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WO2007020880A1 - リンパ球の製造方法 - Google Patents

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WO2007020880A1
WO2007020880A1 PCT/JP2006/315881 JP2006315881W WO2007020880A1 WO 2007020880 A1 WO2007020880 A1 WO 2007020880A1 JP 2006315881 W JP2006315881 W JP 2006315881W WO 2007020880 A1 WO2007020880 A1 WO 2007020880A1
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WO
WIPO (PCT)
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antibody
cells
fibronectin
lymphocytes
fragment
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2006/315881
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takahiro Marui
Kinuko Nagamine
Nobuko Muraki
Akiko Kato
Tatsuji Enoki
Hiroaki Sagawa
Ikunoshin Kato
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takara Bio Inc
Original Assignee
Takara Bio Inc
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Publication date
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Priority to US11/990,443 priority patent/US8765469B2/en
Priority to CN2006800300546A priority patent/CN101243187B/zh
Priority to KR1020087006157A priority patent/KR101279172B1/ko
Priority to JP2007530976A priority patent/JP4929174B2/ja
Publication of WO2007020880A1 publication Critical patent/WO2007020880A1/ja
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    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin
    • G01N33/547—Synthetic resin with antigen or antibody attached to the carrier via a bridging agent

Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining lymphocytes useful in the medical field.
  • B lymphocytes B cells
  • T lymphocytes T cells
  • T cells have a CD (Cluster of Differentiation) 4 marker, and are mainly involved in helping antibody production and inducing various immune responses (hereinafter referred to as T).
  • CD Cluster of Differentiation 4 marker
  • a cytotoxic T cell having a CD8 marker and mainly exhibiting cytotoxic activity [T
  • Cytotoxic T lymphocyte also known as: Killer T cell, hereinafter sometimes referred to as CTL).
  • CTL which plays the most important role in recognizing, destroying, and removing tumor cells and virus-infected cells, is a target cell membrane that does not produce antibodies that react specifically with antigens like B cells.
  • Major histocompatibility complex MHC: human leukocyte antigen (HLA) in humans
  • HLA human leukocyte antigen
  • TCR T cell receptor on the surface of the CTL membrane
  • TCR specifically recognizes the above-mentioned antigen peptide and MHC class I molecule, and the antigen peptide is self-derived or non-self Judge whether it comes from.
  • Target cells determined to be non-autologous are specifically destroyed and removed by CTL.
  • lymphocytes such as CTL that react specifically with the antigen of interest from human-derived lymphocytes
  • Attention has been focused on the effectiveness of adoptive immunotherapy in which the above-mentioned lymphocytes are expanded and transferred to a patient after induction in vitro (ex vivo) or without induction.
  • adoptive immunotherapy is an effective treatment for viral infections and tumors in animal models (eg, Non-Patent Documents 1 and 2). In this therapy, it is important to maintain or increase the number of cells while maintaining or enhancing the antigen-specific injury activity of CTL.
  • Patent Document 1 discloses a REM method (rapid expansion method).
  • This REM method increases the initial population of T cells, including antigen-specific CTL and T, in a short period of time.
  • T cell clones can be expanded to provide large amounts of T cells, and anti-CD3 antibody, IL 2, and PBMC (peripheral blood mononuclear cells) that have lost proliferation by irradiation. It is characterized by increasing the number of antigen-specific CTLs using cells infected with Epstein-Barr virus (hereinafter abbreviated as EBV).
  • EBV Epstein-Barr virus
  • Patent Document 2 discloses a modified REM method, in which the dividing cell line that expresses a T cell stimulating component distinct from PBMC is a feeder cell. To reduce the amount of PBMC used.
  • lymphocytes effective for the treatment of diseases other than CTL include lymphokine activity.
  • Cells for example, Non-Patent Document 3
  • tumor-infiltrating lymphocytes for example, Non-Patent Documents 4 and 5
  • IL-2 interleukin 2
  • Lymphokine activity ⁇ cells are cytotoxic activity obtained by adding IL-2 to peripheral blood (peripheral blood leukocytes) including lymphocytes, umbilical cord blood, tissue fluid, etc., and culturing in vitro for several days. Is a functional cell population.
  • peripheral blood peripheral blood leukocytes
  • lymphocytes peripheral blood leukocytes
  • umbilical cord blood tissue fluid, etc.
  • culturing in vitro Is a functional cell population.
  • an anti-CD3 antibody to the lymphokine-active cell culture process, the proliferation of lymphokine-active cells is further accelerated.
  • the cell growth rate is further improved by co-stimulating not only the anti-CD3 antibody but also the anti-CD28 antibody in the culturing step (for example, Non-Patent Document 8).
  • the lymphokine-active cells obtained in this manner have non-specific cytotoxic activity against various cancer cells and other targets.
  • Fibronectin is a huge glycoprotein with a molecular weight of 250,000 that exists in the blood of animals, on the surface of cultured cells, and in the extracellular matrix of tissues, and is known to have various functions.
  • the domain structure is divided into seven parts (see Fig. 1 below), and the amino acid sequence contains three types of similar sequences. ing. Three similar sequences are called type I, type II, and type ⁇ ⁇ . Of these, type ⁇ is composed of amino acid residues 71-96 amino acid residues. The match rate is 17-40%.
  • the 12th, 13th and 14th (hereinafter referred to as ⁇ -12, III-13 and III-14, respectively) are contained in the heparin binding domain.
  • III-10 contains VLA (very late activation antigen) -5 binding region, and its core sequence is RGDS.
  • a region called IIICS exists on the C-terminal side of the heparin-binding domain.
  • IIICS has a region called CS-1 that has binding activity to VLA-4, which has a capacity of 25 amino acids (for example, Non-Patent Documents 9 to 11).
  • lymphokine-active cells and cytotoxic lymphocytes In the production of lymphokine-active cells and cytotoxic lymphocytes, the present inventors have already described the effects of improving the cell proliferation rate and maintaining the cytotoxic activity by using fibronectin and its fragments. Have been studied (eg, US Pat. However, when considering practical application to adoptive immunotherapy, There is a need for a method of expanding lymphocytes that has a higher cell proliferation rate than is never satisfactory.
  • Non-Patent Document 2 Reusser P. and 3 others, Blood, 1991, Vol. 78, No. 5, P1373-l 380
  • Non-Patent Document 3 Riddell S. A. et al., 4 people, Immunol., 1991, Vol. 146, No. 8, P2795 to 2804
  • Non-Patent Document 4 Greenberg P. D. and 1 other, J. Immunol. Methods, 1990, Vol. 128, No. 2, P189-201
  • Non-Patent Document 5 Rosenberg S. A. et al., N. Engl. J. Med., 1987, Vol. 316, No. 15, P889-897
  • Non-Patent Document 6 Rosenberg S. A. et al., N. Engl. J. Med., 1988, Vol. 319, No. 25, P1676-1680
  • Non-patent literature 7 Ho M. et al., 9 people, Blood, 1993, Vol. 81, No. 8, P2093-2101
  • Non-patent literature 8 Koberda J. et al., 2 people, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1993, Vo 1. 119, No. 3, P131-136
  • Non-Patent Document 9 Deane F. Momer, published in 1988, FIBRONECTIN, ACADE MIC PRESS INC., Pl-8
  • Non-Patent Document 10 Kimizuka F. and 8 others, Biochem., 1991, Vol. 110, No. 2, p284-291
  • Patent Document 1 Pamphlet of International Publication No. 96Z06929
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No. 97Z32970
  • Patent Document 3 Pamphlet of International Publication No. 03Z016511
  • Patent Document 4 Pamphlet of International Publication No. 03Z080817
  • Patent Document 5 International Publication No. 2005Z019450 Pamphlet Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide an efficient method for producing lymphocytes suitable for medical use.
  • the first invention of the present invention includes a step of performing expansion culture in the presence of (a) fibronectin, a fragment thereof or a mixture thereof, (b) CD3 ligand, and (c) CD28 ligand.
  • the present invention relates to a method for producing lymphocytes.
  • the CD3 ligand is anti-CD3 antibody power.
  • the CD28 ligand is exemplified by an anti-CD28 antibody.
  • the fibronectin fragment may be a polypeptide (m) comprising at least one amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 8 in the sequence listing, or 1 in the above amino acid sequence.
  • a polypeptide comprising at least one amino acid sequence in which a plurality of amino acids are substituted, deleted, inserted or appended, and a polypeptide (n) having a function equivalent to that of the polypeptide (m) is exemplified.
  • fibronectin fragments include those having cell adhesion activity and Z or hen binding activity.
  • the fibronectin fragment is exemplified by at least one polypeptide selected from the group consisting of polypeptides having any one of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 9 to 21 in the Sequence Listing.
  • lymphokine-active sputum cells are exemplified as lymphocytes.
  • the first invention of the present invention also provides a method for producing lymphocytes, further comprising the step of introducing a foreign gene into the lymphocyte.
  • a method for producing lymphocytes further comprising the step of introducing a foreign gene into the lymphocyte.
  • the method for introducing a foreign gene include a method using a retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus or simian virus.
  • the second invention of the present invention relates to lymphocytes obtained by the first invention of the present invention.
  • the third invention of the present invention also relates to a medicine containing the second invention of the present invention as an active ingredient.
  • the fourth invention of the present invention is characterized in that a solid phase is brought into contact with at least one selected from the group consisting of an anti-CD3 antibody, an anti-CD28 antibody, fibronectin and a fragment thereof under acidic conditions.
  • Anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, fibronectin and its fragment The present invention relates to a method for producing a solid phase in which at least one selected from the group consisting of In the fourth invention of the present invention, the solid phase is exemplified by a carrier for cell culture.
  • the fifth invention of the present invention relates to a solid phase on which (a) fibronectin, a fragment thereof or a mixture thereof, (b) a CD3 ligand, and (c) a CD28 ligand are immobilized.
  • examples of the solid phase include a cell culture plate, a petri dish, a flask, a bag, a bead, a membrane, or a slide glass.
  • the present invention provides an efficient method for producing lymphocytes.
  • This production method is a very useful method with a high cell growth rate. Therefore, since the lymphocytes obtained by the present invention are suitably used for adoptive immunotherapy, for example, a great contribution to the medical field is expected.
  • the present invention includes a step of expanding lymphocytes in the presence of (a) fibronectin, a fragment thereof or a mixture thereof, (b) CD3 ligand, and (c) CD28 ligand. It has been found that the cell growth rate is high and has been completed.
  • lymphocytes refers to an operation including a step of expanding the cells.
  • the production of lymphocytes of the present invention is also referred to as lymphocyte culture.
  • the fibronectin and fragments thereof described herein may be either naturally occurring or artificially synthesized. Fibronectin and fragments thereof are described in, for example, Ruoslahti E. et al. (Ruoslahti E., et al., Journal 'Ob' Biological 'Chemistry, J. Biol. Chem. 7281 (1981)], it can be produced in substantially pure form from naturally occurring substances.
  • the substantially pure fibronectin or fibronectin fragments described herein essentially contain other proteins that are naturally present together with fibronectin. Means not.
  • the above Blonectin and fragments thereof can be used in the present invention alone or in a mixture of plural kinds.
  • fibronectin is known to have many splicing variants, any of the fibronectins used in the present invention may be used as long as it exhibits the desired effect of the present invention. be able to.
  • a region called ED-B that exists upstream of the cell-binding domain and a region called ED-A that exists between the cell-binding domain and the heparin-binding domain are deleted. It is known that! /, However, such plasma-derived fibronectin can also be used in the present invention.
  • Fibronectin fragments that can be used in the present invention, as well as useful information regarding the preparation of the fragments, are described in Kimika F. et al. [13 ⁇ 41 ⁇ (1111 ⁇ F., et al., Journal 'Ob' Biochemistry ( J. Biochem.), 110, 284-291 (1991)], Corn Bullet AR et al. [1 ⁇ 01: 111) 011 AR, et al., EMBO Journal (EMBO J.), 4th, 7, 1755-1759 (1985)], and Sekiguchi K. 3 ⁇ 4 [Sekiguchi K., et al., Biochemistry, 25th, 17th, 4936-4951 (1986;)], etc. Obtainable.
  • the nucleic acid sequence encoding fibronectin or the amino acid sequence of fibronectin is disclosed in Genbank Accession No. NM-002026, NP_002017.
  • fibronectin fragments include, for example, III-8 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing), ⁇ -9 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) ), III-10 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing), ⁇ —11 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), III 12 (represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing) Amino acid sequence), ⁇ —13 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing), ⁇ —14 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing), and CS—1 (sequence listing)
  • a polypeptide (m) comprising at least one amino acid sequence constituting any region of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 (see Fig.
  • amino acid sequence comprising at least one comprising at polypeptides, Poribe having equivalent functions to the polypeptide (m) Peptide (n) is exemplified.
  • the length of the fragment for example, the number of amino acids is 20 to 1000 force, more preferably 100 to 800 force.
  • the term “multiple” is a concept including several pieces, 2 to 12 pieces are preferred, 2 to 10 pieces are more preferred, and 2 to 8 pieces are more preferred. It is the same.
  • a fragment having cell adhesion activity and Z or hen binding activity can be preferably used as the fragment.
  • the cell adhesion activity can be examined by assessing the binding between the fragment used in the present invention (its cell binding domain) and the cell using a known method.
  • such methods include the method of Williams D. A. et al. (Williams D. A., et al., Nature, 352, 438-441 (1991)).
  • This method is a method for measuring the binding of cells to a fragment immobilized on a culture plate.
  • the heparin binding activity can be examined by assessing the binding of the fragment used in the present invention (its heparin binding domain) to heparin using a known method.
  • fibronectin fragments include C 274 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing), H-271 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the sequence listing), H-296 ( Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing), CH-271 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 in the sequence listing), CH-296 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing) A polypeptide selected from the group consisting of C—CS1 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 in the Sequence Listing) and CH—296N a (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 in the Sequence Listing). Illustrated.
  • Each fragment of CH-271, CH-296, CH-296Na, C-274, and C-CS1 is a polypeptide having a cell binding domain having an activity of binding to VLA-5.
  • C-CS1, H-296, CH-296, and CH-296Na are polypeptides having CS-1 having an activity of binding to VLA-4.
  • H-271, H-296, CH-271, CH-296 and CH-296Na are polypeptides having a heparin-binding domain.
  • CH-296Na is derived from the cell binding domain in plasma fibronectin.
  • a fragment in which each of the above domains is modified can also be used.
  • the heparin-binding domain of fibronectin is composed of three type III sequences ( ⁇ -12, III-13, 1 11-14).
  • a fragment containing a heterogen binding domain from which one or two of the type III sequences have been deleted can also be used in the present invention.
  • the cell binding site of fibronectin VLA-5 binding region, Prol239 to Serl515) and one type III sequence CHV-89 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15), CHV-90 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 in the Sequence Listing), CHV-92 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 in the Sequence Listing), or CHV that is a fragment in which two ⁇ -type sequences are combined — 179 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 in the Sequence Listing), CHV—181 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 in the Sequence Listing).
  • CHV-89, CHV-90, and CHV-92 contain III-13, 111-14, and III-12, respectively, CHV-179 contains III-13 and III-14, and CHV-181 contains III-12. And III—1 3 respectively.
  • a fragment obtained by adding an amino acid to each of the above fragments can also be used in the present invention.
  • the fragment can be produced, for example, by adding a desired amino acid to each of the above fragments.
  • H-275-Cys amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 in the sequence listing
  • SEQ ID NO: 20 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 in the sequence listing
  • the fragment used in the present invention has a function equivalent to that of the fragment containing at least a part of the amino acid sequence of the natural fibronectin exemplified above as long as the desired effect of the present invention is obtained. It may be composed of a polypeptide having an amino acid sequence having substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of the polypeptide constituting the fragment.
  • amino acid substitution and the like are preferably such that the physical and physical properties of the polypeptide can be changed within a range in which the function of the original polypeptide can be maintained.
  • substitution etc. of amino acids the nature (e.g., hydrophobic, hydrophilic, electrostatic load, P K, etc.) peculiar to a polypeptide that substantially conservative range that does not change is preferably a.
  • amino Acid substitutions are: 1. Glycine, alanine; 2. Norrin, isoleucine, leucine; 3. Aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine; 4. Serine, threonine; 5.
  • Lysine, arginine This is a substitution within each group of luranin and tyrosine.
  • Deletion, addition, and insertion of amino acids substantially change the properties of the amino acids around the target site in the polypeptide with properties similar to those around the target site. Deletion, addition, and insertion within a range that does not change the target are preferable.
  • the N-terminal methionine is affected by the influence of methionine beptidase derived from E. coli.
  • Such polypeptides may also be used in the present invention although they may be deleted. That is, polypeptides lacking the N-terminal methionine of the polypeptides described in SEQ ID NOs: 20 and 21 in the sequence listing can also be suitably used in the present invention.
  • the amino acid substitution or the like may be naturally occurring due to species differences or individual differences, or may be artificially induced. Artificial induction is not particularly limited as long as it can be performed by a known method.
  • one or more bases are substituted in a nucleic acid encoding the above-mentioned region derived from natural fibronectin or a predetermined fragment by a known method.
  • the polypeptide constituting the fragment or the like having a function equivalent to that of the above-mentioned region derived from natural fibronectin or the predetermined fragment.
  • a polypeptide containing an amino acid sequence having a substitution in the amino acid sequence can be produced.
  • “having an equivalent function” means that it has an effect of improving the expansion rate of lymphocytes possessed by the polypeptide force fibronectin fragment as a comparative control.
  • the action can be appropriately confirmed according to the method described in Example 1 described later.
  • those having cell adhesion activity and Z or henolin binding activity are preferred.
  • the cell adhesion activity and the hydrogen binding activity can be evaluated according to the above-described activity measuring method.
  • fragments consisting of a polypeptide having an amino acid substitution for example, two fragments Fragments in which one or more amino acids are inserted as linkers between these domains can also be used in the present invention.
  • fibronectin is also a polypeptide having an amino acid sequence having one or more amino acid substitutions, deletions, insertions or additions in the amino acid sequence of the polypeptide, similar to the above-mentioned fragment, A polypeptide having an effect of improving the expansion rate of spheres can be used in the present invention.
  • the fibronectin or fragment thereof used in the present invention is equivalent to the natural fibronectin exemplified above and a fragment containing at least a part of its amino acid sequence as long as the desired effect of the present invention is obtained.
  • a polypeptide having 50% or more homology with the amino acid sequence of the polypeptide constituting the fibronectin or a fragment thereof having a unique function preferably a polypeptide having 70% or more homology, more preferably 90%
  • Polypeptides having the above homology can be used, more preferably peptides having a homology of 95% or more.
  • DNASIS Pro Ver. 2.6 manufactured by Takara Bio Inc.
  • the fibronectin fragment described in the present specification is produced as a recombinant fibronectin fragment from a gene recombinant based on the description in US Pat. No. 5,198,423, for example. You can also.
  • H-271 SEQ ID NO: 10
  • H-296 SEQ ID NO: 11
  • CH-271 SEQ ID NO: 12
  • CH-296 SEQ ID NO: 13
  • the C-274 (SEQ ID NO: 9) fragment can be obtained by the method described in US Pat. No. 5,102,988. Furthermore, the C—CS1 (SEQ ID NO: 14) fragment can be obtained by the method described in Japanese Patent No. 3104178.
  • the above fragments of CHV-89 (SEQ ID NO: 15), CHV-90 (SEQ ID NO: 16), and CHV-179 (SEQ ID NO: 18) can be obtained by the method described in Japanese Patent No. 2729712.
  • the CHV-181 (SEQ ID NO: 19) fragment can be obtained according to the method described in WO 97Z18318 pamphlet.
  • CHV-92 (SEQ ID NO: 17) fragment is disclosed in Japanese Patent No. 2729712 With reference to the booklet and pamphlet of International Publication No. 97Z18318, a plasmid can be routinely constructed based on the plasmids described in those documents, and genetically engineered using the plasmid.
  • FERM BP-2264 Escherichia coli carrying a plasmid encoding H-271; deposit date 19 Jan. 30, 1989
  • FERM BP-2800 Escherichia coli carrying a plasmid encoding CH-296; deposit date 12 May 1989
  • FERM BP-2799 E. coli carrying a plasmid encoding CH-271; deposit date 12 May 1989
  • FERM BP—7420 E. coli harboring a plasmid encoding H—296; deposit date 19 May 12 12
  • FERM BP— 1915 Escherichia coli carrying a plasmid encoding C— 274; date of deposit 19 June 1888
  • FERM BP— 5723 Escherichia coli carrying a plasmid encoding C—CS1; deposit date 1 March 5th, 990
  • FERM BP—10073 (plasmid encoding CH—296Na; date of deposit July 2004 2 3 ⁇ )
  • FERM P—12182 E. coli carrying a plasmid encoding CHV—89; deposit date 8 April 1991
  • FERM P-12183 E. coli harboring a plasmid encoding CHV-179; deposit date 8 April 1991.
  • fibronectin is a large glycoprotein, it is not always easy to prepare and use a protein of natural origin for industrial and pharmaceutical production.
  • fibronectin is a multifunctional protein, it may be caused by inconvenience due to a region different from the region that is effective for the method of the present invention depending on the situation of its use. Therefore, in the present invention, from the viewpoint of availability, ease of handling, and safety, it is preferable to use a fibronectin fragment, more preferably a recombinant fibronectin fragment obtained as described above. It is preferable to use it.
  • the molecular weight of the fibronectin fragment used in the present invention is not particularly limited, but is preferably 1 to 20 OkD, more preferably 5 to 190 kD, and even more preferably 10 to 180 kD.
  • the molecular weight can be measured, for example, by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • amino acid sequence of the polypeptide constituting the fibronectin fragment of the present invention the amino acid sequence portion other than the amino acid sequence of the polypeptide constituting the naturally derived fibronectin fragment is the desired effect of the present invention. It is optional as long as it does not inhibit the expression of, and is not particularly limited.
  • the method of the present invention includes the step of (a) expanding the lymphocytes in the presence of the aforementioned fibronectin, a fragment thereof or a mixture thereof, (b) CD3 ligand, and (c) CD28 ligand.
  • This is a method for producing lymphocytes.
  • (a) the aforementioned fibronectin, a fragment thereof or a mixture thereof, (b) CD3 ligand, and (c) CD28 ligand may be referred to as an active ingredient of the present invention.
  • the lymphocyte means a group of cells containing lymphocytes.
  • lymphocyte expansion culture for example, ex vivo is performed by appropriately adjusting the type of cells to be subjected to the method, culture conditions, and the like.
  • lymphokine-active ⁇ cells cytotoxic T cells (CTL), tumor infiltrating lymphocytes (TI L), NK
  • CTL cytotoxic T cells
  • TI L tumor infiltrating lymphocytes
  • NK examples thereof include a cell population containing at least one kind of cells such as cells, naive cells and memory cells.
  • lymphokine-active cells are cells obtained by adding IL 2 to peripheral blood (peripheral blood leukocytes) containing lymphocytes, umbilical cord blood, tissue fluid, etc., and culturing in vitro for several days. Indicates a functional cell population with damaging activity.
  • Such a cell population is generally called a lymphokine-active killer cell (LAK cell), but since the cell population includes cells that are not cytotoxic, In this specification, the cell population will be referred to as lymphokine-active cells.
  • LAK cell lymphokine-active killer cell
  • examples of cells used for the production of lymphocytes include peripheral blood mononuclear cells (PBM C), NK cells, naive cells, memory cells, hematopoietic stem cells, cord blood mononuclear cells, and the like. It is. Any blood cell can be used in the present invention. Any of these cells collected from a living body, or those obtained by culturing in vitro can be used as they are or as they are frozen and stored.
  • a material containing the cells for example, blood such as peripheral blood and umbilical cord blood, blood from which components such as erythrocytes and plasma are removed, bone marrow fluid, etc. Can be used.
  • CTLs induced by applying antigen stimulation to the cells as described above, or CTLs derived from living organisms can also be used.
  • the method for producing lymphocytes of the present invention is a method for producing lymphocytes comprising the step of expanding and culturing in the presence of the active ingredient of the present invention. Or in any part of the period. In other words, any lymphocyte production process that includes the above-described process is included in the present invention.
  • the CD3 ligand is not particularly limited as long as it is a substance having binding activity to CD3.
  • an anti-CD3 antibody is exemplified, and preferably an anti-CD3 monochroma. And okt3 is particularly preferred.
  • the concentration of the CD3 ligand in the culture solution is not particularly limited.
  • an anti-CD3 monoclonal antibody for example, 0.001 to 100 8 111 is suitable, and 0.01 to: LOO / z gZmL is more preferred.
  • the CD28 ligand is not particularly limited as long as it is a substance having a binding activity to CD28.
  • examples thereof include anti-CD28 antibodies, B7-1, B7-2, and CD80.
  • a suitable example is an anti-CD28 monoclonal antibody.
  • the concentration of the CD28 ligand in the culture solution is not particularly limited.
  • it is suitable for example 0.001 to 100 8 7111, and 0.01 to: LOO / zg / mL is more preferred.
  • the concentration of fibronectin, a fragment thereof, or a mixture thereof in the culture solution is not particularly limited, and is preferably, for example, 0.001 to 500 / ⁇ 8 ⁇ ⁇ , 0.01 to 500 It is suitable for 8/111 months.
  • a known medium prepared by mixing components necessary for expansion culture of lymphocytes which is not particularly limited, can be used. These media can be appropriately selected and used. These media may contain appropriate proteins, cytosines, and other components in addition to the essential components.
  • a medium containing IL-2 is used in the present invention.
  • the concentration of IL-2 in the medium is not particularly limited. For example, it is preferably 0.01 to 1 ⁇ 10 5 UZmL, and more preferably 0.1 to 1 ⁇ 10 4 UZmL.
  • a lymphocyte stimulating factor such as lectin may be added.
  • the concentration of the component in the medium is not particularly limited as long as a desired effect is obtained.
  • serum or plasma can be added to the medium.
  • the amount of applied force in these media is not particularly limited, but is exemplified by 0% to 20% by volume.
  • the present inventors also produced serum lymphocytes in the medium by producing lymphocytes in the presence of fibronectin, a fragment thereof or a mixture thereof. Lymphocytes that maintained a high expansion rate even when the total concentration of selenium was 0% by volume or more and less than 5% by volume It is found that can be manufactured.
  • the total concentration of serum and plasma in the medium is preferably 0% by volume or more and less than 5% by volume from the viewpoint of reducing safety and the burden on patients.
  • the origin of serum or plasma may be either self (meaning that the origin is the same as the lymphocyte to be cultured) or non-self (meaning that the origin is different from the lymphocyte to be cultured).
  • self-derived ones can be used from the viewpoint of safety.
  • the total concentration of serum and Z or plasma being 0% by volume means that serum or plasma is not added to the medium.
  • the production of lymphocytes is usually performed in a medium containing a predetermined component in the presence of the active ingredient of the present invention.
  • the number of cells at the start of the culture used in the present invention is not particularly limited.
  • lc ell / mL to l X 10 8 cells / mL preferably lcell / mL to 5 X 10 7 cells / mL.
  • the conditions used for normal cell culture can be used without any particular limitation on the culture conditions. For example, it can be cultured under conditions such as 37 ° C. and 5% CO.
  • the fresh medium can be added for dilution, the medium can be changed, or the cell culture equipment can be replaced.
  • the cell culture equipment used in the method for producing lymphocytes of the present invention is not particularly limited.
  • a cell culture plate, a petri dish, a flask, a bag, a large culture tank, a nanoreactor, or the like is used. be able to.
  • NOG CO for cell culture
  • Gas permeable bags can be used.
  • a large culture tank can be used when industrially producing a large amount of lymphocytes.
  • the culture can be carried out in either an open system or a closed system. From the viewpoint of the safety of the obtained lymphocytes, it is preferable to carry out the culture in a closed system.
  • fibronectin, a fragment thereof or a mixture thereof, (b) CD3 ligand, and (c) CD28 ligand used in the present invention are dissolved in a medium and coexist.
  • Solid phase eg cell culture plates, petri dishes, flasks, noggs and other cell culture equipment (including both open and closed systems), beads, membranes It may be used after being fixed to a cell culture carrier such as a lens or a slide glass.
  • the solid phase material is not particularly limited as long as it can be used for cell culture. For example, when the component is fixed to the equipment, when the medium is put into the equipment, the ratio is the same as the desired concentration when the component is dissolved in the medium.
  • the fixed amount of the component is not particularly limited as long as a desired effect is obtained.
  • the carrier is used by immersing it in a culture solution in a cell culture equipment during cell culture. When the component is immobilized on the carrier, the amount of medium to be placed in the equipment so that when the carrier is placed in the medium, the ratio is the same as the desired concentration when the component is dissolved in the medium. However, it is preferable to fix a certain amount of each component, but the fixed amount of each component is not particularly limited as long as a desired effect is obtained! /.
  • a solid phase on which (a) fibronectin, a fragment thereof or a mixture thereof, (b) CD3 ligand, and (c) CD28 ligand are immobilized.
  • the solid phase include the above-mentioned solid phase, preferably cell culture plates, petri dishes, flasks, nogs, beads, membranes, glass slides and the like.
  • the amount of immobilization of (a) to (c) above in the solid phase is particularly limited as long as a desired effect is obtained when the solid phase is used in the method for producing lymphocytes of the present invention.
  • the fixing method (a) to (c) described above it is preferable from the viewpoint of improving the efficiency of the fixing method that the fixing method is preferably performed under acidic conditions described later. ,.
  • the method for immobilizing these antibodies fibronectin and its fragment on the solid phase is not particularly limited. These antibodies can be immobilized in contact with a solid phase in a buffer solution. Particularly preferably, as described in Examples 2 and 3 to be described later, these antibodies can be immobilized more efficiently by immobilization under acidic conditions. . It is to be noted for the first time in the present invention that immobilization of these antibodies, fibronectin and fragments thereof, is carried out under acidic conditions. This is a finding.
  • the solid phase is brought into contact with at least one selected from the group consisting of anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, fibronectin and fragments thereof under acidic conditions.
  • the acidic condition is preferably ⁇ 1 to 6.5, more preferably 4 to 6.5.
  • the aforementioned cell culture carriers and the like are preferably exemplified, and these carriers can be used regardless of the material and the presence or absence of surface treatment.
  • the immobilization of the fibronectin fragment to the solid phase can also be carried out by the methods described in WO97Z18318 pamphlet and WO00Z09168 pamphlet.
  • lymphocytes can be obtained by the method of the present invention, and then the lymphocytes and the solid phase can be separated.
  • the active ingredient or the like and the lymphocyte can be easily separated, and mixing of the active ingredient or the like into the lymphocyte can be prevented.
  • acidic polysaccharides, acidic oligosaccharides, acidic monosaccharides and their salt strength which are effective for culturing cytotoxic T cells having antigen-specific cytotoxic activity described in WO 02Z14481
  • a compound selected from the group consisting of the above-mentioned compounds or a substance selected from the following (A) to (D) forces described in WO 03Z01651 No. 1 may be used together with the above components.
  • Examples of the substance having binding activity to CD44 include CD44 ligand and Z or anti-CD44 antibody.
  • Examples of substances capable of controlling the signal emitted by binding to the CD44 ligand CD44 include various phosphate enzymes and dephosphate fermentations. Elemental inhibitors or activators.
  • Substances that can inhibit the binding of growth factors to growth factor receptors include, for example, growth factor binding activity that inhibits growth factors from binding to growth factor receptors by forming complexes with growth factors. Examples include substances that have binding activity to substances or growth factor receptors, and that inhibit growth factors from binding to growth factor receptors.
  • examples of the substance capable of controlling a signal emitted when a growth factor binds to a growth factor receptor include various phosphorylase and dephosphorase inhibitors or activators.
  • concentration of these components in the medium is not particularly limited as long as a desired effect is obtained. Further, these components may be dissolved in a medium and coexist, or may be used after being fixed to an appropriate solid phase as described above.
  • the above various substances can be used alone or in combination of two or more.
  • the components described in International Publication No. 02Z14481 pamphlet and International Publication No. 03Z016 511 can be present in a state capable of exerting their functions when lymphocytes are expanded.
  • the existence state is not particularly limited.
  • the active ingredient can be dissolved in a medium to be used or immobilized on an appropriate solid phase.
  • the content of the component in the culture solution is not particularly limited as long as a desired effect is obtained, but for example, preferably 0.0001 to 10000 gZmL, more preferably 0.001 to 10000.ug. / mL, more preferably 0.005 to 5000 ⁇ g / mL, still more preferably 0.01 to: LOOO / zg / mL.
  • lymphocytes cultured by the method of the present invention can be cloned and maintained as stable lymphocytes.
  • the lymphocytes obtained by the method of the present invention can be used to further expand the cells by the method of the present invention or a known method to obtain lymphocytes.
  • the lymphocyte population obtained by the method of the present invention contains lymphocytes having cytotoxic activity, and the lymphocytes have the ability to recognize desired target cells, for example, target cells. Is destroyed by its cytotoxic activity.
  • the cytotoxic activity of this cytotoxic lymphocyte can be evaluated by a known method. For example, the cytotoxic activity of cytotoxic lymphocytes against target cells labeled with radioactive substances, fluorescent substances, etc. is determined by cytotoxic lymphocytes. It can be evaluated by measuring the radioactivity and fluorescence intensity derived from the destroyed target cells. It can also be detected by measuring the amount of cytodynamic force such as GM-CSF and IFN- ⁇ that are specifically released from cytotoxic lymphocytes and target cells.
  • cytotoxic lymphocytes are contacted with a first fluorescent marker coupled with a cytotoxic lymphocyte-specific antibody and then contacted with an antigen peptide MHC complex coupled with a second fluorescent marker.
  • the cytotoxic activity of cytotoxic lymphocytes can be evaluated by analyzing the presence of double-labeled cells by flow cytometry.
  • the present inventors also cultivated lymphocytes in the presence of fibronectin, a fragment thereof, or a mixture thereof, thereby cultivating low cell viability.
  • culture can be performed at a high expansion culture rate. Therefore, sufficient expansion of lymphocytes can be performed by a culture operation using one cell culture device, in other words, by one culture system. Therefore, the method of the present invention can realize a method for producing lymphocytes that does not require a step of diluting the cell culture medium.
  • the expansion culture of lymphocytes of the present invention is started in a cell culture device by a low cell count
  • the following conditions (X) and ( ⁇ ) are selected at the start of the culture. This can be done using low or low density cell mass.
  • the ratio of the cell volume to the culture area in the cell culture equipment to be used is preferably lcell / cm 2 to 5 X 10 5 cells / cm 2 , more preferably 10 cells / cm 2 to l X 10 5 cells / cm 2 , more preferably 1 ⁇ 10 2 cells / cm 2 to 5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • (Y) Concentration of cells in the medium Preferably lcellZmL to 5 X 10 5 cellsZmL, more preferably 10cellsZmL to 1 X 10 5 cells / mL, more preferably 1 X 10 2 cells ZmL to 5 X 10 4 cells / mL.
  • the amount of cells refers to the number of cells used for culture.
  • the method of the present invention exemplifies a method in which expansion of lymphocytes is performed in one culture system without requiring a step of dilution of the cell culture solution.
  • the method of the present invention can be preferably used when proliferating CTLs having a small number of selected cells.
  • the present inventors perform culturing at a high cell number by producing lymphocytes in the presence of fibronectin, a fragment thereof or a mixture thereof. I have found that it is possible.
  • a method for producing lymphocytes in cell culture equipment in which at least one step of diluting the cell culture medium with a fresh medium, replacing the medium, or cells during the culture
  • the cell concentration in the cell culture medium immediately after these steps is set to a high concentration
  • the cell concentration in the cell culture medium is 2 X 10 5 cell s / mL to l X 10 8 cells / mL, preferably 2 X 10 5 cells / mL to 5 X 10 7 cells / mL, more preferably 2 X 10 5 cells / mL to 2 X 10 7 cells / mL
  • cell culture high density ratio of the culture area in the cell number and cell culture equipment in the liquid e.g., ratio of 1 X 10 5 and culture area in the cell number and cell culture equipment in cell culture ce ll S / cm 2 to l X 10 8 cells / cm 2 , preferably 1 X 10 5 cells / cm 2 to 5 X 10
  • the culture with a high cell number of the present invention is used when setting the cell concentration and cell density during such culture!
  • the concentration of cells in the cell culture medium is 2 X 10 5 cells / mL to l X 10 8 cells / mL or high density or high density condition where the ratio of the number of cells in the cell culture medium to the culture area in the cell culture equipment is 1 X 10 5 cells / cm 2 to 1 X 10 8 cells / cm 2 Refers to the production of lymphocytes.
  • the term “immediately after the step of diluting the cell culture medium with a fresh medium”, “immediately after the process of replacing the medium”, or “immediately after the process of replacing the cell culture equipment” does not include the beginning of the culture.
  • the medium be suitable for the maintenance and growth of both lymphocytes and feeder cells.
  • the culture As the ground, a commercially available medium can be used.
  • the feeder cell used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it stimulates lymphocytes in combination with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody and activates the T cell receptor.
  • B cells EBV-B cells
  • PBMC PBMC
  • Epstein-Barr virus are used.
  • feeder cells are used after depriving of proliferation ability by means such as irradiation.
  • the content of feeder cells in the medium may be determined according to a known method. For example, 1 ⁇ 10 5 cells / mL to 1 ⁇ 10 7 cel lsZmL is suitable.
  • non-virus-infected cells such as EBV-B cells are used as feeder cells.
  • EBV-B cells are used as feeder cells. This eliminates the possibility of EB V- B cells being mixed in expanded lymphocytes, and increases the safety of medical care using cytotoxic lymphocytes such as adoptive immunotherapy. It becomes possible.
  • IL 2 When producing lymphokine-active rod cells by the production method of the present invention, IL (a) fibronectin, a fragment thereof or a mixture thereof, (b) CD3 ligand, and (c) CD28 ligand, IL 2 is incubated with peripheral blood mononuclear cells (PBMC), NK cells, umbilical cord blood mononuclear cells, hematopoietic stem cells or blood components containing these cells.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • NK cells NK cells
  • umbilical cord blood mononuclear cells hematopoietic stem cells or blood components containing these cells.
  • lymphokine-active cells are known conditions [eg, cell engineering, Vol. 14, No. 2, except that the above-mentioned medium is used. p223-227, (1995); cell culture, 17, (6), pl92-195, (1991); THE LANCET, Vol. 356, ⁇ 802-807, (2000); Current Protocols in Immunology, sup plement 17 , See UNIT 7.7].
  • the culture conditions are not particularly limited, and can be those used for normal cell culture, such as 37 ° C, 5% CO, etc.
  • 2 Can be cultured under conditions. This culture is usually carried out for about 2 to 15 days. In addition, a step of diluting the cell culture solution at an appropriate time interval, a step of replacing the medium, or a step of replacing the cell culture equipment may be performed.
  • the lymphocytes obtained by the production method of the present invention have a feature that the production amount of IL-2 is very large.
  • IL-2 production from lymphocytes is an indicator of lymphocyte activity as described in Zhou X. Y. et al., The jounal of immunology, Vol. 168, 3847-3854, (2002).
  • the amount of IL 2 produced is higher compared to stimulation with anti-CD3 antibody alone. It is known to be expensive.
  • the lymphocytes obtained by the production method of the present invention have extremely high IL-2 production, so that they are activated lymphocytes and are suitable for use in adoptive immunotherapy.
  • lymphocytes produced by the method of the present invention are not particularly limited, and examples thereof include cancer, malignant tumors, hepatitis, viruses such as influenza and HIV, bacteria, and fungi. Examples of causative infectious diseases such as tuberculosis, MRSA, VRE, and deep mycosis. In addition, when a foreign gene is further introduced as described later, an effect is expected for various gene diseases.
  • the lymphocytes produced by the method of the present invention can also be used for bone marrow transplantation and donor lymphocyte infusion for the purpose of preventing infection after irradiation.
  • a lymphocyte culture medium containing (a) fibronectin, a fragment thereof or a mixture thereof, (b) a CD3 ligand, and (c) a CD28 ligand as an active ingredient. Is done.
  • the medium further comprises other optional components, for example, medium components used for known cell culture, proteins, cytosines (preferably IL 2), and other desired components.
  • the content of the active ingredient of the present invention in the medium is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention is obtained. According to the content of the active ingredient and the like in the medium used in the method, it can be appropriately determined as desired.
  • One embodiment of the medium of the present invention includes (a) fibronectin, a fragment thereof or a mixture thereof, (b) a CD3 ligand, and (c) a medium containing a cell culture carrier on which a CD28 ligand is immobilized, And (a) fibronectin, a fragment thereof or a mixture thereof, (b) a CD3 ligand, and (c) a medium provided by being enclosed in a cell culture device on which a CD28 ligand is immobilized.
  • the present invention provides lymphocytes obtained by the above-described method for producing lymphocytes of the present invention.
  • the present invention also provides a medicament (therapeutic agent) containing the lymphocyte as an active ingredient.
  • the therapeutic agent containing the lymphocyte is suitable for use in adoptive immunotherapy.
  • adoptive immunotherapy lymphocytes suitable for treating a patient are administered to the patient, for example, by intravenous administration.
  • the therapeutic agent is very useful for use in the aforementioned diseases and donor lymphocyte infusion.
  • the therapeutic agent is in accordance with a method known in the pharmaceutical field, for example, the lymphocyte prepared by the method of the present invention as an active ingredient, for example, an organic or inorganic carrier suitable for known parenteral administration, an excipient. It can be prepared by mixing with agents, stabilizers and the like.
  • the content of the lymphocytes of the present invention in the therapeutic agent, the dosage of the therapeutic agent, and various conditions relating to the therapeutic agent can be determined as appropriate according to known adoptive immunotherapy.
  • the method for producing lymphocytes of the present invention can further include a step of introducing a foreign gene into the lymphocytes. That is, the present invention provides, as one aspect thereof, a method for producing lymphocytes further comprising a step of introducing a foreign gene into lymphocytes. “Outpatient” refers to being out of the lymphocytes targeted for gene transfer.
  • the proliferation ability of the cultured lymphocytes is enhanced. Therefore, an increase in gene introduction efficiency is expected by combining the method for producing lymphocytes of the present invention with a gene introduction step.
  • the gene transfer step can be performed at any time during the production of lymphocytes. For example, it is suitable from the viewpoint of work efficiency, which is performed simultaneously with the expansion culture of the lymphocytes or after the step.
  • the virus vector is not particularly limited, and is usually a known virus vector used in gene transfer methods, such as a retrovirus vector, a lentivirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, and a simian virus vector.
  • a silkworm virus vector or a Sendai virus vector is used.
  • a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a lentivirus vector or a simian virus vector is used as the virus vector.
  • those lacking replication ability are preferable so that they cannot self-replicate in infected cells.
  • the retroviral vector and the lentiviral vector are inserted into the chromosomal DNA of the cell into which the vector is introduced! And can stably incorporate foreign genes, and can be used for gene therapy and the like. Is used. Since the vector has a high infection efficiency for dividing and proliferating cells, it is suitable for gene transfer in the expansion culture process of the present invention.
  • the method for gene transfer without using a viral vector is not limited to the present invention.
  • a method using a carrier such as ribosome or ligand-polylysine, a calcium phosphate method, an electoral position method, The particle gun method can be used.
  • a foreign gene incorporated into plasmid DNA or linear DNA is introduced.
  • any gene that is desired to be introduced into the cell can be selected without any particular limitation as the foreign gene introduced into the lymphocyte.
  • a gene for example, a gene encoding a protein (for example, an enzyme, a cytodynamic ins, a receptor, etc.), an antisense nucleic acid, siRNA (small interfering RNA), or a gene encoding a ribozyme can be used.
  • siRNA small interfering RNA
  • a gene encoding a ribozyme can be used.
  • an appropriate marker gene that enables selection of the transfected cells may be introduced at the same time.
  • the foreign gene can be used, for example, by inserting it into a vector or a plasmid so that it can be expressed under the control of an appropriate promoter.
  • efficient gene transfer Other regulatory elements that cooperate with the promoter and transcription start site, such as an enhancer sequence and a terminator sequence, may be present in the vector to achieve replication.
  • homology is established between the nucleotide sequences on both sides of the desired target insertion site of the gene in the chromosome.
  • An exogenous gene may be arranged between flanking sequences consisting of the nucleotide sequences.
  • the foreign gene to be introduced may be a natural gene, an artificially produced gene, or a DNA molecule having a different origin and bound by a known means such as ligation. Furthermore, it may have a sequence in which a mutation is introduced into a natural sequence according to the purpose.
  • a gene encoding an enzyme related to resistance to a drug used for treatment of a patient such as cancer is introduced into the lymphocyte to impart drug resistance to the lymphocyte.
  • a gene encoding an enzyme related to resistance to a drug used for treatment of a patient such as cancer is introduced into the lymphocyte to impart drug resistance to the lymphocyte.
  • drug resistance genes include multidrug resistance genes.
  • a gene that confers sensitivity to a specific drug can be introduced into lymphocytes to impart sensitivity to the drug.
  • a gene that confers sensitivity to a drug is a thymidine kinase gene.
  • Example 1 Measurement of expansion culture rate in lymphocyte expansion culture by co-stimulation with CH-296, anti-human CD3 antibody and anti-human CD28 antibody
  • PBMC Middle layer peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs PBMCs are rapidly dissolved in a 37 ° C water bath, washed with RPMI1640 medium (SIGMA) containing 10 ⁇ g / mL DNase (Calbiochem), and then trypan blue staining. The number of viable cells was calculated and used for each experiment.
  • SIGMA RPMI1640 medium
  • a 12-well cell culture plate (Betaton Dickinson) was added with 1.9 mL of an acetate buffer aqueous solution containing an anti-human CD3 antibody (manufactured by Janssen Kyowa Co., Ltd.) having a final concentration of 5 ⁇ g ZmL.
  • the acetate buffer aqueous solution is composed of 0.2M acetic acid (manufactured by Nacalai Tester, 00212-43) and 0.2M sodium acetate aqueous solution (manufactured by Nacalai Testa, 311-19) at a ratio of 1: 4 (volume ratio). ) To adjust the pH to 5.3.
  • anti-human CD28 antibody (DakoCytomation, RB342) was added to the group stimulated with anti-human CD28 antibody so that the final concentration was 5 ⁇ g ZmL.
  • -296 was added to a final concentration of 25 ⁇ g ZmL. After incubating these plates at room temperature for 5 hours, the acetate buffer solution containing the antibody and CH-296 is removed by aspiration, and each cell is washed twice with phosphate buffered saline and once with RPMI medium. It used for each experiment.
  • Example 1 (1) Prepared in Example 1 (1) so that it becomes 0.5 X 10 6 cells / mL in AIM-V (Invitrogen, hereinafter 3% AIM-V) containing 3% humanAB serum (Cambrex). After suspending the prepared PBMC and adjusting the cell solution, add 3% AIM-V to the antibody and CH-296 immobilized plate prepared in Example 1 (1) (2) with 2 mL Zwell, and adjust the cells. The solution was added in 1 mL Zwells.
  • AIM-V Invitrogen, hereinafter 3% AIM-V
  • humanAB serum 3% humanAB serum
  • IL-2 manufactured by Shionogi & Co., Ltd.
  • IL-2 manufactured by Shionogi & Co., Ltd.
  • the group stimulated with the antibody was not supplemented with IL 2), and these plates were cultured at 37 ° C in 5% CO (culture day 0).
  • subculture was performed as follows. Collect a portion of the cell culture and count the number of viable cells by trypan blue staining.
  • B. Use AIM-V containing serum to dilute the culture to an appropriate concentration and fix anything! / Transfer to a new 12.5 cm 2 flask (Betaton Dickinson, 353107), add IL-2 to a final concentration of 500 U / mL, and subculture (4 days after the start of culture) Since then, IL-2 has been added to all groups).
  • the cell concentration after subculture is 4 to 5 days after the start of culture.
  • Table 1 shows the cell groups stimulated with anti-human CD3 antibody only, anti-human CD3 antibody and CH-296, anti-human CD3 antibody and anti-human CD28 antibody, anti-human CD3 antibody and anti-human CD28 antibody and CH-296, respectively. It shows the growth rate.
  • phosphate buffered saline with pH 7.4 from Dulbecco PBS powder (manufactured by Nissui Pharmaceutical)
  • 0.2M sodium dihydrogen phosphate aqueous solution manufactured by Nacalai Testa, 317-20
  • 0 Mix 2M aqueous solution of sodium phosphate sodium (manufactured by Nacalai Testa Co., Ltd. from 318-01) at a ratio (volume ratio) of 8.15: 1.85 to obtain a pH 6.2 sodium phosphate buffered aqueous solution.
  • Block Ace Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., UK-B25
  • Block Ace diluted 4-fold with phosphate buffered saline 300 / z L was added and blocked at room temperature for 1 hour. Thereafter, the solution was removed, and the detection antibody was dissolved in Block Ace diluted 10-fold with phosphate buffered saline and added in an amount equal to the amount of the immobilization solution.
  • detection antibodies HRP-rabbit Anti-Mouse IgG (ZYMED, 61-6520) was used to detect anti-human CD3 antibody and anti-human CD2 8 antibody, and HRP-labeled Anti-Human Fibronectin was used to detect CH-296.
  • Anti-CD3 antibody 1. 8 2 4 2. 7 9 9 3-5 0 1
  • Example 3 Comparison of IL 2 production when lymphocytes were expanded using plates fixed at various pH levels
  • Lymphocytes were expanded and cultured in the same manner as in Example 1.
  • pH 5.3 phosphate buffer
  • pH 6 phosphate buffered saline and pH 6 as buffer solution.
  • 2 aqueous sodium phosphate buffer solution was used. Both buffers were prepared as in Example 2.
  • Table 3 shows the amount of IL-2 produced when cells were stimulated with anti-human CD3 antibody, anti-human CD28 antibody and CH-296, pH 7.4 phosphate buffered saline and pH 6.2 sodium phosphate buffer. This is a comparison of the case of fixing using an aqueous solution.
  • Table 4 shows anti-human IL-2 production when cells are stimulated with CD3 antibody, anti-human CD28 antibody, and CH-296, when immobilized using pH 6.2 sodium phosphate buffer aqueous solution and pH 5.3 acetate buffer aqueous solution Is a comparison.
  • Anti-C D 3 antibody + anti-C D 2 8 wipes 5 9 2 1 2 3 6 1 3 7 1 1 1 0 0
  • Example 4 Expanded lymphocyte culture using anti-human CD3 antibody, anti-human CD28 antibody-immobilized beads and CH-296-immobilized beads
  • CH-296 beads CH-296 beads
  • control beads beads that were only blocked without immobilizing any antibodies or proteins.
  • the preparation was performed according to the protocol attached to the product. Immobilization was carried out by suspending beads in a solution of CH-296 at a final concentration force of S200 ⁇ g / mL to 4 ⁇ 10 8 beads / mL and incubating at 5 ° C. for 18 hours. Blocking was performed using human serum albumin (Buminate 25%, Baxter, 7783).
  • T Cell Expander After washing Dynabeads CD3 / CD28 T Cell Expander (DYNAL, 111-31, hereinafter abbreviated as T Cell Expander) according to the attached protocol, AIM—V containing 1% human AB serum (hereinafter 1% AIM—V) Abbreviated to 3 ⁇ 10 6 beadsZmL, and each lmLZ well was added to a 12-well cell culture plate.
  • the control beads and CH-296 beads prepared in Example 4- (1) were washed in the same manner as T Cell Expander, and suspended in 1% AIM-V so as to be 1.9 ⁇ 10 6 beadsZmL.
  • Control bead suspension for anti-human CD3 antibody and anti-human CD28 antibody costimulation groups CH-296 bead suspension for anti-human CD3 antibody, anti-human CD28 antibody and CH-296 stimulation groups, 12
  • Each lmLZ well was added to the well cell culture plate in the form added to the T Cell Expander suspension.
  • Example 1 PBMCs prepared in (1) were suspended in 1% AIM—V to 1 X 10 6 cellsZmL, and each 1 mLZ well was added to a 12-well cell culture plate to which a bead suspension had been added. Attached (total 3mLZ uel). Then, IL 2 was added to each tool to a final concentration of 200 UZmL, and the plate was cultured in an incubator at 5% CO and 37 ° C (0 days of culture).
  • subculture was performed by the following method. Collect a portion of the cell culture medium, count the number of viable cells by trypan blue staining, dilute the culture medium to an appropriate concentration using 1% AIM-V, transfer to a 12.5 cm 2 flask, and final concentration 200 IL-2 was added so that it might become UZmL.
  • the cell concentration after the subculture is 4 to 5 °, and 0.5 ⁇ 10 6 cells / mL, 7th to 0 °, 0.1 ⁇ 10 6 cells / mL, 10 On the day, it was carried out at 0.15 ⁇ 10 6 cellsZmL.
  • Table 5 shows T Cell Expander and control beads or CH-296 beads For cells stimulated with, the growth rate after 14 days of expanded culture is shown.
  • the CH-296 beads-added group showed a higher expansion rate than the control beads-added group.
  • anti-human CD3 antibody and anti-human CD28 antibody-immobilized beads it became clear that the proliferation of lymphocytes could be further promoted by simultaneously adding CH-296-immobilized beads.
  • Example 4 Performed in the same manner as in (1). However, immobilization was performed using a buffer mixed with anti-human CD3 antibody at a final concentration of 25 ⁇ g ZmL and anti-human CD28 antibody at a final concentration of 50 ⁇ g mCH-296 force 125 ⁇ g ZmL.
  • Example 4 Performed in the same manner as in (2). However, at the start of culture, the beads prepared in Example 5- (1) were used as beads for stimulating cells, and the medium contains 0.5% human AB serum and 0.2% human serum albumin.
  • GT-T503 culture medium used (Takara Bio Inc., abbreviated as hereinafter 0. 5% GT-T503), the cell number 0. 5 X 10 6 cells / Ueru, the culture volume was 1. 5 mL / Ueru.
  • the amount of bead loading was set to 0.5 X 10 6 beads / well and 5 X 10 6 bead sZ well.
  • lymphocyte expansion culture can be performed using beads to which an anti-human CD3 antibody, an anti-human CD28 antibody, and CH-296 are simultaneously immobilized.
  • a method for producing lymphocytes is provided.
  • the method has a high cell proliferation rate
  • the lymphocytes obtained by the present invention are suitably used for, for example, adoptive immunotherapy. Therefore, the method of the present invention is expected to make a great contribution to the medical field.
  • Fig. 1 is a schematic diagram showing the domain structure of fibronectin.

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Abstract

　（ａ）フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物、（ｂ）ＣＤ３リガンド、及び（ｃ）ＣＤ２８リガンドの存在下に拡大培養を行なう工程を包含することを特徴とする、リンパ球の製造方法。

Description

明 細 書
リンパ球の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、医療分野において有用なリンパ球を取得する方法に関する。
背景技術
[0002] 生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細 胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立つている。なかでも中心的な役割を 果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球は Bリンパ球（以下、 B細 胞と記載することがある）と Tリンパ球 (以下、 T細胞と記載することがある）という 2種類 の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を 防御する。
[0003] T細胞は、 CD (Cluster of Differentiation) 4マーカーを有し、主に抗体産生 の補助や種々の免疫応答の誘導に関与するヘルパー T細胞（以下、 Tと記載するこ
H
とがある）と、 CD8マーカーを有し、主に細胞傷害活性を示す細胞傷害性 T細胞〔T
C
：細胞傷害性 Τリンパ球 (cytotoxic T lymphocyte)、別名：キラー T細胞、以下、 CTLと記載することがある〕に亜分類される。腫瘍細胞やウィルス感染細胞等を認識 して破壊、除去するのに最も重要な役割を果たしている CTLは、 B細胞のように抗原 に対して特異的に反応する抗体を産生するのではなぐ標的細胞膜表面上に存在 する主要組織適合複合体〔MHC：ヒトにお ヽてはヒト白血球抗原 (HLA)と称するこ ともある〕クラス I分子に会合した標的細胞由来の抗原 (抗原ペプチド)を直接認識し て作用する。この時、 CTL膜表面の T細胞レセプター（以下、 TCRと称す）が前述し た抗原ペプチドおよび MHCクラス I分子を特異的に認識して、抗原ペプチドが自己 由来のものなのか、あるいは、非自己由来のものなのかを判断する。そして、非自己 由来と判断された標的細胞は CTLによって特異的に破壊、除去される。
[0004] 近年、薬剤治療法や放射線治療法のように患者に重い肉体的負担がある治療法 が見直され、患者の肉体的負担が軽い免疫治療法への関心が高まっている。特にヒ ト由来のリンパ球から目的とする抗原に対して特異的に反応する CTL等のリンパ球 を生体外 (ex vivo)で誘導した後、もしくは誘導を行わず、前記リンパ球を拡大培養 し、患者へ移入する養子免疫療法の有効性が注目されている。例えば、動物モデル において養子免疫療法がウィルス感染および腫瘍に対して有効な治療法であること が示唆されている（例えば、非特許文献 1および 2)。この治療法では CTLの抗原特 異的傷害活性を維持もしくは増強させた状態でその細胞数を維持ある 、は増加させ ることが重要である。
[0005] 上記のような養子免疫療法において、治療効果を得るためには一定量以上の細胞 数の細胞傷害性リンパ球を投与する必要がある。すなわち、 ex vivoでこれらの細胞 数を短時間に得ることが最大の問題であるといえる。
[0006] CTLの抗原特異的傷害活性を維持および増強するためには、 CTLについて抗原 に特異的な応答を誘導する際に、目的とする抗原を用いた刺激を繰り返す方法が一 般的である。しかし、通常、この方法では最終的に得られる CTL数が減少し、十分な 細胞数が得られない。
[0007] 次に、抗原特異的な CTLの調製に関しては、自己 CMV感染線維芽細胞と IL 2 ( 例えば、非特許文献 6)、あるいは抗 CD3モノクローナル抗体 (抗 CD3mAb)と IL— 2を用いて、それぞれ CMV特異的 CTLクローンを単離ならびに大量培養する方法（ 例えば、非特許文献 7)が報告されている。
[0008] さらに、特許文献 1には REM法 (rapid expansion method)が開示されている。
この REM法は、抗原特異的 CTLおよび Tを含む T細胞の初期集団を短期間で増
H
殖 (Expand)させる方法である。つまり、個々の T細胞クローンを増殖させて大量の T 細胞を提供可能であり、抗 CD3抗体、 IL 2、並びに放射線照射により増殖性をなく した PBMC (peripheral blood mononuclear cell,末梢血単核細胞）とェプスタ イン バールウィルス（Epstein— Barr virus,以下 EBVと略す）感染細胞とを用い て抗原特異的 CTL数を増加させることが特徴である。
[0009] また、特許文献 2には改変 REM法が開示されており、当該方法は PBMCとは区別 される T細胞刺激成分を発現する分裂して ヽな ヽ哺乳動物細胞株をフィーダ細胞と して使用し、 PBMCの使用量を低減させる方法である。
[0010] CTL以外の疾病の治療に有効なリンパ球としては、例えば、リンフォカイン活性ィ匕 細胞 (例えば、非特許文献 3)、高濃度のインターロイキン 2 (IL— 2)を用いて誘導 した腫瘍浸潤リンパ球 (TIL) (例えば、非特許文献 4および 5)が知られている。
[0011] リンフォカイン活性ィ匕細胞は、リンパ球を含む末梢血液 (末梢血白血球)や臍帯血、 組織液等に IL— 2を加えて、数日間試験管内で培養することにより得られる細胞傷 害活性を持つ機能的細胞集団である。リンフォカイン活性ィ匕細胞の培養工程にぉ ヽ て、抗 CD3抗体を加えることにより、さらにリンフォカイン活性ィ匕細胞の増殖は加速す る。さらに当該培養工程において、抗 CD3抗体のみではなく抗 CD28抗体をカ卩えて 共刺激することで、さらに細胞増殖率が向上することも知られている (例えば、非特許 文献 8)。このようにして得られたリンフォカイン活性ィ匕細胞は非特異的にさまざまなが ん細胞やその他のターゲットに対して傷害活性を有する。
[0012] フイブロネクチンは動物の血液中、培養細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存 在する分子量 25万の巨大な糖タンパク質であり、多彩な機能を持つことが知られて いる。そのドメイン構造は 7つに分けられており（以下、第 1図参照）、またそのアミノ酸 配列中には 3種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構 成されている。 3種類の類似の配列は I型、 II型、 ΙΠ型と呼ばれ、このうち、 ΙΠ型はアミ ノ酸残基 71〜96個のアミノ酸残基で構成されており、これらのアミノ酸残基の一致率 は 17〜40%である。フイブロネクチン中には 14の ΠΙ型の配列が存在する力 そのう ち、 8番目、 9番目、 10番目（以下、それぞれ III— 8、111— 9、111— 10と称する）は細 胞結合ドメインに、また 12番目、 13番目、 14番目（以下、それぞれ ΠΙ— 12、 III- 13 、 III— 14と称する）はへパリン結合ドメインに含有されている。また、 III— 10には VL A (very late activation antigen)— 5結合領域が含まれており、このコア配列は RGDSである。また、へパリン結合ドメインの C末端側には IIICSと呼ばれる領域が存 在する。 IIICSには 25アミノ酸力もなる VLA— 4に対して結合活性を有する CS— 1と 呼ばれる領域が存在する（例えば、非特許文献 9〜11)。
[0013] リンフォカイン活性ィ匕細胞や細胞傷害性リンパ球の製造において、フイブロネクチン やそのフラグメントを使用することによる細胞増殖率の向上作用、細胞傷害活性の維 持作用については、既に本発明者らにより検討されてきた (例えば、特許文献 3、 4お よび 5)。しかしながら、養子免疫療法への実用化を考えた場合、上記文献の方法で は決して満足できるものではなぐさらに細胞増殖率が高いリンパ球の拡大培養方法 が求められている。
非特許文献 l : Greenberg P. D.著， 1992年発行， Advances in Immunolog y
非特許文献 2 :Reusser P.他 3名， Blood, 1991年， Vol. 78, No. 5, P1373〜l 380
非特許文献 3 :Riddell S. A.他 4名， Immunol. , 1991年， Vol. 146, No. 8, P2795〜2804
非特許文献 4: Greenberg P. D.他 1名， J. Immunol. Methods, 1990年， Vol. 128, No. 2, P189〜201
非特許文献 5 : Rosenberg S. A.他， N. Engl. J. Med. , 1987年， Vol. 316, N o. 15, P889〜897
非特許文献 6 : Rosenberg S. A.他， N. Engl. J. Med. , 1988年， Vol. 319, N o. 25, P1676〜1680
非特許文献 7 :Ho M.他 9名， Blood, 1993年， Vol. 81, No. 8, P2093〜2101 非特許文献 8 :Koberda J.他 2名， J. Cancer Res. Clin. Oncol. , 1993年， Vo 1. 119, No. 3, P131 - 136
非特許文献 9 : Deane F. Momer著， 1988年発行， FIBRONECTIN, ACADE MIC PRESS INC. , Pl〜8
非特許文献 10 :Kimizuka F.他 8名， Biochem. , 1991年， Vol. 110, No. 2 , p284- 291
非特許文献 ll :Hanenberg H.他 5名， Human Gene Therapy, 1997年， Vol
. 8, No. 18, p2193- 2206
特許文献 1：国際公開第 96Z06929号パンフレット
特許文献 2：国際公開第 97Z32970号パンフレット
特許文献 3 :国際公開第 03Z016511号パンフレット
特許文献 4 :国際公開第 03Z080817号パンフレット
特許文献 5：国際公開第 2005Z019450号パンフレット 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0014] 本発明の目的は、医療への使用に適した、効率的なリンパ球の製造方法を提供す ることにめる。
課題を解決するための手段
[0015] 本発明の第 1の発明は、（a)フイブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合 物、（b) CD3リガンド、及び (c) CD28リガンドの存在下に拡大培養を行なう工程を包 含することを特徴とする、リンパ球の製造方法に関する。本発明の第 1の発明におい て、 CD3リガンドとは抗 CD3抗体力 CD28リガンドとは抗 CD28抗体が例示される。 また、フイブロネクチンのフラグメントとしては、配列表の配列番号 1〜8で表されるアミ ノ酸配列を少なくとも 1つ含んでなるポリペプチド (m)である力、または前記 、ずれか のアミノ酸配列において 1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付カロ したアミノ酸配列を少なくとも 1つ含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチド (m)と同等な機能を有するポリペプチド (n)が例示される。また、フイブロネクチンのフ ラグメントとしては、細胞接着活性および Zまたはへノ^ン結合活性を有するものが 例示される。また、フイブロネクチンのフラグメントとしては、配列表の配列番号 9〜21 で表されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される少 なくとも 1つのポリペプチドが例示される。また、本発明の第 1の発明において、リンパ 球としてはリンフォカイン活性ィ匕細胞が例示される。また、本発明の第 1の発明は、リ ンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに包含する、リンパ球の製造方法も提供 される。外来遺伝子の導入方法としてはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ゥ ィルス、レンチウィルスまたはシミアンウィルスを用いて導入する方法が例示される。
[0016] 本発明の第 2の発明は、本発明の第 1の発明により得られるリンパ球に関する。また 、本発明の第 3の発明は本発明の第 2の発明を有効成分として含有する医薬に関す る。
[0017] 本発明の第 4の発明は、酸性条件下で、抗 CD3抗体、抗 CD28抗体、フイブロネク チン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも 1つと固相を接触させる ことを特徴とする、抗 CD3抗体、抗 CD28抗体、フイブロネクチン及びそのフラグメン トからなる群より選択される少なくとも 1つが固定化された固相の製造方法に関する。 本発明の第 4の発明において、固相としては細胞培養用担体が例示される。
[0018] 本発明の第 5の発明は、（a)フイブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合 物、（b) CD3リガンド、及び (c) CD28リガンドが固定ィ匕された固相に関する。本発明 の第 5の発明において、固相としては細胞培養プレート、シャーレ、フラスコ、バッグ、 ビーズ、メンブレンまたはスライドガラスが例示される。
発明の効果
[0019] 本発明により、効率的なリンパ球の製造方法が提供される。当該製造方法は細胞 増殖率が高ぐ極めて有用な方法である。従って、本発明により得られるリンパ球は、 例えば、養子免疫療法に好適に使用されることから、医療分野への多大な貢献が期 待される。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 本発明は、（a)フイブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物、（b) CD3 リガンド、及び (c) CD28リガンドの存在下にリンパ球の拡大培養を行なう工程を包含 することにより、極めて細胞増殖率が高くなることを見出し、完成するに至ったもので ある。
[0021] なお、本明細書においてリンパ球の製造とは、当該細胞の拡大培養の工程を包含 する操作を指す。また、本発明のリンパ球の製造を、リンパ球の培養とも称する。
[0022] 以下、本発明を具体的に説明する。
[0023] (1)本発明に使用されるフイブロネクチン、およびそのフラグメント
本明細書中に記載のフイブロネクチンおよびそのフラグメントは、天然力 得られた もの、または人為的に合成されたもののいずれでもよい。フイブロネクチンおよびその フラグメントは、例えば、ルオスラーティ E.ら〔Ruoslahti E. , et al.、ジャーナル 'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー (J. Biol. Chem. )、第 256卷、第 14号、第 7277 〜7281頁（1981)〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で 製造することができる。ここで、本明細書に記載された実質的に純粋なフイブロネクチ ンまたはフイブロネクチンフラグメントとは、これらが天然にお!/、てフイブロネクチンと一 緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。上記のフィ ブロネクチンおよびそのフラグメントは、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のもの を混合して本発明に使用することができる。
[0024] なお、フイブロネクチンは多くのスプライシングバリアントの存在が知られているが、 本発明に使用されるフイブロネクチンとしては、本発明の所望の効果を発現するもの であれば、いずれのバリアントも使用することができる。例えば、血漿由来のフイブ口 ネクチンの場合、細胞結合ドメインの上流に存在する ED— Bと呼ばれる領域や細胞 結合ドメインとへパリン結合ドメインの間に存在する ED— Aと呼ばれる領域が欠失し て!、ることが知られて!/、るが、このような血漿由来のフイブロネクチンも本発明に使用 することができる。
[0025] 本発明に使用できるフイブロネクチンフラグメント、ならびに該フラグメントの調製に 関する有用な情報は、キミヅカ F.ら〔1¾1^(1111^ F. , et al.、ジャーナル'ォブ' バイオケミストリー (J. Biochem. )、第 110卷、 284〜291頁（1991)〕、コーンブリツ ト A. R.ら〔1^01：111)011 A. R. , et al.、 EMBO ジャーナル（EMBO J. )、第 4卷、第 7号、 1755〜 1759 (1985)〕、およびセキグチ K. ¾ [Sekiguchi K. , et al.、ノィオケミストリー（Biochemistry)、第 25卷、第 17号、 4936〜4941 (1986 ；)〕等より得ることができる。また、フイブロネクチンをコードする核酸配列又はフイブ口 ネクチンのアミノ酸配列については、 Genbank Accession No. NM— 002026 、 NP_002017に開示されている。
[0026] 本発明において、フイブロネクチンフラグメントとしては、例えば、 III— 8 (配列表の 配列番号 1で表されるアミノ酸配列）、 ΠΙ— 9 (配列表の配列番号 2で表されるアミノ酸 配列）、 III- 10 (配列表の配列番号 3で表されるアミノ酸配列）、 ΙΠ— 11 (配列表の 配列番号 4で表されるアミノ酸配列）、 III 12 (配列表の配列番号 5で表されるァミノ 酸配列）、 ΠΙ— 13 (配列表の配列番号 6で表されるアミノ酸配列）、 ΠΙ— 14 (配列表 の配列番号 7で表されるアミノ酸配列）、および CS— 1 (配列表の配列番号 8で表さ れるアミノ酸配列）のいずれかの領域を構成するアミノ酸配列を少なくとも 1つ含んで なるポリペプチド (m) (第 1図参照）や、前記いずれかのアミノ酸配列において 1もしく は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも 1つ 含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチド (m)と同等な機能を有するポリべ プチド (n)が例示される。フラグメントの長さとしては、例えば、アミノ酸の数として 20 〜1000力 子ましく、 100〜800力より好ましい。なお、本明細書において、複数個と は数個を含む概念であり、 2〜12個が好ましぐ 2〜10個がより好ましぐ 2〜8個がさ らに好ましぐ以下においても同様である。
[0027] また、当該フラグメントとしては、細胞接着活性および Zまたはへノ^ン結合活性を 有するものが好適に使用できる。細胞接着活性は、本発明で使用されるフラグメント（ その細胞結合ドメイン）と細胞との結合を公知の方法を使用してアツセィすることによ り調べることができる。例えば、このような方法には、ウイリアムズ D. A.らの方法〔W illiams D. A. , et al.、ネイチヤー（Nature)、第 352卷、第 438〜441頁（1991 )〕が含まれる。当該方法は、培養プレートに固定ィ匕したフラグメントに対する細胞の 結合を測定する方法である。また、へパリン結合活性は、本発明に使用されるフラグ メント（そのへパリン結合ドメイン）とへパリンとの結合を公知の方法を使用してアツセィ することにより調べることができる。例えば、上記のウイリアムズ D. A.らの方法にお いて、細胞に換えてへノ《リン、例えば標識へノ リンを使用することにより、同様の方法 でフラグメントとへノ リンとの結合の評価を行うことができる。
[0028] さらにフイブロネクチンのフラグメントとしては、 C 274 (配列表の配列番号 9で表さ れるアミノ酸配列）、 H- 271 (配列表の配列番号 10で表されるアミノ酸配列）、 H— 2 96 (配列表の配列番号 11で表されるアミノ酸配列）、 CH— 271 (配列表の配列番号 12で表されるアミノ酸配列）、 CH— 296 (配列表の配列番号 13で表されるアミノ酸配 列）、 C— CS1 (配列表の配列番号 14で表されるアミノ酸配列）、および CH— 296N a (配列表の配列番号 21で表されるアミノ酸配列）力もなる群より選択されるポリぺプ チドが例示される。
[0029] 上記の CH— 271、 CH— 296、 CH— 296Na、 C— 274、 C— CS1の各フラグメン トは VLA— 5に結合する活性を有する細胞結合ドメインを有するポリペプチドである。 また、 C— CS1、 H— 296、 CH— 296、 CH— 296Naは VLA— 4に結合する活性を 有する CS— 1を有するポリペプチドである。さらに、 H— 271、 H— 296、 CH— 271 、 CH— 296および CH— 296Naはへパリン結合ドメインを有するポリペプチドである 。なお、 CH— 296Naは血漿由来のフイブロネクチンにおける細胞結合ドメインから C S 1までを含むポリペプチドである。
[0030] 本発明においては、上記の各ドメインが改変されたフラグメントも使用することがで きる。フイブロネクチンのへパリン結合ドメインは 3つの III型配列（ΠΙ—12、 III- 13, 1 11- 14)によって構成されている。前記 III型配列のうちの一つもしくは二つを欠失し たへノ^ン結合ドメインを含むフラグメントも本発明に使用することが可能である。例え ば、フイブロネクチンの細胞結合部位 (VLA— 5結合領域、 Prol239〜Serl515)と 一つの III型配列とが結合したフラグメントである CHV— 89 (配列表の配列番号 15で 表されるアミノ酸配列）、 CHV— 90 (配列表の配列番号 16で表されるアミノ酸配列） 、 CHV— 92 (配列表の配列番号 17で表されるアミノ酸配列）、あるいは二つの ΠΙ型 配列とが結合したフラグメントである CHV— 179 (配列表の配列番号 18で表されるァ ミノ酸配列）、 CHV— 181 (配列表の配列番号 19で表されるアミノ酸配列）が例示さ れる。 CHV— 89、 CHV— 90、 CHV— 92はそれぞれ III— 13、 111—14、 III— 12を 含むものであり、 CHV— 179は III— 13と III— 14を、 CHV— 181は III— 12と III— 1 3をそれぞれ含んでいる。
[0031] また、上記の各フラグメントにさらにアミノ酸を付加したフラグメントも本発明に使用 することができる。当該フラグメントは、例えば、上記各フラグメントに所望のアミノ酸を 付加することにより製造可能である。例えば、 H— 275— Cys (配列表の配列番号 20 で表されるアミノ酸配列）は、フイブロネクチンのへパリン結合ドメインを有し、かつ C末 端にシスティン残基を有するフラグメントである。
[0032] なお、本発明に使用されるフラグメントとしては、本発明の所望の効果が得られる限 り、上記に例示した天然のフイブロネクチンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むフ ラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸 配列に 1もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸 配列を有するポリペプチドからなるものであってもよい。
[0033] アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリべ プチドの物理ィ匕学的性状等を変化させ得る程度のものであるのが好ま 、。例えば、 アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの持つ性質 (例えば、疎水性、親水性、電 荷、 PK等）を実質的に変化させない範囲の保存的なものが好ましい。例えば、ァミノ 酸の置換は、 1.グリシン、ァラニン； 2. ノ リン、イソロイシン、ロイシン； 3.ァスパラギン 酸、グルタミン酸、ァスパラギン、グルタミン； 4.セリン、スレオ-ン； 5.リジン、アルギ ニン； 6.フエ-ルァラニン、チロシンの各グループ内での置換であり、アミノ酸の欠失 、付加、挿入は、ポリペプチドにおけるそれらの対象部位周辺の性質に類似した性 質を有するアミノ酸の、対象部位周辺の性質を実質的に変化させない範囲での欠失 、付加、挿入が好ましい。
[0034] なお、本発明に使用されるフラグメントを遺伝子工学的に取得した場合、例えば大 腸菌などを宿主として製造する場合は、大腸菌由来のメチォニンべプチダーゼ等の 影響により、 N末端のメチォニンが欠失される場合があるが、このようなポリペプチドも 本発明において使用することができる。すなわち、配列表の配列番号 20および 21に 記載のポリペプチドの N末端のメチォニンが欠失したポリペプチドも本発明にお 、て は好適に使用できる。
[0035] アミノ酸の置換等は種間や個体差に起因して天然に生ずるものであってもよぐま た、人工的に誘発されたものであってもよい。人工的な誘発は公知の方法により行え ばよぐ特に限定はないが、例えば、公知の手法により、天然のフイブロネクチン由来 の前記領域や所定のフラグメントをコードする核酸において 1もしくは複数個の塩基 が置換、欠失、付加もしくは挿入された所定の核酸を作製し、それを使用して、天然 のフイブロネクチン由来の前記領域や所定のフラグメントと同等な機能を有する、当 該フラグメント等を構成するポリペプチドのアミノ酸配列に置換等を有するアミノ酸配 列を含むポリペプチドを製造することができる。
[0036] また、本明細書において「同等な機能を有する」とは、比較対照であるポリペプチド 力 フイブロネクチンフラグメントの有するリンパ球の拡大培養率の向上作用を有する ことを!ヽぅ。前記作用は後述の実施例 1に記載の方法に準じて適宜確認することがで きる。また、アミノ酸の置換等を有するポリペプチドからなるフラグメントとしては、細胞 接着活性および Zまたはへノ リン結合活性を有するものが好適である。細胞接着活 性およびへノ^ン結合活性は、それらの前記活性測定方法に準じて評価することが できる。
[0037] アミノ酸の置換等を有するポリペプチドからなるフラグメントとして、例えば、 2つの異 なるドメイン間にリンカ一として 1以上のアミノ酸が挿入されたフラグメントも本発明に 使用することができる。
[0038] なお、フイブロネクチンについても、上記のフラグメントと同様、そのポリペプチドの アミノ酸配列に 1もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有する アミノ酸配列を有するポリペプチドであって、リンパ球の拡大培養率の向上作用を有 するポリペプチドを、本発明にお 、て使用することができる。
[0039] また、本発明に使用されるフイブロネクチンまたはそのフラグメントとしては、本発明 の所望の効果が得られる限り、上記に例示した天然のフイブロネクチンやそのァミノ 酸配列の少なくとも 1部を含むフラグメントと同等な機能を有する、当該フイブロネクチ ンまたはそのフラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列と 50%以上のホモ口 ジーを有するポリペプチド、好ましくは 70%以上のホモロジ一を有するポリペプチド、 より好ましくは 90%以上のホモロジ一を有するポリペプチド、さらに好ましくは 95%以 上のホモロジ一を有するペプチドが使用できる。なお、ホモロジ一の算出には、例え ば DNASIS Pro Ver. 2. 6 (タカラバイオ (株)製）を用いることができる。
[0040] 本明細書中に記載のフイブロネクチンフラグメントは、例えば、米国特許第 5, 198, 423号明細書の記載に基づいて遺伝子組換え体より組換えフイブロネクチンフラグン メントとして製造することもできる。例えば、上記の H— 271 (配列番号 10)、 H— 296 (配列番号 11)、 CH— 271 (配列番号 12)、 CH— 296 (配列番号 13)の各フラグメ ントならびにこれらを取得する方法は当該特許明細書に詳細に記載されて 、る。また 、 CH- 296Na (配列番号 21)とその製造方法にっ 、ては国際公開第 2005/019 450号パンフレットに記載されている。また、上記の C— 274 (配列番号 9)フラグメント は米国特許第 5, 102, 988号明細書に記載された方法により得ることができる。さら に、 C— CS1 (配列番号 14)フラグメントは日本特許第 3104178号明細書に記載さ れた方法により得ることができる。上記 CHV—89 (配列番号 15)、 CHV—90 (配列 番号 16)、 CHV— 179 (配列番号 18)の各フラグメントは、 日本特許第 2729712号 明細書に記載された方法により得ることができる。また、 CHV— 181 (配列番号 19) フラグメントは国際公開第 97Z18318号パンフレットに記載された方法に準じて得る ことができる。 CHV— 92 (配列番号 17)フラグメントは、 日本特許第 2729712号明 細書および国際公開第 97Z18318号パンフレットを参照し、それらの文献に記載さ れたプラスミドに基づ 、て定型的にプラスミドを構築し、該プラスミドを用いて遺伝子 工学的に取得することができる。
これらのフラグメントまたはこれらフラグメントから定型的に誘導できるフラグメントは 、〒 305— 8566日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに下記受託番号のもとで寄託された 微生物を用いて製造する、あるいは各微生物の保持するプラスミドを公知の方法によ り改変すること〖こより製造することちでさる；
1、 Escherichia coli HBlOl/pHDIOl
FERM BP— 2264 (H— 271をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日 19 89年 1月 30曰）、
2、 Escherichia coli HB101/pCH102
FERM BP— 2800 (CH— 296をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日 1989年 5月 12曰）、
3、 Escherichia coli HBlOl/pCHlOl
FERM BP— 2799 (CH— 271をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日 1989年 5月 12曰）、
4、 Escherichia coli HB101/pHD102
FERM BP— 7420 (H— 296をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日 19 89年 5月 12曰）、
5、 Escherichia coli JM109/pTF7221
FERM BP— 1915 (C— 274をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日 19 88年 6月 17曰）、
6、 Escherichia coli HB101/pCS25
FERM BP— 5723 (C— CS1をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日 1 990年 3月 5曰）、
7、 pColdl4-CH296Na
FERM BP— 10073 (CH— 296Naをコードするプラスミド；寄託日 2004年 7月 2 3曰）
8、 Escherichia coli HB101/pCHV89
FERM P— 12182 (CHV— 89をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日 1991年 4月 8曰）、
9、 Escherichia coli HB101/pCHV179
FERM P— 12183 (CHV— 179をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日 1991年 4月 8曰）。
[0042] フイブロネクチンは巨大な糖タンパク質であるため、天然起源のタンパク質を調製し て使用することは産業上および医薬品製造上、必ずしも容易ではない。また、フイブ ロネクチンは多機能タンパク質であることから、その使用の状況によっては、本発明の 方法に効果を示す領域とは異なる領域に起因する不都合が起こることも考えられる。 これらのことから、本発明においては、入手、取り扱いの容易さ、安全面の観点から、 好適にはフイブロネクチンフラグメント、さらに好適には前記のようにして得られる組換 ぇフイブロネクチンフラグメントを使用することが好ましい。また、本発明に使用される フイブロネクチンフラグメントの分子量としては、特に限定はないが、好適には 1〜20 OkD、より好適には 5〜190kD、さらに好適には 10〜180kDである。当該分子量は 、例えば、 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定することができる。
[0043] なお、本発明のフイブロネクチンフラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列 において、天然由来のフイブロネクチンフラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸 配列以外のアミノ酸配列部分は、本発明の所望の効果の発現を阻害しな!、限り任意 であり、特に限定されるものではない。
[0044] (2)リンパ球の製造方法
以下、本発明のリンパ球の製造方法について具体的に説明する。本発明の方法は 、（a)前述のフイブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物、（b) CD3リガ ンド、及び (c) CD28リガンドの存在下にリンパ球の拡大培養を行なう工程を包含す ることを特徴とする、リンパ球の製造方法である。以下、上記の（a)前述のフイブロネク チン、そのフラグメントまたはそれらの混合物、（b) CD3リガンド、及び (c) CD28リガ ンドを本発明の有効成分と称することがある。 [0045] 本明細書においてリンパ球とはリンパ球を含有する細胞群を意味する。本発明のリ ンパ球の製造方法においては、該方法に供する細胞の種類や、培養の条件等を適 宜調整することにより、例えば ex vivoでのリンパ球の拡大培養が行なわれる。
[0046] 本発明の製造方法により得られるリンパ球としては、特に限定するものではないが、 例えばリンフォカイン活性ィ匕細胞、細胞傷害性 T細胞 (CTL)、腫瘍浸潤リンパ球 (TI L)、 NK細胞、ナイーブ細胞、メモリー細胞等のこれらのうち少なくとも 1種の細胞を 含む細胞集団等が挙げられる。なお、本明細書においてリンフォカイン活性ィ匕細胞と は、リンパ球を含む末梢血液 (末梢血白血球)や臍帯血、組織液等に IL 2を加えて 、数日間試験管内で培養することにより得られる細胞傷害活性を持つ機能的細胞集 団を示す。このような細胞集団のことを一般的にリンフォカイン活性ィ匕キラー細胞 (L AK細胞）と称することがあるが、当該細胞集団には細胞傷害性を有さない細胞も含 まれていることから、本願明細書においては当該細胞集団をリンフォカイン活性ィ匕細 胞と称することとする。
[0047] 本発明において、リンパ球の製造に使用される細胞としては、末梢血単核球 (PBM C)、 NK細胞、ナイーブ細胞、メモリー細胞、造血幹細胞、臍帯血単核球等が例示さ れる。また、血球系細胞であれば本発明に使用できる。これらの細胞は生体から採取 されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたものをそのままもしくは凍結保 存したもののいずれも使用することができる。なお、本発明のリンパ球の製造方法で は、前記細胞を含有する材料、例えば、末梢血液、臍帯血等の血液や、血液から赤 血球や血漿等の成分を除去したもの、骨髄液等を使用することができる。さらに本発 明の製造方法により、 CTLを製造する場合は上記のような細胞に抗原刺激を付与し て誘導された CTLや、生体由来の CTLを使用することもできる。
[0048] 本発明のリンパ球の製造方法は、本発明の有効成分の存在下に拡大培養するェ 程を包含するリンパ球の製造方法であり、当該培養はリンパ球の培養の全期間、もし くは任意の一部の期間において行われる。すなわち、リンパ球の製造工程の一部に 前記工程を含むものであれば本発明に包含される。
[0049] 本発明において、 CD3リガンドとしては、 CD3に結合活性を有する物質であれば 特に限定はないが、例えば抗 CD3抗体が例示され、好適には抗 CD3モノクローナ ル抗体が例示され、特に好適には okt3が例示される。 CD3リガンドの培養液中の濃 度としては、特に限定はなぐ例えば抗 CD3モノクローナル抗体を使用する場合は、 例えば 0. 001〜100 8 111しカ 子適でぁり、0. 01〜： LOO /z gZmLがより好適であ る。
[0050] また、本発明において、 CD28リガンドとしては、 CD28に結合活性を有する物質で あれば特に限定はないが、例えば抗 CD28抗体、 B7—l、 B7— 2、 CD80が例示さ れ、特に好適には抗 CD28モノクローナル抗体が例示される。 CD28リガンドの培養 液中の濃度としては、特に限定はなぐ例えば抗 CD28モノクローナル抗体を使用す る場合は、例えば 0. 001〜100 87111しカ 子適でぁり、 0. 01〜： LOO /z g/mLがよ り好適である。
[0051] 本発明において、フイブロネクチン、そのフラグメント、またはそれらの混合物の培養 液中の濃度としては、特に限定はなぐ例えば 0. 001〜500 /ζ 8Ζπ^が好適であり 、 0. 01〜500 8/111 カ¾り好適でぁる。
[0052] 本発明のリンパ球の製造方法において使用される培地は、特に限定はなぐリンパ 球の拡大培養に必要な成分を混合して作製された公知の培地を使用することができ 、たとえば市販の培地を適宜選択して使用することができる。これらの培地はその本 来の構成成分以外に適当なタンパク質、サイト力イン類、その他の成分を含んでいて もよい。好適には、 IL— 2を含有する培地が本発明に使用される。 IL— 2の培地中の 濃度としては、特に限定はないが、例えば、好適には 0. 01〜1 X 105UZmL、より 好適には 0. 1〜1 X 104UZmLである。また、この他、レクチン等のリンパ球刺激因 子を添加することもできる。当該成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば 特に限定されるものではない。
[0053] さらに、リンパ球の拡大培養において、培地中に血清や血漿を添加することもでき る。これらの培地中への添力卩量は特に限定はないが、 0容量％〜20容量％が例示さ れる。なお、本発明者らは、国際公開第 2005Z019450号パンフレットにも記載され ているとおり、フイブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下でリ ンパ球の製造を行なうことにより、培地中における血清及び血漿の総含有濃度が 0容 量％以上 5容量％未満という低濃度であっても、高い拡大培養率を維持したリンパ球 の製造が行なえることを見出している。すなわち、本発明においても同様に、培地中 における血清及び血漿の総含有濃度は、安全面や患者への負担を軽減させると!、う 観点から、 0容量％以上 5容量％未満が好適であるが、本発明はこれに限定されるも のではない。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養するリンパ球と由来が 同じであることを意味する)もしくは非自己 (培養するリンパ球と由来が異なることを意 味する）のいずれでも良いが、好適には安全性の観点から自己由来のものが使用で きる。なお、ここで血清及び Z又は血漿の総含有濃度が 0容量％とは、血清や血漿を 培地に添加しないことを意味する。
[0054] 本発明の方法において、リンパ球の製造、すなわちリンパ球の拡大培養は、通常、 本発明の前記有効成分の存在下に、所定の成分を含む培地中で行なわれる。本発 明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、例えば lc ell/mL〜l X 108cells/mL、好適には lcell/mL〜5 X 107cells/mL、さらに 好適には lcellZmL〜2 X 107cellsZmLが例示される。また、培養条件に特に限 定はなぐ通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、 37°C 、 5%CO等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液に
2
新鮮な培地を加えて希釈するか、培地を交換するか、もしくは細胞培養用器材を交 換することができる。
[0055] 本発明のリンパ球の製造方法において使用される細胞培養用器材としては、特に 限定はないが、例えば、細胞培養プレート、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽 、 ノ ィオリアクター等を使用することができる。なお、ノッグとしては、細胞培養用 CO
2 ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量のリンパ球を製造す る場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のい ずれでも実施することができる力 好適には得られるリンパ球の安全性の観点から閉 鎖系で培養を行うことが好まし ヽ。
[0056] なお、本発明に使用される（a)フイブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混 合物、（b) CD3リガンド、及び (c) CD28リガンドは培地中に溶解して共存させる他、 適切な固相、例えば細胞培養プレート、シャーレ、フラスコ、ノ ッグ等の細胞培養用 器材（開放系のもの、および閉鎖系のもののいずれをも含む）、またはビーズ、メンブ レン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定ィ匕して使用してもよい。それらの固 相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではな 、。該成 分を、例えば、前記器材に固定ィ匕する場合、培地を該器材に入れた際に、該成分を 培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れ る培地量に対して各成分の一定量を固定ィヒするのが好適である力 当該成分の固 定ィ匕量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。前記担体は、細胞 培養時に細胞培養用器材中の培養液に浸漬して使用される。前記成分を前記担体 に固定化する場合、該担体を培地に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる 場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分 の一定量を固定ィ匕するのが好適であるが、当該成分の固定ィ匕量は所望の効果が得 られれば特に限定されるものではな！/、。
[0057] また、本発明の別の態様として、 (a)フイブロネクチン、そのフラグメントまたはそれら の混合物、（b) CD3リガンド、及び (c) CD28リガンドが固定化された固相が提供され る。当該固相とは、前述の固相、好適には細胞培養プレート、シャーレ、フラスコ、ノ ッグ、ビーズ、メンブレン、スライドガラス等が例示される。当該固相への上記 (a)〜（c )の固定ィ匕量は、当該固相を本発明のリンパ球の製造方法に使用した際に所望の効 果が得られれば特に限定されるものではなぐ例えば、本発明の方法に使用される 前記培地中の有効成分等の含有量に準じて、所望により、適宜、決定することができ る。また、上記 (a)〜（c)の固定ィ匕方法については、好適には後述する酸性条件下で の固定ィ匕を実施することが固定ィ匕効率の向上と 、う観点からは好まし 、。
[0058] CD3リガンドおよび CD28リガンドとして、抗 CD3抗体および抗 CD28抗体を使用 する場合、これらの抗体ゃフイブロネクチン、そのフラグメントの固相への固定化方法 としては、特に限定はないが、例えば、適当な緩衝液の中でこれらの抗体ゃフイブ口 ネクチン、またはそのフラグメントを固相と接触させることにより固定ィ匕することができ る。特に好適には、後述の実施例 2および 3に記載のとおり、酸性条件下で固定化を 行なうことにより、より効率的にこれらの抗体ゃフイブロネクチン、そのフラグメントの固 定ィ匕を行なうことができる。なお、これらの抗体ゃフイブロネクチン、そのフラグメントの 固定ィ匕を酸性条件下で行なうことについては、本発明において初めて明らかになつ た知見である。すなわち、本発明の別の態様として、酸性条件下で、抗 CD3抗体、 抗 CD28抗体、フイブロネクチン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なく とも 1つと固相を接触させることを特徴とする抗 CD3抗体、抗 CD28抗体、フイブロネ クチン及びそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも 1つが固定ィ匕された固 相の製造方法も提供する。ここで酸性条件としては、好適には ρΗ1〜6. 5、より好適 には 4〜6. 5が例示される。また、固相としては、好適には前述の細胞培養用担体等 が例示され、これらの担体は材質や表面処理の有無にかかわらず使用できる。
[0059] また、フイブロネクチンのフラグメントの固相への固定ィ匕については、国際公開第 97 Z18318号パンフレット、ならびに国際公開第 00Z09168号パンフレットに記載の 方法によっても固定ィ匕を実施することができる。
[0060] 前記の種々の成分や、本発明の有効成分を固相に固定ィ匕しておけば、本発明の 方法によりリンパ球を得た後、該リンパ球と固相とを分離するのみで、有効成分等と 該リンパ球とを容易に分離することができ、該リンパ球への有効成分等の混入を防ぐ ことができる。
[0061] さらに、国際公開第 02Z14481号パンフレットに記載された、抗原特異的な細胞 傷害活性を有する細胞傷害性 T細胞の培養に有効な酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性 単糖およびそれらの塩力もなる群より選択される化合物や、国際公開第 03Z01651 1号パンフレットに記載された下記 (A)〜 (D)力も選択される物質を前記成分と共に 用いてもよい。
(A) CD44に結合活性を有する物質
(B) CD44リガンドが CD44に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物 質
(C)成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質
(D)成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御 し得る物質
[0062] 前記 CD44に結合活性を有する物質としては、例えば CD44リガンドおよび Zまた は抗 CD44抗体が例示される。 CD44リガンドカCD44に結合することにより発せられ るシグナルを制御し得る物質としては、例えば各種リン酸ィ匕酵素および脱リン酸ィ匕酵 素の阻害剤又は活性化剤が挙げられる。成長因子の成長因子レセプターへの結合 を阻害し得る物質としては、例えば成長因子に結合活性を有し、成長因子と複合体 を形成することにより成長因子が成長因子レセプターに結合するのを阻害する物質、 もしくは成長因子レセプターに結合活性を有し、成長因子が成長因子レセプターに 結合するのを阻害する物質が挙げられる。さらに、成長因子が成長因子レセプター に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質としては、例えば各種リン 酸化酵素および脱リン酸化酵素の阻害剤又は活性化剤が挙げられる。これらの成分 の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。また、こ れらの成分は培地中に溶解して共存させる他、前記のような適切な固相に固定ィ匕し て使用してもよい。なお、上記の各種物質は単独で、もしくは 2種以上混合して用い ることがでさる。
[0063] 本発明において、国際公開第 02Z14481号パンフレットや国際公開第 03Z016 511号に記載された前記成分は、リンパ球の拡大培養を行なう際にその機能を発揮 し得る状態で存在させることができ、その存在状態は特に限定されるものではな 、。 例えば、有効成分を使用する培地に溶解させる力もしくは適切な固相に固定化して 使用される。培養液中における前記成分の含有量は、所望の効果が得られれば特 に限定するものではないが、例えば、好ましくは 0. 0001〜10000 gZmL、より好 ましくは 0. 001~ 10000.u g/mL,さらに好ましくは 0. 005~5000 μ g/mL,さら に好ましくは 0. 01〜： LOOO /z g/mLである。
[0064] また、本発明の方法により培養されたリンパ球をクローンィ匕することにより、安定した リンパ球として維持することもできる。また、本発明の方法により得られたリンパ球を用 いて、さらに本発明の方法や公知の方法により、さらに拡大培養することでリンパ球を 得ることちでさる。
[0065] 本発明の方法により得られるリンパ球集団には細胞傷害活性を有するリンパ球が含 まれており、当該リンパ球は所望の標的細胞を認識する能力を有し、例えば標的とな る細胞を、その細胞傷害活性により破壊する。この細胞傷害性リンパ球の細胞傷害 活性は公知の方法により評価できる。例えば、放射性物質、蛍光物質等で標識した 標的細胞に対する細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性を、細胞傷害性リンパ球によ り破壊された標的細胞に由来する放射活性や蛍光強度を測定することによって評価 できる。また、細胞傷害性リンパ球や標的細胞より特異的に遊離される GM— CSF、 I FN— γ等のサイト力イン量を測定することにより検出することもできる。その他蛍光色 素等によって標識された抗原ペプチド MHC複合体の使用によって直接確認する こともできる。この場合、例えば細胞傷害性リンパ球を細胞傷害性リンパ球特異性抗 体とカップリングさせた第 1蛍光マーカーと接触させた後に第 2蛍光マーカーとカップ リングさせた抗原ペプチド MHC複合体を接触させ、そして二重標識細胞の存在を フローサイトメトリーで分析することにより細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性を評価 することができる。
[0066] さらに、本発明者らは国際公開第 03Z080817号パンフレットに記載のとおり、フィ ブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下でリンパ球の製造を行 なうことにより、低細胞数力も培養を開始することが可能であることを見出している。す なわち、本発明の製造方法においても、少量の細胞量より開始された場合でも細胞 培養用器材の大きさに関わらず、高い拡大培養率で培養を行うことができ、本発明の 方法によれば、 1つの細胞培養用器材を用いた培養操作により、換言すれば、 1つの 培養系により、充分なリンパ球の拡大培養を行なうことができる。よって、本発明の方 法により、細胞培養液を希釈する工程を要しないリンパ球の製造方法を実現すること ができる。
[0067] 例えば、本発明のリンパ球の拡大培養を細胞培養用器材中で低細胞数カゝら開始 する場合、培養開始時において、下記 (X)および (Υ)力 選択される条件を満たす 低濃度もしくは低密度の細胞量を使用して行うことができる。
(X)使用する細胞培養用器材における培養面積に対する細胞量の比率が、好適に は lcell/cm2〜5 X 105cells/cm2、より好適には 10cells/cm2〜l X 105cells/ cm2、さらに好適には 1 X 102cells/cm2〜5 X 104cells/cm2である。
(Y)培地中の細胞の濃度力 好適には lcellZmL〜5 X 105cellsZmL、より好適 には 10cellsZmL〜l X 105cells/mL,さらに好適には 1 X 102cellsZmL〜5 X 1 04cells/mLである。
なお、ここで細胞量とは、培養に使用する細胞の個数をいう。 [0068] また、本発明の方法にぉ 、ては、細胞培養液の希釈操作の工程を要しな 、、リンパ 球の拡大培養を 1つの培養系で行なう方法が例示される。
[0069] また、本発明の方法は、少量のリンパ球からの拡大培養にも適していることから、 C
TLのクローンィ匕にも有用である。すなわち、選択された少ない細胞数の CTLを増殖 する際にも、本発明の方法を好適に使用することができる。
[0070] さらに本発明者らは、国際公開第 2005Z019450号パンフレットに記載のとおり、 フイブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下でリンパ球の製造 を行なうことにより、高細胞数での培養を行うことも可能であることを見出している。す なわち、リンパ球の製造を細胞培養用器材中で行なう方法であって、培養途中に、 少なくとも 1回の、細胞培養液を新鮮な培地で希釈する工程、培地を交換する工程、 もしくは細胞培養用器材を交換する工程を包含する場合、これらの工程直後の細胞 培養液中の細胞濃度を高濃度 (例えば、細胞培養液中の細胞の濃度が 2 X 105cell s/mL〜l X 108cells/mL、好適には 2 X 105cells/mL〜5 X 107cells/mL、さ らに好適には 2 X 105cells/mL〜2 X 107cells/mL)もしくは細胞培養液中の細 胞数と細胞培養用器材における培養面積との比率を高密度 (例えば、細胞培養液中 の細胞数と細胞培養用器材における培養面積との比率が 1 X 105 cellS/cm2〜l X 108cells/cm2、好適には 1 X 105cells/cm2〜5 X 107cells/cm2、さらに好適に は 1 X 105cellsZcm2〜2 X 107cellsZcm2)に設定した場合においても、良好な拡 大培養率を実現することができる。本発明の高細胞数での培養とは、このような培養 途中における細胞濃度や細胞密度の設定時にお!、て細胞培養液中の細胞の濃度 力 2 X 105cells/mL〜l X 108cells/mL、もしくは細胞培養液中の細胞数と細胞 培養用器材における培養面積との比率が 1 X 105cells/cm2〜l X 108cells/cm2 という高濃度又は高密度な条件に設定されるリンパ球の製造をいう。なお、ここでいう 細胞培養液を新鮮な培地で希釈する工程直後、培地を交換する工程直後、もしくは 細胞培養用器材を交換する工程直後とは、培養開始時を包含するものではな ヽ。
[0071] また、本発明の方法において、特に CTLの拡大培養においては、適切なフィーダ 細胞と共培養することもできる。リンパ球をフィーダ細胞と共培養する場合には、リン パ球、フィーダ細胞の両者の維持、生育に適した培地であることが望ましい。当該培 地としては、市販の培地が使用できる。
[0072] 本発明の方法に使用されるフィーダ細胞は、抗 CD3抗体、抗 CD28抗体と共同し てリンパ球を刺激し、 T細胞レセプターを活性ィ匕するものであれば特に限定はな 、。 本発明には、例えば、 PBMCやェプスタイン バールウィルスによって形質転換され た B細胞 (EBV— B細胞）が使用される。通常、フィーダ細胞は放射線照射のような 手段で増殖能を奪ったうえで使用される。なお、フィーダ細胞の培地中における含有 量は公知の方法に従って決定すればよぐ例えば、 1 X 105cells/mL〜l X 107cel lsZmLが好適である。
[0073] 特に好ま 、態様にぉ 、ては、フィーダ細胞として、非ウィルス感染細胞、例えば、 EBV— B細胞以外のものが使用される。これにより、拡大培養されたリンパ球中に EB V— B細胞が混在する可能性を排除することができ、養子免疫療法のような細胞傷害 性リンパ球を利用した医療の安全性を高めることが可能となる。
[0074] 本発明の製造方法によりリンフォカイン活性ィ匕細胞を製造する場合、 (a)フイブロネ クチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物、（b) CD3リガンド、及び (c) CD28リ ガンドの存在下、 IL 2とともに末梢血単核球 (PBMC)、 NK細胞、臍帯血単核球、 造血幹細胞もしくはこれらの細胞を含有する血液成分等をインキュベートすることに より実施される。
[0075] また、リンフォカイン活性ィ匕細胞を培養するための一般的な条件は、上記の培地を 使用する点を除いては、公知の条件〔例えば、細胞工学、 Vol. 14、 No. 2、p223〜 227、（1995年）；細胞培養、 17、（6)、 pl92〜195、（1991年）； THE LANCET , Vol. 356、 ρ802〜807、 (2000)； Current Protocols in Immunology, sup plement 17, UNIT7. 7を参照〕に従えばよい。培養条件には特に限定はなぐ通 常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、 37°C、 5%CO等の
2 条件下で培養することができる。この培養は通常、 2〜15日程度実施される。また、 適当な時間間隔で細胞培養液を希釈する工程、培地を交換する工程もしくは細胞培 養用器材を交換する工程を行っても良い。
[0076] 上記のリンフォカイン活性ィ匕細胞の拡大培養と同様に、（a)フイブロネクチン、その フラグメントまたはそれらの混合物、（b) CD3リガンド、及び (c) CD28リガンドの存在 下に培養することにより、 CTL、 TILの拡大培養においても高い拡大培養率を実現 することができる。本発明においては、これらの細胞の拡大培養において、（a)フイブ ロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物、（b) CD3リガンド、及び (c) CD2 8リガンドの存在下に培養する他には特に限定はなぐ前記細胞の培養に適した培 地を使用して実施することができる。（a)フイブロネクチン、そのフラグメントまたはそれ らの混合物、（b) CD3リガンド、及び (c) CD28リガンドの使用量、添加方法等につい ては前記方法に準じて適切なものを選択すればよい。
[0077] なお、本発明の製造方法により得られるリンパ球は実施例 3に記載のとおり、 IL- 2 の産生量が非常に多いという特徴を有する。リンパ球からの IL— 2産生は、 Zhou X . Y. et al. , The jounal of immunology, Vol. 168, 3847— 3854, (2002 )にも記載のとおり、リンパ球活性ィ匕の指標となることが知られており、例えばリンパ球 の拡大培養にぉ 、て抗 CD3抗体および抗 CD28抗体の共刺激を行った場合、抗 C D3抗体のみの刺激と比較して、 IL 2の産生量が高いことが知られている。すなわ ち、本発明の製造方法により得られるリンパ球は IL— 2産生量が極めて高いことから 、活性ィ匕されたリンパ球であり、養子免疫療法への使用に適したリンパ球であるとい える。
[0078] 本発明の方法により製造されるリンパ球を投与される疾患としては、特に限定はな いが、例えば、癌、悪性腫瘍、肝炎や、インフルエンザ、 HIV等のウィルス、細菌、真 菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、 MRSA、 VRE、深在性真菌症が例示さ れる。また、後述のようにさらに外来遺伝子を導入した場合は、各種遺伝子疾患に対 しても効果が期待される。また、本発明の方法により製造されるリンパ球は骨髄移植 や放射線照射後の感染症予防を目的としたドナーリンパ球輸注等にも利用できる。
[0079] 本発明の別の態様として、（a)フイブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混 合物、（b) CD3リガンド、及び (c) CD28リガンドを有効成分として含有するリンパ球 培養用培地が提供される。当該培地は、さらにその他の任意の成分、たとえば、公知 の細胞培養に用いられる培地成分、タンパク質、サイト力イン類 (好適には IL 2)、 所望のその他の成分とからなる。当該培地中の本発明の有効成分等の含有量は、 本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるものではなぐ例えば、本発明の 方法に使用される前記培地中の有効成分等の含有量に準じて、所望により、適宜、 決定することができる。本発明の培地の一態様としては、（a)フイブロネクチン、そのフ ラグメントまたはそれらの混合物、（b) CD3リガンド、及び (c) CD28リガンドが固定ィ匕 された細胞培養用担体を含有する培地、ならびに (a)フイブロネクチン、そのフラグメ ントまたはそれらの混合物、（b) CD3リガンド、及び (c) CD28リガンドが固定ィ匕され た細胞培養用器材に封入して提供される培地が包含される。
[0080] さらに本発明は、上記の本発明のリンパ球の製造方法で得られたリンパ球を提供す る。また、本発明は、当該リンパ球を有効成分として含有する医薬 (治療剤)を提供す る。特に、当該リンパ球を含有する前記治療剤は養子免疫療法への使用に適してい る。養子免疫療法においては、患者の治療に適したリンパ球が、例えば静脈への投 与によって患者に投与される。当該治療剤は前述の疾患やドナーリンパ球輸注での 使用において非常に有用である。当該治療剤は製薬分野で公知の方法に従い、例 えば、本発明の方法により調製された当該リンパ球を有効成分として、たとえば、公 知の非経口投与に適した有機または無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合すること により調製できる。なお、治療剤における本発明のリンパ球の含有量、治療剤の投与 量、当該治療剤に関する諸条件は公知の養子免疫療法に従って適宜、決定できる。
[0081] 本発明のリンパ球の製造方法において、当該リンパ球に外来遺伝子を導入するェ 程をさらに包含することができる。すなわち、本発明は、その一態様として、リンパ球 に外来遺伝子を導入する工程をさらに含むリンパ球の製造方法を提供する。なお、「 外来」とは、遺伝子導入対象のリンパ球に対して外来であることをいう。
[0082] 本発明のリンパ球の拡大培養方法を行うことにより、培養されるリンパ球の増殖能が 増強される。よって、本発明のリンパ球の製造方法を、遺伝子の導入工程と組み合わ せることにより、遺伝子の導入効率の上昇が期待される。
[0083] 外来遺伝子の導入手段には特に限定はなぐ公知の遺伝子導入方法により適切な ものを選択して使用することができる。遺伝子導入の工程は、リンパ球の製造の際、 任意の時点で実施することができる。例えば、前記リンパ球の拡大培養と同時に、あ るいは該工程の後に実施するの力 作業効率の観点から好適である。
[0084] 前記の遺伝子導入方法としては、ウィルスベクターを使用する方法、該ベクターを 使用しな 、方法の 、ずれもが本発明に使用できる。それらの方法の詳細にっ 、ては すでに多くの文献が公表されて 、る。
[0085] 前記ウィルスベクターには特に限定はなぐ通常、遺伝子導入方法に使用される公 知のウィルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウィルスベクター、アデ ノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、シミアンウィルスベクター、ヮクシ- ァウィルスベクターまたはセンダイウィルスベクター等が使用される。特に好適には、 ウィルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随 伴ウィルスベクター、レンチウィルスベクターまたはシミアンウィルスベクターが使用さ れる。上記ウィルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製 能を欠損させたものが好適である。
[0086] レトロウイルスベクターならびにレンチウィルスベクターは、当該ベクターが導入され る細胞の染色体 DNA中に該ベクターに挿入されて!、る外来遺伝子を安定に組み込 むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中 の細胞に対する感染効率が高 、ことから、本発明における拡大培養の工程にぉ 、て 遺伝子導入を行なうのに好適である。
[0087] ウィルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、本発明を限定するもので はないが、例えば、リボソーム、リガンドーポリリジンなどの担体を使用する方法やリン 酸カルシウム法、エレクト口ポレーシヨン法、パーティクルガン法などを使用することが できる。この場合にはプラスミド DNAや直鎖状 DNAに組み込まれた外来遺伝子が 導入される。
[0088] 本発明においてリンパ球に導入される外来遺伝子には特に限定はなぐ前記細胞 に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子として は、例えば、タンパク質 (例えば、酵素、サイト力イン類、レセプター類等）をコードする ものの他、アンチセンス核酸や siRNA (small interfering RNA)、リボザィムをコードす るものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカ 一遺伝子を同時に導入してもよい。
[0089] 前記の外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにべ クタ一やプラスミド等に挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転 写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と協同する他の調節要素、例え ば、ェンハンサー配列やターミネータ一配列がベクター内に存在していてもよい。ま た、外来遺伝子を相同組換えにより導入対象のリンパ球の染色体へ挿入することを 目的として、例えば、該染色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にあ る塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に外来遺 伝子を配置させてもよい。導入される外来遺伝子は天然のものでも、または人工的に 作製されたものでもよぐあるいは起源を異にする DNA分子がライゲーシヨン等の公 知の手段によって結合されたものであってもよい。さらに、その目的に応じて天然の 配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。
[0090] 本発明の方法によれば、例えば、癌等の患者の治療に使用される薬剤に対する耐 性に関連する酵素をコードする遺伝子をリンパ球に導入して該リンパ球に薬剤耐性 を付与することができる。そのようなリンパ球を用いれば、養子免疫療法と薬剤療法と を組み合わせることができ、従って、より高い治療効果を得ることが可能となる。薬剤 耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性遺伝子（multidrug resistance gene)が 例示される。
[0091] 一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子 をリンパ球に導入して、該薬剤に対する感受性を付与することもできる。カゝかる場合、 生体に移植した後のリンパ球を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。 薬剤に対する感受性を付与する遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子 が例示される。
実施例
[0092] 以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する力 本発明はこれらの記 載に何ら限定されるものではな 、。
[0093] 実施例 1 CH— 296および抗ヒト CD3抗体、抗ヒト CD28抗体共刺激によるリンパ球 拡大培養における拡大培養率の測定
(l) PBMCの分離と保存
インフォームド 'コンセントの得られたヒト健常人ドナーより成分採血を実施後、採血 液をリン酸緩衝生理食塩水で 2倍希釈し、 Ficol— paque (AmershamBiosciences 社製)上に重層して 500 X gで 20分間遠心分離した。中間層の末梢血単核球細胞（ PBMC)をピペットで回収、洗浄した。採取した PBMCは 90%FBS (Cambrex社製 ) /10%DMSO (SIGMA社製）力もなる保存液に懸濁し、液体窒素中にて保存し た。リンパ球拡大培養時にはこれら保存 PBMCを 37°C水浴中にて急速溶解し、 10 μ g/mL DNase (Calbiochem社製）を含む RPMI1640培地（SIGMA社製）で 洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。
[0094] (2)抗ヒト CD3抗体、抗ヒト CD28抗体および CH— 296のプレートへの固定化
12穴細胞培養プレート (ベタトン'ディッキンソン社製）に終濃度 5 μ gZmLの抗ヒト CD3抗体 (ヤンセン協和社製）を含む酢酸緩衝水溶液を 1. 9mLずつ添カ卩した。酢 酸緩衝水溶液は、 0. 2M酢酸（ナカライテスタ社製、 00212— 43より調製）と 0. 2M 酢酸ナトリウム水溶液 (ナカライテスタ社製、 311— 19より調製)を 1： 4の比率 (容量比 )で混合し、 pHが 5. 3になるように調製した。この時、抗ヒト CD28抗体による刺激が 行われる群には抗ヒト CD28抗体（DakoCytomation社製、 RB342)を終濃度 5 μ g ZmLとなるように、 CH— 296による刺激が行われる群には CH - 296を終濃度 25 μ gZmLとなるように添カ卩した。これらのプレートは室温で 5時間インキュベートした 後、抗体、 CH— 296を含む酢酸緩衝水溶液を吸引除去し、各ゥ ルをリン酸緩衝生 理食塩水で 2回、 RPMI培地で 1回洗浄し、各実験に供した。
[0095] (3)リンパ球の拡大培養
3%humanAB血清（Cambrex社製）を含む AIM— V(Invitrogen社製、以下 3% AIM— Vと略す）に 0. 5 X 106cells/mLとなるように実施例 1 （1)で調製した PB MCを懸濁し細胞液を調整後、実施例 1一（2)で調製した抗体及び CH— 296固定 化プレートに 3%AIM—Vを 2mLZゥエルで添カ卩し、そこへ調整した細胞液を lmL Zゥエルずつ加えた。その後、抗ヒト CD3抗体単一刺激群および抗ヒト CD3抗体と C H— 296共刺激群には終濃度 lOOOUZmLとなるように IL— 2 (塩野義製薬社製)を 添カロし (すなわち抗ヒト CD28抗体を用いて刺激を行った群には IL 2を添カ卩しな ヽ )、これらのプレートを 5%CO中 37°Cで培養した (培養 0日目）。各群について、培
2
養開始後 4日目、 7日目、 11日目には、以下の方法で継代培養操作を行った。細胞 培養液を一部回収し、トリパンブルー染色法にて生細胞数を計測後、 l%humanA B血清を含む AIM— Vを用いて培養液を適切な濃度に希釈し、何も固定ィ匕して！/ヽな い新しい 12. 5cm2フラスコ（ベタトン'ディッキンソン社製、 353107)に移し、終濃度 500U/mLとなるように IL— 2を添加して、継代培養した (培養開始後 4日目以降は 全ての群に IL— 2を添加している)。なお、継代培養操作後の細胞濃度がそれぞれ、 培養開始 4曰目で ίま 0. 05 X 106cells/mL, 7曰目で ίま 0. 15 X 106cells/mL, 1 1日目では 0. 2 X 106cells/mLになるように希釈を行った。培養開始後 15日目に は、トリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して 拡大培養率を算出した。その結果を表 1に示す。表 1はそれぞれ抗ヒト CD3抗体の み、抗ヒト CD3抗体と CH— 296、抗ヒト CD3抗体と抗ヒト CD28抗体、抗ヒト CD3抗 体と抗ヒト CD28抗体と CH— 296で刺激した細胞群の増殖率を示したものである。
[0096] [表 1]
Figure imgf000029_0001
抗 C D 3抗体 + C H— 2 9 6 2 3 3 1
抗 C D 3抗体 +抗 C D 2 8抗体 1 4 8 6
抗 C D 3抗体 +抗 C D 2 8抗体 + C H— 2 H 4 1 7 0
[0097] 一般に、抗ヒト CD3抗体と抗ヒト CD28抗体で同時に刺激することにより、リンパ球 の増殖が促進されることが知られている力 表 1に示すように、抗ヒト CD3抗体と CH - 296との共刺激の方がより高 、拡大培養率を示し、さらに CH— 296刺激を抗ヒト C D3抗体、抗ヒト CD28抗体共刺激に加えることで、拡大培養率がより上昇することが 明らかになった。
[0098] 実施例 2 種々の pHでの抗ヒト CD3抗体、抗ヒト CD28抗体、 CH— 296のプレート への固定化効率
緩衝液として、ダルベッコ PBS粉末（日水製薬社製)より pH7. 4のリン酸緩衝生理 食塩水を、 0. 2Mリン酸二水素ナトリウム水溶液 (ナカライテスタ社製、 317— 20より 調製）と 0. 2Mリン酸水素ニナトリウム水溶液 (ナカライテスタ社製、 318— 01より調 製)を 8. 15 : 1. 85の比率 (容量比）で混合して pH6. 2のリン酸ナトリウム緩衝水溶 液を、及び 0. 2M酢酸と 0. 2M酢酸ナトリウム水溶液を 1 :4の比率 (容量比）で混合 して pH5. 3の酢酸緩衝水溶液をそれぞれ調製した。これらの緩衝液を用いて終濃 度 5 gZmLになるように調整した抗ヒト CD28抗体の各溶液を、 96穴細胞培養プレ ート（ベタトン.ディッキンソン社製、 353072)の各ウエノレに 100 Lずつ添カロ後、室 温で 5時間インキュベートして各 pHでの固定ィ匕を行った。また同様に、終濃度 5 g ZmLに調整した抗ヒト CD3抗体の各溶液、もしくは終濃度 25 μ gZmLに調整した CH— 296の各溶液を 160 Lずつ添加後、同じく室温 5時間での固定ィ匕を行った。 これらの固定ィ匕が終了後、抗体もしくは CH— 296を含む緩衝液を除去し、リン酸緩 衝生理食塩水で 4倍希釈したブロックエース（大日本製薬社製、 UK-B25)を 300 /z Lずつ添加して 1時間室温に置きブロッキングを行った。その後、溶液を除去し、リ ン酸緩衝生理食塩水で 10倍希釈したブロックエース中に検出用抗体を溶解し、固定 化の液量と等量だけ添加した。検出用抗体として、抗ヒト CD3抗体および抗ヒト CD2 8抗体検出には HRP— rabbit Anti— Mouse IgG (ZYMED社製、 61— 6520) を、 CH— 296の検出には HRP標識した Anti— Human Fibronectin (Clone F NH3— 8、タカラバィォ社製、 M115)を使用した。 1時間の反応後、再度溶液を除 去し、 ABTS溶液 (SIGMA社製、 A1888— 2Gより調製)を固定ィ匕の液量と等量だ け添加、 10分間の反応の後、添カ卩した ABTSの半量の 150mMのシユウ酸溶液（ナ 力ライテスタ社製、 25806— 74より調製)を添加して反応を停止させた。なお各溶液 を除去した際には、リン酸緩衝生理食塩水で 3回の洗浄操作を行った。反応停止後 、吸光プレートリーダー（MicroReader4、 Hyperion社製）で 405nmの吸光度を測 定した。その結果を表 2に示す。表 2は抗ヒト CD3抗体、抗ヒト CD28抗体、 CH— 29 6について、 pH7. 4、 6. 2、 5. 3の 3条件における固定ィ匕効率を、吸光度の値で比 較したものである。
[表 2] 表 2
吸光度
抗体、 C I I 2 9 6 P H 7 . 4 p H 6 . 2 p H 5 . 3
抗 C D 3抗体 1 . 8 2 4 2 . 7 9 9 3 - 5 0 1
抗 C D 2 8抗体 0 . 0 3 0 0 . 3 5 3 1 . 5 2 8
C H - 2 9 6 0 . 5 0 1 0 . 7 6 9 1 . 0 4 6 表 2に示すように、抗ヒト CD3抗体、抗ヒト CD28抗体、 CH— 296のいずれについ ても、 pHを低下させるほど固定ィ匕効率が上昇しており、 pH5. 3条件で固定化を行つ た際に最も固定ィ匕効率が高くなることが明らかになった。
[0101] 実施例 3 種々の pHで固定ィ匕したプレートを用いてリンパ球の拡大培養を行った際 の IL 2産生量の比較
実施例 1と同様の方法でリンパ球を拡大培養した。ただし抗ヒト CD3抗体、抗ヒト C D28抗体および CH— 296の 12穴細胞培養プレートへの固定化について、緩衝液 として pH5. 3酢酸緩衝水溶液ではなぐ pH7. 4のリン酸緩衝生理食塩水と pH6. 2 のリン酸ナトリウム緩衝水溶液を用いた。両緩衝液は実施例 2と同様に調製した。また 培養開始時に播種する細胞数を 1ゥエルあたり 1 X 106 Cellsとした。培養開始後 4日 目まで、約 24時間ごとに培養上清を回収し、 ELISA解析に供し、上清中の IL— 2濃 度を測定した。 ELISA解析は ELISA Development Kit human IL— 2 (Gen zymeZTechne社製、 4904)を使用して行った。その結果を表 3に示す。表 3は抗ヒ ト CD3抗体、抗ヒト CD28抗体および CH - 296で細胞を刺激した際の IL - 2産生量 について、 pH7. 4のリン酸緩衝生理食塩水と pH6. 2のリン酸ナトリウム緩衝水溶液 を用いて固定ィ匕した場合を比較したものである。
[0102] [表 3]
表 3
ρ Η 刺激条件 I L— 2濃度 （U Zm L )
培養開始後の日数
1 曰巨 2曰巨 3曰 4 R S
7 . 4 抗 C D 3抗体 +抗 C D 2 8抗体 1 1 4 5 0 抗 C D 3抗体 +抗 C D 2 8抗体 + C H— 2 9 6 6 3 2 4 4 2 7 7 4 6
6 . 2 抗 C D 3抗体 +抗 C D 2 8抗体 2 8 8 0 7 1 0 抗 C D 3抗体十抗 C D 2. 8抗体 + C H— 2 9 6 1 0 7 3 2 2 3 8 0 1 5 3
[0103] 表 3に示すように、 pH7. 4よりも pH6. 2で固定ィ匕を行った方力 IL 2産生量は上 昇していた。
[0104] また同様に、 pH6. 2のリン酸ナトリウム緩衝水溶液と pH5. 3の酢酸緩衝水溶液を 用いて固定ィ匕した場合の IL— 2産生量にっ ヽても比較を行った。実施例 1と同様の 方法でリンパ球を拡大培養した。ただし抗ヒト CD3抗体、抗ヒト CD28抗体および CH — 296の 12穴細胞培養プレートへの固定化について、緩衝液として pH5. 3の酢酸 緩衝水溶液に加えて、 pH6. 2のリン酸ナトリウム緩衝水溶液を用いた群も設定した。 培養開始後 4日目まで約 24時間ごとに培養上清を回収し、 ELISA解析に供し、上 清中の IL— 2濃度を上記と同様にして測定した。その結果を表 4に示す。表 4は抗ヒト CD3抗体、抗ヒト CD28抗体および CH - 296で細胞を刺激した際の IL - 2産生量 について、 pH6. 2のリン酸ナトリウム緩衝水溶液と pH5. 3の酢酸緩衝水溶液を用い て固定ィ匕した場合を比較したものである。
[表 4]
¾ 4
H 刺激条件 Ϊ L一 2濃度 （U/m L ) 培養 4日目の単位細胞数 培養開始後の日数 あたりの I L— 2量
1曰 S 2 ϋ Q 3 l目 4曰目 ( U/ 1 0 6 c e I 1 s〕
6 . 2 抗 C D 3抗体十抗 C D 2 8抗体 7 1 6 2 1 8 3 5
抗 C D 3抗体 +抗 C D 2 8拭体 5 9 2 1 2 3 6 1 3 7 1 1 1 0 0
+ C H - 2 9 6
5 . 3 抗 C D 3抗体 +抗 C D 2 8抗体 3 2 6 3 7 7 5 8 2 3 6
抗 C D 3抗体 +抗 C D 2 8抗体 1 4 6 5 1 4 8 4 3 9 3 7 2 9 9 7
+ C I I - 2 9 6
[0106] 表 4に示すように、 pH6. 2よりも pH5. 3で固定ィ匕を行った方力 IL 2産生量は上 昇する。また、抗ヒト CD3抗体、抗ヒト CD28抗体および CH— 296で刺激して得られ た細胞は、抗ヒト CD3抗体と抗ヒト CD28抗体で刺激して得られた細胞と比較して、 I L-2産生能が高 、ことが示された。
[0107] 一般に、抗ヒト CD3抗体および抗ヒト CD28抗体共刺激によって IL— 2産生が誘導 されることが知られているが、表 3および表 4に示すように、更に CH— 296刺激をカロ えると IL 2産生量が増加することが明らかとなり、 CH 296の新たな有効性が認め られた。また、 pH5. 3の条件で抗 CD3抗体、抗 CD28抗体および CH— 296のプレ ートへの固定化を行うと、最も固定ィ匕効率が高ぐ IL 2産生量が多くなることが明ら 力になった。すなわち pH5. 3の条件で固定化を行うことにより、細胞への抗体および CH— 296による刺激がより強くなり、リンパ球の増殖やサイト力イン産生などをより活 性ィ匕させることが明ら力となり、 CH— 296を用いたリンパ球拡大培養の効率ィ匕が認 められた。なお、表 3と表 4において、 pH6. 2の固定ィ匕条件における培養 4日目の細 胞の IL-2産生量にみられる差は、培養開始時の細胞数の違いが影響したものと考 えられる。
[0108] 実施例 4 抗ヒト CD3抗体、抗ヒト CD28抗体固定化ビーズと CH— 296固定化ビー ズを用いたリンパ球拡大培養
( 1)コントロールビーズと CH— 296ビーズの調製
Dynabeads M— 450 Epoxy (DYNAL社製、 140— 01)を用いて、 CH— 296 を固定ィ匕したビーズ (以下 CH— 296ビーズと称する）と、抗体やタンパク質を一切固 定ィ匕せずにブロッキングのみを行ったビーズ (以下コントロールビーズと称する）を調 製した。調製は製品付属のプロトコルに従って行った。固定化は CH— 296の終濃度 力 S200 μ g/mLの溶液に 4 X 108beads/mLとなるようにビーズを懸濁し、 5°Cで 18 時間インキュベートすることで行った。ブロッキングはヒト血清アルブミン（ブミネート 25 %、 Baxter社製、 7783)を用いて行った。
(2)ビーズを用いたリンパ球の拡大培養
Dynabeads CD3/CD28 T Cell Expander (DYNAL社製、 111— 31、以 下 T Cell Expanderと略す）を付属のプロトコルに従って洗浄した後、 l%human AB血清を含む AIM— V (以下 1%AIM— Vと略す）に 3 X 106beadsZmLとなるよう に懸濁し、 12穴細胞培養プレートに lmLZゥエルずつ加えた。実施例 4ー（1)で調 製したコントロールビーズと CH— 296ビーズを T Cell Expanderと同様に洗浄後 、 1%AIM— Vに 1. 9 X 106beadsZmLとなるように懸濁した。抗ヒト CD3抗体、抗ヒ ト CD28抗体共刺激群にはコントロールビーズ懸濁液を、抗ヒト CD3抗体、抗ヒト CD 28抗体および CH— 296刺激群には CH— 296ビーズ懸濁液を、 12穴細胞培養プ レートに lmLZゥエルずつ、 T Cell Expander懸濁液に加える形で添カ卩した。実 施例 1— (1)で調製した PBMCを、 1%AIM— Vに 1 X 106cellsZmLとなるように懸 濁し、ビーズ懸濁液が添加されている 12穴細胞培養プレートに lmLZゥエルずつ添 カロした (合計 3mLZゥエル)。その後、終濃度 200UZmLとなるように各ゥヱルに IL 2を添加し、プレートを 5%CO、 37°Cのインキュベーター内で培養した (培養 0日
2
目 )。培養開始後 4日目、 7日目、 10日目には以下の方法で継代培養操作を行った 。細胞培養液を一部回収し、トリパンブルー染色法にて生細胞数を計測、 1%AIM —Vを用いて培養液を適切な濃度に希釈し、 12. 5cm2フラスコに移し、終濃度 200 UZmLとなるように IL— 2を添加した。培養液の希釈は、継代操作後の細胞濃度が それぞれ、 4曰目で ίま 0. 05 X 106cells/mL, 7曰目で ίま 0. 1 X 106cells/mL, 1 0日目では 0. 15 X 106cellsZmLになるように行った。培養開始後 14日目に生細胞 数を計測、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。その結果を表 5 に示す。表 5は T Cell Expanderとコントロールビーズ、もしくは CH— 296ビーズ で刺激した細胞群について、 14日間の拡大培養後の増殖率を示したものである。
[0110] [表 5] 表 5
刺激条件 拡大培養率 （倍率）
T C e l l E x p a n d€ r +コント口一ルビ一ズ 3 7 7
T C e l l E x p a n d€ '― r + C H 2 9 6ビーズ 8 0 9
[0111] 表 5に示すように、コントロールビーズ添加群よりも、 CH— 296ビーズ添加群の方 力 り高い拡大培養率を示した。抗ヒト CD3抗体、抗ヒト CD28抗体固定ィ匕ビーズに 加え、 CH— 296固定ィ匕ビーズを同時に添加することで、リンパ球の増殖を更に促進 させることが可能であると明らかになった。
[0112] 実施例 5 抗ヒト CD3抗体、抗ヒト CD28抗体および CH— 296固定化ビーズを用い たリンパ球拡大培養
(1)抗ヒト CD3抗体、抗ヒト CD28抗体、 CH— 296固定化ビーズの調製
実施例 4— (1)と同様の方法で行った。ただし固定ィ匕は、抗ヒト CD3抗体が 25 μ g ZmL、抗ヒト CD28抗体が 50 μ g m CH— 296力 125 μ gZmLの終濃度で混 在する緩衝液を用いて行った。
[0113] (2)ビーズを用いたリンパ球の拡大培養
実施例 4— (2)と同様の方法で行った。ただし培養開始時について、細胞を刺激す るビーズには実施例 5— (1)で調製したビーズを使用し、培地には 0. 5%humanA B血清と 0. 2%のヒト血清アルブミンを含む GT—T503培地（タカラバイオ社製、以 下 0. 5%GT—T503と略す）を用い、細胞数は 0. 5 X 106cells/ゥエル、培養液量 は 1. 5mL/ゥエルとした。ビーズ添力卩量は 0. 5 X 106beads/ゥエルと 5 X 106bead sZゥエルとなる群を設定した。また継代培養について、継代操作は培養開始後 4日 目、 8日目、 11日目に行い、継代後の細胞濃度はそれぞれ、 4日目では 0. 02 X 106 cellsZmL、 8日目では 0. 15 X 106cells/mLゝ 11日目では 0. 3 X 106cells/mL となるように行った。培地には 0. 5%GT— T503を使用した。培養開始後 14日目に 生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。その結 果を表 6に示す。表 6は、抗ヒト CD3抗体、抗ヒト CD28抗体、 CH— 296固定化ビー ズで刺激した細胞について、 0. 5 X 106beadsと 5 X 106beadsで刺激した細胞群の 14日間の拡大培養後の増殖率を示したものである。
[0114] [表 6] 表 6
刺激条件 拡大培養率 （倍率）
0 . 5 X 1 0 6 b e a d s 4 2 4
5 X l 0 ° b e a d s 6 2 5
[0115] 表 6に示すように、抗ヒト CD3抗体、抗ヒト CD28抗体、 CH— 296を同時に固定化 したビーズを用いて、リンパ球の拡大培養を行うことが可能であると示された。
産業上の利用可能性
[0116] 本発明により、リンパ球の製造方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が高ぐ 本発明により得られるリンパ球は、例えば、養子免疫療法に好適に使用される。従つ て、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。
図面の簡単な説明
[0117] [図 1]フイブロネクチンのドメイン構造を示す模式図である。
配列表フリーテキスト
SEQ ID NO 1 ； Partial region or ribronectin named Ill- 8.
SEQ ID NO 2 ； Partial region of fibronectin named Ill- 9.
SEQ ID NO 3 ； Partial region of fibronectin named Ill- 10.
SEQ ID NO 4 ； Partial region of fibronectin named Ill- 11.
SEQ ID NO 5 ； Partial region of fibronectin named Ill- 12.
SEQ ID NO 6 ； Partial region of fibronectin named Ill- 13.
SEQ ID NO 7 ； Partial region of fibronectin named Ill- 14.
SEQ ID NO 8 ； Partial region of fibronectin named CS— 1.
SEQ ID NO 9 ； Fibronectin fragment named C-274.
SEQ ID NO 10 ； Fibronectin fragment named H— 271.
SEQ ID NO 11 ； Fibronectin fragment named H— 296.
SEQ ID NO 12 ； Fibronectin fragment named CH— 271 -
SEQ ID NO 13 ； Fibronectin fragment named CH— 296 -
SEQ ID NO 14 ； Fibronectin fragment named C— C¾丄. SEQ ID N0:15 Fibronectin fragment named CHV- 89·
SEQ ID N0:16 Fibronectin fragment named CHV- 90·
SEQ ID N0:17 Fibronectin fragment named CHV- 92·
SEQ ID N0:18 Fibronectin fragment named CHV- 179·
SEQ ID N0:19 Fibronectin fragment named CHV- 181·
SEQ ID NO:20 Fibronectin fragment named H— 275— Cys
SEQ ID N0:21 Fibronectin fragment named CH— 296Na.

Claims

請求の範囲
[I] (a)フイブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物、（b) CD3リガンド、及 び (c) CD28リガンドの存在下に拡大培養を行なう工程を包含することを特徴とする、 リンパ球の製造方法。
[2] CD3リガンドが抗 CD3抗体である請求項 1記載の製造方法。
[3] CD28リガンドが抗 CD28抗体である請求項 1記載の製造方法。
[4] フイブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号 1〜8で表されるアミノ酸配列 を少なくとも 1つ含んでなるポリペプチド (m)である力、または前記 、ずれかのアミノ 酸配列において 1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミ ノ酸配列を少なくとも 1つ含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチド (m)と同 等な機能を有するポリペプチド (n)である請求項 1記載の製造方法。
[5] フイブロネクチンのフラグメントが、細胞接着活性および Zまたはへパリン結合活性 を有するものである請求項 4記載の製造方法。
[6] フイブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号 9〜21で表されるいずれかの アミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも 1つのポリぺプ チドである請求項 5記載の製造方法。
[7] リンパ球がリンフォカイン活性ィ匕細胞である請求項 1記載の製造方法。
[8] リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに包含する請求項 1記載の製造方法
[9] 外来遺伝子をレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、レンチウィルスま たはシミアンウィルスを用いて導入する請求項 8記載の製造方法。
[10] 請求項 1〜9いずれ力 1項に記載の方法により得られるリンパ球。
[II] 請求項 1〜9いずれか 1項に記載の方法により得られるリンパ球を有効成分として含 有する医薬。
[12] 酸性条件下で、抗 CD3抗体、抗 CD28抗体、フイブロネクチン及びそのフラグメント 力もなる群より選択される少なくとも 1つと固相を接触させることを特徴とする、抗 CD3 抗体、抗 CD28抗体、フイブロネクチン及びそのフラグメントからなる群より選択される 少なくとも 1つが固定化された固相の製造方法。
[13] 固相が細胞培養用担体である請求項 12記載の製造方法。
[14] (a)フイブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物、（b) CD3リガンド、及 び (c) CD28リガンドが固定ィ匕された固相。
[15] 固相が細胞培養プレート、シャーレ、フラスコ、バッグ、ビーズ、メンブレンまたはスラ イドガラスである請求項 14記載の固相。
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