WO2007080977A1

WO2007080977A1 - 免疫疾患の予防ないし治療剤および方法

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Publication number: WO2007080977A1
Application number: PCT/JP2007/050340
Authority: WO
Inventors: Yasuyuki Ishii; Risa Nozawa; Yukiko Matsui
Original assignee: RIKEN
Current assignee: RIKEN
Priority date: 2006-01-13
Filing date: 2007-01-12
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2008-07-13
Also published as: JPWO2007080977A1; KR20080082893A; EP1974750A1; CN101309705A; CA2601803A1; EP1974750A4; AU2007205489A1; US20120121688A1; JP5191234B2

Abstract

　本発明は、ＮＫＴ細胞の多彩な機能の中から選択的に免疫抑制機能を増強させる方法、及び生体内で抗原特異的免疫抑制を効率よく誘導する方法、並びにそれらを応用した医薬を提供する。　より詳細には、本発明は、ＣＤ１ｄリガンド及び標的抗原（例えば、アレルゲン、自己抗原）を含む医薬（例えば、アレルギー疾患、自己免疫疾患等の免疫疾患の予防・治療剤）を提供する。好ましくは、本医薬は、ＣＤ１ｄリガンド及び標的抗原を含む、内腔を有する薬物送達媒体を含有してなる。

Description

明細書

免疫疾患の予防なレ、し治療剤および方法

技術分野

[0001] 本発明は、アレルギー疾患又は自己免疫疾患などの免疫疾患の予防な!/、し治療剤、免疫疾患の予防ないし治療方法、スギ花粉抗原融合タンパク質などに関する。背景技術

[0002] 免疫応答の異常を原因とする、自己免疫疾患、アレルギー疾患を始めとする免疫疾患に対する現行の治療の多くは対症療法であるため、このような疾患を根本的に治療し得る、免疫制御機構を利用した方法の開発が切望されている。免疫制御機構に関係する主要な細胞集団としては、 NKT細胞、免疫寛容誘導性榭状細胞、制御性 T細胞などが既に報告されている。従って、免疫疾患を根本的に治療し得る方法としては、これらの免疫細胞を介した免疫制御機構を利用する方法が考えられる。

[0003] 免疫疾患の治療につながり得る、免疫制御機構を利用する方法としては、これまでに、以下の報告がある。

特許文献 1には、 (X -GalCer ( a -galactosylceramide)を包含するリボソーム内腔に OVA (卵白アルブミン)タンパク質を封入する方法と上記リボソームによるマウスの抗体産生抑制作用が記載されて、る。

非特許文献 1には、マウス骨髄細胞を IL— 10存在下に試験管内で培養すると CD 45RB^WghCDl lc^lc>w細胞が増殖すること、また脾臓中には CD45RB^WghCDl lc^lc>w細胞が存在し、試験管内と in vivo (マウス)でナイーブ CD4+T細胞カゝら制御性 T細胞を分ィ匕 ·増殖させることができることが記載されて、る。

非特許文献 2には、マウス骨髄細胞力制御性榭状細胞を人工的に作製する方法が記載されている。

非特許文献 3には、マウス脾臓中の低比重 B220陽性 B細胞がバクテリア刺激で IL — 10を産生する能力があることが記載されている。

非特許文献 4には、 α— GalCerを投与したマウスの脾臓中の低比重 Β細胞は ΝΚ T細胞の IL— 4産生能を高められな、ことと、 DCで活性ィ匕する NKT細胞の IFN— Ύと IL— 4産生機能を抑制することが記載されている。

し力しながら、 NKT細胞の多彩な機能の中から選択的に免疫抑制機能を増強させる方法、及び生体内で抗原特異的免疫抑制を効率よく誘導する方法は、未だ開発されていない。

特許文献 1：国際公開 WO2005/120574号パンフレット

非特許文献 l :Wakkach et al, Immunity 18: 605-617 (2003)

非特許文献 2 : Sato et al., Immunity 18: 367-379 (2003)

非特許文献 3 : Burke et al., The Journal of Immunology 173: 2362-2372 (2004) 非特許文献 4: Bezbradica et al., The Journal of Immunology 174: 4696-4705 (2005) 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 従って、本発明の目的は、 NKT細胞の多彩な機能の中から選択的に免疫抑制機能を増強させる方法、及び生体内で抗原特異的免疫抑制を効率よく誘導する方法、並びにそれらを応用した医薬を提供することである。

課題を解決するための手段

[0005] 本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、 CDldリガンド及び天然または組換えァレルゲンを含む薬物送達媒体が該アレルゲンに起因する IgE産生を特異的に抑制することから、該アレルゲンに起因するアレルギー疾患力このような薬物送達媒体により特異的に治療され得ることを見出し、また、かかる知見から、アレルゲンの代わりに自己抗原を含む薬物送達媒体を利用することで、該自己抗原に起因する自己免疫疾患についても同様に特異的に治療し得ることを着想し、以つて本発明を完成するに至った。

[0006] すなわち、本発明は、以下の発明などを提供する：

〔1〕 CDldリガンド及び標的抗原を含む、内腔を有する薬物送達媒体を含有してなる、該標的抗原に起因する免疫疾患の予防又は治療剤。

〔2〕標的抗原がアレルゲンであり、免疫疾患が該アレルゲンに起因するアレルギー疾患である上記〔1〕の剤。

〔3〕薬物送達媒体がリボソームである、上記〔1〕の剤。〔4〕CDldリガンドが oc— GalCerである、上記〔1〕の剤。

〔5〕アレルゲンがスギ花粉抗原である、上記〔2〕の剤。

〔6〕アレルゲンが Cryj 1成熟タンパク質及び Cryj 2成熟タンパク質の融合タンパク質である、上記〔2〕の剤。

〔7〕融合タンパク質において、 Cryj 1成熟タンパク質が Cryj 2成熟タンパク質よりも N 末端側に存在する、上記〔5〕の剤。

〔8〕 CDldリガンドがリボソーム膜内に包埋され、かつアレルゲンがリボソーム内腔に封入されている、上記〔2〕の剤。

〔9〕標的抗原が自己抗原である、上記〔1〕の剤。

〔10〕スギ花粉抗原 Cryj 1タンパク質と Cryj 2タンパク質を含む融合タンパク質。

〔11〕前記 Cryj 1タンパク質が Cryj 1成熟タンパク質であり、 0: 2タンパク質カ ^

2成熟タンパク質である上記〔10〕の融合タンパク質。

〔12〕 Cryj 1タンパク質と Cryj2タンパク質力直接又はペプチドリンカ一を介して連結されている、上記〔10〕の融合タンパク質。

[ 13] Cryj 1タンパク質が N末端側に、 Cryj 2成熟タンパク質が C末端側に存在する、上記〔10〕の融合タンパク質。

〔14〕上記〔1〕〜〔9〕の、ずれかの免疫疾患の予防又は治療剤の薬学的有効量をその治療を必要とする被験体に投与する工程を含む、免疫疾患の予防又は治療方法

[ 15]前記被験体がヒト免疫疾患患者である、上記〔14〕の免疫疾患の予防又は治療方法。

図面の簡単な説明

[図 1] a 0&1じ61：又は0；0じ（0； - GalCer)—リボソーム投与マウス脾臓由来の榭状細胞（DC)及び B細胞における IFN— y、 IL— 4、 IL 10産生を示す図である。 " ND ： not detected。

[図 2A]フローサイトメーターによる、低密度 (LD)— B細胞及び高密度 (HD)— B細胞の解析を示す図である。

[図 2B]低密度 (LD)—B細胞又は高密度 (HD)—B細胞と、全脾臓細胞との共培養により培養培地に分泌された IL— 10量を示す図である。

[図 3] a GCリボソームをパルスした辺縁帯 B細胞による IL— 10産生を示す図である。 ND ： not detected。

[図 4] a GC—天然型 Cryj l—リボソーム、 α GC—リボソーム又はリボソーム単体が投与された、天然型 Cryj l感作マウスにおける血中抗 Cryj l特異的 IgE濃度を示す図である。

[図 5]Cryj 1Z2遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号 8)を示す図である。配列番号 8で表されるヌクレオチド配列のうち、 1〜57番目のヌクレオチド残基からなるヌクレオチド配列（下線を付す）は、 pET47bベクター由来 Hisタグ領域のヌクレオチド配列であり、 58〜： L 119番目のヌクレオチド残基からなるヌクレオチド配列は、 Cryj l成熟タンパク質のアミノ酸配列（GenBankァクセッション番号 BAA07020として登録されているアミノ酸配列のうち、 21〜374番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列：配列番号 10)をコードするヌクレオチド配列であり、 1120〜2283番目のヌクレオチド残基からなるヌクレオチド配列は、 Cryj 2成熟タンパク質のアミノ酸配列（GenBankァクセッシヨン番号 P43212として登録されているアミノ酸配列のうち、 46〜433番目のァミノ酸残基からなるアミノ酸配列：配列番号 11)をコードするヌクレオチド配列である。

[図 6]CryjlZ2タンパク質のアミノ酸配列（配列番号 9)を示す図である。配列番号 9で表されるアミノ酸配列のうち、 1〜19番目のアミノ酸残基力もなるアミノ酸配列（下線を付す）は、 pET47bベクター由来 Hisタグ領域のアミノ酸配列であり、 20-373 番目のアミノ酸残基力もなるアミノ酸配列は、 Cryj l成熟タンパク質のアミノ酸配列（G enBankァクセッション番号 BAA07020として登録されて!、るアミノ酸配列のうち、 2 1〜374番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列：配列番号 10)であり、 374-761 番目のアミノ酸残基力もなるアミノ酸配列は、 Cryj 2成熟タンパク質のアミノ酸配列（G enBankァクセッション番号 P43212として登録されているアミノ酸配列のうち、 46〜 433番目のアミノ酸残基力もなるアミノ酸配列：配列番号 11)である。

[図 7]天然型 Cryj l又は recCryj lZ2タンパク質で免疫したマウス血清中の天然型 C ryj 1特異的 IgE抗体価を示す図である。 *検出限界以下

[図 8]天然型 Cryj l又は recCryj lZ2タンパク質で免疫したマウス血清中の recCryj 1Z2特異的 IgE抗体価を示す図である。

[図 9]天然型 Cryj l又は recCryj lZ2タンパク質で免疫したマウス血清中の天然型 C ryj 1特異的 IgG抗体価を示す図である。

[図 10]recCryj lZ2タンパク質による、天然型 Cryj l免疫マウス血清中の天然型 Cry j 1特異的 IgE抗体価の上昇の抑制を示す図である。

[図 l l] _a GC—組換え Cryj lZ2融合蛋白質—リボソーム、 a GC—リボソーム又は生理食塩水が投与された、天然型 Cryj l感作マウスにおける血中抗 Cryj l IgE濃度を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0008] 一つの実施形態において、本発明は、 CDldリガンド及び標的抗原を含む、内腔を有する薬物送達媒体 (以下、必要に応じて、薬物送達媒体、内腔を有する薬物送達媒体、 CDldリガンドを含む薬物送達媒体、あるいは標的抗原を含む薬物送達媒体などと省略する）を含有してなる、免疫疾患の予防又は治療剤を提供する。

[0009] 本発明で用いられ得る薬物送達媒体としては、動物への薬物送達を可能とし、つ内腔を有するものである限り特に限定されないが、例えば、リボソーム、マイクロスフェアが挙げられる。

[0010] リボソームとは、ミセル (親水性領域と疎水性領域を含む両親媒性分子の凝集によつて得られる水溶性粒子)が閉鎖した小胞構造をいう。本発明の医薬が薬物送達媒体としてリボソームを含む場合、 CDldリガンドがリボソーム膜内に包埋され得、かつアレルゲンがリボソーム内腔に封入され得る。薬物送達媒体としてリボソームが用いられる場合、力かるリボソームは、国際公開 WO2005Z120574号公報に記載の方法により作製できる。詳細には、 a—GalCerなどの CDldリガンドを含むリボソームは、 PCT/JP2005/10254に記載されるような常法に従、、リボソームを構成する脂質と CD Idリガンドを含む有機溶媒溶液を混合後に乾燥し、ここに水を加えて超音波処理することにより得ることができる。また、標的抗原を封入したリボソームは、リボソームを構成する脂質と CDldリガンドを含む有機溶媒溶液を混合後に乾燥し、ここに標的抗原の水溶液をカ卩えて超音波処理することにより得ることができる。

[0011] マイクロスフェアとは、基剤として生体内で分解されるポリマーを使用した微小球状の物質をいう。マイクロスフェアとしては、例えば、多孔型マイクロスフェア、カプセル型マイクロスフェアが挙げられる。

[0012] CDldリガンドとは、 CDld発現抗原提示細胞 (APC)上に提示され、以つて NKT 細胞を活性ィ匕し得る物質をいう。 CDldリガンドとしては、例えば、 a—GalCer及びその類縁体、並びに生体内に存在する IGb3 (Isoglobo-glycosphingolipid)が挙げられるが、 α— GalCerがより好ましい。

[0013] 標的抗原は、生体において該抗原に対する免疫応答の抑制が所望されるものである限り特に限定されない。標的抗原は天然体、組換えタンパク質、化学合成物であつてもよく、例えば、アレルゲン、自己抗原、移植片ァロ抗原が挙げられる。以下、本発明の医薬を、アレルギー性疾患、及び自己免疫疾患等に適用する場合の詳細について説明する。

[0014] (アレルギー性疾患への適用）

アレルゲンは、生体が曝されるか、生体が摂取するか、または生体に適用される、アレルギーの原因となり得る因子である限り特に限定されない。このようなアレルゲンとしては、例えば、花粉 (例、スギ、ヒノキ、ブタクサ、イネ、シラカンバ、カモガヤ、ョモギ）、食品（例、牛乳、そば、卵、ピーナッツ、小麦、大豆、魚介類、果物またはそれらの加工品）、ヒト以外の生物またはその由来物（例、ダニ、カビ、動物'鳥類の体毛、ハチ毒）、薬物 (例、ペニシリン系抗生物質、サルファ剤、バルビツール酸誘導体)、医療用品 (例、天然ゴム手袋)、生活用品 (例、装飾用具の金属）、その他の物質または組成物（例、ラテックス)などに含まれる、アレルギーの原因となり得る因子が挙げられる。

[0015] 本発明の医薬は、標的抗原としてアレルゲンを含む薬物送達媒体を含む場合、該アレルゲンに起因するアレルギー疾患の特異的治療剤として有用である。本発明者らは、 CDldリガンド及びアレルゲンを含む薬物送達媒体が該アレルゲンに起因する IgE産生を特異的に抑制することから、該アレルゲンに起因するアレルギー疾患が、このような薬物送達媒体により特異的に治療され得ることを見出した。本発明の医薬により特異的に治療され得るアレルギー疾患としては、例えば、アトピー型気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎 (例、花粉症）、アレルギー性結膜炎、食物アレルギー、薬物アレルギーが挙げられる。

[0016] アレルゲンとして好ま、例は、スギ花粉抗原 (例、 Cryj 1、 Cryj2等のタンパク質）であり得る。アレルゲンとしてはまたスギ花粉抗原の組換え融合タンパク質もまた好ましい。このような融合タンパク質としては、例えば、 Cryj 1タンパク質及び Cryj 2タンパク質の融合タンパク質 (以下、必要に応じて「融合タンパク質」と省略する）が挙げられる。

[0017] Cryj 1成熟タンパク質は、 Cryj 1遺伝子より発現したポリペプチドのうち、 N末端側に存在するシグナル領域が少なくとも部分的に除去されたポリペプチドである。例えば、 GenBankァクセッション番号： BAA07020を参照すると、 Cryj 1タンパク質として、 374個のアミノ酸残基力もなるポリペプチドが登録されている力 Cryj 1成熟タンパク質は、 BAA07020に登録された 374個のアミノ酸残基からなるポリペプチドのうち、 22〜374番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドに対応する。 BAA07020に登録された 374個のアミノ酸残基からなるポリペプチドのうち、 1〜21番目のアミノ酸残基力なる領域はシグナル領域である。

[0018] Cryj 1成熟タンパク質は、天然 Cryj 1成熟タンパク質、あるいは天然 Cryj 1成熟タンパク質における 1個以上 (例えば 1〜： LO個、好ましくは 1〜7個、より好ましくは 1〜5個、最も好ましくは 1、 2又は 3個）のアミノ酸が改変（例、置換、付加、挿入、欠失)され、又は天然 Cryjl成熟タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約 95%、好ましくは約 97 %、より好ましくは約 98%、最も好ましくは約 99%のアミノ酸配列同一性（％)を示すアミノ酸配列を有し、かつ Cryj l成熟タンパク質中のェピトープを保持する変異タンパク質であり得る。天然 Cryjl成熟タンパク質としては、 GenBankァクセッション番号： BAA07020に登録された 374個のアミノ酸残基からなるポリペプチドのうち、 22〜 374番目のアミノ酸残基を有するポリペプチド、及び天然に存在するそのァイソタイプ（例えば、 GenBankァクセッション番号 D34639、 D26544, D26545, AB0813 09、 AB081310参照）が挙げられる。変異タンパク質は、 Cryj l成熟タンパク質における 1又は 2以上、好ましくは全てのェピトープ (例、 T細胞又は B細胞ェピトープ)を保持するように改変されたタンパク質であり得る。

[0019] Cryj 2成熟タンパク質は、 Cryj2遺伝子より発現したポリペプチドのうち、 N末端側に存在するシグナル領域、並びに成熟タンパク質のコーディング部分の N末端及び C末端側にそれぞれ存在する 2つのプロ領域が除去されたポリペプチドである。例えば、 GenBankァクセッション番号： P43212を参照すると、 Cryj2タンパク質として、 5 14個のアミノ酸残基力なるポリペプチドが登録されている力 Cryj2成熟タンパク質は、 P43212に登録された 514個のアミノ酸残基からなるポリペプチドのうち、 46〜4 33番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドに対応する。 P43212〖こ登録された 514 個のアミノ酸残基力なるポリペプチドのうち、 1〜22番目のアミノ酸残基からなる領域はシグナル領域であり、 23〜45番目のアミノ酸残基からなる領域及び 434〜514 番目のアミノ酸残基からなる領域はそれぞれプロ領域である。

[0020] Cryj2成熟タンパク質は、天然 Cryj2成熟タンパク質、あるいは天然 Cryj2成熟タンパク質における 1個以上 (例えば 1〜： LO個、好ましくは 1〜7個、より好ましくは 1〜5個、最も好ましくは 1、 2又は 3個）のアミノ酸が改変（例、置換、付加、挿入、欠失)され、又は天然 Cryj2成熟タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約 95%、好ましくは約 97 %、より好ましくは約 98%、最も好ましくは約 99%のアミノ酸配列同一性（％)を示すアミノ酸配列を有し、かつ Cryj 2成熟タンパク質中のェピトープを保持する変異タンパク質であり得る。天然 Cryj2成熟タンパク質としては、 GenBankァクセッション番号： P43212に登録された 514個のアミノ酸残基力らなるポリペプチドのうち、 46〜433 番目のアミノ酸残基力なるポリペプチド、及び天然に存在するそのアイソタイプ (例えば、 GenBankァクセッション番号 D37765、 D29772, E10716、 AB081403、 AB081404、 AB081405参照）が挙げられる。変異タンパク質は、 Cryj2成熟タンノク質における 1又は 2以上、好ましくは全てのェピトープ (例、 T細胞又は B細胞ェピトープ)を保持するように改変されたタンパク質であり得る。

[0021] アミノ酸配列同一性（％)は、当該分野で慣用のプログラム (例えば、 BLAST, FA STA等)を初期設定で用いて決定することができる。同一性(％)はまた、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、 Needlemanら（1970) (J. Mol. Biol. 48 :4 44— 453)、 Myers及び Miller (CABIOS, 1988, 4 : 11— 17)のアルゴリズム等を使用して決定することができる。 Needlemanらのアルゴリズムは、 GCGソフトウェアパッケージ (www. gcg. comで入手可能）の GAPプログラムに組み込まれており、同一性（％)は、例えば、 BLOSUM 62 matrix又は PAM250 matrix、並びに ga p weight: 16、 14、 12、 10、 8、 6若しくは 4、及び length weight: 1、 2、 3、 4、 5 若しくは 6のいずれかを使用することによって決定することができる。また、 Myers及び Millerのアルゴリズムは、 GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である ALIGNプログラムに組み込まれて、る。アミノ酸配列を比較するために ALIGN プログラムを利用する場合、例えば、 PAM120 weight residue table、 gap len gth penalty 12、 gap penalty 4を用いることができる。アミノ酸配列同一性は、上記の任意の方法で決定されたものであれば構わず、例えば計算に際して、上記の方法のなかで最も低!、値を示す方法が採用され得る。

[0022] 融合タンパク質は、 Cryjl成熟タンパク質が N末端側に、 Cryj2成熟タンパク質が C 末端側に存在するものであっても、あるいは Cryj l成熟タンパク質が C末端側に、 Cr yj2成熟タンパク質が N末端側に存在するものであってもよい。融合タンパク質はさらに、 Cryj l成熟タンパク質と Cryj2成熟タンパク質との間にペプチドリンカ一を含んでいなくともよぐ又は含んでいてもよい。当業者は、当該技術分野における技術常識より、力かるペプチドリンカ一を適宜設計できる。例えば、ペプチドリンカ一は、約 30 以下、好ましくは約 25以下、より好ましくは約 20以下、さらにより好ましくは約 15以下、最も好ましくは約 10又は 5以下のアミノ酸残基の長さであり得る。

[0023] 融合タンパク質はまた、 N末端又は C末端の、ずれか、あるいは双方にさらなるぺプチド部分が付加されたものであってもよい。このようなペプチド部分は、融合タンパク質に付加された場合に、融合タンパク質の特性を保持し得るものである限り特に限定されない。例えば、このようなペプチド部分としては、精製用タグ (例、ヒスチジン (H is)タグ、 FLAGタグ、 Mycタグ）が挙げられる。また、このようなペプチド部分は、例えば約 30以下、好ましくは約 25以下、より好ましくは約 20以下のアミノ酸残基の長さであり得る。

[0024] 融合タンパク質は可溶性タンパク質であり得る。融合タンパク質が可溶性画分中に得られる可溶性タンパク質である場合、例えば、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製法により高純度に精製可能である、タンパク質の修飾が容易であるなどのメリットがある。融合タンパク質はまた、不溶性画分中に得られた場合であっても、可溶ィ匕処理により可溶ィ匕タンパク質として得ることができ、従って上記メリットもまた有する。

[0025] アナフィラキシー反応は、肥満細胞表面に結合している IgE抗体へのアレルゲンの結合により生じるシグナルの細胞内への導入により引き起こされる。融合タンパク質は、スギ花粉抗原 (例、天然型 Cryj l)に特異的な IgE抗体の産生を誘導し得ないば力りか、スギ花粉抗原によるスギ花粉抗原特異的 IgE抗体の産生をも抑制し得る。一方で、融合タンパク質は、 Cryjl成熟タンパク質及び Cryj 2成熟タンパク質における 1 以上 (好ましくは全て）の T細胞ェピトープを保持し得る。従って、融合タンパク質は、天然型 Cryj 1または Cryj 2特異的 IgE抗体に結合し得なヽことから、ァナフイラキシ一反応を生じ得な、安全なアレルゲンであり得る、スギ花粉に起因するァナフイラキシー反応の程度を抑制し得る、スギ花粉抗原に特異的な免疫 (例、細胞性免疫、 Ig G等の液性免疫）を十分に誘導し得る、全てのスギ花粉症患者における T細胞ェピトープをカバーし得る等の利点を有する。

[0026] (自己免疫疾患等への適用）

自己抗原は、自己免疫疾患において免疫細胞の標的となり得る抗原である限り特に限定されない。自己抗原としては、例えば、コラーゲン、核酸 (関節性リウマチ、全身性エリテマトーデス）、ミエリン塩基性蛋白質 (MBP) (多発性硬化症）、サイログロブリン（甲状腺自己免疫疾患)、移植片ァロ抗原 (移植片対宿主病)が挙げられる。

[0027] 本発明の医薬は、標的抗原として自己抗原を含む薬物送達媒体を含む場合、自己免疫疾患の治療剤として有用である。本発明者らは、 CDldリガンド及びアレルゲンを含む薬物送達媒体が該アレルゲンに起因するアレルギー疾患を特異的に治療し得ることを見出したことから、アレルゲンの代わりに自己抗原を含む薬物送達媒体を利用することで、該自己抗原に起因する自己免疫疾患についても同様に特異的に治療し得ることを着想した。このような自己免疫疾患としては、例えば、上述したものが挙げられる。

[0028] 本発明の薬物送達媒体が投与される個体は、任意の動物種であり得る。このような動物種としては、例えば、霊長類、齧歯動物等の哺乳動物、鳥類が挙げられる。より詳細には、本発明が適用され得る動物としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、ィヌ、ネコ、ゥマ、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ャギ、マウス、ラット、モノレモット、ハムスター、ゥサギ、 -ヮトリが挙げられる。臨床応用という観点からはヒト、及び Z又はィヌ、ネコが好ましい。

[0029] 本発明の医薬は、薬物送達媒体に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウムグリコール—スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クェン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エア口ジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クェン酸、メントール、グリシルリシン'アンモ-ゥム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クェン酸、クェン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビュルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられる力それらに限定されるものではない。

[0030] 経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。

[0031] 非経口的な投与 (例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸ィ匕剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよ!、状態で保存することもできる。

[0032] 本発明の剤の薬学的有効量は、有効成分の活性や種類、投与様式 (例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人 1日あたり有効成分量として体重 lkgあたり約 0. lmg〜約 lOOmgである。

[0033] 本発明の剤は、免疫疾患を有する被験体 (特にヒト患者)に 1日或いは数日間連続投与してもよぐ 1日ないし数日間の間隔をあけて投与してもよい。例えば免疫疾患が花粉症の場合には、対象となる花粉 (例えばスギ、ブタクサなど)の飛散時期の前、または花粉の飛散時期に花粉症の被験体に投与され得る。また、他のアレルギー疾患の場合には、被験体が当該アレルゲンに接触する前、或いは当該アレルゲンに接触後アレルギー症状が現れた時点で投与するのが望ましい。

[0034] 以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する力これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

実施例

[0035] 製造例 1 : α _ガラクトシルセラミドと天然卑』 Cry il蛋白質を含有するリボソームの製造

L- a -Phosphatidylglycerol, dipalmitoyl (DPPG ;和光純薬） 1.12 mgと 1 ,2— Distearoy ト sn- Glycero- 3- Phosphoethanolamine- N-|_Methoxy(Poiyethyleneglycol)-2000](Amm onium Salt) (PEG— PE ; Avanti Polar Lipids) 0.029 mgをクロロホノレム/メタノーノレ（1 : 1) 溶媒 250 1に溶解した。また、 α -ガラクトシルセラミド (独立行政法人理ィ匕学研究所免疫 ·アレルギー科学総合研究センターにて作製) 0.16 mgは別にクロ口ホルム/メタノール（1 : 1)溶媒 250 1に溶解した。次に、両者を混合しエバポレーターで乾固させた後、真空下のデシケーター内で一晩乾燥させた。次に天然スギ花粉力精製された Cry jl蛋白質 (生化学工業)濃度が 0.4mg/mlである水溶液を 200 μ 1添加し、超音波破砕装置にて 10分間処理した後、ポアサイズ 0.22 mの滅菌用メンブランを通過させた。次に、ポアサイズ 100 nmのポリカーボネート膜を装着した LiposoFast- Basic extrude r (Avestin Inc,)を、 25回通過させることにより整粒した。 Amicon Ultra-4遠心フィルタ一 (PL-100) (Millipore)を用いて Cry jlを封入したリボソームの濃縮と精製水での洗浄によりリボソーム未封入 Cry jlタンパク質の除去を行ない、最終的に精製水で 800 μ 1水溶液に調整した。この天然型 Cry jl封入リボソーム（ a GC-天然型 Cry jlリポソーム）を含む水溶液を SDS電気泳動で解析した結果、 Cry jlタンパク質濃度は 50 g /mlであることが確認された。また a -G Cerが全てリボソーム膜に取り込まれたと想定し、 Lipo- a GC + Cry jl溶液中の oc - G Cer最終濃度を 200 μ g/mlとした。

[0036] 実施例 1： α -ガラクトシルセラミド含有リボソームによる Β ί^細朐カの IL-10産牛.誘

BDF1マウスに aqueous a -GalCerまたは oc GC -リボソーム（国際公開 WO2005/120 574号公報）を 2 /z g a -G Cer/マウスで腹腔内に投与し、 24時間後に脾臓を摘出した。スライドガラスで脾臓をすり潰し、細胞を調製した後、抗 CDl lc抗体磁性マイクロビーズ（Miltenyi)を添加し、マグネットを用いて CDl lc+細胞（DC)を調製した。マグネットに結合しなかった残りの細胞から抗 B220 mAb磁性マイクロビーズ（Miltenyi)で B220+細胞（B細胞）を調製した。 96ゥエル U底培養プレートの 1ゥエル内に、 200 1の培養液に懸濁した 2.5 X 10⁵個の正常 BDF1マウスの全脾臓細胞と aqueous a -GalCer または a GC-リボソーム投与 BDF1マウス脾臓細胞由来の 1 x 10⁵個の DCまたは 3 x 10⁵個の B細胞を加え、 37°Cの 5% C0含有インキュベータ内で培養した。 24、 48、 72時

2

間後の培養上清中のサイト力イン IFN- γ、 IL-4、 IL- 10を ELISAで測定した（図 1)。その結果、 a GC-リボソーム投与 BDF1マウス脾臓由来の CDl lc+細胞の添加群は、 aqueous a - G Cer投与 BDF1マウス脾臓由来の CDl lc+細胞の添加群に比べて IFN- γ産生量が高かったが、 IL-4と IL-10産生量は同等であった。 a GC-リボソーム投与 BDF1マウス脾臓由来の B220+細胞を全脾臓細胞に添加すると、 IL-10は産生される力 IL- 4と IFN- γは産生されなかった。 aqueous α - G Cer投与 BDF1マウス脾臓由来の B220+細胞を全脾臓細胞に添カ卩した場合には、 IL-4、 IL-10, IFN- γ産生は検出されなかった。

[0037] 実施例 2： a -ガラクトシルセラミド含有リボソームによる辺縁帯 B細胞からの IL-10産牛.

醒

BDF1マウスに a GC -リボソームを α - G Cer/マウスで腹腔内に投与し、 24時間後に脾臓を摘出した。脾臓中に 1 mg/mlのコラゲナーゼ D (Roche)を注入し、 CO インキュベータ内で 45分間インキュベートした。次に、脾臓力細胞を抽出し 3 mlの Hi stoDenz (14.1%, Sigma- aldrich)に懸濁した後、 50 Mの 2-メルカプトエタノール（2Μ Ε)含有 X- VIVO 15培地（CAMBREX Bio Science Walkerville, Inc.)を重層した。 150 0 rpmで 5分間遠心後、中間層の低密度（LD)細胞と沈殿の高密度（HD)細胞を回収した。 50 M 2ME, 10 % FCSを含有する X-VIVO 15培地で細胞を洗浄後、 0.5% FCS含有リン酸緩衝液 (PBS)に懸濁した。 LD細胞に抗 CDllc mAb磁性マイクロビーズ（Miltenyi)を添加し、マグネットを用いて CDllc+榭状細胞を調製した後、残りの細胞から抗 B220 mAb磁性マイクロビーズ（Miltenyi)で LD-B細胞を調製した。また、 HD 細胞から抗 B220 mAb磁性マイクロビーズ（Miltenyi)で HD- B細胞を調製した。 LD- B 細胞と HD-B細胞をそれぞれ FITC標識抗 IgM抗体と PE標識抗 CD21抗体で染色後、フローサイトメーターで解析した（図 2A)。 96ゥエル U底培養プレートの 1ゥエル内に、 200 μ 1の培養液に懸濁した 2.5 X 10⁵個の正常 BDF1マウスの全脾臓細胞と 1 x 10⁵個の LD- Β細胞または HD- Β細胞を入れ、 37°Cの 5% CO含有インキュベータ内で培養し

2

た。

その結果、 LD-B細胞を全脾臓細胞に添加した群のみ、培養上清中に IL-10産生が検出された（図 2B)。 LD-B細胞は辺縁帯 B細胞であることから、 a GC-リボソームの生体内投与 (インビボ）により得られる辺縁帯 B細胞が、全脾臓細胞との相互作用により、 IL-10産生を誘導することが示された。

¾ 列 3 : , -ガラクトシルセラミド含有リボソームパルス縁帶 B細胞による - 10産牛.纏

BDF1マウスから摘出した脾臓中に 1 mg/mlのコラゲナーゼ D (Roche)を注入し、 C 0インキュベータ内で 45分間インキュベートした。次に、脾臓力細胞を抽出し 3 ml

2

の HistoDenz (14.1%, Sigma- aldrich)に懸濁した後、 50 Mの 2-メルカプトエタノール (2ΜΕ)含有 X- VIVO 15培地 (CAMBREX Bio Science Walkerville, Inc.)を重層した。

1500 rpmで 5分間遠心後、中間層の低密度（LD)細胞を回収した。 2ME, 10% FCSを含有する X-VIVO 15培地で細胞を洗浄後、 0.5% FCS含有リン酸緩衝液 (PB

S)に懸濁した。 LD細胞に抗 CDllc mAb磁性マイクロビーズ（Miltenyi)を添加し、マグネットを用いて CDllc+榭状細胞を調製した後、残りの細胞力抗 B220 mAb磁性マイク口ビーズ (Miltenyi)で LD- B細胞を調製した。 3 x 10⁶個の LD- B細胞を 3 mlの培養液の入った 6穴（ゥエル）培養プレートに添カ卩し、さらに a GC-リボソームを培養液に最終濃度 100 ng/mlで添加したゥエルと添加しないゥエルを用意した。 18時間、 37°C の 5% CO含有インキュベータ内で培養した後、それぞれのゥェルカも細胞を回収した

2

。 BDF1マウスから摘出した全脾臓細胞に抗 B220 mAb磁性マイクロビーズ（Miltenyi) を添加し、マグネットを用いて B220+細胞を除去した全脾臓細胞（-B220陽性細胞）を調製した。 96ゥエル U底培養プレートの 1ゥエル内に、 200 1の培養液に懸濁した 2.5 X 10⁵個の正常 BDF1マウスの全脾臓細胞（-B220陽性細胞）と 1 x 10⁵個の LD-B細胞を入れ、 37°Cの 5% CO含有インキュベータ内で 2日または 3日間培養した。

2

その結果、 a GC-リボソームを添カ卩して培養した LD-B細胞を全脾臓細胞（-B220陽性細胞）に添加した群のみ、培養上清中に IL-10産生が検出された（図 3)。 LD-B細胞は辺縁帯 B細胞であることから、 a GC-リボソームでパルスされた辺縁帯 B細胞 (ィンビボ）力全脾臓細胞との相互作用により、 IL-10産生を誘導することが示された。

[0039] M4: , -ガラクトシルセラミド天然型 Crv il 白皙含有するリボソームこよる in vivo二次的 1 杭体 i¾牛の ¾制作用

天然型 Cry jl (5 g/マウス，生化学工業）と水酸ィ匕アルミ-ユウムゲル (2 mg/マウス）で 2回感作した BDF1マウスに、 a GC—天然型 Cry jl—リボソーム（a GC:

Cryjl : 0.5 g/マウス)、 α GC—リボソーム（a GC: 2 g/マウス)又はリボソーム単体を感作から 28日、 35日、 42日目の 3回静脈内に投与し、 49日目に天然型 Cry jl (1 g /マウス）で追加免疫した。追加免疫前後に採血し、血清中の抗 Cry jl-IgE抗体を EL ISAで測定した。その結果、 a GC—天然型 Cryjl—リボソームを投与した群では、追加免疫後の二次的 IgE抗体産生が有意に抑制されていた（図 4)。

[0040] 実施例 5 : Crv il/2融合遺伝子の合成

Cry jl/2融合遺伝子は、 Cry jl遺伝子（GenBankァクセッション番号： BAA07020)の N末端シグナル領域を含まなヽ 63位 (Ser)から 1122位 (Cys)までのヌクレオチド (成熟 Cryjl)と Cry j2遺伝子（GenBankァクセッション番号： P43212)の N末端シグナル及びプロ領域を含まない 138位 (Arg)から 1299位 (Ser)までのヌクレオチド（成熟 Cry j2)を以下の方法で結合することにより作製した。成熟 Cry j2遺伝子領域には、 Xbal切断配列が 868-874位 (Ser-Arg)のヌクレオチド配列（TCTAGA)として存在し、種々ベクタ一との組換え操作に不都合であるため、 TCTAGA→TCAAGAのコドン置換により Xba I切断配列を喪失させることとした。まず、 Cryj2遺伝子全長が挿入されたプラスミド DN A ( (独)森林総合研究所)をテンプレートにし、プライマー 1、 2又はプライマー 3、 4による PCRを DNA合成の正確度が高い DNAポリメラーゼ（例、宝酒造の PrimeStar、東洋紡の KOD)存在下で 20サイクル行った。その結果、成熟 Cryj2の N末端領域断片と C 末端領域断片をそれぞれ増幅することができた。次に、これら 2つの DNA断片を混合し、プライマー 1、 4を用いた PCRを 20サイクル行うことにより、成熟 Cry j2遺伝子全長を増幅させた。この DNA断片をベクター pMAT324の Xbal-EcoRI部位にサブクロー- ングした後、 DNAシークェンシングを行い、成熟 Cryj2遺伝子の Xbal切断配列の喪失とその他全配列に PCRによる変異が生じて、な、ことを確認した (pMAT324-Cry )2 A XbaI)。 Cryjl/j2融合遺伝子を作製するため、 pMAT324-Cry j2 Δ Xbalをテンプレートにプライマー 4、 5を用いた PCRを行い、成熟 Cry j2遺伝子断片を増幅した。次に Cryjl遺伝子全長が挿入されたプラスミド DNA ( (独)森林総合研究所)をテンプレートにプライマー 6、 7を用いた PCRを行い、成熟 Cry jl遺伝子断片を増幅した。最後に、成熟 Cry jl遺伝子領域 DNA断片と成熟 Cryj2遺伝子領域 DNA断片を混合し、プライマー 4、 6を用いた PCRを 20サイクル行うことにより、 Cry jl/2融合遺伝子 DNA断片を増幅した。 Cry jl/2融合遺伝子を EcoRI消化後、 Smalと EcoRIで切断された pET47b ( Novagen)ベクターとライゲーシヨンを行、、大腸菌 DH10B株に形質転換した（pET47 b-Cryjl/2)。 DNAシークェンシングにより Cry jl/2融合遺伝子の全配列と、ヒスチジン (His)タグ配列が Cryjl/2遺伝子の 5，末端に付加されてヽることを確認した (図 5、 6) 以下、必要に応じて、本実施例で作製された構築物を recCryjl/2と省略する。

プライマー 1 (センス）： CCGGTCTAGAAAAGTTGAGCATTC (配列番号 1) プライマー 2 (アンチセンス）： CCTCTGCTCTTGAGTTTTCCC (配列番号 2) プライマー 3 (センス）： GGGAAAACTCAAGAGCAGAGG (配列番号 3)

プライマー 4 (アンチセンス）： CCGGAATTCCTATCAACTTGGACTTAAATTC (配列番号 4) プライマー 5 (センス）： AGAAAAGTTGAGCATTC (配列番号 5)

プライマー 6 (センス）： TCTGATAATCCCATAGAC (配列番号 6)

プライマー 7 (アンチセンス）： GAATGCTCAACTTTTCTACAACGTTTAGAGAGAG AGC (配列番号 7)

[0042] 実施例 6 :recCrvil/2タンパク質の発現確認

pET47b- Cryjl/2プラスミド DNAを、大腸菌 BL21株 (インビトロジェン）に形質転換した。カナマイシン (最終濃度 20 g/ml)を添加した LB培地 100 mlに形質転換株を植菌した。 37°Cで一昼夜培養した後、 100 mlの菌体培養液全てを 1 Lのカナマイシン含有 LB培地に移し、さらに 37°Cで 2時間培養した。次に、 IPTGを最終濃度 0.1 mMになるように添加した後、 30°Cで 3時間培養した。菌体を回収し、超音波破砕した後、高速遠心機で沈殿を分離した。沈殿を水に懸濁後、遠心後の上清とともに SDSポリアタリルアミド電気泳動と HRP標識抗 Cryj2モノクローナル抗体 (林原研究所)を用いたゥェスタンプロッテイングで解析した。その結果、菌体破砕後の沈殿画分で、クマシ一プリリアントブルー (CBB)タンパク染色で陽性でかつ、抗 Cryj2モノクローナル抗体陽性の分子量約 70 kDaのタンパク質が recCryjl/2タンパク質であることが予想された。次に、ウェスタンブロッテイングで PVDF膜にトランスファーした上記 75 kDa付近のバンドを CBB染色後に切り出し、エンドプロテアーゼ Asp- N (タカラノィォ)酵素消化後、質量分析を行った結果、 Cry jlと Cry j2内のペプチド配列を多数検出できた。

以上の結果から、菌体破砕沈殿にある約 75 kDaのタンパク質は recCryjl/2タンパク質であることが確認された。

[0043] 実施例 7 :recCrvil/2タンパク質の可溶化と精製

pET47b- Cryjl/2発現菌体 1 g (湿重量）を Bugbuster (Novagen) 5 mlと Benzonase (N ovagen) 1 μ 1で溶解後、 16000 g、 20分間遠心し不溶性画分を回収した。次に Bugbust er (Novagen) 5 mlを添カ卩し、ボルテックスで十分に攪拌した後、 Lysonase (Novagen) 2 1を添加し、さらにボルテックスで攪拌した。室温に 5分間静置後、 10倍希釈した Bug buster (Novagen)溶液 30 mlを添カ卩し、 16000 g、 15分間遠心し不溶性画分を回収した。次に 35 mlの 10 mMイミダゾール /8 M尿素/リン酸緩衝液（PBS)に懸濁後、磁気スタ一ラーにて攪拌し、不溶性タンパク質を溶解した。高速遠心機で 18000 rpm、 15分間遠心した後、上清を回収した。次に、 0.1 M NiSOを充填し、 50 mMイミダゾール /8 M

4

尿素/ PBSで平衡化した Chelating Sepharose FF (GLヘルスケアバイオサイエンス）力ラムに、遠心上清を高速液体クロマトグラフィーでアプライした。 50 mMイミダゾール /8 M尿素/ PBSで洗浄後、 500 mMイミダゾール /8 M尿素/ PBSで recCryjl/2融合タンパク質を溶出した。溶出液にアルギニンを最終濃度 0.4 Mになるように添加後、透析チユーブに入れ、 0.4 Mアルギニン/ PBS溶液内で 24時間透析することによって、可溶ィ匕 recCryjl/2タンパク質を回収した。 SDSポリアクリルアミド電気泳動と抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体（GEヘルスバイオサイエンス）、又は HRP標識抗 Cryj2モノクロ一ナル抗体 (林原研究所)を用いたウェスタンブロッテイングで recCryjl/2タンパク質であることを確認した。

¾施例 8 _{: re}cCrvi1 /2タンパク皙免疫による in vivo杭体 i¾牛能

BALB/c X DBA2 Fl (BDF1)マウス 1群 5匹（雌、 8週齢、チャールズリバ一）に、水酸化アルミ-ユウムゲル ·アジュバント (理ィ匕学研究所) 2 mgに混合したスギ花粉由来精製 Cryjl (天然型 Cryjl；林原研究所） 10 μ gあるいは recCryjl/2タンパク質 5又は 10 μ gを実験開始時 (0日目）と 14日目に腹腔内免疫し、 41日目にそれぞれのマウスに天然型 Cryjlを 1 μ gあるいは recCryjl/2タンパク質を 5又は 10 g追加免疫した。さらに、 81日目には、全てのマウスに水酸ィ匕アルミ-ユウムゲル 2 mgに混合した天然型 Cryjl 1 μ gを追加免疫した。眼窩採血を 13、 28、 55、 76、 95日目に実施し、血清中の天然型 Cryjl特異的抗体価と recCryjl/2特異的 IgE抗体価を測定した。その結果、 28、 55 、 76日目の天然型 Cryjl特異的 IgE抗体価は、天然型 Cryjl免疫マウスでは上昇した力 recCryjl/2タンパク質を免疫したマウスでは全く上昇せず、さらに 81日目の水酸化アルミ-ユウムゲル.アジュバントと天然型 Cryjlの免疫に対しても、天然型 Cryjl特異的 IgE抗体の上昇は 94日目でほとんど認められな力つた（図 7)。し力しながら、 76 日目の recCryjl/2特異的 IgE抗体価は、 recCryjl/2融合タンパク質を免疫したマウスで上昇していた (図 8)。一方、 28、 55日目の天然型 Cryjl特異的 IgGlや IgG2a抗体価の上昇は、天然型 Cryjl免疫マウスと recCryjl/2免疫マウスの両方で認められた（図 9

) o

以上の結果から、 recCryjl/2タンパク質は、天然型 Cryjl特異的 IgE抗体の産生を誘導しなヽ、安全な減感作抗原になり得ることが示唆された。

[0045] 実施例 9 : recCrvil/2タンパク質の in vivo IgE抗体産牛.抑制能

BDF1マウス（雌、 8週齢、チャールズリバ一）に、水酸化アルミ-ユウムゲル.アジュバント (理化学研究所) 2 mgに混合したスギ花粉由来精製 Cryjl (天然型 Cryjl；林原研究所 ) 5 gを実験開始時 (0日目）と 14日目に腹腔内免疫した後、 50日目に天然型 Cryjlを 1 μ g追加免疫した。この間、眼窩採血を 14、 29、 57日目に実施し、血清中天然型 Cryjl特異的 IgE抗体を測定した。その後 99日目に全マウスの天然型 Cryjl特異的 IgE抗体を測定し、抗体価の平均値が等しくなるようにマウスを 3群 (5匹 1群）に分けた。 106、 113、 120日目には各群のマウスの腹腔内に、 recCryjl/2タンパク質（0.2 /z g )、 recCryjl/2タンパク質 g)又は生理食塩水を 3回投与し、さらに 133日目に天然型 Cryjlを 1 μ g追加免疫した。眼窩採血を 140、 160日目に実施し、天然型 Cryjl特異的 IgE抗体価を測定した。その結果、 recCryjl/2投与群では、投与後の天然型 Cryjl 特異的 IgE抗体価（127日目）は生理食塩水投与群よりも上昇したが、その後の天然型 Cryjlの追加免疫（133日目）後の天然型 Cryjl特異的 IgE抗体価（160日目）は、生理食塩水投与群で上昇したが recCryjl/2投与群では逆に低下した（図 10)。

以上の結果から、 recCryjl/2タンパク質は、天然型 Cryjl特異的 IgE抗体価の上昇を抑制できる減感作抗原として利用できることが示唆された。

[0046] 観告例 2 : , -ガラクトシルセラミ i _recCrv il /2(釦.¾ ^融合白皙) 含有するリポソームの觀告

L— -Phosphatidylcholine.dioleoyl (DOPC；和光純薬） 0.77 mgと Cholesteryl 3 β - N-(dimethylaminoethyl)carbonate hydrochloride (DC—し hol ; ¾igama— aldrich)0.83 mgと 1 ,2- L istearoyl- sn- Glycero- 3- Phosphoethanolamine- N- [Methoxy(Polyethylene glyc ol)-2000](Ammonium Salt) (PEG— PE ; Avanti Polar Lipids) 0.029 mgをクロ口ホルム/ メタノール（1 : 1)溶媒 250 /z lに溶解した。また、 α -ガラクトシルセラミド (独立行政法人理化学研究所免疫 ·アレルギー科学総合研究センターにて作製) 0.16 mgは別にクロ口ホルム/メタノール（1 : 1)溶媒 250 1に溶解した。次に、両者を混合しエバポレータ一で乾固させた後、真空下のデシケーター内でー晚乾燥させた。次に recCryjl/2タンパク質 (実施例 7)濃度が 0.4mg/mlである水溶液を 200 1添加し、超音波破砕装置にて 10分間処理した後、ポアサイズ 0.22 mの滅菌用メンブランを通過させた。次に、ポアサイズ 100 nmのポリカーボネート膜を装着した LiposoFast- Basic extruder (Ave stin Inc,)を、 25回通過させることにより整粒した。 Amicon Ultra-4遠心フィルター（PL -100) (Millipore)を用いて recCryjl/2を封入したリボソームの濃縮と精製水での洗浄によりリボソーム未封入 recCryjl/2タンパク質の除去を行ない、最終的に精製水で 80 0 μ 1水溶液に調整した。この recCryjl/2封入リボソーム（ α GC-recCryjl/2リボソーム )を含む水溶液を SDS電気泳動で解析した結果、 recCryjl/2タンパク質濃度は 25 μ g /mlであることが確認された。また a -G Cerが全てリボソーム膜に取り込まれたと想定し、 Lipo- a GC + Cry jl溶液中の oc - G Cer最終濃度を 200 μ g/mlとした。

[0047] miO: , -ガラクトシルセラミ recCrv Π /2( ¾ ^融合白皙) 含有するリポソーム¾ ^による _{in vivo}二.次！^ 杭 ^牛の ¾制ィ乍用

天然型 Cryjl (5 g/マウス，生化学工業）と水酸ィ匕アルミ-ユウムゲル (2 mg/マウス )で 2回感作した BDF1マウスに、天然型 Cryjl (1 g/マウス，生化学工業)を追加免疫した後、 a GC—recCry jl/2—リボソーム（ a GC: 2 μ g.recCry jl/2: 0.5 μ g/マウス ), a GC—リボソーム GC: 2 g/マウス)又はリボソーム単体を、感作から 105日、 11 2日、 119日目の 3回腹腔内に投与し、 126日目に天然型 Cryjl (1 μ g/マウス）で二回目の追カロ免疫を行った。感作前、感作後 14曰、 28曰、 56曰、 98曰、 126曰、 140曰、 160日目に採血し、血清中の抗 Cryjl- IgE抗体を ELISAで測定した。その結果、 a GC—リボソームまたは a GC— recCryjl/2—リボソームを投与した群では、リボソーム単体を投与した陰性対照に比べて投与後の血中 IgE抗体価の減少が顕著でかつ、二回目の追加免疫後の三次的 IgE抗体産生の上昇も抑制されていた（ひ GC—recCr yjl/2—リボソーム投与群の抑制効果は統計学的に有意）（図 11)。以上の結果より、ひ GC—リボソームにはアレルギー発症後の高 IgE抗体価を下げる治療効果が期待でき、さらにリボソーム内にアレルゲン性がない抗原を封入することによって、その効果をさらに増強できることが示唆された。

産業上の利用可能性

[0048] CDldリガンド及び標的抗原 (例、アレルゲン、自己抗原）を含む、内腔を有する薬物送達媒体を含有してなる、本発明の剤は、標的抗原に起因する疾患の特異的な治療に有用である。

本発明の剤はまたスギ花粉抗原の融合タンパク質を含み得る。本発明の剤に含まれ得る融合タンパク質は、アナフィラキシー反応を生じ得な、安全なアレルゲンとなり得る、スギ花粉に起因するアナフィラキシー反応の程度を抑制し得る、スギ花粉抗原に特異的な免疫を十分に誘導し得る、全てのスギ花粉症患者における τ細胞ェピトープをカバーし得るという優れた効果を奏する。従って、本発明の剤は、スギ花粉症の新規減感作療法において、並びに Zあるいは治療用ワクチン等の医薬として有用であり得る。

本出願は、 2006年 1月 13日に日本で提出された特願 2006— 005658を基礎としており、その内容は本参照により本明細書中に援用される。

Claims

請求の範囲

[I] CDldリガンド及び標的抗原を含む、内腔を有する薬物送達媒体を含有してなる、該標的抗原に起因する免疫疾患の予防又は治療剤。

[2] 標的抗原がアレルゲンであり、免疫疾患が該アレルゲンに起因するアレルギー疾患である請求項 1記載の剤。

[3] 薬物送達媒体がリボソームである、請求項 1記載の剤。

[4] CDldリガンドが a— GalCerである、請求項 1記載の剤。

[5] アレルゲン力スギ花粉抗原である、請求項 2記載の剤。

[6] アレルゲンが Cryj 1成熟タンパク質及び Cryj 2成熟タンパク質の融合タンパク質である、請求項 2記載の剤。

[7] 融合タンパク質において、 Cryj 1成熟タンパク質が Cryj 2成熟タンパク質よりも N末端側に存在する、請求項 5記載の剤。

[8] CDldリガンドがリボソーム膜内に包埋され、かつアレルゲンがリボソーム内腔に封入されている、請求項 2記載の剤。

[9] 標的抗原が自己抗原である、請求項 1記載の剤。

[10] スギ花粉抗原 Cryj 1タンパク質と Cryj 2タンパク質を含む融合タンパク質。

[I I] 前記 Cryj 1タンパク質が Cryj 1成熟タンパク質であり、 Cryj 2タンパク質が Cryj 2成熟タンパク質である請求項 10記載の融合タンパク質。

[12] Cryj 1タンパク質と Cryj 2タンパク質力直接又はペプチドリンカ一を介して連結されている、請求項 10記載の融合タンパク質。

[13] Cryj 1タンパク質が N末端側に、 Cryj 2成熟タンパク質力末端側に存在する、請求項 10記載の融合タンパク質。

[14] 請求項 1〜9のいずれかに記載の免疫疾患の予防又は治療剤の薬学的有効量をその治療を必要とする被験体に投与する工程を含む、免疫疾患の予防又は治療方法。

[15] 前記被験体がヒト免疫疾患患者である、請求項 14記載の免疫疾患の予防又は治療方法。