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WO2007114296A1 - スクリーニング方法 - Google Patents

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Publication number
WO2007114296A1
WO2007114296A1 PCT/JP2007/056962 JP2007056962W WO2007114296A1 WO 2007114296 A1 WO2007114296 A1 WO 2007114296A1 JP 2007056962 W JP2007056962 W JP 2007056962W WO 2007114296 A1 WO2007114296 A1 WO 2007114296A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tlr4
cells
amino acid
inhibitor
disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2007/056962
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Osamu Hazeki
Kaoru Hazeki
Masayuki Ii
Naoko Matsunaga
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hiroshima University NUC
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Hiroshima University NUC
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hiroshima University NUC, Takeda Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Hiroshima University NUC
Priority to US12/225,721 priority Critical patent/US8329420B2/en
Priority to EP07740400.2A priority patent/EP1997902B1/en
Priority to JP2008508636A priority patent/JP4962982B2/ja
Publication of WO2007114296A1 publication Critical patent/WO2007114296A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a therapeutic agent for heart disease, autoimmune disease, inflammatory disease, central nervous system disease, infectious disease, sepsis, severe sepsis or sebino shock.
  • Patent Document 1 describes the formula (i):
  • R represents an aliphatic hydrocarbon group which may have a substituent, an aromatic hydrocarbon group which may have a substituent, or a heterocycle which may have a substituent.
  • R lb represents an aliphatic hydrocarbon group which may have a hydrogen atom or a substituent
  • R le is the same as or different from R lb and has a hydrogen atom or a substituent.
  • a good aliphatic hydrocarbon group
  • R ° represents or is a hydrogen atom or an aliphatic hydrocarbon group !, R 1 and R ° are joined together to form a bond,
  • Ring A (1) may have a substituent! / ⁇ may be an aliphatic hydrocarbon group, and (2) may have a substituent! / ⁇
  • a good aromatic hydrocarbon group represented by the formula (3): —OR 11 (wherein R 11 has a hydrogen atom or a substituent! Or may represent an aliphatic hydrocarbon group) A group and (4) a halogen nuclear energy, selected from 1 to 4 substituted cycloalkenes, Ar having a substituent! /, An aromatic hydrocarbon group that may be
  • n an integer of 1 to 4.
  • R a may have an aliphatic hydrocarbon group which may have a substituent, an aromatic hydrocarbon group which may have a substituent, or a substituent.
  • R 1 ⁇ 2 and R 5a are the same or different and each represents a hydrogen atom or an aliphatic hydrocarbon group which may have a substituent.
  • R Qa represents a hydrogen atom or an aliphatic hydrocarbon group, or R a and R Qa together form a bond,
  • Ar a has a substituent and may represent an aromatic hydrocarbon group
  • n an integer of 1 to 4.
  • Patent Document 2 includes a formula:
  • R 1 may have an aliphatic hydrocarbon group which may have a substituent, an aromatic hydrocarbon group which may have a substituent, or a substituent.
  • R lb and R le are the same or different and each represents a hydrogen atom or an aliphatic hydrocarbon group which may have a substituent).
  • X represents a methylene group, NH, a sulfur atom or an oxygen atom
  • Y may have a substituent, may be a methylene group or a substituent, and may represent NH
  • ring A may be (1) an aliphatic hydrocarbon which may have a substituent Group, (2) an aromatic hydrocarbon group which may have a substituent, (3) formula: OR 2 (wherein R 2 has a hydrogen atom or a substituent! And a group represented by (4) and (4) having 1 to 4 substituents selected from the group consisting of halogen atoms, which may be a 5- or 8-membered ring.
  • Ar may have a substituent, and represents an aromatic hydrocarbon group
  • n an integer from 0 to 2
  • n an integer of 1 to 3
  • Y represents a methylene group which may have a substituent.
  • a salt thereof or a prodrug thereof has an inhibitory effect on the production of nitric oxide (NO) and suppresses the production of inflammatory sites such as TNF- ⁇ , IL1, and IL6. It is described that it is useful as an agent for the prevention and treatment of diseases such as diseases, autoimmune diseases, inflammatory diseases, central nervous system diseases, infectious diseases, sepsis, and sebino shock.
  • Patent Document 3 describes that the above compound is useful as a TLR signal inhibitor and a prophylactic / therapeutic agent for severe sepsis.
  • Patent Document 1 International Publication No. 99 ⁇ 46242 Pamphlet
  • Patent Document 2 International Application Publication No. 01Z10826 Pamphlet
  • Patent Document 3 International Application Publication No. 03 ⁇ 84527 Pamphlet
  • the present invention provides a method useful for screening a therapeutic agent for the prevention or treatment of heart disease, autoimmune disease, inflammatory disease, central nervous system disease, infectious disease, sepsis, severe sepsis or sebino shock.
  • the purpose is to provide. It is another object of the present invention to provide a kit useful for screening for a preventive / therapeutic agent for the above-mentioned diseases.
  • the present invention provides:
  • Cardiac disease, autoimmune disease, inflammatory disease, central nervous system disease, infection characterized by selecting a substance that binds to the intracellular region of TLR4 and inhibits signal transduction of the molecular force Screening methods for prevention and treatment of one or more diseases selected from the group consisting of sexually transmitted diseases, sepsis, severe sepsis, and sebino shock
  • a cell that expresses a protein in which a residue or its nearby amino acid is mutated to another amino acid or an intracellular region thereof, and contains a gene under the control of a promoter containing an NF- ⁇ or IRF3 binding sequence (Sample 2) Are prepared separately.
  • the screening method of the present invention comprises a heart disease, a self-immune disease, an inflammatory disease by assaying binding of a test compound to the intracellular region of TLR4 and inhibition of signal transduction of the receptor force by the binding.
  • a heart disease a self-immune disease
  • an inflammatory disease by assaying binding of a test compound to the intracellular region of TLR4 and inhibition of signal transduction of the receptor force by the binding.
  • it has the effect of being able to efficiently select a substance having a prophylactic / therapeutic activity for central nervous system diseases, infectious diseases, sepsis, severe sepsis or sebaceous shock.
  • FIG. 1 CBB-stained image of the reaction product of TIRAP, TLR2 TIR domain, TLR4 TIR domain and GST fusion protein and 3 H-labeled compound A
  • FIG. 6 is a diagram showing an autoradiograph (B). Lane 1: GST; Lane 2: GST—TIRAP fusion protein; Lane 3: GST—TLR2 intracellular TIR domain fusion protein; Lane 4: GST—TLR4 intracellular TIR domain fusion protein
  • FIG. 2 shows the binding ability of 3 H-labeled compound A to wild-type TLR4 and various mutant TLR4.
  • the upper panel shows an immunoblot image showing the expression level of TLR protein, and the lower panel shows an autoradiograph showing the binding of Compound A.
  • ⁇ Ding Wild type! ⁇ ! ⁇ ;! ⁇ Eight :! ⁇ R4 G666A ( Indicates that the 666th C is substituted with A.
  • 2CA TLR C 706A
  • 3CA TLR4 C747A
  • 4CA TLR C831A
  • PH TLR P714H
  • 1KR TLR K653R
  • 2KR T LR K666R
  • 3KR TLR K 4KR: TLR K729R
  • 5KR TLR K732R
  • 6KR TLR K 7K R: TLR K7 6R; 8KR:? TLR K813R
  • 9KR TLR K819R
  • FIG. 3 Cells expressing wild-type TLR4 and various mutant TLR4s were identified as Compound A ( Figure 3-1), Compound B ( Figure 3-2), Compound C ( Figure 3-3), Compound D ( Figure 3 is a graph showing the expression level of a luciferase gene under the control of NF- ⁇ B when cultured with LPS stimulation in the presence and absence of 3-4).
  • FIG. 3 is a graph showing the expression level of a luciferase gene under the control of NF- ⁇ B when cultured with LPS stimulation in the presence and absence of 3-4).
  • WT Wild type TLR4; 1CA: TLR4 C666A ; 2CA: TL R C706A ; 3CA: TLR4 C747A ; 4CA: TLR C831A ; PH: TLR P714H ; 1KR: TLR K653R ; 2KR: TLR K666R ; 3KR: TLR K694R ; 5729 : 5LR: TLR K732R ; 6KR: TLR K773R ; 7KR : TLR K776R ; 8KR: TLR K813R ; 9KR: TLR K819R ; EV: vector only
  • the screening method of the present invention binds to the intracellular region of TLR4, and signals TLR4. It is characterized by selecting a substance that inhibits transmission.
  • TLR4 is a single transmembrane receptor, and has an extracellular region, a transmembrane region, and an intracellular region from the N-terminal side.
  • the “TLR4 intracellular region” means, for example, a region consisting of the amino acid sequence represented by amino acid numbers 652 to 839 in the case of human TLR4 represented by SEQ ID NO: 2.
  • TLR4 signaling means that as long as it results in induction of NF- ⁇ -dependent inflammatory cytokines and IRF3-dependent interferon and interferon-inducible gene expression, TLR4 signal It is possible to inhibit the process of transmission.
  • the signal transduction inhibitor from TLR4 selected by the screening method of the present invention may bind to any site in the intracellular region of TLR4 or to one site in the intracellular region. , It may bind to a plurality of sites.
  • the signal inhibitor is one or more cysteine residues in the intracellular region of TLR4 (for example, in the case of human TLR4 represented by SEQ ID NO: 2, positions 664 and 706 of the amino acid sequence). , 747th and 831st cysteine residues), more preferably a TolHL-1 receptor (TIR) domain that activates a signal pathway in the cytoplasm (in the case of human TLR4, represented by SEQ ID NO: 2).
  • TIR TolHL-1 receptor
  • the screening method of the present invention which selects a substance that binds to the intracellular region of TLR4 and inhibits the signal transduction of the molecular force, uses a polypeptide containing all or part of the intracellular region of TLR4. It is characterized by that.
  • the polypeptide used in the screening method of the present invention should contain at least the binding site targeted by the target signal transduction inhibitor, and the binding site can be arbitrarily set within the intracellular region of TL R4.
  • the force that can be used is preferably the cysteine residue described above. Therefore, more preferably, the polypeptide used in the screening method of the present invention comprises at least a portion of the amino acid sequence comprising the 706th and Z or 747th cysteine residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Amino acid sequence A polypeptide comprising.
  • the length of the polypeptide is not particularly limited as long as it contains sufficient adjacent amino acid sequences that can bind to the target binding site of the target signaling inhibitor, for example, 10 amino acids or more, preferably 50 amino acids.
  • polypeptide length is not particularly limited, and examples thereof include the full length of TLR4 (in the case of human TLR4, 839 amino acids (including signal peptide)).
  • the polypeptide used in the present invention contains at least the region necessary for TLR4 to exert the signal transduction action!
  • a polypeptide containing the above TIR domain, a polypeptide containing the entire intracellular region, a polypeptide containing a transmembrane region, or a full-length TLR4 is desirable.
  • the ability of the test compound to bind to the desired target site is determined by the ability to delete the amino acid at the target site by preparing a polypeptide substituted with another amino acid, It can be assayed by examining the presence or absence of the test compound's ability to bind to.
  • the polypeptide may be provided as a fusion polypeptide having a tag at the N-terminus or C-terminus.
  • tags include GST tags, His tags, MBP tags, Flag tags, and the like.
  • Polypeptides containing such tag sequences can be pulled down using dalutathione, metal chelates, maltose, anti-Flag antibody carriers, respectively, and test compounds such as RI (eg 3 H, 35 S, 32 P, etc.) In this case, the binding of the test compound to the polypeptide can be easily detected by measuring the label on the carrier.
  • the TLR4 protein in the present invention is a protein comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • TLR4 protein is found in warm-blooded animals (eg, humans, mice, rats, guinea pigs, nomstar, (Eg, spleen cells, nerve cells, glial cells, spleen j8 cells, bone marrow cells, mesangium) Cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (e.g., macrophages, T cells, B cells, natural cells) Killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, rod cells), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells , Liver cells or stromal cells, or progenitor cells, stem cells or cancer cells of these cells, or any tissue in which these cells exist [eg, brain, brain
  • the “substantially identical amino acid sequence” with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90 with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. % Or more, particularly preferably about 95% or more, and most preferably about 98% or more homology.
  • “homology” refers to an optimal alignment when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably, the algorithm is arranged for optimal alignment). The ratio of the same amino acid residue and similar amino acid residues to all overlapping amino acid residues in the case of introduction of a gap in one or both of them may be considered.
  • Similar amino acids means amino acids that are similar in physical properties, such as aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Ala, Leu, Ile, Val), polar amino acids (Gln Asn), basic amino acids (Lys, Arg, His), acidic amino acids (Glu, Asp), amino acids with hydroxyl groups (Ser, Thr), amino acids with small side chains (Gly, Ala, Ser, Thr, Met) ) And other amino acids classified into the same group.
  • aromatic amino acids Phe, Trp, Tyr
  • aliphatic amino acids Al, Leu, Ile, Val
  • polar amino acids Ga, Leu, Ile, Val
  • polar amino acids Ga, Leu, Ile, Val
  • polar amino acids Gln Asn
  • basic amino acids Lys, Arg, His
  • acidic amino acids Glu, Asp
  • amino acids with hydroxyl groups Ser, Thr
  • amino acids with small side chains Gly, Ala, Ser, Thr, Met
  • the homology of amino acid sequences in the present specification is the homology calculation algorithm NCBI BLAST.
  • the “substantially identical amino acid sequence” means about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Particularly preferred is an amino acid sequence having an identity of about 95% or more, most preferably about 98% or more.
  • the "protein containing substantially the same amino acid sequence" as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And a protein having substantially the same quality of activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • “Substantially the same quality of activity” refers to (1) signal transduction activity (ie, NF- ⁇ B and Z or IRF3 activation by LPS stimulation, inflammatory site force in and Z or Activity to induce expression of ferron and interferon-inducible genes), and (2) binding activity to compounds that bind to the intracellular region of TLR4 and inhibit the above signal transduction. Substantially homogeneous indicates that their activities are qualitatively similar.
  • the signal transduction activity and the binding activity with a signal transduction inhibitor are equivalent, but quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different (for example, activity Is about 0.01 to about 100 times, preferably about 0.1 to about 10 times, more preferably about 0.5 to about 2 times).
  • the signal transduction activity of TLR4 can be determined by known methods such as inflammatory site force-in (eg, TNFa, IL-1, IL-6, IFN- ⁇ , etc.) and interferon (IFN- ⁇ , IFN) in TLR4 expressing cells.
  • inflammatory site force-in eg, TNFa, IL-1, IL-6, IFN- ⁇ , etc.
  • IFN- ⁇ , IFN interferon
  • — ⁇ ) or interferon-inducible genes eg, IP-10, GA RG16, IRG-1 etc.
  • transcription factors eg, NF- ⁇ B, IRF3, ⁇ —1, C / EBP)
  • the binding activity with a signal transduction inhibitor can be measured using, for example, the above pull-down assay, surface plasmon resonance (SPR), fluorescence energy transfer, and the like.
  • SPR surface plasmon resonance
  • a mutant polypeptide in which the amino acid at the desired target site is deleted or substituted with another amino acid is prepared separately, and each of the wild-type polypeptide and the mutant polypeptide is prepared in the presence of the test compound.
  • the TLR4 used in the present invention includes, for example, (1) one or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably Preferably, about 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acid sequences deleted.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence to which an amino acid has been added, (3) represented by SEQ ID NO: 2, about 1 to 30, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to: about L0, more preferably 1 to 5 One or more amino acids (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably 1 to 5) are inserted into the amino acid sequence Amino acid sequence, (4) represented by SEQ ID NO: 2 1 or 2 or more (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to about LO, more preferably about 1 to 5 amino acids) A protein containing an amino acid sequence substituted with an amino acid or (5) an amino acid sequence obtained by combining them is also included.
  • the deletion site is a site other than the binding site of the desired signal transduction inhibitor, preferably a site other than the cysteine residue in the intracellular region and its vicinity. It is.
  • a site other than the binding site of the desired signal transduction inhibitor preferably other than the cysteine residue in the intracellular region and its vicinity
  • the force of the site or the site does not have a qualitative effect on the activity of the site (ie, the activity of binding to the TLR4 signaling inhibitor that binds to the site) as a result of the insertion or substitution. Need to be stuff.
  • proteins and peptides described in the present specification are the left end force end (amino end) and the right end force end (carboxyl end) according to the convention of peptide designation.
  • amino end amino end
  • carboxyl end carboxyl groups
  • carbo Kishireto - COO _
  • amide carbo Kishireto
  • ester - COOR
  • R in the ester is, for example, a C alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, cyclopentyl, cyclohexyl, etc.
  • Any C cycloalkyl group for example, C aryl groups such as phenol, ⁇ -naphthyl, etc.
  • ferro-C alkyl group such as benzyl, phenethyl, etc. (X naphthylmethyl);
  • naphthyl-C alkyl group such as C alkyl group; pivaloyloxy
  • a dimethyl group or the like is used.
  • TLR4 has a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminus
  • those in which the carboxyl group is amidy or esterified are also included in TLR4 of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • TLR4 is protected by the amino group of the amino acid residue at the terminus (eg, methionine residue).
  • Groups eg C acyl groups such as C alkanols such as formyl and acetyl groups).
  • N-terminal glutamine residues produced by cleavage in vivo, pyroglutamate, and substituents on the side chain of amino acids in the molecule are suitable protecting groups (for example, C acyl group such as C alkanol group such as formyl group, acetyl group, etc.)
  • the partial peptide of TLR4 used in the present invention is the partial amino acid sequence of TLR4 described above.
  • substantially the same activity refers to the activity of binding to a compound that binds to the intracellular region of TLR4 and inhibits the above signal transduction.
  • the partial peptide has signal transduction activity (ie, NF- ⁇ B and Z or IRF3 activity by LPS stimulation, and inflammatory site force in and Z or interferon and interferon inducible gene expression. The activity to induce).
  • the “substantially the same quality of activity” can be measured by the same method as described above for TLR4.
  • the TLR4 protein and the partial peptide may be hereinafter referred to as “inhibitor-binding polypeptide”.
  • the partial peptide of TLR4 has a carboxyl group (—COOH) and carboxylate at the C-terminus.
  • examples of R in the ester include the same as those described above for TLR4.
  • these peptides have a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • those having a carboxyl group amidylated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention.
  • the ester in this case for example, the C-terminal ester described above is used.
  • the amino acid of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group, and the Gin produced by cleaving the N-terminal side in vivo is generated. Pyroglutamate, substituents on the side chains of amino acids in the molecule are properly retained. Also included are those that are protected by protecting groups, or complex peptides such as all glycopeptides to which sugar chains are bound.
  • TLR4 or a partial peptide thereof may be a free form! /, Or may be a salt! /.
  • Examples of the salt of TLR 4 or a partial peptide thereof include physiologically acceptable salts with acids or bases, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable.
  • salts examples include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citrate, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the binding site of a desired signal transduction inhibitor preferably a cysteine residue in the intracellular region, for example, in human TLR4 represented by SEQ ID NO: 2,
  • a desired signal transduction inhibitor preferably a cysteine residue in the intracellular region, for example, in human TLR4 represented by SEQ ID NO: 2
  • One or more of the 664th, 706th, 747th and 831st cysteine residues of the amino acid sequence, more preferably 706th and Z or 747th cysteine residues are deleted.
  • a polypeptide substituted with force or other amino acids (for example, force including but not limited to alanine, glycine, parin, leucine, isoleucine, preferably alanine) Since it does not have a binding activity to a signal transduction inhibitor, it does not bind to a compound that specifically binds to the target binding site and inhibits signal transduction. In addition, when the mutant partial peptide further retains signal transduction activity, signal transduction is not inhibited even when contacted with a compound that specifically binds to the target binding site and inhibits signal transduction.
  • force or other amino acids for example, force including but not limited to alanine, glycine, parin, leucine, isoleucine, preferably alanine
  • mutant TLR and the mutant partial peptide may be hereinafter referred to as “inhibitor non-binding polypeptide”.
  • TLR4 or a salt thereof can be prepared from the aforementioned warm-blooded animal cells or tissues by a known protein purification method. Specifically, TLR4 is obtained by homogenizing warm-blooded animal tissues or cells, and separating and purifying the soluble fraction by chromatography such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. Or the salt can be manufactured. [0050] TLR4 or a partial peptide thereof can also be produced according to a known peptide synthesis method.
  • the peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the target protein can be produced by removing the protective group.
  • condensation and the removal of the protecting group are carried out according to a method known per se, for example, the method described in the following (1) to (5).
  • TLR4 or a partial peptide thereof thus obtained can be isolated and purified by a known purification method.
  • the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and combinations thereof.
  • TLR4 obtained by the above method or a partial peptide thereof is a free form
  • the free form can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto
  • the salt can be converted into a free form or other salt by a known method or a method analogous thereto.
  • a commercially available protein synthetic resin can be used.
  • resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, and 4-benzyloxybenzyl alcohol.
  • an amino acid having an a-amino group and a side chain functional group appropriately protected is added to the coconut resin according to various known condensation methods according to the sequence of the target protein or peptide. Allow to condense.
  • the protein (peptide) is cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and further, intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein (peptide) or its amide. .
  • the ability to use various active reagents that can be used in protein synthesis are preferred.
  • the carpositimides include DCC, N, N, -diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N,-(3-dimethylaminoprolyl) carpositimide.
  • a racemization inhibitor for example, HOBt, HOOBt
  • a protected amino acid is added directly to the resin, or a symmetric acid anhydride, HOBt ester or HOOBt ester is added to the active amino acid. It can be added to the resin after it has been activated.
  • the solvent used for the condensation of the protected amino acid with the active resin can be appropriately selected from solvent powers known to be usable in protein condensation reactions.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methyl chloride and chloroform, and trifluoroethanol Lucols
  • sulfoxides such as dimethyl sulfoxide
  • amines such as pyridine
  • ethers such as dioxane and tetrahydrofuran
  • nitriles such as acetonitrile and propionitryl
  • esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or appropriate ones thereof Mixtures are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range force known to be used for peptide bond formation reaction, and is usually selected from the range of about -20 ° C to 50 ° C.
  • Activated amino acid derivatives are usually used in excess of 1.5 to 4 times.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, tertiary pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, and adamantyl.
  • Z Boc, tertiary pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, and adamantyl.
  • oxycarbol, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2--trifluorosulfuryl, diphenylphosphinochi oil, and Fmoc are used.
  • the carboxyl group is, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butinole, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptinole, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butinole, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptinole, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • aralkyl esterification for example, benzyl ester, 4-trobenzyl ester ester, 4-methoxypenzino ester ester, 4-chlorobenzene ester ester, benzhydrino ester ester
  • Phenacyl esterification benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected by, for example, ester or ether.
  • ester group examples include a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group. It is done.
  • group suitable for etherification examples include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, and a tbutyl group.
  • protecting groups for the phenolic hydroxyl group of tyrosine examples include Bzl, C1-Bzl, 2-
  • Mouth benzyl, Br-Z, tertiary butyl, etc. are used.
  • protecting group for imidazole of histidine for example, Tos, 4-methoxy 2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fm oc and the like are used.
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, anhydrous hydrogen fluoride, methane.
  • the above-described elimination reaction by acid treatment is generally performed at a temperature of about -20 ° C to 40 ° C.
  • arsol, phenol, thioanol, metacresol, palatalezole Addition of a cation scavenger such as dimethylsulfide, 1,4 butanedithiol, 1,2 ethanedithiol, etc. is effective.
  • the 2,4 dinitrophenol group used as the imidazole protecting group of histidine was removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan was the 1,2-ethanedithiol, 1,4 butane described above.
  • the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan was the 1,2-ethanedithiol, 1,4 butane described above.
  • it can also be removed by alkaline treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the activated carboxyl group of the raw material includes, for example, the corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (for example, pentachlorophenol, 2, 4, 5 trichloro oral phenol, 2, 4 Esters with di-trophenol, cyanomethyl alcohol, para-trophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOBt) and the like.
  • active ester for example, pentachlorophenol, 2, 4, 5 trichloro oral phenol, 2, 4 Esters with di-trophenol, cyanomethyl alcohol, para-trophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOBt
  • the corresponding phosphoric acid amide is used as the activated amino group of the raw material.
  • an amide form of a protein for example, first, the a-carboxyl group of each C-terminal amino acid of a partial peptide constituting the protein (peptide) is protected by amidation. After extending the peptide chain on the amino group side to the desired chain length (amino acid to be linked to the C-terminal amino acid of the adjacent partial peptide), the (X-amino group of the N-terminal amino acid of the C-terminal peptide chain And a peptide obtained by removing only the protecting group of the carboxyl group of the C-terminal amino acid of the N-terminal side peptide chain, and producing these peptides in a mixed solvent as described above.
  • the condensation reaction is the same as above, and the protected protein (protected peptide) obtained by condensation is purified. After that, the protecting group is removed by the above method, and the desired crude protein (crude peptide) can be obtained.
  • This crude protein (crude peptide) can be purified using various known purification means, and the amide form of the desired protein (peptide) can be obtained by lyophilizing the main fraction.
  • ester form of the protein is obtained, for example, by condensing the ⁇ -carboxyl group of the C-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester and then treating it in the same manner as in the case of the above amide form. be able to.
  • a partial peptide of TLR4 or a salt thereof can also be produced by cleaving TLR4 or a salt thereof with an appropriate peptidase.
  • TLR4 or a partial peptide thereof can be produced by culturing a transformant containing a nucleic acid encoding the same, and separating and purifying TLR4 or the partial peptide from the resulting culture. it can.
  • the nucleic acid encoding TLR4 or a partial peptide thereof may be DNA, RNA, or a DNAZRNA chimera.
  • DNA is used.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded. If double stranded, it may be double stranded DNA, double stranded RNA or DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand)
  • DNA encoding TLR4 or a partial peptide thereof includes genomic DNA, warm-blooded animals
  • Any cell eg, human, mouse, rat, guinea pig, wild, mustard, usagi, hidge, goat, pig, pig, horse, bird, cat, inu, monkey, chimpanzee, etc.
  • Nerve cells glial cells, spleen j8 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langeron cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, Macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, rod cells), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, bone Blasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells or cancer cells, or cells of the blood cell line], or any tissue in which those cells exist
  • genomic DNA and cDNA encoding TLR4 or its partial peptide use the genomic DNA fraction and total RNA or mRNA fraction prepared from the above-mentioned cell's tissue as a cage, respectively. Amplification can also be carried out directly by “PCR method”) and reverse transcriptase-PCR (hereinafter abbreviated as “RT-PCR method”).
  • genomic DNA and cDNA encoding TLR4 or its partial peptide can be prepared by inserting genomic DNA prepared from the cells and tissues described above and total RNA or mRNA fragments into an appropriate vector and Cloning can be performed from a cDNA library by colony or plaqueno, hybridization method or PCR method.
  • the vector used for the library may be any of phages, plasmids, cosmids, phagemids and the like.
  • the DNA encoding TLR4 is, for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a complementary strand sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under highly stringent conditions. It contains a hybridizing base sequence and has substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (ie, a signal transduction activity and a TLR4 signaling inhibitor at the target binding site). DNA encoding a protein having a binding activity of
  • the DNA that can be hybridized with the complementary strand sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under high stringency conditions is, for example, about 60% or more, preferably approximately about the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a DNA containing a base sequence having a homology of 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more is used.
  • NCBI BLAST National and enter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool
  • the above-mentioned homology calculation algorithm for amino acid sequences is also preferably exemplified.
  • Nobbreviation is a method known per se or a method analogous thereto, for example, Molecular Cloning Second Edition (J. Sambrook et al, Cold Spring Harbor Lab. Press , 1989).
  • hybridization can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Hybridization can be preferably performed according to highly stringent conditions.
  • High stringent conditions include, for example, a sodium salt concentration of about 19 to about 40 mM, preferably about 19 to about 20 mM, and a temperature of about 50 to about 70 ° C, preferably about 60 to about 65 °. C conditions.
  • the sodium salt concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • the salt concentration of the hybridization solution, the temperature of the hybridization reaction, the probe concentration, the length of the probe, the number of mismatches, the time of the hybridization reaction, the salt concentration of the washing solution, the washing By appropriately changing the temperature, etc., the desired stringency can be easily adjusted.
  • the DNA encoding TLR4 is preferably human TLR4 DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an allelic variant thereof, or other warm-blooded animals (eg, mouse, rat, guinea pig, mouse) Orthologs etc. in Muster, Usagi, Hidge, Goat, Pig, Ussi, Horse, Bird, Cat, Inu, Monkey, Chimpanzee, etc.
  • the DNA encoding the inhibitor-binding polypeptide is all or part of the intracellular region of TLR4 [preferably the target binding site of the target TLR4 signaling inhibitor (preferably the intracellular region).
  • TLR4 preferably the target binding site of the target TLR4 signaling inhibitor (preferably the intracellular region).
  • the human TL R4 represented by a cysteine residue, for example, SEQ ID NO: 2, one or more of the 664th, 706th, 747th and 83rd 1st cysteine residues of the amino acid sequence, Preferably, it may be V! /, As long as it contains a base sequence encoding at least 706th and Z or 747th cysteine residues).
  • the DNA encoding the inhibitor non-binding polypeptide is TLR4 or a part thereof.
  • the target binding site of the target TLR4 signal transduction inhibitory substance preferably a cysteine residue in the intracellular region, for example, human TLR4 represented by SEQ ID NO: 2
  • the codon encoding one or more of the 664, 706, 747 and 831 cysteine residues of the sequence, more preferably the 706 and Z or 747 cysteine residues is deleted.
  • DNA encoding TLR4 or a partial peptide thereof is amplified by a PCR method using a synthetic DNA primer having a part of the base sequence encoding the protein or peptide, or incorporated into an appropriate expression vector.
  • DNA can be cloned by hybridization with a DNA fragment encoding a part or all of the protein of the present invention or a labeled synthetic DNA.
  • Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular 'Cloning 2nd Edition' (described above). When a commercially available library is used, hybridization can be performed according to the method described in the instruction manual attached to the library.
  • the DNA nucleotide sequence can be determined using a known kit such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo), etc.
  • the conversion can be carried out according to a method known per se such as duplex method, Kunkel method or the like, or a method analogous thereto. Therefore, a DNA encoding an inhibitor non-binding polypeptide can be obtained by introducing a mutation into a DNA encoding an inhibitor binding polypeptide according to the above method.
  • the cloned DNA can be used as it is or after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 ′ end, and TA A, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3 ′ end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the protein or peptide can be produced by transforming the host with an expression vector containing DNA encoding the above TLR4 or a partial peptide thereof, and culturing the resulting transformant.
  • An expression vector containing DNA encoding TLR4 or a partial peptide thereof is produced, for example, by excising a target DNA fragment from DNA encoding TLR4 and ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. can do.
  • plasmids derived from E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • plasmids derived from Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids f row, pSH19, pSH15
  • Butteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrowinoles, vaccinia virus and baculovirus
  • Any promoter can be used as long as it is appropriate for the host used for gene expression! /.
  • SRa promoter when the host is an animal cell, SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegaloinores) promoter, HSV-TK promoter, etc. are used. Of these, CMV promoter and SRa promoter are preferred.
  • the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ ⁇ promoter, ⁇ promoter, ⁇ 7 promoter and the like are preferable.
  • SPOl promoter When the host is Bacillus, SPOl promoter, SP02 promoter, penP promoter, etc. are preferred. When the host is yeast, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • polyhedrin promoter When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter, etc. are preferred.
  • expression vectors, splicing signals, poly-A-added signal, selection marker, SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40ori), etc. are included as desired. It can contain what is contained.
  • a selection marker For example, dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp 1 ), neomycin resistance gene ( Hereinafter, it may be abbreviated as Neo 1 and is resistant to G418).
  • dhfr gene-deficient Chinese omster ovary cells are used and the dhfr gene is used as a selection marker
  • the target gene can also be selected in a medium not containing thymidine.
  • a base sequence (signal codon) encoding a signal sequence suitable for the host to the 5 'end of DNA encoding TLR4 or a partial peptide thereof, or a native signal sequence (Or a preb mouth arrangement) may be substituted. If the host is Escherichia, PhoA 'signal sequence, ⁇ ⁇ signal sequence, etc.
  • the host is Bacillus, a amylase' signal sequence, subtilisin 'signal sequence, etc .; if the host is yeast, MF o; ⁇ Signal sequence, SUC2 'signal sequence, etc .; When the host is an animal cell, insulin' signal sequence, a interferon 'signal sequence, antibody molecule ⁇ signal sequence, etc. are used respectively.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
  • Escherichia coli examples include Escherichia coli K12 'DHl [Proc. Natl. Acad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60 ⁇ , 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9 ⁇ , 309 (1981)], JA221 [Journal 'Ob' Molecular ⁇ ⁇ ⁇ Biology (Journal of Molecular Biology), 120 ⁇ , 517 (197 8)], HB101 (Journal 'Ob' Molequila 'Biology, 41 ⁇ , 459 (1969)), C600 (Genetics), 39 ⁇ , 440 (1954)].
  • Bacillus subtilis MI114 Gen, 24 ⁇ , 255 (1983)]
  • 207-21 Journal of Biochemistry, 95 ⁇ , 87 ( 1984)
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae A H22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pom Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71, etc. are used.
  • insect cells for example, when the virus is AcNPV, larvae-derived cell lines (Spodoptera frugiperda cell; Sf cells), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, High Five derived from eggs of T richoplusia ni Cells, Mitastra brassicae-derived Itoda vesicles, Estigme na acrea-derived cells, etc. are used.
  • insect-derived cell lines Bacthorax mori N cells; BmN cells
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells (above, Vaughn, J ⁇ . Et al., In Vivo, 13, 213-217 (1977)).
  • insects examples include silkworm larvae [Maeda et al., Nature, 315N, 592 (1985)].
  • Animal cells include, for example, monkey cell COS-7, Vero, Chinese mothster oocyte cell (hereinafter abbreviated as CHO cell), dhfr gene-deficient Chinese hamster ovary cell (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr-) cell).
  • CHO cell Chinese mothster oocyte cell
  • dhfr gene-deficient Chinese hamster ovary cell hereinafter abbreviated as CHO (dhfr-) cell.
  • Mouse L cells mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3 cells, human FL cells, HEK293 cells, HeLa cells, etc. are used.
  • Transformation can be performed according to a known method depending on the type of host.
  • the Escherichia genus is, for example, the processings 'Ob The National' Academia 1 o B. Scienses Ob The USA ( proc . Natl. Acad. Sci. USA), 69 ⁇ , 21 10 (1972), Gene, 17 ⁇ , 107 (1982), and the like.
  • Bacillus can be transformed according to the method described in, for example, Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • Yeasts are, for example, Methods in Enzymology, 194 ⁇ , 182—187 (1991), Proceedings of “The National” of Power of Science, of Sciences. It can be transformed according to the method described in, for example, The NAT (Acad. Sci. USA), 75 ⁇ , 1929 (1978). Insect cells and insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6 ⁇ , 47-55 (1988).
  • Animal cells should be transformed according to the method described in, for example, Cell Engineering Supplement 8 New Cell Engineering Experimental Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52 ⁇ , 456 (1973). Can do.
  • the culture of the transformant can be performed according to a known method depending on the type of the host.
  • a liquid medium is preferable as a medium used for the culture.
  • the medium preferably contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like necessary for the growth of the transformant.
  • the carbon source for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc .
  • the nitrogen source for example, ammonium salt, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract.
  • examples include inorganic or organic substances such as soybean meal and potato extract; examples of inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • the medium may be supplemented with yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Glucose and casamino acids in M9 medium (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] Powerful! / ⁇ .
  • a drug such as 3
  • Culture of transformants whose host is Escherichia is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours. If necessary, aeration or agitation may be performed.
  • the transformant whose host is Bacillus is usually cultured at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours. If necessary, aeration or agitation may be performed.
  • a medium for culturing a transformant whose host is yeast for example, Burkholder's minimum medium [Bostian, K., et al., Processing 'Ob' The 'Nashi Standard 'Academia ⁇ ⁇ ⁇ B'Sciences' Bob 'The' US (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77 ⁇ , 4505 (1980)] and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter , G. A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 ⁇ , 5330 (1984)].
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • the culture is usually performed at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours. Aeration and agitation may be performed as necessary.
  • a medium for culturing a transformant whose host is an insect cell or an insect for example, Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195 ⁇ , 788 (196 2))
  • a suitable supplement with an additive such as 10% sushi serum is used.
  • the pH of the medium is preferably about 6.2 to 6.4.
  • Incubation is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days. You may perform ventilation
  • a medium for culturing a transformant whose host is an animal cell for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122 ⁇ , 501 (1952)] , DMEM medium (Virology, 8 ⁇ , 396 (1959)), RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199 ⁇ , 519 ( 1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73 ⁇ , 1 (1950)] .
  • the pH of the medium is preferably about 6-8.
  • the culture is usually performed at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours. You may perform ventilation
  • TLR4 or a partial peptide thereof can be produced inside or outside the transformant.
  • TLR4 or a partial peptide thereof can be separated and purified according to a method known per se.
  • TLR4 or a partial peptide thereof is extracted from cultured cells or cells
  • culture force or cells collected by a known method are suspended in an appropriate buffer, and ultrasound, lysozyme and Z or frozen
  • ultrasound, lysozyme and Z or frozen A method of obtaining a crude extract of soluble protein by centrifugation or filtration after disrupting cells or cells by thawing, etc. is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • Isolation and purification of TLR4 or a partial peptide thereof contained in the soluble fraction thus obtained can be performed according to a method known per se.
  • Such methods include the use of solubility such as salt precipitation and solvent precipitation; mainly the difference in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Method that utilizes difference in charge such as ion exchange chromatography; Method that utilizes specific affinity such as affinity chromatography; Method that utilizes difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography
  • a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing method; These methods can be combined as appropriate.
  • TLR4 obtained by force or its partial peptide is a free form
  • the free form can be converted into a salt by a method according to the method, and the protein
  • the salt can be converted into a free form or other salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • TLR4 produced by the transformant or a partial peptide thereof can be arbitrarily modified or partially removed by applying an appropriate protein-modifying enzyme before purification or after purification.
  • protein-modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, anoreginoleendopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
  • TLR4 or its partial peptide obtained by force can be confirmed by Western blotting or the like using a specific antibody.
  • TLR4 or a partial peptide thereof is translated in vitro using a cell-free protein translation system, such as a rabbit reticulocyte lysate, wheat germ lysate, or E. coli lysate, with the RNA corresponding to the DNA encoding it as a saddle type. By doing so, it can also be synthesized.
  • a cell-free transcription Z translation system further containing RNA polymerase can be used to synthesize DNA encoding TLR4 or a partial peptide thereof as a saddle type.
  • the cell-free protein (transcription) translation system can be a commercially available one, or a method known per se, specifically, the Escherichia coli extract can be obtained from Pratt JM et al., Transcription and Tra nlation, 179-209, Hames BD & Higgins SJ eds., IRL Press, Oxford (1984).
  • Examples of commercially available cell lysates include E. coli S30 extract system (Promega) and RTS 500 Rapid Tranlation System (Roche), and Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega), and wheat germ-derived ones include PROTEIOS TM (TOY OBO). Of these, those using wheat germ lysate are preferred.
  • the screening method of the present invention uses the inhibitor-binding polypeptide obtained by any of the above methods, the binding of the test compound to the TLR4 intracellular region of the polypeptide, and the polypeptide signals When the transmitter activity is retained, the signal transduction activity in the presence of the test compound is measured.
  • an inhibitor-binding polypeptide for example, a microplate), and a solution containing the labeled test compound is immobilized. After adding to the phase and incubating for a certain period of time, the solution can be removed and the amount of label adsorbed on the solid phase can be measured.
  • the inhibitor-binding polypeptide is a fusion polypeptide having an appropriate tag (for example, GST tag, His tag, MBP tag)
  • the polypeptide and the labeled test compound are reacted in a solution.
  • a carrier containing a substance that specifically binds to the tag sequence (e.g., dartathione, gold Binding the test compound to the intracellular region of TLR4 by measuring the amount of the label adsorbed on the solid phase.
  • a labeling agent for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used.
  • the radioisotope for example, 2 5 ⁇ ], [ 131 ⁇ ], [3 ⁇ 4], [ 14 c] and the like are used.
  • the above enzyme those which are stable and have high specific activity are preferred, for example, j8-galactosidase, 13-darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescene isothiocyanate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • the binding between the inhibitor-binding polypeptide and the test compound is carried out by a conventional method on the surface of a commercially available sensor chip (for example, manufactured by Biacore) using, for example, the surface plasmon resonance (SPR) method.
  • the inhibitor-binding polypeptide is immobilized according to the procedure described above, the test compound is brought into contact therewith, light of a specific wavelength is irradiated to the sensor chip at a specific angular force, and the change is made using the change in the resonance angle as an index.
  • the presence or absence of binding of the test compound to the conjugated inhibitor-binding polypeptide can be determined.
  • an inhibitor-binding polypeptide is immobilized on the surface of a protein chip compatible with a mass spectrometer, contacted with a test compound, and then MALDI-MS, ESI-MS, FAB- By combining ionization methods such as MS with mass spectrometers (eg, double-focusing mass spectrometer, quadrupole analyzer, time-of-flight mass spectrometer, Fourier transform mass spectrometer, ion cyclotron mass spectrometer, etc.) By detecting the appearance of a peak corresponding to the test compound, the binding between the inhibitor-binding polypeptide and the test compound can be measured, but the method is not limited to these methods. Any other known method can be used.
  • mass spectrometers eg, double-focusing mass spectrometer, quadrupole analyzer, time-of-flight mass spectrometer, Fourier transform mass spectrometer, ion cyclotron mass spectrometer, etc.
  • Substances that do not bind to peptides can be selected as compounds that bind to target binding sites in the TLR4 intracellular region.
  • the TLR4 signaling inhibitory activity of a test compound can be measured by examining TLR4 signaling of cells expressing TLR4 in the presence and absence of the test compound. Specifically, expression of inflammatory sites such as TNF ⁇ , IL-1, IL-6, and changes in expression of IFN- ⁇ , IFN-
  • Cells expressing TLR4 include mammalian cells expressing endogenous TLR4, or transformed cells introduced with DNA encoding TLR4 or a partial peptide as described above in the production of TLR4 or a partial peptide thereof ( Including transient expression), preferably mammalian cells, more preferably human cells.
  • the test compound when the expression level of the gene is decreased by 20% or more in the presence of the test compound, the test compound can be selected as a TLR4 signaling inhibitor.
  • Induction of inflammatory site force-in expression by TLR4 signal is caused by activation of NF- ⁇ activation, transcription of inflammatory site force-in gene having a cis-element specific for the transcription factor in the promoter region. Occurs by being tricked.
  • the expression of IFN ⁇ and interferon-inducible genes by TLR4 signal can be induced by transcription of IFN- ⁇ and interferon-inducible genes that have a cis element specific to the transcription factor in the promoter region through IRF3 activation. This is caused by activation.
  • the measurement of TLR4 signal transduction inhibitory activity of a test compound is a gene that expresses an inhibitor-binding polypeptide and is under the control of a promoter containing an NF- ⁇ or IRF3 binding sequence.
  • the cells containing the reporter gene can be cultured by culturing for a certain period of time in the presence and absence of the test compound, and then measuring the expression level of the gene.
  • Examples of cells that express the inhibitor-binding polypeptide include the same cells as described above. Since the TLR4 signal is activated by LPS, the TLR4 ligand, the inhibitor-binding polypeptide used is a TLR4 cell so that it can respond to LPS stimulation. It preferably contains an LPS binding region within the extracellular region. In addition, it is desirable that the polypeptide contains a transmembrane region and a signal peptide that is compatible with cells so that the polypeptide can bind to the membrane correctly.
  • the NF- ⁇ B binding sequence includes GGGRNNYYCC (SEQ ID NO: 3), and the IRF3 binding sequence includes GAAASSGAAANY (SEQ ID NO: 4). These are known to be regulated by the transcription factor.
  • any sequence other than the above consensus sequence may be used as long as it is a sequence that binds them in the promoter region of the gene.
  • the promoter to be used is exemplified by any of the promoters described above depending on the host cell, as long as it is functional in the host cell to be used.
  • the promoter used may be a promoter derived from the NF- ⁇ B binding sequence or IRF3 binding sequence used.
  • Reporter genes include, but are not limited to, luciferase genes, GFP genes, EGFP genes, peroxidase genes, alkaline phosphatase genes, and the like.
  • a gene under the control of a promoter containing an NF- ⁇ B or IRF3 binding sequence is inserted into one of the vectors described above depending on the host cell, and introduced into the host cell using the appropriate gene transfer method described above. be able to
  • the culture of the cells can be performed in the same manner as described above in the above-mentioned various media or phosphate buffered saline depending on the host cells.
  • the medium or buffer in addition to the test compound, if the inhibitory binding polypeptide contains a ligand binding region, LPS is added to the baseline of the TLR4 signal (the reporter gene in the absence of the test compound). Expression level) can be increased.
  • measure the expression level of the reporter gene As the measurement method, a method known per se for each reporter gene can be used.
  • the test compound when the expression level of the reporter gene is decreased by 20% or more in the presence of the test compound, the test compound can be selected as a TLR4 signaling inhibitor.
  • a cell (sample 1) expressing an inhibitor-binding polypeptide is bound to a target TLR4 signal inhibitor.
  • Each of the cells expressing the non-inhibitor-binding polypeptide with a mutated site (sample 2) was used to perform the above reporter assay to determine whether or not the test compound bound to the target binding site.
  • the TLR4 signal transduction inhibitory activity of a compound can be collectively measured. That is, in sample 2, since the TLR4 signal inhibitor that binds to the target site does not bind to the inhibitor non-binding polypeptide, the TLR4 signal is not inhibited, and the expression level of the reporter gene is not decreased. Therefore, according to this method, it is not necessary to culture the cells in the absence of the test compound and measure the expression level of the reporter gene.
  • the test compound when the expression level of the reporter gene in sample 1 is reduced by 20% or more compared to the expression level in sample 2, the test compound can be selected as a TLR4 signaling inhibitor.
  • the present invention also provides a cell that expresses the above-described inhibitor-binding polypeptide and a cell that expresses a non-inhibitor-binding polypeptide in which the binding site of the target TLR4 signal inhibitor is mutated.
  • a kit for screening a TLR4 signal transduction inhibitor comprising: The kit may further include a medium and a container for cell culture, a reagent for detecting the expression of a reporter gene, and the like.
  • TLR4 signaling inhibitor of the present invention The substance that binds to the intracellular region of TLR4 and inhibits TLR4 signal transmission (hereinafter abbreviated as TLR4 signaling inhibitor of the present invention) obtained by the screening of the present invention is, for example, a mammal. (Eg, rats, mice, guinea pigs, monkeys, ushi, inu, pigs, humans, etc.) Inhibitors of mono-nitrogen (NO) production, TNF-a, IL-1, IL-6, etc. It is useful as a site force-in production inhibitor, a TLR signal inhibitor (particularly a TLR4 signal inhibitor), and the like.
  • NO mono-nitrogen
  • the TLR4 signaling inhibitor of the present invention includes, for example, sepsis, heart disease, including severe sepsis for mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, monkey, ushi, inu, pig, human, etc.).
  • mammals eg, rat, mouse, guinea pig, monkey, ushi, inu, pig, human, etc.
  • autoimmune disease inflammatory disease, central nervous system disease, infectious disease, septic shock, hypoimmune disease, such as sepsis, endotoxin shock, exotoxin shock, systemic inflammatory response syndrome (SIRS), compensation Anti-inflammatory reaction syndrome (CARS), burns, trauma, postoperative complications, heart failure, shock, hypotension, rheumatoid arthritis, bone Arthritis, gastritis, ulcerative colitis, peptic ulcer, stress gastric ulcer, Crohn's disease, autoimmune disease, tissue damage and rejection after organ transplantation, ischemia reperfusion injury, acute coronary microvascular embolism, shock Vascular embolism (such as disseminated intravascular coagulation (DIC)), ischemic brain damage, arteriosclerosis, pernicious anemia, Fanconi anemia, sickle cell anemia, splenitis, nephrotic syndrome, nephritis, renal failure, insulin Dependent diabetes, non-insulin dependent diabetes mellitus,
  • the TLR4 signal transduction inhibitor of the present invention is useful as a preventive / therapeutic agent for organ disorders and the like for mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, monkeys, ushi, inu, pigs, humans, etc.). It is.
  • mammals eg, rats, mice, guinea pigs, monkeys, ushi, inu, pigs, humans, etc.
  • organ refers to various organs of the central nervous system, circulatory system, respiratory system, bone 'joint system, digestive system or kidney' urinary system.
  • the TLR4 signaling inhibitor of the present invention is caused by a change in TLR signal, (1) Central nervous system disease (G) Neurodegenerative disease (e.g., senile dementia, Alzheimer's disease, Down's syndrome, Parkinson's disease, Creutzfeld's Jacob's disease, amyotrophic spinal sclerosis, diabetic-europathy, etc.) , GO cerebral circulatory disorder (eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, cerebral circulatory failure associated with cerebral arteriosclerosis, etc.), head trauma (E.g., senile dementia, amnesia, etc.)), especially Alzheimer's disease,
  • G Central nervous system disease
  • Neurodegenerative disease e.g., senile dementia, Alzheimer's disease, Down's syndrome, Parkinson's disease, Creutzfeld's Jacob's disease, amyotrophic spinal sclerosis, diabetic-europathy, etc.
  • GO cerebral circulatory disorder eg, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, cerebral circulatory failure
  • Cardiovascular diseases [(0 acute coronary syndromes such as acute myocardial infarction, unstable angina, GO end-stage artery occlusion, Gii) coronary artery interpension (percutaneous coronary angioplasty (PTCA), Restenosis after lecttomy (DCA), stent placement, etc., Gv) Restenosis after coronary artery bypass surgery, (V) Inter-pension (angioplasty, atherectomy, stent placement, etc.) and bypass surgery in other peripheral arteries Post-restenosis, (vi) ischemic heart disease such as myocardial infarction, angina, (vii) intermittent claudication, (viii) stroke (cerebral infarction, cerebral embolism, cerebral hemorrhage, etc.), (ix) latane infarction, (X) Cerebrovascular dementia, (xi) Arteriosclerosis (eg, atherosclerosis, etc.) and diseases resulting from them (eg, ischemic heart disease such as my
  • Respiratory system diseases respiratory distress syndrome, respiratory failure, emphysema, pneumonia, bronchitis, bronchitis, etc.
  • Bone and joint diseases such as rheumatoid arthritis, osteoporosis, osteomalacia, osteopenia, bone peck etet disease), especially rheumatoid arthritis,
  • Kidney's urinary tract disease nephritis, renal failure, cystitis, etc.
  • TLR4 signaling inhibitor of the present invention is useful as a preventive / therapeutic agent for infectious diseases caused by changes in TLR4 signal, particularly sepsis accompanied by organ damage (severe sepsis).
  • the TLR4 signal transduction inhibitor of the present invention is effective for organ damage, severe sepsis, etc. Infectious diseases, central nervous system diseases such as Alzheimer's disease, cardiovascular diseases such as arteriosclerosis, bones such as rheumatoid arthritis, joint diseases, digestive diseases such as ulcerative colitis, etc. It is also useful.
  • the TLR4 signaling inhibitor of the present invention can be used in combination with other drugs.
  • concomitant drugs include antibacterial drugs, antifungal drugs, non-steroidal anti-inflammatory drugs, steroid drugs, anticoagulants, antiplatelet drugs, thrombolytic drugs, immunomodulators, antiprotozoal drugs, antitussive Drugs, sedatives, anesthetics, narcotic antagonists, antiulcer drugs, hyperlipidemia drugs, arteriosclerosis drugs, HDL-increasing drugs, unstable plaque stabilizers, myocardial protective drugs, hypothyroidism treatment Drug, nephrotic syndrome drug, chronic renal failure drug, diuretic, hypertension drug, heart failure drug, muscle relaxant, antiepileptic drug, cardiotonic drug, vasodilator, vasoconstrictor, arrhythmia drug, diabetes treatment Drugs, pressor drugs, tranquilizers, antipsychotic drugs, Alzheimer's disease drugs, antiparkinson drugs, amyotrophic spinal sclerosis drugs
  • Naliditasic acid pipemidic acid trihydrate, enoxacin, norfloxacin, ofloxacin , Tosufloxacin tosylate, ciprofloxacin hydrochloride, lomefloxacin hydrochloride, subarufloxacin, fleroxacin and the like.
  • Iso-azide etampitol (ethampitol hydrochloride), paraaminosalicylic acid (calcium paraaminosalicylate), pyrazinamide, etionamide, prothionamide, rifampicin, streptomycin sulfate, kanamycin sulfate, cycloserine and the like.
  • Idxuridine acyclovir, vitarabine, ganciclovir, etc.
  • Zidovudine didanosine, zalcitabine, indinavir sulfate in ethanol, ritonavir, etc.
  • Tetracycline hydrochloride ampicillin, piperacillin, gentamicin, dibekacin, canendomycin, libidomycin, tobramycin, amikacin, furazimycin, sisomicin, tetracycline, oxytetracycline, loritetracycline, doxycycline, piperacillin, ticarcillin, cephalothin , Cefapirin, cephaloridine, cefaclor, cephalexin, cefloxazine, cefadroxyl, cefamandol, cephoium, cefuroxime, cefothiam, cefothium hexetyl, cefuroxime axetyl, cefdi-l, cefditorenpiboxil, ceftazidime, cefpiramide, cefpiramide, Sim, Cefpodoxime Proxetinore, Cefpirom, Cefazoplan, Cefepime, Husgu
  • cytosine antimetabolite eg, flucytosine
  • Imidazole derivatives eg econazole, clotrimazole, miconazole nitrate, bifonazole, croconazole
  • echinocandin derivatives eg, caspofandine, micafungin, adeurafungin
  • Cyclosporine tacrolimus, gusperimus, azathioprine, anti-lymph serum, dried sulfoimmunoglobulin, erythropoietin, colony stimulating factor, interleukin, interferon, etc.
  • Ephedrine hydrochloride nospower pin hydrochloride, codine phosphate, dihydrocodine phosphate, isoproterenol hydrochloride, methyl ephedrine hydrochloride, noss force pin hydrochloride, alochramide, chlorfedanol, picoperidamine, cloperastine, protochelol, isoproterenol, sanore Butamol, tereptaline, oxypetebanol, morphine hydrochloride, dextrose hydrobromide Oral petrphan, oxycodone hydrochloride, dimorphane phosphate, tipipedin hibenzate, pentoxyberine citrate, clofedanol hydrochloride, benzonate, guaifenesin, bromhexine hydrochloride , Ambroquinol hydrochloride, Acetylcystine, Ethylcystine hydrochloride, Canolevoc
  • anesthetics eg, ether, no, mouth tongue, nitrous oxide, influrane, enflurane
  • intravenous anesthetics eg, ketamine hydrochloride, droperidol, thiopental sodium, thiamyl sodium, pent Barbital
  • Methclopromide histidine hydrochloride, lansoprazole, metoclopramide, pirenzepine, cimetidine, ranitidine, famotidine, urogastrin, oxesazein, proglumide, omebrazole, sucralfate, sulpiride, cetraxate, gefarnate, aldioxa, teprenone, prostaglandin, etc.
  • HMG-CoA reductase inhibitors eg, flupastatin, cerivastatin, atorvastatin, etc.
  • fibrate drugs eg, symfibrate, clofibrate aluminum, clinofibrate, fienofibrate, etc.
  • bile acid adsorbent eg E.g. cholestyramine
  • nicotinic acid preparations e.g. nicomol, -seritrol, tocopherol nicotinate
  • probucol and its derivatives e.g.
  • LDL receptor increasing drug LDL receptor increasing drug
  • Drugs such as Ezetimibe
  • MTP inhibitors MTP inhibitors
  • ileal bile acid transporter inhibitors SCAP ligands
  • FXR ligands etc.
  • MMP inhibitor MMP inhibitor, chymase inhibitor, ACAT inhibitor (Avasimibe, Eflucimibe, etc.), apo AI Milano and similar substances, scavenger receptor inhibitor, 15-lipoxygenase inhibitor, phospholipase A2 inhibitor, ABCA1 activator, LXR ligand Sphingomyelinase inhibitors, noraoxonase activity agonists, estrogen receptor agonists, etc.
  • Squalene synthase inhibitors Squalene synthase inhibitors, CETP inhibitors, LPL activators, etc.
  • MMP inhibitor MMP inhibitor, chymase inhibitor, ACAT inhibitor, lipid 'rich' plaque regression agent, etc.
  • thyroid dry thyroid (thyroid), levothyroxine sodium (thyrazine S), liochi-mouth sodium (thyronine, thyromine)
  • Pred-zolone predo-zolone sodium succinate
  • predonin predo-zolone sodium succinate
  • predonin methylpredo-zolone sodium succinate
  • betamethasone linderone
  • Diuretics eg, furosemide (Lashix), bumetaside (Lunetron), Azosemide (Diaart)
  • antihypertensive agents eg, ACE inhibitor, enalapril maleate (Renibase), Ca antagonist (Mardipine), a receptor Body blockers, acupuncture antagonists (candesartan)] and the like.
  • Thiazide diuretics (benchyl hydrochloride thiazide, cyclopenthiazide, ethiazi , Hydrothiazide thiazide, hydroflumethiazide, methiclothiazide, penfluthiazide, polythiazide, trichlormethiazide, etc., loop diuretics (chlorthalidone, clofenamide, indapamide, mefluside, meticlan, sotrazone, tribamide, kinetazone, metolazone, furosemide Etc.), potassium-sparing diuretics (spironoraton, triamterene, etc.).
  • aStimulants eg, clodin, guanabens, guanfacine, methyldopa, etc.
  • nerves eg, clodin, guanabens, guanfacine, methyldopa, etc.
  • Node blockers eg, hexamethonium, trimetaphan, etc.
  • presynaptic blockers eg, arsaoxylone, dimethylaminoreserpinate, resinamine, reserpine, syrosingopine, etc.
  • neuron blockers eg, betazine, Guanethidine, etc.
  • a blockers eg, bunazosin, doxazosin, prazosin, terazosin, urapidil, etc.
  • j8 blockers eg, pull pranolo nore, nadronore, timolo nore, nipradinore, buniroro nore, indeno ronore, Penbutoro nore, canolete ronore, force noveji ronore, pind ronore, acebutro nore, ateno ronore, bisopro r
  • Calcium channel antagonists eg, cripine, dicardipine, dirubadipine, disoldipine, nitrendipine, benidipine, amlodipine, aranidipine
  • phthalazine derivatives eg, butralazine, force doralazine, ecarazine, hydralazine, todralazine, etc.
  • Alasepril captopril, cilazapril, delapril, enalapril, lisinopril, temocapril, trandolapril, quinapril, imidapril, benazepril, belindopril.
  • Cardiotonic drugs eg, digitoxin, digoxin, methyldigoxin, lanatoside, prossilaridin, etc.
  • a, j8 stimulants eg, epinephrine, norepinephrine, isoproterenol, donomin, docarpamine, dobutamine, denopamine, etc.
  • phosphodiesterase inhibition Drugs eg, amrinone, milrinone, olprinone hydrochloride
  • calcium channel sensitivity enhancers eg, pimobentan
  • nitrate drugs eg, nitroglycerin, isosorbide nitrate
  • ACE inhibitors eg, the aforementioned ACE inhibitors
  • Diuretics such as the aforementioned diuretics
  • carperitide ubidecarenone, vesnarinone, aminophylline and the like.
  • Feu-toin ethosuximide, acetazolamide, chlordiazepoxide, tripetadione, carbamazepine, phenobarbital, primidone, sultiam, pulp pulp sodium, clonazepam, diazepam, nitrazepam, etc.
  • Transbioxocamphor telephilol, aminophylline, ethyrephrine, dopamine, dobutamine, denopamine, aminophylline, vesinaline, amrinone, pimobendan, ubidecarenone, digitoxin, digoxin, methyldigoxin, lanatoside, G-stout funtin, etc.
  • sodium channel blockers e.g., quinidine, pro-inamide, disoviramide, azimarin, cybenzoline, lidocaine, diphenylhydantoin, mexiletine, propafenone, Recainide, pilcainide, phenytoin
  • quinidine e.g., quinidine, pro-inamide, disoviramide, azimarin, cybenzoline, lidocaine, diphenylhydantoin, mexiletine, propafenone, Recainide, pilcainide, phenytoin
  • j8 blockers eg, propranolol, alprenolol, pfuetolol, oxpreno ronole, atenorole, acebutronole, metoproronole, bisoproronole, pindronore, carteolol, arotilonore, etc.
  • potassium channel blockers eg, amiodarone
  • calcium channel blockers eg, verapamil, diltiazem, etc.
  • Sulfoleureas eg, tolptamide, chlorpropamide, glycloviramide, acetohexamide, tolazamide, darifenclamide, dalibuzole, etc.
  • biguanides eg, metformin hydrochloride, buformin hydrochloride, etc.
  • a-darcosidase inhibitors eg, , Voglibose, emulaterbose, etc.
  • insulin sensitizers eg, pioglitazone, rosiglitazone, troglitazone
  • insulin glucagon
  • diabetic complications eg, epalrestat
  • cholinesterase inhibitors such as donepezil, rivastigmine, galantamine, TAK-147,
  • Brain function activators such as idebenone, memantine, vinpocetine and the like.
  • L-dopa deplel, carbidopa + levodono, pergolide, ropirol, strength begoline, pramipexole, entakabron, lazabemide, etc.
  • Olanzapine Olanzapine, risperidone, taetiapine, iloperidone, etc.
  • Vitamin D Vitamin D, D, D, D and D
  • Vitamin E (X Tocopherol, ⁇ Tocopherol, y Tocopherol, ⁇ Tocopherol Coferonole, nicotinic acid dl——Tocoferrore
  • Vitamin K Vitamin K, K, K and K
  • Vitamin B Vitamin B, vitamin B, vitamin B, vitamin B, vitamin B, vitamin B and vitamin
  • Vitamin derivatives such as vitamin D derivatives such as ascorbic acid, 5, 6-trans-cholecalcifer mouth, 2,5-hydroxycholecanoreciferol, 1-a-hydroxycholecanoreciferol, 5, 6—Vitamin D, such as transgergocalciferol
  • Isoprenaline hydrochloride salbutamol sulfate, proterol hydrochloride hydrochloride, terbutaline sulfate, trimethoquinol hydrochloride, lobbuterol hydrochloride, orciprenaline sulfate, fenoterol hydrobromide, ephedrine hydrochloride, odorous protropium, oxytropium bromide, flutropium bromide, theophylline , Aminophylline, sodium cromoglycate, tralast, lebilinast, amlexanone, ibudilast, ketotifen, terfenadine, mequitazine, azelastine, epinastine, ozadarel, pranlukast hydrate, seratrodast, dexamethasone, predo-zolone, hydrocortisone Beclopetazone propionate.
  • Such as sodium cromoglycate Such as sodium cromoglycate.
  • rBPI-21 bacteria permeation increasing protein
  • BI-51017 antithrombin ⁇
  • SC-59735 rTFPl
  • r-PAF acetylenohydrase LY-203638 (r-activated protein) C
  • peptide compounds such as anti-TNF- ⁇ antibody, anti-CD14 antibody, CytoFab, alkaline phosphatase (LPS inactivator), JTE-607, E-5531, E-5564, S-5 920, FR -Non-peptidic compounds such as 167653, ONO-1714, ONO-5046 (sivelestat), GW-273629, RWJ-67657, GR-270773, NOX-100, GR-270773, NOX-100.
  • Phenoliadin derivatives are substituted by Phenoliadin derivatives, 5-HT3 receptor antagonists, etc.
  • Hydroxycam diatherin, megestrol acetic acid, -serologrin, prostaglandins and the like.
  • TLR4 signaling inhibitor of the present invention When the TLR4 signaling inhibitor of the present invention is used in combination with other drugs, the following effects are obtained.
  • the administration timing of the TLR4 signaling inhibitor of the present invention and the concomitant drug is not limited, and the TLR4 signaling inhibitor of the present invention or the pharmaceutical composition thereof and the concomitant drug or the pharmaceutical composition thereof are administered. Can be administered at the same time or time Administration may be performed with a difference.
  • the dose of the concomitant drug can be appropriately selected depending on the administration subject, administration route, disease, combination, etc., according to the clinically used dose.
  • the administration form of the combination is not particularly limited as long as the TLR4 signaling inhibitor of the present invention and the concomitant drug are combined at the time of administration.
  • Examples of such administration forms include (1) administration of a single preparation obtained by simultaneously formulating the TLR4 signaling inhibitor of the present invention or a pharmaceutical composition thereof and a concomitant drug, and (2) the present invention.
  • TLR4 of the present invention Administration of two types of preparations obtained by separately formulating a signal transduction inhibitor or a pharmaceutical composition thereof and a concomitant drug or a pharmaceutical composition thereof with a time difference in the same administration route, (4) (2) TLR4 signal transduction inhibitor, or a pharmaceutical composition thereof, and a concomitant drug or a pharmaceutical composition thereof, which are obtained by separately formulating two different preparations by different administration routes, (5) TLR4 signaling of the present invention Inhibitor or its pharmaceutical group Administration of the two different preparations obtained by separately formulating the drug and the concomitant drug or the pharmaceutical composition thereof with different administration routes (for example, the TLR4 signaling inhibitory substance of the present invention). Or a pharmaceutical composition thereof; administration of a concomitant drug or a pharmaceutical composition thereof in the order of administration, or administration in the reverse order).
  • the mixing ratio of the TLR4 signaling inhibitor of the present invention and the concomitant drug in the concomitant drug of the present invention can be appropriately selected depending on the administration subject, administration route, disease and the like.
  • the content of the cycloalkene compound or compound A in the concomitant drug of the present invention varies depending on the form of the preparation. Usually about 0.01 to 99.8% by weight, preferably about 0.1, relative to the whole preparation. It is about 50 to 50% by weight, more preferably about 0.5 to 20% by weight.
  • the content of the concomitant drug in the concomitant drug of the present invention varies depending on the form of the preparation, but is usually about 0.01 to 99.8% by weight, preferably about 0.1 to 50% by weight, More preferably, it is about 0.5 to 20% by weight.
  • the content of additives such as carriers in the combination of the present invention varies depending on the form of the preparation. However, it is usually about 1 to 99.98% by weight, preferably about 10 to 90% by weight, based on the whole preparation.
  • TLR4 signaling inhibitor of the present invention is formulated separately.
  • the TLR4 signaling inhibitor of the present invention When administered to humans, it is mixed with itself or an appropriate pharmacologically acceptable carrier, excipient, diluent, etc., and orally administered (eg, powder) , Granules, tablets, capsules, etc.), parenteral preparations (eg, injections, external preparations (eg, nasal preparations, transdermal preparations, etc.)), suppositories (eg, rectal suppositories, vaginal suppositories) Etc.) and can be safely administered orally or parenterally.
  • an appropriate pharmacologically acceptable carrier eg, excipient, diluent, etc.
  • orally administered eg, powder
  • parenteral preparations eg, injections, external preparations (eg, nasal preparations, transdermal preparations, etc.)
  • suppositories eg, rectal suppositories, vaginal suppositories
  • preparations can be produced, for example, by applying a method known per se generally used in the production of preparations.
  • the proportion of the TLR4 signal transduction inhibitor of the present invention in the preparation varies depending on the form, but for example, about 10 to 95% by weight is preferable for the oral administration agent described above, for example, About 0.001 to about 95% by weight is preferable for the parenteral administration.
  • TLR4 solubilizers signaling inhibitors of the present invention eg, beta-cyclo dextrins, etc.
  • dispersing agent e.g., Tween (Tw een) 80 (Atlas Powder Co., US Country), HCO60 (Nikko Chemicals), carboxymethylcellulose, sodium alginate, etc.
  • preservatives eg, methylparaben, propylparaben, benzyl alcohol, chlorobutanol, etc.
  • isotonic agents eg, sodium chloride sodium, Glycerin, sorbitol, glucose, etc.
  • vegetable oil eg, olive oil, sesame oil, peanut oil, cottonseed oil, corn oil, etc.
  • propylene glycol etc. It can also be formed into an oily injection by suspension or emulsification.
  • TLR4 signaling inhibitors of the present invention include excipients (e.g., lactose, sucrose, starch, etc.), disintegrants (e.g., starch, calcium carbonate, etc.), binders (e.g., starch, Gum arabic, carboxymethylcellulose, polybutylpyrrolidone, hydroxypropylcellulose, etc.) or lubricants (eg, talc, magnesium stearate, polyethylene glycol 6000, etc.) are added as appropriate and compression molded, and then as necessary In a manner known per se for masking of taste, enteric or persistent purposes It can also be produced by applying a coating or the like.
  • excipients e.g., lactose, sucrose, starch, etc.
  • disintegrants e.g., starch, calcium carbonate, etc.
  • binders e.g., starch, Gum arabic, carboxymethylcellulose, polybutylpyrrolidone, hydroxypropy
  • coating agents include hydroxypropinoremethinoresenorelose, ethinoresenorelose, hydroxymethenoresenorose, hydroxypropylcellulose, polyoxyethylene glycol, Tween 80, pull neck nick F68, cellulose acetate phthalate, hydroxy Propinole methinole cellulose phthalate, hydroxymethyl cellulose acetate succinate, Eudragit (Rohm, West Germany, methacrylic acid, acrylic acid copolymer), dye (eg, titanium oxide, bengara, etc.) are used as appropriate.
  • the TLR4 signaling inhibitor of the present invention can be used as a solid, semi-solid or liquid external preparation.
  • the TLR4 signal transduction inhibitor of the present invention is used as it is, or an excipient (eg, glycol, mannitol, starch, microcrystalline cellulose, etc.), a thickener (eg, natural). It can also be produced by adding and mixing gums, cellulose derivatives, acrylic acid polymers, etc.) to obtain a powdery composition.
  • excipient eg, glycol, mannitol, starch, microcrystalline cellulose, etc.
  • a thickener eg, natural
  • Semi-solid external preparations are preferably prepared according to conventional methods and used as aqueous or oily gels or ointments.
  • Liquid external preparations can also be produced by preparing oily or aqueous suspensions by means used for the production of injections or means equivalent thereto.
  • pH regulators eg, carbonic acid, phosphoric acid, citrate, hydrochloric acid, sodium hydroxide, etc.
  • preservatives eg, nonoxybenzoic acid esters
  • Black butanol, salt benzalkol, etc. may be added as appropriate.
  • petrolatum, lanolin and the like can be used as a base, and an ointment containing about 0.1 to about 10 mg of the TLR4 signaling inhibitor of the present invention per lg can be used.
  • the TLR4 signaling inhibitor of the present invention can be an oily or aqueous solid, semi-solid or liquid suppository.
  • oily bases used in the production of suppositories include glycerides of high-grade fatty acids (eg, cacao butter, witebuzoles (Dynamite Nobel), etc.), intermediate fatty acids (eg, miglyolic acid (Dynamite Nobel)), etc. ) Or vegetable oils (eg, sesame oil, soybean oil, cottonseed oil, etc.) are used as appropriate.
  • the aqueous base include polyethylene glycols and propylene glycol.
  • the aqueous gel base include natural gums, cellulose derivatives, vinyl polymers, and attails. Luric acid polymers are used as appropriate.
  • the dose of the TLR4 signaling inhibitor of the present invention varies depending on age, body weight, symptoms, dosage form, administration method, administration period, etc.
  • a patient adult, body weight of about 60 kg
  • the TLR4 signal transduction inhibitor of the present invention is usually 1 ⁇ 0. 01! 1000 mg / kg for women, ⁇ 3 ⁇ 4 0. 01! 100 mg / kg for women, more preferably about 0. 1 to about 100 mgZkg, especially about 0.1 to about 50 mgZkg, especially about 1.5 to about 30 mgZkg is administered orally or parenterally in 1 to several divided doses per day.
  • the dosage varies depending on various conditions.
  • the dose of the concomitant drug of the present invention varies depending on the type of compound, age, body weight, symptom, dosage form, administration method, administration period, etc.
  • a patient adult, body weight about 60 kg
  • the TLR4 signaling inhibitor of the present invention and the concomitant drug are each about 1 to about 0.01 mg, preferably about 1000 mg / kg, preferably about 0.01 mg to about 100 mg / kg.
  • about 0.1 to about 100 mg / kg, especially about 0.1 to about 50 mgZkg, especially about 1.5 to about 30 mgZkg is intravenously administered once a day in several divided doses.
  • the dosage varies depending on various conditions, so an amount smaller than the above dosage may be sufficient, and it may be necessary to administer beyond the range.
  • the daily dose as a concomitant drug varies depending on the degree of symptoms, age, sex, weight, sensitivity difference, timing of administration, interval, nature of pharmaceutical preparation, formulation, type, type of active ingredient, etc.
  • the amount of the drug is usually about 0.001 to 2000 mg, preferably about 0.01 to 500 mg, more preferably about 0.1 to about LOO mg, per kg body weight, for example, by oral administration. Yes, usually in 1 to 4 divided doses per day.
  • the concomitant drug of the present invention When administering the concomitant drug of the present invention, it may be administered at the same time, but after the concomitant drug is administered first, the TLR4 signaling inhibitor of the present invention may be administered, or the present invention may be administered.
  • a TLR4 signaling inhibitor may be administered first, followed by a concomitant drug.
  • the time difference depends on the active ingredient, dosage form, and method of administration. Although more different, for example, when the concomitant drug is administered first, within 1 minute to 3 days, preferably within 10 minutes to 1 day, more preferably within 15 minutes to 1 hour after administering the concomitant drug. Examples include a method of administering a TLR4 signaling inhibitor.
  • the TLR4 signal transduction inhibitor of the present invention When the TLR4 signal transduction inhibitor of the present invention is administered first, after administration of the TLR4 signal transduction inhibitor of the present invention, it is within 1 minute to 1 day, preferably within 10 minutes to 6 hours, more preferably 15 For example, a concomitant drug can be administered within 1 hour from the minute.
  • PCR polymerase chain reaction
  • TLR2 intracellular TIR domain TLR2 intracellular TIR domain
  • TLR4 intracellular TIR domain TLR4 intracellular TIR domain
  • Escherichia coli was transformed with the completed plasmid, and cultured in 10 mL of LB medium containing ampicillin at 37 ° C for 18 hours. Inoculate 2.4 mL of the bacterial solution into 130 mL of ampicillin-containing LB medium, shake culture, and when the OD force reaches around 0.9, add 1 mol / L isopropy ⁇ ⁇ -D-thiogalactopyranoside to 130
  • the plate was supplemented with ⁇ L and incubated at 30 ° C for 4 hours. After incubation, the cells were collected and supplemented with 10 mL of Lysis Buffer (10 mmol / L Tris pH 7.5, 150 nmol / L NaCl, 0.5% triton—X—100, 1 mmolp / L PMSF). The cells were sonicated and 300 L of Glutathione Sepharo se 4B (Amersham) was added to the supernatant obtained by centrifugation, and gently shaken at 4 ° C for 60 minutes. After the reaction, the GST fusion protein-bound beads were washed with 0.1% Triton X-100-added TBS (Tris buffered saline, 50 mM Tris-HC1 pH 7.5, 150 mM NaCl).
  • TBS Triton X-100-added TBS
  • the finished GST fusion protein-bound beads, H-A compound A (synthesized by Amersham) were reacted overnight at 4 ° C. After the reaction, wash the beads with 0.1% Triton X-100-added TBS, add 5% 2-mercapto oetnanol (Mti, 3 ⁇ 4'3 ⁇ 4 sodium dodecyl sulrate (SDS) -polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) sample buffer, and add 100 ° C. Centrifuge for 5 to 10 minutes, centrifuge and label the supernatant, collect as a protein sample, separate the protein by SDS-PAGE, fix the separated gel with 40% methanol-10% acetic acid solution CBB-stained (Fig.
  • a cDNA encoding TLR4 was obtained by a conventional method using the PCR method, and inserted into the expression vector pEFBos.
  • Each point mutant was prepared using the QuikChange II Site-directed Mutagenesis Kit manufactured by Stratagene. Primers were introduced with mismatches corresponding to mutations on both sides according to the kit instructions. The prepared primers are as follows (mutation sites are underlined). Thereafter, mutants were prepared according to the instructions of the kit, and the competent cells were transformed. A single colony was picked up, and a plasmid was prepared according to a conventional method. After confirming the DNA sequence, a plasmid containing each mutant TLR4 was obtained.
  • Escherichia coli was transformed with the prepared plasmid, and purified to about 500 to 700 g each using EndoFree® Plasmid Maxi Kit (Quiagen). Wash COS-7 from African green monkey kidney cells twice with OPTI-MEM (Invitrogen), add 10% FCS to the medium, and add OPTI-MEM 5mL from DMEM (Invitrogen) containing 100 ⁇ g / mL streptomycin and 100 U / mL penicillin. Changed to / dish.
  • Plasmids encoding FLAG-TLR4 WT or each mutant were transfected into COS-7 cells using PLUS Reagent (Invitrogen) and LipofectAMINE Reagent (Invitrogen) according to standard methods, and in the presence of 37 ° C and 5% CO. Incubate for hours. 20% FCS added DMEM 6.5 mL / di
  • the medium was replaced with 5 mL of DMEM supplemented with 1% FCS, and 3 H-compound A (synthesized by Amersham) was allowed to act at a final concentration of 100 nmol / L and cultured at 37 ° C in the presence of 5% CO for 6 hours.
  • ImL / dish lysis buffer (10 mmol / L Tris pH 7.5, 150 mmol / L NaCl, 0.1% Nonidet P—40, 0.05% 3— ((3— cholamidopropyl dimethyl ammonio-1 -propanesulfonate (CHAPS), 30 mmol / L NaF, 1 mmol / L Na VO and
  • Protease inhibitor cocktail (Sigma) The petri dish containing Lysis buffer was placed on ice for 15 minutes to solubilize the cells. Remove insoluble fraction by centrifugation (12000rpm, 4 ° C, lOmin) The supernatant was collected and used as total cell lysate.
  • the obtained total cell lysate was used for immunoprecipitation with an anti-FLAG antibody according to a conventional method.
  • Proteins are separated from the immunoprecipitate by SDS-PAGE, and the gel after electrophoresis is immersed in a blotting buffer for 15 minutes to remove the SDS. The gel is then adhered to a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane and wet transfer is performed. The protein in the gel was transferred to the PVDF membrane with the apparatus.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • HEK293 derived from human fetal kidney was suspended in DMEM supplemented with 10% FCS, seeded on a 96-well plate at 2 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured overnight at 37 ° C. in the presence of 5% CO. Transformation
  • the medium was replaced with OPTI-MEM (Invitrogen) 50 ⁇ L / well immediately before the incubation.
  • OPTI-MEM Invitrogen
  • the screening method of the present invention it is possible to select a substance that binds to the intracellular region of TLR4 and inhibits signal transmission of TLR4.
  • the obtained substance is used for heart disease, autoimmune disease, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for inflammatory diseases, central nervous system diseases, infectious diseases, sepsis, severe sepsis or boutique shock.

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Abstract

　本発明は、ＴＬＲ４の細胞内領域に結合し、該分子からのシグナル伝達を阻害する物質を選択することを特徴とする、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプシス、重症セプシスおよびセプティックショックからなる群より選択される１以上の疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法、並びにＴＬＲ４からのシグナルをレポーター遺伝子の発現を指標として検出し得る、（１）野生型ＴＬＲ４を発現する細胞および（２）変異型ＴＬＲ４を発現する細胞を含んでなる、該方法のためのキット。

Description

明 細 書
スクリーニング方法
技術分野
[0001] 本発明は、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、 セプシス、重症セプシスまたはセブティックショックの予防'治療薬をスクリーニングす る方法に関する。
背景技術
[0002] 特許文献 1には、（i)式：
[0003] [化 1]
Figure imgf000002_0001
[0004] [式中、 Rは置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよ い芳香族炭化水素基、置換基を有していてもよい複素環基、式：—OR1 (式中、 R1は 水素原子または置換基を有して 、てもよ 、脂肪族炭化水素基を示す。 )で表される 基または式：
[0005] [化 2]
Rlb
/
N
R
[0006] (式中、 Rlbは水素原子または置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を、 Rleは Rlbと同一または異なって、水素原子または置換基を有していてもよい脂肪族炭化水 素基を示す。）で表される基を示し、
R°は水素原子または脂肪族炭化水素基を示すか、ある!、は R1と R°は一緒になつて 結合手を形成し、
環 Aは（1)置換基を有して!/ヽてもよ ヽ脂肪族炭化水素基、 (2)置換基を有して!/ヽても よい芳香族炭化水素基、（3)式：—OR11 (式中、 R11は水素原子または置換基を有し て!、てもよ 、脂肪族炭化水素基を示す。 )で表される基および (4)ハロゲン原子力 選ばれる 1〜4個で置換されたシクロアルケンを示し、 Arは置換基を有して!/、てもよ い芳香族炭化水素基を示し、
式：
[0007] [化 3]
Figure imgf000003_0001
[0008] で表される基は、式:
[0009] [化 4]
( CH2 ) n A (C¾ ) n A
または
[0010] で表される基を示し、 nは 1〜4の整数を示す。 ]で表される化合物、および
(ii)式：
[0011] [化 5]
Figure imgf000003_0002
[0012] [式中、 Raは置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよ い芳香族炭化水素基、置換基を有していてもよい複素環基、式： ORla (式中、 Rla は水素原子または置換基を有して 、てもよ 、脂肪族炭化水素基を示す。 )で表され る基または式：
[0013] [化 6]
, 4 a
R
Figure imgf000003_0003
[0014] (式中、 R½および R5aは同一または異なって、水素原子または置換基を有していても よい脂肪族炭化水素基を示す。）で表される基を示し、
RQaは水素原子または脂肪族炭化水素基を示すか、あるいは Raと RQaは一緒になつて 結合手を形成し、
Araは置換基を有して 、てもよ 、芳香族炭化水素基を示し、
式：
[0015] [化 7]
(CH2) n
[0016] で表される基は、式:
[0017] [化 8]
Figure imgf000004_0001
[0018] で表される基を示し、
nは 1〜4の整数を示す。 ]で表される化合物、これらの化合物の塩並びにこれらのプ ロドラッグが、
また、特許文献 2には、式：
[0019] [化 9]
Figure imgf000004_0002
[0020] [式中、 R1は置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよ い芳香族炭化水素基、置換基を有していてもよい複素環基、式： ORla (式中、 Rla は水素原子または置換基を有して 、てもよ 、脂肪族炭化水素基を示す。 )で表され る基または式： [0021] [化 10]
Figure imgf000005_0001
[0022] (式中、 Rlbおよび Rleは同一または異なって、水素原子または置換基を有していても よい脂肪族炭化水素基を示す。）で表される基を示し、
Xはメチレン基、 NH、硫黄原子または酸素原子を示し、
Yは置換基を有して 、てもよ 、メチレン基または置換基を有して 、てもよ 、NHを示し 、環 Aは（1)置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基、（2)置換基を有していて もよい芳香族炭化水素基、（3)式： OR2 (式中、 R2は水素原子または置換基を有し て!ヽてもよ ヽ脂肪族炭化水素基を示す。 )で表される基および (4)ハロゲン原子から なる群より選ばれる 1乃至 4個の置換基を有して 、てもよ 、5な 、し 8員環を示し、 Arは置換基を有して ヽてもよ ヽ芳香族炭化水素基を示し、
式：
[0023] [化 11]
Figure imgf000005_0002
[0024] で表される基は式:
[0025] [化 12]
Figure imgf000005_0003
mは 0乃至 2の整数を示し、
nは 1乃至 3の整数を示し、
mと nの和は 4以下である；
ただし、 Xカ^チレン基の場合、 Yは置換基を有していてもよいメチレン基を示す。 ]で 表される化合物またはその塩あるいはそのプロドラッグが、一酸化窒素 (NO)産生抑 制作用および TNF— α、 IL 1、 IL 6などの炎症性サイト力イン産生抑制作用を 有しており、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、 セプシス、セブティックショックなどの疾患の予防'治療剤として有用であることが、そ れぞれ記載されている。
特許文献 3には、上記の化合物が TLRシグナル阻害剤、重症セプシスの予防'治 療剤として有用であることが記載されている。
特許文献 1：国際出願公開第 99Ζ46242号パンフレット
特許文献 2：国際出願公開第 01Z10826号パンフレット
特許文献 3：国際出願公開第 03Ζ84527号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0027] 本発明は、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、 セプシス、重症セプシスまたはセブティックショックの予防'治療薬をスクリーニングす るために有用な方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、上記疾患の予防 '治療薬をスクリーニングするために有用なキットを提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0028] 本発明者等は、上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、 TLR4のシ グナル伝達阻害作用を有し、セプシス等の治療薬として有用なシクロアルケンィ匕合 物が予想外にも TLR4の細胞内領域に結合することを見出した。本発明者らは、この 知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
[0029] すなわち、本発明は、
[1]TLR4の細胞内領域に結合し、該分子力 のシグナル伝達を阻害する物質を選 択することを特徴とする、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感 染性疾患、セプシス、重症セプシスおよびセブティックショック力 なる群より選択され る 1以上の疾患の予防 ·治療薬のスクリーニング方法、
[2]当該結合部位力 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 652〜839 で示される領域内に存在する 1以上のシスティン残基である、上記 [ 1 ]記載のスクリ 一二ング方法、
[3]当該結合部位が、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の第 706番目および Zま たは第 747番目のシスティン残基である、上記 [2]記載のスクリーニング方法、
[4]以下の（1)〜 (4)の工程を含む上記 [1]記載のスクリーニング方法、
(1) TLR4またはその細胞内領域を発現し、且つ NF— κ Βもしくは IRF3結合配列を 含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞（サンプル 1)と、 TLR4の細胞 内領域の 1以上のシスティン残基あるいはその近傍アミノ酸を他のアミノ酸に変異さ せた蛋白質またはその細胞内領域を発現し、且つ NF— κ Βもしくは IRF3結合配列 を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞 (サンプル 2)とをそれぞれ調 製する。
(2)試験化合物の存在下でサンプル 1およびサンプル 2をそれぞれ培養する。
(3)培養後、サンプル 1およびサンプル 2における当該遺伝子の発現を測定する。
(4)サンプル 1における当該遺伝子の発現量力 サンプル 2におけるそれに比べて 約 20%以上減少した場合に、当該試験化合物を、 TLR4の細胞内領域内で該分子 と結合して、該分子力ものシグナル伝達を阻害する物質として選択する。
[5]当該システィン残基が、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列の第 706番目および Ζまたは第 747番目のシスティン残基である、上記 [4]記載のスクリーニング方法、 [6] 当該遺伝子がレポーター遺伝子である、上記 [4]記載のスクリーニング方法、 [7]以下の（1)〜（2)の構成を含むことを特徴とする、 TLR4の細胞内領域に結合し て該分子力 のシグナル伝達を阻害する物質を選択するためのスクリーニングキット：
(1) TLR4またはその細胞内領域を発現し、且つ NF— κ Βもしくは IRF3結合配列を 含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞、
(2) TLR4の細胞内領域の 1以上のシスティン残基あるいはその近傍アミノ酸を他の アミノ酸に変異させた蛋白質またはその細胞内領域を発現し、且つ NF— κ Βもしく は IRF3結合配列を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞、および [8]TLR4の細胞内領域に結合して該分子力 のシグナル伝達を阻害する物質が、 心疾患、 自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプシス、重 症セプシスおよびセブティックショック力 なる群より選択される 1以上の疾患の予防 · 治療薬である上記 [7]記載のスクリーニングキットに関する。
発明の効果
[0030] 本発明のスクリーニング法は、試験化合物の TLR4の細胞内領域への結合と、該 結合による該受容体力 のシグナル伝達阻害を検定することにより、心疾患、自己免 疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプシス、重症セプシスまた はセブティックショックの予防 '治療活性を有する物質を効率よく選択し得るという効 果を奏する。
図面の簡単な説明
[0031] [図 1]TIRAP、 TLR2の TIRドメイン、 TLR4の TIRドメインと GSTとの融合蛋白質と3 Hラベルしたィ匕合物 Aとの反応物をゲル電気泳動したものの CBB染色像 (A)および オートラジオグラフ（B)を示す図である。レーン 1： GST;レーン 2： GST— TIRAP融 合蛋白質；レーン 3： GST— TLR2細胞内 TIRドメイン融合蛋白質；レーン 4： GST— TLR4細胞内 TIRドメイン融合蛋白質
[図 2]野生型 TLR4および各種変異 TLR4への3 Hラベルしたィ匕合物 Aの結合能を示 す図である。上段パネルは TLR蛋白質発現量を示すィムノブロット像、下段パネル は化合物 Aの結合を示すオートラジオグラフを示す。 ^^丁：野生型！^！^；！^八:！^ R4G666A (第 666番目の Cが Aに置換されていることを示す。以下同様） ; 2CA:TLRC 706A； 3CA： TLR4C747A； 4CA： TLRC831A； PH： TLRP714H ; 1KR: TLRK653R； 2KR： T LRK666R； 3KR： TLRK 4KR： TLRK729R； 5KR： TLRK732R； 6KR： TLRK 7K R： TLRK7?6R； 8KR： TLRK813R； 9KR： TLRK819R
[図 3]野生型 TLR4および各種変異 TLR4を発現する細胞を、化合物 A (図 3— 1)、化 合物 B (図 3— 2)、化合物 C (図 3— 3)、化合物 D (図 3— 4)の存在下および非存在 下で LPS刺激を与えて培養した場合の、 NF— κ Bの制御下にあるルシフェラーゼ 遺伝子の発現量を示す図である。 WT：野生型 TLR4； 1CA： TLR4C666A； 2CA： TL RC706A ; 3CA: TLR4C747A； 4CA： TLRC831A； PH： TLRP714H ; 1KR: TLRK653R； 2KR ： TLRK666R； 3KR： TLRK694R； 4KR： TLRK729R； 5KR： TLRK732R； 6KR： TLRK773R； 7 KR： TLRK776R； 8KR： TLRK813R； 9KR： TLRK819R； EV：ベクターのみ
[0032] 本発明のスクリーニング方法は、 TLR4の細胞内領域に結合し、 TLR4のシグナル 伝達を阻害する物質を選択することを特徴とする。
TLR4は 1回膜貫通型受容体であり、 N末端側から細胞外領域、膜貫通領域およ び細胞内領域を有する。「TLR4の細胞内領域」とは、例えば、配列番号： 2で表わさ れるヒト TLR4の場合、アミノ酸番号 652〜839で示されるアミノ酸配列からなる領域 を意味する。
「TLR4のシグナル伝達の阻害」としては、結果的に NF— κ Β依存性の炎症性サイ トカイン誘導や IRF3依存性のインターフェロンおよびインターフェロン誘導性遺伝子 の発現誘導に至らな 、限り、 TLR4力ものシグナル伝達の 、かなる過程を阻害しても よい。
[0033] 本発明のスクリーニング方法により選択される TLR4からのシグナル伝達阻害物質 は、 TLR4の細胞内領域のいかなる部位に結合してもよぐ細胞内領域の 1つの部位 に結合してもよいし、複数の部位に結合してもよい。好ましくは、該シグナル阻害物質 は、 TLR4の細胞内領域内の 1個以上のシスティン残基 (例えば、配列番号： 2で表 されるヒト TLR4の場合、該アミノ酸配列の第 664番目、第 706番目、第 747番目お よび第 831番目のシスティン残基）、より好ましくは、細胞質内におけるシグナル経路 を活性化する TolHL-1 receptor (TIR)ドメイン（ヒト TLR4の場合、配列番号： 2で表 されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 674〜839で示される領域）内に存在する 1個以 上のシスティン残基、さらに好ましくは、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の第 706 番目および Zまたは第 747番目のシスティン残基に結合する。
[0034] TLR4の細胞内領域に結合して該分子力 のシグナル伝達を阻害する物質を選択 する、本発明のスクリーニング方法は、 TLR4の細胞内領域の全部もしくは一部を含 むポリペプチドを用いることを特徴とする。
本発明のスクリーニング方法に用いられる上記ポリペプチドは、 目的とするシグナル 伝達阻害物質が標的とする結合部位を最低限含んでいればよぐ該結合部位は TL R4の細胞内領域内で任意に設定することができる力 好ましくは上記したシスティン 残基である。したがって、より好ましくは、本発明のスクリーニング方法に用いられるポ リペプチドは、少なくとも配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列の第 706番目および Zまたは第 747番目のシスティン残基を含む、該アミノ酸配列の部分アミノ酸配列を 含むポリペプチドである。該ポリペプチドの長さは、 目的とするシグナル伝達阻害物 質が標的とする結合部位に結合し得るに十分な隣接アミノ酸配列を含む限り特に制 限はなぐ例えば、 10アミノ酸以上、好ましくは 50アミノ酸以上、より好ましくは 100ァ ミノ酸以上、さらに好ましくは 200アミノ酸以上である。該ポリペプチド長の上限も特に 制限はないが、例えば TLR4の全長（ヒト TLR4の場合、 839アミノ酸（シグナルぺプ チドを含む)）等が挙げられる。
[0035] 例えば、該ポリペプチドの長さを短くすれば、シグナル伝達阻害物質の結合部位の 特定が容易となる反面、該ポリペプチドはシグナル伝達作用を喪失して 、る場合が 多いので、該ポリペプチドに結合した試験化合物について、シグナル伝達阻害作用 の有無を別途試験する必要がある。したがって、試験化合物の標的部位への結合と シグナル伝達阻害作用とを同時に検定するには、本発明で用いられるポリペプチド は、 TLR4がシグナル伝達作用を発揮するのに必要な領域を少なくとも含んで!/、る 必要があり、例えば、上記 TIRドメインを含むポリペプチド、細胞内領域全体を含む ポリペプチド、さらに膜貫通領域を含むポリペプチド、あるいは TLR4全長などである ことが望ましい。この場合、試験化合物が所望の標的部位に結合する力否かは、後 述するように、該標的部位のアミノ酸を欠失させる力 他のアミノ酸で置換したポリべ プチドを作製し、該ポリペプチドへの試験化合物の結合能の有無を調べることにより 検定することができる。
一方、該ポリペプチドと試験化合物との結合の検出を容易にする目的で、該ポリべ プチドは N末端もしくは C末端にタグを有する融合ポリペプチドとして提供されてもよ い。そのようなタグの例としては、 GSTタグ、 Hisタグ、 MBPタグ、 Flagタグ、などが挙 げられる。このようなタグ配列を含むポリペプチドは、それぞれダルタチオン、金属キ レート、マルトース、抗 Flag抗体担体を用いてプルダウンすることができ、試験化合物 を RI (例えば3 H、 35S、 32P等)などでラベルしておけば、該担体上のラベルを測定す ることにより容易に試験化合物の該ポリペプチドへの結合を検出することができる。
[0036] 本発明における TLR4蛋白質は、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
TLR4蛋白質は、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ノヽムスター、ゥ サギ、ヒッジ、ャギ、ブタ、ゥシ、ゥマ、トリ、ネコ、ィヌ、サル、チンパンジーなど）の細 胞 [例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、脾臓 j8細胞、骨髄細胞、メサンギゥム細 胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線 維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞 (例、マクロファージ、 T細胞、 B 細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、榭状細 胞）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細 胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など]も しくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織 [例えば、脳、脳の各部位 (例、嗅球、扁 桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体 、胃、脾臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消 化管 (例、大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、 卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋、腹膜など]に由来する蛋白質であ つてよく、また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で合成された蛋白質であってもよい。 あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸を導入された形質 転換体力ゝら産生された組換え蛋白質であってもよい。
配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列 番号： 2で表わされるアミノ酸配列と約 70%以上、好ましくは約 80%以上、さらに好ま しくは約 90%以上、特に好ましくは約 95%以上、最も好ましくは約 98%以上の相同 性を有するアミノ酸配列をいう。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の 数学的アルゴリズムを用いて 2つのアミノ酸配列をァラインさせた場合の、最適なァラ インメント (好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もし くは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする 全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合 (％)を意味する 。「類似アミノ酸」とは物理ィ匕学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、 芳香族アミノ酸 (Phe、 Trp、 Tyr)、脂肪族アミノ酸 (Ala、 Leu、 Ile、 Val)、極性アミノ酸（ Gln、 Asn)、塩基性アミノ酸（Lys、 Arg、 His)、酸性アミノ酸（Glu、 Asp)、水酸基を有す るアミノ酸（Ser、 Thr)、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、 Ala、 Ser、 Thr、 Met)などの同じグ ループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白 質の表現型に変化をもたらさない (即ち、保存的アミノ酸置換である)ことが予測され る。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載 されている（例えば、 Bowieら， Science, 247 : 1306-1310 (1990)を参照）。
[0038] 本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST
(National Center for Biotecnnology Information Basic Local Alignment search οοΐ) を用い、以下の条件（期待値 =10；ギャップを許す；マトリクス =BLOSUM62；フィルタリ ング =OFF)にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他の アルゴリズムとしては、例えば、 Karlinら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 5873-5877 ersion 2.0)に組み込まれている（Altschulら， Nucleic Acids Res., 25 : 3389-3402 (19 97)) ]、 Needlemanら， J. Mol. Biol, 48 : 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム [該ァ ルゴリズムは GCGソフトウェアパッケージ中の GAPプログラムに組み込まれて!/、る]、 Myersおよび Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズム は CGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である ALIGNプログラム（versi on 2.0)に組み込まれている]、 Pearsonら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-244 8 (1988)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは GCGソフトウェアパッケージ中の FA STAプログラムに組み込まれている]等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ 得る。
[0039] より好ましくは、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号： 2で表わされるアミ ノ酸配列と約 70%以上、好ましくは約 80%以上、さらに好ましくは約 90%以上、特 に好ましくは約 95%以上、最も好ましくは約 98%以上の同一性を有するアミノ酸配 列である。
[0040] 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と「実質的に同一のアミノ酸配列を含有する 蛋白質」とは、前記の配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ 酸配列を含有し、配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的 に同質の活性を有する蛋白質をいう。
「実質的に同質の活性」とは、 (1)シグナル伝達活性 (即ち、 LPS刺激により NF— κ Bおよび Zまたは IRF3の活性ィ匕をし、炎症性サイト力インおよび Zまたはインター フエロンおよびインターフェロン誘導性遺伝子の発現を誘導する活性）、並びに (2) T LR4の細胞内領域に結合して上記シグナル伝達を阻害する化合物との結合活性を いう。実質的に同質とは、それらの活性が定性的に同様であることを示す。従って、シ グナル伝達活性およびシグナル伝達阻害物質との結合活性が同等であることが好ま しいが、これらの活性の程度、蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよ い（例えば、活性については、約 0. 01〜約 100倍、好ましくは約 0. 1〜約 10倍、より 好ましくは約 0. 5〜約 2倍の範囲内が挙げられる）。
TLR4のシグナル伝達活性は、公知の方法、例えば、 TLR4発現細胞における炎 症性サイト力イン（例えば、 TNF a、 IL— 1、 IL— 6、 IFN— γ等）やインターフェロン (IFN - β、 IFN— α )もしくはインターフェロン誘導性遺伝子（例えば、 IP— 10、 GA RG16、 IRG— 1等）の発現変動を測定したり、転写因子 (例えば、 NF- κ B、 IRF3 、 ΑΡ— 1、 C/EBP)の活性ィ匕を、それらの転写因子に特異的なシスエレメントを含む プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子の発現を指標として測定することがで きるが、それらに限定されない。一方、シグナル伝達阻害物質との結合活性は、例え ば、上述のプルダウンアツセィゃ表面プラズモン共鳴（SPR)、蛍光エネルギー転移 等を用いて測定することができる。あるいは後述するように、所望の標的部位のァミノ 酸を欠失させるか、他のアミノ酸で置換した変異ポリペプチドを別に作製し、野生型 ポリペプチドと変異ポリペプチドのそれぞれについて試験化合物の存在下で上記の ようにしてシグナル伝達活性を測定することにより、試験化合物の結合活性とシグナ ル伝達阻害とを一括して検定することもできる。
また、本発明で用いられる TLR4には、例えば、 (1)配列番号： 2で表されるアミノ酸 配列の 1または 2個以上 (例えば 1〜50個程度、好ましくは 1〜30個程度、より好まし くは 1〜10個程度、さらに好ましくは 1〜5個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（2) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 (例えば 1〜50個程度、好ま しくは 1〜30個程度、より好ましくは 1〜： L0個程度、さらに好ましくは 1〜5個）のァミノ 酸が付加したアミノ酸配列、（3)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以 上 (例えば 1〜50個程度、好ましくは 1〜30個程度、より好ましくは 1〜10個程度、さ らに好ましくは 1〜5個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（4)配列番号： 2で表さ れるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (例えば 1〜50個程度、好ましくは 1〜30個程 度、より好ましくは 1〜： LO個程度、さらに好ましくは 1〜5個）のアミノ酸が他のアミノ酸 で置換されたアミノ酸配列、または (5)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する 蛋白質も含まれる。
但し、 1または 2個以上のアミノ酸を欠失する場合、該欠失部位は所望のシグナル 伝達阻害物質の結合部位以外の部位であり、好ましくは細胞内領域のシスティン残 基およびその近傍以外の部位である。また、 1または 2個以上のアミノ酸が挿入される 力 他のアミノ酸で置換される場合、所望のシグナル伝達阻害物質の結合部位以外 の部位 (好ましくは細胞内領域のシスティン残基およびその近傍以外の部位)である 力 あるいは当該部位であっても、その挿入もしくは置換の結果、当該部位の活性（ 即ち、当該部位に結合する TLR4シグナル伝達阻害物質と結合する活性）に質的な 影響を与えな 、ものである必要がある。
[0042] 本明細書に記載される蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左 端力 末端 (ァミノ末端)、右端力 末端 (カルボキシル末端)である。本発明のスクリ 一-ング方法に用いられる TLR4は、 C末端がカルボキシル基（― COOH)、カルボ キシレート (― COO_)、アミド（― CONH )またはエステル（― COOR)の何れであつ
2
てもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、例えば、メチル、ェチル、 n—プロピル、イソプロ ピル、 n—ブチルなどの C アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロへキシルな
1-6
どの C シクロアルキル基；例えば、フエ-ル、 α—ナフチルなどの C ァリール基
3-8 6-12
；例えば、ベンジル、フエネチルなどのフエ-ルー C アルキル基； (X ナフチルメチ
1-2
ルなどの α ナフチルー C アルキル基などの C ァラルキル基；ピバロイルォキ
1-2 7-14
シメチル基などが用いられる。
TLR4が C末端以外にカルボキシル基 (またはカルボキシレート）を有して ヽる場合 、カルボキシル基がアミドィ匕またはエステルイ匕されて ヽるものも本発明の TLR4に含 まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した C末端のエステルなどが用いら れる。
[0043] さらに、 TLR4〖こは、 Ν末端のアミノ酸残基 (例、メチォニン残基)のァミノ基が保護 基（例えば、ホルミル基、ァセチル基などの C アルカノィルなどの C ァシル基な
1 -6 1 -6
ど)で保護されて ヽるもの、生体内で切断されて生成する N末端のグルタミン残基が ピログルタミン酸ィ匕したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 (例えば— OH、 一 SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グァ -ジノ基など）が適当な保護基 (例 えば、ホルミル基、ァセチル基などの C アルカノィル基などの C ァシル基など）
1 -6 1 -6
で保護されて 、るもの、あるいは糖鎖が結合した 、わゆる糖蛋白質などの複合蛋白 質なども含まれる。
[0044] 本発明で用いられる TLR4の部分ペプチドは、上記した TLR4の部分アミノ酸配列
(即ち、細胞内領域の一部もしくは全部の配列）を有し、且つ TLR4と実質的に同質 の活性を有するペプチドである。ここで「実質的に同質の活性」とは TLR4の細胞内 領域に結合して上記シグナル伝達を阻害する化合物との結合活性を 、う。好ましく は、該部分ペプチドは、シグナル伝達活性 (即ち、 LPS刺激により NF— κ Bおよび Zまたは IRF3の活性ィ匕をし、炎症性サイト力インおよび Zまたはインターフェロンお よびインターフェロン誘導性遺伝子の発現を誘導する活性)をさらに保持するもので ある。「実質的に同質の活性」の測定は TLR4において上記したと同様の方法で行う ことができる。
本明細書においては、 TLR4蛋白質および当該部分ペプチドを、以下「阻害物質 結合型ポリペプチド」と称することもある。
[0045] TLR4の部分ペプチドは、 C末端がカルボキシル基（— COOH)、カルボキシレート
(― COO-)、アミド（一 CONH )またはエステル（一COOR)の何れであってもよい。
2
ここでエステルにおける Rとしては、 TLR4について前記したと同様のものが挙げられ る。これらのペプチドが C末端以外にカルボキシル基 (またはカルボキシレート）を有 して 、る場合、カルボキシル基がアミドィ匕またはエステルイ匕されて 、るものも本発明の 部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した C末端のェ ステルなどが用いられる。
[0046] さらに、 TLR4の部分ペプチドには、上記した TLR4と同様に、 N末端のメチォニン 残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成した Ginがピログルタミン酸ィ匕したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保 護基で保護されて ヽるもの、あるいは糖鎖が結合した ヽゎゆる糖ペプチドなどの複合 ペプチドなども含まれる。
[0047] TLR4またはその部分ペプチドは遊離体であってもよ!/、し、塩であってもよ!/、。 TLR 4またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩 が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩として は、例えば、無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有 機酸 (例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、 クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩 などが用いられる。
[0048] 一方、 TLR4またはその部分ペプチドにお 、て、所望のシグナル伝達阻害物質の 結合部位 (好ましくは細胞内領域のシスティン残基、例えば、配列番号： 2で表される ヒト TLR4においては、該アミノ酸配列の第 664番目、第 706番目、第 747番目およ び第 831番目のシスティン残基の 1以上、より好ましくは第 706番目および Zまたは 第 747番目のシスティン残基）が欠失する力 あるいは他のアミノ酸 (例えば、ァラ- ン、グリシン、パリン、ロイシン、イソロイシンなどが挙げられる力 それらに限定されな い。好ましくはァラニンが挙げられる）で置換されたポリペプチドは、目的とするシグナ ル伝達阻害物質に対する結合活性がないので、該標的結合部位に特異的に結合し てシグナル伝達を阻害する化合物と接触させてもこれと結合しない。また、当該変異 部分ペプチドがシグナル伝達活性をさらに保持するものである場合、該標的結合部 位に特異的に結合してシグナル伝達を阻害する化合物と接触させてもシグナル伝達 は阻害されない。
本明細書においては、当該変異 TLRおよび変異部分ペプチドを、以下「阻害物質 非結合型ポリペプチド」と称することもある。
[0049] TLR4またはその塩は、前述した温血動物の細胞または組織から自体公知の蛋白 質の精製方法によって調製することができる。具体的には、温血動物の組織または 細胞をホモジナイズし、可溶性画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトダラ フィ一、ァフィユティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等で分離精製するこ とによって、 TLR4またはその塩を製造することができる。 [0050] TLR4またはその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することも できる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。 T LR4を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保 護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することが できる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の (1)〜(5)に記載 された方法に従って行われる。
(1) M. Bodanszkyおよび M.A. Ondettiゝペプチド 'シンセシス (Peptide Synthesis), In terscience Publishers, New York (196り年
(2) Schroederおよび Luebke、ザ、ペプチド (The Peptide), Academic Press, New York (1965年）
(3)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株）（1975年）
(4)矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、 蛋白質の化学 IV、 205、（1977 年）
(5)矢島治明監修、続医薬品の開発、第 14卷、ペプチド合成、広川書店
[0051] このようにして得られた TLR4またはその部分ペプチドは、公知の精製法により単離 •精製することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロ マトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられ る。
[0052] 上記方法で得られる TLR4またはその部分ペプチドが遊離体である場合には、該 遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することが できるし、逆に TLR4またはその部分ペプチドが塩として得られた場合には、該塩を 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換すること ができる。
[0053] TLR4またはその部分ペプチドの合成には、通常市販の蛋白質合成用榭脂を用い ることができる。そのような榭脂としては、例えば、クロロメチル榭脂、ヒドロキシメチル 榭脂、ベンズヒドリルアミン榭脂、アミノメチル榭脂、 4一べンジルォキシベンジルアル コール榭脂、 4—メチルベンズヒドリルアミン榭脂、 PAM榭脂、 4ーヒドロキシメチルメチ ルフエ-ルァセトアミドメチル榭脂、ポリアクリルアミド榭脂、 4— (2' , 4，—ジメトキシフ ェ-ル—ヒドロキシメチル）フエノキシ榭脂、 4— (2' , 4，—ジメトキシフエ-ルー Fmoc アミノエチル)フエノキシ榭脂などを挙げることができる。このような榭脂を用い、 a - ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とする蛋白質もしくはべプチ ドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、榭脂上で縮合させる。反応の最 後に樹脂から蛋白質 (ペプチド)を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高 希釈溶液中で分子内ジスルフイド結合形成反応を実施し、 目的の蛋白質 (ペプチド） またはそのアミド体を取得する。
[0054] 上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性ィ匕試 薬を用いることができる力 特に、カルポジイミド類がよい。カルポジイミド類としては、 DCC、 N, N，—ジイソプロピルカルボジイミド、 N—ェチル— N， - (3—ジメチルアミ ノプロリル)カルポジイミドなどが用いられる。これらによる活性ィ匕にはラセミ化抑制添 加剤（例えば、 HOBt、 HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するカゝ、また は、対称酸無水物または HOBtエステルあるいは HOOBtエステルとしてあらかじめ 保護アミノ酸の活性ィ匕を行なった後に樹脂に添加することができる。
[0055] 保護アミノ酸の活性ィ匕ゃ榭脂との縮合に用いられる溶媒は、蛋白質縮合反応に使 用しうることが知られている溶媒力も適宜選択されうる。例えば、 N, N—ジメチルホル ムアミド、 N, N—ジメチルァセトアミド、 N—メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メ チレン、クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルォロエタノールなどのァ ルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどのアミン類、ジ ォキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ァセトニトリル、プロピオ二トリルなどの 二トリル類、酢酸メチル、酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合 物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知ら れている範囲力も適宜選択され、通常約— 20°C〜50°Cの範囲から適宜選択される 。活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1.5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応 を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反 応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な 縮合が得られな 、ときには、無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応ァ ミノ酸をァセチルイ匕することができる。
[0056] 原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および用いられる保護基、その保護 基の脱離、並びに反応に関与する官能基の活性化などは、公知の基または公知の 手段から適宜選択しうる。
原料のァミノ基の保護基としては、例えば、 Z、 Boc、ターシャリーペンチルォキシカ ルボニル、イソボルニルォキシカルボニル、 4ーメトキシベンジルォキシカルボニル、 Cl—Z、 Br— Z、ァダマンチルォキシカルボ-ル、トリフルォロアセチル、フタロイル、 ホルミル、 2— -トロフエ-ルスルフエ-ル、ジフエ-ルホスフイノチオイル、 Fmocなど が用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、ェチル、プロピ ル、ブチル、ターシャリーブチノレ、シクロペンチル、シクロへキシル、シクロへプチノレ、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステ ル化）、ァラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、 4 -トロベンジルエステ ノレ、 4ーメトキシペンジノレエステノレ、 4 クロ口べンジノレエステノレ、べンズヒドリノレエステ ル化）、フエナシルエステル化、ベンジルォキシカルボ-ルヒドラジド化、ターシャリー ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができ る。
[0057] セリンの水酸基は、例えば、エステルイ匕またはエーテルィ匕によって保護することが できる。このエステルイ匕に適する基としては、例えば、ァセチル基などの低級アルカノ ィル基、ベンゾィル基などのァロイル基、ベンジルォキシカルボ-ル基、エトキシカル ボニル基などの炭酸力 誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する 基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロビラニル基、 t ブチル基などである。 チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、例えば、 Bzl、 C1— Bzl、 2— -ト
2
口ベンジル、 Br— Z、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、 Tos、 4ーメトキシ 2, 3, 6— トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、ベンジルォキシメチル、 Bum、 Boc、 Trt、 Fm ocなどが用いられる。 [0058] 保護基の除去 (脱離)方法としては、例えば、 Pd—黒あるいは Pd—炭素などの触 媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン 酸、トリフルォロメタンスルホン酸、トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混合液などによ る酸処理や、ジイソプロピルェチルァミン、トリェチルァミン、ピぺリジン、ピぺラジンな どによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上 記酸処理による脱離反応は、一般に約— 20°C〜40°Cの温度で行なわれる力 酸処 理においては、例えば、ァ-ソール、フエノール、チオア-ノール、メタクレゾール、パ ラタレゾール、ジメチルスルフイド、 1, 4 ブタンジチオール、 1, 2 エタンジチォー ルなどのようなカチオン捕捉剤の添カ卩が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール 保護基として用いられる 2, 4 ジニトロフエ-ル基はチオフヱノール処理により除去さ れ、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1, 2—ェ タンジチオール、 1, 4 ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外 に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去さ れる。
[0059] 原料のカルボキシル基の活性ィ匕されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、 アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフエノール、 2, 4, 5 トリクロ 口フエノール、 2, 4 ジ-トロフエノール、シァノメチルアルコール、パラ-トロフエノー ル、 HONB、 N ヒドロキシスクシミド、 N ヒドロキシフタルイミド、 HOBt)とのエステ ル〕などが用いられる。原料のァミノ基の活性ィ匕されたものとしては、例えば、対応す るリン酸アミドが用いられる。
[0060] 蛋白質 (ペプチド)のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、蛋白質 (ぺプ チド)を構成する部分ペプチドの各 C末端アミノ酸の a—カルボキシル基をアミドィ匕し て保護し、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長（隣接する部分ペプチドの C末端ァ ミノ酸と連結されるべきアミノ酸)まで延ばした後、 C末端側ペプチド鎖の N末端アミノ 酸の (Xーァミノ基の保護基のみを除いたペプチドと、 N末端側ペプチド鎖の C末端ァ ミノ酸のカルボキシル基の保護基のみを除 、たペプチドとを製造し、これらのぺプチ ドを上記したような混合溶媒中で縮合させる方法が挙げられる。縮合反応の詳細に ついては上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質 (保護ペプチド)を精製 した後、上記方法によって保護基を除去し、所望の粗蛋白質 (粗ペプチド)を得ること ができる。この粗蛋白質 (粗ペプチド)は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主 要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質 (ペプチド)のアミド体を得ることができる
[0061] 蛋白質 (ペプチド）のエステル体は、例えば、 C末端アミノ酸の α—カルボキシル基 を所望のアルコール類と縮合してアミノ酸エステルとした後、上記のアミド体の場合と 同様に処理して得ることができる。
[0062] TLR4の部分ペプチドまたはその塩は、 TLR4またはその塩を適当なぺプチダー ゼで切断すること〖こよっても製造することができる。
[0063] さらに、 TLR4またはその部分ペプチドは、それをコードする核酸を含有する形質 転換体を培養し、得られる培養物から TLR4またはその部分ペプチドを分離精製す ること〖こよって製造することもできる。
TLR4またはその部分ペプチドをコードする核酸は DNAであっても RNAであって もよぐあるいは DNAZRNAキメラであってもよい。好ましくは DNAが挙げられる。ま た、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖 D NA、二本鎖 RNAまたは DNA: RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、セン ス鎖 (即ち、コード鎖)であっても、アンチセンス鎖 (即ち、非コード鎖)であってもよい
[0064] TLR4またはその部分ペプチドをコードする DNAとしては、ゲノム DNA、温血動物
(例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ノ、ムスター、ゥサギ、ヒッジ、ャギ、ブタ、ゥシ 、ゥマ、トリ、ネコ、ィヌ、サル、チンパンジーなど）のあらゆる細胞 [例えば、脾細胞、 神経細胞、グリア細胞、脾臓 j8細胞、骨髄細胞、メサンギゥム細胞、ランゲルノヽンス細 胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、 免疫細胞（例、マクロファージ、 T細胞、 B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、 好中球、好塩基球、好酸球、単球、榭状細胞）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細 胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の 前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞などや血球系の細胞]、あるいはそれらの細胞が 存在するあらゆる組織 [例えば、脳、脳の各部位 (例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、 海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭 葉、被殻、尾状核、脳染、黒質)、脊髄、下垂体、胃、脾臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲 状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管 (例、大腸、小腸)、血管、心臓、 胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関 節、骨格筋、腹膜など]由来の cDNA、合成 DNAなどが挙げられる。 TLR4またはそ の部分ペプチドをコードするゲノム DNAおよび cDNAは、上記した細胞'組織より調 製したゲノム DNA画分および全 RNAもしくは mRNA画分をそれぞれ铸型として用 い、 Polymerase Chain Reaction (以下、「PCR法」と略称する）および Reverse Transcr iptase-PCR (以下、「RT— PCR法」と略称する）によって直接増幅することもできる。 あるいは、 TLR4またはその部分ペプチドをコードするゲノム DNAおよび cDNAは、 上記した細胞 ·組織より調製したゲノム DNAおよび全 RNAもしくは mRNAの断片を 適当なベクター中に挿入して調製されるゲノム DNAライブラリーおよび cDNAライブ ラリーから、コロニーもしくはプラークノ、イブリダィゼーシヨン法または PCR法などによ り、それぞれクローユングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、ノクテ リオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
[0065] TLR4をコードする DNAとしては、例えば、配列番号： 1で表される塩基配列を含 有する DNA、あるいは配列番号： 1で表される塩基配列の相補鎖配列とハイストリン ジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、前記した配列番号： 2で表 されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 (即ち、シグナル伝達活 性および標的結合部位での TLR4シグナル伝達阻害物質との結合活性など）を有す る蛋白質をコードする DNAなどが挙げられる。
配列番号： 1で表される塩基配列の相補鎖配列とハイストリンジ ントな条件下でノ、 イブリダィズできる DNAとしては、例えば、配列番号： 1で表される塩基配列と約 60 %以上、好ましくは約 70%以上、さらに好ましくは約 80%以上、特に好ましくは約 90 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
[0066] 本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (N ational し enter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を 用い、以下の条件（期待値 =10 ;ギャップを許す；フィルタリング =ON;マッチスコア =1； ミスマッチスコア =-3)にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するため の他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様 に好ましく例示される。
[0067] ノ、イブリダィゼーシヨンは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モ レキユラ一.クロー-ング（Molecular Cloning)第 2版（J. Sambrook et al, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、巿販 のライブラリーを使用する場合、ハイブリダィゼーシヨンは、添付の使用説明書に記載 の方法に従って行なうことができる。ハイブリダィゼーシヨンは、好ましくは、ハイストリ ンジェントな条件に従って行なうことができる。
[0068] ハイストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約 19〜約 40mM、 好ましくは約 19〜約 20mMで、温度が約 50〜約 70°C、好ましくは約 60〜約 65°Cの 条件等が挙げられる。特に、ナトリウム塩濃度が約 19mMで温度が約 65°Cの場合が 好ましい。当業者は、ハイブリダィゼーシヨン溶液の塩濃度、ハイブリダゼーシヨン反 応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダィゼーシヨン 反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のスト リンジエンシーに容易に調節することができる。
[0069] TLR4をコードする DNAは、好ましくは配列番号： 1で表される塩基配列を含有す るヒト TLR4DNAもしくはそのアレル変異体、または他の温血動物（例えば、マウス、 ラット、モルモット、ノヽムスター、ゥサギ、ヒッジ、ャギ、ブタ、ゥシ、ゥマ、トリ、ネコ、ィヌ 、サル、チンパンジーなど）におけるそのオルソログ（ortholog)等である。
[0070] 阻害物質結合型ポリペプチド (部分ペプチド）をコードする DNAは、 TLR4の細胞 内領域の全部もしくは一部 [目的とする TLR4シグナル伝達阻害物質の標的結合部 位 (好ましくは細胞内領域のシスティン残基、例えば、配列番号： 2で表されるヒト TL R4においては、該アミノ酸配列の第 664番目、第 706番目、第 747番目および第 83 1番目のシスティン残基の 1個以上、より好ましくは第 706番目および Zまたは第 747 番目のシスティン残基)を少なくとも含む]をコードする塩基配列を含むものであれば Vヽかなるものであってもよ!/、。
[0071] また、阻害物質非結合型ポリペプチドをコードする DNAは、 TLR4もしくはその部 分ペプチドをコードする塩基配列において、目的とする TLR4シグナル伝達阻害物 質の標的結合部位 (好ましくは細胞内領域のシスティン残基、例えば、配列番号： 2 で表されるヒト TLR4においては、該アミノ酸配列の第 664番目、第 706番目、第 747 番目および第 831番目のシスティン残基の 1以上、より好ましくは第 706番目および Zまたは第 747番目のシスティン残基)をコードするコドンが欠失する力、あるいは他 のアミノ酸（例えば、ァラニン、グリシン、ノ リン、ロイシン、イソロイシンなどが挙げられ る力 それらに限定されない。好ましくはァラニンが挙げられる）をコードするコドンで 置換された塩基配列を含むものであれば 、かなるものであってもよ 、。
[0072] TLR4またはその部分ペプチドをコードする DNAは、該蛋白質またはペプチドをコ ードする塩基配列の一部分を有する合成 DNAプライマーを用いて PCR法によって 増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだ DNAを、本発明の蛋白質の 一部あるいは全領域をコードする DNA断片もしくは合成 DNAを標識したものとハイ ブリダィゼーシヨンすることによってクロー-ングすることができる。ハイブリダィゼーシ ヨンは、例えば、モレキュラー 'クローユング (Molecular Cloning)第 2版 (前述）に記載 の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイ ブリダィゼーシヨンは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従つ て行うことができる。
[0073] DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、 Mutan™-super Express Km (宝酒造（ 株））、 Mutan™- K (宝酒造 (株））等を用いて、 ODA- LA PCR法、 Gapped duplex法、 K unkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することがで きる。従って、阻害物質非結合型ポリペプチドをコードする DNAは、阻害物質結合 型ポリペプチドをコードする DNAに、上記方法に従って変異を導入することにより得 ることがでさる。
[0074] クローンィ匕された DNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化 するか、リンカ一を付加した後に、使用することができる。該 DNAはその 5 '末端側に 翻訳開始コドンとしての ATGを有し、また 3 '末端側には翻訳終止コドンとしての TA A、 TGAまたは TAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドン は、適当な合成 DNAアダプターを用いて付加することができる。 [0075] 上記の TLR4またはその部分ペプチドをコードする DNAを含む発現ベクターで宿 主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該蛋白質またはぺプ チドを製造することができる。
TLR4またはその部分ペプチドをコードする DNAを含む発現ベクターは、例えば、 TLR4をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、該 DNA断片を適当 な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
[0076] 発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、 pBR322、 pBR325、 pUC12 、 pUC13)；枯草菌由来のプラスミド（例、 pUB110、 pTP5、 pC194)；酵母由来プラ スミド（f列、 pSH19、 pSH15)； λファージなどのバタテリオファージ；レトロゥイノレス、 ワクシニアウィルス、バキュロウィルスなどの動物ウィルス； pAl— 11、 pXTl、 pRc/ CMV、 pRc/RSV, pcDNAlZNeoなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター であれば!/、かなるものでもよ！/、。
[0077] 例えば、宿主が動物細胞である場合、 SR aプロモーター、 SV40プロモーター、 L TRプロモーター、 CMV (サイトメガロウイノレス）プロモーター、 HSV-TKプロモータ 一などが用いられる。なかでも、 CMVプロモーター、 SR aプロモーターなどが好まし い。
宿主がェシエリヒア属菌である場合、 trpプロモーター、 lacプロモーター、 recAプロ モーター、 λ Ρプロモーター、 Ιρρプロモーター、 Τ7プロモーターなどが好ましい。
L
宿主がバチルス属菌である場合、 SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 penP プロモーターなどが好まし 、。 宿主が酵母である場合、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモー ター、 ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、 P10プロモーターなどが好 ましい。
[0078] 発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりェンノヽンサ一、スプライシングシグ ナル、ポリ A付カ卩シグナル、選択マーカー、 SV40複製オリジン（以下、 SV40oriと略 称する場合がある）などを含有して 、るものを用いることができる。選択マーカーとし ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、 dhfrと略称する場合がある）遺伝子〔メソ トレキセート（MTX)耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、 Amp1と略称する場合が ある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、 Neo1と略称する場合がある、 G418耐性)等 が挙げられる。特に、 dhfr遺伝子欠損チャイニーズノヽムスター卵巣細胞を用い、 dhf r遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地 によって選択することもできる。
[0079] また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナル コドン）を、 TLR4またはその部分ペプチドをコードする DNAの 5 '末端側に付加する 力 あるいはネイティブなシグナル配列 (もしくはプレブ口配列）と置換してもよい。宿 主がェシエリヒア属菌である場合、 PhoA'シグナル配列、 ΟπιρΑ·シグナル配列など 力 宿主がバチルス属菌である場合、 a アミラーゼ 'シグナル配列、サブチリシン' シグナル配列などが；宿主が酵母である場合、 MF o; ·シグナル配列、 SUC2 'シグナ ル配列などが；宿主が動物細胞である場合、インシュリン 'シグナル配列、 a インタ 一フエロン'シグナル配列、抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
[0080] 宿主としては、例えば、エシ リヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli) K12 ' DHl〔プロシー ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミ^ ~ ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエス エー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 60卷, 160(1968)〕、 JM103〔ヌクイレック'ァシ ッズ 'リサーチ（Nucleic Acids Research) , 9卷， 309(1981)〕、 JA221〔ジャーナル' ォブ 'モレキュラ^ ~ ·バイオロジー（Journal of Molecular Biology) , 120卷， 517(197 8)〕、 HB101〔ジャーナル'ォブ 'モレキユラ一'バイオロジー， 41卷， 459(1969)〕、 C600〔ジェネティックス（Genetics) , 39卷， 440(1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、枯草菌（Bacillus subtilis) MI114〔ジーン， 24卷， 255(1983)] , 207— 21〔ジャーナル ·ォブ'バイオケミストリー（Journal of Biochemist ry) , 95卷， 87(1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) A H22、 AH22R―、 NA87—11A、 DKD— 5D、 20B—12、シゾサッカロマイセス ポ ンべ（Schizosaccharomyces pombe) NCYC1913、 NCYC2036、ピキア パストリス（ Pichia pastoris) KM71などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウィルスが AcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細 胞（Spodoptera frugiperda cell ; Sf細胞）、 Trichoplusia niの中腸由来の MG1細胞、 T richoplusia niの卵由来の High Five 細胞、 Mamestra brassicae由来の糸田胞、 Estigme na acrea由来の細胞などが用いられる。ウィルスが BmNPVの場合、昆虫細胞として は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N細胞； BmN細胞）などが用いられる。該 Sf細 胞としては、例えば、 Sf9細胞（ATCC CRL1711)、 Sf21細胞（以上、 Vaughn, J丄.ら， イン.ヴイボ（In Vivo) , 13, 213-217 (1977))などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら，ネイチヤー（Nature) , 315卷， 592 (1985)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞 COS— 7、 Vero、チャイニーズノヽムスター卵 巣細胞（以下、 CHO細胞と略記）、 dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター卵巣細 胞（以下、 CHO (dhfr—)細胞と略記）、マウス L細胞、マウス AtT— 20、マウスミエ口 一マ細胞、ラット GH3細胞、ヒト FL細胞、 HEK293細胞、 HeLa細胞などが用いられ る。
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
ェシエリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ 'ォブ ·ザ'ナショナル'ァカデミ一'ォ ブ.サイェンジィズ.ォブ.ザ.ユーエスエー（proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69卷， 21 10 (1972)やジーン（Gene) , 17卷， 107(1982)などに記載の方法に従って形質転 換することができる。
バチルス属菌は、例えば、モレキュラ^ ~ ·アンド'ジェネラル 'ジェネティックス（Molec ular & General Genetics) , 168卷， 111 (1979)などに記載の方法に従って形質転 換することができる。
酵母は、例えば、メソッズ'イン'ェンザィモロジ一（Methods in Enzymology) , 194 卷， 182—187 (1991)、プロシージングズ ·ォブ 'ザ'ナショナル 'ァ力デミ一 ·ォブ · サイェンシィズ.ォブ.ザ.ユーエスエー（proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75卷， 1929( 1978)などに記載の方法に従って形質転換することができる。 昆虫細胞および昆虫は、例えば、バイオ Zテクノロジー（Bio/Technology) ,6卷， 47 - 55 (1988)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロトコール. 263— 267 (1995) (秀潤社発行）、ヴイロロジー（Virology) , 52卷， 456 (1973)に記載の方法 に従って形質転換することができる。
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することがで きる。
例えば、宿主がェシエリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する 場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換 体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、 炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素 源としては、例えば、アンモ-ゥム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ'リカー、ペプトン 、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機 物としては、例えば、塩ィ匕カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなど がそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子など を添カ卩してもよい。培地の pHは、好ましくは約 5〜8である。
宿主がェシエリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば
、グルコース、カザミノ酸を含む M9培地〔ミラー（Miller) ,ジャーナル'ォブ'エタスぺ リメンッ'イン'モレキュラー 'ジェネティックス (Journal of Experiments in Molecular Ge netics) , 431— 433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕力好まし!/ヽ 。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、 3 |8—インドリルァク リル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がェシエリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約 15〜43°Cで、約 3〜2 4時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約 30〜40°Cで、約 6〜24 時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホ 一ルダー（Burkholder)最小培地〔Bostian, K.しら、プロシージングズ 'ォブ 'ザ'ナシ ョナル 'アカデミ^ ~·ォブ'サイェンシィズ'ォブ'ザ 'ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. S ci. USA) , 77卷， 4505 (1980)〕や 0.5%カザミノ酸を含有する SD培地 [Bitter, G. A .ら、プロシージングズ ·ォブ ·ザ'ナショナル 'ァ力デミ一 ·ォブ ·サイェンシィズ 'ォブ' ザ'ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 81卷， 5330 (1984)〕など力挙げ られる。培地の pHは、好ましくは約 5〜8である。培養は、通常約 20°C〜35°Cで、約 24〜72時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
[0083] 宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例 えば Grace's Insect Medium (Grace, T.C.C.,ネイチヤー（Nature) , 195卷， 788 (196 2) )に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜カ卩えたものなどが用いられる。培 地の pHは、好ましくは約 6. 2〜6. 4である。培養は、通常約 27°Cで、約 3〜5日間 行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
[0084] 宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約 5 〜20%の胎児牛血清を含む MEM培地〔サイエンス（Science) , 122卷， 501 (1952 )〕、 DMEM培地〔ヴイロロジー（Virology) , 8卷， 396 (1959)〕、 RPMI 1640培地〔 ジャーナル'ォブ 'ザ'アメリカン'メディカル'アソシエーション（The Journal of the Am erican Medical Association) , 199卷， 519 (1967)〕、 199培地〔プロシージング'ォ ブ.ザ.ソサイエティ.フォ^ ~·ザ.バイオロジカル.メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 73卷， 1 (1950)〕などが用いられる。培地の pHは、好 ましくは約 6〜8である。培養は、通常約 30°C〜40°Cで、約 15〜60時間行なわれる 。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
[0085] 以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外に TLR4またはその部分べ プチドを生成させることができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から、 TLR4またはその部分ペプチドを 自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、 TLR4またはその部分ペプチドを培養菌体ある 、は細胞から抽出する場 合、培養物力 公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超 音波、リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した 後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ る。該緩衝液は、尿素や塩酸グァ-ジンなどの蛋白質変性剤や、トリトン X— 100™ などの界面活性剤を含んで 、てもよ 、。
[0086] このようにして得られた可溶性画分中に含まれる TLR4またはその部分ペプチドの 単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩 析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法;透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、 および SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用す る方法;イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；ァフィユティー クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法;逆相高速液体クロマトグラフ ィーなどの疎水性の差を利用する方法;等電点電気泳動法などの等電点の差を利用 する方法;などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
[0087] 力べして得られる TLR4またはその部分ペプチドが遊離体である場合には、自体公 知の方法ある!/、はそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該 蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれ に準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
[0088] なお、形質転換体が産生する TLR4またはその部分ペプチドを、精製前または精 製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリべ プチドを部分的に除去することもできる。該蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシ ン、キモトリブシン、ァノレギニノレエンドぺプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダ ーゼなどが用いられる。
[0089] 力べして得られる TLR4またはその部分ペプチドの存在は、特異抗体を用いたェン ザィムィムノアツセィゃウェスタンブロッテイングなどにより確認することができる。
[0090] さらに、 TLR4またはその部分ペプチドは、それをコードする DNAに対応する RNA を铸型として、ゥサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセート など力 なる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによつても合成す ることができる。あるいは、さらに RNAポリメラーゼを含む無細胞転写 Z翻訳系を用 V、て、 TLR4またはその部分ペプチドをコードする DNAを铸型としても合成すること ができる。無細胞蛋白質 (転写)翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自 体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液は Pratt J.M. et al.， Transcription and Tra nlation, 179-209, Hames B.D. & Higgins S.J. eds., IRL Press, Oxford (1984)に記載 の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来 のものは E. coli S30 extract system (Promega社製)や RTS 500 Rapid Tranlation Syst em (Roche社製)等が挙げられ、ゥサギ網状赤血球由来のものは Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega社製)等、さらにコムギ胚芽由来のものは PROTEIOS™ (TOY OBO社製)等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である 。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えば Johnston F.B. et al.， Nature, 179, 160-161 (1957)あるいは Erickson A.H. et al.， Meth. EnzymoL, 96, 38-50 (1996)等 に記載の方法を用いることができる。
[0091] 蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法 (Pratt J.M. et al. (1984 )前述)や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋 白質合成システム（Spirin A.S. et al" Science, 242, 1162-1164 (1988))、透析法（木 川等、第 21回日本分子生物学会、 WID6)、あるいは重層法 (PROTEIOS™ Wheat ge rm cell-free protein synthesis core kit取扱説明書： TOYOBO社製）等が挙げられる 。さらには、合成反応系に、铸型の RNA、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給 し、合成物や分解物を必要時に排出する方法 (特開 2000-333673)等を用いることが できる。
[0092] 本発明のスクリーニング方法は、上記のいずれかの方法によって得られる阻害物質 結合型ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドの TLR4細胞内領域への試験化合物 の結合、および該ポリペプチドがシグナル伝達活性を保持する場合には、試験化合 物存在下でのシグナル伝達活性を測定することを特徴とする。
具体的には、例えば、 TLR4細胞内領域への試験化合物の結合は、阻害物質結 合型ポリペプチドを固相化 (例えば、マイクロプレートなど）して、標識した試験化合物 を含む溶液を該固相に添加して一定時間インキュベートした後、溶液を除去し、固相 に吸着した標識量を測定することにより行うことができる。あるいは、阻害物質結合型 ポリペプチドが適当なタグ (例えば、 GSTタグ、 Hisタグ、 MBPタグ)を有する融合ポリ ペプチドである場合には、該ポリペプチドと標識した試験化合物とを溶液中で反応さ せた後、該タグ配列と特異的に結合する物質を含む担体 (例えば、ダルタチオン、金 属キレート、マルトース等を固相化したビーズなど）を用いて該ポリペプチドをブルダ ゥンし、固相に吸着した標識量を測定することによつても試験化合物の TLR4細胞内 領域への結合を検定することができる。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、 酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、 25ι〕、〔131ι〕、〔¾〕、〔14c〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大 きなものが好ましぐ例えば、 j8—ガラクトシダーゼ、 13—ダルコシダーゼ、アルカリフ ォスファターゼ、パーォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物 質としては、例えば、フルォレスカミン、フルォレツセンイソチオシァネートなどが用い られる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ル シゲニンなどが用いられる。
[0093] あるいは、阻害物質結合型ポリペプチドと試験化合物との結合は、例えば、表面プ ラズモン共鳴（SPR)法を用いて、市販のセンサーチップ（例えば、 Biacore製）の表面 上に、常法に従って阻害物質結合型ポリペプチドを固定ィ匕し、これに試験化合物を 接触させた後、該センサーチップに特定の波長の光を特定の角度力 照射し、共鳴 角度の変化を指標にして、固定化した阻害物質結合型ポリペプチドへの試験化合物 の結合の有無を判定することができる。あるいはまた、質量分析計に適合可能なプロ ティンチップの表面上に阻害物質結合型ポリペプチドを固定ィ匕し、これに試験化合 物を接触させた後、 MALDI-MS、 ESI-MS、 FAB- MSなどのイオン化法と質量分析計（ 例:二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換 質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計など)を組み合わせる方法により、試験 化合物に相当するピークの出現を検出することによつても、阻害物質結合型ポリぺプ チドと試験化合物との結合を測定することができるが、これらの方法に限定されず、 V、かなる公知の他の方法も利用可能である。
[0094] 試験化合物が、阻害物質結合型ポリペプチドにおける TLR4細胞内領域内の標的 結合部位に結合することの確認は、阻害物質結合型ポリペプチドの代わりに阻害物 質非結合型ポリペプチドを用いて、上記と同様にして試験化合物の結合活性を測定 すること〖こより行うことができる。
その結果、阻害物質結合型ポリペプチドに結合するが、阻害物質非結合型ポリべ プチドには結合しな 、物質を、 TLR4細胞内領域内の標的結合部位に結合するィ匕 合物として選択することができる。
[0095] 試験化合物の TLR4シグナル伝達阻害活性の測定は、試験化合物の存在下およ び非存在下における、 TLR4を発現する細胞の TLR4シグナル伝達を調べること〖こ より行うことができる。具体的には、 TNF α、 IL— 1、 IL— 6などの炎症性サイト力イン の発現や、 IFN— α、 IFN— |8もしくはインターフェロン誘導性遺伝子の発現変動を 、ノーザンブロットや RT— PCRなどの RNAレベルで測定する力、あるいは各遺伝子 産物の抗体を用いて蛋白質レベルで測定するかにより調べることができる。 TLR4を 発現する細胞としては、内在の TLR4を発現している哺乳動物細胞、もしくは TLR4 もしくはその部分ペプチドの製造において上記した、 TLR4もしくはその部分べプチ ドをコードする DNAを導入した形質転換細胞 (一過的発現を含む）、好ましくは哺乳 動物細胞、より好ましくはヒト細胞が挙げられる。
例えば、試験化合物の存在下で上記遺伝子の発現量が 20%以上減少した場合に 、当該試験化合物を、 TLR4シグナル伝達阻害物質として選択することができる。
[0096] TLR4シグナルによる炎症性サイト力インの発現誘導は、 NF— κ Βの活性化を介し て該転写因子に特異的なシスエレメントをプロモーター領域に有する炎症性サイト力 イン遺伝子の転写が活性ィ匕されることにより起こる。また、 TLR4シグナルによる IFN βやインターフェロン誘導性遺伝子の発現誘導は、 IRF3の活性化を介して該転 写因子に特異的なシスエレメントをプロモーター領域に有する IFN— βやインターフ ェロン誘導性遺伝子の転写が活性ィ匕されることにより起こる。したがって、より好ましい 実施態様においては、試験化合物の TLR4シグナル伝達阻害活性の測定は、阻害 物質結合型ポリペプチドを発現し、且つ NF— κ Βもしくは IRF3結合配列を含むプロ モーターの制御下にある遺伝子、好ましくはレポーター遺伝子を含む細胞を、試験 化合物の存在下および非存在下で一定時間培養した後、当該遺伝子の発現量を測 定すること〖こより行うことができる。
[0097] 阻害物質結合型ポリペプチドを発現する細胞としては、上記したと同様のものが挙 げられる。 TLR4シグナルは TLR4リガンドである LPSによって活性化されるので、使 用される阻害物質結合型ポリペプチドは、 LPS刺激に応答し得るように、 TLR4の細 胞外領域内の LPS結合領域を含んでいることが好ましい。また、該ポリペプチドが正 しく膜に結合し得るように、該ポリペプチドは膜貫通領域と、細胞に適合したシグナル ペプチドを含んでいることが望ましい。 NF- κ B結合配列としては、 GGGRNNYYCC (配列番号： 3)が、 IRF3結合配列としては GAAASSGAAANY (配列番号： 4)がそれ ぞれ挙げられるが、該転写因子の発現制御を受けることが知られている遺伝子のプ 口モーター領域における、それらの結合する配列であれば、上記コンセンサス配列以 外のものであってもよい。使用するプロモーターとしては、用いる宿主細胞内で機能 的なものであれば特に制限はなぐ宿主細胞に応じて上記したいずれかのプロモー ターがそれぞれ例示される。宿主細胞として動物細胞を用いる場合は、使用するプロ モーターは、使用する NF— κ B結合配列もしくは IRF3結合配列の由来するプロモ 一ターであってよい。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、 GFP遺伝 子、 EGFP遺伝子、ペルォキシダーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子などが 挙げられる力 それらに限定されない。 NF- κ Bもしくは IRF3結合配列を含むプロ モーターの制御下にある遺伝子は、宿主細胞に応じて上記したベクターのいずれか に挿入し、上記した適当な遺伝子導入法を用いて宿主細胞に導入することができる
[0098] 上記細胞の培養は、宿主細胞に応じて、上記した各種培地もしくはリン酸緩衝生理 食塩水などの中で、上記と同様の方法で行うことができる。培地もしくは緩衝液中に は、試験化合物の他、阻害結合型ポリペプチドがリガンド結合領域を含む場合には、 LPSを添加して TLR4シグナルのベースライン（試験化合物非存在下でのレポータ 一遺伝子の発現量)を高くすることができる。培養終了後、レポーター遺伝子の発現 量を測定する。当該測定方法は、各レポーター遺伝子について自体公知の方法が それぞれ使用され得る。
例えば、試験化合物の存在下でレポーター遺伝子の発現量が 20%以上減少した 場合に、当該試験化合物を、 TLR4シグナル伝達阻害物質として選択することができ る。
[0099] 本発明のスクリーニング方法の特に好ましい態様においては、阻害物質結合型ポリ ペプチドを発現する細胞 (サンプル 1)と、 目的とする TLR4シグナル阻害物質の結合 部位を変異させた阻害物質非結合型ポリペプチドを発現する細胞 (サンプル 2)とを それぞれ用いて、上記レポーターアツセィを実施することにより、試験化合物の標的 結合部位への結合の有無と、試験化合物の TLR4シグナル伝達阻害活性とを一括 して測定することができる。即ち、サンプル 2では、標的部位に結合する TLR4シグナ ル阻害物質は阻害物質非結合型ポリペプチドに結合しな 、ので、 TLR4シグナルを 阻害せず、レポーター遺伝子の発現量の減少はみられない。したがって、当該方法 によれば、試験化合物非存在下で細胞を培養し、レポーター遺伝子の発現量を測 定する必要がない。
例えば、サンプル 1におけるレポーター遺伝子の発現量がサンプル 2における発現 量に比べて 20%以上減少した場合に、試験化合物を、 TLR4シグナル伝達阻害物 質として選択することができる。
[0100] 従って、本発明はまた、上記の阻害物質結合型ポリペプチドを発現する細胞と、 目 的とする TLR4シグナル阻害物質の結合部位を変異させた阻害物質非結合型ポリ ペプチドを発現する細胞とを構成として含む、 TLR4シグナル伝達阻害物質のスクリ 一ユング用キットを提供する。当該キットは、細胞の培養のための培地や容器、レポ 一ター遺伝子の発現の検出用試薬等をさらに構成として含んでもよい。
[0101] 本発明のスクリーニングで得られる、 TLR4の細胞内領域に結合し、 TLR4のシグ ナル伝達を阻害する物質 (以下、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質と略記する )は、例えば、哺乳動物 (例、ラット、マウス、モルモット、サル、ゥシ、ィヌ、ブタ、ヒト等） に対する一酸ィ匕窒素 (NO)産生抑制剤、 TNF— a、 IL— 1、 IL— 6などの炎症性サ イト力イン産生抑制剤、 TLRシグナル阻害剤（特に、 TLR4シグナル阻害剤）などとし て有用である。
また、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質は、例えば、哺乳動物 (例、ラット、マ ウス、モルモット、サル、ゥシ、ィヌ、ブタ、ヒト等)に対する重症セプシスを含むセプシ ス、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプティ ックショック、免疫機能低下症などの疾患、例えば、敗血症、エンドトキシンショック、 ェキソトキシンショック、全身性炎症反応症候群 (SIRS)、代償性抗炎症反応症候群（ CARS)、熱傷、外傷、手術後合併症、心不全、ショック、低血圧、リウマチ関節炎、骨 関節炎、胃炎、潰瘍性大腸炎、消化性潰瘍、ストレス性胃潰瘍、クローン病、自己免 疫疾患、臓器移植後の組織障害および拒絶反応、虚血再灌流障害、急性冠微小血 管塞栓、ショック性血管塞栓 (播種性血管内血液凝固（DIC)など）、虚血性脳障害、 動脈硬化、悪性貧血、ファンコニー貧血症、鎌形赤血球性貧血病、脾炎、ネフロー ゼ症候群、腎炎、腎不全、インシュリン依存性糖尿病、インシュリン非依存性糖尿病、 肝性ポルフィリン症、アルコール中毒、パーキンソン病、慢性白血病、急性白血病、 腫瘍、骨髄腫、幼児および成人性呼吸窮迫症候群、肺気腫、痴呆、アルツハイマー 病、多発性硬化症、ビタミン E欠乏性、老化、サンバーン、筋ジストロフィー、心筋炎、 心筋症、心筋梗塞、心筋梗塞後遺症、骨粗鬆症、肺炎、肝炎、乾癬、疼痛、白内障 、インフルエンザ感染症、マラリア、ヒト免疫不全ウィルス (HIV)感染症、放射線障害 、火傷、体外受精効率化、高カルシウム血症、硬直性脊椎炎、骨減少症、骨ペーチ エツト病、骨軟化症、骨折、急性バクテリア髄膜炎、へリコパクター 'ピロリ感染症、侵 襲性ブドウ状球菌感染症、結核、全身性真菌感染症、単純へルぺスウィルス感染症 、水痘 帯状疱疹ウィルス感染症、ヒトパピローマウィルス感染症、急性ウィルス脳炎 、脳炎、髄膜炎、感染症に伴う免疫機能低下、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー 性鼻炎、逆流性食道炎、発熱、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高脂血症、 糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、痛風、胃 アトニー、痔疾、全身性エリテマトーデス、脊髄損傷、不眠症、統合失調症、癲癇、肝 硬変、肝不全、不安定狭心症、心弁膜症、透析による血小板減少症または低血圧症 、急性虚血性脳卒中、急性期脳血栓症、癌転移、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、大腸 癌、胃癌、卵巣癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性黒色腫、ホジキン 病、非ホジキン性リンパ腫、抗癌剤や免疫抑制剤投与による副作用などの予防'治 療剤としても有用である。
さらに、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質は、例えば、哺乳動物 (例、ラット、 マウス、モルモット、サル、ゥシ、ィヌ、ブタ、ヒト等)に対する臓器障害等の予防'治療 剤としても有用である。ここでいう臓器とは、中枢神経系、循環器系、呼吸器系、骨' 関節系、消化器系または腎 '尿路系の各種臓器をいう。より具体的には、本発明の T LR4シグナル伝達阻害物質は、 TLRシグナルの変化に起因する、 (1)中枢神経系疾患〔G)神経変性疾患 (例、老年期痴呆、アルツハイマー病、ダウン 症、パーキンソン病、クロイツフェルト 'ヤコブ病、筋萎縮性脊髄側索硬化症、糖尿病 性-ユーロパシー等)、 GO脳循環器障害 (例、脳梗塞、脳出血、脳動脈硬化に伴う脳 循環不全等)時、頭部外傷 ·脊髄損傷時、脳炎後遺症時または脳性麻痺時の神経 障害、（m)記憶障害 (例、老年期痴呆、健忘症等)など〕、特にアルツハイマー病、
(2)循環器系疾患〔(0急性心筋梗塞，不安定狭心症等の急性冠動脈症候群、 GO末 梢動脈閉塞症、 Gii)冠動脈インターペンション (経皮的冠動脈形成術 (PTCA)、ァテ レクトミー (DCA)、ステント留置等)後の再狭搾、 Gv)冠動脈バイパス手術後の再狭窄 、（V)その他の末梢動脈におけるインターペンション (血管形成術、ァテレクトミー、ス テント留置等)及びバイパス手術後の再狭窄、（vi)心筋梗塞、狭心症等の虚血性心疾 患、（vii)間歇性跛行、（viii)脳卒中 (脳梗塞、脳塞栓、脳出血など)、（ix)ラタネ梗塞、（X) 脳血管性痴呆、（xi)動脈硬化症 (例えば、ァテローム性動脈硬化症など)およびこれ らに起因する疾患 (例えば、心筋梗塞等の虚血性心疾患および脳梗塞'脳卒中等の 脳血管障害など)、（Xii)心不全、（Xiii)不整脈、（Xiv)動脈硬化巣の進展、（XV)血栓形 成、（xvi)低血圧症、（xvii)ショック、 （xviii)ショック性血管塞栓 (播種性血管内血液凝 固 (DIC)など)〕、特に動脈硬化症、
(3)呼吸器系疾患〔呼吸窮迫症候群、呼吸不全、肺気腫、肺炎、気管支炎、細気管 支炎など〕、
(4)骨 ·関節系疾患〔慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、骨軟化症、骨減少症、骨ペーチ エツト病など〕、特に慢性関節リウマチ、
(5)消化器，肝胆脾系疾患〔潰瘍性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、肝硬変、肝不全、肝 炎、胆嚢炎、膝炎など〕、特に潰瘍性大腸炎、
(6)腎'尿路系疾患〔腎炎、腎不全、膀胱炎など〕
またはこれらが組み合わさった疾患 (多臓器不全など)などの予防'治療剤としても有 用である。さら〖こ、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質は、 TLR4シグナルの変化 に起因する感染症、特に臓器障害を伴うセプシス (重症セプシス)の予防 *治療剤とし て有用である。
さらに、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質は、臓器障害、重症セプシスなどの 感染症、アルツハイマー病などの中枢神経系疾患、動脈硬化症などの循環器系疾 患、慢性関節リウマチなどの骨'関節系疾患、潰瘍性大腸炎などの消化器系疾患な どの予防'治療剤としても有用である。
[0102] 本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質は他の薬物と併用して使用することができ る。そのような併用薬としては、例えば、抗菌薬、抗真菌薬、非ステロイド性抗炎症薬 、ステロイド薬、抗凝血薬、抗血小板薬、血栓溶解薬、免疫調節薬、抗原虫薬、鎮咳 •去たん薬、鎮静薬、麻酔薬、麻薬拮抗薬、抗潰瘍薬、高脂血症治療薬、動脈硬化 症治療薬、 HDL増加薬、不安定プラーク安定化薬、心筋保護薬、甲状腺機能低下 症治療薬、ネフローゼ症候群治療薬、慢性腎不全治療薬、利尿薬、高血圧治療薬、 心不全治療薬、筋弛緩薬、抗てんかん薬、強心薬、血管拡張薬、血管収縮薬、不整 脈治療薬、糖尿病治療薬、昇圧薬、精神安定薬、抗精神病薬、アルツハイマー病治 療薬、抗パーキンソン薬、筋萎縮性脊髄側索硬化症治療薬、神経栄養因子、抗うつ 薬、精神分裂病治療薬、抗腫瘍薬、ビタミン薬、ビタミン誘導体、関節炎治療薬、抗リ ゥマチ薬、抗アレルギー薬、抗喘息薬、アトピー性皮膚炎治療薬、アレルギー性鼻炎 治療薬、頻尿，尿失禁治療薬、タンパク質分解薬、タンパク質分解酵素阻害薬、抗 SI DS薬、抗セプシス薬、抗セブティックショック薬、エンドトキシン拮抗薬あるいは抗体 、シグナル伝達阻害薬、炎症性メディエーター作用抑制薬、炎症性メディエーター作 用抑制抗体、炎症性メディエーター産生抑制薬、抗炎症性メディエーター作用抑制 薬、抗炎症性メディエーター作用抑制抗体、抗炎症性メディエーター産生抑制薬、 a 1アドレナリン作動薬などが挙げられ、なかでも抗菌薬、抗真菌薬、非ステロイド性 抗炎症薬、ステロイド薬、抗凝血薬などが好ましい。具体的には以下のものが挙げら れる。
[0103] (1)抗菌薬
(0サルファ剤
スルファメチゾール、スルフイソキサゾール、スルファモノメトキシン、スルファメチゾ ール、サラゾスルフアビリジン、スルフアジアジン銀など。
(ii)キノリン系抗菌薬
ナリジタス酸、ピぺミド酸三水和物、エノキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン 、トシル酸トスフロキサシン、塩酸シプロフロキサシン、塩酸ロメフロキサシン、スバルフ ロキサシン、フレロキサシンなど。
(iii)抗結核薬
イソ-アジド、エタンプトール (塩酸エタンプトール）、パラアミノサリチル酸 (パラアミ ノサリチル酸カルシウム）、ピラジナミド、ェチォナミド、プロチォナミド、リファンピシン 、硫酸ストレプトマイシン、硫酸カナマイシン、サイクロセリンなど。
(iv)抗酸菌薬
ジァフエニルスルホン、リファンピシリンなど。
(V)抗ウィルス薬
イドクスゥリジン、ァシクロビル、ビタラビン、ガンシクロビルなど。
(νθ抗 HIV薬
ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、硫酸インジナビルエタノール付カ卩物、リトナ ビルなど。
(vii)抗スピロヘータ薬
(viii)抗生物質
塩酸テトラサイクリン、アンピシリン、ピぺラシリン、ゲンタマイシン、ジべカシン、カネ ンドマイシン、リビドマイシン、トブラマイシン、アミカシン、フラジ才マイシン、シソマイ シン、テトラサイクリン、ォキシテトラサイクリン、ロリテトラサイクリン、ドキシサイクリン、 ピぺラシリン、チカルシリン、セファロチン、セファピリン、セファロリジン、セファクロル、 セファレキシン、セフロキサジン、セフアドロキシル、セフアマンドール、セフォトアム、 セフロキシム、セフォチアム、セフォチアムへキセチル、セフロキシムアキセチル、セフ ジ -ル、セフジトレンピボキシル、セフタジジム、セフピラミド、セフスロジン、セフメノキ シム、セフポドキシムプロキセチノレ、セフピロム、セファゾプラン、セフエピム、セフス口 ジン、セフメノキシム、セフメタゾール、セフミノクス、セフォキシチン、セフブペラゾン、 ラタモキナセフ、フロモキセフ、セファゾリン、セフォタキシム、セフオペラゾン、セフチ ゾキシム、モキサラクタム、チェナマイシン、スルファゼシン、ァズスレオナムまたはそ れらの塩、グリセオフルビン、ランカシジン類〔ジャーナル ·ォブ ·アンチバイオティック ス（J. Antibiotics) , 38, 877— 885 (1985)〕など。 (2)抗真菌薬
(i)ポリエチレン系抗生物質 (例、アムホテリシン B、ナイスタチン、トリコマイシン）
(ii)グリセオフルビン、ピロール-トリンなど
(m)シトシン代謝拮抗薬 (例、フルシトシン）
(iv)イミダゾール誘導体（例、ェコナゾール、クロトリマゾール、硝酸ミコナゾール、ビホ ナゾール、クロコナゾール）
(V)トリァゾール誘導体（例、フルコナゾール、イトラコナゾール、ァゾール系化合物〔2 —〔（1R, 2R) - 2- (2, 4 ジフルオロフェ-ル）一2 ヒドロキシ一 1—メチル 3— (1H- 1, 2, 4 トリァゾール一 1—ィル）プロピル〕一 4—〔4— (2, 2, 3, 3—テトラフ ルォロプロポキシ）フエ-ル〕— 3 (2H, 4H)— 1, 2, 4 トリァゾロン〕）
(vi)チォカルバミン酸誘導体 (例、トリナフトール）
(vii)ェキノカンジン系誘導体（例、カスポファンジン、ミカファンジン、ァ-デユラファン ジン）など。
(3)非ステロイド性抗炎症薬
ァセトァミノフェン、フエナセチン、ェテンザミド、スルピリン、アンチピリン、ミグレニン 、アスピリン、メフエナム酸、フルフエナム酸、ジクロフエナックナトリウム、ロキソプロフ エンナトリウム、フエ-ルブタゾン、インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナ プロキセン、ォキサプロジン、フノレルビプロフェン、フェンブフェン、プラノプロフェン、 フロクタフェニン、ェピリゾール、塩酸チアラミド、ザルトプロフェン、メシル酸ガべキサ ート、メシル酸力モスタツト、ゥリナスタチン、コルヒチン、プロベネジド、スルフィンピラ ゾン、ベンズブロマロン、ァロプリノール、金チオリンゴ酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリ ゥム、サリチル酸ナトリウム、塩酸モルヒネ、サリチル酸、アト口ピン、スコポラミン、モル ヒネ、ペチジン、レボルフアイノール、ケトプロフェン、ナプロキセン、ォキシモルフオン またはその塩など。
(4)ステロイド薬
デキサメサゾン、へキセストロール、メチマゾール、ベタメサゾン、トリアムシノロン、ト リアムシノロンァセトニド、フルオシノ -ド、フルオシノロンァセトニド、プレドニゾロン、メ チルプレドニゾロン、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、フルォロメトロン、プロピオン 酸べクロメタゾン、エストリオールなど。
(5)抗凝血薬
へノ リンナトリウム、クェン酸ナトリウム、活性ィ匕プロテイン C、組織因子経路阻害剤、 アンチトロンビン III、ダルテパリンナトリウム、ヮルフアリンカリウム、アルガトロバン、ガ べキサート、クェン酸ナトリウムなど。
(6)抗血小板薬
ォザタレルナトリウム、ィコサペンタ酸ェチル、ベラプロストナトリウム、アルプロスタジ ル、塩酸チクロビジン、ペントキシフィリン、ジピリダモールなど。
(7)血栓溶解薬
チソキナーゼ、ゥロキナーゼ、ストレプトキナーゼなど。
(8)免疫調節薬
シクロスポリン、タクロリムス、グスペリムス、ァザチォプリン、抗リンパ血清、乾燥スル ホ化免疫グロブリン、エリスロポイエチン、コロニー刺激因子、インターロイキン、インタ 一フエロンなど。
(9)抗原虫薬
メトロ-ダゾール、チ -ダゾール、クェン酸ジェチルカルバマジン、塩酸キニーネ、 硫酸キニーネなど。
( 10)鎮咳 '去たん薬
塩酸エフェドリン、塩酸ノス力ピン、リン酸コディン、リン酸ジヒドロコディン、塩酸イソ プロテレノール、塩酸メチルエフェドリン、塩酸ノス力ピン、ァロクラマイド、クロルフエジ ァノール、ピコペリダミン、クロペラスチン、プロトキロール、イソプロテレノール、サノレ ブタモール、テレプタリン、ォキシぺテバノール、塩酸モルヒネ、臭化水素酸デキスト 口ペトルファン、塩酸ォキシコドン、リン酸ジモルフアン、ヒベンズ酸チぺピジン、クェン 酸ペントキシベリン、塩酸クロフエダノール、ベンゾナテート、グァイフェネシン、塩酸 ブロムへキシン、塩酸アンブロキノール、ァセチルシスティン、塩酸ェチルシスティン 、カノレボシスティンなど。
( 11)鎮静薬
塩酸クロルプロマジン、硫酸アト口ピン、フエノバルビタール、バルピタール、ァモバ ノレビターノレ、ペントバルビタール、チォペンタールナトリウム、チアミラーノレナトリウム、 ニトラゼパム、エスタゾラム、フルラザパム、ハロキサゾラム、トリァゾラム、フルニトラゼ パム、ブロムヮレリル尿素、抱水クロラール、トリクロホスナトリウムなど。
(12)麻酔薬
(12— 1)局所麻酔薬
塩酸コカイン、塩酸プロ力イン、リドカイン、塩酸ジブ力イン、塩酸テトラカイン、塩酸 メピバ力イン、塩酸ブピバ力イン、塩酸ォキシブプロ力イン、ァミノ安息香酸ェチル、ォ キセサゼインなど。
(12— 2)全身麻酔薬
(0吸入麻酔薬 (例、エーテル、ノ、口タン、亜酸化窒素、インフルラン、ェンフルラン）、 (ii)静脈麻酔薬 (例、塩酸ケタミン、ドロペリドール、チォペンタールナトリウム、チアミラ 一ルナトリウム、ペントバルビタール）など。
(13)麻薬拮抗薬
レバロルフアン、ナロルフイン、ナロキソンまたはその塩など。
(14)抗潰瘍薬
メタクロプロミド、塩酸ヒスチジン、ランソプラゾール、メトクロプラミド、ピレンゼピン、 シメチジン、ラニチジン、ファモチジン、ゥロガストリン、ォキセサゼイン、プログルミド、 オメブラゾール、スクラルフアート、スルピリド、セトラキサート、ゲファルナート、アルジ ォキサ、テプレノン、プロスタグランジンなど。
(15)高脂血症治療薬
HMG- CoA還元酵素阻害薬 (例、フルパスタチン、セリバスタチン、アトルバスタチン など)、フイブラート系薬剤（例、シンフイブラート、クロフイブラートアルミニウム、クリノフ イブラート、フエノフイブラートなど）、胆汁酸吸着薬 (例、コレスチラミンなど）、ニコチン 酸製剤（例、ニコモール、 -セリトロール、ニコチン酸トコフエロールなど）、プロブコー ル及びその誘導体、多価不飽和脂肪酸誘導体 (例、ィコサペント酸ェチル、ポリェン フォスファチジルコリン、メリナミドなど）、植物ステロール（例、ガンマ オリザノール、 ソイステロールなど）、エラスターゼ、デキストラン硫酸ナトリウム、スクワレン合成酵素 阻害薬、スクワレンエポキシダーゼ阻害薬、 CETP阻害薬、 2 クロロー 3—〔4一（2— メチル 2—フエ-ルプロボキシ）フエニル〕プロピオン酸ェチル〔ケミカル 'アンド'ファ 一マシューティカル'ブレティン（Chem. Pharm. Bull) , 38, 2792— 2796 (1990)〕 、 LDL受容体増加薬、コレステロール吸収阻害薬（Ezetimibeなど）、 MTP阻害薬、回 腸胆汁酸トランスポーター阻害薬、 SCAPリガンド、 FXRリガンドなど。
(16)動脈硬化症治療薬
MMP阻害薬、キマーゼ阻害薬、 ACAT阻害薬 (Avasimibe、 Eflucimibeなど）、 apo AI Milanoとその類似物質、スカベンジャー受容体阻害薬、 15-リポキシゲナーゼ阻害 薬、ホスホリパーゼ A2阻害薬、 ABCA1活性化薬、 LXRリガンド、スフインゴミエリナ一 ゼ阻害薬、ノ ラオキソナーゼ活性ィ匕薬、エストロジェン受容体作動薬など。
(17) HDL増加薬
スクワレン合成酵素阻害薬、 CETP阻害薬、 LPL活性化薬など。
(18)不安定プラーク安定化薬
MMP阻害薬、キマーゼ阻害薬、 ACAT阻害薬、リピド 'リッチ'プラーク退縮剤など
(19)心筋保護薬
心臓 ATP— K用口薬、エンドセリン拮抗薬、ゥロテンシン拮抗薬など。
(20)甲状腺機能低下症治療薬
乾燥甲状腺 (チレォイド）、レポチロキシンナトリウム（チラ一ジン S)、リオチ口-ジン ナトリウム (サイロニン、チロミン)など。
(21)ネフローゼ症候群治療薬
プレド -ゾロン（プレドニン）、コハク酸プレド-ゾロンナトリウム（プレドニン）、コハク 酸メチルプレド-ゾロンナトリウム（ソル'メドロール）、ベタメタゾン（リンデロン）など。
(22)慢性腎不全治療薬
利尿薬〔例、フロセミド (ラシックス）、ブメタ-ド (ルネトロン）、ァゾセミド (ダイアート）〕 、降圧薬〔例、 ACE阻害薬、マレイン酸ェナラプリル（レニベース）、 Ca拮抗薬 (マ- ジピン)、 a受容体遮断薬、 ΑΠ拮抗薬 (カンデサルタン)〕など。
(23)利尿薬
サイァザイド系利尿薬（ベンチルヒドロクロ口チアジド、シクロペンチアジド、ェチアジ ド、ヒドロクロ口チアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ペンフルチアジド、ポ リチアジド、トリクロルメチアジドなど）、ループ利尿薬 (クロルタリドン、クロフエナミド、 インダパミド、メフルシド、メチクラン、ソトラゾン、トリバミド、キネタゾン、メトラゾン、フロ セミドなど）、カリウム保持性利尿薬 (スピロノラタトン、トリアムテレンなど)。
(24)高血圧治療薬
(0交感神経抑制薬
a刺激薬 (例、クロ-ジン、グアナべンズ、グアンファシン、メチルドパなど）、神経
2
節遮断薬 (例、へキサメトニゥム、トリメタファンなど）、シナプス前遮断剤 (例、アルサ 一ォキシロン、ジメチルアミノレセルピナート、レシナミン、レセルピン、シロシンゴピン など）、ニューロン遮断薬 (例、ベタ-ジン、グァネチジンなど）、 a 遮断薬 (例、ブナ ゾシン、ドキサゾシン、プラゾシン、テラゾシン、ゥラピジルなど）、 j8遮断薬 (例、プル プラノロ一ノレ、ナドローノレ、チモローノレ、ニプラジローノレ、ブニ卜ロロ一ノレ、ィンデノロ 一ノレ、ペンブトローノレ、カノレテ才ローノレ、力ノレベジローノレ、ピンドローノレ、ァセブトロー ノレ、ァテノロ一ノレ、ビソプロローノレ、メトプロローノレ、ラベタローノレ、ァモスラローノレ、ァ 口チノロールなど）など。
(ii)血管拡張薬
カルシウムチャンネル拮抗薬（例、マ-ジピン、二カルジピン、二ルバジピン、二ソル ジピン、ニトレンジピン、ベニジピン、アムロジピン、ァラニジピンなど）、フタラジン誘 導体 (例、ブトララジン、力ドララジン、ェカラジン、ヒドララジン、トドララジンなど)など。
(iii) ACE阻害薬
ァラセプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、ェナラプリル、リジノプリル、 テモカプリル、トランドラプリル、キナプリル、イミダプリル、べナゼプリル、ベリンドプリ ルなど。
(iv) AII拮抗薬
口サルタン、カンデサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、ィルベサルタン、フォ ラサルタンなど。
(V)利尿薬 (例えば前述の利尿薬など）
(25)心不全治療薬 強心薬（例、ジギトキシン、ジゴキシン、メチルジゴキシン、ラナトシドじ、プロスシラリ ジンなど）、 a、 j8刺激薬 (例、ェピネフリン、ノルェピネフリン、イソプロテレノール、ド ノ ミン、ドカルパミン、ドブタミン、デノパミンなど）、ホスホジエステラーゼ阻害薬 (例、 アムリノン、ミルリノン、塩酸オルプリノンなど)カルシウムチャンネル感受性増強薬 (例 、ピモベンタンなど）、硝酸薬 (例、ニトログリセリン、硝酸イソソルビドなど）、 ACE阻害 薬 (例えば前述の ACE阻害薬など)、利尿薬 (例えば前述の利尿薬など)、カルペリチ ド、ュビデカレノン、ベスナリノン、アミノフィリンなど。
(26)筋弛緩薬
プリジノール、ッボクラリン、パンクロ-ゥム、塩酸トルペリゾン、力ルバミン酸クロルフ エネシン、ノ クロフェン、クロノレメザノン、メフエネシン、クロゾキサゾン、エペリゾン、チ ザ二ジンなど。
(27)抗てんかん薬
フエ-トイン、エトサクシミド、ァセタゾラミド、クロルジァゼポキシド、トリぺタジオン、 カルバマゼピン、フエノバルビタール、プリミドン、スルチアム、パルプ口酸ナトリウム、 クロナゼパム、ジァゼパム、ニトラゼパムなど。
(28)強心薬
トランスバイオキソカンファー、テレフィロール、アミノフィリン、ェチレフリン、ドパミン 、ドブタミン、デノパミン、アミノフィリン、べシナリン、アムリノン、ピモベンダン、ュビデ カレノン、ジギトキシン、ジゴキシン、メチルジゴキシン、ラナトシドじ、 G—スト口ファン チンなど。
(29)血管拡張薬
ォキシフエドリン、ジノレチアゼム、トラゾリン、へキソベンジン、バメタン、クロ二ジン、メ チルドパ、グアナべンズなど。
(30)血管収縮薬
ドパミン、ドブタミン、デノパミンなど。
(31)不整脈治療薬
(0ナトリウムチャンネル遮断薬 (例、キニジン、プロ力インアミド、ジソビラミド、アジマリ ン、シベンゾリン、リドカイン、ジフエ-ルヒダントイン、メキシレチン、プロパフェノン、フ レカイニド、ピルジカイニド、フエニトインなど）、
(ii) j8遮断薬（例、プロプラノロール、アルプレノロール、プフエトロール、オクスプレノ ローノレ、ァテノーノレ、ァセブトローノレ、メトプロローノレ、ビソプロローノレ、ピンドローノレ、 カルテオロール、ァロチローノレなど）、
(iii)カリウムチャンネル遮断薬 (例、アミオダロンなど）、
(iv)カルシウムチェンネル遮断薬 (例、ベラパミル、ジルチアゼムなど）など。
(32)昇圧薬
ドパミン、ドブタミン、デノパミン、ジギトキシン、ジゴキシン、メチルジゴキシン、ラナト シド C、 G—スト口ファンチンなど。
(33)糖尿病治療薬
スルホ-ル尿素剤（例、トルプタミド、クロルプロパミド、グリクロビラミド、ァセトへキサ ミド、トラザミド、ダリベンクラミド、ダリブゾールなど）、ビグアナイド剤（例、塩酸メトホル ミン、塩酸ブホルミンなど）、 a—ダルコシダーゼ阻害薬（例、ボグリボース、ァカルボ ースなど）、インスリン抵抗性改善薬 (例、ピォグリタゾン、ロジグリタゾン、トログリタゾ ンなど）、インスリン、グルカゴン、糖尿病性合併症治療薬 (例、ェパルレスタツトなど） など。
(34)精神安定薬
ジァゼパム、ロラゼパム、ォキサゼパム、クロノレジァゼポキシド、メダゼパム、ォキサ ゾラム、クロキサゾラム、クロチアゼバム、ブロマゼパム、ェチゾラム、フルジァゼパム、 ヒドロキシジンなど。
(35)抗精神病薬
塩酸クロルプロマジン、プロクロルペラジン、トリフロペラジン、塩酸チオリダジン、マ レイン酸ペルフエナジン、ェナント酸フルフエナジン、マレイン酸プロクロルペラジン、 マレイン酸レボメプロマジン、塩酸プロメタジン、ハロペリドール、ブロムペリドール、ス ピペロン、レセルピン、塩酸クロカプラミン、スルピリド、ゾテピンなど。
(36)アルツハイマー病治療薬
(i)ドネぺジル、リバスチグミン、ガランタミン、 TAK— 147等のコリンエステラーゼ阻害 剤、 (ii)イデべノン、メマンチン、ビンポセチン等の脳機能賦活薬など。
(37)抗パーキンソン薬
L—ドーパ、デプレ-ル、カルビドパ +レボドノく、ぺルゴライド、ロピ-ロール、力べ ルゴリン、プラミぺキソール、ェンタカブロン、ラザべミドなど。
(38)筋萎縮性脊髄側索硬化症治療薬
リルゾール、メカセルミン、ガバペンチンなど。
(39)抗うつ薬
イミプラミン、クロミプラミン、ノキシプチリン、フェネルジン、塩酸アミトリプチリン、塩 酸ノルトリプチリン、ァモキサピン、塩酸ミアンセリン、塩酸マプロチリン、スルピリド、マ レイン酸フルボキサミン、塩酸トラゾドンなど。
(40)精神分裂病治療薬
オランザピン、リスペリドン、タエチアピン、イロペリドンなど。
(41)抗腫瘍薬
6— 0—（N—クロロアセチルカルバモイル）フマギロール、ブレオマイシン、メトトレ キサート、ァクチノマイシン D、マイトマイシン C、ダウノルビシン、アドリアマイシン、ネ ォカルチノスタチン、シトシンァラビノシド、フルォロウラシル、テトラヒドロフリル 5— フルォロウラシル、ピシバニール、レンチナン、レバミゾール、べスタチン、アジメキソ ン、グリチルリチン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ブレオマイシン、 硫酸へプロマイシン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、塩酸イリノテカン、シ クロフォスフアミド、メルファラン、ズスルファン、チォテパ、塩酸プロカルバジン、シス プラチン、ァザチォプリン、メルカプトプリン、テガフール、カルモフール、シタラビン、 メチルテストステロン、プロピオン酸テストステロン、ェナント酸テストステロン、メピチォ スタン、ホスフェストロール、酢酸クロルマジノン、酢酸リュープリン、酢酸ブセレリンな ど。
(42)ビタミン薬
(0ビタミン A類：ビタミン A、ビタミン Aおよびパルミチン酸レチノール
1 2
(ii)ビタミン D類：ビタミン D、 D、 D、 Dおよび D
1 2 3 4 5
(iii)ビタミン E類： (X トコフエロール、 β トコフエロール、 y トコフエロール、 δ ト コフェローノレ、ニコチン酸 dl— —トコフェローノレ
(iv)ビタミン K類：ビタミン K、 K、 Kおよび K
1 2 3 4
(V)葉酸 (ビタミン M)
(vi)ビタミン B類：ビタミン B、ビタミン B、ビタミン B、ビタミン B、ビタミン Bおよびビタミ
1 2 3 5 6 ン B
12
(Vii)ピオチン (ビタミン など。
(43)ビタミン誘導体
ビタミンの各種誘導体、例えば、ァスコルビン酸、 5, 6—トランス一コレカルシフエ口 一ノレ、 2, 5—ヒドロキシコレカノレシフェローノレ、 1 - a—ヒドロキシコレカノレシフェロー ルなどのビタミン D誘導体、 5, 6—トランスーェルゴカルシフエロール等のビタミン D
3 2 誘導体など。
(44)抗アレルギー薬
ジフェンヒドラミン、クロルフエ二ラミン、トリべレナミン、メトジラミン、クレミゾール、ジフ ェニルビラリン、メトキシフヱナミン、クロモグリク酸ナトリウム、トラ-ラスト、レビリナスト、 アンレキサノクス、イブジラスト、ケトチフェン、テルフエナジン、メキタジン、アセラスチ ン、ェピナスチン、塩酸ォザダレル、プランルカスト水和物、セラトロダストなど。
(45)抗喘息薬
塩酸イソプレナリン、硫酸サルブタモール、塩酸プロ力テロール、硫酸テルブタリン 、塩酸トリメトキノール、塩酸ッロブテロール、硫酸オルシプレナリン、臭化水素酸フエ ノテロール、塩酸エフェドリン、臭ィ匕ィプロトロピウム、臭化ォキシトロピウム、臭化フル トロピウム、テオフィリン、アミノフィリン、クロモグリク酸ナトリウム、トラ-ラスト、レビリナ スト、アンレキサノン、イブジラスト、ケトチフェン、テルフエナジン、メキタジン、ァゼラス チン、ェピナスチン、塩酸ォザダレル、プランルカスト水和物、セラトロダスト、デキサメ タゾン、プレド-ゾロン、ヒドロコルチゾン、プロピオン酸べクロぺタゾンなど。
(46)アトピー性皮膚炎治療薬
クロモグリク酸ナトリウムなど。
(47)アレルギー性鼻炎治療薬
クロモグリク酸ナトリウム、マレイン酸クロルフエ-ラミン、酒石酸ァリメマジン、フマル 酸クレマスチン、塩酸ホモクロルシクリジン、テルフエナジン、メキタジンなど。
(48)頻尿 ·尿失禁治療薬
塩酸フラボキサートなど。
(49)抗セプシス薬
rBPI- 21 (バクテリシダルパーミアピリティ インクリージング プロテイン）、 BI- 51017 ( アンチトロンビン ΠΙ)、 SC-59735 (rTFPl)、 r- PAFァセチノレヒドラーゼ、 LY- 203638 (r- 活性化プロテイン C)、抗 TNF— α抗体、抗 CD14抗体、 CytoFab,アルカリフォスフ ァターゼ（LPS不活性化剤）等のペプチド性化合物、 JTE-607, E-5531、 E-5564、 S-5 920、 FR- 167653、 ONO- 1714、 ONO- 5046(sivelestat)、 GW- 273629、 RWJ- 67657、 G R-270773, NOX-100、 GR-270773, NOX-100、等の非ペプチド性化合物など。
(50)制吐剤
フエノリアジン誘導体、 5- HT3受容体アンタゴ-ストなど。
(51)メトヘモグロビン上昇防止剤
メチレンブルー、ァスコルビン酸など。
(52)その他
ヒドロキシカム、ダイアセリン、メゲストロール酢酸、 -セロゴリン、プロスタグランジン 類など。
本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質と他の薬物とを併用した場合、次のような効 果を有する。
(1)本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質や併用薬物を単独投与した場合よりも、 これらの投与量を軽減することができる。
(2)相乗的な治療効果が得られる。
(3)菌感染などの疾患に伴い発症する種々の疾患に対して、広く治療効果を発揮す る。
(4)本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質の副作用を軽減できる。
併用に際しては、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質と併用薬物の投与時期 は限定されず、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質またはその医薬組成物と併 用薬物またはその医薬組成物とを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間 差をおいて投与してもよい。併用薬物の投与量は、臨床上用いられている投与量に 準ずればよぐ投与対象、投与ルート、疾患、組み合わせ等により適宜選択すること ができる。
併用の投与形態は、特に限定されず、投与時に、本発明の TLR4シグナル伝達阻 害物質と併用薬物とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例 えば、（1)本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質またはその医薬組成物と併用薬物 とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、 (2)本発明の TLR4シグナル伝 達阻害物質またはその医薬組成物と併用薬物またはその医薬組成物とを別々に製 剤化して得られる 2種の製剤の同一投与経路での同時投与、（3)本発明の TLR4シ グナル伝達阻害物質またはその医薬組成物と併用薬物またはその医薬組成物とを 別々に製剤化して得られる 2種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、 (4)本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質またはその医薬組成物と併用薬物また はその医薬組成物とを別々に製剤化して得られる 2種の製剤の異なる投与経路での 同時投与、（5)本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質またはその医薬組成物と併 用薬物またはその医薬組成物とを別々に製剤化して得られる 2種の製剤の異なる投 与経路での時間差をお!、ての投与 (例えば、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物 質またはその医薬組成物;併用薬物またはその医薬組成物の順序での投与、あるい は逆の順序での投与)などが挙げられる。
本発明の併用剤における本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質と併用薬物との 配合比は、投与対象、投与ルート、疾患等により適宜選択することができる。
例えば、本発明の併用剤におけるシクロアルケン化合物または化合物 Aの含有量 は、製剤の形態によって相違する力 通常製剤全体に対して約 0. 01ないし 99. 8重 量％、好ましくは約 0. 1ないし 50重量％、さらに好ましくは約 0. 5ないし 20重量％程 度である。
本発明の併用剤における併用薬物の含有量は、製剤の形態によって相違するが、 通常製剤全体に対して約 0. 01ないし 99. 8重量％、好ましくは約 0. 1ないし 50重 量％、さらに好ましくは約 0. 5ないし 20重量％程度である。
本発明の併用剤における担体等の添加剤の含有量は、製剤の形態によって相違 するが、通常製剤全体に対して約 1ないし 99. 98重量％、好ましくは約 10ないし 90 重量％程度である。
また、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質をそれぞれ別々に製剤化する場合も 同様の含有量でよい。
[0111] 本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質をヒトに投与する場合、それ自体あるいは 適宜の薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などと混合し、経口投与剤 (例、 散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤など)、非経口投与剤 (例、注射剤、外用剤 (例、経 鼻投与製剤、経皮投与製剤など)、坐剤 (例、直腸坐剤、膣坐剤など)などの医薬組 成物として経口的または非経口的に安全に投与することができる。
これらの製剤は、例えば、製剤の製造において通常一般に用いられる自体公知の 方法を適用することにより製造することができる。製剤中の本発明の TLR4シグナル 伝達阻害物質の配合割合は、その形態によっても異なるが、例えば前記した経口投 与剤にお 、ては約 10な 、し約 95重量％が好ましぐ例えば前記した非経口投与剤 では約 0.001ないし約 95重量％が好ましい。
[0112] 例えば注射剤は、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質を可溶化剤（例、 β—シ クロデキストリン類など）、分散剤（例、ツイーン (Tween) 80 (アトラスパウダー社製、米 国）、 HCO60 (日光ケミカルズ製）、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウ ムなど）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロ ロブタノールなど）、等張化剤（例、塩ィ匕ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖 など)などとともに常法に従って水性注射剤にすることもでき、あるいは植物油（例、ォ リーブ油、ゴマ油、ラッカセィ油、綿実油、コーン油など）、プロピレングリコールなどに 、適宜溶解、懸濁あるいは乳化して油性注射剤に成形することもできる。
経口投与製剤は、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質に、例えば、賦形剤 (例 、乳糖、白糖、デンプンなど)、崩壊剤 (例、デンプン、炭酸カルシウムなど)、結合剤 ( 例、デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビュルピロリドン、ヒド ロキシプロピルセルロースなど）または滑沢剤（例、タルク、ステアリン酸マグネシウム 、ポリエチレングリコール 6000など)などを適宜添加して圧縮成形し、次いで必要に応 じて、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のための自体公知の方法での コーティングなどを施すことにより製造することもできる。コーティング剤としては、例え ばヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、ェチノレセノレロース、ヒドロキシメチノレセノレロー ス、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン 80、プル口 ニック F68、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピノレメチノレセルロースフタ レート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギッド（ローム社製 、西ドイツ、メタアクリル酸、アクリル酸共重合）、色素（例、酸化チタン、ベンガラなど） などが適宜用いられる。
本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質は、固状、半固状あるいは液状の外用剤と してち用いることがでさる。
例えば、固状の外用剤は、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質をそのまま、ある いは賦形剤（例、グリコール、マン-トール、デンプン、微結晶セルロースなど）、増粘 剤（例、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体など)などを添加、混合し 、粉状の組成物とすることにより製造されることもできる。半固状の外用剤は、常法に 従って製造し、水性または油性のゲル剤、あるいは軟膏剤として用いることが好まし い。液状の外用剤は、注射剤の製造に用いる手段あるいはそれに準じた手段により 、油性あるいは水性の懸濁剤とすることにより製造されることもできる。
また、固状、半固状または液状の外用剤に、 pH調節剤 (例、炭酸、リン酸、クェン酸 、塩酸、水酸ィ匕ナトリウムなど）、防腐剤 (例、ノ ラオキシ安息香酸エステル類、クロ口 ブタノール、塩ィ匕ベンザルコ -ゥムなど）などを適宜カ卩えてもよい。具体的には、例え ばワセリン、ラノリンなどを基剤として、 lgあたり本発明の TLR4シグナル伝達阻害物 質を通常約 0.1乃至約 lOOmg含有する軟膏剤として、用いることもできる。
本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質は、油性または水性の固状、半固状あるい は液状の坐剤とすることもできる。坐剤を製造する際の油性基剤としては、例えば高 級脂肪酸のグリセライド (例、カカオ脂、ウイテツブゾール類 (ダイナマイトノーベル社 製)など）、中級脂肪酸 (例、ミグリオール酸 (ダイナマイトノーベル社製)など）、あるい は植物油（例、ゴマ油、大豆油、綿実油など)などが適宜用いられる。また水性基剤と しては、例えばポリエチレングリコール類、プロピレングリコールなどが用いられ、水性 ゲル基剤としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アタリ ル酸重合体などが適宜用いられる。
本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質の投与量は、年齢、体重、症状、剤形、投 与方法、投与期間などにより異なるが、例えば、セプシス治療を目的として患者 (成 人、体重約 60kg)—人あたり、通常、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質として 1 曰 0. 01な!ヽし 1000mg/kg、女子ましく ί¾ 0. 01な!ヽし 100mg/kg、より女子 ましくは約 0. 1ないし約 100mgZkg、とりわけ約 0. 1ないし約 50mgZkgを、なかで も約 1. 5ないし約 30mgZkgを 1日 1回から数回に分けて経口または非経口投与さ れる。もちろん、前記したように投与量は種々の条件で変動するので、前記投与量よ り少な 、量で十分な場合もあり、また範囲を超えて投与する必要のある場合もある。 本発明の併用剤の投与量は、化合物の種類、年齢、体重、症状、剤形、投与方法 、投与期間などにより異なるが、例えば、セプシス治療を目的として患者 (成人、体重 約 60kg)—人あたり、通常、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質および併用薬物 として、それぞれ 1曰約 0. 01な!ヽし約 1000mg/kg、好ましくは約 0. 01な!ヽし約 1 00mg/kg、より好ましくは約 0. 1ないし約 100mg/kg、とりわけ約 0. 1ないし約 50 mgZkgを、なかでも約 1. 5ないし約 30mgZkgを 1日 1回力も数回に分けて静脈投 与される。もちろん、前記したように投与量は種々の条件で変動するので、前記投与 量より少ない量で十分な場合もあり、また範囲を超えて投与する必要のある場合もあ る。
併用薬物は、副作用が問題とならない範囲でどのような量を設定することも可能で ある。併用薬物としての一日投与量は、症状の程度、投与対象の年齢、性別、体重、 感受性差、投与の時期、間隔、医薬製剤の性質、調剤、種類、有効成分の種類など によって異なり、特に限定されないが、薬物の量として通常、たとえば経口投与で哺 孚 L動物 lkg体重あたり約 0. 001〜2000mg、好ましくは約 0. 01〜500mg、さらに 好ましくは、約 0. 1〜： LOOmg程度であり、これを通常 1日 1〜4回に分けて投与する。 本発明の併用剤を投与するに際しては、同時期に投与してもよいが、併用薬物を 先に投与した後、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質を投与してもよいし、本発 明の TLR4シグナル伝達阻害物質を先に投与し、その後で併用薬物を投与してもよ い。時間差をおいて投与する場合、時間差は投与する有効成分、剤形、投与方法に より異なるが、例えば、併用薬物を先に投与する場合、併用薬物を投与した後 1分〜 3日以内、好ましくは 10分〜 1日以内、より好ましくは 15分〜 1時間以内に本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質を投与する方法が挙げられる。本発明の TLR4シグナ ル伝達阻害物質を先に投与する場合、本発明の TLR4シグナル伝達阻害物質を投 与した後、 1分〜 1日以内、好ましくは 10分〜 6時間以内、より好ましくは 15分から 1 時間以内に併用薬物を投与する方法が挙げられる。
実施例
[0115] 以下、実施例を記載し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ れない。
[0116] 実施例 1
定法によりポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)法によって各種 cDNAの 3 ' -および 5 ' -末端 に制限酵素サイトを付加した DNAを増幅した。プライマーは以下のとおり。
TIRAP:
5， -GCGCGGATCCATGGCATCATCGACCTCCCT-3 ' (配列番号： 5)
5， -GCGCGCGGCCGCTCAAAGTAGATCAGATA-3，（配列番号： 6)
TLR2細胞内 TIRドメイン：
5， - GGATCCTATGATGCATTTGTTTCTTACAGT- 3 ' (配列番号： 7)
5， - AAGCGGCCGCCTAGGACTTTATCGCAGCTCTCAG- 3，（配列番号： 8)
TLR4細胞内 TIRドメイン：
5 ' - GGATCCTATGATGCCTTTGTTATCTACTCA- 3 ' (配列番号： 9)
5 ' -AAGCGGCCGCTCAGATAGATGTTGCTTCCTGCCA-3 ' (配列番号： 10) 上記プライマー DNAおよび TAKARA Ex Taqを用い、サーマルサイクラ一にて、最 初 95°Cで 2分間置いた後、 95°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分を 1反応サイクルとし て 30サイクル繰り返し、最後に 72°Cで 10分間伸長反応を行った。増幅した DNA断片 を TA Cloning Kit (Invitrogen)を用いてクローユングした。得られたプラスミドベクター を制限酵素処理してァガロースゲルで電気泳動し、 Sephaglas BandPrep Kit (Amersh am)によりバンド切り出し精製を行った。これをインサートとして、 DNA ligation kit Ver. 2 (TAKARA)を用いてにベクタープラスミド pGEX- 4T- 1 (Amersham)に挿入した。 完成したプラスミドで大腸菌を形質転換し、 10 mLの ampicillin含有 LB培地中で 37°C 、 18時間培養した。菌液 2.4 mLを 130 mLの ampicillin含有 LB培地に接種、振とう培養 し OD 力 0.9前後になったら 1 mol/Lの isopropy卜 β - D- thiogalactopyranosideを 130
600
μ L添カ卩し 30°Cで 4時間培養した。培養後、菌体を集め、 10 mLの Lysis Buffer (10 m mol/L Tris pH7.5, 150 nmol/L NaCl, 0.5% triton— X— 100, 1 mmolp/L PMSF)を添カロ した。菌体を超音波破砕後、遠心して得られた上清に 300 Lの Glutathione Sepharo se 4B (Amersham)を添カ卩し、 4°Cで 60分穏やかに振とうした。反応後、 GST融合蛋白 結合ビーズを 0.1% Triton X- 100添加 TBS (Tris buffered saline, 50mM Tris- HC1 pH7 .5, 150mM NaCl)で洗った。
完成した GST融合蛋白結合ビーズど H-ィ匕合物 A (アマシャム社で合成）を 4°Cで一 夜反応させた。反応後、 0.1% Triton X-100添加 TBSでビーズを洗い、 5% 2-mercapt oetnanol (Mti, ¾'¾ sodium dodecyl sulrate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)用 sample bufferを加え、 100°Cで 5〜10分間加熱した。遠心し上清をラベル化 蛋白サンプルとして分取し、 SDS-PAGEで蛋白を分離した。蛋白を分離したゲルを 40 %メタノール- 10%酢酸溶液で固定して力 CBB染色し（図 1A)、ろ紙上に載せてゲ ル乾燥機で乾燥させた。乾燥ゲルとイメージングプレート TR2040 (富士写真フィルム) を密着させ感光し、 BAS-2500 (富士写真フィルム)で蛋白に結合した3 H量を測定した (オートラジオグラフィ一)。 3H-ィ匕合物 Aは GST-TLR4細胞内 TIRドメイン融合蛋白に 選択的に結合し、それ以外の GST融合蛋白や GSTには結合しな力つた（図 1B)。 実施例 2
PCR法を用いて定法により TLR4をコードする cDNAを得て、発現ベクター pEFBosに 糸且み込んだ。各点変異体は Stratagene社製の QuikChange II Site-directed Mutagen esis Kitを用いて作製した。プライマーは、キットの説明書にしたがい、両側に変異に 相当するミスマッチを導入した。作製したプライマーは下記の通り（変異導入部位を 下線で示す)。以後はキットの説明書に従い変異体を作製し、コンビテントセルを形 質転換した。シングルコロニーをピックアップし、定法に従いプラスミドを調製後 DNA 配列を確認し各変異体 TLR4を含むプラスミドを得た。
1CA: 5 ' -TGATGCTTCTTGCTGGCGCCATAAAGTATGGTAGAG-3， (配列番号： 11) 5， -CTCTACCATACTTTATGGCGCCAGCAAGAAGCATCA-3，（配列番号: 12) 2CA:
5， -CCTCCATTTCAGCTCGCCCTTCACTACAGAGA-3， (配列番号： 13) 5， -TCTCTGTAGTGAAGGGCGAGCTGAAATGGAGG-3， (配列番号： 14) 3CA:
5 ' -ATCCAGAGCCGCTGGGCTATCTTTGAATATGA-3， (配列番号： 15) 5 ' -TCATATTCAAAGATAGCCCAGCGGCTCTGGAT-3， (配列番号： 16) 4CA:
5， -ACAGTGGGTACAGGAGCCAATTGGCAGGAAGC-3， (配列番号： 17) 5 ' -GCTTCCTGCCAATTGGCTCCTGTACCCACTGT-3， (配列番号： 18) PH:
5 ' -TACAGAGACTTTATTCACGGTGTGGCCATTGC-3 ' (配列番号： 19) 5， -GCAATGGCCACACCGTGAATAAAGTCTCTGTA-3' (配列番号： 20) 1KR:
5， -CAGTTCTGGTCTATAGGTTCTATTTTCACCTG-3 ' (配列番号 : 21) 5， -CAGGTGAAAATAGAACCTATAGACCAGAACTG-3，（配列番号： 22) 2KR:
5， -TGCTGGCTGCATAAGGTATGGTAGAGGTG-3，（配列番号： 23)
5， -CACCTCTACCATACCTTATGCAGCCAGCA-3，（配列番号： 24)
3KR:
5 ' -GGAATGAGCTAGTAAGGAATTTAGAAGAAGG-3 ' (配列番号： 25) 5， -CCTTCTTCTAAATTCCTTACTAGCTCATTCC-3 ' (配列番号： 26)
4KR:
5， -CATGAAGGTTTCCATAGAAGCCGAAAGGTGATT-3，（配列番号： 27) 5， -AATCACCTTTCGGCTTCTATGGAAACCTTCATG-3，（配列番号： 28) 5KR:
5， -CCATAAAAGCCGAAGGGTGATTGTTGTGG-3，（配列番号： 29) 5， -CCACAACAATCACCCTTCGGCTTTTATGG-3，（配列番号： 30)
6KR:
5， -CATTGTCCTGCAGAGGGTGGAGAAGACC-3，（配列番号：31)
5， -GGTCTTCTCCACCCTCTGCAGGACAATG-3，（配列番号： 32)
7KR:
5， -CAGAAGGTGGAGAGGACCCTGCTCAGGC-3，（配列番号： 33)
5， -GCCTGAGCAGGGTCCTCTCCACCTTCTG-3，（配列番号： 34)
8KR:
5， -GAGACGACTCAGAAGAGCCCTGCTGGATG-3，（配列番号： 35)
5， -CATCCAGCAGGGCTCTTCTGAGTCGTCTC-3，（配列番号： 36)
9KR:
5， -CCTGCTGGATGGTAGATCATGGAATCCAGA-3，（配列番号： 37)
5， -TCTGGATTCCATGATCTACCATCCAGCAGG-3，（配列番号： 38)
作製したプラスミドで大腸菌を形質転換させ、 EndoFree(R) Plasmid Maxi Kit (Quiag en)を使用して各々 500〜700 g程度精製した。アフリカミドリザル腎由来細胞 COS-7 を OPTI- MEM (Invitrogen)で 2回洗い、培地を 10%FCS添加、 100 μ g/mL streptomyci nおよび 100 U/mL penicillin含有 DMEM (Invitrogen)から OPTI- MEM 5mL/dishに変 えた。 FLAG-TLR4 WT或いは各変異体をコードするプラスミドを PLUS試薬（Invitrog en)及び LipofectAMINE試薬 (Invitrogen)を用いて定法に従い COS-7細胞にトランスフ ェクシヨンし、 37°C、 5%CO存在下で 3時間培養した。 20%FCS添加 DMEMを 6.5 mL/di
2
shとなるよう加え、更に 2日間培養した。
培地を 1%FCS添加 DMEM 5mLに置き換え、 3H-化合物 A (アマシャム社で合成）を 最終濃度 100 nmol/Lとなるよう作用させ 37°C、 5%CO存在下で 6時間培養した。培養
2
後、細胞を PBS 5 mLで 1回洗って ImL/dishとなるよう lysis buffer (10 mmol/L Tris pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 0.1 % Nonidet P— 40, 0.05 % 3— ((3— cholamidopropyl dimethyl ammonio - 1 -propanesulfonate (CHAPS), 30 mmol/L NaF, 1 mmol/L Na VOおよび
3 4
Protease inhibitor cocktail (Sigma))をカ卩えた。 Lysis bufferをカ卩えたシャーレを氷上に 15分置き、細胞を可溶ィヒさせた。遠心（12000rpm, 4°C, lOmin)して不溶性画分を除 き上清を採取し、これを total cell lysateとした。
得られた total cell lysateを用いて定法に従い抗 FLAG抗体による免疫沈降を行つ た。 anti-FLAG M2抗体（Sigma) 30 μ gを添カ卩し、 4°Cで穏やかに振とうしながら 3時間 反応させ、更に 50 μ Lの protein A Sepharose beadsをカ卩えて 4°Cで穏やかに振とうしな がらー晚反応させた。翌日、ビーズを lysis bufferで 3回洗い、 5% 2-ME含有 SDS-PAG E用 sample bufferを加えて 100°Cで 10分間加熱処理した。遠心してビーズを捨てた上 清を免疫沈降物とした。
免疫沈降物を SDS-PAGEにより蛋白を分離し、泳動後のゲルをブロッテイング用 buff erに 15分間浸して SDSを除去した後、ゲルを polyvinylidene difluoride(PVDF)膜に密 着させ、ウエット式転写装置でゲル中の蛋白を PVDF膜に転写した。蛋白の転写され た PVDF膜を 3%(W/V) nonfat milk含有 Tris- HC1 buffer (50 mmol/L Tris, 138 mmol/ L NaCl, 2.7 mmol/L KC1, pH8.0)中でブロッキングし、一次抗体（anti- FLAG M2 10 μ g/mL)を 3% milk含有 Tris-HCl buffer中で 2時間反応させた。洗浄後 2次抗体 (HRP- anti mouse IgG)と 1時間反応させた後、 ECL試薬を用いて HRP標識抗体が結合した 蛋白を発光させた。バンドの発光を X線フィルム Kodak Biomax-MSで撮影し、蛋白発 現レベルを確認した（図 2；上段パネル)。撮影の終了した PVDF膜を PBS-Tで洗って 乾燥させ、イメージングプレート TR-2040に 7日間感光させて、 BAS-2500 (富士写真 フィルム)で発現蛋白に結合した3 H量を測定した。 TLR4の 747番目のシスティンをァラ ニンに変異させた場合のみ3 H-ィヒ合物 Aの結合量が顕著に低下した（図 2；下段パネ ル)。化合物 Aは 747番目のシスティンに選択的に結合していることが判明した。 実施例 3
ヒト胎児腎由来 HEK293を 10%FCS添加 DMEM中に懸濁し、 96ゥエルプレートに 2x1 04cells/wellとなるよう播種し 37°C、 5% CO存在下で一夜培養した。トランスフエクショ
2
ン直前に培地を OPTI- MEM (Invitrogen) 50 μ L/well〖こ置換した。 FLAG- TLR4 WT 或いはその変異体 0CA〜3CA、 PH、 1KR〜9KRをコードするプラスミドを各々 0.5 ng/ wellとなるように添カ卩し、 PLUS試薬（Invitrogen)及び LipofectAMINE試薬（Invitrogen) を用いて定法に従いトランスフエクシヨンし、 37°C、 5%CO存在下で 3時間培養した。
2
培養後、 20%FCS添加 DMEMを 100 L/wellとなるよう加え、更に一夜培養し、強制発 現細胞とした。なお、共通 DNAとして pNiFty (NF_kB活性化測定用 plasmid) 15 ng/we 11、 phRL-TK (内部標準 plasmid) 15 ng/well、 MD— 2 plasmid 10 ng/well、 CD14 plasm id 10 ng/wellを野生型 TLR4や各変異体とともにトランスフエクシヨンした。
トランスフエクシヨン翌日、強制発現細胞の培地を 1%FCS添加 DMEMに置き換え、化 合物 A (ェチル（6R)- 6- [N- (2-クロ口- 4-フルオロフェ -ル)スルファモイル]- 1-シクロ へキセン- 1-カルボキシラート）、化合物 B (d-ェチル 6-[N-(2,4-ジフルオロフェ -ル） スルファモイル]- 1-シクロへキセン- 1-カルボキシラート）、化合物 C (ェチル 6-[N-(2- ブロモ -4-フルオロフェ -ル)スルファモイル]- 1-シクロへキセン- 1-カルボキシラート） 、化合物 D (d-ェチル 6-[(2-クロ口- 4-フルォロベンジル)スルホ -ル] -1-シクロへキセ ン- 1-カルボキシラート）を最終濃度 0、 30、 100、 300 nmol/Lとなるよう作用させ 37°C、 5%CO存在下で 2時間培養した。 100 ng/mLとなるよう LPSを添カ卩し、更に 4時間培養
2
した。培養後、 Dual— Glo Luciferase Assay System (Promega)を用いてノレシフエフ ~~ ゼの発光量を測定した。測定は、 firefly luciferase (FL, NF-kB活性化由来)および ren ilia luciferase (RL,内部標準)による発光量を測定し、 FLの CPS (counts per second) 値を RLの CPSで補正した値、すなわち FL/RL ratioを求めた。結果を図 3に示す。
TLR4の 747番目のシスティンをァラニンに変異させた場合のみ化合物 A、化合物 B 、化合物 C、化合物 Dによるシグナル抑制作用が消失した。したがって、化合物 A、 化合物 B、化合物 C、化合物 Dは 747番目のシスティンに選択的に結合し、シグナル を抑制して 、ることがわかった。
産業上の利用可能性
[0119] 本発明のスクリーニング方法を用いることにより、 TLR4の細胞内領域に結合し、 T LR4のシグナル伝達を阻害する物質を選択することができ、得られた物質は心疾患 、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプシス、重症セプ シスまたはセブティックショックの予防'治療薬として有用である。
[0120] 本発明を好ま U、態様を強調して説明してきたが、好ま 、態様が変更され得るこ とは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載され た以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の 範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。 本出願は、日本国で出願された特願 2006-095936を基礎としており、そこに開示さ れる内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許お よび特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたこ とによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

Claims

請求の範囲 [1] TLR4の細胞内領域に結合し、該分子力 のシグナル伝達を阻害する物質を選択 することを特徴とする、心疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染 性疾患、セプシス、重症セプシスおよびセブティックショック力 なる群より選択される 1以上の疾患の予防'治療薬のスクリーニング方法。 [2] 当該結合部位力 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 652〜839で 示される領域内に存在する 1以上のシスティン残基である、請求項 1記載のスクリー ユング方法。 [3] 当該結合部位が、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列の第 706番目および Zまた は第 747番目のシスティン残基である、請求項 2記載のスクリーニング方法。 [4] 以下の（1)〜 (4)の工程を含む請求項 1記載のスクリーニング方法。
(1) TLR4またはその細胞内領域を発現し、且つ NF— κ Βもしくは IRF3結合配列を 含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞（サンプル 1)と、 TLR4の細胞 内領域の 1以上のシスティン残基あるいはその近傍アミノ酸を他のアミノ酸に変異さ せた蛋白質またはその細胞内領域を発現し、且つ NF— κ Βもしくは IRF3結合配列 を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞 (サンプル 2)とをそれぞれ調 製する。
(2)試験化合物の存在下でサンプル 1およびサンプル 2をそれぞれ培養する。
(3)培養後、サンプル 1およびサンプル 2における当該遺伝子の発現を測定する。
(4)サンプル 1における当該遺伝子の発現量力 サンプル 2におけるそれに比べて 約 20%以上減少した場合に、当該試験化合物を、 TLR4の細胞内領域内で該分子 と結合して、該分子力ものシグナル伝達を阻害する物質として選択する。
[5] 当該システィン残基が、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列の第 706番目および Ζ または第 747番目のシスティン残基である、請求項 4記載のスクリーニング方法。
[6] 当該遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項 4記載のスクリーニング方法。
[7] 以下の（1)〜（2)の構成を含むことを特徴とする、 TLR4の細胞内領域に結合して 該分子からのシグナル伝達を阻害する物質を選択するためのスクリーニングキット： (1)TLR4またはその細胞内領域を発現し、且つ NF— κ Βもしくは IRF3結合配列を 含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞、
(2) TLR4の細胞内領域の 1以上のシスティン残基あるいはその近傍アミノ酸を他の アミノ酸に変異させた蛋白質またはその細胞内領域を発現し、且つ NF— κ Βもしく は IRF3結合配列を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む細胞。
TLR4の細胞内領域に結合して該分子からのシグナル伝達を阻害する物質が、心 疾患、 自己免疫疾患、炎症性疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、セプシス、重症 セプシスおよびセブティックショック力 なる群より選択される 1以上の疾患の予防 ·治 療薬である請求項 7記載のスクリーニングキット。
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