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WO2007037297A1 - 成人病の予防及び治療に有効な組成物 - Google Patents

成人病の予防及び治療に有効な組成物 Download PDF

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WO2007037297A1
WO2007037297A1 PCT/JP2006/319240 JP2006319240W WO2007037297A1 WO 2007037297 A1 WO2007037297 A1 WO 2007037297A1 JP 2006319240 W JP2006319240 W JP 2006319240W WO 2007037297 A1 WO2007037297 A1 WO 2007037297A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
polypeptide
acid sequence
tyr
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2006/319240
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Itsuki Murota
Tadakazu Tamai
Takashi Baba
Kenji Sato
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Maruha Nichiro Corp
Original Assignee
Maruha Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Maruha Corp filed Critical Maruha Corp
Priority to JP2007537656A priority Critical patent/JP4834671B2/ja
Priority to US12/065,984 priority patent/US7951782B2/en
Priority to EP06810698A priority patent/EP1930017B1/en
Publication of WO2007037297A1 publication Critical patent/WO2007037297A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives

Definitions

  • the present invention relates to a composition useful for the prevention and treatment of adult diseases including hyperuricemia, which are useful in the fields of foods, beverages and medicines, and foods, beverages and pharmaceuticals containing the compositions. It is related to.
  • the adult diseases referred to in the present invention are a series of cancers and lifestyle-related diseases. Specifically, for example, solid cancers, metastatic cancers, gout, hyperuricemia, arteriosclerotic diseases, Examples include coronary artery disease, cerebrovascular disorder, peripheral circulation disorder, diabetes, and hypertension.
  • Non-Patent Document 1 hypertension and diabetes are cited as risk factors even for hyperlipidemia.
  • the Ministry of Health, Labor and Welfare has implemented a health promotion campaign called “Healthy Japan 21” since 2000. (From the Ministry of Health, Labor and Welfare website)
  • products such as roulonic acid, chondroitin sulfate, chondroitin sulfate protein complex, etc., and those that are decomposed and extracted and purified mainly from protein components derived from collagen are still in circulation as collagen and collagen peptides.
  • examples of such products include pharmaceutical chondroitin sulfate, edible chondroitin sulfate SCP, and fish collagen WP (all manufactured by Maruha Corporation).
  • adult diseases such as cancer, arteriosclerotic diseases, lifestyle-related diseases such as hyperuricemia and joint pain, improved skin quality, and suppression of aging It is said that a beneficial effect can be obtained.
  • Non-Patent Document 1 Nobuhiro Yamada, editor in charge Cardiovascular NOW12 Arteriosclerosis ⁇ Hyperlipidemia P153
  • Patent Document 1 JP 2003-335698 A
  • Patent Document 2 Patent No. 3248170 Specification
  • the present invention elucidates an active ingredient present in an animal-derived cartilage extract, and provides a composition effective for the prevention and treatment of adult diseases such as hyperuricemia containing the active ingredient and a method for using the same. It is to provide.
  • the enzyme digest of the basic fraction in cartilage extract has a beneficial effect on adult diseases such as hyperuricemia. I have found that I have it. Further, when the fraction showing the basicity was further fractionated using a reverse phase column, one of the column adsorption fractions showed the above action. As a result of GPC analysis, this fraction had a molecular weight of 50,000 Da or less, and as a result of amino acid analysis, it was found to contain aspartic acid, glutamic acid, proline, glycine, alanine, leucine, tyrosine, lysine and arginine.
  • the present invention has been made based on these findings, and is characterized by containing an enzyme digest obtained by enzymatic digestion of a basic fraction of animal-derived cartilage extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition effective for the prevention and treatment of diseases.
  • the present invention also includes a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10, and an amino acid sequence Leu-Tyr.
  • the present invention provides foods, beverages and pharmaceuticals characterized by containing the above composition.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of an isoelectric focusing apparatus used in Examples.
  • FIG. 2 is a graph showing the total amino acid concentration, chondroitin sulfate concentration, and pH of each cell when shark cartilage extract is fractionated by isoelectric focusing.
  • FIG. 3 shows the total amino acid concentration, chondroitin sulfate concentration, and pH of each cell when edible chondroitin sulfate SCP (manufactured by Maruha Corporation) is fractionated by isoelectric focusing.
  • FIG. 4 Shows a chromatogram when the basic fraction of shark cartilage extract is fractionated on a reverse phase column.
  • FIG. 5 shows a chromatogram when the elution pattern of the reverse phase column fraction fr4 of the basic fraction of shark cartilage extract and its alcalase denatured product was confirmed.
  • FIG. 6 shows a chromatogram of GPC analysis of reverse phase column fraction fr4 of the basic fraction of shark cartilage extract.
  • FIG. 7 shows a chromatogram of GPC analysis of reverse phase column fraction fr4 of the basic fraction of shark cartilage extract.
  • FIG. 8 shows a chromatogram of Gal analysis of an alcalase digest of reverse phase column fraction fr4 of the basic fraction of shark cartilage extract.
  • FIG. 9 shows a chromatogram of GPC analysis of an alcalase digest of reverse phase column fraction fr4 of the basic fraction of shark cartilage extract.
  • FIG. 10 shows a chromatogram of the polypeptide contained in the alcalase digest of reverse phase column fraction fr4 of the basic fraction of shark cartilage extract.
  • FIG. 11 shows an HPLC pattern of a synthetic polypeptide (YLDNY) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 12 shows an HPLC mass chromatograph of a synthetic polypeptide (YLDNY) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 13 A diagram showing an evaluation of the serum uric acid level lowering activity of edible chondroitin sulfate SCP fractions using normal rats.
  • FIG. 14 is a graph showing an evaluation of serum uric acid level-lowering activity of an alcalase digest of a fraction of a shark cartilage water extract using a model rat with hyperuricemia induced by potassium oxonate feeding.
  • FIG. 16 is a view showing the evaluation results of serum uric acid levels of a product obtained by fractionating a basic fraction of shark cartilage extract using a reverse phase column and digesting with alcalase.
  • FIG. 17 is a view showing the serum uric acid level lowering activity of a polypeptide contained in a product obtained by fractionating a basic fraction of shark cartilage extract using a reverse phase column and digesting with alcalase.
  • FIG. 18 is a graph showing the uric acid synthase inhibitory activity of serum administered with a polypeptide (YLDNY) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 19 is a diagram showing an evaluation of gout activity by an alcalase denatured product of a basic fraction of shark cartilage extract by rat urate paw edema method.
  • FIG. 20 is a graph showing an evaluation of gout activity by alkaline digestion of basic fraction of shark cartilage extract by rat urate acicular crystal air sac method.
  • FIG. 21 shows the evaluation of the activity against solid cancer by the alcalase digest of the basic fraction of shark cartilage extract.
  • FIG. 22 shows the evaluation of the activity against metastatic cancer by the alcalase digest of the basic fraction of shark cartilage extract.
  • FIG. 23 is a graph showing serum triglyceride levels and serum total cholesterol levels when an alcalase digest of the basic fraction of shark cartilage extract is administered to hyperlipidemic model mice for 28 days.
  • Figure 24 is a graph showing the cerebral infarction area ratio when an alcalase digest of the basic fraction of shark cartilage extract was administered to cerebrovascular disorder model rats for 28 days.
  • FIG. 25 shows the evaluation of serum uric acid level-lowering activity of a polypeptide (YLDNY) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 using hyperuricemia model rats by intraperitoneal administration of potassium oxalate.
  • FIG. 26 is a diagram showing the inhibitory activity of uric acid synthase of a peptide (number of amino acids; 2) comprising a part of the sequence of polypeptide (YLDNY) having the amino acid sequence ability shown in SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 27 is a diagram showing the inhibitory activity of uric acid synthase of a peptide (number of amino acids; 3) comprising a part of the sequence of the polypeptide (YLDNY) having the amino acid sequence ability shown in SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 28 is a view showing the inhibitory activity of uric acid synthase of a peptide (amino acid number: 4) comprising a part of the sequence of polypeptide (YLDNY) having the amino acid sequence ability shown in SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 29 is a view showing a uric acid synthase inhibitory activity of a polypeptide (YINY) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • FIG. 30 is a graph showing the inhibitory activity of uric acid synthase of polypeptides (YNL, GYL, INF) contained in the enzyme digest of the reverse phase column fraction of the basic fraction of shark cartilage extract.
  • compositions effective for the prevention and treatment of adult diseases of the present invention will be described in detail.
  • composition of the present invention can be obtained by enzymatic digestion of the basic fraction of animal-derived cartilage extract.
  • animal-derived cartilage used as a raw material for the composition of the present invention examples include cartilaginous fish, teleost, mammal, bird, reptile, amphibian, crustacean, or mollusc cartilage.
  • the animal-derived cartilage extract used in the present invention is extracted from the animal-derived cartilage using a suitable solvent such as water or alcohol. Two or more types of animal-derived cartilage having different origins can be used in combination. When the animal-derived cartilage is cartilage fish, teleost or mammal-derived cartilage, it is preferable to extract the cartilage after enzymatic treatment.
  • the animal-derived cartilage extracts include edible chondroitin sulfate SCP (manufactured by Maruha Co., Ltd.), chondroitin sulfate (for food) (manufactured by Shin Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), SNC-20, S NC-40 (both stocks Company-Chiro), Chondroitin Q (Cupee Co., Ltd.), Fish Collagen WP (Maruha Co., Ltd.), Collagen Peptide (Enzyme Digested Product) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Marine Matrix (Yaizu Fisheries Chemical Industries It is possible to use commercially available products such as Co., Ltd., ⁇ Trigelatin (Nippon Ham Co., Ltd.), P-LAP (Nippon Ham Co., Ltd.), etc.
  • the basic fraction of the animal-derived cartilage extract can be obtained by fractionating the animal-derived cartilage extract by, for example, isoelectric focusing.
  • the basic fraction is preferably a fraction having an isoelectric point of 9 or more, more preferably a fraction having an isoelectric point of 11 to 13. More preferably, the isoelectric point is within the above range, and aspartic acid, glutamic acid, proline, glycine, alanine, leucine, tyrosine, lysine, and arginine. It is a fraction containing nin, and even more preferably, a fraction having a molecular weight of 50,000 Da or less among these fractions.
  • the enzyme digest which is an active ingredient of the composition of the present invention is an enzyme digest of the above basic fraction.
  • Examples of the enzyme used for the enzyme digestion include alcalase protease and the like.
  • the enzyme treatment is usually performed by reacting a 5 to 15% substrate solution prepared at pH 6 to 8 at 40 to 60 ° C for 4 to 12 hours. However, it is not limited to this condition.
  • the enzyme digest is a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10, and a polypeptide comprising the amino acid sequence Leu-Tyr.
  • the composition of the present invention comprises one or more of the above polypeptides or salts thereof as an active ingredient. It may be a polypeptide composition contained as:
  • the above-mentioned polypeptide or salt thereof contained as an active ingredient in the polypeptide composition may be an artificially synthesized method such as an organic synthetic method or a fermentation method using a microorganism.
  • the above polypeptide or salt thereof present in natural products such as animal-derived cartilage may be isolated. Preferred examples of the method for synthesizing the above polypeptide or a salt thereof are listed below.
  • a commonly used chemical synthesis method such as the Fmoc method can be cited.
  • polypeptide which is an active ingredient of the composition of the present invention exists in a natural product that has been eaten in the past, and there is no problem in its safety.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, inorganic acid, organic acid
  • a base eg, alkali metal salt
  • Acid addition salts are preferred.
  • examples of such salts include inorganic acids (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, tartaric acid, succinic acid).
  • Succinic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid are not limited to these.
  • the composition of the present invention is a tablet, powder, granule using a suitable solid carrier such as ratatoose, clay, sucrose, dextrin, talc, gelatin, agar, pectin, acacia, magnesium stearate, etc. It can be ingested by oral administration as a troche or capsule, or by appropriately using a liquid carrier such as syrup, vegetable oil or water, as a syrup or soft gelatin capsule. It can also be taken in the form added to other foods and drinks.
  • a suitable solid carrier such as ratatoose, clay, sucrose, dextrin, talc, gelatin, agar, pectin, acacia, magnesium stearate, etc. It can be ingested by oral administration as a troche or capsule, or by appropriately using a liquid carrier such as syrup, vegetable oil or water, as a syrup or soft gelatin capsule. It can also be taken in the form added to other foods and drinks.
  • composition of the present invention contains an isotonic agent such as a saccharide or a salt, a buffering agent that gives a pH suitable for in vivo pH, a surfactant, an antioxidant, an absorption delaying agent, and the like. I'll do it with you.
  • an isotonic agent such as a saccharide or a salt
  • a buffering agent that gives a pH suitable for in vivo pH
  • a surfactant an antioxidant
  • absorption delaying agent an absorption delaying agent
  • Fig. 1 shows a schematic diagram of the isoelectric point used
  • Fig. 1 shows the isoelectric point of the basic fraction of shark cartilage extract
  • Table 2 shows the yield
  • Table 2 shows the isoelectric point of the shark cartilage extract.
  • Figure 2 shows the total amino acid concentration, chondroitin sulfate concentration, and pH of each cell when fractionated by electrophoresis.
  • edible chondroitin sulfate SCP manufactured by Maruha Co., Ltd.
  • 50 g which is one of the shark cartilage extracts distributed as a product, was fractionated under the same conditions as above, the total amino acid concentration of each cell, chondroitin It showed sulfuric acid concentration and P H in Figure 3.
  • cells 1 to 4 and cells 7 to 10 are filled with distilled water, and each cell is partitioned by a semipermeable membrane.
  • Example 4 Fractionation of basic fraction of shark cartilage extract using reversed phase column
  • the basic fraction of 2 g of shark cartilage extract was fractionated on a 2 cm ⁇ 20 cm column packed with Bakerbond C18.
  • the elution rate was lOmlZmin. (Eluent: water (0.1% TFA)), and monitoring was performed at 280 nm.
  • 2 g of the basic fraction was dissolved in 100 ml of the eluent, loaded onto the column, washed with a sufficient amount (250 ml) of eluent, and the non-adsorbed fraction was collected. Then, gradient elution was performed with 0 ⁇ 60% (2 Omin) acetonitrile. Collected eluent (including eluent used for washing) force S295ml to 350ml fraction was fr.2, 350ml to 400ml fraction was fr.3, 400ml to 500ml fraction was fr.4.
  • fr. 4 which is one of the reversed-phase column fractions of the basic fraction of shark cartilage extract and its alcalase digest was confirmed under the following conditions.
  • the chromatogram at that time is shown in Fig. 5.
  • Example 6 GPC analysis of reverse-phase column fraction fr4 of the basic fraction of shark cartilage extract and its alkalase digest, and confirmation of the amino acid sequence of the main peptide
  • Distilled water of 500 1 was added to 5 mg of fr4 or its alcalase digest, stirred, and then centrifuged (2 minutes, 12000 rpm) to obtain a supernatant.
  • 200 1 30% acetonitrile (containing 0.1% TFA) was added and stirred, and then centrifuged in the same manner to collect the supernatant.
  • the collected supernatants were combined and freeze-dried (FD_81, EYELA).
  • the obtained sample was applied to a gel filtration column under the following conditions and fractionated at intervals of 1 minute. Each fraction was dried and then 1001 distilled water was added and analyzed using HPLC under the following conditions.
  • fr4 was thought to be composed of components with a molecular weight of 50000 or less.
  • the chromatograms at that time are shown in FIGS. 6 and 7 for fr4 and in FIGS. 8 and 9 for the alcalase digest of fr4, respectively.
  • the alkalase digest of fr4 was further analyzed by amino acid sequencer (PPSQ-21, Shimadzu), and the amino acid sequence of the peak contained was confirmed. The results are shown in FIG.
  • HPLC was performed under the following conditions.
  • the HPLC mask mouth graph was performed under the following conditions.
  • Example 8 Evaluation of serum uric acid level lowering activity of edible chondroitin sulfate SCP (manufactured by Maruha Corporation) fraction using normal rats)
  • Edible chondroitin sulfate SCP manufactured by Maruha Co., Ltd.
  • the feed was CRF-1 (Oriental Yeast Co., Ltd.) and drinking water, Hakkaba municipal water.
  • blood was collected by abdominal aorta whole blood collection under Nembutal anesthesia, and serum uric acid level was evaluated using a commercially available uric acid level measurement kit (Uric acid B test ⁇ Koichi).
  • Uric acid B test ⁇ Koichi serum uric acid level measurement kit
  • serum uric acid level-lowering activity was observed in the basic fraction of edible chondroitin sulfate SCP.
  • Example 9 Evaluation of serum uric acid level lowering activity of enzyme digest of shark cartilage water extract fraction using hyperuricemia model rat induced by potassium oxalate diet
  • the aqueous extract of shark cartilage prepared by the same method as in Example 1 was fractionated into acidic, weakly acidic, and basic fractions by isoelectric focusing (composition ratios were 66%, 24%, and 10%, respectively).
  • the feed was obtained by mixing 2.5% potassium oxalate with general breeding feed as hyperuricemia-inducing feed, which was freely ingested. Table 6 shows the hyperuricemia-induced feed composition.
  • the aqueous extract of shark cartilage prepared by the same method as in Example 1 was fractionated into acidic, weakly acidic, and basic fractions by isoelectric focusing (composition ratios were 66%, 24%, and 10%, respectively).
  • the reverse phase column fraction of the basic fraction of shark cartilage extract prepared in the same manner as in Example 4 was digested with alcalase, and the composition ratio was the lowest and the fr4 dose was set to 50 mgZkg body weight.
  • the dose (Table 7) was determined based on the composition ratio, and gavaged Wistar male rats (150-220 g) after acclimation breeding using a sonde needle.
  • potassium oxonate Z3% gum arabic physiological saline solution 250 mg Zkg body weight was administered once intraperitoneally as an inducer of hyperuricemia, and 1 hour after administration of the inducer, the patient underwent Nembutal anesthesia from an abdominal artery. Blood was collected.
  • Specific activity is the% inhibition value per lmg of administration when the mean value of serum uric acid in the non-induced group is 0 and the mean value of serum uric acid in the vehicle group is 100.
  • Example 12 Evaluation of serum uric acid level lowering activity of polypeptide contained in enzyme digest of reverse phase column fraction of basic fraction of shark cartilage extract.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (YLDNY) and a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SPPYWPY) contained in the alcalase digest of the reverse-phase column fraction of the basic fraction was synthesized using the method shown in Example 7 and the like, and 5 mg Zkg body weight was administered to the rat via the tail vein.
  • 250 mg Zkg body weight of potassium oxalate Z3% gum arabic physiological saline as a hyperuricemia inducer was administered once intraperitoneally, and blood was drawn from the abdominal aorta under Nembutal anesthesia 1 hour after the inducer administration. Collected.
  • the blood was seraized by a conventional method, and the serum uric acid level was evaluated using a commercially available uric acid level measurement kit (Uritsu Acid Test Co., Ltd.).
  • serum uric acid level lowering activity was observed in both the polypeptide having the amino acid sequence ability shown in SEQ ID NO: 1 (YLDNY) and the polypeptide having the amino acid ability shown in SEQ ID NO: 3 (SPPYWPY).
  • Example 13 Evaluation of inhibitory activity of uric acid synthase in serum administered with polypeptide having amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1)
  • reaction solution 5 mg Zkg body weight, tail vein of the polypeptide (YLDNY) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 contained in the alcalase digest of the reverse-phase column fraction of the basic fraction
  • the reaction solution was prepared by adding 2 ml of 50 mM Tris-HC1 Buffer (pH 7.4) containing 15 ⁇ xanthine as an enzyme substrate to 100 / zl of blood serum prepared after 1 hour. It was. To this was added 0. lunit (100 units of 25 units / 25 ml enzyme solution) milk-derived xanthine oxidase (XO; wako) and allowed to react for 11 minutes (under 37 ° C).
  • XO milk-derived xanthine oxidase
  • the amount of uric acid produced from xanthine by the action of xanthine oxidase was evaluated by the change in OD value (292 nm), and the enzyme activity was calculated by the following formula.
  • YLDNY polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • xanthine oxidase activity was inhibited.
  • Example 14 Evaluation of gout-induced activity of Alcalase digest of basic fraction of shark cartilage extract by rat urate paw edema method
  • Example 15 Evaluation of activity against gout of alcalase digest of basic fraction of shark cartilage extract by rat uric acid needle crystal air sac method
  • Alkalase digest of basic fraction of shark cartilage extract prepared in the same manner as Example 3 for lOOmgZkg body weight in SD male rats (150-200g) after acclimation breeding (Vehicle group is Otsuka water for injection) After 6 days of oral gavage, 8 ml of air was injected subcutaneously into the back under ether anesthesia to create an air bag.
  • the alcalase digest of the basic fraction of the shark cartilage extract with body weight of lOOmgZkg (Vehicle group is Otsuka water for injection) was forcibly administered orally, and 5% uric acid needle crystals ZO. 5% carboxymethylcellulose ( 4 ml of a solution containing 0.5% casein was injected into the air bag.
  • the exudate in the air bag was collected and the amount of liquid was measured, and compared with the vehicle group.
  • the alcalase digested group administered with the basic fraction of the shark cartilage extract showed a significantly lower value than the vehicle group.
  • Example 16 Evaluation of activity of alkalase digest of basic fraction of shark cartilage extract against solid cancer
  • Example 17 Evaluation of activity of Alkalase digest of basic fraction of shark cartilage extract against metastatic cancer
  • Example 18 Evaluation of activity of alkalase digest of basic fraction of shark cartilage extract against arteriosclerosis
  • a 4-week-old rat model of cerebrovascular disorder due to middle cerebral artery ligation was digested with an alcalase digest of the basic fraction of shark cartilage extract prepared in the same manner as in Example 3 for 28 days, 100 mgZkg body weight Z day.
  • the cerebral infarction area rate was significantly lower than that in the vehicle group (distilled water administration).
  • the results of comparison of the cerebral infarction area rate 28 days after the start of administration are shown in FIG.
  • the average cerebral infarction area rate in the Vehi cle group was taken as 100.
  • Example 20 (Characteristic value of polypeptide contained in enzyme digest of reverse phase column fraction of basic fraction of shark cartilage extract)
  • Example 21 Evaluation of activity of lowering serum uric acid level of polypeptide having amino acid sequence ability shown in SEQ ID NO: 1)
  • a polypeptide (YLDNY) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 contained in the enzyme digest of the reverse phase column fraction of the basic fraction of shark cartilage extract was synthesized by the method according to Example 7. Rats were orally administered 5-50 mg Zkg body weight. 1 hour later high uric acid As a blood glucose inducer, 250 mg Z kg body weight of potassium oxalate Z3% gum arabic saline solution was administered intraperitoneally, and blood was collected from the abdominal aorta under Nembutal anesthesia 1 hour after administration of the inducer. Blood was seraized by a conventional method, and serum uric acid levels were measured by the recommended method of the Japanese Society for Clinical Chemistry (Clinical Chemistry, 22,300-307, 1993). As a result, serum uric acid level-lowering activity was observed, and the 50% inhibitory amount (ID) was calculated to be 39.3 mgZkg. Evaluation
  • Example 22 Evaluation of inhibitory activity of uric acid synthase of a peptide comprising a part of the polypeptide sequence having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1)
  • Example 23 Evaluation of inhibitory activity of uric acid synthase of polypeptide having amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • a polypeptide (YINY) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 contained in the enzyme digest of the reverse phase column fraction of the basic fraction of shark cartilage extract was synthesized by the method according to Example 7.
  • 50 mM Tris-HCl Buffer (pH 7.4) containing 15 ⁇ xanthine as an enzyme substrate A solution added to 200 1 was used as a reaction solution.
  • Figure 29 shows the control [Dunnett]).
  • Example 24 Evaluation of inhibitory activity of uric acid synthase of polypeptide contained in enzyme digest of reverse phase column fraction of basic fraction of shark cartilage extract.
  • Polypeptides contained in the enzyme digest of the reverse phase column fraction of the basic fraction of shark cartilage extract were synthesized by the method according to Example 7 and 15 ⁇ m was used as the enzyme substrate.
  • a reaction solution prepared by adding 200 ⁇ l of 50 mM Tris-HCl Buffer (pH 7.4) containing xanthine was used as a reaction solution.
  • 0.1 unit (10 units / 100 ⁇ l enzyme solution added 1 ⁇ l) buttermilk-derived xanthine oxidase ( ⁇ ; wako) and allowed to react (37 ° C.) for 10 minutes.
  • compositions useful in the prevention and treatment of adult diseases including hyperuricemia which is useful in the fields of foods, beverages and medicines, and foods, beverages containing the compositions and Medical supplies can be provided.

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Abstract

　動物由来軟骨抽出物の塩基性画分を酵素消化して得られる酵素消化物を有効成分として含有する組成物。及び、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０の何れかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドなどの特定のポリペプチド群から選ばれる一種以上のポリペプチドを有効成分として含有するポリペプチド組成物。

Description

明 細 書
成人病の予防及び治療に有効な組成物
技術分野
[0001] 本発明は、食品、飲料及び医薬の分野で有用な、高尿酸血症を含む成人病の予 防及び治療に利用可能な組成物と、該組成物を含有する食品、飲料及び医薬品に 関するものである。尚、本発明でいう成人病とは、一連のガンと生活習慣病のことであ り、具体的には例えば、固形ガン、転移性ガン、痛風、高尿酸血症、動脈硬化性疾 患、冠動脈疾患、脳血管障害、末梢循環障害、糖尿病、高血圧などである。
背景技術
[0002] 生活習慣の中でも食習慣が健康に及ぼす影響は大きぐ食習慣の乱れはガン、痛 風、高尿酸血症、高脂血症、動脈硬化性疾患、冠動脈疾患、脳血管障害、及び高 血圧といった一連の成人病や生活習慣病を招く要因となる。これらは互いに影響を 及ぼしあうものも多いため、 1つの症状が単独で発症するだけではなぐ複数が同時 に発症するケースも多い。例えば、動脈硬化性疾患は高血圧や糖尿病が主要冠危 険因子として挙げられており（日本動脈硬化学会 動脈硬化性疾患診療ガイドライン
2002年版より）、高脂血症でも高血圧や糖尿病が危険因子として挙げられている (非 特許文献 1参照)。また、痛風の患者で高血圧や肥満、動脈硬化性疾患などを合併 するケースなども知られている。現在、日本では死因の三分の二近くが成人病、生活 習慣病に関連したものであり、これに対して厚生労働省も平成 12年より「健康日本 21 」と 、う健康づくり運動を実施して 、る (厚生労働省ホームページより）。
[0003] しかし、バランスのとれた食事の摂取は理想ではあるものの、現代人の食生活は乱 れがちであり、崩れたバランスを栄養補助食品などの利用で補う者も多い。サメゃゥ シなどの動物由来軟骨は医薬品原体や栄養補助食品の素材として長年利用されて きたものの 1つであり、それらの抽出物で精製度が高いものの 1部は医薬用として、比 較的精製度の低い糖質やペプチドなどの混合物については、主に食品や飲料用と して利用されてきた。軟骨より得られるコンドロイチン硫酸などの多糖、及びそれに結 合する蛋白質で構成されるプロテオダリカンを中心に分解 '抽出'精製したものがヒア ルロン酸、コンドロイチン硫酸、あるいはコンドロイチン硫酸蛋白複合体などとして、又 、コラーゲンに由来する蛋白質成分を中心に分解 '抽出'精製したものがコラーゲン やコラーゲンペプチドとして現在も流通している。このような製品の一例としては医薬 用コンドロイチン硫酸、食用コンドロイチン硫酸 SCP、及びフィッシュコラーゲン WP ( 全てマルハ株式会社製)などを挙げることができる。これらを継続して服用することで ガンのような成人病、動脈硬化性疾患、高尿酸血症などの生活習慣病や関節痛の 軽減、皮膚の質の向上、及び老化の抑制などに対して有益な効果が得られるといわ れている。例えば、食用コンドロイチン硫酸 SCP (マルハ株式会社製）は継続的に摂 取することで高尿酸血症、痛風や骨粗鬆症の予防に有益な作用が得られることが報 告されて!/ヽる (特許文献 1及び 2参照)。
[0004] 非特許文献 1 :山田信博担当編集 循環器 NOW12 動脈硬化 ·高脂血症 P153 特許文献 1：特開 2003 - 335698号公報
特許文献 2 :特許第 3248170号明細書
発明の開示
[0005] しかしながら、コンドロイチン硫酸やコラーゲンそのものの生理作用につ 、ては知見 があるものの、動物由来軟骨抽出物を精製することで得られる組成物中に含まれる 有効成分については未解明な部分も多い。
従って、本発明は、動物由来軟骨抽出物中に存在する有効成分を解明し、該有効 成分を含有する高尿酸血症などの成人病の予防及び治療に有効な組成物及びそ の利用法を提供することにある。
[0006] 本発明者らは、上記目的を達成すべく種々検討した結果、軟骨抽出物中の塩基性 を示す画分の酵素消化物が高尿酸血症などの成人病に対し有益な作用を有するこ とを知見した。また、上記塩基性を示す画分を逆相系カラムを用いてさらに分画した ところ、カラム吸着画分の 1つが上記作用を示した。本画分は、 GPC分析の結果、分 子量 5万 Da以下であり、アミノ酸分析の結果、ァスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン 、グリシン、ァラニン、ロイシン、チロシン、リシン及びアルギニンを含むことを見出した 。本画分を酵素消化したものを HPLCによるパターン分析にかけたところ、 20以上の 主要なポリペプチドとそれらの酵素消化物などで構成されることを見出した。 [0007] 本発明は、これらの知見に基づいてなされたもので、動物由来軟骨抽出物の塩基 性画分を酵素消化して得られる酵素消化物を有効成分として含有することを特徴と する成人病の予防及び治療に有効な組成物を提供するものである。
[0008] また、本発明は、配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9及び 10の何れかに示すアミノ 酸配列からなるポリペプチド、アミノ酸配列 Leu-Tyrからなるポリペプチド、アミノ酸配 列 Phe-Tyrからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr-Tyrからなるポリペプチド、ァミノ 酸配列 Ser-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr-Phe力 なるポリペプチド、 アミノ酸配列 Tyr-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Leu-Phe力 なるポリぺプ チド、アミノ酸配列 Arg- Tyr- Pheからなるポリペプチド、アミノ酸配列 VaKTyr- Gin力 らなるポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr-Asn-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 G1 y-Tyr-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Gly-Phe-Leu力 なるポリペプチド、 アミノ酸配列 Ile-Asn- Pheからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Va卜 Glu-Tyrからなるポ リペプチド、アミノ酸配列 Ile-Asn- Tyrからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Ile-Tyr-Leu からなるポリペプチド、又はこれらのポリペプチドの一部分、あるいはこれらのアミノ酸 配列を一部に有するポリペプチド若しくはこれらのポリペプチドの医薬的に許容され る塩の一種以上を有効成分として含有することを特徴とする成人病の予防及び治療 に有効なポリペプチド組成物を提供するものである。
[0009] さらに、本発明は、上記の組成物を含有することを特徴とする食品、飲料及び医薬 品を提供するものである。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]実施例で使用した等電点電気泳動装置の概略を示す図である。
[図 2]サメ軟骨抽出物を等電点電気泳動法で分画した際の各セルの総アミノ酸濃度、 コンドロイチン硫酸濃度、及び pHを示す図である。
[図 3]食用コンドロイチン硫酸 SCP (マルハ株式会社製)を等電点電気泳動法で分画 した際の各セルの総アミノ酸濃度、コンドロイチン硫酸濃度、及び pHを示す図である
[図 4]サメ軟骨抽出物の塩基性画分を逆相カラムで分画した際のクロマトグラムを示 す。 [図 5]サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物 fr4及びそのアルカラーゼ消 化物の溶出パターンを確認した際のクロマトグラムを示す。
[図 6]サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物 fr4の GPC分析時のクロマト グラムを示す。
[図 7]サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物 fr4の GPC分析時のクロマト グラムを示す。
[図 8]サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物 fr4のアルカラーゼ消化物 の GPC分析時のクロマトグラムを示す。
[図 9]サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物 fr4のアルカラーゼ消化物 の GPC分析時のクロマトグラムを示す。
[図 10]サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物 fr4のアルカラーゼ消化物 中に含まれるポリペプチド分取時のクロマトグラムを示す。
[図 11]配列番号 1に示すアミノ酸配列からなる合成ポリペプチド (YLDNY)の HPLC パターンを示す図である。
[図 12]配列番号 1に示すアミノ酸配列からなる合成ポリペプチド (YLDNY)の HPLCマ スクロマトグラフを示す図である。
[図 13]正常ラットを用いた食用コンドロイチン硫酸 SCP分画物の血清尿酸値低下活 性を評価した図である。
[図 14]ォキソン酸カリウム混餌誘発による高尿酸血症モデルラットを用いたサメ軟骨 水抽出物の分画物のアルカラーゼ消化物の血清尿酸値低下活性を評価した図であ る。
圆 15]ォキソン酸カリウム腹腔内投与による高尿酸血症モデルラットを用いたサメ軟 骨水抽出物の分画物のアルカラーゼ消化物の血清尿酸値低下活性を評価した図で ある。
[図 16]サメ軟骨抽出物の塩基性画分を逆相カラムで分画し、アルカラーゼで消化し た物の血清尿酸値評価結果を示す図である。
[図 17]サメ軟骨抽出物の塩基性画分を逆相カラムで分画し、アルカラーゼで消化し た物の中に含まれるポリペプチドの血清尿酸値低下活性を示す図である。 [図 18]配列番号 1に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド (YLDNY)投与血清の尿 酸合成酵素の阻害活性を示す図である。
[図 19]ラット尿酸塩足浮腫法によるサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消 化物による痛風に対する活性の評価を示す図である。
[図 20]ラット尿酸針状結晶空気嚢法によるサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラ ーゼ消化物による痛風に対する活性の評価を示す図である。
[図 21]サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物による固形ガンに対する 活性の評価を示す図である。
[図 22]サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物による転移性ガンに対す る活性の評価を示す図である。
[図 23]高脂血症モデルマウスにサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化 物を 28日間投与した際の血清中性脂肪値と血清総コレステロール値を示す図であ る。
圆 24]脳血管障害モデルラットにサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化 物を 28日間投与した際の脳梗塞領域率を示す図である。
[図 25]ォキソン酸カリウム腹腔内投与による高尿酸血症モデルラットを用いた配列番 号 1に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド (YLDNY)の血清尿酸値低下活性を 評価した図である。
[図 26]配列番号 1に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド (YLDNY)の配列の一部 からなるペプチド (アミノ酸数； 2)の尿酸合成酵素の阻害活性を示す図である。
[図 27]配列番号 1に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド (YLDNY)の配列の一部 からなるペプチド (アミノ酸数； 3)の尿酸合成酵素の阻害活性を示す図である。
[図 28]配列番号 1に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド (YLDNY)の配列の一部 からなるペプチド (アミノ酸数; 4)の尿酸合成酵素の阻害活性を示す図である。
[図 29]配列番号 2に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド (YINY)の尿酸合成酵素 の阻害活性を示す図である。
圆 30]サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に含まれ るポリペプチド (YNL、 GYL、 INF)の尿酸合成酵素の阻害活性を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0011] 以下、本発明の成人病の予防及び治療に有効な組成物の好ましい実施形態につ いて詳述する。
本発明の組成物は、動物由来軟骨抽出物の塩基性画分を酵素消化することで得 ることがでさる。
本発明の組成物の原料となる動物由来軟骨としては、例えば、軟骨魚類、硬骨魚 類、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、甲殻類又は軟体動物由来の軟骨が挙げられる 力 好ましくは軟骨魚類、硬骨魚類、哺乳類、鳥類又は軟体動物由来の軟骨であり、 より好ましくは軟骨魚類、硬骨魚類又は哺乳類由来の軟骨であり、更により好ましくは 軟骨魚類又は硬骨魚類由来の軟骨であり、特に好ましくは軟骨魚類由来の軟骨で ある。
[0012] 本発明で用いられる動物由来軟骨抽出物は、上記動物由来軟骨から水やアルコ ールなどの適当な溶媒を用いて抽出したものである。上記動物由来軟骨は、由来の 異なる 2種類以上を併用することもできる。また、上記動物由来軟骨が軟骨魚類、硬 骨魚類及び哺乳類由来の軟骨の場合には、該軟骨を酵素処理した後、抽出するの が好ましい。
また、上記動物由来軟骨抽出物としては、食用コンドロイチン硫酸 SCP (マルハ株 式会社製)、コンドロイチン硫酸 (食品用）（新日本薬業株式会社製)、 SNC— 20、 S NC-40 (ともに株式会社-チロ製）、コンドロイチン Q (キューピー株式会社製）、フ イツシュコラーゲン WP (マルハ株式会社製)、コラーゲンペプチド (酵素消化品）（和 光純薬株式会社製)、マリンマトリックス (焼津水産化学工業株式会社製)、 -ヮトリゼ ラチン（日本ハム株式会社製)、 P-LAP (日本ハム株式会社製)などの市販品を用 いることちでさる。
[0013] 上記動物由来軟骨抽出物の塩基性画分は、上記動物由来軟骨抽出物を例えば 等電点電気泳動法により分画することにより得られる。
上記塩基性画分は、等電点 9以上の画分であることが好ましぐより好ましくは等電 点 11〜13の画分である。更に好ましくは、等電点が上記範囲内で、ァスパラギン酸 、グルタミン酸、プロリン、グリシン、ァラニン、ロイシン、チロシン、 リシン及びアルギ ニンを含む画分であり、更により好ましくは、これらの画分のうち分子量が 5万 Da以下 の画分である。
[0014] 本発明の組成物の有効成分である酵素消化物は、上記塩基性画分を酵素消化し たものである。該酵素消化に用いられる酵素としては、アルカラーゼゃプロテアーゼ などが挙げられ、該酵素処理は、通常、 pH6〜8に調製した 5〜15%基質溶液を 40 〜60°Cで 4〜12時間反応させることにより行うとよいが、この条件に限定されるもので はない。
[0015] 上記酵素消化物は、配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9及び 10の何れかに示す アミノ酸配列からなるポリペプチド、アミノ酸配列 Leu-Tyrからなるポリペプチド、ァミノ 酸配列 Phe-Tyrからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr-Tyrカゝらなるポリペプチド、 アミノ酸配列 Ser-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr-Phe力もなるポリぺプ チド、アミノ酸配列 Tyr-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Leu-Pheからなるポリ ペプチド、アミノ酸配列 Arg-Tyr-Pheからなるポリペプチド、アミノ酸配列 VaKTyr-Gl nからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr-Asn-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配 列 Gly-Tyr-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Gly-Phe-Leuからなるポリべプチ ド、アミノ酸配列 Ile-Asn- Pheからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Va卜 Glu-Tyr力 な るポリペプチド、アミノ酸配列 Ile-Asn- Tyrからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Ile-Tyr -Leuからなるポリペプチド、又はこれらのポリペプチドの一部分、あるいはこれらのァ ミノ酸配列を一部に有するポリペプチド若しくはこれらのポリペプチドの医薬的に許容 される塩を一種以上含むことが好ましぐ特に、配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 及び 10の何れかに示すアミノ酸配列力もなるポリペプチド、アミノ酸配列 Arg-Tyr-Ph eからなるポリペプチド、アミノ酸配列 VaKTyr- Ginからなるポリペプチド、アミノ酸配 列 Tyr-Asn-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Gly-Tyr-Leuからなるポリべプチ ド、アミノ酸配列 Ile-Asn- Tyrからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Ile-Tyr-Leu力 な るポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr-Leu-Aspからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Leu-A sp-Asnからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Asp-Asn- Tyrからなるポリペプチド、又は これらのポリペプチドの医薬的に許容される塩を一種以上含むことが好ましい。
[0016] また、本発明の組成物は、上記のポリペプチド又はその塩の一種以上を有効成分 として含有するポリペプチド組成物であってもよ 、。該ポリペプチド組成物にぉ 、て、 有効成分として含有する上記のポリペプチド又はその塩は、有機合成的手法ゃ微生 物を用いた発酵法などにより人工的に合成したものでもよぐまた上記動物由来軟骨 などの天然物中に存在する上記のポリペプチドやその塩を単離したものでもよい。 上記のポリペプチド又はその塩の合成法の好ま 、一例を以下に挙げる。上記動 物由来軟骨を粉体ィ匕したものを十分量の水で抽出し、得られた抽出物を等電点電気 泳動、逆相カラムクロマト、ゲルろ過カラムクロマト、限外ろ過などの方法を用いて分 画することにより、上記のポリペプチド又はその塩を得る方法が挙げられる。また、上 記有機合成的手法としては、一般に用いられる Fmoc法等の化学合成法が挙げられ る。
本発明の組成物の有効成分であるポリペプチドは、従来より食されている天然物中 に存在して 、るものであり、その安全'性には問題がな 、。
[0017] 上記のポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸 (例、無機酸、有機酸） や塩基 (例、アルカリ金属塩)などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される 酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、 臭化水素酸、硫酸）、あるいは有機酸 (例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸 、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、クェン酸、リンゴ酸、シユウ酸、安息香酸、メタンスル ホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩が用いられる力 これらに限定されるものではな い。
[0018] 本発明の組成物は、例えば、ラタトース、白土、シユークロース、デキストリン、タルク 、ゼラチン、寒天、ぺクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウムなどの適当な固体 担体を用いて、錠剤、散剤、顆粒剤、トローチ剤又はカプセル剤としたり、シロップ、 植物油、水などの液体担体を適宜用いて、シロップやソフトゼラチンカプセル剤として 、経口投与によって摂取させることができる。また、他の飲食品に添加した形態で摂 取させることちでさる。
本発明の組成物には、必要であれば、糖類又は塩などの等張剤、生体内の pHに 適応する pHを与える緩衝剤、界面活性剤、酸化防止剤、吸収遅延剤などを配合す ることちでさる。 実施例
[0019] 以下に本発明の効果を示す実施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例に何等 制限されるものではない。
[0020] 実施例 1 (動物由来軟骨抽出物の製造）
粉末サメヒレ軟骨 250gに 1200mlの蒸留水を加えて撹拌後、遠心分離（10分， 30 OOrpm)し、上清を得た。残渣は 200mlの蒸留水を加えて撹拌後、同様に遠心分離 し上清を回収する操作を 2回繰り返した。回収した上清は 1つにまとめて凍結乾燥 (F D-81、 EYELA)した。その結果、 50gのサメ軟骨抽出物を得た。
[0021] 実施例 2 (動物由来軟骨抽出物の製造）
ゥシ肩胛骨部軟骨 250gに 1000mlの蒸留水をカ卩えた後、 120°Cで 120分加熱し て溶解させた。溶解後、 50°Cまで冷却し、市販のアルカラーゼを 400 1添加後、 3 時間反応させた。反応後、 2000mlの変性エタノールを加えて撹拌し、上清を回収し た。上清は真空乾燥で変性アルコールを除去後、凍結乾燥した。その結果、 62gの ゥシ軟骨抽出物を得た。
[0022] 実施例 3 (サメ軟骨抽出物の塩基性画分の分画）
実施例 1で得られた 50gのサメ軟骨抽出物を 10%水溶液とし、 5リットル容量の等 電点電気泳動装置で、含有する成分の等電点の違いを利用して 10画分に分画した 。等電点電気泳動は、電圧を 500Vとし、装置を流れる電流が一定となったことを確 認した後、終了した。分画後、各セル溶液の pHが 9以上であったものを塩基性画分 として回収し、 1つにまとめた後、凍結乾燥（FD-81、 EYELA)した。使用した等電点 電気泳動装置の概略図を図 1に、サメ軟骨抽出物の塩基性画分の等電点を表 1に、 その歩留まりを表 2に、サメ軟骨抽出物を等電点電気泳動法で分画した際の各セル の総アミノ酸濃度、コンドロイチン硫酸濃度及び pHを図 2に、それぞれ示した。また、 製品として流通しているサメ軟骨抽出物の 1つである、食用コンドロイチン硫酸 SCP ( マルハ株式会社製） 50gを上記と同様の条件で分画した際の各セルの総アミノ酸濃 度、コンドロイチン硫酸濃度及び PHを図 3に示した。尚、図 1に示す等電点電気泳動 装置において、セル 1〜4及びセル 7〜10は蒸留水で満たされ、各セル間は半透膜 で仕切られている。 [0023] [表 1]
サメ軟骨抽出物の塩基性画分の等電点
Figure imgf000011_0001
[0024] [表 2]
サメ軟骨抽出物の塩基性画分の歩留まリ
Figure imgf000011_0002
[0025] 実施例 4 (逆相カラムを用いたサメ軟骨抽出物の塩基性画分の分画）
Bakerbond C18を充填した 2cm X 20cmカラムで 2gのサメ軟骨抽出物の塩基性画 分を分画した。溶出速度は lOmlZmin.とし (溶離液;水（0. 1%TFA) )、モニター は 280nmで行った。 2gの塩基性画分を 100mlの溶離液に溶かしてカラムに Load後 、充分量（250ml)の溶離液で洗浄し、非吸着画分を回収した。その後、 0→60% (2 Omin)ァセトニトリルでグラジェント溶出した。回収した溶離液 (洗浄に用いた溶離液 を含む）力 S295ml〜350mlの画分を fr. 2、 350ml〜400mlの画分を fr. 3、 400ml 〜 500mlの画分を fr. 4とした。
溶離液に不溶の成分にっ 、ては別途回収した。回収した各画分は全て凍結乾燥（ FD-81、 EYELA)した。分画した際のクロマト図を図 4に、分画結果を表 3に、 fr. 4のァ ミノ酸含量を表 4に、それぞれ示した。
[0026] [表 3] 塩基性画分の逆相カラム分画結果
Figure imgf000012_0001
]
サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相 カラム分画物 f r 4のアミノ酸含量 成分 ( At g /m g )
Asp 7 4. 8
Glu 9 9. 4
Hyp 2 9. 7
Ser 3 7. 7
Gly 6 1 . 2
His 1 2. 1
Arg 4 8. 2
Thr 2 7. 3
Ala 3 7. 1
Pro 6 7. 4
Tyr 2 7. 9
Val 2 7. 2
Met 1 7. 3
Me 2 5. 9 し eu 5 8. 4
HyM 4. 8
Hyl2 2. 3
Phe 2 6. 8 し ys 5 7. 1 total 7 4 2. 4 [0028] 実施例 5 (サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物 fr. 4及びそのアル力 ラーゼ消化物の溶出パターンの確認）
サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の 1つである fr. 4及びそのアル カラーゼ消化物の溶出パターンの確認を以下の条件で行った。その際のクロマト図 を図 5に示した。
カラム； Cosmosil 5C18-MS-II, Nacalai Tesque (4.6 x 250 mm)
カラム温度； 40°C
検出波長； 230nm
分析時間; 40分
移動相； 0.1% TFA存在下で 10→80%ァセトニトリル Z30分。 30〜35分は 80%ァセト -トリル - 0.1% TFA。
溶出速度; 0. 7ml/min.
[0029] 実施例 6 (サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物 fr4及びそのアルカラ ーゼ消化物の GPC分析、並びに主要ペプチドのアミノ酸配列の確認）
fr4又はそのアルカラーゼ消化物 5mgに 500 1の蒸留水をカ卩えて撹拌後、遠心分 離（2分， 12000rpm)し、上清を得た。残渣は 200 1の 30%ァセトニトリル（0. 1% TFA含有)を加えて撹拌後、同様に遠心分離し上清を回収した。回収した上清は 1 つにまとめて凍結乾燥 (FD_81、 EYELA)した。得られたサンプルを以下の条件でゲル ろ過カラムにかけ、 1分間隔で分取した。各分取物を乾固した後に 100 1の蒸留水 を加えたものを、以下の条件で HPLCを用いて分析した。その結果、 fr4では分子量 50000以下の成分で構成されると考えられた。その際のクロマト図を、 fr4について は図 6及び図 7に、 fr4のアルカラーゼ消化物については図 8及び図 9に、それぞれ 示した。また、 fr4のアルカラーゼ消化物については、さらにアミノ酸シークェンサ一（ PPSQ- 21,島津)で分析を行い、含まれるピークのアミノ酸配列の確認を行った。その 結果を図 10及び表 5に示した。
ゲルろ過時の条件
充 材； Superdex Peptide
検出波長； 230nm 分析時間; 40分
移動相； 30%ァセトニトリル（0.1% TFA含有）
溶出速度； 0.5ml/min.
分取物の HPLCによる分析時の条件
カラム； Cosmosil 5C18-MS-II, Nacalai Tesque (4.6 x 250 mm)
カラム温度； 40°C
検出波長； 230nm
分析時間; 40分
移動相； 0.1% TFA存在下で 10→80%ァセトニトリル Z30分。 30〜35分は 80%ァセト -トリル - 0.1%TFA。
溶出速度； 1. Oml/min.
[表 5] ァミノ
シークェンス結果
酸数
Tyr Ser Leu Tyr Phe Tyr Leu>A!a>Thr
2
Tyr Leu Tyr Phe Tyr し eu Phe>Tyr
Arg Val Tyr Me Val Gly Gly>Tyr lte>Ser l!e>Ser>Val
3 Tyr Tyr Asn Asn Glu Tyr Phe>Tyr Asn>Tyr Tyr>Phe>Asn
Phe Gin Leu Tyr Tyr し eu し eu Phe し eu ier Ser Val>Ser>Tro Tyr>Leu Tyr し eu
Asn l ie Glu lle>Ala>Val し eu
- -
TrD Tyr Tyr Asn ASD Asn
Gin Asp Phe Tyr Asn Tyr
Tyr
Phe し eu
5 Trp Asp
Arg Asn
Tyr Tyr
Ser Ser
Leu Pro
Pro Pro
7 Tyr Tyr
TrD Trp
Pro Pro
Tyr Tyr [0031] 実施例 7 (配列番号 1に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチドの合成） fr4のアルカラーゼ消化物中に含まれるポリペプチドの 1つである配列番号 1に示す アミノ酸配列からなるポリペプチド (YLDNY)を、 Fmoc法で合成を行った。アミノ酸保 護基は Fmoc基を用い、縮合剤やあらかじめ活性化させておいた該当する ex—ァミノ 酸誘導体を用いて順次結合させて 、つた。保護基として用いた Fmoc基の除去はピ ペリジン処理で行った。合成したポリペプチドの確認は HPLCと HPLCマスクロマトグ ラフを用いて行った。その結果を図 11及び図 12に示した。
HPLCは以下の条件で行つた。
機器； Waters 2690
カラム； Discovery,C18 (4.6 x 250 mm)
検出波長； 215nm
分析時間； 20分
移動相； 0.1% TFA 0→30%ァセトニトリル (0.1%TFA)/20分
溶出速度； 1. 5ml/min.
また、 HPLCマスク口マトグラフは以下の条件で行った。
機器； HPLC: Agilent 1100 series,マスク口マトグラフ： Thermo Finnigan LCQ
Advantage
カラム； Discovery,C18 (4.6 x 250 mm)
分析時間; 0. 95分
移動相； 0.1% TFA、ァセトニトリル (0.1%TFA)
溶出速度； 1. Oml/min.
[0032] 実施例 8 (正常ラットを用いた食用コンドロイチン硫酸 SCP (マルハ株式会社製)分 画物の血清尿酸値低下活性の評価）
サメ軟骨抽出物として食用コンドロイチン硫酸 SCP (マルハ株式会社製)を実施例 3 と同様の方法で等電点電気泳動を行い、酸性画分、弱酸性画分、及び塩基性画分 に分画 (組成比はそれぞれ 38%、 25%、及び 37% )したものを被験物質として lgZk g体重相当量（酸性画分； 1 X 0. 38 = 380mg,弱酸性画分； 1 X 0. 25 = 250mg, 塩基性画分； 1 X 0. 37 = 370mg)を、馴化飼育後の 7週齢 SD系雌性ラットにゾンデ 針を用いて 22日間反復強制経口投与した。飼料は CRF— 1 (オリエンタル酵母社製 )を、飲料水はっくば市営水道水をともに自由摂取させた。飼育期間終了後、ネンブ タール麻酔下で腹大動脈全採血により血液を採取し、市販の尿酸値測定キット (尿 酸 Bテストヮコ一）を用いて血清尿酸値の評価を行った。その結果、食用コンドロイチ ン硫酸 SCPの塩基性画分に血清尿酸値低下活性が観察された。評価結果 (n=6,平 均士 SD, * ;p< 0.05 vs Vehicle [ANOVA後、 Scheff法で検定])を図 13に示す。
[0033] 実施例 9 (ォキソン酸カリウム混餌誘発による高尿酸血症モデルラットを用いたサメ 軟骨水抽出物の分画物の酵素消化物の血清尿酸値低下活性の評価）
実施例 1と同様の方法で作製したサメ軟骨の水抽出物を等電点電気泳動法により 酸性、弱酸性、及び塩基性画分に分画 (組成比はそれぞれ 66%、 24%、及び 10% ) し、それらをアルカラーゼ消化したものを被験物質として lgZkg体重相当量 (酸性画 分； 1 X 0. 66 = 660mg,弱酸性画分； 1 X 0. 24 = 240mg,塩基性画分； 1 X 0. 10 = 100mg)を、馴化飼育後の 7週齢 SD系雌性ラットにゾンデ針を用いて 28日間反 復強制経口投与した。飼料は一般の飼育飼料に 2. 5%ォキソン酸カリウムを混合さ せたものを高尿酸血症誘発飼料とし、自由摂取させた。高尿酸血症誘発飼料組成を 表 6に示す。飲料水はっくば市営水道水を自由摂取させた。飼育期間終了後、ネン ブタール麻酔下で腹大動脈全採血により血液を採取し、市販の尿酸値測定キット（ゥ リックアシッドテストヮコ一）を用いて血清尿酸値の評価を行った。その結果、サメ軟骨 水抽出物中の塩基性画分に血清尿酸値低下活性が観察された。評価結果 (n=6,平 均士 SD, * * ;p< 0.01, * ;p< 0.05 vs Vehicle [ANOVA後、 Dunnett法で検定])を 図 14に示す。
[0034] [表 6] 高尿酸血症誘発飼料組成
Figure imgf000018_0001
実施例 10 (ォキソン酸カリウム腹腔内投与による高尿酸血症モデルラットを用いた サメ軟骨水抽出物の分画物の酵素消化物の血清尿酸値低下活性の評価）
実施例 1と同様の方法で作製したサメ軟骨の水抽出物を等電点電気泳動法により 酸性、弱酸性、及び塩基性画分に分画 (組成比はそれぞれ 66%、 24%、及び 10% ) し、それらをアルカラーゼ消化したものを被験物質として lgZkg体重相当量 (酸性画 分 X O. 66 = 660mg,弱酸性画分； 1 X 0. 24 = 240mg,塩基性画分； 1 X 0. 10 = 100mg)を、馴化飼育後の Wistar系雄性ラット（150〜220g)にゾンデ針を用いて 強制経口投与した。その 1時間後に高尿酸血症誘発剤としてォキソン酸カリウム Z3 %アラビアゴム生理食塩水溶液を 250mgZkg体重量を腹腔内に単回投与し、誘発 剤投与 1時間後にネンブタール麻酔下で腹大動脈より血液を採取した。血液は常法 により血清化し、市販の尿酸値測定キット（ウリツクアシッドテストヮコ一）を用いて血清 尿酸値の評価を行った。その結果、サメ軟骨水抽出物中の塩基性画分に血清尿酸 値低下活性が観察された。評価結果 (n=6,平均士 SD, * ;p< 0.05 vs Vehicle [T-TE ST])を図 15に示す。
[0036] 実施例 11 (サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物の血 清尿酸値低下活性の評価）
実施例 4と同様の方法で作製したサメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画 物をアルカラーゼ消化後、最も組成比の低 、fr4の投与量が 50mgZkg体重となるよ うに設定して組成比を基に投与量 (表 7)を決め、馴化飼育後の Wistar系雄性ラット（ 150〜220g)にゾンデ針を用いて強制経口投与した。その 1時間後に高尿酸血症誘 発剤としてォキソン酸カリウム Z3%アラビアゴム生理食塩水溶液を 250mgZkg体 重量を腹腔内に単回投与し、誘発剤投与 1時間後にネンブタール麻酔下で腹大動 脈より血液を採取した。血液は常法により血清化し、市販の尿酸値測定キット（ウリツク アシッドテストヮコ一）を用いて血清尿酸値の評価を行った。その結果、逆相カラム吸 着画分の 1つである fr4のアルカラーゼ消化物に血清尿酸値低下活性が観察された 。評価結果 (n=6,平均士 SD, a,b [異符号間で有意] ;p< 0.05 vs Vehicle [ANOVA後 、 Schefff去で検定])を図 16に示す。尚、比活性は、非誘発群の血清尿酸平均値を 0、 Vehicle群の血清尿酸平均値を 100とした時の投与物 lmgあたりの％抑制値である
[0037] [表 7]
サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物
のアルカラーゼ消化物のラッ 卜への投与量
Figure imgf000020_0001
[0038] 実施例 12 (サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に 含まれるポリペプチドの血清尿酸値低下活性の評価）
塩基性画分の逆相カラム分画物のアルカラーゼ消化物中に含まれる配列番号 1に 示すアミノ酸配列からなるポリペプチド (YLDNY)及び配列番号 3に示すアミノ酸配列 カゝらなるポリペプチド (SPPYWPY)を実施例 7に示される方法などを用いて合成し、ラ ットに 5mgZkg体重量、尾静脈投与した。その直後に高尿酸血症誘発剤としてォキ ソン酸カリウム Z3%アラビアゴム生理食塩水溶液を 250mgZkg体重量を腹腔内に 単回投与し、誘発剤投与 1時間後にネンブタール麻酔下で腹大動脈より血液を採取 した。血液は常法により血清化し、市販の尿酸値測定キット（ウリツクアシッドテストヮコ 一）を用いて血清尿酸値の評価を行った。その結果、配列番号 1に示すアミノ酸配列 力 なるポリペプチド (YLDNY)及び配列番号 3に示すアミノ酸配列力もなるポリぺプ チド (SPPYWPY)のいずれにも血清尿酸値低下活性が観察された。評価結果 (n=8, 平均士 SD, * ;p< 0.05, * * ;p< 0.01, * * * ;p< 0.001 vs Vehicle [T— TEST])を図 17に示す。
[0039] 実施例 13 (配列番号 1に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド投与血清の尿酸合 成酵素の阻害活性の評価）
塩基性画分の逆相カラム分画物のアルカラーゼ消化物中に含まれる配列番号 1に 示すアミノ酸配列からなるポリペプチド (YLDNY)をラットに 5mgZkg体重量、尾静脈 投与し、その 1時間後に採取した血液力も調製した血清 100 /z lを、酵素基質として 1 5 μ Μキサンチンを含む 50mM Tris- HC1 Buffer(pH7.4) 2ml〖こ添カ卩したものを反応 液とした。それに 0. lunit (25units/25mlの酵素溶液を 100 1添加）の牛乳由来キサ ンチンォキシダーゼ（XO ;wako)を添カ卩して 11分間反応（37°C下）させた。キサンチ ンォキシダーゼの作用でキサンチンから生成する尿酸量を OD値（292nm)の変化 で評価し、さらにそこ力 下記の式で酵素活性を算出した。その結果、配列番号 1に 示すアミノ酸配列からなるポリペプチド (YLDNY)を投与した血清を添加した場合では 、キサンチンォキシダーゼ活性が阻害を受けた。その結果 (n=6,平均士 SD, * * ;p< 0.01, * ;p< 0.05 vs Vehicle [T- TEST])を図 18に示す。尚、ァロプリノールは反応液 に溶解した。
[0040] [数 1] 酵素活性 （％) =
(各個体の血清を溶解した反応液についての X0添加で上昇する 0D値） X 100
(Veh i c I e群の血清を溶解した反応液についての X0添加で上昇する 0D値の平均値）
[0041] 実施例 14 (ラット尿酸塩足浮腫法によるサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラ ーゼ消化物の痛風に対する活性の評価）
馴化飼育後の Wistar系雄性ラット（200〜250g)に lOOmgZkg体重量の実施例 3 と同様の方法で作製したサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物 (Vehic le群は大塚注射用水）を強制経口投与した後、エーテル麻酔下で左後肢躕皮下に は 0. 1mlの 10%尿酸針状結晶生理食塩水溶液を、右後肢躕皮下には同量の生理 食塩水を投与した。その後、左右後肢に生じる浮腫容積の差を両群間で評価したと ころ、 Vehicle群に対しサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物投与群 は有意に低値を示した。その結果 (n=6,平均士 SD, * ;p< 0.05 vs Vehicle [T-TEST] )を図 19に示す。尚、 Vehicle群における左右後肢に生じる浮腫容積の差の平均を 1 00とした。
[0042] 実施例 15 (ラット尿酸針状結晶空気嚢法によるサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアル カラーゼ消化物の痛風に対する活性の評価） 馴化飼育後の SD系雄性ラット（150〜200g)に lOOmgZkg体重量の実施例 3と同 様の方法で作製したサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物 (Vehicle群 は大塚注射用水）を 6日間強制経口投与した後、エーテル麻酔下で背部皮下に 8ml の空気を注入して空気袋を作成した。その 24時間後に再度 lOOmgZkg体重量の サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物 (Vehicle群は大塚注射用水）を 強制経口投与し、さらに 5%尿酸針状結晶 ZO. 5%カルボキシメチルセルロース (0. 5%カゼイン含)溶液 4mlを上記空気袋内に注入した。尿酸針状結晶投与 4日後に 空気袋内の滲出液を回収して液量を測定し、 Vehicle群との比較を行った。その結果 、 Vehicle群に対しサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物投与群は有 意に低値を示した。その結果 (n=6,平均士 SD, * ;p< 0.05 vs Vehicle [T- TEST])を 図 20に示す。尚、 Vehicle群における滲出液量の平均を 100とした。
[0043] 実施例 16 (サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物の固形ガンに対 する活性の評価）
マウス由来のガン細胞 B16F10メラノーマを BDF1マウスの背部に移植後、 300mgZ kg体重量の実施例 3と同様の方法で作製したサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアル カラーゼ消化物 (Vehicle群は大塚注射用水）を 14日間反復して腹腔内投与を行った 。移植した腫瘍を投与開始力 15日目に摘出してその重量を測定し、投与物の増殖 に対する影響を評価した。その結果、 Vehicle群 (蒸留水投与)と比較してサメ軟骨抽 出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物投与群では腫瘍重量が有意に低値を示し た。その結果 (n=9,平均士 SD, * ;p< 0.05 vs Vehicle [T- TEST])を図 21に示した。 尚、 Vehicle群における腫瘍の重量の平均を 100とした。
[0044] 実施例 17 (サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物の転移性ガン〖こ 対する活性の評価）
実施例 3と同様の方法で作製したサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消 化物を 28日間、 300mgZkg体重 Z日量を強制経口投与し、投与開始 14日目にマ ウス由来 B16F10皮膚ガン細胞を C57BL/6マウスの尻尾の静脈に移植した。被験物 質投与開始から 28日後の肺へのガン転移の程度について検査を行った。その結果 、肺に転移したガン (黒い斑点)数は Vehicle群 (蒸留水投与）と比較して、サメ軟骨 抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物投与群では有意に低値を示した。その 結果 (n=12,平均士 SD, * ;p< 0.05vs Vehicle [T- TEST])を図 22に示した。尚、 Vehicl e群における転移したガンの数の平均を 100とした。
[0045] 実施例 18 (サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物の動脈硬化症に 対する活性の評価）
4週齢の ICR系雄性マウスに 40%牛脂混合高脂肪食を自由摂食させることで誘発 した高脂血症モデルマウスに、実施例 3と同様の方法で作製したサメ軟骨抽出物の 塩基性画分のアルカラーゼ消化物を 28日間、 lOOmgZkg体重 Z日量を強制経口 投与した。投与期間終了後、ネンブタール麻酔下で腹大動脈より全採血し、血液は 常法により速やかに血清化した。中性脂肪と総コレステロールの測定を行ったところ 、サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物投与群は、 Vehicle群 (蒸留 水投与)と比較して有意に低値を示した。高脂血症誘発に用いた高脂肪食の組成を 表 8に、血清中性脂肪値と血清総コレステロール値の測定結果 (n=6,平均士 SD, * ; p< 0.05 vs Vehicle [T— TEST])を図 23に示した。
[0046] [表 8]
高脂肪食の組成
Figure imgf000024_0001
[0047] 実施例 19 (サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物の脳血管障害抑 制活性の評価）
4週齢の、中大脳動脈結紮による脳血管障害モデルラットに、実施例 3と同様の方 法で作製したサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物を 28日間、 100 mgZkg体重 Z日量を強制経口投与させた結果、 Vehicle群 (蒸留水投与）と比較し て脳梗塞領域率が有意に低値を示した。投与開始 28日後の脳梗塞領域率を比較し た結果 (n=8,平均士 SD, * ;p< 0.05 vs Vehicle [T- TEST])を図 24に示す。尚、 Vehi cle群における脳梗塞領域率の平均を 100とした。
[0048] 実施例 20 (サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に 含まれるポリペプチドの特性値）
塩基性画分の逆相カラム分画物のアルカラーゼ消化物中に含まれるポリペプチド 2 4種類を実施例 7に準じた方法により 10〜300mg合成し、その特性値を測定した。 得られたポリペプチドの分子量、溶解性、及び外観の評価結果を表 9に示す。 [0049] [表 9]
Figure imgf000025_0001
[0050] 実施例 21 (配列番号 1に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチドの血清尿酸値低下 活性の評価）
サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に含まれる配 列番号 1に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド (YLDNY)を実施例 7に準じた方法 により合成し、ラットに 5〜50mgZkg体重量、経口投与した。その 1時間後に高尿酸 血症誘発剤としてォキソン酸カリウム Z3%アラビアゴム生理食塩水溶液を 250mgZ kg体重量を腹腔内に単回投与し、誘発剤投与 1時間後にネンブタール麻酔下で腹 大動脈より血液を採取した。血液は常法により血清化し、 日本臨床化学会の勧告法（ 臨床化学, 22,300-307, 1993)で血清尿酸値の測定を行った。その結果、血清尿酸値 低下活性が観察され、その 50%抑制量 (ID )は 39. 3mgZkgと算出された。評価
50
結果 (n=6,平均士 SD, *;p<0.05 vs Omg/kg [Dunnett])を図 25に示す。
[0051] 実施例 22 (配列番号 1に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチドの配列の一部から なるペプチドの尿酸合成酵素の阻害活性の評価）
サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に含まれる配 列番号 1に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド (YLDNY)の配列の一部からなるぺ プチド（YL、 LD、 DN、 NY、 YLD、 LDN、 DNY、 YLDN、 LDNY)を実施例 7に準じた方 法により合成し、酵素基質として 15 μ Μキサンチンを含む 50mM Tris-HCl Buffer (p H7.4)lmlに添カ卩したものを反応液とした。それに 0.1 unit (25units/25mlの酵素溶液 を 100 μ 1添加）の牛乳由来キサンチンォキシダーゼ (XO ;wako)を添加して 10分間反 応（37°C)させた。キサンチンォキシダーゼの作用でキサンチン力 生成する尿酸量 を OD値（292nm)の変化で評価し、さらにそこ力 上記〔数 1〕に示す式で酵素活性 を算出した。その結果、配列番号 1に示すアミノ酸配列力もなるポリペプチド (YLDNY )の配列の一部からなるペプチドである LD、 DN、 LDN、 DNY、 YLDN、及び LDNYを添 カロした場合では、キサンチンォキシダーゼ活性が阻害を受け、その 50%阻害量は、 それぞれ LD (IC =1.7 X 10— 3M)ゝ DN (IC =5.0 X 10— 4M)ゝ LDN (IC =7.6 X 10— 4M)、 D
50 50 50
NY(IC =8.8 X 10— 4M)ゝ YLDN (IC =1.2 X 10— 3M)、及び LDNY(IC =7.5 X 10— 4M)と算
50 50 50
出された。その結果（n=6,平均士 SD, *;p<0.05 vs control [Dunnett])を図 26、図 27 、及び図 28に示す。
[0052] 実施例 23 (配列番号 2に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチドの尿酸合成酵素の 阻害活性の評価）
サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に含まれる配 列番号 2に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド (YINY)を実施例 7に準じた方法に より合成し、酵素基質として 15 μ Μキサンチンを含む 50mM Tris-HCl Buffer (pH7.4) 200 1に添カ卩したものを反応液とした。それに 0.1 unit (10 units/ 100 1の酵素溶液 を 1 μ 1添加）のバターミルク由来キサンチンォキシダーゼ（XO ;wako)を添カ卩して 10 分間反応（37°C)させた。キサンチンォキシダーゼの作用でキサンチン力 生成する 尿酸量を OD値 (292nm)の変化で評価し、さらにそこから上記〔数 1〕に示す式で酵素 活性を算出した。その結果、配列番号 2に示すアミノ酸配列力 なるポリペプチドであ る YINYを添加した場合では、キサンチンォキシダーゼ活性が阻害を受け、その 50% 阻害量は、 IC =3.7 X 10— 3Mと算出された。その結果（n=6,平均士 SD, *;p〈0.05 vsコ
50
ントロール [Dunnett])を図 29に示す。
[0053] 実施例 24 (サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に 含まれるポリペプチドの尿酸合成酵素の阻害活性の評価）
サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に含まれるポリ ペプチド (YNL、 GYL、 INF)を実施例 7に準じた方法により合成し、酵素基質として 15 μ Μキサンチンを含む 50mM Tris-HCl Buffer (pH7.4) 200 μ 1に添カ卩したものを反応 液とした。それに 0.1 unit (10 units/ 100 μ 1の酵素溶液を 1 μ 1添加）のバターミルク由 来キサンチンォキシダーゼ (ΧΟ； wako)を添加して 10分間反応（37°C)させた。キサン チンォキシダーゼの作用でキサンチンから生成する尿酸量を OD値 (292nm)の変化 で評価し、さらにそこ力 上記〔数 1〕に示す式で酵素活性を算出した。その結果、サ メ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に含まれるポリべ プチド (YNL、 GYL、 INF)を添カ卩した場合では、キサンチンォキシダーゼ活性が阻害 を受けた。その結果（n=6,平均士 SD, *;p<0.05 vsコントロール [Dunnett])を図 30に 示す。
産業上の利用可能性
[0054] 本発明によれば、食品、飲料及び医薬の分野で有用な、高尿酸血症を含む成人 病の予防及び治療に利用可能な組成物と、該組成物を含有する食品、飲料及び医 薬品を提供することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 動物由来軟骨抽出物の塩基性画分を酵素消化して得られる酵素消化物を有効成 分として含有することを特徴とする成人病の予防及び治療に有効な組成物。
[2] 上記塩基性画分が、等電点 9以上の画分である請求の範囲第 1項記載の組成物。
[3] 上記塩基性画分が、ァスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、グリシン、ァラニン、口 イシン、チロシン、リシン及びアルギニンを含む画分である請求の範囲第 1項又は第 2 項記載の組成物。
[4] 上記塩基性画分が、分子量 5万 Da以下の画分である請求の範囲第 1項ないし第 3 項の何れかに記載の組成物。
[5] 上記酵素消化物が、配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9及び 10の何れかに示す アミノ酸配列からなるポリペプチド、アミノ酸配列 Leu-Tyrからなるポリペプチド、ァミノ 酸配列 Phe-Tyrからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr-Tyrカゝらなるポリペプチド、 アミノ酸配列 Ser-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr-Phe力もなるポリぺプ チド、アミノ酸配列 Tyr-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Leu-Pheからなるポリ ペプチド、アミノ酸配列 Arg-Tyr-Pheからなるポリペプチド、アミノ酸配列 VaKTyr-Gl nからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr-Asn-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配 列 Gly-Tyr-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Gly-Phe-Leuからなるポリべプチ ド、アミノ酸配列 Ile-Asn- Pheからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Va卜 Glu-Tyr力 な るポリペプチド、アミノ酸配列 Ile-Asn- Tyrからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Ile-Tyr -Leuからなるポリペプチド、又はこれらのポリペプチドの一部分、あるいはこれらのァ ミノ酸配列を一部に有するポリペプチド若しくはこれらのポリペプチドの医薬的に許容 される塩を一種以上含む請求の範囲第 1項ないし第 4項の何れかに記載の組成物。
[6] 上記酵素消化物が、配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9及び 10の何れかに示す アミノ酸配列からなるポリペプチド、アミノ酸配列 Arg-Tyr-Pheからなるポリペプチド、 アミノ酸配列 VaKTyr- Ginからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr-Asn-Leuからなる ポリペプチド、アミノ酸配列 Gly-Tyr-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Ile-Asn- Tyrからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Ile-Tyr-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配 列 Tyr-Leu-Aspからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Leu-Asp-Asn力 なるポリぺプ チド、アミノ酸配列 Asp-Asn- Tyrからなるポリペプチド、又はこれらのポリペプチドの 医薬的に許容される塩を一種以上含む請求の範囲第 1項ないし第 4項の何れかに 記載の組成物。
[7] 配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9及び 10の何れかに示すアミノ酸配列からなる ポリペプチド、アミノ酸配列 Leu-Tyrからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Phe-Tyrから なるポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr-Tyrからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Ser-Leu からなるポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr- Pheからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr- Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Leu-Pheからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Arg-Tyr-Pheからなるポリペプチド、アミノ酸配列 VaKTyr-Gln力もなるポリペプチド 、アミノ酸配列 Tyr-Asn-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Gly-Tyr-Leu力もな るポリペプチド、アミノ酸配列 Gly-Phe-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Ile-As n-Pheからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Va卜 Glu-Tyrからなるポリペプチド、ァミノ 酸配列 Ile-Asn- Tyrからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Ile-Tyr-Leu力 なるポリべ プチド、又はこれらのポリペプチドの一部分、あるいはこれらのアミノ酸配列を一部に 有するポリペプチド若しくはこれらのポリペプチドの医薬的に許容される塩の一種以 上を有効成分として含有することを特徴とする成人病の予防及び治療に有効なポリ ペプチド組成物。
[8] 配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9及び 10の何れかに示すアミノ酸配列からなる ポリペプチド、アミノ酸配列 Arg-Tyr- Pheからなるポリペプチド、アミノ酸配列 VaKTyr -Ginからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr-Asn-Leuからなるポリペプチド、ァミノ 酸配列 Gly-Tyr-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Ile-Asn- Tyr力 なるポリべ プチド、アミノ酸配列 lie -Tyr-Leuからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Tyr-Leu-Asp からなるポリペプチド、アミノ酸配列 Leu-Asp-Asnからなるポリペプチド、アミノ酸配列 Asp-Asn- Tyrからなるポリペプチド、又はこれらのポリペプチドの医薬的に許容され る塩の一種以上を有効成分として含有する請求の範囲第 7項記載の組成物。
[9] 上記成人病が、固形ガン、転移性ガン、痛風、高尿酸血症、動脈硬化性疾患、冠 動脈疾患、脳血管障害、末梢循環障害、糖尿病、及び高血圧である請求の範囲第 1 項な 、し第 8項の何れかに記載の組成物。 請求の範囲第 1項ないし第 9項の何れかに記載の組成物を含有することを特徴とす る食品、飲料又は医薬品。
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