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WO2007119774A1 - タウリントランスポーター遺伝子 - Google Patents

タウリントランスポーター遺伝子 Download PDF

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WO2007119774A1
WO2007119774A1 PCT/JP2007/058049 JP2007058049W WO2007119774A1 WO 2007119774 A1 WO2007119774 A1 WO 2007119774A1 JP 2007058049 W JP2007058049 W JP 2007058049W WO 2007119774 A1 WO2007119774 A1 WO 2007119774A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polypeptide
dna
seq
taurine transporter
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2007/058049
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hisahiro Tabuchi
Tomoya Sugiyama
Saeko Tanaka
Satoshi Tainaka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to DK07741485.2T priority patent/DK2011880T3/da
Priority to ES07741485T priority patent/ES2397383T3/es
Priority to CN200780013191.3A priority patent/CN101421411B/zh
Priority to JP2008510979A priority patent/JP4977691B2/ja
Priority to AU2007239679A priority patent/AU2007239679B2/en
Priority to CA2649148A priority patent/CA2649148C/en
Priority to US12/226,195 priority patent/US9238687B2/en
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority to EP07741485A priority patent/EP2011880B1/en
Priority to TW096113111A priority patent/TWI388664B/zh
Publication of WO2007119774A1 publication Critical patent/WO2007119774A1/ja
Priority to KR1020087018082A priority patent/KR101342172B1/ko
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to a hamster taurine transporter, a gene encoding a hamster taurine transporter, and a method for producing a polypeptide using cells that strongly express the taurine transporter.
  • prokaryotic cells can perform complex post-translational modifications and folding. Therefore, animal cells have been widely used as host cells for recombinant protein production.
  • Taurine is a kind of amino acid that is abundant in seafood and molluscs, and is an important nutrient for the growth of mammals. Although it is not used for protein synthesis, it has the functions of normalizing hypercholesterolemia, lowering blood pressure, detoxification, maintaining immune function, stabilizing biological membranes, regulating nerve excitability, and antioxidant properties. In cultured cells, it is known to contribute to osmotic pressure regulation and cell membrane stabilization (Non-patent Document 1). However, adding taurine to the medium of primary astrocyte culture cells that function the taurine transporter does not increase taurine uptake into cells (Non-patent Document 2). It was not enough to add.
  • taurine transporters human: non-patent document 3, mouse: non-patent document 4, rat : Non-patent document 5
  • taurine transporter is known to be involved in cellular uptake of amino acids such as taurine and
  • Non-Patent Document 1 Ian Henry Lambert, Neurochemical Research (2004) 29 (1), 27-63
  • Non-Patent Document 2 Journal of Neurochemistry (2000), 75 (3), 919-924
  • Non-Patent Document 3 Uchida, S. et.al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89 (17), 8230— 8234
  • Non-Patent Document 4 Liu, Q.R. et.al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89 (24), 12145-12149
  • Non-Patent Document 5 Smith, K.E. et.al, Mol. Pharmacol. (1992) 42 (4), 563-569
  • Patent Document 6 Ryo Shioda. Et.al., Investigative Ophthalmology & Visual Science (20
  • An object of the present invention is to provide a method capable of producing a natural protein or a recombinant protein at low cost.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a method for producing a polypeptide comprising culturing cells into which a DNA that strongly expresses a taurine transporter and that encodes a desired polypeptide is introduced, to produce the desired polypeptide.
  • a method for producing a pharmaceutical product comprising the polypeptide produced by the method according to any one of (1) to (6).
  • DNA encoding a taurine transporter which is one of the following (a) to (e) (excluding DNAs having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 3, 5 and 7).
  • a recombinant vector comprising the DNA according to (8).
  • a cell into which a DNA that strongly expresses a taurine transporter and encodes a desired polypeptide is introduced.
  • a desired polypeptide can be produced at low cost.
  • FIG. 1 shows the base sequence and amino acid sequence of a newly cloned CHO cell-derived hamster taurine transporter gene.
  • FIG. 2 shows Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.89 based on the transmembrane region and orientation predicted by the TMpred program based on the amino acid sequence of Hamster TauT derived from newly cloned CHO cells. , pp.8230— 8234, September 1992, Shinichi Uchida et.al.
  • This is a taurine transporter membrane topology created based on FIG. ⁇ is an amino acid residue specific to Hamster TauT, and the second loop (EX: extracellular region), the 12th transmembrane region (TM), and the C-terminus (IC: intracellular region) have amino acids different from Human TauT. There are many.
  • FIG. 3 shows a plasmid expressing Hamster TauT (622 amino acids).
  • the pHyg / TauT-introduced cells produced low lactic acid and were superior to the pHyg-introduced cells (t test P ⁇ 0.05).
  • the anti-glibican-3 antibody in the cells transfected with pHyg / TauT was superior to the cells transfected with pHyg (P ⁇ 0.01).
  • FIG. 8 is a graph showing the survival rate in fed-batch culture with 1 L jar of T10, a pHyg / TauT-introduced cell with high growth ability in the expansion process in stationary culture.
  • the survival rate of T10 was more than 80% even on the 32nd day of culture.
  • the parent stock fell below 80% on the 19th day.
  • FIG. 9 is a graph showing the amount of antibody produced in fed-batch culture with a 1 L jar of T10, a pHyg / TauT-introduced cell with high proliferation ability in the expansion process in stationary culture.
  • the amount of anti-glibican-3 antibody produced on day 35 of culture was 2.9 g / L.
  • FIG. 10 shows the results of flow cytometry analysis showing that TauT-introduced T10 cells express TauT molecules on the cell membrane.
  • Usagi anti-rat taurine transporter antibody (Alpha diagnostics, US) was used as the primary antibody (antibody) and labeled with donkey anti-usagi IgG antibody Pycoerythrin Conjugate (Abeam, UK) as the secondary antibody.
  • FIG. 11 is a graph showing the intracellular ammonia content (concentration ratio) during 1 L jar fed-batch culture. In contrast to the parent strain, ammonia suppression of the pHyg / TauT-introduced strain was significant.
  • FIG. 12 is a graph showing that taurine is taken up into cells depending on the concentration of taurine in the medium. There was no difference in taurine uptake between the pHyg / TauT-introduced strain and the parent strain.
  • FIG. 13 is a graph showing glutamine consumption in the medium.
  • the pHyg / TauT-introduced strain had significantly higher glutamine consumption per cell than the parent strain, regardless of the taurine concentration in the medium.
  • FIG. 14 is a graph showing that the amount of anti-gribican-3 antibody produced by a pHyg / TauT-introduced strain is almost the same without depending on the taurine concentration in the medium at the start of the culture.
  • the present invention provides a method for producing a polypeptide, comprising culturing a cell into which a DNA that strongly expresses a taurine transporter and that encodes the desired polypeptide is introduced, to produce the desired polypeptide.
  • the cell may be a natural cell capable of producing a desired polypeptide or a transformed cell into which DNA encoding the desired polypeptide has been introduced.
  • a transformed cell into which DNA encoding the peptide has been introduced is preferred.
  • the desired polypeptide is not particularly limited, and antibodies (for example, anti-IL-6 receptor antibody, anti-glibican-3 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD20 antibody, anti-GPIIb / IIIa antibody)
  • Anti-TNF antibody anti-CD25 antibody, anti-EGFR antibody, anti-Her2 / neu antibody, anti-RSV antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD52 antibody, anti-IgE antibody, anti-CDlla antibody, anti-VEGF antibody, anti-VLA4 antibody, etc.
  • Active proteins granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage mouth-stimulating factor (GM-CSF), erythropoietin, interferon, interleukins such as IL-1 and IL-6, t-PA, urokinase Any polypeptide such as serum albumin, blood coagulation factor, PTH, etc., but antibodies are particularly preferred.
  • the antibody may be any antibody such as a natural antibody, a low molecular weight antibody such as Fab, scFv, and sc (Fv) 2, a chimeric antibody, and a human rabbit antibody.
  • Taurine transporter is known as a membrane protein having a function of incorporating amino acids such as taurine and
  • the cell that strongly expresses the taurine transporter is not particularly limited as long as it is a cell in which the expression level of the taurine transporter is increased as compared with natural cells.
  • Natural cells are not particularly limited, and examples thereof include cells that are used as hosts when producing recombinant proteins such as CHO cells.
  • Examples of cells that strongly express taurine transporter include cells into which a single taurine transporter gene has been artificially introduced.
  • Cells into which a taurine transporter gene has been artificially introduced can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, a taurine transporter gene is inserted into a vector and the vector is transformed into a cell. Can be produced.
  • the taurine transporter gene that is strongly expressed in cells is not particularly limited as long as it is a taurine transporter derived from any organism.
  • Specific examples include taurine transporters derived from organisms such as rodents such as humans, mice, rats, and hamsters, and are taurine transporters derived from the same species as humans, rodents, or host cells.
  • the cell that strongly expresses the taurine transporter is a Chinese or Musta ovary cell (CHO cell), it is preferably a human or hamster-derived taurine transporter.
  • DNAs (a) to (e) encoding a porter can also be mentioned.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 the amino acid sequence has one or more (for example, several) amino acids substituted, deleted, added or Z and inserted; DNA encoding a polypeptide with taurine transporter activity
  • Any cell that strongly expresses the taurine transporter may be any cell, but CHO cells are preferred, and CHO dhfr-cells are particularly preferred.
  • the desired polypeptide can be produced by introducing a gene encoding the desired polypeptide into a cell that strongly expresses the taurine transporter and culturing the cell in a medium. It is.
  • the order of introduction of the taurine transporter gene and the gene encoding the desired polypeptide is not particularly limited, and taurine transport is not limited.
  • a gene encoding a desired polypeptide may be introduced after introducing the porter gene, or a taurine transporter gene may be introduced after introducing a gene encoding the desired polypeptide. Further, a taurine transporter gene and a gene encoding a desired polypeptide may be introduced simultaneously.
  • the taurine transporter gene and the gene encoding the desired polypeptide may be introduced simultaneously by a single vector or may be introduced separately using a plurality of vectors.
  • a medium used in normal cell (preferably animal cell) culture can be used. These are usually amino Contains acids, vitamins, lipid factors, energy sources, osmotic regulators, iron sources, pH buffers. The content of these components is usually 0.05-1500 mg / L for amino acids, 0.001-10 mg / L for vitamins, 0-200 mg / L for lipid factors, 120 g / L for energy sources, and 0.1 for osmotic pressure regulators.
  • the strength of 10000 g / L and nucleoside in the range of 0.001-50 mg / L is not limited to these, and can be determined appropriately depending on the type of cells to be cultured, the type of desired polypeptide, and the like.
  • trace metal elements for example, trace metal elements, surfactants, growth cofactors, nucleosides and the like may be added.
  • copper sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, magnesium sulfate, nickel chloride, tin chloride, magnesium chloride, sodium silicate, etc. preferably copper sulfate, zinc sulfate, magnesium sulfate, etc.
  • Surfactant such as Tween80, Pull mouth Nick F68; and Recombinant insulin, Recombinant IGF-1, Recombinant EGF, Recombinant FGF, Recombinant PDGF, Recombinant TGF- ⁇ , Ethanolamine hydrochloride, sodium selenite, retinoic acid, putretucin hydrochloride, etc., preferably sodium selenite, ethanolamine hydrochloride, recombinant IGF-1, putretin hydrochloride and other growth cofactors; deoxyadenosine, Nucleosides such as deoxycytidine, deoxyguanosine, adenosine, cytidine, guanosine, and uridine may be added.
  • antibiotics such as streptomycin, penicillin G potassium and gentamicin, and pH indicators such as phenol red may be included.
  • the pH of the medium varies depending on the cells to be cultured. Generally, the pH is 6.8 to 7.6, and in many cases, the pH is 7.0 to 7.4.
  • the medium may be a commercially available animal cell culture medium such as D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) ⁇ D—MEM / F—12 1: 1 Mixture (Dulbeccos Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F—12), RPMI1640, CHO—S—SFM II (Invitrogen), CHO-SF (Sigma—Aid rich), EX-CELL 301 (JRH biosciences), CD—CHO (Invitrogen), IS CHO—V (Irvine Scientific) ), PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich) and other media can also be used.
  • D-MEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • D—MEM / F—12 1 1 Mixture (Dulbeccos Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F—12), RPMI1640, CHO—S—SFM II (Invitrogen), CHO-SF (Sigma—Aid rich), EX-CELL
  • the medium may be a serum-free medium.
  • CHO cells When the cells that strongly express the taurine transporter are CHO cells, CHO cells can be cultured using methods known to those skilled in the art. For example, usually the gas phase CO concentration
  • Culturing can be performed in an atmosphere of 40%, preferably 2-10%, at 30-39 ° C, preferably about 37 ° C.
  • a desired polypeptide such as an antibody
  • the cells are in a considerably high density state (approximately 1 X 10 7 cells / ml) in the later stage of culture, and waste products such as lactic acid are produced.
  • the effect of is very high. If a desired polypeptide is produced from the cells of the present invention, a high survival rate can be maintained even in the later stage of culture, and an improvement in the production amount of the desired polypeptide can be expected.
  • a suitable culture period for producing a desired polypeptide using the cells of the present invention is usually 1 day to 3 months, preferably 1 day to 2 months, more preferably 1 day to 1 month.
  • a fermenter tank culture apparatus for example, a fermenter tank culture apparatus, an air lift culture apparatus, a culture flask culture apparatus, a spinner flask culture apparatus, a microcarrier culture apparatus
  • the culture can be performed using a fluidized bed type culture apparatus, a holofiber type culture apparatus, a roller bottle type culture apparatus, a filled tank type culture apparatus, or the like.
  • any method such as batch culture, fed-batch culture, or continuous culture may be used, but fed-batch culture or continuous culture is preferred. A fed-batch culture is more preferred.
  • taurine may be added to the medium in order to promote the incorporation of taurine into the cells.
  • concentration of taurine added to the medium is not particularly limited, but is usually 0 g / L to 100 g / L, preferably 0 g / L to 20 g / L, and more preferably 0 g / L to 10 g / L.
  • the polypeptide produced by the method of the present invention has a biological activity that can be used as a medicine
  • the polypeptide is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier or additive to prepare a preparation. By making it, a pharmaceutical product can be produced.
  • Examples of pharmaceutically acceptable carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polybutyl alcohol, polybutylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, carboxymethylcellulose sodium, poly Sodium acrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethyl cellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, poly Examples include lenglycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, ratatose, and surfactants acceptable as pharmaceutical additives. It is done.
  • the actual additive is a force selected from the above alone or in appropriate combination depending on the dosage form of the therapeutic agent of the present invention.
  • the additive is not limited to these.
  • a solvent such as physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • an adsorption inhibitor such as Tween80, Tween20, gelatin
  • human serum is dissolved therein.
  • Those with albumin or the like can be used.
  • an excipient for lyophilization which may be lyophilized to obtain a dosage form that is dissolved and reconstituted before use, for example, sugar alcohols and saccharides such as mannitol and glucose are used. Can be used.
  • the effective dose of the polypeptide is appropriately selected depending on the type of polypeptide, the type of disease to be treated or prevented, the age of the patient, the severity of the disease, and the like.
  • the polypeptide is an anti-glypican antibody
  • the effective dose of the anti-glybican antibody is selected in the range of 0.000 mg / kg body weight / kg / kg of body weight per kg of body weight. Yes! / ⁇ ⁇ or tang, per person 0.0.01
  • a dose of ⁇ 100,000 mg Zbody can be selected. However, they are not limited to these doses.
  • the administration method of the polypeptide is force S that can be either oral or parenteral administration, preferably parenteral administration, specifically injection (for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection). Systemic or local administration by injection, subcutaneous injection, etc.), nasal administration, pulmonary administration, transdermal administration and the like.
  • the present invention also provides the following novel polypeptides (A) to (E) (except for polypeptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 6 and 8). To do.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has an amino acid sequence in which one or more (for example, several) amino acids are substituted, deleted, added or Z and inserted, and has taurine transporter activity Polypeptide
  • novel polypeptide of the present invention is a hamster taurine transporter and a functionally equivalent polypeptide.
  • hamster taurine transporter has activities similar to those possessed by a hamster taurine transporter, such as a binding activity to taurine and an activity to transport taurine into cells.
  • activities similar to those possessed by a hamster taurine transporter such as a binding activity to taurine and an activity to transport taurine into cells.
  • polypeptides include mutants of hamster taurine transporter.
  • a polypeptide functionally equivalent to the Musta monotaurine transporter can be prepared.
  • Amino acid mutations can also occur in nature.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are mutated in the amino acid sequence of the hamster taurine transporter of the present invention and functionally equivalent to the hamster taurine transporter is also included. Included in peptides.
  • polypeptide functionally equivalent to the hamster taurine transporter of the present invention specifically, 1 or 2 or more, preferably 1 or more and 30 or less in the hamster taurine transporter amino acid sequence, More preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 or more and 10 or less, and most preferably 1 or more and 5 or less amino acid deletions, Hams 1 or 2 or more, preferably 1 or more and 30 or less, more preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 or more and 10 or less, most preferably 1 or more in the tertaurine transporter amino acid sequence 5 1 or 2 or more, preferably 1 or more and 30 or less, more preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 in the hamster taurine transporter amino acid sequence.
  • Examples include those in which from 10 to 10, most preferably from 1 to 5 amino acids are substituted with other amino acids.
  • amino acid residue to be mutated is not particularly limited. It is preferable that the amino acid residue is mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved.
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G,
  • a polypeptide having an amino acid sequence modified by deletion or addition of one or more amino acid residues to a certain amino acid sequence and substitution by Z or another amino acid maintains its biological activity. This is already known (Mark, DF et al., Proc. Nat
  • Examples of the polypeptide in which one or a plurality of amino acid residues are attached to the hamster taurine transporter of the present invention include fusion polypeptides containing the nose and mustaurine transporters.
  • the fusion polypeptide is a fusion of the protein nominta taurine transporter of the present invention and another polypeptide, and is included in the present invention.
  • a gene encoding the hamster taurine transporter of the present invention and a gene encoding another polypeptide are linked so that the frames coincide with each other, introduced into an expression vector, and expressed in a host. Any method known to those skilled in the art can be used.
  • Other polypeptides subjected to fusion with the polypeptides of the present invention There is no particular limitation.
  • peptides to be subjected to fusion with the polypeptide of the present invention include, for example, FLAG (H opp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6 His (histidines) ) Residual 6 X His, 10 X His, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, pl8HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T Antigen fragment, lck tag, a-tubulin fragment, B-tag, Protein C fragment, GST (glutathione S-transferase), HA (influenza agglutinin), immunoglobulin constant region, ⁇ -galactosidase And ⁇ (maltose-binding polypeptide).
  • FLAG H opp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210
  • 6 His histidines
  • a fusion polypeptide by fusing a gene encoding these polypeptides that are commercially available with a gene encoding the polypeptide of the present invention and expressing the fusion gene thus prepared. it can.
  • Hybridization conditions for isolating a DNA encoding a polypeptide functionally equivalent to the hamster taurine transporter of the present invention can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the hybridization conditions include low stringency conditions.
  • Low stringent conditions include, for example, 42 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS, and preferably 50 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS. More preferably, highly stringent conditions are included.
  • highly stringent conditions include 65 ° C, 2 XS SC, and 0.1% SDS. Under these conditions, the higher the homology, the lower the temperature. It is possible to comprehensively obtain not only DNA having sex but also DNA having low homology.
  • Polypeptides encoded by DNA isolated by these hybridization techniques usually have high homology in amino acid sequence with the hamster taurine transporter of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention includes a polypeptide that is functionally equivalent to the hamster taurine transporter of the present invention and has high homology with the hamster taurine transporter amino acid sequence of the present invention.
  • High homology usually refers to a homology of 97% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% or more.
  • the algorithm described in the literature Wang, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730 may be used.
  • the polypeptide of the present invention may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence or form of a sugar chain, etc., depending on the cell, host or purification method producing the polypeptide as described later.
  • the obtained polypeptide power is included in the present invention as long as it has the same function as the hamster taurine transporter of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention when expressed in prokaryotic cells such as E. coli, a methionine residue is added to the N-terminus of the original polypeptide amino acid sequence.
  • the N-terminal signal sequence is removed.
  • the polypeptides of the present invention also include such polypeptides.
  • the polypeptide of the present invention can be prepared as a recombinant polypeptide or a natural polypeptide by methods known to those skilled in the art. If the polypeptide is a recombinant polypeptide, the DNA encoding the polypeptide of the present invention is incorporated into an appropriate expression vector, and the transformant obtained by introducing the DNA into an appropriate host cell is recovered to obtain an extract. Purification by chromatography such as ion exchange, reverse phase, genore filtration, or affinity chromatography in which an antibody against the polypeptide of the present invention is immobilized on the column, or by combining a plurality of these columns. Can be prepared Noh.
  • polypeptide of the present invention is used as a fusion polypeptide with a glutathione S-transferase polypeptide or as a recombinant polypeptide to which a plurality of histidines are added in a host cell (eg, animal cell or E. coli).
  • a host cell eg, animal cell or E. coli.
  • the expressed recombinant polypeptide can be purified by using a daltathion column or a nickel column.
  • the region other than the target polypeptide of the fusion polypeptide can be cleaved with thrombin or factor Xa as necessary.
  • hamster taurine transporter which will be described later, by methods well known to those skilled in the art, for example, extracts of tissues and cells expressing the polypeptide of the present invention. It can be isolated by purifying it with the action of the affinity column to which the antibody is bound.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the present invention provides a DNA encoding a taurine transporter which is any of the following (a) to (e) (excluding DNAs having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3, 5 and 7).
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 one or a plurality of (for example, several) amino acids have a substitution, deletion, addition or Z and inserted amino acid sequence, and a polymorphism having taurine transporter activity DNA encoding the peptide
  • the DNA of the present invention can be used in vivo or in vitro for the polypeptide of the present invention as described above. In addition to being used for the production of hamster taurine transporter, it can be used for the production of cells that strongly express hamster taurine transporter.
  • the DNA of the present invention may be in any form as long as it can encode the polypeptide of the present invention. That is, it does not matter whether it is a cDNA synthesized from mRNA, a genome DNA, a chemically synthesized DNA, or the like. In addition, DNA having any base sequence based on the degeneracy of the genetic code is included as long as it can encode the polypeptide of the present invention.
  • the DNA of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • a cDNA library is prepared from cells expressing and expressing the polypeptide of the present invention, and hybridization is performed using a part of the DNA sequence of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1) as a probe.
  • SEQ ID NO: 1 a part of the DNA sequence of the present invention.
  • One cDNA library may be prepared by the method described in, for example, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), or a commercially available gene library may be used.
  • RNA is prepared from cells expressing the polypeptide of the present invention
  • oligo DNA is synthesized based on the sequence of the DNA of the present invention (eg, SEQ ID NO: 1), and PCR reaction is performed using this as a primer. It is also possible to prepare by amplifying the cDNA encoding the taurine transporter.
  • the translation region encoded by the cDNA can be determined, and the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention can be obtained.
  • genomic DNA can be isolated by screening a genomic DNA library using the obtained cDNA as a probe.
  • mRNA is isolated from cells, tissues, etc. that express the polypeptide of the present invention. Isolation of mRNA is performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al, Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), etc., prepare total RNA and purify mRNA from total RNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia). Alternatively, mRNA can be prepared directly using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • cDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase. cDNA synthesis is done with AMV
  • a target DNA fragment is prepared from the obtained PCR product and ligated with vector DNA. Furthermore, a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA can be confirmed by a known method such as the dideoxynucleotide chain termination method.
  • a nucleotide sequence with higher expression efficiency can be designed in consideration of the codon usage frequency of the host used for expression (Grantham, R. et al, Nucleic Acids Research (1981) 9, r43—74).
  • the DNA of the present invention can be modified by a commercially available kit or a known method. Examples of modifications include digestion with restriction enzymes, insertion of synthetic oligonucleotides and appropriate DNA fragments, addition of linkers, insertion of start codon (ATG) and Z or stop codon (TAA, TGA, or TAG). It is done.
  • the DNA of the present invention is also a DNA that is hybridized under stringent conditions with a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and that encodes a polypeptide functionally equivalent to a taurine transporter including.
  • Stringent conditions can be appropriately selected by those skilled in the art, and examples thereof include low stringent conditions.
  • Low stringent conditions include, for example, 42 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS, preferably 50 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS. More preferably, highly stringent conditions are included. Examples of highly stringent conditions include 65 ° C, 2 X SSC, and 0.1% SDS. Under these conditions, DNA having high homology can be obtained as the temperature is increased.
  • Said hybridizing DNA is preferably naturally-derived DNA, such as cDNA or chromosomal DNA.
  • the DNA isolated by these hybridization techniques usually has high identity in nucleotide sequence with the DNA encoding the hamster taurine transporter of the present invention.
  • the DNA of the present invention is functionally identical to the hamster taurine transporter of the present invention.
  • High identity generally refers to homology of 96% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% or more.
  • the identity of the base sequence can be determined by the algorithm BLAST (Proc. Natl. A cad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993) by Karlin and Altschul. Based on this algorithm, programs called BLASTN and BLASTX have been developed!
  • the present invention also provides a vector into which the DNA of the present invention is inserted.
  • the vector 1 of the present invention is used to hold the DNA of the present invention in a host cell or to express the polypeptide of the present invention (that is, a hamster taurine transporter and a polypeptide functionally equivalent thereto).
  • the polypeptide of the present invention that is, a hamster taurine transporter and a polypeptide functionally equivalent thereto.
  • It is also useful for strongly expressing taurine transporter in host cells. By strongly expressing the taurine transporter in the host cell, the incorporation of taurine into the host cell is promoted, and the production of the desired polypeptide by the host cell can be increased.
  • a vector for example, when Escherichia coli is used as a host, the vector is amplified in Escherichia coli in order to amplify it in large quantities using Escherichia coli (for example, JM109, DH5a, HB101, XLlBlue) and the like. It is preferable to have a selected gene of E. coli transformed (for example, a drug resistance gene that can be discriminated by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)). Examples of vectors include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, and pCR-Script.
  • an expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing the polypeptide of the present invention.
  • the host is defined as JM109, DH5 a , HB101, XLl-Blue, and other E. coli promoters that can be efficiently expressed in E. coli, such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-5 46; FASEB J.
  • the vector also includes a signal sequence for polypeptide secretion!
  • a signal sequence for polypeptide secretion the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when it is produced in the periplasm of E. coli.
  • Introduction of the vector into the host cell can be carried out by using, for example, the calcium chloride method or the electopore position method.
  • vectors used for producing the polypeptide of the present invention include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF) — BOS (Nucleic Acids. Res.
  • Insect cell-derived expression vectors eg “Bac-to- BAC baculovairus expression system” (GIBCO BRL), pBacPAK8) Plant-derived expression vectors (eg, ⁇ 1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (eg, pZIpneo), yeast-derived expression vectors (eg, “Pichia Expression Kit” (manufactured by Invitrogen), pNVll, SP-Q01), expression vectors derived from Bacillus subtilis (eg, pPL608, pKTH50), and the like.
  • Bacillus subtilis eg, pPL608, pKTH50
  • promoters required for expression in cells such as SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277 108), MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc.
  • the gene has a gene (eg, a drug resistance gene that can be discriminated by a drug (neomycin, G418, etc.)).
  • Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK- CMV, pOPRSV, pOP13, etc.
  • the gene when the gene is stably expressed and the purpose is to amplify the copy number of the gene in the cell, the DHFR gene that complements the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway is used. And a method of amplifying with methotrexate (MTX), and when transient expression of the gene is intended, a gene that expresses SV40 T antigen
  • a method of transforming with a vector (such as pcD) having an SV40 replication origin using COS cells having a chromosome on the chromosome can be mentioned.
  • a vector such as pcD
  • COS cells having a chromosome on the chromosome
  • the origin of replication those derived from poliovirus, adenovirus, ushipapilloma virus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vector is a selectable marker for amplification of gene copy number in the host cell system: aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) Gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene, and the like.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • the present invention also provides a host cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and for example, Escherichia coli and various animal cells can be used.
  • the host cell of the present invention can be used, for example, as a production system for production and expression of the polypeptide of the present invention.
  • the host cell of the present invention can strongly express a taurine transporter, promotes taurine uptake, and increases production of a desired polypeptide.
  • Production systems for polypeptide production include in vitro and in vivo production systems. Examples of in vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as the host.
  • Animal cells include mammalian cells such as CH0 (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, amphibian cells such as African cells. Megael oocytes (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340) or insect cells such as S19, S121, Tn5 are known.
  • CHO cells dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • CHO cells are particularly preferred.
  • Vectors can be introduced into host cells by methods such as the calcium phosphate method, DEAE dextran method, Cationic ribosome DOTAP (Boehringer Mannheim), electopore method, and lipofusion. Is possible.
  • cells derived from Nicotiana tabacum are known as polypeptide production systems, and these may be cultured in callus.
  • Fungal cells include yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus' Niger. niger) is known.
  • prokaryotic cells When prokaryotic cells are used, there are production systems using bacterial cells.
  • bacterial cells include E. coli, such as JM109, DH5a, HB101, and other Bacillus subtilis.
  • a polypeptide encoded by the target gene can be obtained.
  • the culture can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as a culture medium for animal cells.
  • a serum supplement such as fetal calf serum (FC S) can be used together, or serum-free culture can be performed.
  • FC S fetal calf serum
  • the pH during culture is preferably about 6-8. Cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 200 hours, and medium exchange, aeration, and agitation are added as necessary.
  • examples of a system for producing a polypeptide in vivo include a production system using animals and a production system using plants.
  • the desired gene is introduced into these animals or plants to produce and recover the polypeptide in the animals or plants.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mice When animals are used, there are production systems using mammals and insects. As mammals, goats, pigs, hidges, mice and mice can be used (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). In addition, when a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • the gene of interest is produced uniquely in milk such as goat j8 casein Prepared as a fusion gene with a gene encoding a polypeptide. Subsequently, the gene fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transferred to a female goat.
  • the desired polypeptide can be obtained from the milk produced by the transgene goat born from the goat that received the embryo or its offspring.
  • Hormones may be used in Transgene goats as appropriate to increase the milk yield, including polypeptides that are also produced by Transgenic goats (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702;).
  • the target polypeptide can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with a baculovirus inserted with a gene encoding the target polypeptide (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594;).
  • tobacco when using plants, for example, tobacco can be used.
  • a gene encoding the desired polypeptide is inserted into a plant expression vector, such as pMO N 530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens.
  • the bacteria can be infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the desired polypeptide can be obtained from the leaves of this tobacco (Julian K.-C. Ma et al., Eur. J Immunol. (1994) 24, 131-138).
  • polypeptide thus obtained can be isolated from inside or outside the host cell (such as a medium) and purified as a substantially pure and homogeneous polypeptide. Separation and purification of polypeptides are not limited in any way as long as separation and purification methods used in normal polypeptide purification are used. For example, select chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. In combination, polypeptides can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc .; 0 (Strategies for Protein Purification and Haractenzat ion: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996).
  • chromatography are liquid phase chromatography, eg For example, it can be performed using liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • the present invention also encompasses polypeptides that are highly purified using these purification methods.
  • the modification can be arbitrarily selected or the peptide can be partially removed by allowing an appropriate polypeptide modifying enzyme to act before or after the polypeptide is purified.
  • polypeptide-modifying enzyme examples include trypsin, chymotrypsin, lysyl endobeptidase, protein kinase, darcosidase and the like.
  • the present invention also provides an antibody that binds to the polypeptide of the present invention.
  • the form of the antibody of the present invention includes a monoclonal antibody as well as a polyclonal antibody without particular limitation. Also included are antisera obtained by immunizing animals such as rabbits with the polypeptide of the present invention, all classes of polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.
  • the polypeptide used as the sensitizing antigen may be a complete polypeptide or a partial peptide of the polypeptide.
  • Examples of the partial peptide of the polypeptide include an amino group (N) terminal fragment and a carboxy (C) terminal fragment of the polypeptide.
  • antibody refers to an antibody that reacts with the full length or fragment of a polypeptide.
  • a gene encoding the polypeptide of the present invention or a fragment thereof is inserted into a known expression vector system, and the host cell described herein is transformed with the vector, and the target polypeptide is expressed from inside or outside the host cell.
  • a peptide or a fragment thereof may be obtained by a known method and used as a sensitizing agent.
  • cells expressing the polypeptide of the present invention, lysates thereof, or chemically synthesized polypeptides of the present invention may be used as the sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but it is generally preferable to select it in consideration of the compatibility with the parent cell used for cell fusion. Tooth, maggot, primate animals are used.
  • rodent animals examples include mice, rats, and hamsters.
  • Usagi is an example of an animal of the order Usagi.
  • monkeys are used as primate animals.
  • monkeys with narrow nose old world monkeys
  • rival cynomolgus monkeys monkeys, baboons, chimpanzees and the like are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously in a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted and suspended in an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, etc., and an appropriate amount of a normal adjuvant such as Freund's complete adjuvant is mixed if necessary. After emulsification, it is administered to mammals.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline physiological saline
  • an appropriate amount of a normal adjuvant such as Freund's complete adjuvant
  • it is administered to mammals.
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen. After immunization in this way, it is
  • the blood of the mammal sensitized with the antigen is taken out.
  • This blood force also separates serum by a known method.
  • serum containing the polyclonal antibody may be used, and if necessary, a fraction containing the serum power polyclonal antibody may be further isolated and used.
  • a fraction recognizing only the polypeptide of the present invention is obtained using the affinity column coupled with the polypeptide of the present invention, and this fraction is further used with a protein A or protein G column. Then, immunoglobulin G or M can be prepared by purification.
  • immune cells are taken out from the mammal and subjected to cell fusion.
  • spleen cells are particularly preferable as immune cells used for cell fusion.
  • the other parent cell to be fused with the immune cell is preferably a myeloma cell of a mammal, more preferably a myeloma cell that has acquired the characteristics for selecting fused cells by a drug.
  • the cell fusion of the immune cells and myeloma cells is basically performed according to a known method, for example, the method of Milstein et al. (Galfre, G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). Can be done.
  • Hyperidoma obtained by cell fusion is selected by culturing in a normal selective culture medium, for example, a HAT culture medium (a culture liquid containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Cultivation in the HAT medium is not intended for cells other than the desired hyperidoma (non- This is carried out for a time sufficient for the fusion cells) to die, usually several days or weeks. Then, the usual limiting dilution method is performed, and the hybridoma producing the target antibody is screened and cloned.
  • a normal selective culture medium for example, a HAT culture medium (a culture liquid containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Cultivation in the HAT medium is not intended for cells other than the desired hyperidoma (non- This is carried out for a time sufficient for the fusion cells) to die, usually several days or weeks. Then, the usual limiting dilution method is performed, and the hybridoma producing the
  • the obtained hyperidoma was transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites was collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody was used for, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G force ram, DEAE ion exchange chromatography. It can be prepared by purification using a chromatography column or a affinity column coupled with the polypeptide of the present invention.
  • the antibody of the present invention is used for purification and detection of the polypeptide of the present invention.
  • Monoclonal antibodies obtained in this way can also be obtained as recombinant antibodies produced using genetic recombination techniques (eg, Borrebaeck, CAK and Larrick, JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • Recombinant antibodies are produced by cloning the gene encoding them into hyperpridoma or immune cells such as sensitized lymphocytes that produce antibodies, incorporating them into appropriate vectors, and introducing them into a host.
  • the present invention encompasses this recombinant antibody.
  • the antibody of the present invention may be an antibody fragment or a modified antibody thereof as long as it binds to the polypeptide of the present invention.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ′) 2, Fv, or single chain Fv (scFv) in which H chain and L chain Fv are linked with an appropriate linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • an antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate antibody fragments, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector, and then an appropriate host is prepared.
  • an enzyme such as papain or pepsin
  • a modified antibody an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) is used. It can also be used.
  • the “antibody” of the present invention includes these modified antibodies. Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • the antibody obtained as described above can be purified to homogeneity. Separation and purification of antibodies used in the present invention may be carried out using separation and purification methods used in ordinary polypeptides. For example, by selecting and combining chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc., antibodies can be separated, (Antibodies: A Laboratory Manual. Ti, d Harlow and David Lane, Cola Spring Harbor Laboratories, 1988) Forces are not limited to these. The concentration of the antibody obtained above can be measured by measuring absorbance, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), or the like.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Examples of the column used for the affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • a protein A column Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) and the like can be mentioned.
  • chromatography other than affinity chromatography examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (Strategies for Protein Purification and Char acterization: A Laboratory). Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatography can be carried out using liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • a method for measuring the antigen binding activity of the antibody of the present invention for example, absorbance measurement, enzyme-linked immunosorbent assay (tuJA), EIA (enzyme immunoassay) RIA (radioimmunoassay) or fluorescent antibody method can be used.
  • tuJA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescent antibody method for example, absorbance measurement, enzyme-linked immunosorbent assay (tuJA), EIA (enzyme immunoassay) RIA (radioimmunoassay) or fluorescent antibody method.
  • tuJA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescent antibody method for example, absorbance measurement, enzyme-linked immunosorbent assay (tuJA), EIA (enzyme immunoassay) RIA (radioimmunoassay) or fluorescent antibody method.
  • a secondary antibody that recognizes an antibody labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase After adding a secondary antibody that recognizes an antibody labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase, the plate is incubated, washed, and then ⁇ -nitro Antigen binding activity can be evaluated by measuring absorbance by adding an enzyme substrate such as phenyl phosphate.
  • a polypeptide fragment such as a fragment consisting of the C-terminal or a fragment consisting of the N-terminal may be used as the polypeptide.
  • BIAcore manufactured by Pharmacia
  • RNA was extracted from anti-IL-6 receptor antibody-producing cells (JP-A-8-99902) in which an anti-IL-6 receptor antibody gene was introduced into CHO DXB11 cells, followed by synthesis of cDNA dependent on poly A .
  • the Hamster taurine transporter (TauT) gene was obtained by PCR by stencilizing cDNA fragmented with three types of restriction enzymes, Sail, XhoI, and EcoRI. PCR primers containing 5 'and 3' in which the gene sequence is conserved between known Rat / Mouse TauT were designed and used. The base sequence of the cloned gene was determined, and it was confirmed that it encodes Hamster TauT based on homology with TauT of a known species (Fig. 1). Hamster TauT amino acid sequence is highly homologous to Mouse (96% Identity), Rat (96% Id entity), Human (93% Identity) TauT and is a transporter with 12 transmembrane regions ( Figure 2).
  • Example 2 Increased live cell density by introducing hamster taurine transporter! ], Suppression of lactic acid production, and increase of antibody production
  • a Kozak sequence was added to the Hamster TauT (hereinafter referred to as TauT) gene obtained by cloning in Example 1, and a CMV promoter expression plasmid pHyg / TauT (FIG. 3) was constructed.
  • the control plasmid pHyg except for pHyg / TauT or TauT gene was introduced into the parent strain, anti-glibican-3 antibody-producing CHO cells (see pamphlet of International Publication No. WO 2006/006693) by the electoral position method.
  • Production amount and anti-glypican-3 antibody production amount were compared.
  • growth inhibitors such as lactic acid accumulate in the culture medium as the cell grows, and growth is suppressed, but the viable cell density of the pHyg / TauT-introduced cells (Fig. 4) and lactic acid are suppressed.
  • the production amount (Fig. 5) was superior to pHyg-introduced cells (t test P ⁇ 0.05).
  • the amount of anti-glibican-3 antibody produced 4 out of 7 pHyg / TauT-introduced cells exceeded the maximum value of pHyg-introduced cells (Fig. 6).
  • Example 3 Ammonia production amount of the hamster taurine transporter introduced strain suppression, tau phosphorus uptake, glutamine consumption increase, and taurine not dependent antibody production quantity parent strain and pHyg / TauT transferred strain, initial 2xl0 5 cells / and 1L jar fed-batch culture in mL, were taken timely, a culture solution containing fermenter Kakara 450Xl0 5 cells. After separating the culture supernatant by centrifugation, the cell pellet is filled with 1 mL of cold sterilized water containing protease inhibitors (Complete Mini, Roche Diagnostics, Protease inhibitor cocktail tablets), and the cells are placed on ice.
  • protease inhibitors Complete Mini, Roche Diagnostics, Protease inhibitor cocktail tablets
  • the intracellular concentration is determined by adding 1 mL of cold sterilized water to the cell pellet, and then using ultrasound. Since cell disruption was performed, the measured values of various amino acids and ammonia were converted to values per cell, and the converted values were compared.
  • Ammonia concentration ratio of 11, a 450Xl0 5 pieces per Rino ammonia detected value of the parent strain at the start of 1L jar fed-batch culture was defined as 1, at the start of cultivation, day 6, day 12, day 18 The ratio was obtained by comparison with the detected value.
  • taurine and glutamic acid in FIGS. 12 and 13 were also measured by the amino acid analysis.
  • the intracellular taurine concentration ratio was determined by the same method as that for ammonia (Fig. 12).
  • ammo detection value of the parent strain per 5 200xl0 cells on the 4th day of 50 mL shaker batch culture is defined as 1.
  • the pHyg / TauT-introduced strain incorporated taurine depending on the amount of taurine-added potassium, and the amount incorporated was the same as that of the parent strain.
  • the glutamine consumption of the pHyg / TauT-introduced strain was conspicuous for the parent strain, and did not depend on the initial taurine concentration. It has been reported that glutamine functions to improve the cell growth and survival rate of hyperpridoma and the ability to produce antibodies, and to increase antibody production (Enzyme and Microbial Technology 17: 47-55, 1995).
  • the antibody production enhancement effect of the pHyg / TauT-introduced strain may be due to incorporation of amino acids other than taurine (such as glutamine) via the taurine transporter.
  • the glutamine concentration is a value obtained by converting the measurement value obtained by amino acid analysis of the culture solution on the fourth day of culture in FIG. 12 per lxlO 5 cells.
  • the amount of anti-glibican-3 antibody produced did not depend on the initial taurine concentration (0 to 500 mM (62.575 g / L)) at the start of 50 mL shaker fed-batch culture (FIG. 14). In addition, there was no significant difference in the effect of antibody production due to the initial taurine concentration in the parent strain.
  • the present invention is applicable to all antibody-producing cells.
  • the present invention can be used for production of polypeptides.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of the gene encoding hamster taurine transporter.
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of the hamster taurine transporter.
  • SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of a gene encoding rat taurine transporter.
  • SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence of rat taurine transporter.
  • SEQ ID NO: 5 shows the base sequence of the gene encoding the mouse taurine transporter ⁇ SEQ ID NO: 6>
  • SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of mouse taurine transporter.
  • SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of a gene encoding human taurine transporter.
  • SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence of human taurine transporter.

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Abstract

　安価に天然型タンパク質又は組換えタンパク質を生産することができる方法を提供する。 　タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した細胞を培養し、所望のポリペプチドを産生させることを含む、ポリペプチドの製造方法。ハムスタータウリントランスポーター、それをコードするＤＮＡ、組換えベクター及び形質転換細胞なども提供される。

Description

明 細 書
タウリントランスポーター遺伝子
技術分野
[0001] 本発明は、ハムスタータウリントランスポーター及びハムスタータウリントランスポータ 一をコードする遺伝子並びにタウリントランスポーターを強発現する細胞を用いてポリ ペプチドを製造する方法に関する。
背景技術
[0002] 遺伝子組換え技術を用いて、医薬として有用なタンパク質を生産する際に、動物細 胞を用いると、原核細胞が行 、得な 、ような複雑な翻訳後修飾やフォールデイングが 可能となるため、動物細胞は組換えタンパク質生産のための宿主細胞として多用さ れてきている。
近年、抗体や生理活性タンパク質などの多くのバイオ医薬品が排出されているが、 組換えタンパク質を効率よく動物細胞に生産させる技術は、ノィォ医薬品の低コスト 化につながり、患者への安定な供給を約束するものである。
従って、より生産効率の高 、タンパク質の製造方法が望まれて 、る。
[0003] タウリンは、魚介類や軟体動物に多く含まれるアミノ酸の一種で、哺乳動物の成長 に大切な栄養素である。タンパク質合成には使われないが、高コレステロール血症正 常化、血圧降下、 解毒作用、免疫機能維持、生体膜安定化、神経興奮性調節、抗 酸化性などを有している。培養細胞においては、浸透圧調節および細胞膜の安定 化に寄与することが知られている（非特許文献 1)。しかし、タウリントランスポーターが 機能するァストロサイト初代培養細胞の培地に、タウリンを添加しても、タウリンの細胞 内への取り込みが増加するとは言えないことから（非特許文献 2)、培地にタウリンを 添加するだけでは不十分であった。
[0004] 一方、タウリントランスポーターを介したタウリンや他のアミノ酸の培養細胞内への取 り込み力 培養細胞における所望の組換えタンパク質の産生向上に寄与するかどう かはまったく知られて ヽな 、。
いくつかのタウリントランスポーター (ヒト:非特許文献 3、マウス:非特許文献 4、ラット ：非特許文献 5)、並びにそのタウリントランスポーターがタウリンや |8—ァラニンなど のアミノ酸の細胞への取り込みに関与することは知られている（非特許文献 6)力 ハ ムスターのタウリントランスポーターについてはその存在を含めて未だ知られていな い。
[0005] 非特許文献 1： Ian Henry Lambert, Neurochemical Research (2004) 29(1), 27-63 非特許文献 2 Journal of Neurochemistry (2000), 75(3), 919-924
非特許文献 3 : Uchida, S. et.al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89 (17), 8230— 8234
非特許文献 4 : Liu, Q.R. et.al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89 (24), 12145- 12149
非特許文献 5 : Smith,K.E. et.al, Mol. Pharmacol. (1992) 42 (4), 563-569
特許文献 6 : Ryo Shioda. et.al., Investigative Ophthalmology & Visual Science (20
02) 43 (9), 2916
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、安価に天然型タンパク質又は組換えタンパク質を生産することができる 方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意努力した結果、タウリントランスポー ターを強発現する細胞を用いることによって、所望のポリペプチドの生産量を増加さ せることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明の要旨は以下の通りである。
[0008] (1)タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードする DNA を導入した細胞を培養し、所望のポリペプチドを産生させることを含む、ポリペプチド の製造方法。
(2)タウリントランスポーターを強発現する細胞力 タウリントランスポーターをコードす る DNAを導入した細胞である（1)記載の製造方法。
(3)細胞がチャイニーズノ、ムスター卵巣細胞である（2)記載の製造方法。 (4)所望のポリペプチドが抗体である（1)〜（3)の 、ずれかに記載の製造方法。
(5)タウリントランスポーターをコードする DNAが以下の (a)〜(e)の!、ずれかである（2 )〜 (4)の 、ずれかに記載の製造方法。
[0009] (a)配列番号 2、 4、 6又は 8のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNA
(b)配列番号 2、 4、 6又は 8のアミノ酸配列において、 1又は複数のアミノ酸が置換、 欠失、付加又は Z及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつタウリントランスポーター 活性を有するポリペプチドをコードする DNA
(c)配列番号 2、 4、 6又は 8のアミノ酸配列と 70%以上の相同性を有し、かつタウリント ランスポーター活性を有するポリペプチドをコードする DNA
(d)配列番号 1、 3、 5又は 7の塩基配列を有する DNA
(e)配列番号 1、 3、 5又は 7の塩基配列を有する DNAに相補的な DNAとストリンジヱ ントな条件下でノヽイブリダィズし、かつタウリントランスポーター活性を有するポリぺプ チドをコードする DNA
[0010] (6)タウリン濃度が 0g/L〜100 g/Lである培地で培養することを含む（1)〜（5)のいず れかに記載の製造方法。
(7) (1)〜（6)の ヽずれかに記載の方法で製造されたポリペプチドを含有する医薬 品を製造する方法。
(8)以下の (a)〜(e)の!、ずれかであるタウリントランスポーターをコードする DNA (但し 、配列番号 3、 5及び 7の塩基配列を有する DNAを除く）。
(a)配列番号 2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNA
(b)配列番号 2のアミノ酸配列において、 1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又 は Z及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつタウリントランスポーター活性を有する ポリペプチドをコードする DNA
(c)配列番号 2のアミノ酸配列と 97%以上の相同性を有し、かつタウリントランスポータ 一活性を有するポリペプチドをコードする DNA
(d)配列番号 1の塩基配列を有する DNA
(e)配列番号 1の塩基配列を有する DNAに相補的な DNAとストリンジ ントな条件 下でノ、イブリダィズし、かつタウリントランスポーター活性を有するポリペプチドをコー ドする DNA
[0011] (9)以下の (A)〜(E)のいずれかであるポリペプチド（但し、配列番号 4、 6及び 8のアミ ノ酸配列を有するポリペプチドを除く）。
(A)配列番号 2のアミノ酸配列を有するポリペプチド
(B)配列番号 2のアミノ酸配列において、 1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又 は Z及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつタウリントランスポーター活性を有する ポリペプチド
(C)配列番号 2のアミノ酸配列と 97%以上の相同性を有し、かつタウリントランスポー ター活性を有するポリペプチド
(D)配列番号 1の塩基配列を有する DNAによりコードされるポリペプチド
(E)配列番号 1の塩基配列を有する DNAに相補的な DNAとストリンジ ントな条件 下でノ、イブリダィズし、かつタウリントランスポーター活性を有するポリペプチドをコー ドする DNAによりコードされるポリペプチド
[0012] (10) (8)記載の DNAを含む組換えベクター。
(11) (8)記載の DNAが導入されている細胞。
(12)タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードする DN Aを導入した細胞。
(13)タウリントランスポーターをコードする DNAが導入されている細胞。
発明の効果
[0013] 本発明により、安価に所望のポリペプチドを生産することができるようになった。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願 2006- 110467の明 細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]図 1は、新規にクローユングされた CHO細胞由来ハムスタータウリントランスポー ター遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
[図 2]図 2は、新規にクローユングした CHO細胞由来 Hamster TauTのアミノ酸配列力 ら TMpred programによって予測された膜貫通領域および方向に基づいて、 Proc. N atl. Acad. Sci. USA Vol.89, pp.8230— 8234, September 1992, Shinichi Uchida et.al. の FIG.5.を参考に作成したタウリントランスポーター膜トポロジーである。◎は Hamster TauT特異的なアミノ酸残基であり、第 2ループ (EX:細胞膜外領域)、 12番目の膜 貫通領域 (TM)および C末端 (IC：細胞内領域）に Human TauTと異なるアミノ酸が多 数存在する。
[図 3]図 3は、 Hamster TauT (622アミノ酸）を発現させたプラスミドである。
[図 4]図 4は、 50mlシェーカーフラスコバッチ培養 7日目における生細胞密度プロット である (n= 7)。 pHyg/TauT導入細胞の生細胞密度は、 pHyg導入細胞に対して優位 であった（P< 0. 05)。
[図 5]図 5は、 50mlシェーカーフラスコバッチ培養 7日目における乳酸産生量プロット である (n= 7)。 pHyg/TauT導入細胞は低乳酸産生であり、 pHyg導入細胞に対して優 位であった（t検定 P< 0. 05)。
[図 6]図 6は、 50mlシェーカーフラスコバッチ培養 7日目における抗グリビカン- 3抗体 産生量プロットである (n= 7)。 pHyg/TauT導入細胞の 7株中 4株は、 pHyg導入細胞 の最高値以上の抗体産生量を有して!/、た。
[図 7]図 7は、 50mlシェーカーフラスコ流加培養 7日目における抗グリビカン- 3抗体産 生量プロットである (n= 7)。 pHyg/TauT導入細胞の抗グリビカン- 3抗体は、 pHyg導 入細胞に対して優位であった (P< 0. 01)。
[図 8]図 8は、静置培養での拡大過程で増殖能の高カゝつた pHyg/TauT導入細胞であ る T10の 1Lジャーによる流加培養における生存率を示すグラフである。 T10の生存 率は培養 32日目においても 80%以上であった。一方で、親株は 19日目には 80% を下回った。
[図 9]図 9は、静置培養での拡大過程で増殖能の高カゝつた pHyg/TauT導入細胞であ る T10の 1Lジャーによる流加培養における抗体産生量を示すグラフである。培養 35 日目における抗グリビカン- 3抗体産生量は 2. 9g/Lであった。
[図 10]図 10は、 TauT導入 T10細胞が細胞膜上に TauT分子を発現していることを示 すフローサイトメトリー分析の結果である。 1次抗体としてゥサギ抗ラットタウリントランス ポーター抗体 (Alpha diagnostics社， U.S.)を使用（抗体士）し、 2次抗体としてロバ抗 ゥサギ IgG抗体 Pycoerythrin Conjugate (Abeam社， U.K.)で標識した。 [図 11]図 11は、 1Lジャー流加培養中の細胞内アンモニア含量 (濃度比）を示すダラ フである。親株にたいして、 pHyg/TauT導入株のアンモニア抑制は顕著であった。
[図 12]図 12は、培地中のタウリン濃度に依存してタウリンが細胞内に取り込まれてい ることを示すグラフである。タウリンの取り込み量は、 pHyg/TauT導入株と親株で差は みられなかった。
[図 13]図 13は、培地中のグルタミン消費を示すグラフである。 pHyg/TauT導入株は 親株にたいして、培地中のタウリン濃度に依存せずに細胞あたりのグルタミン消費量 が顕著に高力つた。
[図 14]図 14は、 pHyg/TauT導入株の抗グリビカン- 3抗体産生量力 培養開始時の 培地中のタウリン濃度に依存することなぐ同程度であることを示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
[0015] 以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードす る DNAを導入した細胞を培養し、所望のポリペプチドを産生させることを含む、ポリ ペプチドの製造方法を提供する。
本発明の方法において、細胞は、所望のポリペプチドを産生できる天然の細胞であ つても、所望のポリペプチドをコードする DNAを導入した形質転換細胞であってもよ V、が、所望のポリペプチドをコードする DNAを導入した形質転換細胞が好ま 、。
[0016] 本発明の方法において、所望のポリペプチドは特に限定されず、抗体 (例えば、抗 I L-6レセプター抗体、抗グリビカン- 3抗体、抗 CD3抗体、抗 CD20抗体、抗 GPIIb/IIIa 抗体、抗 TNF抗体、抗 CD25抗体、抗 EGFR抗体、抗 Her2/neu抗体、抗 RSV抗体、抗 CD33抗体、抗 CD52抗体、抗 IgE抗体、抗 CDlla抗体、抗 VEGF抗体、抗 VLA4抗体 など)や生理活性タンパク質 (顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)、顆粒球マクロファ ージコ口-一刺激因子（GM-CSF)、エリスロポエチン、インターフェロン、 IL- 1や IL- 6 等のインターロイキン、 t-PA、ゥロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固因子、 PTHな ど）など如何なるポリペプチドでもよいが、特に抗体が好ましい。抗体は、天然抗体、 Fab, scFv、 sc(Fv)2などの低分子化抗体、キメラ抗体、ヒトイ匕抗体などの如何なる抗体 であってもよい。 [0017] 本発明者らは、タウリントランスポーターを強発現する細胞を用いることにより、強発 現したタウリントランスポーターを介して、タウリンや βーァラニンだけでなぐダルタミ ンについても特異的に細胞内への取り込みを促進することを見出した。
[0018] タウリントランスポーターは、タウリンや |8—ァラニンなどのアミノ酸を細胞内に取り込 む機能を有する膜タンパク質として知られて ヽるが、細胞にタウリントランスポーター を強発現させることによりグルタミンを特異的に細胞内に取り込むようになることは知 られて 、な 、。ハイプリドーマにお!、てグルタミンが抗体の産生に関与して!/、ることが 知りれて ヽる (文献； Yeon— Ho Jeong et al, Enzyme and Microbial Technology (1995) 17,47-55)ことから、タウリントランスポーターを強発現させた細胞が抗体等のタンパク 質の産生を増強させる効果は、このタウリントランスポーターによるグルタミンの細胞 内への特異的な取り込み作用による可能性も考えられる。
[0019] タウリントランスポーターを強発現する細胞は、天然の細胞と比較してタウリントラン スポーターの発現量が増加して 、る細胞であれば特に限定されな 、。天然の細胞は 特に限定されないが、例えば CHO細胞など組換えタンパク質を製造する際に宿主と して用いられて 、る細胞を挙げることができる。
タウリントランスポーターを強発現する細胞としては、例えば、タウリントランスポータ 一遺伝子が人為的に導入された細胞を挙げることができる。タウリントランスポーター 遺伝子が人為的に導入された細胞は当業者に公知の方法により作製することが可 能であり、例えば、タウリントランスポーター遺伝子をベクターに糸且込み、該ベクターを 細胞に形質転換することにより作製することが可能である。
[0020] 細胞に強発現させるタウリントランスポーター遺伝子としては、如何なる生物由来の タウリントランスポーターでもよぐ特に限定されない。具体的には、ヒト、マウス、ラット 、ハムスターなどのげつ歯類などの生物由来のタウリントランスポーターが挙げられ、 ヒト、げっ歯類或いは宿主細胞と同じ種由来のタウリントランスポーターであることが好 ましぐ例えば、タウリントランスポーターを強発現させる細胞がチャイニーズノ、ムスタ 一卵巣細胞 (CHO細胞)である場合には、ヒト或いはハムスター由来のタウリントラン スポーターであることが好まし 、。
さらに、細胞に強発現させるタウリントランスポーター遺伝子としては、タウリントランス ポーターをコードする以下の (a)〜(e)のいずれかの DNAを挙げることもできる。
[0021] (a)配列番号 2、 4, 6又は 8のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNA
(b)配列番号 2、 4, 6又は 8のアミノ酸配列において、 1又は複数 (例えば、数個）のァ ミノ酸が置換、欠失、付加又は Z及び挿入されたアミノ酸配列を有し、カゝっタウリント ランスポーター活性を有するポリペプチドをコードする DNA
(c)配列番号 2、 4, 6又は 8のアミノ酸配列と 70%以上の相同性を有し、かつタウリント ランスポーター活性を有するポリペプチドをコードする DNA
(d)配列番号 1、 3、 5又は 7の塩基配列を有する DNA
(e)配列番号 1、 3、 5又は 7の塩基配列を有する DNAに相補的な DNAとストリンジヱ ントな条件下でノヽイブリダィズし、かつタウリントランスポーター活性を有するポリぺプ チドをコードする DNA
タウリントランスポーターを強発現する細胞は如何なる細胞でもよ 、が、 CHO細胞が 好ましぐ特に CHO dhfr—細胞が好ましい。
[0022] 所望のポリペプチドを製造するには、タウリントランスポーターを強発現する細胞に 所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入し、該細胞を培地中で培養することに より製造することが可能である。
タウリントランスポーター遺伝子が人為的に導入された細胞を用いて所望のポリべ プチドを製造する場合、タウリントランスポーター遺伝子と所望のポリペプチドをコード する遺伝子の導入の順序は特に制限されず、タウリントランスポーター遺伝子を導入 した後に所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入してもよいし、所望のポリぺプ チドをコードする遺伝子を導入した後にタウリントランスポーター遺伝子を導入しても よい。又、タウリントランスポーター遺伝子と所望のポリペプチドをコードする遺伝子を 同時に導入してもよい。
[0023] タウリントランスポーター遺伝子及び所望のポリペプチドをコードする遺伝子の導入 は単一のベクターにより同時に導入してもよいし、複数のベクターを用いて別々に導 人してちょい。
[0024] タウリントランスポーターを強発現する細胞の培養には、通常の細胞 (好ましくは、 動物細胞)培養で使用されている培地を用いることができる。これらには通常、ァミノ 酸、ビタミン類、脂質因子、エネルギー源、浸透圧調節剤、鉄源、 pH緩衝剤を含む。 これらの成分の含量は、通常、アミノ酸は 0.05— 1500mg/L、ビタミン類は 0.001— 10m g/L、脂質因子は 0— 200mg/L、エネルギー源は 1 20g/L、浸透圧調節剤は 0.1— 10 000mg/L、鉄源は 0.1— 500mg/L、 pH緩衝剤は 1 10000mg/L、微量金属元素は 0.0 0001— 200mg/L、界面活性剤は 0— 5000mg/L、増殖補助因子は 0.05— 10000 g/L およびヌクレオシドは 0.001— 50mg/Lの範囲が適当である力 これらに限定されず、 培養する細胞の種類、所望のポリペプチドの種類などにより適宜決定できる。
[0025] 上記成分のほか、例えば、微量金属元素、界面活性剤、増殖補助因子、ヌクレオシ ドなどを添カ卩しても良い。
[0026] 具体的には、例えば、 L-ァラニン、 L-アルギニン、 L-ァスパラギン、 L-ァスパラギン 酸、 L-システィン、 L-シスチン、 L-グルタミン、 L-グルタミン酸、グリシン、 L-ヒスチジン 、 L-イソロイシン、 L-ロイシン、 L-リジン、 L-メチォニン、 L-オル-チン、 L-フエ-ルァ ラニン、 L-プロリン、 L-セリン、 L-スレオニン、 L-卜リプ卜ファン、 L-チロシン、 L-ノ リン 等、好ましくは L-ァラニン、 L-アルギニン、 L-ァスパラギン、 L-ァスパラギン酸、 L-シ スチン、 L-グルタミン、 L-グルタミン酸、グリシン、 L-ヒスチジン、 L-イソロイシン、 L-口 イシン、 L-リジン、 L-メチォニン、 L-フエ二ルァラニン、 L-プロリン、 L-セリン、 L-スレオ ニン、 L-トリプトファン、 L-チロシン、 L -パリン等のアミノ酸類； i—イノシトール、ビォチ ン、葉酸、リポ酸、ニコチンアミド、ニコチン酸、 P-ァミノ安息香酸、パントテン酸カルシ ゥム、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミン B12 、ァスコルビン酸等、好ましくはピオチン、葉酸、リポ酸、ニコチン酸アミド、パントテン 酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミン B12、ァスコ ルビン酸等のビタミン類；塩化コリン、酒石酸コリン、リノール酸、ォレイン酸、コレステ ロール等、好ましくは塩ィ匕コリン等の脂質因子；グルコース、ガラクトース、マンノース 、フルクトース等、好ましくはグルコース等のエネルギー源;塩ィ匕ナトリウム、塩化カリ ゥム、硝酸カリウム等、好ましくは塩ィ匕ナトリウム等の浸透圧調節剤； EDTA鉄、クェン 酸鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硝酸第二鉄等、好まし くは塩ィ匕第二鉄、 EDTA鉄、クェン酸鉄等の鉄源類;炭酸水素ナトリウム、塩化カルシ ゥム、リン酸二水素ナトリウム、 HEPES、 MOPS等、好ましくは炭酸水素ナトリウム等の p H緩衝剤を含む培地を例示できる。
[0027] 上記成分のほか、例えば、硫酸銅、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、 塩化ニッケル、塩化スズ、塩化マグネシウム、亜ケィ酸ナトリウム等、好ましくは硫酸銅 、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム等の微量金属元素； Tween80、プル口ニック F68等の 界面活性剤；および組換え型インスリン、組換え型 IGF- 1、組換え型 EGF、組換え型 F GF、組換え型 PDGF、組換え型 TGF- α、塩酸エタノールァミン、亜セレン酸ナトリウ ム、レチノイン酸、塩酸プトレツシン等、好ましくは亜セレン酸ナトリウム、塩酸エタノー ルァミン、組換え型 IGF-1、塩酸プトレツシン等の増殖補助因子；デォキシアデノシン 、デォキシシチジン、デォキシグアノシン、アデノシン、シチジン、グアノシン、ゥリジン 等のヌクレオシドなどを添カ卩してもよい。なお上記培地の好適例においては、ストレプ トマイシン、ペニシリン Gカリウム及びゲンタマイシン等の抗生物質や、フエノールレツ ド等の pH指示薬を含んで ヽても良 、。
[0028] 培地の pHは培養する細胞により異なる力 一般的には pH6. 8〜7. 6、多くの場合 pH7. 0〜7. 4力適当である。
培地は、市販の動物細胞培養用培地、例えば、 D-MEM (Dulbecco's Modified Eagl e Medium)^ D— MEM/F— 12 1:1 Mixture (Dulbecco s Modified Eagle Medium： Nutrie nt Mixture F— 12)、 RPMI1640, CHO— S— SFM II(Invitrogen社)、 CHO-SF (Sigma— Aid rich社)、 EX-CELL 301 (JRH biosciences社)、 CD— CHO (Invitrogen社)、 IS CHO— V (Irvine Scientific社)、 PF- ACF- CHO (Sigma- Aldrich社)などの培地を用いることも可 能である。
又、培地は無血清培地であってもよい。
[0029] タウリントランスポーターを強発現する細胞が CHO細胞である場合、 CHO細胞の培 養は当業者に公知の方法を用いて行うことができる。例えば、通常、気相の CO濃度
2 力 40%、好ましくは、 2— 10%の雰囲気下、 30— 39°C、好ましくは 37°C程度で、培養 することが可能である。
後述の実施例力 も明らかなように、タウリントランスポーターを強発現する細胞に おいては、細胞の生育阻害物質となる乳酸などの老廃物の産生が抑制されうる。そ の結果、細胞は高い生存率維持効果を示すこととなり、本発明の細胞は 3ヶ月或い はそれ以上もの長期間の培養が可能である。
[0030] さらには培養細胞で抗体などの所望のポリペプチドを産生する場合、培養後期にお いては細胞がかなり高密度の状態（およそ 1 X 107 cells/ml)となり、乳酸などの老廃 物の影響が極めて高くなる。本発明の細胞により所望のポリペプチドを製造すれば、 培養後期においても高い生存率を維持し、所望のポリペプチドの産生量の向上につ いても期待できる。
本発明の細胞を用いて所望のポリペプチドを産生するために適当な培養期間は、 通常 1日〜3ヶ月であり、好ましくは 1日〜2ヶ月、さらに好ましくは 1日〜1ヶ月である。
[0031] また、動物細胞培養用の各種の培養装置としては、例えば発酵槽型タンク培養装 置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピンナーフラスコ型 培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培 養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置等を用いて培養することが できる。
培養は、バッチ培養 (batch culture),流カ卩培養 (fed- batch culture),連続培養 (conti nuous culture)などのいずれの方法を用いてもよいが、流加培養又は連続培養が好 ましぐ流加培養がより好ましい。
さらに本発明の細胞を培養する際に、細胞へのタウリンの取り込みを促進するため に培地中にタウリンを添加してもよい。培地に添加するタウリンの濃度は特に限定さ れないが、通常 0g/L〜100g/L、好ましくは 0g/L〜20g/L、さらに好ましくは 0g/L〜10g /Lである。
[0032] 本発明の方法により製造されたポリペプチドが医薬として利用可能な生物学的活 性を有する場合には、このポリペプチドを医薬的に許容される担体又は添加剤と混 合して製剤化することにより、医薬品を製造することができる。
[0033] 医薬的に許容される担体及び添加剤の例として、水、医薬的に許容される有機溶 剤、コラーゲン、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビ-ルポリマ 一、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリ ゥム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセル ロース、ェチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリェチ レングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、 ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA)、マン-トール、ソル ビトール、ラタトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
[0034] 実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組 み合わせて選ばれる力 もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製 剤として使用する場合、精製されたポリペプチドを溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液 、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えば Tween80、 Tween20、ゼラ チン、ヒト血清アルブミン等をカ卩えたものを使用することができる。あるいは、使用前に 溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよぐ凍結乾燥のため の賦形剤としては、例えば、マン-トール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用 することができる。
[0035] ポリペプチドの有効投与量は、ポリペプチドの種類、治療や予防の対象とする疾患 の種類、患者の年齢、疾患の重篤度などにより適宜選択される。例えば、ポリべプチ ドが抗グリピカン抗体である場合、抗グリビカン抗体の有効投与量は、一回につき体 重 lkgあたり 0. OOlmg力ら lOOOmgの範囲で選ば、れる。ある!/ヽ ίま、唐、者あたり 0. 01
〜100000mgZbodyの投与量を選ぶことができる。しかしながら、これらの投与量 に制限されるものではな 、。
ポリペプチドの投与方法は、経口、非経口投与のいずれでも可能である力 S、好まし くは非経口投与であり、具体的には、注射 (例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔 内注射、皮下注射などによる全身又は局所投与)、経鼻投与、経肺投与、経皮投与 などが挙げられる。
[0036] また、本発明は、以下の (A)〜(E)の 、ずれかである新規ポリペプチド (但し、配列番 号 4、 6及び 8のアミノ酸配列を有するポリペプチドを除く）を提供する。
[0037] (A)配列番号 2のアミノ酸配列を有するポリペプチド
(B)配列番号 2のアミノ酸配列において、 1又は複数 (例えば、数個）のアミノ酸が置 換、欠失、付加又は Z及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつタウリントランスポー ター活性を有するポリペプチド
(C)配列番号 2のアミノ酸配列と 97%以上の相同性を有し、かつタウリントランスポー ター活性を有するポリペプチド
(D)配列番号 1の塩基配列を有する DNAによりコードされるポリペプチド
(E)配列番号 1の塩基配列を有する DNAに相補的な DNAとストリンジ ントな条件 下でノ、イブリダィズし、かつタウリントランスポーター活性を有するポリペプチドをコー ドする DNAによりコードされるポリペプチド
本発明の新規ポリペプチドは、ハムスタータウリントランスポーター及びそれと機能 的に同等なポリペプチドである。
[0038] 本発明において、ハムスタータウリントランスポーターと機能的に同等とは、タウリン への結合活性、タウリンの細胞内への輸送活性などのハムスタータウリンポーターが 有する活性と同様の活性を有していることを言う。このようなポリペプチドには、例えば 、ハムスタータウリントランスポーターの変異体などが含まれる。
[0039] あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知 られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、 当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、 K ramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441—9456、 Kramer W, and Fritz HJ( 1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、 Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492、 Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766)などを用いて、ハ ムスタータウリントランスポーターのアミノ酸に適宜変異を導人することによりノ、ムスタ 一タウリントランスポーターと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。ま た、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明のハムスタータウ リントランスポーターのアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が変異したァミノ 酸配列を有し、ハムスタータウリントランスポーターと機能的に同等なポリペプチドもま た本発明のポリペプチドに含まれる。
[0040] 本発明のハムスタータウリントランスポーターと機能的に同等なポリペプチドとしては 、具体的には、ハムスタータウリントランスポーターアミノ酸配列中の 1又は 2個以上、 好ましくは、 1個以上 30個以下、より好ましくは 1個以上 20個以下、さらに好ましくは 1 個以上 10個以下、最も好ましくは 1個以上 5個以下のアミノ酸が欠失したもの、ハムス タータウリントランスポーターアミノ酸配列に 1又は 2個以上、好ましくは、 1個以上 30 個以下、より好ましくは 1個以上 20個以下、さらに好ましくは 1個以上 10個以下、最も 好ましくは 1個以上 5個以下のアミノ酸が付カ卩したもの、ハムスタータウリントランスポ 一ターアミノ酸配列中の 1又は 2個以上、好ましくは、 1個以上 30個以下、より好ましく は 1個以上 20個以下、さらに好ましくは 1個以上 10個以下、最も好ましくは 1個以上 5 個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたもの等が挙げられる。
[0041] 変異するアミノ酸残基は、特に限定されな!ヽが、アミノ酸側鎖の性質が保存されて いる別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、 疎水性アミノ酸 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水性アミノ酸（R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、
H、 K、 S、 T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有 するアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及 びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ離 (R
、 K、 H)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることができる（括弧 内は 、ずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。
[0042] なお、あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び Z 又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがそ の生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al.， Proc. Nat
I. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、 Zoller, M. J. &Smith, M. Nucleic Acids Re search (1982) 10, 6487—6500 、 Wang, A. et al, Science 224, 1431—1433 、 Dalbadie -McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409—6413；)。
[0043] 本発明のハムスタータウリントランスポーターに 1又は複数個のアミノ酸残基が付カロ されたポリペプチドとしては、例えば、ノ、ムスタータウリントランスポーターを含む融合 ポリペプチドが挙げられる。融合ポリペプチドは、本発明のタンパク質ノヽムスタータウ リントランスポーターと他のポリペプチドとが融合したものであり、本発明に含まれる。 融合ポリペプチドを作製する方法は、本発明のハムスタータウリントランスポーターを コードする遺伝子と他のポリペプチドをコードする遺伝子をフレームが一致するように 連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよぐ当業者に公知の手 法を用いることができる。本発明のポリペプチドとの融合に付される他のポリペプチド としては、特に限定されない。
[0044] 本発明のポリペプチドとの融合に付される他のペプチドとしては、例えば、 FLAG (H opp, T. P. et al.， BioTechnology (1988) 6, 1204- 1210 )、 6個の His (ヒスチジン）残 基からなる 6 X His, 10 X His,インフルエンザ凝集素（HA)、ヒト c-mycの断片、 VSV- GPの断片、 pl8HIVの断片、 T7- tag、 HSV- tag、 E- tag、 SV40T抗原の断片、 lck tag 、 a - tubulinの断片、 B- tag、 Protein Cの断片、 GST (グルタチオン一 S—トランスフ エラーゼ）、 HA (インフルエンザ凝集素）、ィムノグロブリン定常領域、 β—ガラタトシダ ーゼ、 ΜΒΡ (マルトース結合ポリペプチド)等が挙げられる。
巿販されているこれらのポリペプチドをコードする遺伝子を本発明のポリペプチドを コードする遺伝子と融合させ、これにより調製された融合遺伝子を発現させることによ り、融合ポリペプチドを調製することができる。
[0045] また、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製する当業者によく知ら れた他の方法としては、ハイブリダィゼーシヨン技術（SambrookJ et al.， Molecular CI oning 2nd ed" 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)を利用する方法が 挙げられる。即ち、当業者であれば、本発明のハムスタータウリントランスポーターを コードする DNA配列もしくはその一部を基に、これと相同性の高い DNAを単離して、 該 DNAからハムスタータウリントランスポーターと機能的に同等なポリペプチドを単離 することも通常行いうることである。このように、本発明のハムスタータウリントランスポ 一ターをコードする DNAもしくはその一部からなる DNAとハイブリダィズする DNAがコ ードするポリペプチドであって、本発明のハムスタータウリントランスポーターと機能的 に同等なポリペプチドもまた本発明のポリペプチドに含まれる。
[0046] 本発明のハムスタータウリントランスポーターと機能的に同等なポリペプチドをコード する DNAを単離するためのハイブリダィゼーシヨンの条件としては、当業者であれば 適宜選択することができる。ハイブリダィゼーシヨンの条件は、例えば、低ストリンジェ ントな条件が挙げられる。低ストリンジヱントな条件とは、例えば 42°C、 2 X SSC、 0.1% SDSが挙げられ、好ましくは 50°C、 2 X SSC、 0.1%SDSである。またより好ましくは、高 ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば 65°C、 2 X S SC及び 0.1%SDSが挙げられる。これらの条件において、温度を下げる程に高い相同 性を有する DNAのみならず、低 、相同性しか有して 、な 、DNAまでも包括的に得る ことができる。逆に、温度を上げる程、高い相同性を有する DNAのみを得られることが 期待できる。但し、ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーに影響する要素として は温度以外にも塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適 宜選択することで同様のストリンジエンシーを実現することが可能である。
[0047] これらハイブリダィゼーシヨン技術により単離される DNAがコードするポリペプチドは 、通常、本発明のハムスタータウリントランスポーターとアミノ酸配列において高い相 同性を有する。本発明のポリペプチドには、本発明のハムスタータウリントランスポー ターと機能的に同等であり、本発明のハムスタータウリントランスポーターアミノ酸配列 と高い相同性を有するポリペプチドも含まれる。高い相同性とは、通常、 97%以上の 相同性、好ましくは 98%以上の相同性、さらに好ましくは 99%以上の相同性を指す。 ポリペプチドの相同性を決定するには、文献（Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730)に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
[0048] 本発明のポリペプチドは、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法 により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しか しながら、得られたポリペプチド力 本発明のハムスタータウリントランスポーターと同 等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明のポリペプチドを原 核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来のポリペプチドのアミノ酸配列の N末 端にメチォニン残基が付加される。また、真核細胞、例えば哺乳動物細胞で発現さ せた場合、 N末端のシグナル配列は除去される。本発明のポリペプチドはこのような ポリペプチドも包含する。
[0049] 本発明のポリペプチドは、当業者に公知の方法により、組み換えポリペプチドとして 、また天然のポリペプチドとして調製することが可能である。組み換えポリペプチドで あれば、本発明のポリペプチドをコードする DNAを、適当な発現ベクターに組み込み 、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、ィ オン交換、逆相、ゲノレ濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のポリペプチド に対する抗体をカラムに固定したァフィユティークロマトグラフィーにかけることにより、 または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可 能である。
[0050] また、本発明のポリペプチドをグルタチオン Sトランスフ ラーゼポリペプチドとの融 合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドと して宿主細胞 (例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させ た組み換えポリペプチドはダルタチオンカラムある 、はニッケルカラムを用いて精製 することができる。
融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち目的のポリぺプ チド以外の領域を、トロンビンまたはファクター Xaなどにより切断し、除去することも可 能である。
[0051] 天然のポリペプチドであれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明のポリべプチ ドを発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述するハムスタータウリントランスポ 一ターに結合する抗体が結合したァフィユティーカラムを作用させて精製することに より単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体 であってもよい。
さらに、本発明は、以下の (a)〜(e)のいずれかであるタウリントランスポーターをコー ドする DNA (但し、配列番号 3、 5及び 7の塩基配列を有する DNAを除く）を提供す る。
[0052] (a)配列番号 2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNA
(b)配列番号 2のアミノ酸配列において、 1又は複数 (例えば、数個）のアミノ酸が置換 、欠失、付加又は Z及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつタウリントランスポータ 一活性を有するポリペプチドをコードする DNA
(c)配列番号 2のアミノ酸配列と 97%以上の相同性を有し、かつタウリントランスポータ 一活性を有するポリペプチドをコードする DNA
(d)配列番号 1の塩基配列を有する DNA
(e)配列番号 1の塩基配列を有する DNAに相補的な DNAとストリンジ ントな条件 下でノ、イブリダィズし、かつタウリントランスポーター活性を有するポリペプチドをコー ドする DNA
本発明の DNAは、上述したような本発明のポリペプチドの in vivoや in vitroにおけ る生産に利用される他、ハムスタータウリントランスポーターを強発現する細胞の作製 に用いることができる。本発明の DNAは、本発明のポリペプチドをコードしうるもので あれば、いかなる形態でもよい。即ち、 mRNAから合成された cDNAである力、ゲノム D NAであるカゝ、化学合成 DNAであるかなどを問わない。また、本発明のポリペプチドを コードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有する DNAが含まれる
[0053] 本発明の DNAは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発 明のポリペプチドを発現して ヽる細胞より cDNAライブラリーを作製し、本発明の DNA の配列（例えば、配列番号 1)の一部をプローブにしてハイブリダィゼーシヨンを行うこ とにより調製できる。 cDNAライブラリ一は、例えば Sambrook, J. et al.， Molecular Clon ing、 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載の方法により調製してもよい し、市販の遺伝子ライブラリーを用いてもよい。また、本発明のポリペプチドを発現し ている細胞より RNAを調製し、本発明の DNAの配列（例えば、配列番号 1)に基づい てオリゴ DNAを合成し、これをプライマーとして用いて PCR反応を行い、タウリントラン スポーターをコードする cDNAを増幅させることにより調製することも可能である。
[0054] また、得られた cDNAの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域 を決定でき、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を得ることができる。また、得られた cDNAをプローブとしてゲノム DNAライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノム DNAを単離することができる。
具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のポリペプチドを発現する細胞、 組織などから、 mRNAを単離する。 mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グァ-ジン 超遠心法 (Chirgwin, J. M. et al, Biochemistry (1979) 18, 5294—5299)、 AGPC法 (C homczynski, P. and Sacchi, N.， Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159)等により全 RN Aを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia)等を使用して全 RNAから mRNAを精 製する。また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia)を用いることにより mRN Aを直接調製することちでさる。
[0055] 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV
Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業）等を用いて 行うこともできる。また、プライマー等を用いて、 5'- Ampli FINDER RACE Kit (Clontec h製)およびポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction； PCR)を用いた 5'- RA CE法 (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998—9002； Belyavsky, A. et al" Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919—2932)にしたがい、 cDNA の合成および増幅を行うことができる。
[0056] 得られた PCR産物から目的とする DNA断片を調製し、ベクター DNAと連結する。さら に、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望 の組換えベクターを調製する。 目的とする DNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェインターミネーシヨン法により確認することができる。
[0057] また、本発明の DNAにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮し て、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Grantham, R. et al, Nucel ic Acids Research (1981) 9, r43— 74 )。また、本発明の DNAは、巿販のキットや公知 の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、 合成オリゴヌクレオチドや適当な DNAフラグメントの挿入、リンカ一の付加、開始コドン (ATG)及び Z又は終止コドン (TAA、 TGA、又は TAG)の挿入等が挙げられる。
[0058] 本発明の DNAはまた、配列番号 1の塩基配列を有する DNAとストリンジ ントな条件 下でノ、イブリダィズする DNAであり、かつタウリントランスポーターと機能的に同等な ポリペプチドをコードする DNAを含む。
[0059] ストリンジェントな条件としては、当業者であれば適宜選択することができるが、例え ば低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、例えば 42°C、 2 X SSC、 0.1%SDSが挙げられ、好ましくは 50°C、 2 X SSC、 0.1%SDSである。またより 好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例 えば 65°C、 2 X SSC及び 0.1%SDSが挙げられる。これらの条件において、温度を上げ る程に高い相同性を有する DNAを得ることができる。上記のハイブリダィズする DNA は好ましくは天然由来の DNA、例えば cDNA又は染色体 DNAであってよい。
[0060] これらハイブリダィゼーシヨン技術により単離される DNAは、通常、本発明のハムス タータウリントランスポーターをコードする DNAと塩基配列において高い同一性を有 する。本発明の DNAには、本発明のハムスタータウリントランスポーターと機能的に同 等なポリペプチドをコードし、本発明のハムスタータウリントランスポーターをコードす る DNAと高い同一性を有する DNAも含まれる。高い同一性とは、通常、 96%以上の 相同性、好ましくは 98%以上の相同性、さらに好ましくは 99%以上の同一性を指す。 塩基配列の同一性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAST(Proc. Natl. A cad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズム に基づ 、て、 BLASTNや BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されて!、る (Altschu 1 et al. J. Mol. Biol.215:403- 410, 1990)。 BLASTに基づいて BLASTNによって塩 基配列を解析する場合には、パラメータ一は、例えば、 score = 100、 wordlength = 12 とする。これらの解析方法の具体的な手法は公知である (http：〃 www.ncbi.nlm.nih.go
[0061] また、本発明は、本発明の DNAが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクタ 一は、宿主細胞内において本発明の DNAを保持したり、本発明のポリペプチド (すな わち、ハムスタータウリントランスポーター及びそれと機能的に同等なポリペプチド)を 発現させるために有用である。また、宿主細胞にタウリントランスポーターを強発現さ せるために有用である。宿主細胞にタウリントランスポーターを強発現させることにより 、宿主細胞へのタウリンの取り込みが促進され、宿主細胞による所望のポリペプチド の生産を増カロさせることができる。
[0062] ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例え ば、 JM109、 DH5 a、 HB101、 XLlBlue)などで大量に増幅させ大量調製するために、 大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子 (例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフエ 二コール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有することが好ましい。ベクター の例としては、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescript、 pCR-Scriptな どが挙げられる。また、 cDNAのサブクローユング、切り出しを目的とした場合、上記べ クタ一の他に、例えば、 pGEM- T、 pDIRECT、 pT7などが挙げられる。本発明のポリべ プチドを生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが 有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、 ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主を JM109、 DH5 a 、 HB101、 XLl-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現でき るようなプロモーター、例えば、 lacZプロモーター（Wardら， Nature (1989) 341, 544-5 46 ;FASEB J. (1992) 6, 2422- 2427)、 araBプロモーター（Betterら， Science (1988) 24 0, 1041-1043 )、または T7プロモーターなどを持っていることが好ましい。このような ベクターとしては、上記ベクターの他に PGEX-5X-1 (Pharmacia社製）、「QIAexpress system] (Qiagen社製）、 pEGFP、または pET (この場合、宿主は T7 RNAポリメラーゼを 発現して!/、る BL21が好まし 、；)などが挙げられる。
[0063] また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれて!/、てもよ!/ヽ 。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生さ せる場合、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379 )を使用 すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩ィ匕カルシウム法、エレクト口 ポレーシヨン法を用いて行うことができる。
[0064] 大腸菌を宿主とする場合以外にも、例えば、本発明のポリペプチドを製造するため に用いられるベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、 pcDNA3 (Inv itrogen社製）や、 pEGF— BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、 pEF、 pCDM 8 昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac- to- BAC baculovairus expression s ystem」（GIBCO BRL社製）、 pBacPAK8)、植物由来の発現ベクター（例えば ρΜΗ1、 p MH2)、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw )、レトロ ウィルス由来の発現ベクター（例えば、 pZIpneo)、酵母由来の発現ベクター（例えば、 「Pichia Expression Kit」（ Invitrogen社製）、 pNVll、 SP-Q01)、枯草菌由来の発現 ベクター（例えば、 pPL608、 pKTH50)などが挙げられる。
[0065] CHO細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には 、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば SV40プロモーター（Mulliga nら， Nature (1979) 277, 108)、 MMLV-LTRプロモーター、 EF1 αプロモーター（Mizu shimaら， Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、 CMVプロモーターなどを持っているこ とが好ましぐ細胞への形質転換を選抜するための遺伝子 (例えば、薬剤 (ネオマイ シン、 G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい 。このような特性を有するベクターとしては、例えば、 pMAM、 pDR2、 pBK-RSV、 pBK- CMV、 pOPRSV、 pOP13などが挙げられる。
[0066] さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を 目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CHO細胞にそれを相補する DHFR遺 伝子を有するベクター（例えば、 pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート (MTX)により 増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、 S V40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起点 を持つベクター (pcDなど)で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、 また、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウィルス（BPV )等の由来の ものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現べ クタ一は選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ (APH )遺伝子、チミ ジンキナーゼ (TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラ ーゼ (Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等を含むことができる。
[0067] また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明の ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなぐ例えば、大腸菌や種々の 動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明の ポリペプチドの製造や発現のための産生系として使用することができる。また、本発 明の宿主細胞は、タウリントランスポーターを強発現することができ、タウリンの取り込 みが促進され、所望のポリペプチドの生産を増加させることができる。ポリペプチド製 造のための産生系は、 in vitroおよび in vivoの産生系がある。 in vitroの産生系として は、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
[0068] 真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用い ることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、 CH0 (J. Exp. Med. (1995) 108, 945)、 COS、 3T3、ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney )、 HeLa、 Vero、両 生類細胞、例えばアフリカッメガエル卵母細胞（Valle, et al.， Nature (1981) 291, 358 - 340 )、あるいは昆虫細胞、例えば、 S19、 S121、 Tn5が知られている。 CHO細胞とし ては、特に、 DHFR遺伝子を欠損した CHO細胞である dhfr- CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220 )や CHO K- 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 6 0, 1275)を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする 場合には特に CHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン 酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、カチォニックリボソーム DOTAP (ベーリンガー マンハイム社製）を用いた方法、エレクト口ポーレーシヨン法、リポフエクシヨンなどの方 法で行うことが可能である。
[0069] 植物細胞としては、例えば、ニコチアナ 'タパカム（Nicotiana tabacum )由来の細胞 がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞と しては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces )属、例えば、サッカロミセス' セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae )、糸状菌、例えば、ァスぺノレギノレス (Aspergill us )属、例えば、ァスペルギルス '二ガー（Aspergillus niger )が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大 腸菌（E. coli )、例えば、 JM109、 DH5 a、 HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が 知られている。
[0070] これらの細胞を目的とする遺伝子により形質転換し、形質転換された細胞を in vitro で培養することにより、目的とする遺伝子がコードするポリペプチドが得られる。培養 は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、 DMEM、 MEM、 RPMI1640, IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FC S)等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時の pHは、 約 6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、必 要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、 in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産 生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とする遺 伝子を導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明 における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
[0071] 動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物として は、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993 )。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェ- ック動物を用いることができる。
[0072] 例えば、目的とする遺伝子を、ャギ j8カゼインのような乳汁中に固有に産生される ポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合 遺伝子を含む遺伝子断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ移植する。胚を 受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する乳汁から、 目的のポリペプチドを得ることができる。トランスジ ニックャギカも産生されるポリべ プチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使 用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702；)。
[0073] また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、 目的 のポリペプチドをコードする遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させる ことにより、このカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる（Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594；)。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場 合、 目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を植物発現用ベクター、例えば pMO N 530に挿入し、このベクターをァグロバタテリゥム'ッメファシエンス（Agrobacterium t umefaciens )のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチ アナ 'タパカム（Nicotiana tabacum )に感染させ、本タバコの葉より所望のポリべプチ ドを得ることができる（Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131—138)。
[0074] これにより得られたポリペプチドは、宿主細胞内または細胞外 (培地など)から単離 し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの 分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用 すればよぐ何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルタ 一、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミド ゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば ポリペプチドを分離、精製することができる。
[0075] クロマトグラフィーとしては、例えばァフィユティークロマトグラフィー、イオン交換クロ マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着ク ロマトグフスィ ~~等; 0 けられる (Strategies for Protein Purification andし haractenzat ion: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例え ば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、こ れらの精製方法を用い、高度に精製されたポリペプチドも包含する。
なお、ポリペプチドを精製前又は精製後に適当なポリペプチド修飾酵素を作用させ ることにより、任意に修飾をカ卩えたり部分的にペプチドを除去することもできる。ポリべ プチド修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、リシルエンドべプチダ ーゼ、プロテインキナーゼ、ダルコシダーゼなどが用いられる。
[0076] また、本発明は、本発明のポリペプチドと結合する抗体を提供する。本発明の抗体 の形態には、特に制限はなぐポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含ま れる。また、ゥサギなどの免疫動物に本発明のポリペプチドを免疫して得た抗血清、 すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。
感作抗原として使用されるポリペプチドは、完全なポリペプチドであってもよいし、ま た、ポリペプチドの部分ペプチドであってもよい。ポリペプチドの部分ペプチドとして は、例えば、ポリペプチドのアミノ基 (N)末端断片やカルボキシ (C)末端断片が挙げ られる。本明細書で述べる「抗体」とはポリペプチドの全長又は断片に反応する抗体 を意味する。
[0077] 本発明のポリペプチド又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系 に挿入し、該ベクターにより本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該宿主細 胞内外から目的のポリペプチド又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗 原として用いればよい。また、本発明のポリペプチドを発現する細胞又はその溶解物 あるいは化学的に合成した本発明のポリペプチドを感作抗原として使用してもよい。 感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融 合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましぐ一般的には、げっ 歯目、ゥサギ目、霊長目の動物が使用される。
[0078] げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ゥサ ギ目の動物としては、例えば、ゥサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、 サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、力二クイ ザル、ァカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
[0079] 感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法 としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗 原を PBS (Phosphate- Buffered Saline)や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したも のに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量 混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバン トに適量混合した感作抗原を、 4〜21日毎に数回投与することが好ましい。また、感 作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所 望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
[0080] ここで、本発明のポリペプチドに対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所 望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取 り出す。この血液力も公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては 、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清力 ポリク ローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明 のポリペプチドをカップリングさせたァフィユティーカラムを用いて、本発明のポリぺプ チドのみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテイン Aあるいはプロテイン G カラムを利用して精製することにより、免疫グロブリン Gあるいは Mを調製することがで きる。
[0081] モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の 抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞 融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾 細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺 乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を 獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミ ルスティンらの方法 (Galfre, G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 等に準じて行うことができる。
[0082] 細胞融合により得られたハイプリドーマは、通常の選択培養液、例えば、 HAT培養 液 (ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより 選択される。当該 HAT培養液での培養は、 目的とするハイプリドーマ以外の細胞 (非 融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日'数週間継続して行う。次いで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリー- ングおよびクロー-ングを行う。
[0083] 次いで、得られたハイプリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収 し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン G力 ラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のポリペプチドをカップリングしたァ フィ-ティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗 体は、本発明のポリペプチドの精製、検出に用いられる。
[0084] このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生さ せた組換え型抗体として得ることができる（例えば、 Borrebaeck, C. A. K. and Larrick , J. W.， THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Ki ngdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照)。組換え型抗体は、それを コードする遺伝子をハイプリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞 力 クロー-ングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。 本発明は、この組換え型抗体を包含する。
[0085] さらに、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドに結合する限り、その抗体断片や 抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、 Fab、 F(ab')2、 Fv又は H鎖と L 鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv(scFv) (Huston, J. S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883)が挙げられる。具体的には、 抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させる力、又は、 これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適 当な宿主細胞で発現させる（例えば、 Co, M. S. et al" J. Immunol. (1994) 152, 2968 -2976； Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476—496； Plu ckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515；し amoyi, E., M ethods Enzymol. (1986) 121, 652-663； Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (198 6) 121, 663-669； Bird, R. E. and Walker, B. W" Trends Biotechnol. (1991) 9, 132- 137参照)。
[0086] 抗体修飾物として、ポリエチレングリコール (PEG)等の各種分子と結合した抗体を 使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このよ うな抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得るこ とができる。これらの方法はこの分野にぉ 、て既に確立されて 、る。
前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用さ れる抗体の分離、精製は通常のポリペプチドで使用されている分離、精製方法を使 用すればよい。例えば、ァフィユティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム 、フィルター、限外濾過、塩析、透析、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電 気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる (Antibod ies： A Laboratory Manual. ti,d Harlow and David Lane, Cola Spring Harbor Laborat ory, 1988)力 これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は 吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法 (Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)等により行うことができる。
[0087] ァフィユティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテイン Aカラム、プロテ イン Gカラムが挙げられる。例えば、プロテイン Aカラムを用いたカラムとして、 Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。
ァフィユティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン 交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー 、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる (Strategies for Protein Purification and Char acterization： A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Sprin g Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーは HPLC、 FPLC等の液 相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
[0088] また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測 定、酵素結合免役吸着検定法 (Enzyme- linked immunosorbent assay； tuJ A)、 EIA ( 酵素免疫測定法)、 RIA (放射免疫測定法)あるいは蛍光抗体法を用いることができる 。 ELISAを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明のポリペプチド を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精 製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識 する二次抗体を添カ卩し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、 ρ-ニトロ フエニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価 することができる。ポリペプチドとしてポリペプチドの断片、例えばその C末端カゝらなる 断片あるいは N末端カゝらなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には 、 BIAcore(Pharmacia製）を使用することができる。
実施例
[0089] 以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発 明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
[0090] 〔実施例 l〕CHO細胞由来ハムスタータウリントランスポーター遺伝子クローニング
CHO DXB11細胞に抗 IL-6レセプター抗体遺伝子を導入した抗 IL-6レセプター抗 体産生細胞（特開平 8-99902号公報）から total RNA抽出をおこなったのち、ポリ Aに 依存する cDNAを合成した。 Sail, XhoI、 EcoRIの三種類の制限酵素で断片化した cDNAを铸型することで、 Hamsterタウリントランスポーター（TauT)遺伝子を PCRに より得た。 PCRプライマーは既知である Rat/Mouse TauT間で遺伝子配列が保存 されている 5' ,3'を含むものを設計して用いた。クローユングされた遺伝子は塩基配 列を決定し、既知の生物種の TauTとの相同性から Hamster TauTをコードしている ことを確認した（図 1)。 Hamster TauTアミノ酸配列は Mouse(96% Identity), Rat(96% Id entity), Human(93% Identity) TauTに対して高い相同性を有しており、 12の膜貫通 領域をもつトランスポーターであることが予想された（図 2)。
[0091] 〔実施例 2〕ハムスタータウリントランスポーター導入による生細胞密度増力！]、乳酸産 生量抑制、および抗体産生量増加
実施例 1のクローユングにより取得した Hamster TauT (以下 TauT)遺伝子に Kozak 配列をカ卩え、 CMVプロモーター発現プラスミド pHyg/TauT (図 3)を構築した。 pHyg/ TauTあるいは TauT遺伝子を除 、たコントロールプラスミド pHygを、親株である抗グリ ビカン- 3抗体産生 CHO細胞（国際公開第 WO 2006/006693号パンフレットを参照） にエレクト口ポレーシヨン法で導入した。発現プラスミド導入細胞を Hygromycin(400 μ g/ml)存在下で選抜したのち、安定して増殖する細胞株すベてを拡大した (pHyg/Ta uT : 8株， pHyg: 7株）。 TauT mRNAを調製ののち TaqMan法により、親株に対して優 位な発現を確認できる 7株を pHyg/TauT導入細胞とした。導入細胞（7株）の mRNA平 均発現量はコントロール（7株）の約 40倍であった。計 14株の細胞は 2xl05cells/mL の初発密度で 50mlシェーカーフラスコ〖こよるバッチ (batch)培養および流加（Fed-ba tch)培養をおこない、培養後期 7日目における生細胞密度、乳酸産生量、抗グリピカ ン -3抗体産生量を比較した。ノ ツチ培養にぉ 、ては細胞増殖にともな 、培養液中に 乳酸などの生育阻害物質が蓄積し、増殖が抑制されるが、 pHyg/TauT導入細胞の 生細胞密度（図 4)および乳酸産生量（図 5)は pHyg導入細胞に対して優位であった（ t検定 P< 0.05)。抗グリビカン- 3抗体産生量に関しては、 pHyg/TauT導入細胞の 7 株中 4株が pHyg導入細胞の最高値以上であった（図 6)。さらに pHyg/TauT導入細胞 の抗グリビカン- 3抗体産生量の優位性 (t検定 P< 0.01,図 7)が流加培養により明ら カゝになったため、上記 4株中で最も増殖能が高カゝつた pHyg/TauT導入細胞 (T10)と 親株の 1Lジャーによる流加培養をおこなったところ、 T10は培養 32日目においても 生存率が 80%以上に維持されており（図 8)、乳酸産生が抑制されていた。その結果 、抗グリビカン- 3抗体産生量は、培養 35日目において 2. 9g/L (図 9)を達成した。 Ta uT導入 T10細胞が細胞膜上に TauT分子を発現していることはフローサイトメトリー分 析（図 10)で確認した。以上の結果は、 Hamster TauTを人為的に発現させることによ つて抗体産生細胞のポテンシャルが上がり、抗体高産生株が得られることを示唆して いる。
〔実施例 3〕ハムスタータウリントランスポーター導入株のアンモニア産生量抑制、タウ リンの取り込み、グルタミン消費量増加、およびタウリン否依存的な抗体産生量 親株及び pHyg/TauT導入株を、初発 2xl05cells/mLで 1Lジャー流加培養し、適時 、培養槽カゝら 450xl05細胞を含む培養液を採取した。遠心により、培養上清を分取 したのち、細胞ペレットにプロテアーゼ阻害剤（Complete Mini, Roche Diagnostics社 、 Protease inhibitor cocktail tablets)を含む lmLの冷却滅菌水をカ卩え、氷上にて、超 音波細胞破砕機（MISONIX ASTRASON MODEL XL2020を用いて 5秒パルス操作 後、 5秒休止を 1セットとし、計 12セット、処理を繰り返し、細胞を完全に破砕した。処 理後の溶液は全量を遠心式ろ過ユニットにアプライすることで、分子量 5000以下のろ 液を調製して、細胞内アミノ酸測定用の試料とした。各試料は、さらに、ニンヒドリン試 液- L8500セット (和光純薬工業)および、日立製全自動アミノ酸分析装置 (L-8500) の改良型を用いて、 570nmの吸光度を検出、比較し、試料中の各種アミノ酸濃度を求 めた。培養液中の各種アミノ酸およびアンモニア等の濃度は直接測定した値である ので、 Mオーダーの濃度比較をおこない、一方、細胞内濃度は、細胞ペレットに冷 却滅菌水 lmLを加えたのち、超音波細胞破砕をおこなっていることから、各種アミノ 酸およびアンモニア等の測定値を細胞あたりの値に換算し、その換算値の比較をお こなった。 図 11のアンモニア濃度比は、 1Lジャー流加培養開始時の 450xl05個当た りの親株のアンモニア検出値を 1と規定し、培養開始時、 6日目、 12日目、 18日目の 検出値と比較し、比を求めた。また、図 12、図 13のタウリンとグルタミン酸も、上記アミ ノ酸分析により測定した。
その結果、 pHyg/TauT導入株は、培養後期において、細胞内アンモニアが低濃度に 維持されており、抗体高産生に寄与して 、ると考えられた（図 11)。
[0093] 細胞内のタウリン濃度比は、上記、アンモニアとほぼ同様の方法で求めた（図 12)。
相違点は、 50mLシェーカーバッチ培養 4日目の 200xl05個当たりの親株のアンモ- ァ検出値を 1と規定していることである。
[0094] その結果、 pHyg/TauT導入株は、タウリン添カ卩量に依存してタウリンを取り込んでお り、その取り込み量は親株と同等であった。しかし、図 13に示すように、 pHyg/TauT 導入株のグルタミン消費量は、親株にたいして顕著であり、初発タウリン濃度に依存 しな力つた。グルタミンがハイプリドーマの細胞増殖や生存率、および抗体産生能を 改善し、抗体産生量を上げる働きをすることは報告されている（Enzyme and Microbial Technology 17:47-55, 1995)。よって、 pHyg/TauT導入株の抗体産生増強効果は、 タウリントランスポーターを介した、タウリン以外の他のアミノ酸 (グルタミンなど）の取り 込みによる可能性も考えられる。なお、グルタミン濃度は、図 12における培養 4日目 の培養液をアミノ酸分析した測定値を、 lxlO5細胞あたりに換算した値である。
[0095] 抗グリビカン- 3抗体産生量は、 50mLシェーカー流加培養開始時の初発タウリン濃 度（0〜500mM(62.575g/L))に依存しな力つた（図 14)。また、親株についても初発 タウリン濃度による抗体産生量の影響に優位な差は認められなかった。
以上の結果は、培養開始時の培地中にタウリンを含んでいなくとも TauT強発現株が 高い抗体産生能を有することを示唆しており、タウリン以外のアミノ酸等の取り込みに っ ヽても促進して 、る可能性も考えられる。
[0096] 本発明は、あらゆる抗体産生細胞へ応用可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
[0097] 本発明は、ポリペプチドの生産に利用することができる。
配列表フリーテキスト
[0098] <配列番号 1 >
配列番号 1は、ハムスタータウリントランスポーターをコードする遺伝子の塩基配列を 示す。
<配列番号 2>
配列番号 2は、ハムスタータウリントランスポーターのアミノ酸配列を示す。
<配列番号 3 >
配列番号 3は、ラットタウリントランスポーターをコードする遺伝子の塩基配列を示す。 <配列番号 4>
配列番号 4は、ラットタウリントランスポーターのアミノ酸配列を示す。
<配列番号 5 >
配列番号 5は、マウスタウリントランスポーターをコードする遺伝子の塩基配列を示す <配列番号 6 >
配列番号 6は、マウスタウリントランスポーターのアミノ酸配列を示す。
<配列番号 7>
配列番号 7は、ヒトタウリントランスポーターをコードする遺伝子の塩基配列を示す。 <配列番号 8 >
配列番号 8は、ヒトタウリントランスポーターのアミノ酸配列を示す。

Claims

請求の範囲
[1] タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードする DNAを導 入した細胞を培養し、所望のポリペプチドを産生させることを含む、ポリペプチドの製 造方法。
[2] タウリントランスポーターを強発現する細胞力 タウリントランスポーターをコードする D
NAを導入した細胞である請求項 1記載の製造方法。
[3] 細胞がチャイニーズノ、ムスター卵巣細胞である請求項 2記載の製造方法。
[4] 所望のポリペプチドが抗体である請求項 1〜3の 、ずれかに記載の製造方法。
[5] タウリントランスポーターをコードする DNAが以下の (a)〜(e)のいずれかである請求項
2〜4の 、ずれかに記載の製造方法。
(a)配列番号 2、 4、 6又は 8のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNA
(b)配列番号 2、 4、 6又は 8のアミノ酸配列において、 1又は複数のアミノ酸が置換、 欠失、付加又は Z及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつタウリントランスポーター 活性を有するポリペプチドをコードする DNA
(c)配列番号 2、 4、 6又は 8のアミノ酸配列と 70%以上の相同性を有し、かつタウリント ランスポーター活性を有するポリペプチドをコードする DNA
(d)配列番号 1、 3、 5又は 7の塩基配列を有する DNA
(e)配列番号 1、 3、 5又は 7の塩基配列を有する DNAに相補的な DNAとストリンジヱ ントな条件下でノヽイブリダィズし、かつタウリントランスポーター活性を有するポリぺプ チドをコードする DNA
[6] タウリン濃度が 0g/L〜100 g/Lである培地で培養することを含む請求項 1〜5のいず れかに記載の製造方法。
[7] 請求項 1〜6のいずれかに記載の方法で製造されたポリペプチドを含有する医薬品 を製造する方法。
[8] 以下の (a)〜(e)のいずれかであるタウリントランスポーターをコードする DNA (但し、配 列番号 3、 5及び 7の塩基配列を有する DNAを除く）。
(a)配列番号 2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNA
(b)配列番号 2のアミノ酸配列において、 1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又 は z及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつタウリントランスポーター活性を有する ポリペプチドをコードする DNA
(c)配列番号 2のアミノ酸配列と 97%以上の相同性を有し、かつタウリントランスポータ 一活性を有するポリペプチドをコードする DNA
(d)配列番号 1の塩基配列を有する DNA
(e)配列番号 1の塩基配列を有する DNAに相補的な DNAとストリンジ ントな条件 下でノ、イブリダィズし、かつタウリントランスポーター活性を有するポリペプチドをコー ドする DNA
[9] 以下の (A)〜(E)の!、ずれかであるポリペプチド（但し、配列番号 4、 6及び 8のアミノ酸 配列を有するポリペプチドを除く）。
(A)配列番号 2のアミノ酸配列を有するポリペプチド
(B)配列番号 2のアミノ酸配列において、 1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又 は Z及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつタウリントランスポーター活性を有する ポリペプチド
(C)配列番号 2のアミノ酸配列と 97%以上の相同性を有し、かつタウリントランスポー ター活性を有するポリペプチド
(D)配列番号 1の塩基配列を有する DNAによりコードされるポリペプチド
(E)配列番号 1の塩基配列を有する DNAに相補的な DNAとストリンジ ントな条件 下でノ、イブリダィズし、かつタウリントランスポーター活性を有するポリペプチドをコー ドする DNAによりコードされるポリペプチド
[10] 請求項 8記載の DNAを含む組換えベクター。
[11] 請求項 8記載の DNAが導入されて ヽる細胞。
[12] タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードする DNAを導 入した細胞。
[13] タウリントランスポーターをコードする DNAが導入されている細胞。
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