に合計 4回免疫した。初回免疫後 52日目に各ゥサギを麻 酔下、 頸動脈採血し、 ぺプチド 1、 ぺプチド 2またはべプチド 3を免疫したゥサ ギから各々 70ml、 66ml、 72mlの抗血清を得た。 このようにして得られた抗血清か らィムノグロプリン画分を硫安塩析法により濃縮し、 プロテイン Aァフィ二ティ 一力ラム （Amersham Biosciences社 GE Healthcare社に社名変更） により精製 し、 IgG抗体画分を得た。 こうして得た IgG抗体を、 各ぺプチドを Cys残基を介 してセファロースカラム （Amersham Biosciences社 GE Healthcare社に社名変 更） にカップリングした固定化カラムに供した。 カラムを PBSで洗浄した後、 8M 尿素を含む PBSを用いてぺプチド特異的抗体を溶出した。 これらの溶出液を PBS に対して透析して尿素を除いた後、 限外濃縮、 フィルターろ過滅菌することによ り、 ぺプチド 1、 ぺプチド 2、 およぴぺプチド 3に対する抗 Nectin- 2ゥサギポリ クローナル抗体精製標品 （AS- 2704、 AS- 2705、 および AS- 2706) を取得した。 参考例 18 組換え型完全長 Nectin- 2 δ安定発現 NS0細胞株の樹立
Nectin-2 5タンパク質 （配列番号： 3 ) を安定的に発現する NS0細胞株を樹立 した。 動物細胞用発現べクタ一 pEE12. 4 - Nectin- 2 δを取得するため、 参考例 4で 作製した pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2 δを制限酵素 EcoRI、および EcoRVにて消化した。 同様に動物細胞発現ベクター pEE12. 4 (Lonza Biologics社） を制限酵素 EcoRI、お よび Smalにて消化した。これらをァガロースゲル電気泳動し目的断片を切り出し MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN社）にて精製し、両 DNA断片を Ligation High (T0Y0B0社) を用いてライゲーシヨンさせた後、 Competent high DH5 a (T0Y0B0 社）に導入し、 アンピシリンを含む LB寒天培地中で選択培養した。 増殖した大腸 菌コロニーをアンピシリンを含む LB培地で培養し、 遠心して回収した菌体から QIAfilter Plasmid Maxi kit (QIAGEN社）にてプラスミドを調製した。 プラスミド を制限酵素 EcoRIにて消化後、ァガロースゲル電気泳動で Nectin- 2 δ遺伝子の揷 入を確認し、 Nectin- 2 δタンパク質 （配列番号： 3 ) をコードする cDNA配列 （配 列番号： 4 )を有する動物細胞用発現ベクター pEE12. 4 - Nectin- 2 δを得た。制限酵 素 (Pvul)消化により直線化した pEE12. 4— Nectin— 2 δ 40 gを NS0細胞 (2 x 107
100 個）にジーンパルサー（Bio- Rad社）を用いてトランスフエクション (250V, 400 μ F) した。 これを 10%透析 FBS (Invitrogen社）おょぴ、 2 mM L-グルタミンを含有する DMEM培地（JRH社）に再懸濁させ、 96穴平底組織培養プレート 16枚に 1ゥエルあ たり 8， 000個/ 50 L、 プレート 20枚に 1ゥエルあたり 2， 000個/ 50 // L、 プレート 40枚に 1ゥェルあたり 400個 /50 Lとなるよう播種した。 'これらを 8%炭酸ガス 気流中、 37°Cで 24時間培養した後、 10%透析 FBSおよび GS supplement (JRH社） を 含有する GS選択 DMEM培地 (JRH社）を各ゥヱルに 150 n Lずつ加え、 8%炭酸ガス気 流中、 37°Cで 3〜4週間培養を継続した。 上記選択培地中で増殖したコロニーを 24穴平底組織培養プレートへ再播種し、 増殖した細胞より RNeasy 96 Kit (QIAGEN 社）を用いてトータノレ. RNAを抽出した後、 TaqMan One Step PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems社） を用いて定量的 PCRを行い、 Nectin- 2 δ mRNA高発 現細胞株を選択した。 定量的 PCRの反応液は、 トータル RNA 100 ngを鎵型とし、 2X Master Mix (Applied Biosvstems 社) 25 μ L、 40Χ MultiScribe (Applied Biosystems社） 1. 25 //レ プライマー 4 2 (配列番号： 4 2 ) およびプライマー 4 3 (配列番号： 4 3 ) を各 50 nM、 FAM標識した TaqManプローブ 3 (配列番号： 4 4 ) を 50 nMとなるようにカ卩え、反応液量 50 μ Lとした。 PCRは、 48°C · 30分、 95°C · 10分の後、 95°C . 15秒、 60°C · 1分のサイクルを 40回繰り返した。 その 結果、 Nectin-2 δ遺伝子の mRNAを高発現している NS0細胞 12株を選択取得した。 これら 12株の Nectin- 2 δタンパク質発現量を参考例 17で作製した抗 Nectin - 2 ペプチドゥサギポリクローナル抗体（AS- 2704)を用いたフローサイトメ トリーに より比較し、 中でも Nectin - 2 δタンパク質を高発現する NS0細胞株 (#2-75) を 選択取得した。 参考例 19 組換え型完全長 Nectin- 2 δ安定発現 FM3A細胞株の樹立
Nectin-2 δタンパク質（配列番号： 3 ) を安定的に発現する FM3A細胞株を樹立 した。動物細胞用発現ベクター pEFl- Nectin- 2 δを取得するため、参考例 4で作製 した pcDNA3. 1 (+) -Nectin-2 8を制限酵素 EcoRI、 および EcoRVにて消ィヒした。 同 様に動物細胞発現ベクター pEFl/myc - His A (Invitrogen社） を制限酵素 EcoRI、お ょぴ EcoRVにて消化した。 これらを PCR Purification Kit (QIAGEN社） にて精製 し、 両 DNA断片を DNA Ligation Kit ver. 2 (TaKaRa Bio社） を用いてライゲ^"ト
101 させた後、 Competent high JM109 (T0Y0B0社）に導入し、 アンピシリンを含む LB 寒天培地中で選択培養した。 増殖した大腸菌コロニーをアンピシリンを含む LB 培地で培養し、 遠心して回収した菌体から QIAprep Turbo Miniprep Kit (QIAGEN 社）にてプラスミ ドを調製した。 プラスミドを制限酵素 EcoRI、 および EcoRVにて' 消化後、 ァガロースゲル電気泳動で Nectin- 2 δ遺伝子の挿入を確認し、 Nectin - 2 δタンパク質 （配列番号： 3 ) をコードする cDNA配列 （配列番号： 4 ) を有する 動物細胞用発現べクター pEFl-Nectin- 2 δを得た。
pEFl-Nectin-2 δ 40 /i gを FM3A細胞（1 χ 107個）にジーンパルサー（Bio- Rad社） にてトランスフエクシヨン（350 950 μ F)した。 これを 10°/。 FBS (Invitrogen社） を含有する RPMI1640培地（Invitrogen社）に再懸濁し、 5%炭酸ガス気流中、 37°C で 18 時間培養した。 この遺伝子導入細胞を 10% FBS および 1 mg/mL Geneticine (Invitrogen社）を添加した RPMI1640培地に再懸濁させ、 96穴平底組 織培養プレートに 1ゥエルあたり 1, 000個/ 200 μ L、 100個/ 200 x Lとなるよう各 20枚ずつ播種し、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 1〜2週間培養を継続した。 上記選 択培地中で増殖したコロニーを 24穴平底組織培養プレートへ再播種し、増殖した 細胞より RNeasy 96 Kit (QIAGEN社）を用いてトータル RNAを抽出した後、 TaqMan One Step PGR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems社） を用いて定量 的 PCRを行い、 Nectin- 2 δ mRNA高発現細胞株を選択した。 定量的 PCRの反応液 は、 トータル RNA 100 ngを鍚型とし、 2X Master Mix (Applied Biosystems社） 25 Lゝ 40X MultiScribe (Applied Biosystems社） 1. 25 μ L、 プライマー 1 (配列 番号： 9 )およびプライマー 2 (配列番号： 1 0 ) を各 50 nM、 FAM標識した TaqMan プローブ 1 (配列番号： 1 1 )を 50nMとなるように加え、反応液量 50 /Z Lとした。 PCR反応は、 48°C · 30分、 95°C · 10分の後、 95°C · 15秒、 60°C · 1分のサイクル を 40回繰り返した。 その結果、 Nectin - 2 δ遺伝子の mRNAを高発現している FM3A 細胞 7株を選択取得した。
これら 7株の Nectin - 2 δタンパク質発現量を参考例 17で作製した抗 Nectin - 2 ペプチドゥサギポリクローナル抗体 (AS - 2704)を用いたフローサイトメトリーに より比較し、 中でも Nectin - 2 δタンパク質を高発現する FM3A細胞株 (#58、 #60) を選択取得した。さらにこれらの細胞株を上記選択培地に再懸濁させ 96穴平底組 織培養プレートに 1ゥェルあたり 3個/200 /i L、 1個/ 200 μ1、 0. 3個/200 Lにな
102 るよう各 · 1枚ずつ播種し、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで培養を継続した。 単一コロ ニーと.して増殖した細胞株の一部を上記のフローサイ トメ トリーに供し、 Nectin- 2 δタンパク質発現量の高いクローン（#60- 6)を選択取得した。 参考例 20 組換え型完全長 Nectin- 2 δ安定発現 CHO- K1細胞株の樹立
Nectin- 2 δタンパク質（配列番号： 3 ) を安定的に発現する CH0 - K1細胞株を榭 立した。 参考例 18 で構築した Nectin- 2 δ動物細胞用発現ベクター (ρΕΕ12. 4- Nectin- 2 δ )を制限酵素 Pvul消化により直線化し、 40 μ gを CH0-K1細 胞 (1 X 107個）にジーンパルサーを用いてトランスフエクションした。これを 10% 透析 FBS (Invitrogen社）および GS supplement (JRH社） を含有する DMEM培地（ JRH 社）に再懸濁させ、 96穴平底組織培養プレート 40枚に 1ゥヱルあたり 2， 500個/ 50 Lとなるよう播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 24時間培養した後、 33. 3 μ Μまたは 66. 6 μ M MSX (ICN社） を含む上記培地 150 μ Lをそれぞれプレート ¾)枚 ずつに加え、 5 %炭酸ガス気流中、 37°Cで 3〜4週間選択培養を継続した。 上記選 択培地中で増殖したコロニーを 24穴平底組織培養プレートへ再播種し、増殖した 細胞より RNeasy 96 Kit (QIAGEN社）を用いてトータル RNAを取得しこれを铸型と して逆転写反応を行った。 さらにこの反応産物を铸型として定量的 PCRを行い、 Nectin-2 δの mRNAを高発現する上位 60株を選択取得した。
これら 60株の Nectin-2 δタンパク質発現量を参考例 17で作製した抗 Nectin2 ペプチドゥサギポリクローナル抗体 (AS 2704)を用いたフローサイトメ トリーに より比較し、 Nectin- 2 δタンパク質を高発現する CHO- K1細胞株 (43- 2)を選択取得 した。 参考例 21 組換え型 Nectin-3細胞外領域一 Fcタンパク質の動物細胞用発現べク ターの構築
(1) マウス IgG2a · Fcフラグメントのクロ一二ング
マウス脾臓由来 Marathon - Ready cDNA (BD Biosciences社） を鏺型とし、 制限 酵素 EcoRIの認識配列を付カ卩したプライマー 4 5 (配列番号： 4 5 ) および ½lj限 酵素 Xholの認識配列を付加したプライマー 4 6 (配列番号： 4 6 ) を用いて PCR 反応を行った。該反応における反応液の組成は上記 cDNA l w L、Pfu Turbo Hotstart
103 DNA Polymerase (STRATAGENE社） 1U、 プライマー 4 5 (配列番号： 4 5 ) および プライマー 4 6 (配列番号： 4 6 ) 各 l /x M、 dNTPs 200 Mおよび 2xGC Buffer I (TaKaRa Bio社） 10 // Lで、 合計 20 の液量とした。 PCRは、 95°C · 1分の後、 95°C · 20秒、 60°C · 15秒、 72°C . 2分のサイクルを 30回操り返した。 次に PCR Purificat ion Ki t (QIAGEN社） にて該 PCR産物を精製し、 制限酵素 EcoRIおよび Xholにて消化した。 同様に pcDNA3. 1 (+) (Inv itrogen社） も制限酵素 EcoRIおよ ぴ Xholにて消化した。 これらを PCR Purifi cat ion Kitにて精製し、 両 DNA断片 を DNA Li gat ion Ki t ver. 2 (TaKaRa Bio社） を用いてライゲーシヨンさせた後、 大腸菌 T0P10 (Invitrogen社）に導入し、アンピシリンを含む LB寒天培地中で選択 培養した。 増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を 解析した結果、 マウス IgG2aの Fc領域をコードする cDNA配列を有する動物細胞 用発現べクタ一 pcDNA3. 1 (+) -mFcを得た。
(2) Nect in-3細胞外領域一ヒト Fcキメラタンパク質発現ベクターの構築 ヒト肺癌細胞株 A549由来 Marathon-Ready cDNA (BD Biosc iences社） を鎳型と し、 制限酵素 Hindlllの認識配列を付加したプライマー 4 7 (配列番号： 4 7 ) および制限酵素 EcoRIの認識配列を付加したプライマー 4 8 (配列番号： 4 8 ) を用いて PCRを行つた。該反応における反応液の組成は上記 cDNA 1 j L、 Pfu Turbo Hot start DNA Po lymerase 2. 5U、 プライマー 4 7 (配列番号： 4 7 ) およびプラ イマ一 4 8 (配列番号： 4 8 )各 1 μ M、 dNTPs 200 ^ M、および 2xGC Buffer I (TaKaRa Bio社） 25 /z Lをカ卩え、合計 50 / Lの液量とした。 PCRは、 95°C · 1分の後、 95°C · 20秒、 60°C · 15秒、 72°C . 2分のサイクルを 35回繰り返した。 該 PCR産物を PCR Purificat ion Ki tにて精製した後、制限酵素 Hindlllおよび EcoRIにて消化した。 同様に参考例 15で作製した pcDNA3. 1 (+) -hFcを制限酵素 Hindlllおよび EcoRI にて消化した。 反応産物をァガロースゲル電気泳動で分離後、 Gel Extraction Kit (QIAGEN社）を用いて精製した。 両 DNA断片を DNA Li gat ion Kit ver. 2を用い てライゲーシヨンした後、大腸菌 T0P10に導入し、アンピシリンを含む LB寒天培 地中で選択培養したした。 増殖した大腸菌コ口ニーから回収した個々の遺伝子ク ローンの配列を解析した結果、 Nect in - 3タンパク質の細胞外領域 （配列番号'： 5 で表される Nect in - 3のアミノ酸配列の 1番目から 404番目） とヒト IgGlの Fc 領域が融合したタンパク質（配列番号： 4 9 )をコードする cDNA配列（配列番号：
104 5 0 ) を有する動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) -Nectin-3ED-hFcを得た。 (3) Nectin - 3細胞外領域一マウス Fcキメラタンパク質発現ベクターの構築 (2)で得た動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin - 3ED-hFc を制限酵素 Hindlllおよび EcoRIにて消化し、ァガロースゲル電気泳動で分離後 Nectin- 3タ ンパク質の細胞外領域をコードする DNA断片を切り出し、 Gel Extraction Kitを 用いて精製した。 同様に（1)で得た pcDNA3. 1 (+) - raFcを制限酵素 Hindlllおよび EcoRIにて消化し、反応産物をァガロースゲル電気泳動で分離後、 Gel Extraction Kitを用いて精製した。 両 DNA断片を DNA Ligation Kit ver. 2を用いてライゲー シヨンした後、大腸菌 T0P10に導入しァンピシリンを含む LB寒天培地中で選択培 養した。 増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解 析した結果、 Nectin- 3タンパク質の細胞外領域 (配列番号： 5で表される Nectin-3 のァミノ酸配列の 1番目から 404番目）とマウスの Fc領域が融合したタンパク質 (配列番号： 5 1 ) をコードする cDNA配列 （配列番号： 5 2 ) を有する動物細胞 用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 3ED- mFcを得た。 参考例 22 組換え型 Nectin- 3ED-raFcタンパク質の調製
参考例 21 にて作製した pcDNA3. 1 (+) - Nectin -3 ED- mFc によりコードされる Nectin- 3ED- raFcタンパク質を FreeStyle293発現システム ·（Invitrogen社） を用 い調製した。 具体的には、 293F細胞株に pcDNA3. 1 (+) - Nectin - 3ED- mFcを 293フ ェクチン（Invitrogen社）を用いてトランスフエクションし、 8%炭酸ガス気流中、 37°Cで 3 日間旋回培養した。 細胞懸濁液を遠心分離して得た培養上清上澄液を 0. 22 μ ηιのフィルターを用いろ過した後、 PBSで平衡化した rProteinA Sepharose FFカラム （Amersham Biosciences社 GE Healthcare社に社名変更） に供した。 PBSでカラムを洗浄した後、 0. 15 M NaCl含有 0. 1 M Glycine- HC1 (pH 3. 5)で溶 出し、 溶出液を速やかに 1 M Tris-HCl (pH 8)で中和した。 Nectin- 3ED- Fc溶出画 分を PBSに対して 4°C、 終夜透析した後、 Amicon Ultral5 30MWCO (MILLIP0RE社） を用いて限外濃縮し、 組換え型 Nectin- 3ED-mFcタンパク質を取得した。 参考例 23 抗 Nectin- 2ゥサギポリクローナル抗体の精製
免疫組織染色 （IHC) 時の非特異反応を低減させるため、 参考例 14で作製した
105 抗 Nectin - 2 ゥサギポリクローナル抗体 N2_No. 2 を、 参考例 26 で作製した Nectin 3ED- FLAGタンパク質を HiTrap NHS - Activated HP (GE Healthcare社） に 固定化して作製した Nectin- 3ED- FLAGカラムに供し、 FLAGタグに結合する抗体画 分を除去した。同力ラムから素通りした Nectin - 2特異的なゥサギポリクローナル 抗体画分を N2-No. 2-2として回収し、 これを IHC実験に用いた。 参考例 24 ヒト癌組織における Nectin- 2タンパク質の発現亢進
ヒト癌 #且織おける Nectin - 2タンパク質の発現を IHCにより検討した。 具体的 には、 ヒ ト乳癌組織アレイ （Cybrdi 社）、 およぴヒ ト卵巣癌 ¾|戠アレイ （Cybrdi 社）、 ヒト正常組織アレイ （Biomax社） ヒトを脱パラフィン処理した後に、 抗原 賦活化溶液 (DAK0社） に浸漬させォートクレーブにて 121°Cで 15分間処理した。 次にこれらの組織ァレイを水洗後、 3%過酸化水素水を用いて室温で 7. 5分間処理 し、 PBSにて洗浄した後、 ャギ血清 （Vectastain社） を用いて室温で 20分間ブロ ッキング反応を行った。 ャギ血清を除去後、 参考例 23 で精製した l g/mL の N2- No. 2- 2を含む抗体希釈緩衝液 （DAK0社） を用いて 4°Cでー晚反応させた。 PBS を用いてアレイを洗浄後、 EN SI0N+ (DAK0社） を用いて室温で 30分間反応させ た。 再度 PBSにて洗浄を行い、 0. 01%過酸化水素水を含む MB基質 (Merck社） 溶液を組織ァレイに添加し室温で 3分間反応させた。 その後、 水洗を行いへマト キシリンに 1分間浸漬させた後、 脱水処理を行った。 顕微鏡により各ァレイにス ポットされた組織を観察したところ、表 2 Aおよび表 2 Bに示す割合で Nectin- 2 タンパク質が癌組織で有意に発現亢進している事が明らかとなつた。
106 表 2 A
乳房組織 (Breast tissues)
分類 (Classification) Positive rate
浸潤性腺管癌 (Infiltrating ductal carcinoma) 89% (16/18)
腺管癌 (Ductal carcinoma) 100% (7/7)
浸潤性小葉癌 (Infiltrating lobular carcinoma) 100% (9/9)
髄様癌 (Medullary carcinoma) 50% (3/6)
粘液腺癌 (Mucinous adenocarcinoma; 71% (5/7)
ノ ジエツ卜病 (Paget's disease) 100% (7/7)
正常乳房， (Normal breast) 0% (0/5)
¾ B
卵巣糸且織 (Ovarian Tissues)
Figure imgf000109_0001
参考例 25 組換え型 Nectin- 3細胞外領域一 FLAGタンパク質の動物細胞用発現べ クタ一の構築
組換え型 Nectin-3細胞外領域一 FLAGタンパク質の動物細胞用発現べクターの 作製にあたり、 先ず、 FLAGタグ配列を付加させることのできるベクターを構築し
107 た。 具体的には、 5 ' 末端をリン酸化した 2種類の合成 DNA、 FLAG- FSALN0T (配列 番号： 53) もしくは FLAG- RSALN0T (配列番号： 54) を 50 μ Mになるように TE (1 mM EDTA含有 Tri s_HCl (pH 8) )で希釈後、 等量を混合し、 95°C · 10分間加熱後徐冷 してアニーリングを行った。 次に動物細胞用発現ベクター pCI-neo (Promega社） を制限酵素 Nhelと Notlで消化した後、 ァガロースゲル電気泳動し、 ベクター断 片を Gel Extract ion Ki t (QIAGEN社）で抽出した。 この制限酵素処理した pCI- neo にァニーリングを行つた上記合成 DNA を混合し Ligat ion Hi gh (T0Y0B0社） を用 いてライゲーション反応を行い、 FLAGタグ配列を付加した動物発細胞発現用べク ター pCI-FLAGを構築した。
次 に 参 考 例 21 で 作 製 し た 動 物 細 胞 用 発 現 ベ ク タ ー pcDNA3. l (+) -Nect in-3ED-hFcを铸型とし、 制限酵素 Sailの認識配列を付加した プライマー 55 (配列番号： 55)、 および制限酵素 Nhelの認識配列を付加したブラ イマ一 56 (配列番号： 56) を用いて PCRを行った。 該反応における反応液の組成 は pcDNA3. 1 (+) - Nect in- 3ED- hFcを鎵型とし、 Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio 社） 2. 5U、 プライマー 55 (配列番号： 55) とプライマー 56 (配列番号： 56) 各 0· 5 μ Μ dNTPs 200 μ Μ、 および 10x Pyrobest Buffer Π (Takara Bio社） 5 μ Lの合 計 50 /i Lとした。 PCRは、 94°C · 2分の後、 94°C · 30秒、 60°C · 30秒、 68°C · 1. 5 分のサイクルを 30回繰り返した後に、 68°C · 2分の反応を行った。 次に該 PCR産 物を PCR Purif icat i on Kit (QIAGEN社） を用いて精製した後、 制限酵素 Sai l、 および Nhelにより消化した。 同様に上述の pCI-FLAGを制限酵素 Sai lと Nhelに より消化した。 PCR Purification Kitを用いて両 DNA断片を精製した後、 Ligat ion High (T0Y0B0社） を用いて両 DNA断片をライゲーシヨンさせた。 得られた反応物 を大腸菌 T0P10 (Invitrogen社）に導入し、 アンピシリンを含む LB寒天培地中で 選択培養した。 増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子ク口一ンの配 列を解析し、 Nect in- 3タンパク質 （配列番号： 5 ) のアミノ酸配列の 1番目から 404番目の C末端に FLAGタグが融合した Nect in- 3ED - FLAGタンパク質 (配列番号： 57) をコードする cDNA配列 （配列番号： 58) を有する動物細胞用発現ベクター pCI- Nect in- 3ED- FLAGを得た。 参考例 26 組換え型 Nect in_3ED - FLAGタンパク質の調製
108 参考例' 25にて作製した動物細胞用発現ベクター（pCI- Nectin- 3ED-FLAG)により コード.される Nectin - 3ED- FLAG タンパク質を、 FreeStyle293 発現システム (Invitrogen 社） を用いて調製した。 具体的には、 動物細胞用発現ベクター pCI- Nectin- 3ED- FLAGを 293フエクチン（Invitrogen社）を用いて 293F細胞株にト ランスフエクシヨンし、 この細胞を 8 %炭酸ガス気流中、 37°Cで 3 日間旋回培養 した。 細胞懸濁液を遠心分離して得た培養上清を 0. 45 πιのフィルターを用いろ 過した後、 0. 3 M NaCl含有 0. 1 M Tris-HCl (pH 7. 5)で平衡化させた抗 FLAG抗 体力ラム（Sigma社）に供した。 0. 3 M NaCl 含有 0. 1 M Tris-HCl (pH 7. 5)で力ラム を洗浄した後、 FLAG ペプチドを 0. 1 mg/raL の濃度で含有する同緩衝液にて Nectin- 3ED- FLAGタンパク質を溶出した。 この溶出画分を Amicon Ultra 15 (30K MWCO) (Millipore 社）を用いて限外濃縮した後、 PBS で平衡化させた PD-10 Desalting column (GE Healthcare社）に供し、混入する FLAGぺプチドを除去し、 再度濃縮して高純度の組換え型 NeCtin-3ED- FLAGタンパク質を取得した。 参考例 27 抗 Nectin-3ゥサギポリクローナル抗体の作製
参考例 26で調製した組換え型 Nectin - 3ED - FLAGタンパク質を免疫原として抗 Nectin-3ゥサギポリクローナル抗体を作製した。 Nectin - 3ED- FLAGタンパク質の PBS溶液とフロインド完全アジュバント（D co社）とを等量混合して作製したェ マルシヨンを、 家兎 （日本白色種、 雌、 3 kg) 2羽の背部皮下および皮内に 1羽 あたり Nectin - 3ED- FLAGタンパク質として 0. l mgずつ免疫した。 2回目以降の免 疫にはフロインド不完全アジュバント（D co社）を用いた同タンパク質エマルシ ョンを同様に調製し、 2週間毎に 7回免疫を繰り返した。
免疫前および 4 回目と 6 回目の免疫 1 週間後に耳静脈より試験採血し、 Nectin - 3ED- FLAGタンパク質をコートしたィムノプレートを用いた ELISAにより 血清抗体価の上昇を確認した。 最終免疫の 1週間後に 2羽のゥサギより麻酔下、 類動脈採血を行い、 それぞれ 78. 9 ml、 78. 8 mlの抗血清を取得した。
これらの抗血清を PBSで 2倍希釈し遠心分離した上澄液を、 Nectin- 3ED-FLAG タンパク質を HiTrap NHS- Activated HP (GE Healthcare社） に固定化し作製した 抗原カラムに供した。カラムを PBSで洗浄後、 0. 15 M NaCl含有 0. 1 M Glycine- HC1 (pH 3)で溶出し、 溶出液を速やかに 1M Tris-HCl (pH 8)で中和した後、 PBSに対
109 して 4°Cで終夜透析し、 抗 Nectin-3ゥサギポリクロ一ナル抗体 (N3 - No. 1および N3-No. 3) を取得した。 参考例 28 抗 Nectin - 2 ヒトモノクローナル抗体の大量調製
In vivo抗腫瘍活性測定に用いた 11種類の抗 Nectin- 2ヒトモノクロ一ナル抗 体は該抗体産生ハイブリ ドーマ（Necl-803-2、Necl - 964- l、Necl-303-2、Necl-554- 1. Necl-1302- 2、 Necl- 769- 2、 Necl- 1305- 1、 Necl- 141- 3、 Necl - 209- 2、 Nec卜 909- 1 および Necl - 847- 2) 力 ら調製した。 以下にその典型的な調製方法を例示する。 上 記ハイブリ ドーマ細胞株を 10 % FBS, Ultra-Low- IgG (Invitrogen社）を含む IH 培地 (Iscove ' s Modified Dulbecco' s Medium ： Ham' s F - 12=1 : 1、 0. 1 mM MEM 非必須ァミノ酸溶液、 1 ピルビン酸ナトリゥム溶液、 2 mM L-グルタミン溶液； Invitrogen社） で 37°C、 5 %炭酸ガス気流中で拡大培養した後、 1次馴化培地（IH 培地： CD Hybridoma Medium, 8 raM L -グルタミン溶液 =1 : 1、 Invitrogen社）に拡大 して 1日培養し、 さらに主培養培地（IH培地： CD Hybridoma Medium, 8 mM L-グル タミン溶液 =1 : 3； Invitrogen社）に拡大してスピナ一フラスコを用いる場合は 37°C、 5 %炭酸ガス気流中、 50 L容攪拌培養槽を用いる場合は 37°C、 溶存酸素濃 度 2 ppm、 pH 7. 0、 攪拌回転数 40 rpm条件下で 5〜7日間培養した。 その間、 培 地成分分析を基にグルコース溶液および L -ダルタミン溶液を添加した。主培養は 細胞生存率 50%付近を目安として終了した。 培養終了後、 遠心分離 （7， 460 X g、 20分間） を行って培養上清を回収した。
こうして得た各ハイプリ ドーマ培養上清を限外ろ過膜 （ハイドロザルト膜、 分 画分子量 10, 000；ザルトリウス社） を用いて濃縮し、 0. 15 M NaCl含有 20 mMリ ン酸緩衝液 (pH 7. 0)にバッファ一置換した後、 遠心分離操作 (14, 300 X g、 20分 間） を行い、 上澄液を得た。 これを更に精密ろ過 （ステリカップ HV、 0. 45 μ ιη； ミリポア社） して濃縮液を得た。 これを 0. 15 M NaCl含有 20 mMリン酸緩衝液 (pH 7. 0)で平衡化した Protein A Sepharoseカラム（22 應 ID x 79 mm、 GE Healthcare 社）に吸着させ、 20 カラム容量の同緩衝液でカラムを洗浄した。 カラムに結合し た抗体画分は 0· 1 M クェン酸ナトリゥム緩衝液 (PH 3. 0)を 20カラム容量通液す ることにより溶出させ、 直ちに 1/10容量の 1 M Tris-HCl緩衝液 (pH 9. 0) を加 え中和した。この抗体溶液を限外ろ過膜（アミコンゥノレトラ、分画分子量 30， 000 ；
110 Mill ipore社）を用いて濃縮した後、 PBSで平衡化させた Superdex 200カラム (26 mmlD x - 60 cm、 GE Healthcare社） に供し、 同緩衝液で溶出して抗体単量体画分 を得た。 これを PBSで平衡化した ActiClean EToxカラム （25 mmlD x 59 mm, ス テロジーン.バイオセパレーションズ社）に供してエンドトキシンを除去した後、 限外ろ過膜 （アミコンウルトラ、 分画分子量 10， 000； Millipore社） を用いて濃 縮し、 さらに無菌ろ過 （マイレタス GV、 0. 22 μ ηι ; Millipore社） して精製抗体を 得た。
ハイブリ ドーマ Necl - 554- 1の培養上清から Protein Aカラム精製された抗体画 分は例外的に活性抗体と不活性抗体との混合物である事が分かつた為、 この抗体 画分をさらに陽イオン交換カラムに供し、 活性画分を分離取得する事とした。 す なわち、 上記の Protein A カラム精製抗体画分を 20 mM酢酸ナトリゥム緩衝液 (pH5. 0) で 3倍希釈して 100 mM NaCl含有 20 mM酢酸ナトリウム緩衝液 （ρΗ 5. 0) で平衡化させた SP - 5PWカラム （21. 5 mmlD x 150 讓、 東ソ一社） に吸着させた。 このカラムを約 2カラム容量の 100 mM NaCl含有 20 raM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5. 0)で洗浄した後、 溶離液の NaCl濃度を 70分間で lOOmMから 300mM へ上昇させ る直線濃度勾配溶出法により活性抗体画分と不活性抗体画分を分離し、 活性抗体 画分 (SP3)を回収した。こうして得た抗体溶出液を限外ろ過膜（アミコンウルトラ、 分画分子量 30， 000 ; Millipore社）を用いて濃縮し、 PBSで平衡化させた Superdex 200カラム （26 mmlD x 60 cm、 GE Healthcare社） に供し、 同緩衝液で溶出して 抗体単量体画分を得た。 これを PBSで平衡化した ActiClean EToxカラム（25讓 ID x 59 mm、 ステロジーン 'バイオセパレーシヨンズ社） に供してエンドトキシンを 除去した後、 限外ろ過膜 (アミコンウルトラ、分画分子量 10， 000 ； Mi llipore社） を用いて濃縮し、 さらに無菌ろ過 （マイレタス GV、 0· 22 μ ηι、 Millipore社） して 精製抗体を得た。 この精製抗体を Necl-554 - 1 SP3と命名した。
こうして得られた精製抗体はいずれも SDS- PAGEおよび Superdex 200カラムを 用いたゲルろ過 HPLCで 95%以上の純度を示した。また抗体標品のェンドトキシン 含量をエンドスぺシ一 ES-24Sセット （生化学工業社） およびトキシカラー DIAセ ット （生化学工業社） 用いて分析したところ、 いずれも 0. 1 EU/mg抗体以下であ つた。
111 参考例 29 Nectin- 1、 Nectin- 3、 Nectin- 4、 Necl- 5の動物細胞用発現ベクターの 構築 ·
ヒ ト Nectin- 1遺伝子はヒ ト脳の Marathon- Ready cDNA (Takara Bio社） を鎵 型とし、 制限酵素 EcoRVの認識配列を付加したプライマー 59 (配列番号： 59) と 制限酵素 Xholの認識配列を付加したプライマー 60 (配列番咅： 60) を用いて PCR を行うことにより取得した。 該反応における反応液の組成は上記 cDNA溶液 1 μ L を铸型として使用し、 Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE社） 1U、 プライマー 59 (配列番号： 59) とプライマー 60 (配列番号： 60)各 1 M、 dNTPs 200 M、 および IOX Pfu Ultra Buffer (STRATAGENE社） 2 J Lの合計 20 /i Lとした。 PCRは、 95°C · 1分の後、 95°C · 20秒、 60°C · 15秒、 72°C · 3分のサイクルを 40 回繰り返した。 該 PCR産物を PCR Pur ication Kit (QIAGEN社） を用いて精製し た後、制限酵素 EcoRVと Xholにより消化した。 同様に pCMV- Tag4 (STRATAGEN社） を制限酵素 EcoRV と Xhol にて消化した。 これらの DNA 断片をそれぞれ PCR Purification Kitを用いて精製し、両 DNA断片を DNA Ligation Kit ver. 2 (TaKaRa Bio 社） を用いてライゲーシヨ ンさせた。 この反応混合物を大腸菌 TOP10 (Invitrogen社）に導入し、カナマイシンを含む LB寒天培地中で選択培養し た。増殖した大腸菌コ口ニーから回収した個々の遺伝子ク口ーンの配列を解析し、 Nectin - 1タンパク質 （配列番号： 62) をコードする cDNA配列 （配列番号： 61) を有する動物細胞用発現べクター pCMV- Tag4-Nectin- 1を得た。
ヒ 卜 Nectin- 3遺伝子は MTC Multiple Tissue cDNA Panels (Takara Bio社） に 含まれるヒト胎盤の cDNAを铸型とし、制限酵素 Hindinの認識配列を付加したプ ライマー 47 (配列番号：47)、 と制限酵素 EcoRVの認識配列を付加したプライマー 63 (配列番号： 63) を用いて PCRを行うことにより取得した。 該反応における反 応液の組成は上記 cDNA溶液 1 μ L、 Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase 1U、 プ ライマー .47 (配列番号： 47) およぴプライマー 63 (配列番号： 63) 各 1 M、 dNTPs 200 μ Μ, および 2xGC Buffer I (TaKaRa Bio社） 10 μ Lの合計 20 μ Lとした。 PCR は、 95°C · 1分の後、 95°C · 20秒、 60°C · 15秒、 72°C · 2分のサイクルを 40回繰 り返した。 該 PCR産物を PCR Purification Kitを用いて精製した後、 制限酵素 Hindlllと EcoRVにより消化した。 同様に pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen社） を制限 酵素 Hindlllと EcoRVにより消化した。これらの DNA断片を PCR Pur ication Kit
112 を用いてそれぞれ精 し、 両 DNA断片を DM Ligation Kit ver. 2を用いてライゲ ーシヨンさせた。 この反応混合物を大腸菌 T0P10に導入し、 アンピシリンを含む LB寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝 子クローンの配列を解析し、 Nectin- 3 タンパク質 （配列番号： 5) をコードする cDNA配列（配列番号： 6)を有する動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin - 3 を得た。 ここで得られた pcDNA3. 1 (+) - Nectin - 3 を鑤型とし、 制限酵素 Hindlll の認識配列を付カ卩したプライマー 47 (配列番号：47) と制限酵素 Xholの認識配列 を付加したプライマー 64 (配列番号： 64) を用いて PCRを行った。 該反応におけ る反応液の糸且成は pcDNA3. 1 (+) - Nectin— 3 100 ng、 Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase 2. 5U、プライマー 47 (配列番号： 47)およびプライマー 64 (配列番号： 64) 各 1 μ Μ、 dNTPs 200 μ Μ, および 2xGC Buffer I 25 Lの合計 50 Lとした。 PCRは、 95。C · 1分の後、 95。C · 20秒、 60。C · 15秒、 72。C · 2分のサイクルを 30 回繰り返した。 該 PCR産物を PCR Purification Kitを用いて精製した後、 制限酵 素 Hindlllと Xholにより消化した。同様に pCMV - Tag4を制限酵素 Hindlllと Xhol により消化した。 これらの DNA断片を MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN 社） を用いて精製し、 両 DNA断片を DNA Ligation Ki t ver. 2を用いてライゲーシ ヨンさせた。 この反応混合物を大腸菌 T0P10 に導入し、 カナマイシンを含む LB 寒天培地中で選択培養した。 増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子 クローンの配列を解析し、 Nectin - 3タンパク質（配列番号： 5 )をコードする cDNA 配列 （配列番号： 6 ) を有する動物細胞用発現ベクター pCMV-Tag4-Nectin- 3を得 た。
ヒ ト Nectin- 4遺伝子はヒ ト肺の Marathon-Ready cDNA (Takara Bio社） を铸型 とし、 制限酵素 EcoRIの認識配列を付加したプライマー 65 (配列番号： 65) と制 限酵素 Xhol の認識配列を付加したプライマー 66 (配列番号： 66) を用いて PCR を行うこ.とにより取得した。該反応における反応液の組成は上記 c丽溶液 1 a L、 Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase 1U、 プライマー 65 (配列番号： 65) とプラ イマ一 66 (配列番号： 66) 各 1 μ Μ、 dNTPs 200 μ Μ、 および 10x Pfu Ultra Buffer 2 Lの合計 20 x Lとした。 PCRは、 95°C ' 1分の後、 95。C · 20秒、 60°C · 15'秒、 72°C - 3分のサイクルを 40回繰り返した。次に該 PCR産物を PCR Purification Kit を用いて精製した後、制限酵素 EcoRIと Xholにより消化した。 同様に pCMV- Tag4
113 を制限酵素 EcoRIと Xholにて消化した。これらの DNA断片を PCR Purification Kit にて精製し、 挿入 DNA断片とベクター断片とを DNA Ligation Kit ver. 2を用いて ライゲーシヨンさせた。 この反応混合物を大腸菌 T0P10に導入し、 カナマイシン を含む LB寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回収した個々 の遺伝子クローンの配列を解析し、 Nectin- 4タンパク質 （ί己列番号： 68) をコー ドする cDNA 配列 （配列番号 ： 67 ) を有する動物細胞用発現ベクター pCMV-Tag4-Nectin-4を得た。 '
ヒ ト Necl- 5遺伝子はヒ ト小腸の Marathon-Ready cDNA (Takara Bio社） を鎵型 とし、制限酵素 Hindlllの認識配列を付加したプライマー 69 (配列番号： 69)、 お よび制限酵素 Sailの認識配列を付加したプライマー 70 (配列番号： 70) を用いて PCRを行うことにより取得した。該反応における反応液の組成は上記 cDNA溶液 1 μ ΐ, Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase 1U、 プライマー 69 (酉己歹 IJ番号： 69) と プライマー 70 (配列番号： 70)各 1 μ M、 dNTPs 200 μ M、および 10x Pfu Ultra Buffer 2 μ Ιの合計 20 μ Lとした。 PCRは、 95°C · 1分の後、 95°C · 20秒、 60°C · 15秒、 72°03分のサイクルを 40回繰り返した。次に該 PCR産物を PCR Purification Kit を用いて精製した後、 pCR- Bluntll - T0P0 (Invitrogen社） とライゲーシヨンさせ た。 この反応混合物を大腸菌 T0P10に導入し、カナマイシンを含む LB寒天培地中 で選択培養した。 増殖した大腸菌コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの 配列を解析し、 Nec 1-5タンパク質 （配列番号： 71) をコードする cDNA配列 （配 列番号： 72) を有するクローニングベクター pCR- Bluntll- Necl - 5を得た。 ここで 得られた pCR- Bluntll - Necl-5を制限酵素 Hindlll と Sail にて消化し、 同様に pCMV-Tag4 を制限酵素 Hindlll と Sail により消化した。 これらの DNA断片を MinElute PCR Purification Kitを用いて精製し、 .両 DNA断片を DNA Ligation Kit ver. 2を用いてライゲーシヨンさせた。 この反応物を大腸菌 T0P10に導入し、 力 ナマイシンを含む LB寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから回 収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、 Necl-5タンパク質（配列番号： 71) をコードする cDNA配列 （配列番号： 72) を有する動物細胞用発現ベクター pCMV-Tag4-Necl-5を得た。 参考例 30 Iglもしくは Ig2ドメィン欠損 Nectin - 2変異体の動物細胞用発現べク
114 ターの構築
Nectin-2 細胞外領域の Igl ドメイン、 もしくは Ig2 ドメインを欠損させた Nectin-2 変異体遺伝子を以下の方法により取得した。 参考例 4 で取得した pcDNA3. 1 (+) - Nectin - 2 δを錶型とし、 PCR を行った。 該反応における反応液の組 成は上記 pcDNA3. 1 (+) -Nectin-2 δを 10 ng、 Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE社） 1U、 Igl ドメイン欠損体には制限酵素 EcoRIの認識配列を付加 したプライマー 5 (配列番号： 1 5 ) および制限酵素 EcoRVの認識配列を付カロし たプライマー 73 (配列番号： 73)、 また Ig2 ドメイン欠損体には制限酵素 EcoRI の認識配列を付加したプライマ一 5 (配列番号： 1 5 ) および制限酵素 EcoRVの 認識配列を付加したプライマー 74 (配列番号： 74) を各 1 μ M、 dNTPs 200 μ Μ、 お よび 2xGC Buffer I (TaKaRa Bio社） 10 Lの合計 20 μ Lとした。 PCRは、 95°C · 1分の後、 95°C · 20秒、 60。C · 15秒、 72°C · 1. 5分のサイクルを 30回繰り返した。 次に該 PCR産物を PCR Purification Kit (QIAGEN社） を用いて精製し、 制限酵素 EcoRIと EcoRVとを用いて消化した。 同様に pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen社） を制 限酵素 EcoRIと EcoRVとを用いて消ィ匕した。 これらを PCR Purification Kitにて 精製し、 PCR産物の制限酵素消化物とベクター断片とを DNA Ligation Kit ver. 2 (TaKaRa Bio社） を用いてライゲーシヨンさせた後、 大腸菌 T0P10 (Invitrogen 社）に導入し、 アンピシリンを含む LB寒天培地中で選択培養し、 増幅した各々の PCR 断片を有するプラス ミ ド pcDNA3. 1 (+) -Nectin-2 Δ Igl - 1、 および pcDNA3. 1 (+) -Nectin-2 Δ Ig2- 1を得た。
次に pcDNA3. 1 (+) -Nectin-2 δ 10 ngを鐯型として使用し、 Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase 1U、 Igl ドメィン欠損体には制限酵素 EcoRVの認識配列を付加し たプライマー 75 (配列番号： 75)および制限酵素 Xholの認識配列'を付加したブラ イマ一 76 (配列番号： 76)、 また Ig2 ドメイン欠損体には制限酵素 EcoRVの認識配 列を付加したプライマー 77 (配列番号： 77) および制限酵素 Xholの認識配列を付 加したプライマー 76 (配列番号： 76)を各 1 μ M、 dNTPs 200 μ M、および 2xGC Buffer I 1 μ Ιの合計 20 しとした。 PCRは、 95°C · 1分の後、 95°C · 20秒、 60°C · 15 秒、 72°C ' l. 5分のサイクルを 30回繰り返した。次に該 PCR産物を PCR Purification Kitを用いて精製し、 制限酵素 EcoRVと Xholとを用いて消ィ匕した。 同様に上記で 構築した pcDNA3. l (+) -Nectin- 2 A Ig!L- 1、 および pcDNA3. 1 (+) -Nectin- 2 A Ig2-l
115 も制限酵素 EcoRVと Xholにて消化した。 これらを PCR Purification Kitにて精 製し、 プライマー 75 (配列番号： 75) とプライマー 76 (配列番号： 76) を用いた PCR産物の制限酵素消化物と PcDNA3. 1(+) -Nectin-2 Δ Igl- 1の制限酵素消化物と を DNA Ligation Kit ver.2 を用いてライゲーシヨンさせ、 同様にプライマー 77 (配列番号： 77) とプライマー 76 (配列番号： 76) を用いこ PCR産物の制限酵素 消化物と pcDNA3.1(+) - Nectin - 2AIg2 - 1の制限酵素消化物とを DNA Ligation Kit ver.2を用いてライゲーシヨンさせた。 これらを大腸菌 T0P10に導入し、 アンピ シリンを含む LB寒天培地中で選択培養し、 Nectin-2の Igl ドメインを欠損させ たタンパク質 （配列番号： 78) をコードする cDNA配列 （配列番号： 79) を有する 動物細胞用発現ベクター pcDNA3.1(+)- Nectin- 2Δ¾1、 および、 Nectin-2 の Ig2 ドメインを欠損させたタンパク質（配列番号：80) をコードする cDNA配列 （配列 番号： 81)を有する動物細胞用発現ベクター PcDNA3. l(+)-Nectin- 2AIg2を得た。 参考例 31 力二クイザル Nectin- 2 cDNAのクローニングと塩基配列の決定 力二クイザル Nectin- 2 遺伝子を以下の様に取得した。 力二クイザルの精巣よ り調製したトータル RNA約 l g (UNITECH社） を錶型として、 TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems ¾t) を用レヽて添付フ σ 卜 一ノレ【こ 従レ、逆転写反応を行つて cDNAライブラリーを調製した。 この cDNAライプラリー を铸型とし、 プライマー 82 (配列番号： 82) とプライマー 83 (配列番号： 83) を 用いて PCRを行った。 該反応における反応液の組成'はトータル RNA約 40 ngに相 当する上記 cDNA、 Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE社） 1U、 プ ライマー 82 (配列番号： 82) とプライマー 83 (配列番号： 83) を各 1 β M、 dNTPs 200 μΜ および 10χ Pfu Ultra Buffer (STRATAGENE社） 2μίの合計 20μίとした。 PCRは、 96。C · 1分の後、 96°C · 20秒、 60°C · 15秒、 72°C · 2.5分のサイクルを 40回繰り返した。 次に該 PCR産物を鏺型としプライマー 84 (配列番号： 84) とプ ライマー 85 (配列番号： 85) を用いて PCRを行った。 該反応における反応液の組 成は上記該 PCR産物 lu Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase 1U、 プライマー 84 (配列番号： 84) とプライマー 85 (配列番号： 85) 各 1μΜ、 dNTPs 200 μ お よび 10x Pfu Ultra Buffer の合計 20μίとした。 PCRは、 96°C · 1分の後、 96°C · 20秒、 60°C · 15秒、 72°C · 2.5分のサイクルを 40回繰り返した。 次に該
116 PCR 産物を MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN 社） を用いて精製し、 pCR-Bluntll-TOPO (Invitrogen社） とライゲーシヨンさせた後、 大腸菌コンピテ ントセル T0P10 (Invitrogen社） に導入し、 カナマイシンを含む LB寒天培地中で 選択培養した。 増殖した大腸菌コ口ニーから回収した個々の遺伝子ク口一ンの配 列を解析し、 力二クイザル Nectin- 2 ダンパク質 （配列番夸： 86) をコードする cDNA配列 （配列番号： 87) を有するベクター PCR- Bluntll- maNectin-2を得た。 参考例 32 力-クイザル Nectin- 2動物細胞用発現ベクターの構築
参考例 31 で作製した力二クイザル Nectin- 2 遺伝子を含有する pCR-Bluntll- maNectin-2を鎵型とし、制限酵素 EcoRIの認識配列を付加したプラ イマ一 88 (配列番号： 88)、 および制限酵素 Xholの認識配列を付加したプライマ 一 89 (配列番号： 89) を用いて PCR を行った。 該反応における反応液の組成は pCR-BluntII-maNectin-2を 10 ng、 KOD-Plus-DNA Polymerase (T0Y0B0社） 1リ、 プライマー 88 (配列番号： 88) とプライマー 89 (配列番号： 89) 各 0. 3 μ M、 dNTPs 200 μ M、 および 10x PCR Buffer (T0Y0B0社） 5 μ Lの合計 50 Lとした。 PCRは、 95°C · 3分の後、 95°C · 30秒、、 60°C · 30秒、 68°C · 1分 30秒、のサイクノレを 35回 繰り返した。 次に該 PCR産物を MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN社） を 用いて精製した後、制限酵素 EcoRIと Xho Iにて消化し、 MinElut e PCR Purification Kit (QIAGEN社） を用いて精製した。 同様に pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen社）を制限 酵素 EcoRI と Xhol にて消化し、 ァガロース ¾気泳動分離後、 ベクター断片を MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN社） を用いて精製した。 こうして得られ た挿入 DNA断片とベクター'断片とを Ligation High (T0Y0B0社） を用いてライゲ ーシヨンさせた後、 大腸菌 Competent high DH5 (¾ (TOY0B0社）に導入し、 アンピシ リンを含む LB寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コ口ニーから回収した 個々の遺伝子クローンの配列を解析し、力二クイザル Nectin- 2タンパク質（配列 番号： 86) をコードする cDNA配列 （配列番号： 87) を有する動物細胞用発現べク ター pcDNA3. 1 (+) -maNectin-2を得た。 参考例 33 力二クイザル型変異を導入したヒ ト Nectin-2の動物細胞用発現べク ターの構築
117 参考例 4で作製した動物細胞用発現べクタ一 pcDNA3. 1 (+) - Nectin - 2 δを铸型と し、 制限酵素 Hindlllの認識配列を付加したプライマー 90 (配列番号： 90) とプ ライマー 91 (配列番号： 91)、 もしくは制限酵素 EcoRIの認識配列を付加したブラ イマ一 92 (配列番号： 92) とプライマー 93 (配列番号： 93) を用いて PCRを行つ た。 該反応における反応液の組成は pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2 δを 10 ng、 KOD-Plus-DNA Polymerase (T0Y0B0社） 1U、 プライマー 90 (配列番号： 90) とプ ライマー 91 (配列番号： 91)、 もしくはプライマー 92 (配列番号： 92) とプライマ 一 93 (配列番号： 93) を各 0. 3 ^ M、 dNTPs 200 μ M、 および 10x PCR Buffer (T0Y0B0 社） 5 Lの合計 50 μ Lとした。 PCRは、 95°C · 3分の後、 95°C · 30秒、 60°C · 30 秒、 68°C · 1分のサイクルを 35回繰り返した。 次に該 PCR産物を MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN社） を用いて精製した。 次に、 こうして得られた PCR 産物の混合物を鏡型とし、 プライマー 90 (配列番号： 90)とプライマー 92 (配列番 号： 92)を用いて PCR を行った。 該反応における反応液の組成は上記の精製 PCR 産物を各 5 /z L 、 KOD-Plus-DNA Polymerase 1U、 プライマー 90 (配列番号： 90)と プライマー 92 (配列番号： 92) 各 0. 3 Μ、 dNTPs 200 μ U および 10x PCR Buffer 5 μ Lの合計 50 μ Lとした。 PCRは、 95°C · 3分の後、 95°C · 30秒、 60°C · 30秒、 68°C · 1 分のサイクルを 20 回繰り返した。 次に該 PCR産物を MinElute PCR Purification Kitを用いて精製した後、 制限酵素 HindIII、 および EcoRIにて消 化し、 消化物を MinElute PCR Purification Kit を用いて精製した。 同様に pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen社）を制限酵素 Hindlllと EcoRIにて消化し、 ァガロー スゲル電気泳動後、 目的のベクター断片を MinElute Gel Extruction Kit (QIAGEN 社） を用いて精製した。挿入 DNA断片とベクター断片とを Ligation High (T0Y0B0 社） を用いてライゲーションさせた後、 大腸菌 Competent High DH5 a (T0Y0B0社） に導入し、アンピシリンを含む LB寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コ ロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、 ヒト Nectin- 2 δタン ノ、。ク質 （配列番号： 3 ) の 77番目の Alaが Proに、 78番目の Asnが Aspに変異 したタンパク質、 AN77- 78PDをコードする cDNA配列を有する動物細胞用発現べク タ一 pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2 (AN77 - 78PD)を得た。
次に参考例 4で作製した動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) -Nectin-2 δを錡 型とし、 制限酵素 Hindlllの認識配列を付加したプライマー 90 (配列番号： 90)
118 とプライマー 94 (配列番号： 94)、 もしくは制限酵素 EcoRIの認識配列を付加した プライマー 92 (配列番号： 92) とプライマー 95 (配列番号： 95) を用いて PCRを 行った。 該反応における反応液の組成は pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2 δを 10 ng、 KOD-Plus-DNA Polymerase 1U, プライマー 90 (配列番号： 90) とプライマー 94 (配 列番号： 94)、 もしくはプライマー 92 (配列番号： 92) とブラ'ィマー 95 (配列番号： 95) を各 0· 3 ^ Μ、 dNTPs 200 μ Μ、 および 10x PCR Buffer 5 Lの合計 50 μ Lとし た。 PCRは、 95°C · 3分の後、 95°C · 30秒、 60°C · 30秒、 68°C · 1分のサイクル を 35回繰り返した。 次に該 PCR産物を MinElute PCR Purification Kitを用いて 精製した。こうして得られた PCR産物の混合物を铸型とし、プライマー 90 (配列番 号： 90)とプライマー 92 (配列番号： 92)を用いて PCRを行った。該反応における反 応液の組成は上記の精製 PCR産物を各 、 KOD-Plus-DNA Polymerase 1U、 プ ライマー 90 (配列番号： 90)とプライマー 92 (配列番号： 92) 各 0. 3 μ M、 dNTPs 200 μ Μ、 および 10x PCR Buffer 5 μ Ιの合計 50 μ Lとした。 PCRは、 95°C · 3分の後、 95°C . 30秒、 60°C . 30秒、 68°C · 1分のサイクルを 20回繰り返した。 以下、 上 述と同様の方法により、 ヒト Nectin - 2 δタンパク質 （配列番号： 3 ) の 113番目 の Glyが Argに変異したタンパク質、 G113Rをコードする cDNA配列を有する動物 細胞用発現べクタ一 pcDNA3. 1 (+) -Nectin-2 (G113R)を得た。
次に参考例 4で作製した動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2 δを鎵 型とし、 制限酵素 Hindlll の認識配列を付加したプライマー 90 (配列番号： 90) とプライマー 96 (配列番号： 96)、 もしくは制限酵素 EcoRIの認識配列を付加した プライマー 92 (配列番号： 92) とプライマー 97 (配列番号： 97) を用いて PCRを 行った。 該反応における反応液の組成は pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2 δを 10 ng、 KOD-Plus- DNA Polymerase 1U、 プライマー 90 (配列番号： 90) とプライマー 96 (配列番号： 96)、 もしくはプライマー 96 (配列番号： 96) とプライマー 97 (配列 番号： 97.) を各 0. 3 /i M、 dNTPs 200 Μ および 10x PCR Buffer 5 μ Ι の合計 50 At Lとした。 PCRは、 95°C · 3分の後、 95°C · 30秒、 60°C · 30秒、 68°C · 1分のサ イタルを 35回繰り返した。 次に該 PCR産物を MinElute PCR Purification Kit を用いて精製した。次に、こうして得られた PCR産物を铸型とし、プライマー 90 (配 列番号： 90)とプライマー 92 (配列番号： 92)を用いて PCRを行った。該反応におけ る反応液の組成は上記の精製 PCR産物を各 5 L 、 KOD-Plus-DNA Polymerase 1U、
119 プライマー 90 (配列番号： 90)とプライマー 92 (配列番号： 92) 各 0. 3 /x M、 dNTPs200 μ Μ、 ぉょぴ10x PCR Buffer 5 i Lの合計50 Ju Lとした。 PCRは、 95°C · 3分の後、 95°C . 30秒、 60°C · 30秒、 68°C · 1分のサイクルを 20回繰り返した。 以下、 上 述と同様の方法により、 ヒ ト Nectin- 2 δタンパク質 （配列番号： 3 ) の 128番目 の Hisが Argに変異したタンパク質、 H128Rをコードする cf)NA配列を有する動物 細胞用発現べクタ一 pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2 (H128R)を得た。 参考例 34 Igl ドメインに 1ァミノ酸置換を行つたヒ ト Nectin- 2ED_Fcタンパク 質の動物細胞用発現ベクターの構築
参考例 15 にて作製した動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED - hFc を铸型とし、 Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene |±) を用いて Nectin- 2の Igl ドメイン 中 26力所のアミノ酸残基をコードする DNA 配列を、 該アミノ酸残基を各々 1箇所ずっァラニン残基あるいはグリシン残基に 置換するよう変異を加えた。 該反応における反応液の組成は上記発現プラスミ ド (20 ng/ μ L) 7 μ L、 lOxBuffer 35 μ L、 dNTP mix 7 μ L、 Quick Solution 21 レ Pfu Turbo DNA Polymerase (2. 5U/ μ L) 7 /z L に蒸留水を加え合計 300 μ L とし たものを 9 /i L ずつ 26本の PCR用チューブに分注し、 さらにそれぞれ 3. 7 μ Μの プライマー Q37A (配列番号： 98) およびプライマー Q37A R (配列番号： 99)、 もし くはプライマー P40G (配列番号： 100)およびプライマー P40G R (配列番号： 101)、 もしくはプライマー Q45A (配列番号： 102) およびプライマー Q45A R (配列番号： 103)、 もしくはプライマー Η55Α (配列番号： 104) およぴプライマー H55A R (配列 番号： 105)、 もしくはプライマー V60A (配列番号： 106) およびプライマー V60A R (配列番号： 107)、 もしくはプライマー Υ64Α (配列番号： 108) およびプライマー Y64A R (配列番号： 109)、 もしくはプライマー Q71A (配列番号： 110) およびプラ イマ一 Q71A R (配列番号： 111)、 もしくはプライマー A75G (配列番号： 112) およ びプライマー A75G R (配列番号： 113)、 もしくはプライマー P76G (配列番号： 114) およびプライマ一 P76G R (配列番号： 115)、 もしくはプライマー A77G (配列番号： 116) およぴプライマー A77G R (配列番号： 117)、 もしくはプライマー Ν78Α (配列 番号： 118) およびプライマー N78A R (配列番号： 119)、 もしくはプライマー Η79Α (配列番号： 120) およぴプライマー H79A R (配列番号： 121)、 もしくはプライマ
120 一 Q80A (配列番号： 122) およびプライマー Q80A R (配列番号： 123)、 もしくはプ ライマー N81A (配列番号： 124) およぴプライマー N81A R (配列番号： 125)、' もし くはプライマー K88A (配列番号： 126)およびプライマー K88A R (配列番号： 127)、 もしくはプライマー S95A (配列番号： 128) およびプライマー S95A R (配列番号： 129)、' もしくはプライマー K109A (配列番号： 130) およびプライマー K109A R (配 列番号： 131)、 もしくはプライマー E117A (配列番号： 132)およぴプライマー E117A R (配列番号： 133)、 もしくはプライマー D122A (配列番号： 134) およぴプライマ 一 D122A R (配列番号： 135)、 もしくはプライマー H128A (配列番号： 136) および プライマー H128A R (配列番号： 137)、 もしくはプライマー N137A (配列番号： 138) およびプライマー N137A R (配列番号： 139)、 もしくはプライマー F145A (配列番 号： 140) およ プライマー F145A R (配列番号： 141)、 もしくはプライマー K147A (配列番号： 142) およびプライマー K147A R (配列番号： 143)、 もしくはプライ マー V150A (配列番号： 144) およびプライマー V150A R (配列番号： 145)、 もしく はプライマー M153A (配列番号： 146)およびプライマー M153A R (配列番号： 147)、 もしくはプライマー T154A (配列番号： 148)およびプライマー T154A R (配列番号： 149) の糸且み合わせでそれぞれのプライマーを 0. ずつ添カ卩したものとした。
PCRは 95°C · 1分の後、 95°C · 50秒、 60°C · 50秒、 68°C · 7分 40秒のサイクル を 18回繰り返した後に、 68°C · 7分の反応を行った。 反応後、 26本の PCR液に 制限酵素 Dpnl (2U/ μ L) を 1 /i Lずつ添カ卩し、 37°C · 1時間反応させた。 これら の反応混合液 を大腸菌 XL10 - Gold ultracompetent cells 20 μ L に導入し、 アンピシリンを含む LB寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌コロニーから 回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、 Nectin - 2ED-Fc (配列番号： 37) の 37番目の Ginが Alaに変異したタンパク質 Q37Aをコードする 0DNA配列を有す る動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (Q37A)、 Nectin- 2ED-Fc (配列番号： 37) の 40番目の Proが Glyに変異したタンパク質 P40Gをコードす る cDNA配列を有する動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) -Nectin - 2ED-Fc (P40G)、 Nectin- 2ED - Fc (配列番号： 37)の 45番目の Ginが Alaに変異したタンパク質 Q45A を コ ー ドす る cDNA 配列 を 有す る 動物細胞用 発現べ ク タ ー pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (Q45A)、 Nectin- 2ED-Fc (配列番号： 37) の 55番目 の Hisが Alaに変異したタンパク質 H55Aをコードする cDNA配列を有する動物細
121 胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (H55A)、 Nectin - 2ED-Fc (配列番 号： 37) の 60番目の Valが Alaに変異したタンパク質 V60Aをコードする cDNA 配列を有する動物細胞用発現べクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin - 2ED- Fc (V60A)、 Nectin- 2ED-Fc (配列番号： 37)の 64番目の Tyrが Alaに変異したタンパク質 Y64A を コ ー ドす る cDNA 配列 を 有す る 動物細胞用 発現べ ク タ ー pcDNA3. l (+) -Nectin-2ED-Fc (Y64A)、 Nectin- 2ED-Fc (配列番号： 37) の 71番目 の Ginが Alaに変異したタンパク質 Q71Aをコードする cDNA配列を有する動物細 胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin - 2ED_Fc (Q71A)、 Nectin- 2ED-Fc (配列番 号： 37) の 75番目の Alaが Glyに変異したタンパク質 A75Gをコードする cDNA 配列を有する動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin-2ED - Fc (A75G)、 Nectin-2ED-Fc (配列番号： 37)の 76番目の Proが Glyに変異したタンパク質 P76G を コ ー ドす る cDNA 配列 を有す る 動物細胞用 発現べ ク タ ー pcDNA3. l (+) -Nectin-2ED-Fc (P76G)、 Nectin- 2ED-Fc (配列番号： 37) の 77番目 の Alaが Glyに変異したタンパク質 A77Gをコードする cDNA配列を有する動物細 胞用発現ベクター PcDNA3. 1 (+) - Nectin - 2ED-Fc (A77G)、 Nectin- 2ED-Fc (配列番 号： 37) の 78番目の Asn ifi Alaに変異したタンパク質 N78Aをコードする cDNA 配列を有する動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) -Nect in-2ED - Fc (N78A)、 Nectin - 2ED-Fc (配列番号： 37)の 79番目の His力 S Alaに変異したタンパク質 H79A を コ ー ドす る cDNA 配列 を 有す る 動物細胞用 発現べ ク タ ー pcDNA3. l (+) -Nectin-2ED-Fc (H79A)、 Nectin- 2ED-Fc (配列番号： 37) の 80番目 の Ginが Alaに変異したタンパク質 Q80Aをコードする cDNA配列を有する動物細 胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED - Fc (Q80A)、 Nectin- 2ED - Fc (配列番 号： 37) の 81番目の Asnが Alaに変異したタンパク質 N81Aをコードする cDNA 配列を有する動物細胞用発現べクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin - 2ED - Fc (N81A)、 Nectin-2ED-Fc (配列番号： 37)の 88番目の Lysが Alaに変異したタンパク質 K88A を コ ー ドす る cDNA 配列 を 有す る 動物細胞用 発現べ ク タ ー pcDNA3. 1 (+)- Nectin- 2ED - Fc (K88A)、 Nectin-2ED-Fc (配列番号： 37) の 95番目 の Serが Alaに変異したタンパク質 S95Aをコードする cDNA配列を有する動物細 胞用発現べクタ一 pcDNA3. 1 (+) -Nectin-2ED-Fc (S95A)、 Nectin - 2ED-Fc (配列番 号： 37) の 109番目の Lysが Alaに変異したタンパク質 K109Aをコードする cDNA
122 配列を有する動物細胞用発現べクタ一 pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED- Fc (K109A)、 Nectin-2ED-Fc (配列番号： 37) の 117番目の Gluが Alaに変異したタンパク質 E117A を コー ドする cDNA 配列を有する動物細胞用発現ベク ター pcDNA3. l (+) -Nectin-2ED-Fc (E117A)、 Nectin- 2ED- Fc (配列番号： 37) の 122番 目の Aspが Alaに変異したタンパク質 D122Aをコードする ci)NA配列を有する動物 細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED- Fc (D122A)、 Nectin - 2ED-Fc (配列 番号： 37)の 128番目の Hisが Alaに変異したタンパク質 H128Aをコードする cDNA 配列を有する動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED- Fc (H128A)、 Nectin-2ED-Fc (配列番号： 37) の 137番目の Asnが Alaに変異したタンパク貧 N137A を コー ドする cDNA 配列を有する動物細胞用発現べク ター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (N137A)、 Nectin - 2ED-Fc (配列番号： 37) の 145番 目の Pheが Alaに変異したタンパク質 F145Aをコードする cDNA配列を有する動物 細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED - Fc (F145A)、 Nectin- 2ED - Fc (配列 番号： 37)の 147番目の Lysが Alaに変異したタンパク質 K147 A'をコードする cDNA 配列を有する動物細胞用発現べクタ一 pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (K147A)、 Nectin- 2ED-Fc (配列番号： 37) の 150番目の Valが Alaに変異したタンパク質 V150A を コー ドする cDNA 配列を有する動物細胞用発現べク ター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (V150A)、 Nectin - 2ED-Fc (配列番号： 37) の 153番 目の Metが Alaに変異したタンパク質 M153Aをコードする cDNA配列を有する動物 細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin - 2ED- Fc (M153A)、 Nectin- 2ED_Fc (配列 番号： 37)の 154番目の Thrが Alaに変異したタンパク質 T154Aをコードする cDNA 配列を有する動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) -Nectin-2ED-Fc (T154A)をそ れぞれ得た。 ' 参考例 35 Ig2 ドメインに 1ァミノ酸置換を行つたヒ ト Nectin- 2ED - Fcタンパク 質の動物細胞用発現ベクターの構築
参考例 15 にて作製した動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED - hFc を铸型とし、 Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene |±) を用いて Nectin- 2の Ig2 ドメイン中 13力所のアミノ酸残基をコードする DNA配 列を、 該アミノ酸残基を各々 1箇所ずっァラニン残基あるいはグリシン残基に置
123 換するよう変異を加えた。 該反応における反応液の組成は上記発現ベクター（20 ng/ μ ΐ) 3· 5 μ L、 lOxBuffer 17. 5 L、 dNTP mix 3. 5 μ L、 Quick Solution 10. 5 /i L、 Pfu Turbo DNA Polymerase (2. 5U/ μ L) 3. 5 L に蒸留水を加え合計 150 μ L としたものを ずつ 13本の PCR用チューブに分注し、 さらにそれぞれ 3. 7 のプライマー Q165A (配列番号： 150) およぴプライマー Q165A R (配列番号：
151)、 もしくはプライマー K170A (配列番号： 152) およぴプライマー K170A R (配 列番号： 153)、もしくはプライマー F173A (配列番号： 154)およびプライマー F173A R (配列番号： 155)、 もしくはプライマー P177G (配列番号： 156) およびプライマ 一 P177G R (配列番号： 157)、 もしくはプライマー I184A (配列番号： 158) および プライマー I184A R (配列番号： 159)、 もしくはプライマー K186A (配列番号： 160) およびプライマー K186A R (配列番号： 161)、 もしくはプライマー L197A (配列番 号： 162) およぴプライマー L197A R (配列番号： 163)、 もしくはプライマー W202A (配列番号： 164) およびプライマー W202A R (配列番号： 165)、 もしくはプライ マー Ε206Α (配列番号： 166) およびプライマー Ε206Α R (配列番号： 167)、 もしく はプライマー T212A (配列番号： 168)およびプライマー T212A R (配列番号： 169)、 もしくはプライマー Τ235Α (配列番号： 170)およぴプライマー T235A R (配列番号： 171)、 もしくはプライマー Κ239Α (配列番号： 172) およびプライマー Κ239Α R (配 列番号： 173)、 もしくはプライマー A249G (配列番号： 174)およびプライマー A249G R (配列番号： 175) の組み合わせでそれぞれのプライマーを 0. 5 /z Lずつ添加し たものとした。 PCRは 95°C · 1分の後、 95°C · 50秒、 60°C · 50秒、 68。C · 7分 40 秒のサイクルを 18 回繰り返した後に、 68°C · 7分の反応を行った。 反応後、 13 本の PCR液に制限酵素 Dpnl (2υ/ μ Ι) を 1 Lずつ添カ卩し、 37°C · 1時間反応さ せた。 これらの反応混合液 2 Ai Lを大腸菌 XL10 - Gold ultracompetent cells 20 μ L に導入し、アンピシリ ンを含む LB寒天培地中で選択培養した。増殖した大腸菌 コロニーから回収した個々の遺伝子クローンの配列を解析し、 Nectin - 2ED-Fc (配 列番号： 37) の 165番目の Ginが Alaに変異したタンパク質 Q165Aをコードする cDNA配列を有する動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED- Fc (Q165A)、 Nectin-2ED-Fc (配列番号： 37) の 170番目の Lysが Alaに変異したタンパク質 K170A を コー ドする cDNA 配列を有する動物細胞用発現べク ター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (K170A)、 Nectin - 2ED - Fc (配列番号： 37) の 173番
124 目の Pheが Alaに変異したタンパク質 F173Aをコードする cDNA配列を有する動物 細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED_Fc (F173A)、 Nectin- 2ED-Fc . (配列 番号： 37)の 177番目の Pro.が Glyに変異したタンパク質 P177Gをコードする cDNA 配列を有する動物細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED - Fc (P177G)、 Nectin-2ED- Fc (配列番号： 37) の 184番目の lieが Alaに変異したタンパク質 I184A をコー ドする cDNA 配列を有する動物細胞用発現べク ター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (I184A)、 Nectin- 2ED-Fc (配列番号： 37) の 186番 目の Lysが Alaに変異したタンパク質 K186Aをコードする cDNA配列を有する動物 細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin-2ED- Fc (K186A)、 Nectin- 2ED - Fc (配列 番号： 37)の 19†番目の Leuが Alaに変異したタンパク質 L197Aをコードする cDNA 配列を有する動物細胞用発現べクタ一 pcDNA3. 1 (+) - Nectin-2ED- Fc (L197A)、 Nectin-2ED-Fc (配列番号： 37) の 202番目の Trpが Alaに変異したタンパク質 W202A をコー ドする cDNA 配列を有する動物細胞用発現べク ター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (W202A)、 Nectin- 2ED-Fc (配列番号： 37) の 206番 目の Gluが Alaに変異したタンパク質 E206Aをコードする cDNA配列を有する動物 細胞用発現ベクター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED- Fc (E206A)、 Nectin- 2ED - Fc (配列 番号： 37)の 212番目の Thrが Alaに変異したタンパク質 T212Aをコードする cI?NA 配列を有する動物細胞用発現ベクター pcDNA3. l (+) -Nectin-2ED-Fc (T212A)、 • Nectin- 2ED-Fc (配列番号： 37) の 235番目の Thrが Alaに変異したタンパク質 T235A をコー ドする cDNA 配列を有する動物細胞用発現べク ター pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (T235A)、 Nectin- 2ED-Fc (配列番号： 37) の 239番 目の Lysが Alaに変異したタンパク質 K239Aをコードする cDNA配列を有する動物 細胞用発現べクタ一 pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED - Fc . (K239A)、 Nectin- 2ED-Fc (配列 番号： 37)の 249番目の Alaが Glyに変異したタンパク質 A249Gをコードする cDNA 配列を有する動物細胞用発現べクタ一 pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (A249G)を得 た。 ' 実施例 1 抗 Nectin- 2 ヒ トモノクローナル抗体の作製
参考例 I6で調製した Nectin- 2ED-Fcタンパク質 （1. 6 mg/mL PBS溶液） または 参考例 I3で調製した Nectin- 2ED - FLAGタンパク質 （2 mg/raL PBS溶液） とフロイ
125 ンド完全アジュバント（Difco社）とを等容量混合して調製したエマルションを KM マウス.（10週齢、 12週齢、 雄；キリンビール (株)） 各 5匹の皮下および皮内にそ れぞれ 5011 g/匹で免疫した。 2回目以降はこれらの組換え型 Nectin - 2細胞外領域 タンパク質とフロインド不完全アジュバント（Difco社）とを等量混合して調製し たエマルシヨンを同様に 2週間毎に追加免疫した。
また、 参考例 19で樹立した Nectin- 2 δ安定発現 FM3A細胞株 （#60-6) と参考 例 18で樹立した Nectin-2 δ安定発現 NS0細胞株 （#2-75) をフラスコ培養し、 そ れぞれ遠心分離 （1, 200 rpm x 5 分） によって細胞を回収し、 RPMIIMO 培地 (Invitrogen社) に再懸濁後、 遠心分離 (1, 200 rpm x 5分) によって細胞を回 収することを 3 回繰り返し、 血清成分を除去した。 回収した各細胞を RPMI1640 培地に 5 X 107個/ mLになるよう再懸濁させ、 RPMI 1640培地に溶解させたマイト マイシン C (和光純薬㈱） を最終濃度 20 ^ gAiLになるよう添加し、 37°Cで 30分 間ィンキュベートした。 マイトマイシン C処理した両細胞株を 10 mLの PBSで同 様に 3回洗浄後、 2 X 107個/ mLになるよう PBSに再懸濁させたものを KMマウス (10週齢一12週齢、 雄） 各 5匹の腹腔内に 1 X 107個/ 500 μ ίずつ 1週間毎に繰 り返し免疫した。
また Nectin - 2ED_Fcタンパク質または Nectin - 2ED- FLAGタンパク質とフロイン ド完全アジュバントとを等容量混合して調製したエマルシヨンを KMマウス （12 週齢、 雄） 各 5匹の皮下および皮内にそれぞれ 50 g/匹で免疫し、 初回免疫の 1 週間後に上記の方法によりマイトマイシン C処理した Nectin- 2 δ発現 FM3A細胞 株を 1 X 107 個/ 500 μ Ι^ ずつ腹腔内に免疫した。 3 回目は Nectin- 2ED-Fc、 Nectin- 2ED- FLAG とフロインド不完全ァジュバントとを等容量混合して調製した エマルシヨンを皮下おょぴ皮内にそれぞれ 50 μ g./匹で免疫し、同時に上記の方法 によりマイトマイシン C処理した Nectin- 2 δ発現 FM3A細胞株（#60-6) を 1 x 107 ■個/ 500 ; .Lずつ腹腔内に免疫した。 4回目以降は上記の方法によりマイトマイシン C処理した Nectin- 2 δ発現 FM3A細胞株 （#60-6) のみを 1 x 107個/ 500 z Lずつ 腹腔内に免疫した。
免疫開始前おょぴ 3回目の免疫 1週間後に全てのマウスからエーテル麻酔卞、 眼底採血して抗血清を取得し、 以下に述べるフローサイトメトリー法により血清 抗体価を調べた。 すなわち、 参考例 20で樹立した Nectin-2 δ安定発現 CH0細胞
126 株 （#43-2) と mock- CHO細胞株の細胞懸濁液 （PBS) をそれぞれ 5 x 105個ずっポ リプロピレンチューブに分注し、 遠心分離 （1, 200 rpm x 5分） により PBSを除 去した。 これらの細胞残渣を、 1% BSAおよび 10% FBS含有 PBSで 100倍希釈した 上記マウス抗血清 50 μ Lずつに再懸濁させ、氷上暗所で 30分間反応させた。 この 細胞懸濁液に PBSを 200 // L加え遠心分離 （1， 200 rpm x 5分） した後、 上澄液を 吸引除去し、 細胞残渣を 1% BSAおよび 10%. FBS含有 PBS で 100倍希釈した Anti-human IgG (H+L) Alexa 488 (Invitrogen社） 溶液 50 μ Lに再懸濁させ、 氷上喑所で 30分間反応させた。 この細胞懸濁液を同様に PBSで 3回洗浄した後、 細胞残渣を PBS 200 /i L に再懸濁させ、 フローサイトメーター MPL500 (BECKMAN COULTER社） を用いて各細胞の蛍光強度を測定し、 横軸に蛍光強度を縦軸に細胞 数をとつたグラフを作成して血清抗体価を比較した。
上記の方法で十分な血清抗体価上昇が確認された KMマウスに、 Nectin- 2ED- Fc または Nectin- 2ED- FLAGを免疫した個体にはこれらのタンパク質抗原を 10 μ g/匹 ずつ尾静脈注射し、また Nect in-2 5安定発現細胞株を免疫した個体には同細胞株 を 1 X 107個ずつ腹腔内注射した。 これらの最終免疫 3日後に該マウスを放血死 させて脾臓を摘出し、得られたマウス脾臓細胞とあらかじめ 10% FBS含有 Daigo T 培地 (F-12 Nutrient Mixture (HAM) (Invitrogen f±) と Iscove s Modified Dulbecco' s Medium (Invitrogen社） との等量混合培地に MEM Non-Ess ential Amino Acid Solution (丄 nvitrogenネェ、 Sodium Pyruvate (Invitrogen千土)、 およ ぴ L- Glutamine (Invitrogen社） を添加したもの） 500 mLに対し 8 - Azaguanine (Sigma社) 1パイアルを溶解させた培地で馴化培養しておいたマウスミエローマ 細胞 （P3X63Ag8U. 1 (P3U1) ) とを 5 : 1 の割合で混合し、 ボリエチレングリコール (PEG) 1, 500 (Roche Diagnotics社） を用いて融合させた。 細胞融合操作は試薬 に添付のマニュアルに従って行った。 融合後の細胞を 10% FBS および 10% BM Condimed HI (Roche Diagnot ics社） 含有 Daigo T培地に再懸濁させ、 96ゥエル 培養プレートに脾臓細胞 5 X 104個/ 100 ゥエルで播種したものを 5%炭酸ガス 気流中、 37°Cで 1日間培養した後、 0. I mMヒポキサンチン、 0. 4 /z Mアミノプテリ ン、 0. 016 mMチミジン （HAT)、 10% BM Condimed HIぉょぴ 10% FBS含有 Daigo T 培地 （HAT選択培地） を 100 μ !7ゥ ル添加し、 さらに 5%炭酸ガス気流中、 37°C で培養を継続し、 3日毎に 2回、 培養上清の 3/4を新鮮な HAT選択培地に交換し
127 た。
培養.7 日目〜 14 日目にかけてコロニーの増殖が見られたゥエルの培養上清を Nectin-2 δ安定発現 CH0細胞株 （#43-2) または mock- CH0細胞株を用いた Cell ELISAに供し、抗 Nectin-2 ヒトモノク口ーナル抗体産生ハイブリ ドーマをスクリ 一二ングした。 すなわち、 Nectin- 2 δ安定発現 CH0細胞株 ' (#43- 2) と mock— CH0 細胞株を 10%透析 FBS、および GS supplementを含有する GS選択 DMEM培地を用い て 96ゥエル組織培養プレートで培養し、各細胞株がコンフルェントに達したプレ 一トの培養上清を吸引除去した後、 2% FBS含有 PBS (+)を 200 L/ゥヱル添加し、 氷上喑所で 1時間ィンキュベートした。 各ゥエルの上澄液を吸引除去し、 ハイブ リ ドーマ培養上清を 50 μ L/ゥェルずつ添加し、氷上喑所で 2時間反応させた。 こ のプレートを 4°Cに冷やした PBS (+) で 1回洗浄したあと、' 2% FBS含有 PBS (+) で 3, 000倍希釈した Anti-human IgG (H+L) chain specific (GOAT) peroxidase conjugate (CALBI0CHEM社） を 100 L/ゥェルずつ添加し、氷上喑所で 2時間反応 させた。 プレー トを 4 °Cに冷やした PBS ( + ) で 3 回洗浄した後、 3, 3' ， 5， 5' tetramethylbenzidine ( TMB ) 溶液 ( SureBlue Microwell TMB peroxidase substrate； Kirkegaard & Perry Laboratories社) 100 /z L/ヮェノレ ずつ添加し、 室温 5分間発色させ、 2 N硫酸 （和光純薬㈱） を 100 L/ゥ ルずつ 添加して酵素反応を停止させた。 各ゥエルの吸光度 （450 ηπι) をプレートリーダ 一 (Multiskan BICHR0MATIC； Thermo Electron Co. ) を用いて測定し、 Nectin - 2 発現 CH0細胞株プレートの吸光度が 0. 5以上かつ mock- CH0細胞株プレートの吸光 度が 0. 3未満のものを陽性ゥエルと判定した。 これらの中から特に抗原特異性と 親和性の高そうな IgG抗体産生ハイブリ ドーマを選択し、 10% FBSおよび 10%擺 Condimed HI含有 Daigo T培地に再懸濁させた後.、 96ゥェル組織培養プレートに 0. 5個/ゥエルで播種し、顕微鏡観察によりモノクローンである事を確認したハイ ブリ ドーマの培養上清を上記 Cel l ELISAで再度スクリ一二ングして抗 Nectin- 2 ヒトモノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマ ·クローンを樹立した。 こうして得 た 256種類の抗 Nectin - 2ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマを 100 mL の 10% FBS, Ultra low IgG (Invitrogen ¾：) 含有 Daigo T培地中でフラスコ培養 し、 培養上清を遠心分離 （1，200 rpm x 5分） してモノクローナル抗体を含有す る上澄液を取得した。 これらの培養上清に PBS で平衡化したプロテイン A
128 Sepharosfe FF 200 L (Amersham Biosciences社 GE Healthcare社に社名変更) を添加し 4°Cで終夜緩やかに振とうさせて抗体を吸着させた。 このプロテイン A 担体を遠心分離操作により回収し、 PBSで洗浄後、 0. 3 M NaCl含有 0. 1 M グリシ ン- HC1 (pH3. 0) 1. 2 mLにて IgG画分を溶出した。 この溶出液を 1 M Tris-HCl (pH 8. 0) を用いて速やかに中和した後、 限外濾過膜 （ビバスピン 6 :分画分子 量 lO kDa) (Sartorius社）を用いた限外濃縮操作により PBSにバッファー置換し、 これを抗 Nectin - 2 ヒ トモノクローナル抗体標品として下記の in 性状解析 に用いた。 実施例 2 抗 Nectin-2ヒ トモノク口—ナル抗体の結合活性
抗 Nectin-2 ヒ トモノクローナル抗体の結合親和力は実施例 1 に示した Nect in-2 安定発現 CH0細胞株を用いた Cell ELISA に実施例 1で調製した抗 Nectin-2ヒトモノクローナル抗体を 2% FBS含有 PBS ( + ) で段階希釈したものを 供し、濃度依存性曲線を作成することにより各抗体の EC5 Q値を相対評価した。各 モノクローナル抗体の抗原特異性は Nectin_2安定発現 CH0細胞株プレートに対す る結合性と mock - CH0細胞株プレートに対する結合性との比較により確認した。各 抗 Nectin- 2ヒトモノクローナル抗体の EC5。をまとめて表 3に示す。 実施例 3 抗 Nectin-2 ヒ トモノクローナル抗体のサブクラス
実施例 1で取得した抗 Nectin - 2ヒトモノクローナル抗体のサブクラスを以下に 示す ELISAにより同定した。 ヒ ト 、 IgGい IgG3、 IgG4、 IgMの H鎖およびヒ ト κ鎖を特異的に認識する 6種類の抗体（Anti- human IgGi， Fc Fragment (Mouse) , purified ; CALBIOCHEM社、 Ant i -human IgG2 , Fc Fragment (Mouse) ， purified； CALBI0CHEM社、 Mouse Anti-Human IgG3 ； Zymed社、 Ms x Hu IgG4 Fc； CHEMIC0N 社、 Monoclonal Mouse Ant i -Human- IgM； Zymed社、 Goat ant i -Human Kappa Light Chain Antibody b+f affinity purified； Bethyl社） をそれぞれ 50 mM炭酸ナト リゥム-重炭酸ナトリゥム緩衝液 (pH 9. 6) で 2 / g/mL の濃度に希釈し、 これを 96穴ハーフゥエルィムノプレート (Costar社) に 50 μ L/ゥェルずつ添加しそ室 温 5 時間反応させた。 各ゥエルから反応液を除去した後 25%プロックエース (DAINIPP0N PHARMACEUTICALS社） 含有蒸留水を 100 ju L/ゥエルずつ添加し 4°C、
129 終夜ブ口ッキングした。
このように作製した ELISA用プレートを 0. 05% Tween20含有 PBSで 2回洗浄し た後、実施例 1で精製取得した各抗 Nect in - 2ヒ トモノクローナル抗体を 10%プロ ックエース含有蒸留水で l g/mLに希釈調製したものを 50 ゥェル添加し、室 温 2時間反応させた。このプレートを 0. 05% Tween20含有 PB$で 4回洗浄した後、 10%ブロックエース含有蒸留水で 5, 000倍希釈した Anti - IgG+IgA+IgM (H+L) ， Human, Goat, Horseradish Peroxidase (Zymed |±) を 50 L/ゥェル つ添カロし、 室温 2時間反応させた。さらにプレートを 0. 05% Tween20含有 PBSで 6回洗浄し、 TMB溶夜 (SureBlue Mi cr owe 11 TMB peroxidase substrate) を 50 L /ウエノレずっ 添加後室温 2分間発色させ、 2 N硫酸 （和光純薬㈱） を 50 ゥエルずつ添カロし て酵素反応を停止させた。 各ゥュルの吸光度 （450 nm) をプレートリーダー (Multiskan BICHR0MATIC) を用いて測定し、他と比べて有意に高い吸光度を示す ゥエルに固定ィヒされた抗体の抗原特異性から各抗体のサブクラスを同定した。 そ の結果を表 3 Aに示す。 実施例 4 抗 Nectin - 2ヒトモノクローナル抗体のェピトープによるグノレーピング 実施例 1で取得した抗 Nectin - 2ヒ トモノクローナル抗体を、その認識ェピトー プの違いによりグループ化した。 以下にその方法を示す。 抗体同士の拮抗阻害反 応を行うため、 実施例 1 で取得したモノクローナル抗体のうち 187 種類の抗 Nectin - 2 ヒ トモノクローナル抗体をビォチン標識した。 すなわち、 抗 Nect in - 2 ヒトモノクローナル抗体 を Biotin Labeling Kit- NH2 (Dojindo社） に付属 の WS Buffer 50 z Lに添カ卩し、 Microcon YM50 (MILLIP0RE社） を用いて溶液量が ほとんど無くなるまで限外濃縮した。 この残液に Biotin Label ing Kit - NH2に付 属の Reaction Buffer 0 μ ΐ t 50 z Lの DMSO こ溶角军した NH2 Reactive Biotin 4 しとを順次添加し、 37°Cで 10分間反応させた。 この反応混合物を再度限外濃縮 操作により WS Bufferにバッファ一置換し、 Biotin標識抗 Nectin- 2 ヒ トモノク 口一ナル抗体を得、 これらを以下に示すアツセィに使用した。 実施例 1で取得し た抗 Nectin - 2ヒトモノクローナル抗体の ¾ FBS含有 PBS溶液（25 g/mL) 5 'Lと Nectin-2 δ安定発現 CH0細胞株の 2% FBS含有 PBS懸濁液（2 x 105個/ mL) 15 μ L、 およぴ Streptavidin - Alexa Fluor 647 conjugate (Invitrogen社) 5 μ L ¾r FMAT
130 plate (384well plate Black/Clear Bottom with Lid； Applied Biosystems社) に添カ卩し、混合した後室温で 10分間反応させた。このプレートに上記の方法で作 製した Biotin化抗 Nectin- 2ヒトモノクローナル抗体の 2% FBS含有 PBS溶液（0. 5 μ g/mL) 5 μ Ιを添加し、 室温で 60分間ィンキュベートした。 対照実験として非 標識抗 Nectin- 2モノクローナル抗体溶液の代わりに 2% FBS含有 PBSを添加した ゥヱルを設けた。 この拮抗阻害反応ビォチン標識に供した全ての抗体の組合せに つレヽて行った。 このプレー卜を Appl ied Biosystems 8200 Cellular Detection システム（Applied Biosystems社）にセットし、各ゥヱルの蛍光強度を測定した。 各抗 Nectin- 2 ヒトモノクローナル抗体の組合せにおける拮抗阻害率は以下に示 す式を用いて算出した。
拮抗阻害率 = (1-A/B) X 100
A；非標識抗体を添加したゥエルの FL1 total値
B；非標識抗体を添加していないゥエルの FL1 total値
各抗体の組合せについて、 この計算式で得られたおける P且害率を多変数解析ソフ 卜、 SpotFire DecisionSite for Lead Discovery (Spotf ire社)を用レヽて角 rrし、 そこで得られた樹形図から抗 Nectin- 2 ヒトモノク口一ナル抗体をェピトープに よりグループ化し、 その結果として Iから VIIの 7個の大きなグループに属する 抗体と、 どのグループにも属さない抗体に分類した。各抗 Nectin- 2 ヒトモノクロ ーナル抗体のェピトープグループをまとめて表 4に示す。 実施例 5 抗 Nectin - 2ヒ トモノクローナル抗体の Nectin- 2 - Nectin - 3 トランス結 合阻害活性
Nectin - 2ほ Nectin - 3 とへテロフィリックにトランス結合することが知られて いる。 実施例 1 で取得した各抗 Nectin- 2 ヒ トモノ ク ローナル抗体の Nectin- 2- Nectin- 3 トランス結合阻害を下記に示すビアコア （Biacore2000 ； Biacore社 GE Healthcare社に社名変更） 測定法で定量的に評価した。 センサー チップ CM5 (Biacore社 GE Healthcare社に社名変更）を Biacore2000に装着し、 下記の方法により Nectin-3ED- Fcタンパク質固定ィ匕チップを作製した。すな ち、 HBS-EP buffer (Biacore社 GE Healthcare社に社名変更） をランニングバッフ ァ一として用い、 Amine Coupling kit (Biacore社 GE Healthcare社に社名変更）
131 —に付属の ' N - ethyl-N' - (3-dimethylaminopropyl) carbodi imide hydrochloride (EDC) N-hydroxysuccinimide (NHS) とを蒸留水に溶解させて調製した溶液を 100 /i Lずつ等量混合し、流速 10 μ ΐ7分で 7分間センサーチップに通液した後、参 考例 22で調製した Nectin- 3ED- mFc (Img/mL PBS溶液）を 10 mM酢酸緩衝液（pH 5. 0) (Biacore社 GE Healthcare社に社名変更）で Ιβθ μ g/mLに希釈調製したものを 流速 10 μ L/分で 7分間センサーチップに通液し、チップ上に該タンパク質を固定 ィ匕した。次いで同キットに付属のエタノールァミン溶液を流速 10 μ ΐ 分で 7分間 センサーチップに通液し、 残った活性 NHS基をブロッキングした。 さらに 10 mM NaOHを流速 10 μ L/分で 1分間通液し、センサーチップを洗浄した。 このようにし て作製した Nectin - 3ED- mFc タンパク質固定化センサーチップに対し、 Nectin - 2ED— hFcタンパク質溶液 （80 μ g/mL HBS-EP buffer) と抗 Nectin- 2 ヒ ト モノクローナル抗体溶液もしくはコントロールヒト抗体溶液 （Human IgG Whole molecule Chrora Pure； Jackson社） (60 μ g/mL HBS-EP buffer) との等容量混合 液を流速 20 L/分で 2分間通液し、 レスポンスの変化を記録し、 下記の計算式に より Nectin- 2- Nectin- 3 トランス結合阻害率を算出した。
Nectin- 2 - Nectin - 3 トランス結合阻害率 （％) = (A-B) x 100 / A
A : コントローノレ抗体を用いたときのレスポンス
B：抗 Nectin - 2ヒ トモノクローナル抗体を用いたときのレスポンス
各抗 Nectin- 2ヒ トモノクローナル抗体の Nectin - 2- Nectin- 3のトランス結合阻害 活性をまとめて表 5に示す。 実施例 6 0V-90 ヒト卵巣癌細胞株を用いた抗 Nectin- 2 ヒトモノクローナル抗体 の細胞増殖阻害活性
実施例 1で取得した各抗 Nectin- 2ヒ トモノクローナル抗体の in vitroにおけ る 0V - 90.ヒト卵巣癌細胞株増殖阻害活性を下記の方法により測定した。 0V - 90細 胞株の培養には、 15% FBS (JRH社）を含む MCDB105 (Sigma社） i Mediuml99 (Sigma 社） との等量混合培地を用い、 1 日置きに 1枚あたり 4. 5 X 105個の細胞密度で 10 cm組織培養シャーレ （Becton Dickinson社） に播種し、. 5%炭酸ガス気流 ψ、 37°Cで培養する事により継代した。 0V-90 細胞株のシャーレからの剥離は、 Collagenase N - 2 (Nitta Gelatin ±) 400 Uで 37°C 2分間処理し、 さらに Cel l
132 Dissociation Buffer ' (Invitrogen社） 2 mLを加えて 37°C、 15分間処理すること により行った。 こうして得た細胞懸濁液を遠心分離 （1000 rpm、 3分） して回収 した細胞を 1% FBS含有 MCDB105/Mediuml99等量混合培地に 3 x 104個/ mLの密度 で再懸濁させた。
実施例 1で取得した抗 Nectin- 2ヒ トモノクローナル抗体、 参考例 14で作製し た抗 Nectin-2 ポリクローナル抗体 （N2 - No. 1)、 およびコントロールヒ ト抗体 (Human IgG Whole molecule Chrom Pure； Jackson社） をそれぞれ PBSで 300 g/mLに調製した溶液、もしくは PBSを 96穴細胞培養用プレート（Becton Dickinson 社） に 10 L/ゥヱルずつ添加し、 上記の 0V- 90細胞懸濁液を 100 i L/ゥェルずつ 添加した。また下記の細胞増殖阻害率測定時のバックグラウンド値を測定する為、 PBS 10 U Lに同培地 IOO Lを加えたゥエルを準備した。 このプレートを 5%炭酸 ガス気流中、 37°Cで 6日間ィンキュベートした後、 細胞増殖測定用試薬 WST-8溶 液 （Cell Counting kit- 8； Do j indo社） を 10 μ L/ゥエルずつ添加し、 プレートを 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 1時間ィンキュベートした後、 生成ホルマザンに由来 する各ゥエルの吸光度 （450 nm) をプレートリーダー （Multiskan BI CHROMATIC) を用いて測定し、 下記の計算式により 0V-90細胞株増殖阻害率を算出した。
細胞増殖阻害率二 [ (A-B) - (C-B) ] X 100/ (A-B)
A： コントロールヒト抗体添加ゥヱルの吸光度
B： PBSを添加（0V90細胞株非添加）ゥヱルの吸光度
C： Nectin-2ヒトモノクローナル抗体もしくは抗 Nectin - 2ゥサギポリ ク口ーナル抗体添加ゥエルの吸光度
取得した抗 Nectin - 2ヒトモノクローナル抗体の中には、 0V - 90細胞株に対して 細胞増殖阻害活性の強い抗体や弱い抗体があった。また、抗 Nectin- 2ゥサギポリ クローナル抗体 （N2- No. 1) は終濃度 30 g/mLで約 10%の 0V- 90細胞株増殖阻害 活性を示した。 各抗 Nectin - 2ヒ トモノクローナル抗体 （終濃度 SO g/mL) の in vitro 0V-90細胞株増殖阻害率をまとめて表 6に示す。
上記一次スクリ一二ングで比較的強い in vitro 0V-90細胞株増殖阻害活性を示 した 30抗体を再度ハイプリ ドーマから培養調製し、 Protein Aカラムクロマ'トグ ラフィ一およびゲルろ過 HPLCにより高純度精製した抗体標品を用いて、再度上述 の方法により 0V - 90細胞株に対する濃度依存的 （100、 30、 10、 3、 1、 0. 3、 0. 03
133 H g/mL)な細胞増殖阻害活性を測定した。その結果、抗体濃度依存的な強い 0V - 90 細胞株増殖阻害活性を再現性良く示す 8種の抗 Nectin- 2ヒ トモノクローナル抗体
(Necl-803-2, Nec卜 520- 1、 Necl- 530- 1、 Necl- 845- 2、 Necl- 834- 1、 Necl- 244 - 3、 Necl- 303 - 2、 Necl - 903- 1) を選択した。 これらの抗体は 0V90細胞株を 96穴細胞 培養用プレート上に生着させた後に抗体溶液を加えた場合でも同様の活性を示し た。上記 8種の抗 Nectin- 2ヒトモノクローナル抗体の各濃度における 0V- 90細胞 株増殖阻害活性をまとめて表 7に示す。
134 SSI
ε挲
Figure imgf000137_0001
09O3 OSO
806690/ 00Zdf/I3d 921
Figure imgf000138_0002
Figure imgf000138_0001
Figure imgf000138_0003
Figure imgf000138_0004
v ε拏
806690/.00Zdf/X3d Ned -303-2 G1/k Ned -831-4 G1/k Nec2-1633-4 G1/k
Nect-304-2 G1/k Ned -834-1 G1/k Nec3-1829-2 G4/k
Ned -308-2 G1/k Ned -835-1 G1/k Nec3-1907-1 G4/k
Ned -313-1 G1/k Ned -842-2 G1/k Nec3-1908-4 G1/k
Nec1-316-1 G1/k Nec1-843-1 G1/k Nec3- 1927-3 G4/k
Ned -319-2 G1/k Necl -845-2 G1/k Nec3-1932-1 G4/k
Ned -320-1 G1/k Ned -847-2 G1/k Nec3- 2006-1 G1/k
Ned -322-5 G1/k Ned -868-7 G4/k Nec3-2025-3 G1/k
Ned -326-7 G1/k Ned -869-6 G1/k Nec3 - 2036- 6 G1/k
Ned -332-1 Gt/k Ned -878-1 G1/k Nec3-2109-2 G2/k
Ned -333-1 G1/k Ned -888-11 G1/k Nec3-2123-1 G1/k
Ned -336-2 G4/k Ned -903-1 G1/k Nec3-2134-1 G4/k
Necl -338-1 G2/k Ned -907-1 G1/k Nec3-2213-1 G1/k
Ned -341 -10 G1/k Ned -908-2 G1/k Nec5-323-2 G4/k
Ned -349-1 G1/k Ned -909-1 G1/k Nec5-326-1 G2/k
Ned -411-1 G4/k Ned -914-1 G1/k Nec5- 532- 1 G1/k
Ned -416-1 G2/k Nec1-917-2 G1/k Nec5-617-7 G4/k
Ned -427-2 G4/k Ned -918-2 G1/k Nec5- 2309-7 G2/k
Ned -428-1 G1/k Nec1-919-1 G1/k Nec6- 505 - 2 G4/k
Ned -445-4 G1/k Ned -920-1 G1/k Nec6- 940-7 G4/k
Ned -458-6 G1/k Ned -927-14 G4/k Nec8-3350-1 G4/k
Ned -460-1 G4/k Ned -930-1 G1/k Nec8-3410-1 G1/k
Necl -464-1 G1/k Ned -938-2 G1/k Nec8-3517-11 G1/k
Ned -470-2 G1/k Ned -940-2 G1/k Nec8- 3523 - 3 G1/k
Ned - 501 - 1 G4/k Ned -948-3 G1/k Nec8-3524-14 G1/k
Ned -503-8 G4/k Ned— 964-1 G1/k Nec8- 3669-4 G1/k
Ned -505-3 G2/k Ned -1004-2 G1/k Nec8-3704-7 , G1/k
Ned -506-1 G1/k Ned -1005-2 G4/k Nec8- 3717-4 G4/k
Ned -507-1 G1/k Ned -1008-1 G4/k Nec8- 3723-3 G1/k
137 Ned -508-2 G4/k Ned -1012-1 G2/k Nec8-3734-1 G2/k
Necl— 520- 1 G1/k Ned -1020-1 G4/k Nec8-3806-2 G2/k
Ned -522-2 G2/k Ned -1021 -2 G1/k Nec8- 3814- 17 G1/k
Ned -526-1 G4/k Ned -1036-5 G1/k Nec8- 3823- 5 G1/k
Ned -528-2 G1/k Ned -1039-3 G1/k Nec8- 3833 - 6 G4/k
Ned -530-2 G1/k Ned -1044-4 G1/k Nec8- 4024-5 G1/k
Ned -538-3 G2/k Necl -1085-1 G1/k Nec8-4116-8 G1/k
Ned -546-5 G1/k Ned -1115-2 G1/k Nec8-4144-2 G4/k
Ned -549-4 G4/k Nec1-1132-2 G1/k Nec8-4188-1 G4/k
Ned -554-1 G1/k
138 6ετ
Figure imgf000141_0002
Figure imgf000141_0001
Figure imgf000141_0003
挲
806690/.00Zdf/X3d tsmo oz OAV 表 5
Figure imgf000142_0002
Figure imgf000142_0001
表 6
Figure imgf000142_0003
140 表 7
Figure imgf000143_0001
Figure imgf000143_0002
実施例 7 抗 Nectin-2 ヒ トモノクローナノレ抗体の ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity)
実施例 1で作製した抗 Nectin- 2ヒ トモノクローナル抗体のうち、 Necl - 803 - 2、 Nec8_4116— 8、 Necl— 520— 1、 Necl— 530— 1、 Necl—845— 2、 Nec8— 3941— 4、 Necl-834— 1、 Necl- 244- 3、 Necl- 918- 2、 Nec8- 3806- 1、 Necl- 303- 2、 Necl-903- 1の ADCCを測定 した。 ターゲット細胞としてはヒト卵巣癌細胞株 0V- 90を用い、 エフェクター細 胞には市販の凍結ヒ ト末梢血単核球 (旭テクノグラス社) を 10 nM組換え型ヒ ト IL - 2 (DIACL0NE Research社）、 55 M 2-メルカプトェタノール （Invitrogen社）、 および 10% FBS (JRH社） を含む RPMI1640培地 （Invitrogen社） 中でー晚培養し たものを用いた。 ' 対数増殖期の 0V- 90細胞株を実施例 6に記載の方法により回収し、 1 X 106個 の細胞に対し 250 ;u Ci の Na^ i CrCL (Amersham Biosciences社 GE Healthcare
141 社に社名変更） を添加して 37°C、 1時間インキュベートすることにより 5 1 Cr標識 した。 これらの細胞を 0. 4% BSA (Invitrogen社） を含有する RPMI 1640培地（以後 0. 4% BSA/RPMI培地と称する）で 4回洗浄した後、 0. 4% BSA/RPMI培地に対し 1 x 105 個/ mLに再懸濁させた。 このターゲット細胞懸濁液 100 L (1 X 104細胞） と上 記の抗 Nectin- 2ヒトモノクローナル抗体を 0. 4% BSA/RPMI培地で終濃度 0. 015 μ g/mL, 0. 15 g/mLおよび 1. 5 μ g/mLとなるように希釈した溶液 50 Lとを 96穴 RMCプレート（BI0BIK社）の各ゥエルに添力 Pした。 陰性コントロールとして非免疫 ヒト IgG (最終濃度 1. S /z g/mL) もしくは！) - PBS (Invitrogen ¾t) を同量添加し た。 これらのプレートを氷上で 1時間インキュベートした後、 上述のエフヱクタ 一細胞懸濁液を 5 X 105個/ゥヱルずつ加え（エフェクター細胞：ターゲット細胞 = 50 : 1)、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 4時間反応させた。 各ゥ-ルの細胞懸濁液 を 96ウェルマルチスクリーン AS ^ n Millipore社）に移し変え、遠心分離操作に より培養上清を回収した。 これらの培養上清中に細胞内から漏出した放射活性 (sample release) を γカウンター （AccuFLEX y 7000； Aloka Co. ) を用いて測 定した。 ADCCの最大傷害活性 (maximum release) は Triton- X 100 (Sigma社） を最終濃度 1%になるように加えた場合、また自然放出活性 (spontaneous release) は、エフェクター細胞のかわりに 10°/。FBSを含む RPMI1640培地を加えた場合に培 養上清中に検出される放射活性とした。 ADCC強度の指標となる spe ific lysis (%j {ま、 ( (sample release] 一 (spontaneous release] ) / (し maximum re上 ease〕 - [spontaneous release] ) xlOO として算出した （表8)。 非免疫ヒト IgG (最終 濃度 1. 5 μ g/mL) 添加時および D - PBS添加時の ADCC (specific lysis (%) )は共 に 17° /。であったのに対し、 サブクラスが IgGi に属する抗 Nectin- 2ヒトモノクロ ーナル抗体 Necl- 803- 2、 Nec8- 4116- 8、 Necl- 520- 1、 Necl- 530- 1、 Necl- 845 - 2、 Nec8- 3941- 4、 Necl- 834-1、 Necl- 903- 1の ADCCは各々 1. 5 g/mLで 35%、 34%、 30%、 27.%、 30%、 34%、 31%、 32%と有意に高かった。 特に抗体 4116- 8は抗体 最終濃度 0. 015 u g/mlでも specific lysisが 33%と他の抗 Nectin -2ヒ トモノク ローナル抗体に比べより強い ADCCを示した。
142 表 8
Figure imgf000145_0001
実施例 8 抗 Nectin- 2ヒトモノクローナル抗体の追加作製
実施例 1で作製した抗体に加え、 KMマウスに以下の方法により免疫を行レ、、抗 Nectin -2 ヒトモノクローナル抗体を追加作製した。 すなわち、 参考例 16で ί周製 した Nectin- 2ED - Fc タンパク質 （1. 6 mg/mL PBS溶液） とフロインド完全アジュ パント（D co社）とを等容量混合して調製したエマルションを KMマウス（10週齢、
143 12週齢、雄；キリンビール (株)） 5匹の皮下および皮内にそれぞれ 50 g/匹で免 疫した。. 2週間後、フロインド不完全アジュバント（D co社）を用いて作製した同 タンパク質エマルションを KMマウス 5匹の皮下および皮内にそれぞれ 25 i g/匹 で免疫した。 さらに 2週間後に同エマルションを 10 g/匹で免疫した。
免疫開始前および 3回目の免疫 1週間後に全てのマウスをエーテル麻酔下、 眼 底採血して抗血清を取得し、 実施例 1に記載と同様の方法により血清抗体価を調 ベた。十分な血清抗体価上昇が確認された KMマウスに、 Nectin- 2ED- Fcを 10 g/ 匹ずつ尾静脈注射し、実施例 1に記載と同様の方法により抗 Nectin-2ヒ トモノク ローナル抗体産生ハイプリ ドーマを追加取得し、 その培養上清から抗体を調製し た。 実施例 9 抗 Nectin - 2ヒ トモノクローナル抗体の Nectin- l、Nectin-3、Nectin- 4、 Necl - 5タンパク質に対する交差反応性
実施例 1で作製した抗 Nectin- 2ヒトモノクローナル抗体のヒト Nectin - 2に対 する特異性を確認する為、ヒト Nectinフアミリータンパク質 (Nectin - l、Nectin- 3、 Nectin - 4)およびヒト Necl- 5に対する交差反応性をこれらのタンパク質の一過性 発現細胞を用いたフローサイトメトリー法 （以下 FCMと称する） により調べた。 具体的には、 CHO- K1細胞株を T75フラスコ中、 10°/oFBS (JRH社） を含有する DMEM 及び F- 12の当量混合培地（Invitrogen社） を用いて 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 1〜2 日培養した。 この細胞が約 90%コンフルェントになったところで、 参考例 18 にて作製 した pEE12. 4- Nectin-2 δ 、 参考例 29 にて作製 した pCMV-Tag4-Nectin-l 、 pCMV-Tag4- Nectin- 3 、 pCMV-Tag4- Nectin - 4 、 pCMV- Tag4 - Necl- 5、 および陰性コント口一ルプラスミ ドと して pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen社） を Lipofectamine 2000 (Invitrogen社） を用いて添付のプロ トコールに従いトランスフエクシヨンした。 その 4時間後にこれらの遺伝子導入 CH0-K1細胞の培地を新鮮な上記培地と交換し、 さらに 2日間培養した。 これらの 糸田胞を D-PBSで 2回洗净し、 Cell Dissociat ion Buffer enzyme-free, PBS— based (Invitrogen社） を用いて細胞を剥離させ、 1%FBS、0. 1%アジ化ナトリウム 含 有する D-PBS (-） （以後 FCM bufferと称する） で 5 X 106個/ mLの密度で再懸濁さ せた。これらの細胞懸濁液を 96ゥヱル V底プレートに 30 ずつ入れ、 FCM buffer
144 で 15 / g/mLに希釈した抗ヒト Nect in - 2ヒトモノクローナル抗体 （Necl - 8O3- 2、 Necl- 520- 1、 Nec l-530 - 1、 Necl— 834- 1、 Necl-244 - 3、 Nec l- 303— 2、 Necl-903- 1、 もしくは Nec8-4116- 8) 及ぴ、 陽性コントロール抗体 〔抗ヒト Nect in - 1マウスモ ノクローナル抗体 (ZY ED社）、 参考例 14で作製した抗 Nect in- 2ゥサギポリク口 ーナル抗体 N2-No. 2、 参考例 27で作製した抗ヒト Nect i n-3ゥサギポリクローナ ル抗体、 抗ヒト Nect in - 4ャギポリクローナル抗体 （R&D社）、 もしくは抗ヒ ト Necl - 5マウスモノクローナル抗体（LAB VISION社)〕を 20 /z L (最終濃度： 6 μ g/mL) 加え、 氷上で 1時間反応させた。 各ゥヱルに FCM buffer 200 μ 1^を加え、 遠心分 離操作により 1回洗净した後、 FCM bufferで 10 μ g/mLに希釈した Alexa488標識 2次抗体を 1ゥヱル当たり 50 し加え懸濁させた後、 氷上で 1時間反応させた。 なお、 1次抗体としてヒト抗体を用いた場合には Alexa Fluor488 goat ant i-human IgG (H+L) を、 マウス抗体を用いた場合には Alexa Fluor488 goat ant i- mouse IgG (H+L) を、 ゥサギ抗体を用い 場合には Alexa Fluor488 goat anti-rabbit IgG (H+L) を、 ャギ抗体を用いた場合には Alexa Fluor488 donkey ant i-goat IgG (H+L) (Invi trogen社） をそれぞれ 2次抗体として用いた。 これらの細胞をさら に FCM bufferで 2回洗浄した後、 250 μ Lの FCM bufferに再懸濁させ、 フ口ーサ イトメーター MPL500 (BECKMAN COULTER社） で染色細胞の蛍光強度を測定した。 各抗体について陰性コントロールプラスミド pcDNA3. 1 (+)導入 CH0- K1細胞の蛍光 強度の median値に対する各遺伝子導入 CH0- K1細胞の蛍光強度 median値の比を計 算し、 その結果を表 9に示した。 この比が 1の場合、 抗体が該タンパク質に対し て全く結合せず、 比が大きいほど抗体が該タンパク質に強く結合することを意味 している。 これらの結果から、本実験に供した 8種類の抗ヒト Nect in- 2ヒトモノ クローナル抗体は他のヒト Nect inファミリ一タンパク質 （Nect in- 1、 Nectin- 3、 Nect in-4) およびヒト Necl- 5にとは交差反応せずヒト Nect in- 2に特異的な抗体 であることが明らかとなった。
145 表 9
Figure imgf000148_0001
実施例 10 抗 Nectin- 2ヒトモノクローナル抗体の Nectin-2- Nectin-2 トランス 結合阻害活性
実施例 1 および実施例 8 で取得した抗 Nectin- 2 ヒトモノクローナル抗体の Nectin - 2- Nectin- 2 トランス結合阻害活性は時間分解蛍光法を利用した下記の方 法で定量的に評価した。まず、参考例 16で調製した Nectin- 2ED - Fc タンパク質 1 mgを VIVASPIN MWC0 30， 000 (VIVA SCIENCE社） を用いた限外ろ過法により 50 mM 炭酸ナトリゥム緩衝液 (pH 9. 6) に濃縮置換し、 4 mg/mL溶液を調製した。 この Nectin- 2ED-Fc 溶液に DELFIA Eu- Labeling kit (Perkin Elmer 社）付属の Eu- labeling Reagentを添加し混和した後、 4°Cでー晚反応させた。 反応混合物か ら上述の限外ろ過法により未反応の Eu3+を除去すると同時に PBSにバッファー置 換し、 Eu標識 Nectin-2ED- Fcを調製した。この時の Eu3+導入数は Nectin- 2- ED-Fc 1分子あたり 5. 23分子であった。次に Nectin- 2ED_Fcを 50 mM炭酸ナトリゥム緩 衝液 （PH 9. 6) で 5 g/mLの濃度に希釈し、 これを Wallac Delfia用プレート (Perkin Elraer社） に 100 ； u L/ゥヱルずつ添加して室温 5時間反応させた。 その 後各ゥェルに 2% BSA含有 PBSを 200 μ Lずつ添加し、 4°Cで終夜ブロッキングした。 そのプレートを 0. 05% Tween20-PBS (PBS-T) で 2回洗浄した後、 0. 2% BSA含有 PBS で 600 /z g/mL に希釈した抗 Nectin - 2 ヒ トモノクロ ナル抗体もしくは
146 Control hlgG (Human IgG Whole molecule Chrom Pure； Jackson社） と 0. 2% BSA 含有 PBSで 6. 4μ g/mLに希釈した Eu標識 Nectin- 2ED-Fcとを等量混合し、これを 100 μ L/ゥエルずつ添加し、 室温 1. 5時間反応させた。 このプレートを PBS- Τで 6 回洗浄した後、 Enhancement Solution (Perkin Elmer社） を 200 μ L/ゥヱル添カロ し、室温 1分間プレートミキサ一で攪拌した。こうして反応させた各ゥエルの 615 nmの蛍光 （励起光 340 nm、 遅延時間 400 秒） を ARV0 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer社）を用いて測定し、 下記の計算式により Nectin- 2 - Nectin- 2 ト ランス結合阻害率を算出した。
Nectin- 2 - Nectin- 2 トランス結合阻害率 (%) = (A - B) X 100/A A: コントローノレ hlgGを用いたときのカウント
B: 杭 Nectin - 2ヒ トモノク口一ナル抗体を用いたときのカウント 各抗 Nectin - 2ヒトモノクローナル抗体の Nectin - 2 - Nectin - 2のトランス結合 阻害活性をまとめて表 1 0に示す。
147 表 1 0
Figure imgf000150_0001
実施例 11 抗 Nectin-2 ヒ 卜モノクローナノレ抗体の ADCC (Antibody - dependent cellular cytotoxicity).
実施例' 1 で作製した抗 Necti.n - 2 ヒ トモノクローナル抗体のうち、 グループ I の Necl-964- 1、 グループ IVの Necl- 303- 1、 Necl-554- 1、 Necl- 1302- 2、 グループ Vの Necl-769- 2、Necl- 1305- 1、グノレープ VIの Necl- 141-3、Necl- 209- 2、Necl-9Q9-l Necl - 847- 2、 Necl- 803- 2、 グループ の Nec8- 4116- 8の ADCCを測定した。 ターゲ ット細胞としてはヒト卵巣癌細胞株 0V- 90を用い、 エフェクター細胞には市販の 凍結ヒ ト末梢血単核球 (旭テタノグラス社）を 0. 1 nM組換え型ヒ ト IL - 2 (DIACLONE
148 Research社）、 55 μ M 2—メノレ力プトェタノール (Invitrogen社）、 および 10% FBS (JRH社）を含む RPMI 1640培地（Invitrogen社）中で一晚培養したものを用いた。 対数増殖期の 0V-90細胞株を実施例 6に記載の方法により回収し、 1 X 106個 の細胞に対し 250 ^ Ci の Na2 5 1 Cr04 (GE Healthcare ¾：) を添加して 37°C、 1時 間インキュベートすることにより 5 1 Cr 標識した。 これらの細胞を 0. 4% BSA (Invitrogen社） を含有する RPMI1640培地（以後 0. 4% BSA/RPMI培地と称する） で 4回洗浄した後、 0. 4% BSA/RPMI培地に対し 1 x 105個/ mLに再懸濁させた。 こ のターゲット細胞懸濁液 100 μ ΐ (1 X 104細胞） と、 上記の抗 Nectin - 2ヒトモ ノクローナル抗体を 0. 4% BSA/RPMI培地で終濃度 0. 0015 μ g/mL, 0. 015 μ g/raL, 0. 15 μ g/mLおよび 1· 5 g/raLとなるように希釈した溶液 50 μ Lとを 96穴 RMCプ レート（BI0BIK '社）の各ゥヱルに添加した。 陰性コントロールとして非免疫ヒ ト IgG (最終濃度 1. 5 / g/mL) もしくは！)- PBS (Invitrogen社） を同量添加した。 こ れらのプレートを氷上で 1時間ィンキュベートした後、 上述のエフェクター細胞 懸濁液を 5 X 105個/ゥヱルずつ加え（エフェクター細胞：ターゲット細胞 = 50： 1)、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 4時間反応させた。 各ゥエルの細胞懸濁液を 96 ウェルマルチスクリーン 45 /i m (Mi l l ipore 社）に移し変え、 遠心分離操作により 培養上清を回収した。これらの培養上清中に細胞内から漏出した放射活性（Sampl e release)を yカウンター（AccuFLEX γ 7000； AL0KA Co. )を用いて測定した。 ADCC の最大傷害活性 (Maximum release) は Triton- X 100 (Sigma社） を最終濃度 1% に なるように加えた場合、 また自然放出活性 （Spontaneous release) は、 エフヱク ター細胞のかわりに 10% FBSを含む RPMI 1640培地を加えた場合に培養上清中に検 出される放射活性とした。 ADCC強度の指標となる Specific lysis (%)は、（ [Sampl e release] -し Spontaneous release] ) / (し Maximum releasej一 [Spontaneous release] ) xlOOとして算出した （表 1 1および 1 2 )。
非免疫ヒ ト IgG (最終濃度 1. 5 g/mL) 添加時および D- PBS 添加時の ADCC (specific 1 313 (°/。））は各々4%、 3%であったのに対し、 グループ Iの抗 Nectin - 2 ヒ トモノクローナル抗体 Necl - 964-1、 グノレープ IVの Nec l-554 - 1、 Necl-1302- 2、 Necl- 769- 2、 グループ VIの Necl- 803- 2、 グループ YDの Nec8- 4116- 8の ADCCは抗 体最終濃度 1. 5
Figure imgf000151_0001
で各々12°ん 19%、 15%、 12%、 15% 17% と有意に高かった。 特にグループ IVの Necl- 554- 1およびグループ Wの Nec8- 4116- 8は抗体最終濃度
149 . 15 g/mLでの Specific lysisが各々 15%、 12% と他の抗 Nectin- 2ヒ トモノク ローナル抗体に比べより強い ADCCを示した。 .
150 表 1 1
Figure imgf000153_0001
151 表 1 2
Figure imgf000154_0001
実施例 12 抗 Nectin - 2ヒ トモノクローナル抗体の in t 'ra抗腫瘍活性
152 実施例 1で取得した抗 Nectin- 2ヒトモノクローナル抗体のうち、 Necl - 803- 2、 Necl - 964- l、Necl- 303- 2、Necl- 554- lSP3、Necl- 1302- 2、Necl- 769- 2、Necl- 1305-1、 Necl- 141- 3、 Necl- 209- 2、 Necl- 909- 1および Nec 1-847-2の抗 B重瘍活' I生を OV- 90 ヒ ト卵巣癌細胞株のヌードマウス皮下移植モデルにおいて調べた。各抗 Nectin- 2 ヒ トモノクローナル抗体標品は参考例 28 に記載の方法により調製したものを用 いた。 0V- 90細胞株は、 15%FBS (JRH社） を含む MCDB105 (Sigma社） と Mediuml99
(Sigma社） との等量混合培地を用い、 150 cm2組織培養フラスコ （Corning社） に播種し、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで培養した。 トリプシン- EDTA処理により剥 離して得た対数増殖期の 0V- 90細胞株懸濁液を、遠心分離操作（l， 000 rpm、 3分） を用いて Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS) (Invitrogen社） で 3回洗浄し た。 こうして得た細胞を HBSSに 8 X 107個/ mLの密度で再懸濁させた。
' 日本クレアより購入したヌードマウス（BALBん AJcl-nu/nu) (5週齢、 雌） を 1 週間馴化飼育した後、 上記 0V- 90細胞懸濁液を腹側皮下に 100 x L/個体ずつ接種 した。細胞接種 10日後に 0V- 90腫瘍塊の長径と短径をノギスで測定し、下記の計5 算式により腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積 (mm3) =長径 X (短径） 2 /2
OV-90細胞株を移植した上記ヌードマウスの中から腫瘍塊の生着したものを選 抜し、 各個体の体重を測定した後、 各群の平均腫瘍塊体積が均等 (約 50 醒 3)にな るように群分けした。 細胞接種 10、 13、 17、 20、 24、 27、 31日目に、 PBSで 0. 150 mg/mLに希釈した上記抗 Nectin- 2ヒトモノクローナル抗体溶液もしくは PBSを 10 mL/kgずつ尾静脈投与し、 それと同時に上記の方法により腫瘍体積を測定した。 抗 Nectin - 2 ヒトモノクローナル抗体の増殖抑制活性は、薬物投与開始 4,週間後の 腫瘍体積を基に、 下記の計算式により T/C (Treatment/Control) '値を算出した。 また投与群間の有意差検定にはパラメ トリック Dunnet型多重比較検定（SAS前臨5 床パッケージ Version 5. 0) を用いた。
T/C (%) =[ (抗体投与群における薬物投与開始時からの腫瘍体積の増加量） I (PBS投与群における薬物投与開始時からの腫瘍体積の増加量） ] x 100 上記の抗 Nectin- 2 ヒトモノクローナル抗体の中には、 0V-90細胞株腫瘍塊の増 殖を強く抑制する抗体や弱く抑制する抗体があった。各抗 Nectin- 2ヒ トモノクロ0 ーナル抗体の T/Cと PBS投与群に対する有意差検定値 (P value)をまとめて表 1 3
153 に示す。 表 1 3
Figure imgf000156_0001
実施例 13 抗 Nectin- 2ヒトモノクローナル抗体の結合ドメイン解析
抗 Nect in - 2 ヒトモノクローナル抗体のェピトープ探索方法の一つとして、 Nectin - 2の Igl ドメイン（配列番号 1または配列番号 3で表されるァミノ酸配列 の 4 7〜1 4 2番目） 欠損タンパク質および Ig2 ドメイン （配列番号 1または配 列番号 3で表されるァミノ酸配列の 1 7 5〜 2 4 0番目） 欠損タンパク質に対す る反応性を、これらのタンパク質の一過性発現 CH0- K1細胞を用いた FCMにより調 ベた。 具体的には、 実施例 9 と同様の方法により、 参考例 18 で作製した PEE12. 4- Nectin - 2 δ、 および参考例 30で作製した pcDNA3. 1 (+)- Nectin- 2 Δ Igl、 pcDNA3. 1 (+) -Nectin- 2 Δ Ig2、また陰†生コントロールとして pcDNA3. 1 (+)を一過性 発現させた CH0 - K1細胞懸濁液を作製した。 これらの細胞懸濁液を 96ゥェル V底 プレートの各ゥエルに 30 μ Lずつ加え、 そこへ FCM bufferで 15 μ g/mLに希釈し た幾つかの実施例 1で作製した抗ヒ ト Nectin-2モノクローナル抗体または参考例
14で作製した抗 Nectin- 2ゥサギポリクローナル抗体 N2- No. 2'を 20 (終濃度： 6
/mL) ずつ加えて氷上で 1 時間反応させた。 各ゥヱルに FCM buffer 200 L
154 を加え、 遠心分離操作により 1回洗浄した後、 FCM bufferで lO ^ g/mLに希釈し た Alexa488標識 2次抗体を 50 Lずつ加え、 混合し、 氷上で 1時間反応ざせた。 Alexa488標識 2次抗体は、 ヒト抗体には Alexa Fluor488 goat anti-human IgG (H+L) を、 ゥサギ抗体には Alexa Fluor488 goat anti-rabbit IgG (H+L) (Invitrogen社） を用いた。 各ゥヱルの細胞を FCM bufferで 2回洗浄した後、 250 の FCM buffer に再懸濁させ、 フローサイ トメーター MPL500 (BECKMAN COULTER社） を用いて染色細胞の蛍光強度を測定し、 各抗体の陰性コントロール 群の蛍光強度 median値に対する 1次抗体添加群の蛍光強度 median値の比を各々 の遺伝子導入 CH0-K1細胞に対する反応性として表 1 4および 1 5に示した。表中 では pcDNA3. 1 (+) -Nectin- 2 Δ Igl導入細胞およぴ pcDNA3. 1 (+) -Nectin- 2 Δ Ig2導 入細胞に対する反応性をそれぞれ、 delta- Igl、 delta - Ig2と表記し、 陰性コント ロールに対する比が 2以上のものを反応性があると規定し、 Delta - Iglとの比が 2 以上で delta - Ig2との比が 2以下のものは Nectin- 2の Ig2 ドメインを認識する抗 体、また delta - Iglとの比が 2以下で delta- Ig2との比が 2以上のものは Nectin- 2 の Igl ドメインを認識する抗体と判断した。 また、 上記のいずれの比も 2以下の 反応性の抗体の結合ドメイン（ェピトープドメイン）は "unknown" と記載した。 その結果、 ェピトープグループ IVに属する抗体は Nectin- 2の Ig2 ドメィンを 認識していることが示唆された。 また、 ェピトープグループ Vおよび VIに属する 抗体は Nectin - 2の Igl ドメインを認識していることが示唆された。
155 1 4
Figure imgf000158_0001
156 表 1 5
Figure imgf000159_0001
実施例 14 抗 Nectin - 2モノクローナル抗体の力-クイザル Nectin - 2に対する交 差反応性
実施例 1 で作製した抗 Nectin - 2 ヒ トモノクローナル抗体の力二クイザル Nectin-2に対する交差反応性を力二クィザル Nectin-2—過性発現 CH0- K1細胞を 用いた FCMにより調べた。実施例 9と同様の方法により、参考例 18にて作製した pEE12. 4- Necin-2 δ、参考例 32で作製した PcDNA3. 1 (+) - maNectin- 2、 もしくは陰
157 性コントロールとじて pcDNA3. 1 (+)を一過性発現させた CH0 - K1細胞懸濁液を各々 作製した。これらの細胞懸濁液を 96ゥヱル V底プレートの各ゥエルに 30 μ Lずつ 加え、 そこへ 1次抗体として FCM bufferで 15 / g/mLに希釈した幾つかの実施例 1で作製した抗ヒト Nectin - 2ヒトモノクローナル抗体、もしくは陽性コントロー ル抗体として参考例 14 で作製した抗 Nectin - 2 ゥサギポリクローナル抗体 N2-No. 2を 20 μ L (最終濃度： 6 μ g/mL) ずつ加えて氷上で 1時間反応させた。 そ の後各ゥエルに FCM buffer 200 Lを加え、遠心分離操作により 1回洗浄した後、 FCM bufferで 10 μ g/mLに希釈した Alexa488標識 2次抗体を 50 μ Lずつ加え、 懸 濁させて、 氷上で 1時間反応させた。 なお、 ヒト抗体には Alexa Fluor488 goat anti-human IgG (H+L). を、 ゥサギ抗体には Alexa Fluor488 goat anti- rabbit IgG (H+L) (Invitrogen社） を用いた。 次に FCM bufferで細胞を 2回洗浄した後、 250 μ ΐ の FCM buffer に再懸濁させ、 フローサイ トメーター MPL500 (BECKMAN COULTER社） で染色細胞の蛍光強度を測定し、 各抗体の結合反応性を確認した。 各抗体について陰性コントロール群の蛍光強度 median値に対する 1次抗体添加群 の蛍光強度 median値の比を表 1 6に示した。 この結果から、実施例 1で作製した 抗ヒト Nectin-2ヒ トモノクローナル抗体の中には力二クイザノレ Nectin- 2に交差 反応するものとしないものが存在することが分かった。 グループ b に属する Necl- 554- 1、 ェピトープグループ VIに属する Necl- 319- 2、 Necl-843- 1、 ェピト ープグループ VIIに属する Nec8 - 4116- 8は力二クイザル Nectin- 2に対し交差反応 性を示した。これに対しェピトープグループ VIに属する Necl- l l l-3、Necl-144 - 1、 Necl - 209-2、 Necl - 244-3、 Necl - 316- 1、 Necl— 332- 1、 Necl- 520-1、 NeclH530- 1、 Necl— 704- 1、 Necl- 730- 4、 Nec卜 803- 2、 Necl— 834— 1、 Necl— 843— 1、 Necl- 845 - 2、 Necl-903-l s Necl— 909-1、 Necl— 918- 2、 Necl- 1214— 5、 Nec8 - 4024 5は力二クイザ ノレ Nectin- 2に対し交差反応性を示さなかつた。
158 表 1 6
Figure imgf000161_0001
実施例 15 抗 Nectin- 2 ヒ トモノクローナル抗体の力-クイザル型変異を導入し た Nectin- 2に対する交差反応性
159 実施例 1で作製した抗 Nectin- 2ヒ トモノクローナル抗体の力-クィザル型変異 を導入したヒ ト Nectin-2に対する交差反応性を、力二クイザル型変異を導入した ヒト Nectin - 2—過性発現 CH0-K1細胞を用いた FCMにより調べた。 実施例 9と同 様の方法により、 参考例 18で作製した pEE12. 4- Necin- 2 δ、 参考例 33で作製し た力-クイザル型変異を導入した Nectin - 2 の動物細胞用発現ベクター ； pcDNA3. 1 (+) - Nectin - 2 (AN77—78PD) 、 pcDNA3. 1 (+) ~Nectin-2 (G113R) 、 pcDNA3. 1 (+) -Nectin- 2 (H128R) 、 および陰性コント口一ルとして pcDNA3. 1 (+)を 一過性発現させた CH0 - K1細胞懸濁液を作製した。 これらの細胞懸濁液を 96ゥェ ル V底プレートの各ゥエルに 30 i Lずつ力!]え、 それに 1次抗体として FCM buffer で 15 // g/raLに希釈した幾つかの実施例 1で作製した抗ヒト Nectin- 2ヒトモノク ローナル抗体を 20 (最終濃度： 6 j g/mL)ずつ加えて氷上で 1時間反応させた。 その後各ゥヱルに FCM buffer 200 Lを加え、 遠心分離操作により 1回洗浄した 後、 FCM bufferで 10 μ g/mLに希釈した Alexa Fluor488 goat anti-human IgG (H+L) を 50 / L加え、 懸濁させて、 氷上で 1時間反応させた。 次に FCM bufferで細胞を 2回洗浄した後、250 i Lの FCM bufferに再懸濁させ、フローサイトメーター MPL500 (BECKMA COULTER社） で各染色細胞の蛍光強度を測定し、 各抗体の陰性コント 口ール群の蛍光強度 median値に対する 1次抗体添加群の蛍光強度 median値の比 を表 1 7に示した。この結果から、グループ VIに属する Necl- 111 - 3、Necl - 209- 2、 Necl - 244- 3、 Necl- 316- 1、 Necl- 332- 1、 Necl- 520- 1、 Necl - 530-1、 Necl- 704—1、 Necl - 730- 4、 Necl-803- 2、 Necl - 834- 1、 Necl- 843- 1、 Necl- 845- 2、 Necl- 903—1、 Necl- 909- 1、 Necl- 918-2、 Necl- 1214-5、 Nec8- 4024- 5は G113Rおよび H128Rに対 して Nectin - 2と同等に結合したが、 AN77 - 78PDには結合しなかった。 この結果は これらのヒ トモノクローナル抗体が Nectin- 2の または Asn78を含む領域を認 識している可能性を示唆している。 一方、 グループ IVbに属する Necl- 554-1、 グ ループ VIに属する Necl-144- 1、 Necl-319-2、 Necl- 843-1、 グル一プ VIIに属す る Nec8 - 4116- 8は AN7 7- 78PD、 G113Rおよび H128Rに対して Necitin- 2と同等に結 合した。
160 表 1 7
Figure imgf000163_0001
実施例 16 ェピトープグループ Vおよび VIに属する抗 Nectin-2 ヒトモノクロー ナル抗体のェピトープ解析
161 実施例 13においてェピトープグループ Vおよび VIに属する抗体は Nectin- 2の Igl ドメインを認識していることが示唆された。 これらの抗 Nectin - 2ヒトモノク ローナル抗体のェピト一プをさらに詳細に特定する事を目的と して、 Nectin - 2ED-Fcの Igl ドメインに 1アミノ酸置換を行った組換えタンパク質を調 製し、これらの変異体に対する抗 Nectin - 2ヒトモノクローナル抗体の結合活性を 調べた。 293F細胞株に、 参考例 15で作製した pcDNA3. l (+) -Nectin- 2ED- hFc、 お よび参考例 34で作製した Nectin - 2ED-Fcの 1ァミノ酸置換体の動物細胞用発現べ クタ一； pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED - Fc (Q37A)、pcDNA3. 1 (+) -Nectin- 2ED-Fc (P40G) pcDNA3. 1 +) -Nect in-2ED-Fc (Q45A) pcDNA3. K+) -Nectin-2ED-Fc (H55A) 、 pcDNA3. 1 +) - Nect in- 2ED-Fc (V60A) pcDNA3. K+) -Nectin-2ED-Fc (Y64A) 、 pcDNA3. 1 +) - Nectin- 2ED-Fc (Q71A) pcDNA3. K+) -Nectin-2ED-Fc (A75G) 、 pcDNA3. 1 +) - Nectin- 2ED-Fc (P76G) pcDNA3. K+) - Nectin - 2ED- Fc (A77G) 、 pcDNA3. 1 +) -Nectin-2ED-Fc (N78A) pcDNA3. K+) -Nectin-2ED-Fc (H79A) 、 pcDNA3. 1 +) - Nect in - 2ED - Fc (Q80A) pcDNA3. K+) -Nectin-2ED-Fc (N81A) 、 pcDNA3. 1 +) - Nect in- 2ED-Fc (K88A) pcDNA3. K+) -Nectin-2ED-Fc (S95A) 、 pcDNA3. 1 +) -Nectin-2ED-Fc (K109A) pcDNA3. K+)- -Nectin- 2ED - Fc (E117A) 、 pcDNA3. 1 +) - Nectin—2ED—Fc (D122A) pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (H128A) 、 pcDNA3. 1 +) - Nectin- 2ED-Fc (N137A) pcDNA3. i (+) - -Nectin-2ED-Fc (F145A) 、 pcDNA3. 1 +) - Nect in- 2ED- Fc (K147A) pcDNA3. 1 (+)— Nectin - 2ED—Fc (V150A) 、 pcDNA3. 1 +) - Nectin- 2ED-Fc (M153A)、 pcDNA3. 1 (+) - Nectin-2ED-Fc (T154A)を 293 フエクチン（Invitrogen社）を用いてトランスフエクションした。そしてこれらの 細胞を 8%炭酸ガス気流中、 37°Cで 3日間旋回培養することにより、上記プラスミ ドにコードされる Nectin- 2ED-Fcタンパク質およびその 1アミノ酸変異体タンパ ク質 [Q37Aヽ P40G、 Q45Aヽ H55Aヽ V60Aヽ Y64A、 Q71A、 A75G、 P76G、 A77G、 N78A、 H79A、 Q80A、 N8.1A、 K88A、 S95A、 K109A、 E117A、 D122A、 H128A、 N137A、 F145A、 K147A、 V150A、 M153A、 T154A]を培養上清中に分泌させた。 各細胞懸濁液から遠心分離操 作おょぴフィルターろ過により培養上清を調製し、 以下の ELISAに供した。
実施例 1で作製した抗 Nectin - 2ヒ トモノクローナル抗体 Nec8-4116 - 8を 5'0 ηιΜ 炭酸ナトリゥム-重炭酸ナトリゥム緩衝液 （pH 9. 6) で 5 μ g/mLの濃度に希釈し、 これを 96穴ハーフゥエルィムノプレート （Costar社） に 50 L/ゥエルずつ添カロ
162 して室温 · 5時間反応きせた。 各ゥヱルから反応液を除去した後 2% BSA含有 PBS を 100 μ L/ゥェルずつ添加し 4°C、 終夜ブロッキングした。 このように作製した ELISA用プレートを 0. 05% Tween20含有 PBSで 2回洗浄した後、 Nectin - 2ED - Fc タンパク質（wi ld type)およぴ上記の Nectin - 2ED - Fc 1ァミノ酸置換体タンパク質 を一過性発現させた上記の 293F細胞株培養上清を 0. 2% BSA含有 PBS で 5倍希釈 したものを、 50 μ ΐ7ゥヱルずつ添加し、 室温 2時間反応させた。 また陰性コント 口ールとして 293F細胞用の培地を同プレートに添カ卩した。 このプレートを 0· 05% Tween20含有 PBSで 6回洗浄した後、 実施例 4で作製したピオチン化抗 Nectin - 2 ヒ トモノクローナル抗体を 0. 2% BSA含有 PBSで 5 ng/raLから 20 ng/ Lの濃度に 希釈した溶液を 50 μ L/ゥエルずつ添加し、 室温 2時間反応させた。 このプレート を 0. 05% Tween20含有 PBSで 6回洗浄し、 0. 2% BSA含有 PBSで 3， 000倍希釈した Avidin-HRP (Vector社）を 50 μ L/ゥエルずつ添加し、室温 2時間反応させた。 この プレートを 0. 05% Tween20含有 PBSで 6回洗浄し、 TMB溶液 （SureBlue Mi cr owe 11 TMB peroxi dase substrate) を 50 L/ゥエルずつ添カ卩後室温 1分間発色させ、 2 N 硫酸 （和光純薬㈱） を 50 / L/ゥエルずつ添カ卩して酵素反応を停止させた。 各ゥェ ルの吸光度 （450 nm) をプレートリーダー （Multiskan BICHROMATIC) を用いて測 定した。 個々の Nectin- 2ED-Fc の 1 アミノ酸置換体に対する各ビォチン化抗 Nectin - 2ヒトモノクローナル抗体の反応性は以下の式により算出した。 反応性 (％ wi ld type) = [吸光度（ 1ァミノ酸置換体）一吸光度（陰性コントロー ル) ] /[ 吸光度 (wi ld type) -吸光度（陰性コントロール) ] X 100 表 1 8において実施例 4 でェピトープグループ VIに分類された抗体の中には A75G、P76Gおよび N78Aに対する結合力の低下が見られるものと A75G 、P76G、N78A および N137Aに対する結合力の低下が見られるものがあり、前者の抗体群が Ala75、 Pro76, Asn78を含むェピトープを、後者の抗体群が Ala75、 Pro76, A'sn78,および Asn137 を含むェピトープを認識することが示唆された。 また、 実施例 4でェピトープグ ループ Vに分類された抗体は F145Aに対する反応性の低下が見られ、 これらの抗 体が Phe145を含むェピトープを認識することが示唆された。
163
Figure imgf000166_0001
164 実施例' 17 ェピトープグループ Iおよび Wに属する抗 Nectin - 2ヒトモノクロー ナル抗体のェピトープ解析
実施例 1で取得した抗 Nectin - 2ヒトモノクローナル抗体のェピトープをきら に詳細に特定する事を目的として、 Nectin - 2ED - Fcの Ig2 ドメインに 1アミノ酸 置換を行った組換えタンパク質を調製し、 これらの結合活性.を調べた。 293F細 胞株に、 参考例 15で作製した pcDNA3. 1 (+) - Nectin-2ED- hFc、 および参考例 35 で作製した Nectin - 2ED-Fc の 1 アミノ酸置換体の動物細胞用発現べクタ —； pcDNA3. l (+) -Nectin-2ED-Fc (Q165A) , pcDNA3. 1 (+) -Nectin~2ED-Fc (K170A)、 pcDNA3. 1 (+) -Nectin-2ED-Fc (F173A)、 pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (P177G)、 pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (I184A)、 pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (K186A)、 pcDNA3. 1 (+) -Nectin-2ED-Fc (L197A)、 pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (W202A)、 pcDNA3. 1 (+) -Nectin-2ED-Fc (E206A)、 pcDNA3. 1 (+)— Nectin - 2ED - Fc (T212A)、 pcDNA3. l (+) -Nectin-2ED-Fc (T235A)、 pcDNA3. 1 (+) -Nectin- 2ED - Fc (K239A)、 pcDNA3. 1 (+) - Nectin- 2ED-Fc (A249G) を 293フエクチン (Invitrogen社）を用レ、 てトランスフエクシヨンし、 これらの細胞を 8 %炭酸ガス気流中、 37°Cで 3日間 旋回培養することにより、 上記プラスミドにコードされる Nectin - 2ED-Fc タン パク質おょぴその 1アミノ酸変異体タンパク質 [Q165A、 K170A、 F173A、 P177G、 I184A、 K186A、 L197A、 W202A、 E206A、 T212A、 T235A、 K239A、 A249G] を 培養上清中に分泌させた。 各細胞懸濁液から遠心分離操作およびフィルターろ 過により培養上清を調製し、 以下の ELISAに供した。
実施例 1で取得した抗 Nectin - 2ヒ トモノクローナル抗体 Necl - 803 - 2を 50 mM 炭酸ナトリウム -重炭酸ナトリウム緩衝液 (pH 9. 6)で 5 μ g/mLの濃度に希釈し、 これを 96穴ハーフゥエルィムノプレート (Costar社) に 50 ゥヱルずつ添 加して室温 5時間反応させた。各ゥエルから反応液を除去した後 2%BSA含有 PBS を 100 z L/ゥエルずつ添加し 4°C、 終夜ブロッキングした。 このように作製した ELISA用プレートを 0. 05% Tween20含有 PBSで 2回洗浄した後、 Nectin - 2ED - Fc タンパク質 (wild type)および Nectin -2 ED- Fc lアミノ酸置換体タンパク質を 過性発現させた上記の 293F細胞株培養上清を 0. 2%BSA含有 PBS で 25倍もしく は 125倍希釈したものを 50 ^ L/ゥエルずつ添加し、 室温 2時間反応させた。 ま
165 た陰性 ントロールとして 293F細胞用の培地を同プレートに添加した。 このプ レートを 0. 05% Tween20含有 PBSで 6回洗浄した後、 実施例 4で作製したピオ チン標識抗 Nect in- 2抗体を 0. 2% BSA含有 PBSで 1 μ g/mLの濃度に希釈した溶 液を 50 L/ゥエルずつ添加し、 室温 2時間反応させた。 このプレートを 0. 05% Tween20 含有 PBS で 6 回洗浄し、 0. 2°/。BSA含有 PBS で 3, 000 倍希釈した Avi din-HRP (Vector社）を 50 μ L/ゥエルずつ添加し、 室温 2時間反応させた。 プ レートを 0. 05% Tween20含有 PBSで 6回洗浄し、 TMB溶液 (SureBlue Mi crowel l TMB peroxidase substrate ; Kirkegaard & Perry Laboratories, inc. ) を 50 / L/ゥエルずつ添加後室温 1分間発色させ、 2 Ν硫酸 （和光純薬㈱） を 50 / L/ ゥヱルずつ添加して酵素反応を停止させた。 各ゥエルの吸光度 （450 nra) をプ レートリ一ダー （SPECTRAmax 340PC ; Molecular Devices, Inc. ) を用いて測定 した。 個々の Nect in- 2ED-Fcl アミノ酸置換体に対する各ビォチン標識抗 Nect in- 2 'ヒ トモノクローナル抗体の反応性は以下の式により算出し、 結果を表 1 9にまとめた。 反応性 (％ wi ld type) = [吸光度（ 1ァミノ酸置換体）一吸光度（陰性コントロー ル) ] /[吸光度 (wi ld type) -吸光度（陰性コントロール) ] X 100 ェピトープグループ Iに属する Nec 1-964-1の Nect in - 2ED-hFc 1ァミノ酸置換 体に対する結合活性は I 184A、 K186A、 T212Aで顕著に低下し、この抗体が I le184、 Lys186, Thr212を含むェピトープを認識することが示唆された。一方ェピトープグ ループ Wに属する抗体群の中で Nec8- 4116- 8、 Nec9- 1004- 1、 Nec9-1236-1 Nec9- 1637- 1 の Nect in- 2ED_hFc 1ァミノ酸置換体に対する結合活性は F173Aで 顕著に低下し、これらの抗体が Phe173を含むェピトープを認識することが示唆さ れた。
166 表 1 9
Figure imgf000169_0001
実施例 18 ェピトープグループの細分化
実施例 1および実施例 8で作製した抗 Nectin - 2ヒ トモノクローナル抗体は実 施例 4に示すように大きく 7つのェピトープグループに分類されたが、 その後 の検討によりこれらがさらに細分化されることが分かった。 例えば、 実施例 4 で行った拮抗阻害実験の結果を詳細に調べると、 ェピトープグループ IVに属す る抗体の中にはェピトープグループ1 πの抗体とも拮抗阻害反応を示す一群の抗 体があった。 これらの抗体はェピトープグループ1 νπと拮抗阻害反応を示さない ェピトープグループ IVの抗体とは若干ェピトープが異なるものと考えられるの で、 便宜上ェピトープグループ IVb、 ェピトープグループ IVに属し、 ェピトープ グループ Wと拮抗阻害反応を示さない抗体群をェピトープグループ IVa という ようにサブグループ化した（表 2 0 )。 また、 ェピトープグループ VIに属する抗 体の中にはェピトープグループ Iに属する抗体群と拮抗阻害反応を示す抗体群 があった。 これらの抗体はェピトープグループ I と拮抗阻害反応を示さないェ ピトープグループ VIの抗体とは若干異なるェピトープを認識していると考えら れる為、便宜上これらをェピトープグループ Viaと称することとした。 さらに、' 実施例 16においてェピトープグループ VIに属し、 ェピトープグループ I と拮抗 阻害反応を示さない抗体群は A75G、 P76Gおよび N78Aに対する結合力低下が見
167 られる抗体群と A75G 、 P76G、 N78Aおよび N137Aに対する結合力低下が見られ る抗体群に分かれた。 そこで A75G、 P76Gおよび N78Aに対する結合力低下が見 られる抗体群を便宜上ェピトープグループ VIb、 A75G 、 P76G、 N78Aおよび Nl A に対する結合力低下が見られる抗体群を便宜上ェピトープグループ Vic とした (表 2 0 )。実施例 16において、ェピトープグループ Viaに属する抗体 Necl- 141-3 はいずれのアミノ酸置換体に対しても wild type とほぼ同等の結合力を示し、 ェピトープグループ Vlbや Vicとェピト一プが'異なることが示唆された。また、 実施例 1 7においてェピトープグループ に属する抗体の中には F173Aに対す る結合力低下を示す抗体群が見出された。 そこで F173Aに対する結合力低下が 見られるェピトープグループ Wに属する抗体群を便宜上ェピトープグループ1 νπ a、 それ以外のェピトープグループ1 WIに属する抗体群を便宜上ェピトープグルー °Wbとした （表 2 0 )。
168 表 2 0
Figure imgf000171_0001
実施例 19 抗 Nectin - 2ヒトモノクローナル抗体の可変領域の塩基配列、ァミノ 酸配列 ， 実施例 1 で作製した抗 Nectin - 2 ヒ トモノクローナル抗体 Necl- 244 - 3、 Necl- 530- 1、 Necl - 554— 1、 Necl - 803 - 2、 Necl- 834-1、 Necl - 845 - 2、 Necl- 903-1、
169 Nec8-4116-8の可変領域の塩基配列、ァミノ酸配列を以下の手法により決定した。 具体的には SuperScriptlll Cells Direct cDNA Synthesis System (Invitrogen 社）を用い、 実施例 1で樹立した抗 Nectin- 2 ヒ トモノクローナル抗体産生ハイ プリ ドーマ 3〜10 X 105個を 80 / Lの PBSに懸濁させ、 そのうち 1 μ Lを水上で RNaseOUT Ι μ Ιと Resuspension Buffer 10 Lの入った PCRチューブにカロえ、 75。Cで 10分間加熱した。 次に氷上で lO X DNasel Buffer 1. と DNasel 5 μ ΐを加え、 室温で 5分間放置後、 チューブを氷上に戻し、 25 mM EDTA 1. 2 μ Ι を加え、 70°Cで 5分間加熱した。 続いて 01 igo (dT) 2。 と 10 mM dNTP Mix 1 μ Lを加え 70。Cで 5分間加熱後、氷上で 2分間放置し、 5 X RT Buffer 6 μ L、 RNase OUT l L、 SuperScriptlll RT 1 μ L、 および 0. 1 mM DTT 1 μ Lをカ卩ぇ 50°Cで 50 分、 さらに 85°Cで 5分間反応させて cDNAを合成した。
各ハイブリ ドーマより合成した上記 cDNAを铸型にし、 Necl- 244-3、 Necl- 530-1、 Necl- 803- 2、 Necl_834- 1、 Necl- 845- 2、 Necl- 903 - 1の H鎖遺伝子はプライマー 176 (配列番号： 176) およびプライマー 177 (配列番号： 177)、 L鎖遺伝子はプ ライマー 178 (配列番号： 178) およびプライマー 179 (配列番号： 179) を用い て、 Nec8 - 4116- 8の H鎖遺伝子はプライマー 177およびプライマー 178、 L鎖遺伝 子はプライマー 180 (配列番号： 180) およびプライマー 179 を'用いて、 また、 Necl - 554- 1の H鎖遺伝子はプライマー 181 (配列番号： Ιδΐ) およびプライマー 177、 L鎖遺伝子はプライマー 182 (配列番号： 182) およびプライマー 179 を用 いてそれぞれ PCR法により増幅させた。該反応における反応液の組成は上記 cDNA 4 レ K0D— Plus -（TOYOBO社） 1U、 プライマー各 0. 3 /z Mヽ dNTPs 200 μ Μ, MgS04 1 mM、 lO XPCR buffer (TOYOBO社）を含む合計' 50 μ ίとした。 PCRは 94°C · 2分の 後、 94°C · 15秒、 60°C · 30秒、 68°C · 1分のサイクルを 30回繰り返し、 続いて 68°C · 5分間加熱して行った。 H鎖遺伝子は PCR終了後の反応液 を鍚型に して再度上記と同様の PCRを行つた。該 PCR産物は PCR Purification Kit (QIAGEN 社） を用いて精製し、 EB buffer 75uLに溶出した。
DNA塩基配列決定のための反応は上記の PCR産物精製溶液を 10 μ L、 ABI PRISM BigDye Terminator v3. 1 Cycle Sequencing Kit Cycle Sequencing Mix (Applied Biosystems社） 8 μ L、 プライマー 183 (配列番号： 183) 3. 2 pmolからなる容量
170 20 /z Lの溶液を用い、 96°C · 2分の後、 96°C · 10秒、 50°C · 5秒、 60°C · 4分の サイクルを 25回繰り返して行つた。反応液の精製は Sephadex G- 75 Superfine (GE healthcare社）を用いて蒸留水 30 μ Lに置換して行った。 この反応生成物を t»NA 配列解析装置 ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems社） に供し、 同装置に添付 のマニュアルにより DNA配列を決定した。 各抗体のァミノ酸配列は DNA配列よ り常法に従って推定した。
. その結果、 Necl-244-3の H鎖可変領域は配列番号： 187で表されるアミノ酸配 列をコードする塩基配列 （配列番号： 191)、 Necl-244-3の L鎖可変領域は配列 番号： 195 で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列 （配列番号： 199)、 Necl-530-l の H鎖可変領域は配列番号： 203で表されるァミノ酸配列をコード する塩基配列 （配列番号： 207)、 Necl-530-l の L鎖可変領域は配列番号： 211 で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列 （配列番号： 215)、 Necl-554-l の H鎖可 領域は配列番号： 219で表されるァミノ酸配列をコ一ドする塩基配列 (配列番号： 223)、 Necl-554-lの L鎖可変領域は配列番号： 227で表されるァ ミノ酸配列をコードする塩基配列 （配列番号： 231)、 Necl-803-2の H鎖可変領 域は配列番号： 235で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列 （配列番号： 239)、 Necl-803-2の L鎖可変領域は配列番号： 243で表されるアミノ酸配列を コードする塩基配列（配列番号： 247)、 Necl-834-lの H鎖可変領域は配列番号： 251で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号： 255)、 Necl- 834-1 のし鎖可変領域は配列番号： 259で表されるアミソ酸配列をコ一ドする塩基配列 (配列番号： 263)、 Necl - 845 - 2の H鎖可変領域は配列番号： 267で表されるァ ミノ酸配列をコ一ドする塩基配列 （配列番号： 271)、 Necl- 845 - 2の L鎖可変領 域は配列番号： 275で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列 （配列番号： 279)、 Necl- 903-1の H鎖可変領域は配列番号： 283で表されるアミノ酸配列を コードする塩基配列（配列番号： 287)、 Necl- 903- 1の L鎖可変領域は配列番号： 291 で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列 （配列番号： 295 )、 Nec8-4116-8の H鎖可変領域は配列番号： 299で表されるァミノ酸配列をコ一ド する塩基配列 （配列番号： 303)、 Nec8- 4116- 8の L鎖可変領域は配列番号： 307 で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列 （配列番号： 311)、 であること
171 が明らかとなった。
ここで られた抗体の重鎖の C D R 1〜3 (ァミノ酸配列） の組合せは表 2 1 に記載される通りである。 また、 その抗体軽鎖の C D R 1〜3 (アミノ酸配列） の組合せは表 2 2に記載される通りである。 また、 ここで得られた抗体の重鎖 の C D R 1〜3 (塩基配列） は、 表 2 1に記載のアミノ酸配列をコードする塩 基配列であり、 その組合せは、 表 2 3に記載される通りである。 また、 ここで 得られた抗体の軽鎖の C D R 1〜 3 (塩基配列） は、 表 2 2に記載のァミノ酸 配列をコードする塩基配列であり、 その組合せは、.表 2 4に記載される通りで める。
更に、 ここで得られた抗体の可変領域のアミノ酸配列および塩基配列は、表 2 5に記載した通りである。
参考のため、図 1にこれら各抗体の H鎖および L鎖可変領域のァミノ酸配列を、 また図 2および 3にそれぞれの塩基配列を示す。
抗 Nectin-2抗体重鎖の CDR配列（アミノ酸配列)
Figure imgf000174_0001
配列後ろのカツコ内の数字は配列番号を表す。
172 表 22 抗 Nectin-2抗体軽鎖の CDR配列（アミノ酸配列)
Figure imgf000175_0001
配列後ろのカツコ内の数字は配列番号を表す。
173 表 23 抗 Nectin- 2抗体重鎖の CDR配列（塩基配列）
Figure imgf000176_0001
配列後ろのカツコ内の数字は配列番号を表す。
174 表 24 抗 Nectin- 2抗体軽鎖の CDR配列（塩基配列)
Figure imgf000177_0001
配列後ろのカツコ内の数字は配列番号を表す。
175 表 25 抗 Nectin-2抗体可変領域の塩基配列およびアミノ酸配列
Figure imgf000178_0001
配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分ぺプチドまたはそ の塩に対するヒトモノクローナル抗体は例えば、癌 （例、大腸癌、 乳癌、肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 ·治療剤 (好ましくは、 乳癌、 肺癌、 大腸癌、 前立腺癌、 卵巣癌、 鸱臓癌などの予防 - 治療剤）、 癌細胞のアポトーシス促進剤、 癌細胞の増殖阻害剤、 癌細胞の細胞周 期変化の誘発剤、 エフェクター細胞依存性の癌細胞障害剤などとして安全に使 用することができる。 参考例 3 6 抗 Nectin-2ヒトモノク口ーナル抗体の作製 '
(i)参考例 1 6で調製した Nectin - 2 δの細胞外領域 (Metし Gly361)とヒ ト 抗 体 Fc領域 (Pro217- Lys447)との融合タンパク質をコードする動物細胞発現べクタ
176 一をヒ ト 293F 細胞株（Invitrogen 社）に一過性発現させて調製した組換え Nectin- 2ED - hFc融合タンパク質 (1. 6 mg/mL PBS溶液） または（ii) Nectin - 2 δ の細胞外領域（Met1 - Gly361)と FLAGタグ（Asp- Tyr - Lys- Asp- Asp - Asp - Asp- Lys) の 融合タンパク質をコードする動物細胞発現ベクターをヒ ト 293F 細胞株 (Invitrogen 社）に一過性発現させて参考例 1 3で p製した組換え Nectin- 2ED-FLAG融合タンパク質 （2 mg/mL PBS溶液） と、 フロインド完全ァジ ュバント（Mfco社）とを等容量混合してエマルションを調製した。
これらのエマルシヨンを KMマウス （10週齢、 12週齢、雄；キリンビール (株）） 各 5匹の皮下および皮内にそれぞれ 10〜50 /z g/匹ずつ初回免疫した。 2回目以 降は組換え Nectin - 2ED - hFcタンパク質または組換え Necin - 2ED - FLAGタンパク 質とフロインド不完全アジュバント（D CO社）とを等量混合して調製したエマ ルシヨンを同様に 2週間毎に追加免疫した。 また、 Nectin- 2 δを安定発現する 組換え FM3A細胞株 (#60-6) ( P C T/ J P 2 0 0 6 / 3 2 0 4 2 9を参照）や Nectin- 2 δを安定発現する組換え NS0細胞株 （#2-75) をフラスコ培養し、 これ を回収して洗浄操作により血清成分を除去した後、マイトマイシン C (和光純薬 睡） で 37°C、 30分間処理した。 マイトマイシン C処理した両細胞株を 10 mLの PBSで 3回洗浄後、 2 X 107個/ mLになるよう PBSに再懸濁させ、 これらを KMマ ウス （キリンビール㈱； 10週齢一 12週齢、雄） 各 5匹の腹腔内に 1 X 107個/ 500 Lずつ 1週間毎に繰り返し免疫した。
さ らに、 上記の組換え Nectin- 2ED- hFc タンパク質または組換え Nectin - 2ED- FLAGタンパク質と、フロインド完全アジュバントとを等容量混合し て調製したエマルシヨンを KMマウス （12週齢、雄） 各 5匹の皮下おょぴ皮内に それぞれ 10〜50 /i g/匹で免疫し初回免疫した。 初回免疫の 1週間後に上記の方 法によりマイトマイシン C処理した Nectin- 2 δ発現組換え FM3A細胞株を 1 x 107 個/ 500 /z Lずつ腹腔内に免疫した。 3回目は組換え Nectin- 2ED- hFcまたは組換 え Nectin- 2ED - FLAG とフロインド不完全アジュバントとを等容量混合して調製 したエマルシヨンを皮下および皮内にそれぞれ免疫し、同時にマイトマイシン' C 処理した Nectin- 2 δ発現組換え FM3A細胞株 （#60-6) を 1 x 107個/ 500 /z Lず つ腹腔内に 1週間毎に免疫した。 4回目以降は上記の方法によりマイトマイシン
177 C処理した Nectin-2 5発現組換え FM3A細胞株 （#60-6) のみを 1 x 107個/ 500 /i Lずつ腹腔内に免疫した。
免疫開始前および免疫後に全てのマウスからエーテル麻酔下、 眼底採血して 抗血清を取得し、 以下に述べるフローサイトメ トリー法により血清抗体価を調 ベた。 すなわち、 Nectin- 2 δを安定発現する組換え CH0細嗨株 （#43-2) ( P C T/ J P 2 0 0 6 / 3 2 0 4 2 9を参照）と mock- CH0細胞株の細胞懸濁液 (PBS) をそれぞれ 5 X 105個ずつポリプロピレンチューブに分注し、 遠心分離 （1，200 rpm X 5分） により PBSを除去した。 これらの細胞残渣を、 1% BSA と 10% FBS とを含有する PBSで 100倍希釈した上記マゥス抗血清 50 Lずつに再懸濁させ、 氷上喑所で 30分間反応させた。 この細胞懸濁液に PBSを 200 μ L加え遠心分離 (1, 200 rpm x 5分） した後、 上澄液を吸引除去し、 細胞残渣を 1% BSAと 10% FBS とを含有する PBS で 100 倍希釈した anti- human IgG (H+L) Alexa 488 (Invitrogen ¾t) 溶液 50 μ Lに再懸濁させ、 氷上暗所で 30分間反応させた。 こ の細胞懸濁液を同様に PBSで 3回洗浄した後、 細胞残渣を PBS 200 Lに再懸濁 させ、 フローサイトメーター MPL500 (BECKMAN COULTER社） を用いて各細胞の蛍 光強度を測定し、 横軸に蛍光強度を縦軸に細胞数をとったグラフを作成して血 清抗体価を比較した。
上記の方法で十分な血清抗体価上昇が確認された KM マウスのうち、 組換え Nectin-2ED-hFcまたは組換え Nectin - 2ED-FLAGを免疫した個体にはこれらのタ ンパク質抗原を尾静脈注射し、 また Nectin-2 S 'を安定発現する組換え細胞株を 免疫した個体には同細胞株を腹腔内注射した。 これらの最終免疫 3 日後に該マ ウスを放血死させて脾臓を摘出し、得られたマウス脾臓細胞と、 あらかじめ 10% FBSを含有する Daigo T培地 （F- 12 Nutrient Mixture (HAM) (Invitrogen社） t Iscove ' s Modified Dalbecco' s Medium (Invitrogen ¾；) との等量混合培 ±也に MEM Non- Essential Amino Acid Solution (Invitrogen社)、 Sodium Pyruvate (Invitrogen社）、およぴ L— Glutamine (Invitrogen社）を添加したもの） 500 mL に対し8 - Azaguanine (HybriMax, Sigraa- Aldrich社） 1バイアルを溶解させた培 地で馴化培養しておいたマウスミエローマ細胞 P3X63Ag8U. 1 (P3U1) (ATCC) とを 5 : 1の割合で混合し、 ポリエチレングリコール （PEG) 1, 500 (Roche Diagnotics
178 社） を用いて融合させた。 細胞融合操作は試薬に添付のマ-ユアルに従って行 つた。 融合後の細胞を 10% FBSと 10% BM Condimed HI (Roche Diagnotics社） とを含有する Daigo T培地に再懸濁させ、 96ゥエル培養プレートに脾臓細胞' 5 X 104個/ 100 L/ゥ ルで播種した。 これを 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 1 日間培 養した後、 0. 1 mMヒポキサンチン、 0. 4 μ Mアミノプテリン、 0. 016 mMチミジン (HAT) , 10% BM Condimed HIおよび 10% FBSを含有する Daigo T培地 （HAT選 択培地） を 100 μ 1/ゥヱル添カ卩し、 さらに培養上清の 3/4を 3日毎に 2回、新鮮 な HAT.選択培地に交換しながら、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで培養を継続した。 培養 7 日目〜 14日目にかけてコロニーの増殖が見られたゥエルの培養上清を Nectin-2 δを安定発現する組換え CH0細胞株 （#43-2) または mock-CHO細胞株 を用いた Cell ELISAでスクリーニングし、 抗 Nectin - 2 ヒ トモノクローナル抗 体産生ハイプリ ドーマを樹立した。 すなわち、 Nectin-2 δを安定発現する組換 え CH0細胞株 (#43-2)と mock_CH0細胞株を 10%透析 FBS、および GS supplement を含有する GS選択 DMEM培地（Dulbecco' s Modified Eagle Medium； Invitrogen 社）を用いて 96 ゥエル組織培養プレートで培養した。 各細胞株がコンフルェン トに達したプレートの培養上清を吸引除去した後、 2% FBSを含有する？8≤ (+) を 200 i L/ゥエルずつ添加し、氷上暗所で 1時間ィンキュベートした。各ゥエル の上澄液を吸引除去した後、 ハイプリ ドーマ培養上清を 50 μ ΐ7ゥエルずつ添加 し、 氷上喑所で 2時間反応させた。 このプレートを 4°Cに冷やした PBS (+) で 1 回洗浄した後、 2% FBSを含有する PBS (+) で 3， 000倍希釈した anti- human IgG (H+L) chain specific (GOAT) peroxidase conjugate (CALBI0CHEM社） を 100 μ L/ゥエルずつ添加し、氷上暗所で 2時間反応させた。 プレートを 4°Cに冷やし た PBS (+) で 3回洗浄した後、 3， 3 ' ，5， 5， tetramethylbenzidine (TMB) 溶液 ( SureBlue Microwell TMB peroxidase suostrate ； Kirkegaard & Perry Laboratories社） を 100 / L/ゥ土ルずつ添加し、 室温 5分間発色させ、 2 N硫酸 (和光純薬㈱） を 100 μ ί/ゥエルずつ添加して酵素反応を停止させた。各ゥエル の吸光度（450 nm)をプレートリーダー（Multiskan BICHR0MATIC； Thermo Electron Co. ) を用いて測定し、 Nectin- 2発現組換え CH0細胞株を播種したプレートの吸 光度が 0. 5以上で、 かつ mock- CH0細胞株を播種したプレートの吸光度が 0. 3未
179 満のものを陽性ゥエルと判定した。 これらの中から特に抗原特異性と親和性の 高い IgG抗体産生ハイプリ ドーマを選択し、 10% FBSと 10%應 Condimed HIと を含有する Daigo T培地に再懸濁させた。 これらの細胞株を 96ゥヱル組織培養 プレートに 0.5個/ゥエルで播種し、 顕微鏡観察によりモノクローンである事を 確認したハイプリ ドーマの培養上清を上記 Cel 1 ELISAで再庳スクリーニングし て 258種類の抗 Nectin - 2ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマ 'クロー ンを樹立した。
こうして得た抗 Nectin - 2 ヒトモノクローナノレ抗体産生ハイブリ ドーマを 100 mLの 10% FBS Ultra low IgG (Invitrogen社） を含有する Daigo T培地中でフ ラスコ培養し、 培養上清を遠心分離 （1， 200 rpm X 5分） してその上澄液を取得 した。 これらの培養上清に PBSで平衡化したプロテイン A Sepharose FF 200 μ L (GE Healthcare Bio - science社） を添加し 4°Cで終夜緩やかに振とうさせて抗 体を吸着 せた。 このプロテイン A担体を遠心分離操作により回収し、 PBSで洗 浄後、 0.3 M NaCl含有 0.1 M ダリシン- HC1 (pH3.0) 1.2 mLにて IgG画分を溶 出した。 この溶出液に 1 M Tris-HCl (pH 8.0) を加えて速やかに中和した後、 限外濾過膜 (ビバスピン 6：分画分子量 10 kDa) (Sartorius社） を用いた限外 濃縮操作により PBSにバッファー置換し、 これを抗 Nectin - 2ヒトモノクローナ ル抗体標品として^ w'iro性状解析に用いた。
抗体産生ハイプリ ドーマ ·クローンのなかから、本発明に用いられる抗体を産 生するハイプリ ドーマ 'クローンである N e c 1— 803— 2 (FERM B P— 1041 7)、 Ne c 1 -244-3 (F ERM BP— 10423)、 N e c l-530-1 (F ERM B P— 10424 )、 N e c 1 _ 903— 1 (F ERM B P— 10425)、 Ne c 1— 520— 1 (FERM BP— 104 26)、 Ne c 1 -845- 2 (FERM BP— 10427)、 Ne c l— 8 34- 1 (F ERM B P— 10428 )、 N e c 1— 964 _ 1 (F E RM B P— 10683)、 N e c 1— 1 302— 2 (FERM BP— 10684)、 Ne c l— 554— 1 (FERM B P— 10681 )、 N e c 1— 769— 2 (FERM B P— 10682)、 N e c 8— 41 16 _ 8 (FERM BP— 10685)、 Ne c l— 1044— 4、 Ne c 8— 351 7— l lまたは N e
180 c 8 - 3 7 0 4 - 7を得た 参考例 3 7 本発明に用いられる抗体と Nectin-2に対し競合的に結合する抗体 の選択
参考例 3 6で作製した本発明に用いられる抗体と Nectin-2に対し競合的に結 合するモノクローナル抗体は以下に述べる方法により選択した。
まず、 抗 Nectin- 2ヒ トモノクローナル抗体同士の Nectin-2に対する競合的 結合阻害反応を行うため、 参考例 3 6で取得した抗 Nectin- 2ヒトモノクローナ ル抗体を被試験抗体としてビォチンで標識した。 すなわち、 抗 Nectin- 2ヒ トモ ノクローナル抗体 10 μ gを Biotin Labeling Kit - NH2 (Dojindo社） に付属の WS Buffer 50 / Lに添加し、 Microcon YM50 (MILLIP0RE社） を用いて溶液量がほと んど無くなるまで限外濃縮した。 この残液に Biotin Label ing Kit-NH2 に付属 の Reaction Buffer 50 μ L、および 50 μ Lの DMS0に溶解した腿 2 Reactive Biotin 4 z Lを順次添加し、 37°Cで 10分間反応させた。 この反応混合物を再度限外濃縮 操作により WS Bufferにバッファー置換し、 ピオチン標識抗 Nectin - 2ヒトモノ ク口ーナル抗体を調製し、 これらを以下のァッセィに使用した。
参考例 3 6で作製した本発明に用いられる抗体 （非標識抗 Nectin- 2 モノク ローナル抗体） を、 FBSを含有する PBSで 25 g/mLに希釈した溶液 5 i L、 Nectin-2 δ安定発現 CH0細胞株（#43-2)を 2% FBSを含有する PBSに懸濁させた 懸濁液（2 105個/ mL) 15 μレ およぴ Streptavidin-Alexa Fluor 647 conjugate (Invitrogen社） 5 μ Lを FMAT plate (384well plate Black/Clear Bottom with Lid ; Applied Biosystems社） に添加し、 これらを混合した後室温で 10分間反 応させた。 このプレートに上記の方法で作製したビォチン標識抗 Nectin-2ヒト モノクローナル抗体 （被試験抗体） を 2% FBSを含有する PBSで 0. 5 μ g/mLに希 釈した溶液 5 μ Lを添加し、 室温で 60分間ィンキュベートした。 対照実験とし て非標識抗 Nectin - 2モノクローナル抗体溶液の代わりに同容量の 2% FBSを含 有する PBSを添加したゥヱルを設けた。 この Nectin- 2に対する競合的結合阻害 反応をビォチン標識に供した被試験抗体と本発明に用いられる抗体との全ての 組合せについて行った。 各ゥヱルの蛍光強度（FL1 total 値）を Appl ied
181 Biosystems 8200 Cellular Detectionシステム (Applied Biosystems社) を用 いて測定した。 抗 Nectin-2ヒトモノクローナル抗体の各組合せにおける競合的 結合阻害率は以下に示す式を用いて算出した。 ' 競合的結合阻害率 = (1-A/B) X 100
A；被試験抗体に、 非標識抗体を添加したゥヱルの FL1 total値
B ;被試験抗体に、 非標識抗体を添加していないゥヱルの FL1 total値 本手法により、 例えば、 参考例 3 6で作製した抗 Nectin-2ヒ 卜モノクローナ ル抗体の中から Nectin-2に対して Necl - 554 - 1 と競合的に結合する抗体として 例えば Nec 1-1044- 4と Necl-1302 - 2を選択的に取得した。 また Nectin - 2に対し て Nec8-4116-8 と競合的に結合する抗体と して例えば Nec8- 3704 - 7 と Nec8 - 3517-11を選択的に取得した。
表 2 6に抗 Nectin- 2 ヒ トモノクローナル抗体によるピオチン標識 Nec8-4116-8と Nectin - 2との結合阻害率を、また表 2 7に抗 Nectin- 2ヒトモノ ク口ーナル抗体によるビォチン標識 Necl - 554 - 1 と Nectin - 2 との結合に対する 競合的結合阻害率を示す。
なお、 こうして選択された本発明に用いられる抗体と Nectin - 2に対して競合 的に結合する抗体 Nec卜 1044— 4と Necl— 1302- 2、 Nec8- 3704— 7 と Nec8— 3517 - 11 は、 それぞれ寄託されている。 表 2 6
Figure imgf000184_0001
182 表 2 7
Figure imgf000185_0001
参考例 3 8 組換え抗 Nectin - 2 ヒ トモノクローナル抗体（Nec8- 4116-8)の大量 調製 ·
組換え抗 Nectin - 2 ヒ トモノクローナル抗体（Nec8- 4116-8)は該抗体遺伝子を CH0K1SV 細胞株（Lonza Biologies)に安定発現させることにより調製した。 抗 Nectin- 2 ヒ トモノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマ Nec8- 4116-8の培養上清 から Protein Aカラムを用いて精製した抗体標品の H鎖と L鎖を還元条件下で SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動を行って分離し、 H鎖、 L鎖タンパク質を PVDF膜に転写した。 H鎖は N末端がピロダルタミルイ匕されている事が多い為、 Pfu Pyroglutamate Aminopeptidase (タカラ/ ィ才）を用レヽてヒ。ログノレタミン酸 除去反応を行つた。 PVDF膜に転写したタンパク質の N末端ァミノ酸配列はプロ ティンシーケンサー（ABI)を用いて決定した。 こうして得られた N末端アミノ酸 配列 （H 鎖 （配列番号： 3 1 2 )、 L 鎖 （配列番号： 3 1 3 ) ) を V BASE (http：〃 vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk)を用いてホモロジ一検索し、 上記ァミノ酸 配列と合致する germline (VH4、 VKIIIA27)とそれから予測されるシグナル配列の N末端をコードする塩基配列 (H鎖 （配列番号： 3 1 4 )、 L鎖 （配列番号： 3 1 5 ) )を選択した。 これらのシグナル配列に制限酵素 Hind III サイトと Kozak 配列を付加したオリゴ DNAをフォワードプライマー（H鎖（配列番号： 1 7 6 )、 ' L鎖 （配列番号： 1 8 0 ) ) として合成した。 一方、 リバースプライマーとして
183 抗体 H鎖および L鎖遺伝子の終止コドンの下流に制限酵素 EcoR Iサイトを付加 したオリゴ DNAをそれぞれ合成した (H鎖 （配列番号： 3 1 6 )、 L鎖 （配列番 号： 3 1 7 ) )。 ハイプリ ドーマ細胞 （Nec8- 4116- 8) から SuperScriptlll Cells Direct cDNA Synthesis System (Invitrogen社）を用いて調製した cDNAを铸型 にし、 上記のプライマーを用いて PCRを行い Nec8- 4116- 8抗体 H鎖おょぴ L鎖 の全長遺伝子をそれぞれ取得した。
こうして得られた H鎖遺伝子、 L鎖遺伝子を制限酵素 HindIII、 EcoRIでそれ ぞれ消化した後、 その精製 DNA 断片を動物細胞発現ベクター PEE6. 4 (Lonza Biologies社)およびグルタミン合成酵素 (GS)遺伝子を含有する動物細胞発現べ クタ一 pEE12. 4 (Lonza Biologies社）の Hind III - EcoR Iサイトへそれぞれ揷 入し、 H鎖発現ベクター、 L鎖発現ベクターを構築した。 さらに、 各ベクターか ら制限酵素 Not I/Sal I消化により切り出した H鎖遺伝子挿入フラグメントと L 鎖遺伝子挿入フラグメントを単離した後、 ライゲートさせ、 GS遺伝子、 H鎖遺 伝子、 L鎖遺伝子を共に含むダブルジーンベクターを構築した。 このベクターを Lonza Biologies社のマニュアルに従つて CH0K1SV細胞にトランスフエクション し、 Methionine Sulphoximine (MSX)を含む培地中、 96ゥエル組織培養プレート で選択培養した。 単一コロニーが増殖したゥエルの培養上清中のヒト抗体濃度 を ELISAで定量し、 22種類の Nec8- 4116-8を安定的に高発現する組換え細胞株 を選択した。 これらの細胞株を拡大培養した後、 無血清培地に浮遊馴化し、 細 胞增殖性と抗体生産性の高い Nec8- 4116- 8 安定発現 CH0K1SV 細胞株（Clone 25 - 78)を樹立した。
上記 CH0K1SV細胞株を 25 M methionine sulphoximine (MP Biomedicals社） および GS supplement (50 X、 SAFC社）を含む ProCH05培地（Cambrex社）で 37°C、 5 %炭酸ガス気流中で拡大培養した後、 2 L ジャーフアーメンターを用いて 32 日間攪拌培養 (37°C、 溶存酸素濃度 2 mg/L pH 6. 7〜7. 0、 攪拌回転数 80 rPm、 通気 100〜300mL/min)した。この期間中、培地の成分分析を基にグルコース溶液、 L-グルタミン溶液、 GS supplement (50 X、 SAFC社）、 Amino Acids (50 X、 SAFC 社）、 Trace Elements (10， 000 X、 SAFC社）、 Vitamins (100 X、 SAFC社）および Soy Hydrolysate (50 X、 SAFC社）を添加した。 細胞生存率が約 10%まで低下した時点
184 で主培養を終了した。
次にこの培養上清を遠心分離（7， 460 X g、 20分間） してその上澄液を回収し、 これを限外ろ過膜 （Hydrosart膜、 分画分子量 10, 000； Sartorius社） を用いて 濃縮し、 0. 15 M NaClを含有する mMリン酸緩衝液 (pH 7. 0)に置換した。 この 濃縮液を遠心分離（14， 300 X g、 20分間）して上澄液を得、 それを更にフィルタ 一ろ過 (Stericup HV、 0. 4δ m； Millipore社） して濃縮液を得た。 これを 0. 15 M NaClを含有する 20 mMリン酸緩衝液 (pH 7. 0)で平衡化した Protein A Sepharose カラム（22 mmID x 79 mm、 GE Healthcare社）に吸着させ、 20カラム容量の同緩 衝液でカラムを洗浄した後、 カラムに結合した抗体画分を 0. 1 M クェン酸ナト リゥム緩衝液 (pH 3. 0)により溶出させた。 この溶出液に直ちに 1/10容量の 1 M Tris-HCl 緩衝液 （pH 9. 0) を加え中和した後、 この抗体溶液を限外ろ過膜 (AmiconUltra, 分画分子量 30， 000； Millipore社） を用いて濃縮した。 これを PBSで平衡化させた Superdex 200カラム （26 mmID x 60 cm、 GEHealthcare社) に供し、 同緩衝液で溶出して抗体単量体画分を得た。 さらにこの抗体画分を PBS で平衡化した ActiClean EtOXカラム （25 mmID x 59腕、 Sterogene社） に供し てエンドトキシンを除去し、 限外ろ過膜 （AmiconUltra、 分画分子量 10， 000； Millipore社） を用いて濃縮し、 無菌ろ過 (Millex GVヽ 0. 22 m； Millipore社） して組換え Nec8- 4116- 8精製標品を得た。こうして得られた精製抗体は SDS- PAGE および Superdex 200カラムを用いたゲルろ過 HPLCで 95%以上の純度を示した。 また、 抗体標品のエンドトキシン含量をエンドスぺシ一 ES-24Sセット （生化学 工業社) とトキシカラー DIAセット (生化学工業社) を用いて分析したところ、 0. 1 EU/mg抗体以下であった。 参考例 3 9 抗 Nectin - 2 ·ヒトモノクローナル抗体 (Necl- 554-1)の大量調製 抗 Nectin - 2 ヒトモノクローナル抗体 Necl- 554- 1は該抗体産生ハイブリ ドー マ細胞株 （Necl-554- 1) から以下の方法により調製した。 ハイプリ ドーマ細胞 株 Necl- 554-1を 10 % FBS (Ultra-Low IgG, Invitrogen社）を含有する IH培地 (Iscove s Modified Dulbecco' s Medium ： Ham' s F - 12=1 : 1、 0. 1 mM MEM非 必須ァミノ酸溶液、 1 mM ピルビン酸ナトリゥム溶液、 2 mM L-グルタミン溶液；
185 Invitrogen社） で 37°C、 5 %炭酸ガス気流中で拡大培養した後、 1次馴化培地 (IH培地： CD Hybridoma Medium, 8 mM L -グルタミン溶液 =1 : 1、 Invitrogen社） に拡大して 1日培養し、 さらに主培養培地（IH培地： CD Hybridoma Medium, 8 mM L-グルタミン溶液 =1 : 3； Invitrogen社）に拡大して 50 L操拌培養槽を用いて 5 〜7日間培養（37°C、 溶存酸素濃度 2 / pH 7. 0、 攪拌回転数 40 rpm)した。 この期間中、 培地の成分分析を基にグルコース溶液および L-グルタミン溶液を '添加した。 細胞生存率が約 50%まで低下した時点で主培養を終了した。
次にこの培養上清を遠心分離（7， 460 X g、 20分間） してその上澄液を回収し、 これを限外ろ過膜 （Hydrosart膜、 分画分子量 10， 000 ； Sartorius社） を用いて 濃縮し、 0· 15 M NaClを含有する 20 mMリン酸緩衝液 (pH 7. 0)にバッファ一置換 した。 これを遠心分離 （14, 300 X g、 20分間） して上澄液を得、 更に精密ろ過 (3セ 1^
Figure imgf000188_0001
社） して濃縮液を得た。 これを 0. 15 M NaCl を含有する 20 mM リン酸緩衝液 (pH 7. 0)で平衡化した Protein A Sepharose力 ラム（22 腿 ID X 79 mm、 GE Healthcare社）に吸着させ、 20カラム容量の同緩衝 液でカラムを洗浄した。 カラムに結合した抗体画分は 0· 1 M タエン酸ナトリウ ム緩衝液 (pH 3. 0)により溶出させ、 直ちに 1/10容量の 1 M Tris-HCl緩衝液 (pH 9. 0) を加え中和した。
こうして得た精製抗体画分は例外的に活性抗体と不活性抗体との混合物であ る事が分かった。 そこで、 この抗体画分をさらに 20 mM酢酸ナトリゥム緩衝液 (pH5. 0) で 3倍希釈し、 100 mM NaClを含有する 20 mM酢酸ナトリゥム緩衝液 (pH 5. 0) で平衡化させた SP- 5PW陽イオン交換カラム （21. 5 mmlD x 150 mm, 東ソ一社） に吸着させた。 このカラムを約 2 カラム容量の同緩衝液で洗浄した 後、 溶離液の NaCl濃度を 70分間で lOOmMから 300mMへ上昇させる直線濃度勾 配溶出法により 3つの溶出画分として分離した。 これらの溶出画分の Nectin - 2 に対する結合活性を固相化組換え Nectin- 2- ED - Fcタンパク質を用いた ELISAで 測定し、 最も高い比活性を示した抗体画分 (SP3)を抗 Nectin-2抗体画分として 回収した。 こうして得た抗体溶出液を限外ろ過膜 （AmiconUltra、 分画分子量 30, 000； Millipore社） を用いて濃縮した後、 PBSで平衡化させた Super dex 200 カラム （26 mmlD x 60 cm、 GE Healthcare Bio- Sciences社） に供し、 同緩衝液
186 で溶出して抗体単量体画分を得た。 これを PBSで平衡化した ActiClean EtOX力 ラム (25随 ID X 59 mm、 Sterogene社) に供してェンドトキシンを除去した後、 限外ろ ίί膜（Ami conUltra、分画分子量 10， 000； Mi l l ipore社）を用いて濃縮し、 さらに無菌ろ過 （Mi l lex GV、 0. 22 Mi l l ipore社） して精製抗体を得た。 こ の精製抗体を Nec l- 554 - 1 SP3と命名した。 .
こうして得られた精製抗体は SDS- PAGEおよび Superdex 200カラムを用いた ゲルろ過 HPLCで 95%以上の純度を示した。 また、 抗体標品のエンドトキシン含 量をエンドスぺシ一 ES- 24Sセット （生化学工業社） およびトキシカラー DIAセ ット （生化学工業社） 用いて分析したところ、 0. 1 EU/mg抗体以下であった。 実施例 2 0 抗 Nectin - 2 ヒトモノクローナル抗体のヒト乳癌細胞株に対する ADCC
参考例 3 6およひ'参考例 3 7で作製した抗 Nect in - 2ヒ 1、モノク口ーナル抗体 Necl- 554- 1、 Necl- 1044- 4、 Necl-1302- 2、 Nec8- 4116- 8、 Nec8- 3517- 11、 Nec8-3704-7の ADCCを測定した。 ターゲット細胞として実施例 2 2に記載の方 法に従って培養したヒト乳癌細胞株 MM - MB- 231 (ATCC)を用い、 エフェクター細 胞には市販の凍結ヒト末梢血単核球（ALLCELLS社）を 0. 1 nM組換え型ヒト IL- 2
(DIACL0NE Research社）、 55 μ Μ 2-メルカプトエタノ ル （Invitrogen社）、 および 10%牛胎児血清 （FBS) (JRH社） を含む RPMI IMO培地 （Invitrogen社） (以後 10 % FBS/RPMI 1640 培地と称する） 中でー晚培養したものを用いた。 Necl-1044 - 4、 Necl- 1302-2、 Nec8 - 4116-8、 Nec8- 3517- 11、 Nec8- 3704- 7 は参考 例 3 6に記載の抗体標品を、 Necl- 554- 1 は参考例 3 9に記載の抗体標品 (Necl-554-1 SP3)をそれぞれ用いた。
対数増殖期のヒ ト乳癌細胞株 MDA-MB- 231を回収し、 1. 0 x 106個の細胞に対し 250 Ciの Na2 5 1 Cr04 (GE Healthcare Bio- sciences社） を添カ卩し、 37°C、 1時 間インキュベートすることにより 5 1 Cr 標識した。 この細胞株を 10 % FBS/RPMI 1640培地で 4回洗浄した後、 10%FBS/RPMI 1640培地に対し 1 x 105個 に再懸濁させた。 ADCCは、 細胞懸濁液 50 (5 X 103 細胞） と上記の抗 体を 10%FBS/RPMI 1640培地で終濃度 0. 0015 μ g/mL, 0. 015 μ g/mL, 0. 15 μ g/mL
187 および' 1· 5 u g/mL となるように希釈した溶液 25 L とを 96 穴 RMC プレート (BI0BIK社）の各ゥヱルに添加して行った。 陰性コントロールとして非免疫ヒ ト IgG (最終濃度 O. OOlS /z g/mL 0. 015 μ g/mL, 0. 15 g/mLおよび 1. 5 g/mL) ' も しくは抗体無添加 (No Ab)時の非特異的な活性を検出するため D-PBS (Invitrogen 社）を同量添加した。 これらのプレートを氷上で 1時間ィン ュベートした後、 上述のエフェクター細胞懸濁液を 2. 5 X 105 個/ゥエルずつ加え（エフェクター 細胞： ターゲット細胞 =50： 1)、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 4時間反応させ、 各ゥエルの細胞内から培養上清中に漏出した放射活性 （Sample release) をシ ンチレーシヨンカウンター （TopCount NXT) を用いて測定した。 すなわち反応 後の細胞懸濁液を Multi- screen 0. 45 Ai m フィルタープレート （Millipora社） に移し、そのプレートを遠心分離（1， 200rpra、 10分間）して培養上清を回収した。 この培養上清 50 をマイクロシンチ 40 (Perkin Elmer社） を 150 L/wellで 添加した 96wellプレート （Costar社） に加え、 室温で 30分間混合した後、 各 ゥエルの蛍光をシンチレーシヨンカウンターを用いて測定した（表 3 3 )。 ADCC の最大傷害活性 （Maximum release) は Triton- X 100 (Sigma社） を最終濃度 1% になるように加えた場合、 また自然放出活性 （Spontaneous release) は、 エフ ェクタ一細胞のかわりに 10% FBSを含む RPMI1640培地を加えた場合め放射活性 とした。 ADCC強度の指標となる Specific lysis (%) は、 ( [Sample release] - [spontaneous releasej ) / ( LMaximum release] ― [spontaneous releasej ) xlOOとして算出した。 表 3 3
Figure imgf000190_0001
188 No Ab - 6
Ned -554-1 0.0015 8
0.015 1 1
0.15 16
1.5 16
Ned -1044-4 0.0015 10
0.015 9
0.15 9
1.5 14
Ned -1302-2 0.0015 8
0.015 8
0.15 11
1.5 14
Nec8-4116-8 0.0015 8
0.015 11
0.15 15
1.5 16
Nec8-3517-11 0.0015 10
0.015 12
0.15 15
1.5 17
Nec8-3704-7 0.0015 9
0.015 12
0.15 16
1.5 16 実施例 2 1 抗 Nect in - 2ヒ トモノクローナル抗体のヒ ト前立腺癌細胞株、 ヒ ト肺癌細胞株、 ヒト血液癌由来細胞株に対する ADCC
参考例 3 6で作製した抗 Nectin - 2 ヒ トモノクローナル抗体、 Necl - 554- 1、' Nec8 - 4116- 8 の ADCC を測定した。 ターゲット細胞としてヒ ト肺癌細胞株 NCI - H1299、 ヒ ト前立腺癌細胞株 Dul45、 ヒ ト血液癌細胞株 U937を用い、 ェフエ
189 クタ一細胞には市販の凍結ヒト末梢血単核球 （ALLCELLS社） を 0. 1 nM組換え 型ヒ ト IL-2 (DIACLONE Research社）、 55 M 2 -メルカブトエタノール (Invitrogen 社）、 および 10%牛胎児血清 （FBS) (JRH社） を含む RPMI1640培地 （Invitrogen 社） （以後 10%FBS/RPMI1640培地と称する） 中でー晚培養したものを用いた。 ヒト肺癌細胞株 NCI - H1299、 ヒト前立腺癌細胞株 Dul45、 ヒト血液癌細胞株 U937 は ATCC から購入し、 これらの細胞株は ATCC推奨の方法に準じて培養した。 Nec8- 4116- 8 は参考例 3 6に記載の抗体標品を、 Necl- 554- 1 は参考例 3 9に記 載の抗体標品（Necl- 554- 1 SP3)をそれぞれ用いた。
対数増殖期の各種癌細胞を回収し、 1. 0 X 106個の細胞に対し 250 / Ci の Na2 5 1 Cr04 (GE Healthcare Bio- sciences社） を添加して 37°C、 1時間インキュ ベートすることにより 5 1 Cr標識した。 これらの細胞株を 10%FBS/RPMI1640培 地で 4回洗浄した後、 10%FBS/RPMI1640培地に対し 1 x 105個/ mLに再懸濁さ せた。 ADCCは細胞懸濁液 50 Κ5 χ 103細胞）と上記の抗体を 10%FBS/RPMI1640 培地で終濃度 0· 0015 ju g/mL、 0. 015 /i g/mL, 0. 15 g/mLおよび 1. 5 μ g/mLとな るように希釈した溶液 25 丄とを 96穴 RMCプレート (BI0BIK社）の各ゥエルに添 加して行つた。陰性コントロールとして非免疫ヒト IgG (最終濃度 0. 0015 μ g/mL、 0. 015 μ g/mL、 0. 15 μ g/mLおよび 1. 5 μ g/mL) もしくは抗体無添加 (No Ab)時の 非特異的な活性を検出するため D-PBS (Invitrogen社） を同量添カ卩した。 これ らのプレートを氷上で 1時間インキュベートした後、 上述のエフェクター細胞 懸濁液を 2. 5 X 105 個/ゥヱルずつ加え（エフヱクタ一細胞：ターゲット細胞 = 50 : 1)、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 4時間反応させ、 各ゥエルの細胞内から培 養上清中に漏出した放射活性 （Sample release) をシンチレーシヨンカウンタ 一 (TopCount NXT) を用いて実施例 2 0に記載の方法と同様に測定した （表 3 4 )。 ADCCの最大傷害活性 (Maximum release) は Triton- X 100 (Sigma社） を 最終濃度 1% になるように加えた場合、また自然放出活性 (Spontaneous release) は、 エフェクター細胞のかわりに 10% FBSを含む RPMI1640培地を加えた場合の 放射活性とした。 ADCC強度の指標となる Specific lysis (%) は、 ( (Sample release] - L Spontaneous release] ) / ( [Ma imum release J 一 [Spontaneous release] ) xlOOとして算出した。
190 表 3 4
Figure imgf000193_0001
実施例 2 2 抗 Nectin- 2 ヒ トモノクローナル抗体の in vivo抗腫瘍活性 (MDA-MB-231 ヒト乳癌細胞株スキッドマウス肺転移治療モデル）
参考例 3 6で作製した抗 Nectin- 2ヒトモノクローナル抗体 (Nec8- 4116 - 8およ び Necl- 554- 1)の抗腫瘍活性を、 MDA- MB- 231 ヒト乳癌細胞株 （ATCCより購入） を用いたスキッドマウス肺転移治療モデルにおいて調べた。 Nec8- 4116- 8抗体標 品は参考例 3 8、 Necl- 554- 1 SP3抗体標品は参考例 3 9に記載の方法によりそ れぞれ調製したものを用いた。 MM- MB- 231細胞株は、 10% FBS (Thermo Electron 社）を含む Leibovitz' s L- 15 (Invitrogen社)培地を用い、 10 cm組織培養シャ ーレ (Coming社）に播種し、 炭酸ガス無供給下、 37°Cで培養した。 トリプシン -EDTA処理により剥離して得た対数増殖期の MM- MB- 231細胞株の懸濁液を、 遠 心分離操作（1, 000 rpm、 3 分）を用いて Hank' s Balanced Salt Solution
191 (HBSS) (Invitrogen社）で 3回洗浄した。 こうして得た細胞を HBSSに 5 x 106個 ZmLの密度で再懸濁させた。
日本クレア社より購入したスキッドマウス （C. B - 17/Icr - scid/scidjcl) (5週 齢、雌）に上記 MM- MB-231細胞懸濁液を尾静脈に 200 μ L/個体ずつ接種した。細 胞接種後 14日目に、各個体の体重を測定した後、各群の平均体重が均等 (約 20 g) になるように 1群あたり 5匹に分けた。 Necl- 554- 1の抗腫瘍活性評価実験では、 細胞接種後 14、 21、 28、 35、 42、 49日目に、 PBSで 0. 3 mg/mLもしくは 0· 03 mg/mL に希釈した Nec卜 554- 1 SP3溶液、 もしくは PBSを 10 mL/kgずつ尾静脈投与し た。 一方、 Nec8-4116-8 の抗腫瘍活性評価実験では、 細胞接種後 14、 21、 28、 35、 42、 49、 56 日目に、 PBS で 0. 3mg/mL もしくは 0. 03 mg/mL に希釈した Nec8- 4116- 8溶液、 もしくは PBSを 10 mL/kgずつ尾静脈投与した。
Necl-554-l と Nec8- 4116- 8の抗腫瘍活性は、 肺の横隔膜側に生じた癌コロニー 数を計測することで評価した。また実験群間の有意差はパラメ トリック Dumiett 型多重比較検定 (SAS前臨床パッケージ Version 5. 0)を用いて検定した。
Necl-554-lと Nec8- 4116-8はいずれの投与濃度でも、 MDA- MB- 231細胞の肺で の増殖を有意（Pく 0. 0001)に抑制した。 Necl- 554-1投与群と PBS投与群の癌コ口 ニー数（平均土標準偏差）および両群間の有意差検定値 ( value)を表 3 5に、 Nec8_4116- 8投与群と PBS投与群の癌コロニー数 (平均土標準偏差)および両群間 の P valueを表 3 6に示す。 表 3 5
Figure imgf000194_0001
192 PBS 152 ±46 -
Nec8-4116-8 3 mg/kg 18± 10 く 0. 0001
Nec8-4116-8 0. 3 mg/kg 41 ± 23 く 0. 0001 実施例 2 3 抗 Nectin- 2 ヒ トモノクローナル抗体の i vivo抗腫瘍活性 (MM- MB- 231乳癌細胞株スキッドマウス皮下移植治療モデル）
参考例 3 6で作製した Nec8- 4116- 8 および Necl- 554- 1 の抗腫瘍活性を MDA-MB-231ヒト乳癌細胞株 （ATCCより購入） を用いたスキッドマウス皮下移植 治療モデルにおいて調べた。 Nec8- 4116- 8抗体標品は参考例 3 8、Necl- 554- 1 SP3 抗体標品は参考例 3 9に記載の方法によりそれぞれ調製したものを用いた。 MDA-MB-231細胞株は、 10% FBS (Hyclone社） および 7. 5%重炭酸ナトリウム (Invitrogen社） 1/40容量を含む Leibovitz' s L- 15 (Invitrogen社） 培地を 用い、 10 cm組織培養シャーレ (Becton Dickinson社） に播種し、 5%炭酸ガス ：気流中、 37°Cで培養した。 トリプシン- EDTA処理により剥離して得た対数増殖期 の MM- MB-231細胞株懸濁液を、遠心分離操作（1， 000 rpm、 3分）を用いて Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS) (Invitrogen社） で 3回洗浄した。 こうして得 た細胞を HBSSと Matrigel (BD Biosciences社） の等量混合液に再懸濁させ 3 x 107個 /mLの密度の細胞懸濁液を得た。
日本クレア社より購入したスキッドマウス（C. B- 17/Icr - scid/scidjcl) (5週 齢、雌）を 1週間馴化飼育した後、上記 MDA- MB- 2'31細胞懸濁液を腹側皮下に 100 μ !7個体ずつ接種した。 細胞接種 28 日後に MDA - MB-231腫瘍塊の長径と短径を ノギスで測定し、 下記の計算式により腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積 (mm3) =長径 X (短径） 2 /2
MDA-MB-231細胞株を播種した上記スキッドマゥスの各個体の体重を測定した 後、 各群の平均腫瘍塊体積が均等 (約 Π0 隨 3)になるように群分けした。 細胞接 種後 28、 31、 35、 38、 42日目に、 PBSで 3 mg/mLに希釈した上記 Nec8-4116 - 8、 もしくは Necl- 554- 1 SP3抗体溶液もしくは PBSを 10 mL/kgずつ尾静脈投与し、' それと同時に上記の方法により腫瘍体積を測定した。 NeC8-4116-8 および Necl- 554-1の増殖抑制活性は、 薬物投与開始 3週間後の腫瘍体積を基に、 下記
193 の計算式により T/C (Treatment/Control) 値として算出した。 また実験群間の 有意差はパラメ トリック Durmett 型多重比較検定 （SAS 前臨床パッケージ Version ' 5. 0) を用いて検定した。 · T/C (%) =[ (抗体投与群における薬物投与開始時からの腫瘍体積の増加量） I (PBS投与群における薬物投与開始時からの腫瘍体積の増加暈） ] X 100 図 4に癌細胞株移植後の腫瘍体積平均値の経実的変化を示す。
Nec8- 4116- 8投与群および Necl- 554- 1投与群の T/C値はそれぞれ 39. 2%, 38. 7% であり、 両抗体はいずれも MM- MB- 231 細胞株腫瘍の増殖を有意に抑制した (pく 0. 0001) (図 4 )。 実施例 2 4 抗 Nectin - 2ヒ トモノクローナル抗体の in vivo抗腫瘍活性 (0V-90 卵巣癌細胞株ヌ一ドマウス肝臓転移治療モデル）
参考例 3 6で作製した抗 Nectin - 2 ヒ トモノクローナル抗体 （Nec8-411S- 8) の抗腫瘍活性を、 0V- 90 ヒト卵巣癌細胞株 （ATCC より購入） を用いたヌードマ ウス肝臓転移治療モデルにおいて調べた。 Nec8- 4116- 8抗体標品は参考例 3 8に 記載した方法により調製したものを用いた。 0V- 90 細胞株は、 MCDB 105 Medium (Sigma社）を 1Lの蒸留水に溶解後 pHを 7. 5に調整して無菌ろ過し、次い でこの MCDB 105 Medium 500 mLと Mediuml99 (Sigma社） 500 mLとを混合し、 こ れに FBS (Thermo Electron社）を 150 mL加えた培地を用い、 150 cm2培養フラス コ（Corning社）に播種し、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで培養した。トリプシン- EDTA 処理により剥離して得た対数増殖期の 0V- 90細胞株の懸濁液を遠心分離（1, 000 rpm , 3 分）により沈殿させたのち Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS) (Invitrogen社） で 3回洗浄した。 こうして得た細胞を HBSSに 1 x 107個/ mLと なるように再懸濁させた。
日本クレア社より購入したヌードマゥス（BALBん AJcl- nu/nu) (5週齢、雌） を エーテル麻酔下開腹し、脾臓を露出させ、脾臓内に上記 0V - 90細胞懸濁液を 100 μ ΐ7個体ずつ接種した。 細胞接種後、 肝臓での生着が観測される 14日目以降' 1 週間毎（14、 21、 28、 35および 42日目）に PBSで 3 mg/mLに希釈した Nec8- 4116- 8 を 30 mg/kgとなるように尾静脈内投与した。 なお、 対照群には生理食塩水を投
194 与した。最終投与の 1週間後に 2. 5%エバンスブルー 1 raLを尾静脈内に投与し、 肝臓を摘出後 10%中性緩衝ホルマリン溶液に浸して固定し、 肝臓に転移した癌 細胞株の増殖を肉眼的に観察した。 ' その結果、 対照群では肝臓における腫瘍増殖が 6例中 6例に認められたのに 対して Nec8- 4116 - 8投与群では肝臓における腫瘍増殖は 6例中 1例に認められ たに過ぎず、 Nec8- 4116- 8は肝臓に生着した癌細胞増殖を顕著に抑制した。
195

Claims

請求の範囲
I . 配歹 iJ番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もし は 実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドま たはその塩に対するモノクローナル抗体。
2 . 配列番号： 3で表されるァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部 分ぺプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体である請求項 1記載の抗 体。
3 . ヒトモノクローナノレ抗体である請求項 1記載の抗体。
4 . キメラモノクローナル抗体である請求項 1記載の抗体。
5 . ヒト化モノクローナル抗体である請求項 1記載の抗体。
6 . ヒ ト I サブクラスに属するモノクローナル抗体である請求項 1記載 の抗体。
7 . 癌細胞増殖阻害活性を有する請求項 1記載の抗体。
8 . 抗体依存性細胞傷害活性 ( ADCC : Antibody- dependent cellular cytotoxicity) を有する請求項 1記載の抗体。
9 . Nectin -2 lectin- 3または Nectin_2ZNectin_2 トランス結合阻害活性を有 する請求項 1記載の抗体。
1 0 . 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ酸配列の、 1-350番目 のアミノ酸配列に存在するェピトープを認識するモノクローナル抗体である請 求項 1記載の抗体。
I I . 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列の、 47-142番 目または 175-240 #目のアミノ酸配列に存在するェピトープを認識するモノク 口一ナル^:体である請求項 1記載の抗体。
1 2 . 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列の、 第 75， 76, 77, 78, 95， 137， 145, 173， 184, 186及び 212番目の少なくとも 1つのアミノ 酸残基を含むァミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体である請求項 1記載 の抗体。
1 3 . 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしく
196 は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド またはその塩に対して、 Ne c l— 803— 2 (FERM B P— 1041 7)、 Ne c 1 -244-3 (F ERM BP— 10423)、 Ne c l— 530 1 (FERM BP-10424), Ne c 1-903-1 (FERM BP— 1 0425)、 N e c 1— 520— 1 (FERM B P— 10426 )、 N e c 1 -845-2 (FERM B P— 10427 )、 N e c 1— 834— 1 (FER M B P— 10428)、 Ne c 1— 964— 1 (FERM BP— 10683). Ne c l— 1302— 2 (FERM B P— 10684 )、 N e c 1— 554— 1 (FERM BP— 10681)、 Ne c l— 769— 2 (FERM BP— 10682) または Ne c 8— 41 16— 8 (FERM BP— 10685) で表示されるハイプリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体と競合 的に結合する請求項 1記載の抗体。
14. Ne c l— 803— 2 (F ERM BP— 1041 7)、 Ne c l— 24 4-3 (FERM B P— 10423)、 N e c 1— 530— 1 (FERM B P— 1 0424)、 N e c 1— 903— 1 (FERM BP— 10425)、 N e e l— 520— 1 (F ERM BP— 10426)、 Ne c l— 845— 2 (F ERM B P— 10427) または N e c 1— 834— 1 (FERM B P— 10428)、 Ne c l-964- 1 (FERM BP— 10683)、 Ne c 1 - 1302-2 (FERM BP— 10684)、 Ne c l— 554— 1 (F ERM BP— 1068 1)、 Ne c l— 769— 2 (FERM BP— 106 82) または N e c 8— 41 16— 8 (FERM BP— 10685) で表示 されるハイプリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体が認識するァ ミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を認識する請求項 1記載 の抗体。
15. 請求項 1記載の抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞。
16. Ne c l— 803— 2 (FERM BP— 1041 7)、 Ne c l— 24 4-3 (FERM B P— 10423)、 N e c 1— 530— 1 (FERM B P— 10424)、 N e c 1— 903— 1 (FERM BP— 10425)、 N e e l— 520— 1 (F ERM BP— 10426)、 Ne c l— 845— 2 (F
197 ERM B P - 10427)、 N e c 1 - 834 - 1 (FERM BP - 104 28)、 Ne c l— 964— 1 (FERM BP— 1 0683)、 Ne c l— 1 302-2 (FERM B P— 10684)、 N e c 1— 554— 1 (FERM BP— 10681)、 Ne c l_769— 2 (FERM BP— 10682) ま たは Ne c 8— 4 1 1 6— 8 (FERM B P— 1 0685 ) で表示される請 求項 15記載のハイブリ ドーマ細胞。
17. 請求項 16記載のハイプリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル 抗体。
18. 組換え型モノクローナル抗体である請求項 1記載の抗体。
19. 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （ C D R 1 )、 第 2の相補性決 定領域 （CDR2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 が、 それぞれ、 （i)配列番号： 184， 200， 216, 232， 248, 264, 280および 296 からなる より選択される配列番号、 （ii)配列番号： 185， 201， 217， 233, 249， 265， 281および 297からなる群より選択される配列番号および（i ii)配列番号： 186, 202, 218， 234, 250， 266, 282および 298からなる群より選択される配列 番号で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含 む請求項 1記載の抗体。
20. 抗体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （CDR1)、 第 2の相補性決 定領域 （CDR2) およぴ第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 、 それぞれ、 （iv)酉己列番号： 192， 208， 224, 240, 256, 272, 288および 304 からなる群より選択される配列番号、 （V)配列番号： 193, 209, 225, 241, 257， 273, 289および 305からなる群より選択される配列番号おょぴ (vi)配列番号： 194, 210, 226, 242， 258, 274, 290および 306からなる群より選択される配列 番号で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含 む請求項 1記載の抗体。
21. 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチド またはその塩に対するモノクローナル抗体を含有してなる診断剤。
22. 癌の診断剤である請求項 21記載の診断剤。
198
2 3 . 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ぺプチド またはぞの塩に対するモノクローナル抗体を含有してなる医薬。 ' 2 4 . 癌の予防 ·治療剤である請求項 2 3記載の医薬。
2 5 . 癌細胞のアポトーシス促進剤である請求項 2 3記載の.医薬。
2 6 . 癌細胞の増殖阻害剤である請求項 2 3記載の医薬。
2 7 . 抗体の Fc領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害剤である請求 項 2 3記載の医薬。
2 8 . 哺乳動物に対して、 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ 酸配列と同一.もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質また はその部分べプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の有効量を投与 することを特徴とする癌の予防 ·治療方法。
2 9 . 哺乳動物に対して、 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質また はその部分べプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の有効量を投与 することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進方法。
3 0 . 哺乳動物に対して、 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質また はその部分べプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の有効量を投与 することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。 ■
3 1 . 哺乳動物に対して、 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質また はその部分ぺプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体の有効量を投与 することを特徴とする、 抗体の Fc領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞 障害方法。
3 2 . 癌の予防 ·治療剤を製造するための配列番号： 1または配列番号： 3で 表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する タンパク質またはその部分べプチドまたはその塩に対するモノクローナル抗体 の使用。
199
33. 癌細胞のアポトーシス促進剤を製造するための配列番号： 1または配列 番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 を含有するタンパク質またはその部分ぺプチドまたはその塩に対するモノ 口 ーナル抗体の使用。
34. 癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号： 1または配列番号： 3 で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有す るタンパク質またはその部分べプチドまたはその塩に対するモノクロ一ナル抗 体の使用。
35. 抗体の Fc領域を介した生体防御機構を利用する癌細胞障害剤を製造する ための配列番号： 1または配列番号： 3で表されるァミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド ' またはその塩に対するモノクローナル抗体の使用。
36. Ne c l-803-2 (F ERM BP— 10417)、 Ne c l— 24
4— 3 (F ERM B P— 10423)、 N e c 1— 530— 1 (F ERM B P— 10424)、 Ne c l— 903— 1 (F ERM BP— 10425)、 N e e l - 520 - 1 (FE RM BP— 10426)、Ne c 1— 845— 2 (F ERM BP— 10427)、 Ne c 1—834— 1 (FERM BP— 104 28)、 Ne c l— 964— 1 (F ERM BP_ 10683)、 Ne c l— 1 302-2 (F ERM BP_10684)、 Ne c l— 554—1 (F ERM B P— 10681)、 Ne c l— 769— 2 (F ERM BP— 10682)、 または N e c 8— 41 1 6— 8 (F ERM BP— 10685) で表示される ハイプリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体を含有してなる乳癌 の予防または治療剤。
37. Ne c l— 803— 2 (F ERM BP_1041 7)、 N e c 1 - 24 4— 3 (F ERM B P— 10423 )、 N e c 1— 530— 1. (F E RM B
P- 10424), Ne c l -903- 1 (F ERM BP— 10425)、 N e e l— 520— 1 (FERM BP— 10426)、Ne c 1— 845— 2 (F ERM BP_10427)、 Ne c l— 834— 1 (FERM BP— 104 28)、 N e c 1— 964— 1 (FERM B P— 10683 )、 N e c 1— 1
200 302-2 (F ERM B P_ 10684)、 N e c 1— 554— 1 (F ERM BP— 1068 1)、 Ne c 1-769-2 (F ERM BP— 1 0682)、 または M e c 8— 41 1 6 _ 8 (F ERM B P— 10685) で表示される ハイブリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体と Nectin - 2に対して 競合的に結合するモノクローナル抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤。
38. Ne c l -554-1 (FERM BP— 1 0681) で表示されるハ イブリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体と Nectin- 2に対して競 合的に結合するモノクローナル抗体が、 Ne c l— 1044— 4 (F ERM B P- 10805) または N e c 1 _ 1302— 2 (FERM BP— 1068 4 ) である請求項 37記載の乳癌の予防または治療剤。
39. Ne c 8-41 1 6-8 (FERM B P— 10685) で表示される ハイプリ ドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体と Nectin - 2に対して 競合的に結合するモノクローナル抗体が、 Ne c 8— 3704— 7 (FERM B P— 10807) または N e c 8 _ 3517— 1 1 (FERM BP— 10 806) である請求項 37記載の乳癌の予防または治療剤。
40. 抗体の F c領域を介した生体防御機構を利用するものである請求項 36 から 39のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
41. 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （CDR 1)、 第 2の相補性決 定領域 （CDR 2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 、 それぞれ、 （i)配列番号： 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280および 296 からなる群より選択される配列番号、 (ii)配列番号： 185， 201， 217, 233， 249, 265， 281および 297からなる群より選択される配列番号おょぴ（iii)配列番号： 186， 202， 218, 234, 250， 266, 282および 298からなる群より選択される配列 番号で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 む抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤。
42. 抗体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （CDR1)、 第 2の相補性決 定領域 （CDR 2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 が、 それぞれ、 （iv)配列番号： 192， 208， 224, 240, 256， 272, 288および 304 からなる群より選択される配列番号、 （V)配列番号： 193， 209， 225， 241, 257,
201 273, 289および 305からなる群より選択される配列番号および (vi)配列番号： 194, 210， '226， 242, 258， 274, 290および 306からなる群より選択される配列 番号で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含 む抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤。
43. 抗体重鎖可変領域の第 1の相補性決定領域 （ C D R 1 )、 第 2の相補性決 定領域 （CDR2) およぴ第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列 力 それぞれ、 （i)配列番号： 184， 200， 216， 232， 248, 264, 280および 296 からなる群より選択される配列番号、 （ii)配列番号： 185， 201， 217， 233, 249, 265, 281および 297からなる群より選択される配列番号および（iii)配列番号： 186, 202, 218， 234, 250, 266， 282および 298からなる群より選択される配列 番号で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、 抗 ' 体軽鎖可変領域の第 1の相補性決定領域（ C D R 1 )、第 2の相補性決定領域（ C DR 2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) のアミノ酸配列が、 それぞ れ、 (iv)配列番号： 192, 208， 224, 240, 256， 272， 288および 304からなる群 より選択される配列番号、 （V)配列番号： 193， 209， 225, 241, 257, 273, 289 および 305からなる群より選択される配列番号および (vi)配列番号： 194， 210, 226， 242, 258, 274, 290および 306からなる群より選択される配列番号で表さ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、 及び抗体定常 領域含む抗体を含有してなる乳癌の予防または治療剤。
44. Ne c l-1044-4 (F ERM B P— 10805) 、 Ne c 8—
351 7- 11 (F ERM B P _ 10806 ) または N e c 8— 3704— 7 (FERM B P_ 10807) で表示されるハイプリ ドーマ細胞。
45. 請求項 44に記載のハイブリ ドーマ細胞から産生されるモノクローナル 抗体。
46. Ne c l -1044-4 (F ERM BP— 10805) 、 N.e c 8 -
351 7- 1 1 (FERM BP— 10806) または N e c 8 _ 3 704— 7 (FERM B P_ 1 08◦ 7) で表示されるハイプリ ドーマ細胞から産生 されるモノクローナル抗体と競合的に結合するモノクロ一ナル抗体。
47. 請求項 45または 46に記載のモノクローナル抗体を含有してなる、 乳
202 癌の予防または治療剤
203
PCT/JP2007/069908 2006-10-06 2007-10-04 Prophylactic or therapeutic agent for cancer Ceased WO2008044754A1 (en)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2007307536A AU2007307536A1 (en) 2006-10-06 2007-10-04 Agent for preventing/treating cancer
US12/444,382 US20100008928A1 (en) 2006-10-06 2007-10-04 Agent for preventing/treating cancer
BRPI0717024-6A2A BRPI0717024A2 (pt) 2006-10-06 2007-10-04 Anticorpo, célula de hibridoma, agente de diagnótico, medicamento, métodos para prevenir/tratar câncer, para induzir apoptose células cancerosas , para inibir crescimento de células cancerosas e para destruir células cancerosas, uso de um anicorpo monoclonal e agente para prevenir ou tratar câncer de mama.
JP2008538759A JPWO2008044754A1 (ja) 2006-10-06 2007-10-04 癌の予防・治療剤
MX2009003126A MX2009003126A (es) 2006-10-06 2007-10-04 Agente para prevenir/tratar el cancer.
CNA2007800371476A CN101541834A (zh) 2006-10-06 2007-10-04 癌症的预防和/或治疗剂
CA002666249A CA2666249A1 (en) 2006-10-06 2007-10-04 Agent for preventing/treating cancer
EP07829644A EP2067791A4 (en) 2006-10-06 2007-10-04 PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC ACTIVE AGAINST CANCER
IL197389A IL197389A0 (en) 2006-10-06 2009-03-03 Prophylactic or therapeutic agent for cancer
TN2009000090A TN2009000090A1 (en) 2007-04-04 2009-03-16 Prophylactic or therapeutic agent for canger
NO20091783A NO20091783L (no) 2006-10-06 2009-05-05 Middel for a forebygge/behandle kreft

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPPCT/JP2006/320429 2006-10-06
PCT/JP2006/320429 WO2007043635A1 (ja) 2005-10-07 2006-10-06 癌の予防・治療剤
ARP-070101453 2007-04-04
ARP070101453A AR060362A1 (es) 2005-10-07 2007-04-04 Agente para prevenir / tratar el cancer
JP2007100876 2007-04-06
JP2007-100876 2007-04-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2008044754A1 true WO2008044754A1 (en) 2008-04-17

Family

ID=44083820

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/069908 Ceased WO2008044754A1 (en) 2006-10-06 2007-10-04 Prophylactic or therapeutic agent for cancer

Country Status (21)

Country Link
US (1) US20100008928A1 (ja)
EP (1) EP2067791A4 (ja)
JP (1) JPWO2008044754A1 (ja)
KR (1) KR20090078339A (ja)
CN (1) CN101541834A (ja)
AR (1) AR063153A1 (ja)
AU (1) AU2007307536A1 (ja)
BR (1) BRPI0717024A2 (ja)
CA (1) CA2666249A1 (ja)
CL (1) CL2007002879A1 (ja)
CO (1) CO6190538A2 (ja)
EC (1) ECSP099276A (ja)
IL (1) IL197389A0 (ja)
MA (1) MA30816B1 (ja)
MX (1) MX2009003126A (ja)
NO (1) NO20091783L (ja)
PE (1) PE20081456A1 (ja)
RU (1) RU2009117237A (ja)
TN (1) TN2009000090A1 (ja)
TW (1) TW200823235A (ja)
WO (1) WO2008044754A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015520192A (ja) * 2012-06-06 2015-07-16 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｈｉｐｐｏ経路を調節する結合剤およびその使用
JP2018531215A (ja) * 2015-08-05 2018-10-25 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハーＡＭＧＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ）ＧｍｂＨ 血液由来のがんの治療における使用を目的とする免疫チェックポイント阻害物質

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012092374A2 (en) * 2010-12-31 2012-07-05 Short Jay M Express humanization of antibodies
DK2740794T3 (en) * 2011-08-04 2018-06-14 Toray Industries PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT AND / OR CANCER PREVENTION
WO2014069682A1 (ko) * 2012-10-29 2014-05-08 인제대학교 산학협력단 암 표적 항체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
WO2014069681A1 (ko) * 2012-10-29 2014-05-08 인제대학교 산학협력단 암 표적 항체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
WO2016134335A2 (en) 2015-02-19 2016-08-25 Compugen Ltd. Pvrig polypeptides and methods of treatment
PL3653221T3 (pl) 2015-02-19 2022-12-19 Compugen Ltd. Przeciwciała anty-pvrig i sposoby ich zastosowania
KR102585976B1 (ko) 2016-08-17 2023-10-05 컴퓨젠 엘티디. 항-tigit 항체, 항-pvrig 항체 및 이들의 조합
RU2765410C2 (ru) 2016-11-30 2022-01-28 Онкомед Фармасьютикалс, Инк. Способы лечения рака, включающие связывающие tigit агенты
US11225523B2 (en) 2017-06-01 2022-01-18 Compugen Ltd. Triple combination antibody therapies
AU2019306628B2 (en) 2018-07-20 2024-11-14 Surface Oncology, LLC Anti-CD112R compositions and methods
CN118878685A (zh) * 2019-01-13 2024-11-01 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司 特异性针对人类连接蛋白-2的抗体
CN113527486B (zh) * 2020-04-21 2025-12-02 迈威(上海)生物科技股份有限公司 一种抗Nectin-4的抗体及其应用
BR112023014128A2 (pt) 2021-01-15 2023-10-31 Seagen Inc Conjugados de anticorpo-fármaco imunomodulatórios
JP2024506300A (ja) 2021-02-03 2024-02-13 シージェン インコーポレイテッド 免疫刺激化合物及びコンジュゲート体
WO2023161943A1 (en) * 2022-02-28 2023-08-31 Nectin Therapeutics Ltd. Humanized antibodies against nectin-2 and drug conjugates thereof
CA3252067A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Seagen Inc. Immunomodulatory Antibody-Drug Conjugates
CA3262320A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Regents Of The University Of Minnesota Anti-PD-L1 Conjugates - Immunostimulating Drugs
EP4321522A1 (en) 2022-08-12 2024-02-14 Seagen Inc. Cytotoxic compounds and conjugates thereof

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0125023A1 (en) 1983-04-08 1984-11-14 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobulin preparations, methods for their preparation, DNA sequences, expression vectors and recombinant host cells therefor
EP0546073A1 (en) 1990-08-29 1993-06-16 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES.
WO1999063063A1 (en) 1998-06-03 1999-12-09 Northwestern University Cellular proteins which mediate herpesvirus entry
WO2000029442A1 (de) 1998-11-16 2000-05-25 Genovac Ag Verfahren zur herstellung von antikörpern gegen ein polypeptid, von dem nur die kodierende nukleinsäure bekannt ist
WO2002000677A1 (en) 2000-06-07 2002-01-03 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2002028902A2 (en) 2000-10-05 2002-04-11 Immunex Corporation Nectin polypeptides, polynucleotides, methods of making and use thereof
WO2002099040A2 (en) 2001-06-05 2002-12-12 Exelixis, Inc. Igs as modifiers of the p53 pathway and methods of use
WO2002098217A1 (en) 2001-06-06 2002-12-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for targeting transcriptionally active loci
WO2003020743A1 (en) 2001-09-05 2003-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of expressing transgenes
WO2003088808A2 (en) 2002-04-16 2003-10-30 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2004030615A2 (en) 2002-10-02 2004-04-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2005097204A1 (ja) 2004-04-09 2005-10-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited 癌の予防・治療剤

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030129685A1 (en) * 1998-10-28 2003-07-10 Jian Ni 12 human secreted proteins
US20030022279A1 (en) * 1999-06-14 2003-01-30 Fraser Christopher C. Novel genes encoding proteins having prognostic, diagnostic, preventive, therapeutic, and other uses

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0125023A1 (en) 1983-04-08 1984-11-14 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobulin preparations, methods for their preparation, DNA sequences, expression vectors and recombinant host cells therefor
EP0546073A1 (en) 1990-08-29 1993-06-16 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES.
WO1999063063A1 (en) 1998-06-03 1999-12-09 Northwestern University Cellular proteins which mediate herpesvirus entry
WO2000029442A1 (de) 1998-11-16 2000-05-25 Genovac Ag Verfahren zur herstellung von antikörpern gegen ein polypeptid, von dem nur die kodierende nukleinsäure bekannt ist
WO2002000677A1 (en) 2000-06-07 2002-01-03 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2002028902A2 (en) 2000-10-05 2002-04-11 Immunex Corporation Nectin polypeptides, polynucleotides, methods of making and use thereof
WO2002099040A2 (en) 2001-06-05 2002-12-12 Exelixis, Inc. Igs as modifiers of the p53 pathway and methods of use
WO2002098217A1 (en) 2001-06-06 2002-12-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for targeting transcriptionally active loci
WO2003020743A1 (en) 2001-09-05 2003-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of expressing transgenes
WO2003088808A2 (en) 2002-04-16 2003-10-30 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2004030615A2 (en) 2002-10-02 2004-04-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2005097204A1 (ja) 2004-04-09 2005-10-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited 癌の予防・治療剤

Non-Patent Citations (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Enzyme immunoassay", 1978, IGAKUSHOIN
"Enzyme immunoassay", 1982, IGAKUSHOIN
"Enzyme immunoassay", 1987, IGAKUSHOIN
"Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS
"Peptide Synthesis", vol. 14, HIROKAWA SHOTEN, article "Zoku lyakuhin no Kaihatsu"
"Radioimmunoassay", 1974, KODANSHA
"Saibo Kogaku (Cell Engineering)", 1995, SHUJUNSHA, article "Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol (New Cell Engineering Experimental Protocol)", pages: 263 - 267
"Sequel to the Radioimmunoassay", 1979, KODANSHA
APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 70, 2004, pages 2567
BIO/TECHNOLOGY, vol. 6, 1988, pages 47 - 55
BLOOD, vol. 92, no. 12, 1998, pages 4602
BOSTIAN, K. L. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 77, 1980, pages 4505
CURR. BIOL., vol. 12, 2002, pages 1145
CURR. OPIN. BIOTECHNOL., vol. 7, 1996, pages 536
EBERLE F. ET AL.: "The human PRR2 gene, related to the human poliovirus receptor gene (PVR), is the true homolog of the murine MPH gene", GENE, vol. 159, no. 2, 1995, pages 267 - 272, XP004042219 *
EXP. CELL RES., vol. 235, 1997, pages 374
FEBS, vol. 579, 2005, pages 2243 - 2249
G A. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 81, 1984, pages 5330
GENE, vol. 17, 1982, pages 107
GENE, vol. 24, 1983, pages 255
GENETICS, vol. 39, 1954, pages 440
HARUAKI YAJIMA; SHUNPEI SAKAKIBARA: "Tanpakushitsu no Kagaku (Chemistry of Proteins)", vol. IV, 1977, article "Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experiment)", pages: 205
IMMUNOCHEMICAL TECHNIQUES, vol. 121
IMMUNOCHEMICAL TECHNIQUES, vol. 73
IMMUNOCHEMICAL TECHNIQUES, vol. 74
IMMUNOCHEMICAL TECHNIQUES, vol. 84
IMMUNOCHEMICAL TECHNIQUES, vol. 92
INTL. IMMUNOL., vol. 16, no. 4, 2004, pages 533
J. BIOL. CHEM., vol. 277, no. 30, 2002, pages 27006
J. BIOL. CHEM., vol. 279, no. 17, 2004, pages 18015
J. CELL BIOL., vol. 156, 2002, pages 555
J. CELL SCI., vol. 116, no. 1, 2003, pages 17
J. CELL SCI., vol. 116, no. 1, 2003, pages PL7
J. EXP. MED., vol. 198, no. 4, 2003, pages 557
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS
J. VIROL., vol. 74, no. 3, 2000, pages PL267 - PL274
J. VIROL., vol. 75, no. 2, 2001, pages 11185
J. VIROL., vol. 75, no. 2, 2001, pages 11I85
JBC, vol. 276, 2001, pages 48350
JCB, vol. 145, 1999, pages 539
JEM, vol. 198, no. 4, 2003, pages 557
JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 95, 1984, pages 87
JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 120, 1978, pages 517
JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 41, no. 459, 1969
M. BODANSZKY; M.A. ONDETTI: "Peptide Synthesis", 1966, INTERSCIENCE PUBLISHERS
MAEDA ET AL., NATURE, vol. 315, 1985, pages 592
METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 194, 1991, pages 182 - 187
METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 70
MILLER: "Journal of Experiments in Molecular Genetics", 1972, COLD SPRING HARBOR LABORATORY, pages: 431 - 433
MOL. IMMUNOL., vol. 42, 2005, pages 463
MOLECULAR & GENERAL GENETICS, vol. 168, 1979, pages 111
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 23, 2005, pages 1105
NATURE REV. GENET., vol. 4, 2003, pages 794
NATURE, vol. 195, 1962, pages 788
NATURE, vol. 256, 1975, pages 495
NATURE, vol. 356, pages 152 - 154
NOBUO IZUMIYA ET AL.: "Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken (Basics and experiments of peptide synthesis)", 1975, MARUZEN CO.
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 9, 1981, pages 309
ONCOGENE, vol. 18, 1999, pages 1609
PENDE D. ET AL.: "PVR (CD155) and Nectin-2 (CD112) as ligands of the human DNAM-1 (CD226) activating receptor: involvement in tumor cell lysis", MOL. IMMUNOL., vol. 42, no. 4, 2005, pages 463 - 469, XP004686640 *
PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 60, 1968, pages 160
PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 69, 1972, pages 2110
PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 75, 1978, pages 1929
PROCEEDING OF THE SOCIETY FOR THE BIOLOGICAL MEDICINE, vol. 73, 1950, pages 1
PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, vol. 37, 1992, pages 2977 - 2984
PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, vol. 48, no. 2, 2003, pages 105
SCHROEDER; LUEBKE: "The Peptide", 1965, ACADEMIC PRESS, NEW YORK
SCIENCE, vol. 122, 1952, pages 501
See also references of EP2067791A4
TAHARA-HANAOKA S. ET AL.: "Functional characterisation of DNAM-1 (CD226) interaction with its ligands PVR (CD155) and nectin-2 (PRR-2/CD112)", INT. IMMUNOL., vol. 16, no. 4, 2004, pages 533 - 538, XP003010458 *
THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION, vol. 199, 1967, pages 519
VAUGHN, J. L. ET AL., IN VIVO, vol. 13, 1977, pages 213 - 217
VIROL., vol. 246, 1998, pages PL79 - PL89
VIROLOGY, vol. 52, 1973, pages 456
VIROLOGY, vol. 8, 1959, pages 396

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015520192A (ja) * 2012-06-06 2015-07-16 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｈｉｐｐｏ経路を調節する結合剤およびその使用
JP2018531215A (ja) * 2015-08-05 2018-10-25 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハーＡＭＧＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ）ＧｍｂＨ 血液由来のがんの治療における使用を目的とする免疫チェックポイント阻害物質
JP7170532B2 (ja) 2015-08-05 2022-11-14 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー 血液由来のがんの治療における使用を目的とする免疫チェックポイント阻害物質

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2008044754A1 (ja) 2010-02-18
MA30816B1 (fr) 2009-10-01
BRPI0717024A2 (pt) 2014-03-11
CL2007002879A1 (es) 2008-06-27
EP2067791A1 (en) 2009-06-10
PE20081456A1 (es) 2008-11-27
IL197389A0 (en) 2011-08-01
NO20091783L (no) 2009-07-01
CO6190538A2 (es) 2010-08-19
EP2067791A4 (en) 2009-11-25
TN2009000090A1 (en) 2010-08-19
RU2009117237A (ru) 2010-11-20
MX2009003126A (es) 2009-04-06
CN101541834A (zh) 2009-09-23
US20100008928A1 (en) 2010-01-14
ECSP099276A (es) 2009-06-30
KR20090078339A (ko) 2009-07-17
AU2007307536A1 (en) 2008-04-17
AU2007307536A2 (en) 2009-04-30
AR063153A1 (es) 2008-12-30
TW200823235A (en) 2008-06-01
CA2666249A1 (en) 2008-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2008044754A1 (en) Prophylactic or therapeutic agent for cancer
CA3027417C (en) Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo
US11639388B2 (en) CD3 antigen binding fragment and application thereof
WO2020107715A1 (en) Anti-pd-l1/anti-4-1bb bispecific antibodies and uses thereof
WO2023116925A1 (en) Novel anti-tslp antibodies
AU2008237296B2 (en) Methods for inhibiting the binding of endosialin to ligands
CN114206929B (zh) 一种抗tigit免疫抑制剂及应用
JP5723270B2 (ja) 抗カドヘリン抗体
TR201807750T4 (tr) Anti-TIM-3 antikoru.
JPWO2020026987A1 (ja) 抗ｒｏｒ１モノクローナル抗体およびその機能的断片、遺伝子、薬剤デリバリー組成物、並びに、医薬組成物
KR20180101483A (ko) 치료적 항-ｃｄ９ 항체
WO2021097800A1 (en) Anti-pd-l1/anti-b7-h3 multispecific antibodies and uses thereof
WO2022143794A1 (zh) 抗cldn18.2抗体及其制备方法和应用
WO2024131962A1 (zh) 新型抗gprc5d抗体
TW200840825A (en) Prophylactic and therapeutic agent for cancers
CN115701436A (zh) 靶向siglec-15的嵌合抗原受体及其应用
US20240317880A1 (en) Epithelial Cadherin-Specific Antibodies
WO2025140619A1 (zh) 包含ccr8抗原结合结构域的多特异性抗体
WO2023145844A1 (ja) 抗ヒトｃｘｃｌ１抗体
HK40095347A (zh) 上皮钙黏素特异性抗体
HK1129683A (en) Prophylactic or therapeutic agent for cancer
HK40068895A (en) Anti-tigit immunosuppressant and application thereof
HK1119713A (en) Preventive/remedy for cancer

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200780037147.6

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07829644

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: CR2009-010676

Country of ref document: CR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: DZP2009000162

Country of ref document: DZ

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1109/KOLNP/2009

Country of ref document: IN

Ref document number: MX/A/2009/003126

Country of ref document: MX

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 0900884

Country of ref document: KE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007307536

Country of ref document: AU

Ref document number: 2007829644

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12009500598

Country of ref document: PH

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2666249

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 575992

Country of ref document: NZ

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008538759

Country of ref document: JP

Ref document number: 12444382

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2007307536

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20071004

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020097009036

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09044621

Country of ref document: CO

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11243

Country of ref document: GE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2009117237

Country of ref document: RU

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: A20090645

Country of ref document: BY

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0717024

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20090318