[go: up one dir, main page]

WO2006117910A1 - 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体 - Google Patents

抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体 Download PDF

Info

Publication number
WO2006117910A1
WO2006117910A1 PCT/JP2006/301818 JP2006301818W WO2006117910A1 WO 2006117910 A1 WO2006117910 A1 WO 2006117910A1 JP 2006301818 W JP2006301818 W JP 2006301818W WO 2006117910 A1 WO2006117910 A1 WO 2006117910A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
loop
seq
gpvi
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2006/301818
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Takayama
Kamon Shirakawa
Shoji Furusako
Yoshitaka Hosaka
Tomokazu Matsusue
Katsuki Naito
Yumi Hotta
Tetsushi Kawahara
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mochida Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority to US11/816,233 priority Critical patent/US20090041783A1/en
Priority to US11/912,757 priority patent/US7977461B2/en
Priority to EP11160861A priority patent/EP2363416A3/en
Priority to CN2006800230882A priority patent/CN101253264B/zh
Priority to CN2012102783100A priority patent/CN102875679A/zh
Priority to CA002606450A priority patent/CA2606450A1/en
Priority to EP06746241A priority patent/EP1876240B1/en
Priority to PCT/JP2006/309431 priority patent/WO2006118350A1/ja
Priority to JP2007514878A priority patent/JP4185555B2/ja
Publication of WO2006117910A1 publication Critical patent/WO2006117910A1/ja
Priority to JP2007078649A priority patent/JP5224707B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US13/095,098 priority patent/US8389692B2/en
Priority to US13/721,547 priority patent/US8524870B2/en
Priority to US13/949,515 priority patent/US20140044723A1/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/34—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood group antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • the present invention relates to an antibody against human platelet membrane glycoprotein VI (hereinafter sometimes abbreviated as GPVI) and a recognition region of the antibody.
  • GPVI human platelet membrane glycoprotein VI
  • Platelets play an extremely important role in thrombus formation and defense, and their physiological roles are elucidating. In particular, platelets are attracting attention for their function of forming hemostatic thrombus. For example, when vascular endothelial cells are damaged, collagen, which is the main matrix protein in the subendothelium, is exposed, and platelets adhere to it. . Next, platelets are activated by a signal from collagen, and finally platelets aggregate via fibrinogen. And in some cases, it is attracting attention as a therapeutic target because it causes pathological conditions such as thromboembolic diseases.
  • anti-1 & 1_platelet drugs such as aspirin, ticlobidine, 0-11 1) / 111 & antagost have been used for the purpose of preventing thrombosis based on platelet aggregation 'prevention.
  • Many problems have been pointed out in terms of side effects such as gourd bleeding, and it is hoped that an excellent antiplatelet drug with sufficient safety and certain and appropriate action without these problems will appear. ing.
  • GPVI which is present on the platelet membrane, is a collagen receptor for platelets and has been shown to play a central role in the activation of platelets by collagen stimulation (Hiroshi Takayama, Journal of Japanese Society of Thrombosis and Hemostasis, 2 2003, 14th, No. 2, p. 7 5-8 1). That is, Sugiama et al. Show that the 62 kDa membrane protein is specifically deficient in platelets of patients with autocide thrombocytopenia and platelet aggregation due to collagen is not observed (Tateo Sugiyama). Outside 5 people, see Blood, (USA), 1 987, 6th 9th, 6th, p.
  • human-chain antibody scFv: single chain Fv
  • scFv single chain Fv
  • phage display method International Patent Publication No. 0 1/00810, international patent application
  • Publication No. 02/080968 and Pea 1 A ⁇ Smethurst, outside 5 people, Blood (B) _ood
  • single-chain antibodies are obtained by linking the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) of a human antibody with a peptide linker. ; Generally speaking, the affinity for antigen is low and the half-life in vivo is short compared to normal immunoglobulins produced by S. Sumesa et al. Also analyzed the epitopes on GP VI for a single-chain antibody that inhibits platelet aggregation (1 0 B 1 2).
  • GPV I collagens such as collagen, convulxin and CRP, and G PV I, an antibody that inhibits the binding of collagen (9012.2), activates platelets.
  • GPVI shedding was reported to occur (Stephens G outside 4 people, B 1 oo d. 20 O 5 J an 1; 1 0 5 (1): 1 86— 9 1; Gardiner EE outside 4 ⁇ , Blood. 2004; 104: 3611-3617; Bergmeier Thromb Haemost.
  • anti-GPV I antibodies that can be administered to living bodies are highly desired in a situation where there is a demand for drugs that are highly safe, effective, and easy to use as antiplatelet drugs.
  • An object of the present invention is to provide a novel antibody, preferably a monoclonal antibody, that specifically binds to GPV I, a glycoprotein present on human platelet membrane.
  • the present invention provides an anti-GPV I antibody that can be administered to a living body, is effective, and has no problems in terms of side effects such as thrombocytopenia.
  • the present invention also provides an antibody that specifically binds to human GPV I and contains a novel CDR sequence.
  • cells that produce these antibodies are provided.
  • the present inventors have conceived to establish a large number of mouses and hybridomas that produce antibodies against GPV I and to analyze the properties of the antibodies produced.
  • the clone was isolated and further examined, and as a result, the gene encoding the antibody was successfully obtained, and it was revealed that the amino acid sequence of CIR of this antibody was a novel sequence. .
  • a first aspect of the invention is specific to human GPVI, which exhibits a specific function or property Antibody, preferably a monoclonal antibody (hereinafter sometimes referred to as anti-human GPV I antibody and human GPV I monoclonal antibody), or an active fragment thereof, or a derivative thereof. Physically,
  • the bleeding time-prolonging action is weak, (1) to (4) antibody or its active fragment or derivative thereof,
  • (6) GPV is the dissociation constant of the I the following 4 X 10- 8 M, an antibody or its active fragments or derivatives thereof (1) to (5).
  • the antibodies (1) to (6) above are preferably antibodies that do not cause human platelet aggregation alone.
  • a good example is the anti-recognition of clones listed in Table 6 and Table 11 or child or GPVI loop 9! ⁇ Or a chimeric antibody prepared by combining it with human IgG, more preferably human. IgG4, or a humanized antibody.
  • the antibodies of the present invention human GPV I and anti ⁇ and dissociation constant (Kd value) of preferably not more than 10 one 8 M, more preferably less antibody 4 X 10- 9 M.
  • Antibody of the present invention As long as the active fragment or derivative thereof has the ability to bind to GPV I, excluding chimeric antibody and humanized antibody, Fab (Fragment of antigen
  • dsFv peptides including diabody, nanobody and CDR, etc.
  • labeled antibodies 'conjugate antibodies, antibody fusion proteins, and the like.
  • the antibody of the first aspect of the present invention specifically binds to human GPV I and specifically reduces the ability of collagen to aggregate platelets, but other agonists such as ADP or f thrombin Those that do not affect the coagulation ability with respect to the water are preferred. In addition, it is preferable that it does not cause human platelet aggregation by itself.
  • the antibody is equivalent to a human blood J-collagen concentration or a monthly dose that suppresses the aggregation of the plate, preferably 10 times, more preferably f 100 times, and even more preferably 1,000 times. Les that do not cause significant aggregation.
  • the antibodies (1) to (6) may be antibodies that inhibit the binding of human GPVI to collagen, and preferably 10 to 8 M or less, more preferably. 10- 9 M or less, more preferably a dissociation constant of less than 10- ie M
  • Kd value is an antibody that inhibits the binding between human GPV I and collagen.
  • the antibody of the present invention is not necessarily limited to a specific clone, and an antibody having the same action as that of the preferred example of the present invention is included in the scope of the present description.
  • the presence or absence of the action of the antibody of the present invention can be confirmed by a known method.
  • a preferred antibody of the present invention and an antibody whose recognition region, binding site or epitope on GPVI is at least partially in common for example, an antibody that competes with IS for binding to GPV I It is included in the scope of the present invention.
  • the presence or absence of a common recognition region or binding site with the antibody of the present invention can be confirmed according to the method described in the Examples or by a known method.
  • the present invention provides an antibody that competes with the specific antibody of the present invention for GPVI binding.
  • antibodies classified into eight groups listed in Table 1, preferably gnolepe d, e or h, more preferably gnolepe d or e, are used in the present invention. It is mentioned as an antibody.
  • the second aspect of the present invention is a novel recognition region, binding site or enzyme on GPVI.
  • Anti-GPV I antibody defined by a group, preferably a monoclonal antibody.
  • At least part of 1 is E21, K22 and P23 in loop 2, G33 in loop 3 and A57, K59 and L62 in loop 5, or S43, S44, S45, R46 and E48 in loop 4 Loop 57 A 57, K 59 and L 62, or Loop 9 T 116, R117, Gi 9 and Q 122, or Loop 9 T 116, R117, G 119 and Q 122 and Loop 11 R 139, the antibody of (7) or an active fragment thereof or a derivative thereof,
  • each of the above loops is, for example, a residue in which the amino acid Z acid residue corresponding to a heterologous GPVI, for example, mouse or rat GPVI in human GPI is different.
  • the modeling structure of GP V I eg, human GP V I can be estimated by the method described in the Examples, and the positions of each loop structure are shown in FIGS.
  • domain 2 loop 9 and domain 1 loop 2, and preferably domain 2 loop 9 are important as the recognition region of the antibody of the present invention, and antibodies that recognize these are preferable.
  • Preferable examples include antibodies listed in Table 6 and L1, or chimeric antibodies or humanized antibodies obtained by replacing them with human Ig G, more preferably human Ig G4.
  • the antibody according to the second aspect of the present invention can be classified by the binding with the peptide according to the eighth aspect of the present invention or the polypeptide according to the ninth aspect, or the binding region can be confirmed. it can. That is, the present invention provides an anti-GPV I antibody that is preferably reduced in binding ability to a specific peptide of the peptide of the eighth aspect and / or the polypeptide of the ninth aspect of the present invention. Specifically, an anti-GPVI antibody that has a significantly different, preferably reduced, binding to a specific GPVI variant from a binding to human GPVI and other GPVI variants or other GPVI variants. Examples of suitable classification and suitable antibodies, such as specific confirmation methods, polypeptides to be used, and the like are described in the examples.
  • the antibody of the present invention is not necessarily limited in its antigen binding valence, such as Fab or scF.
  • valence antibodies may be used, but from the viewpoints of in vivo stability, particularly in blood, binding to GP VI, or strength of action, it is preferably a bivalent or more multivalent antibody, eg, bivalent A trivalent, tetravalent or decavalent antibody, more preferably a bivalent antibody.
  • a decavalent antibody preferably a bivalent antibody is provided.
  • examples of tetravalent antibodies include IgA
  • examples of decavalent antibodies include IgM, but are not limited thereto.
  • trivalent antibodies do not exist physiologically, but natural or synthetic peptides with unique trimeric properties, such as domains of tenascin molecules (M 110-139, Swissprot Trivalent antibodies can be prepared by chemically or genetically binding to monovalent antibodies (scFv or Fab, etc.) using # P10039 (chicken) or Swissprot # P24821 (human). (See Special Publication 2004-508828).
  • N The antibody of the second aspect of the present invention preferably exhibits a specific function or characteristic of the antibody of the first aspect.
  • a third aspect of the present invention is an anti-GPV I antibody containing a novel CDR amino acid sequence or variable region amino acid sequence, preferably a chimeric antibody, preferably a human IgG, particularly a recombinant antibody with human IgG4. Is a CDR-grafted antibody, waiting for humanized antibody.
  • a novel CDR amino acid sequence or variable region amino acid sequence preferably a chimeric antibody, preferably a human IgG, particularly a recombinant antibody with human IgG4.
  • At least 3 sets of CDRs of antibody one of H chain or L chain, preferably 6 sets of CDRs of both antibody H chain and L chain are listed in Table 8, 9, 12 _3 ⁇ 4 13
  • the clone described above preferably containing the CDR amino acid sequence of an antibody that recognizes GPVI / oop 9, as the corresponding CDR amino acid sequence 3 ⁇ 43 ⁇ 4GPVI antibody or an active fragment thereof or a derivative thereof,
  • At least the variable region of the light chain or light chain of the antibody preferably the variable region of both the light chain and the light chain of anti- ⁇ : clones described in Table 7 or f or Table 14;
  • Anti-human GPVI antibody containing the variable region amino acid sequence of the antibody recognizing loop 9 as the corresponding variable region amino acid sequence, particularly a chimeric antibody recombined with human IgG, preferably human IgG4 Alternatively, it is an active raw fragment or a derivative thereof.
  • Antibodies of the third aspect preferably, Mel in having a first happy-like and Roh or properties ⁇ Pi Roh or recognition region specificity of the antibody or the like of the second aspect G
  • the fourth aspect of the present invention relates to the antibody of the first to third aspects or the active '! ⁇ Fragment thereof.
  • a CDR of at least one of the H chain or L chain of the derivative preferably 6 sets of CDRs of H chain and L chain, or a polynucleotide containing a nucleotide sequence coding for the variable region or It is a nucleic acid.
  • the present invention also provides an anti-human GPV [antibody gene or its heavy chain or light chain variable region gene derived from an antibody gene containing a specific mouse germline antibody gene segment combination. That is,
  • Anti-human GPVI antibody gene derived from an antibody heavy chain gene containing any combination of mouse germ-line antibody gene segments V H , DH and J H listed in Table 16 Heavy chain variable region gene,
  • an anti-human GPVI antibody gene comprising a nucleotide sequence encoding the CDR amino acid sequence of the antibody heavy chain variable region gene or a heavy chain variable region gene thereof,
  • An anti-human GPVI antibody gene or its light chain variable mode gene that comes from an antibody light chain gene containing any combination of J L (25)
  • An anti-human GPVI antibody gene comprising a nucleotide sequence j encoding the CDR amino acid sequence of the antibody light chain variable region gene or a light chain variable region gene thereof.
  • V H 3: 3.9
  • D H DSP2.7 or DSP2.5
  • JH4 codes to the gene derived from the pre-antibody antibody gene, as long as the antibody exhibits similar antigen specificity, the antibody gene itself or f
  • the present invention relates to a wipe or a wipe encoded by a human GPVI antibody gene or a heavy chain or light chain variable region gene thereof derived from an antibody gene having a specific combination of mouse germline antibody gene segments. Active fragments or derivatives thereof are provided. That is,
  • the present invention relates to an anti-human GPVI antibacterized with polyethylene glycolol (PEG), specifically, the antibody of the present invention, preferably an antibody recognizing GPVI loop 9, or its activity. Fragments or their derivatives are provided.
  • a method for binding PEG to an antibody or the like can be performed according to a known method (see, for example, Roberts MJ et al. Advanced Drug delivery Reviews 54 (2002) 459-476). I'm written 1 / I speak.
  • the fifth aspect of the present invention is a cell that produces the antibody of the first to third aspects, an active fragment thereof, or a derivative thereof, or a tabule containing the polynucleotide of the fourth aspect.
  • the polynucleotide according to any one of (18) to (21) It contains cells, in particular transformed cells, or hybridomas.
  • the sixth joy of the present invention is the use of the polynucleotide according to the fourth aspect or the expression vector containing the polynucleotide or the cell according to the fifth aspect, according to the first or third aspect. A method for producing an antibody.
  • the sixth joy of the present invention is the use of the polynucleotide according to the fourth aspect or the expression vector containing the polynucleotide or the cell according to the fifth aspect, according to the first or third aspect.
  • (31) including the step of using the polynucleotide of (17) to (21), an expression vector containing the polynucleotide, or the cell of (28) or (29), It is a manufacturing method of the antibody of an aspect.
  • the seventh aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the * fc form of the first to third aspects or the active fragment thereof or a derivative thereof as an active ingredient, preferably thrombotic, embolic
  • the antibody of the present invention has few side effects such as platelet activation, platelet aggregation, thrombocytopenia and prolonged bleeding time, and is useful for the prevention and / or treatment of the above-mentioned diseases. .
  • the eighth aspect of the present invention relates to a specific structure of GPV I soil, in particular, a peptide constituting a loop structure, specifically,
  • the peptide may contain a heterologous GPV I-derived O amino acid sequence or a polypeptide other than GPV I, for example, Fc amino acid sequence CJ.
  • the ninth aspect of the present invention is a specific GPV I mutant, for example, f, an amino acid substitution, a domain substitution between species, or a partial sequence substitution between species, such as a loop substitution.
  • a tenth aspect of the present invention is a method for screening an antibody or an active fragment thereof or a derivative thereof, comprising the following steps.
  • Eleventh aspect of the present invention Estimating the epitope of an antibody, comprising the step of measuring the reactivity of the peptide of the eighth aspect or the polypeptide of the ninth aspect with the antibody, for example, the binding.
  • a method for producing an antibody specific for GPV I comprising using the peptide of the twelfth aspect of the present invention, the peptide of the eighth aspect of the present invention, the polypeptide of the ninth aspect of the present invention, or the like.
  • An antibody specific to GPV I characterized by using the eighth sputum-like peptide of the present invention or the positive peptide of the ninth aspect as an antigen for detecting or identifying the antibody, preferably It is a method for producing the antibody of the first to third aspects of the invention. That is, the amino acid sequence on human GPV I that can be recognized by the antibody of the present invention, for example, GPV I recombinant in which the amino acid sequence corresponding to the loop structure is incorporated on mouse GPV I is: It is possible to obtain a new antibody capable of recognizing the same recognition region as an immunogen and / or a detection antigen.
  • a method using a human antibody gene transgenic non-human animal is disclosed (WO 2002/07 O 648 (Special Table 2005-504507), WO 2 002). 043 478 (Special Table 2004-515230)).
  • Heterogeneous QPV I for example, a protein that incorporates a partial amino acid sequence of human GPV I into mouse GPVI
  • an animal such as a mouse is immunized, it is considered that a human antibody that reacts with a human amino acid sequence, preferably an epitope, incorporated without reacting with the amino acid sequence of GPVI mouse is efficiently obtained. Therefore, the human antibody obtained by this method is useful as a human antibody having the characteristics of the antibody of the first or second aspect of the present invention, and the method is particularly useful.
  • a thirteenth aspect of the present invention is a method for detecting or quantifying GP V I in a sample using the antibody of the first to third aspects.
  • This method can be applied to a method for diagnosing a disease, preferably a method for diagnosing a disease associated with thrombus formation, by measuring GPV I on platelets or GPV I in a body fluid, particularly blood.
  • the sputum method can be applied to the monitoring of GPV I-related treatment, in particular, anti-GPV I antibody effect prediction or determination, or prognosis determination using GPV I on platelets as an index.
  • Figure 1 shows the amino acid sequence alignment between human soluble GP V I and mouse soluble GP V I.
  • the squares indicate the position of the loop region (L1-L14) predicted by GPV I domain region modeling.
  • FIG. 2 shows the results of a competition test between a GPV I deficient, patient antibody and a mouse anti-human GPV I monoclonal antibody.
  • YA-Abs_88 and ⁇ -Abs-03 represent anti-GPV I antibodies in GP "V I deficient patients.
  • Fig. 3 shows the amino acid sequence of human soluble GP V I and rat soluble GP V I.
  • the squares indicate the position of the loop region (L 1 -L 14) predicted by the domain region op modeling.
  • Figure 4 shows the results of examining the reactivity of the mouse hybridoma antibody and the chimeric antibody.
  • Figure 5 shows the inhibition of the binding of chimerized antibody and mouse hyperpridoma antibody to GPV I and collagen. '
  • Figure 6 shows the results of examining the binding characteristics of anti-human GPV I antibodies with GPV I mutants. .
  • FIG. 7 shows the results of examining the reactivity of CF1232-37-2 with various hGP VI mouse loop substitutes.
  • Figure 8 shows the effect of activating human platelets and power cynomolgus platelets.
  • CD62P P-selectin expression level
  • A human platelets
  • B force cynomolgus platelets
  • FIG. 9 shows the aggregation-inducing effect on human platelets.
  • FIG. 10 shows the effect of F1232-37-2 on collagen-induced human platelet aggregation.
  • Figure 11 shows the effect of F1232-37-2 on ADP-induced human platelet aggregation.
  • FIG. 12 shows the results of an intravenous administration test of mouse anti-human G P V I monoclonal antibodies F1232-37-2 and F1199-6 to force dipsal monkeys.
  • Fig. 13 shows the results of a mouse / human chimeric anti-human GPVI antibody ex vivo test (single intravenous test cF1232-37-2 single intravenous administration test).
  • Fig. 14 shows the results of the ex vivo test (repeated intravenous administration test) of c mouse / human chimeric anti-human GPVI antibody.
  • Collagen-induced platelet aggregation (A) and platelet GPVI content (B) were measured when cF1232 -37-2 was administered 0.3 mg / kg four times every other day to a dynamite monkey.
  • Fig. 15 shows the results of a power mouse quiz ex vivo test (subcutaneous administration test) of c mouse / human chimeric anti-human GPVI antibody.
  • CF1232-37-2 subcutaneous administration test
  • blood was collected over time, and platelet aggregation (A) and platelet GPVI levels (B) induced by 2 ⁇ g / mL collagen were measured. .
  • FIG. 16 shows the action of F1232-37-2 Fab to inhibit collagen-induced platelet aggregation.
  • FIG. 17 shows the results of a force double quiz ex vivo test for F1232-37-2 F (ab,) 2 .
  • FIG. 18 shows the construction of CF1232-37-2 double-stranded stable co-expression plasmid.
  • Figure 19 shows the antigen-binding reactivity of CF1232-37-2 expressed in COS cells and CF1232-37-2 expressed in CH0 cells.
  • Figure 20 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable region and its humanization.
  • Figure 21 shows the amino acid sequence of the light chain variable region and its humanization.
  • Figure 2.2 shows the GP V I binding specificity of the humanized antibody.
  • FIG. 23 shows the results of the collagen-induced agglutination ability test of the force cynomolgus blood / J, plate administered with the chimeric anti-GPVI antibody.
  • ' Figure 24 shows the results of the force quizanole bleeding time test.
  • A eptif ibatide administration It shows the collagen-induced aggregation ability of platelets 5 minutes after intrapulmonary administration and 48 hours after administration of anti-GPV I antibody cF1232-37-2.
  • B The results of comparing the bleeding time after administration of eptifibatide 5 minutes after intrapulmonary administration and 48 hours after administration of GPV I antibody cF 1232-37-2 with the values before each drug administration.
  • 'Fig. 25 shows the results of the platelet GPVI ⁇ 3 ⁇ 4hara shedding confirmation test with anti-GPV I antibody.
  • FIG. 26 shows the results of PEGylation of whole anti-PVI antibody and Fab antibody.
  • Each lens consists of 1: F1232-37-2 total antibody; 2: PEGf ⁇ reaction product of F1232-37-2; 3: PEGylated F1232-3-7-2 purified product; 4: F1232-37-2 Fab 5: PEGylated reaction product of F1232-37-2 Fab; 6: PEGylated F1232-37-2 Fab purified product.
  • FIG. 27 shows the results of a GP V I antigen binding activity test of a PEGylated anti-GP V I antibody.
  • the antibody of the present invention specifically recognizes GPVI, which is a membrane glycoprotein present on human platelets.
  • GPVI recognized by the antibody of the present invention is not necessarily limited to that on the ifeL platelet, and can recognize, for example, GPVI of megakaryocytes.
  • the present invention will be described in more detail below. In today's Monthly Book, the amino acid “IJ” may be written in one-letter or three-letter code5.
  • the anti-antibody of the present invention may be a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the production method of this monoclonal antibody is not limited to a specific method.
  • monoclonal antibodies produced by hybridomas, antibody genes the incorporating ⁇ ⁇ recombinant cell monoclonal antibody was no direct or EBV 3 ⁇ 4 connection may be any of the monoclonal antibodies (Epusutain 'server 1 to the virus) to by Ri transformed cells are produced.
  • the present TsutomuAkira It may be an anti-mixture or polyclonal antibody containing at least one monoclonal antibody, or a plurality of (a monoclonal ⁇ : body mixture of the present invention.
  • the antibody of the present invention is bispecific (bispecific). ) Body or polyspecific antibodies are also included.
  • the antibody of the present invention is an antibody that specifically binds to human GPV I.
  • the binding between the body of the present invention and human GPVI can be determined by a known method, and specifically, the method shown in the practice can be mentioned.
  • Dissociation constant of the antibody of the present invention is a human GPV I and the antibody ⁇ : (K d value) force 4 X 10- 8 M, preferably no more than 1 0- 8 M, more preferably 4 X 1 - 9 M or less, further preferably not more than 10- 9 M.
  • the method for measuring the number of dissociations between human GPVI and the antibody is not limited to a specific method, and can be performed by a conventional method.
  • it can be measured by a protein interaction analyzer such as BI ACORE3000 using GPV I-Fc immobilized on a chip. Specifically, it is shown in Example 13 ⁇ 4.
  • the antibody of the first aspect of the present invention has an action of eliminating GPVI on the platelet membrane at least partially fr3 ⁇ 4 by bringing it into contact with platelets, particularly in the body.
  • the action can be confirmed by contacting the antibody of the present invention with platelets for a certain period of time, separating the platelets, and measuring the expression level of GPVI on the surface.
  • the expression level of GPV I can be measured by a conventional method using ⁇ F AC S etc., and the specific method is shown in the examples.
  • the antibody of the present invention is preferably administered at a dose of lmsZkg, more preferably 0.3 mgZkg, pre-dose value or control group (compared to the value, preferably 40% or more, more preferably 80% or more, platelet Top (Has the effect of eliminating GP VI.
  • the antibody of the present invention is a platelet GPVI shedding, in particular, a GPVI shedding from platelets by cleaving via a protease that accompanies platelet activation, a GPVI elimination action, or the shedding. It is an antibody that at least partially eliminates GPVI on the platelet membrane by bringing it into contact with platelets with little or no substantial induction.
  • the presence or absence of shedding was determined by a known method (Stephens G, 4 people, Blood. 200, 5 J am 1; 105 (1): 186-91_; Gardiner EE et al., Blood. 2004; 104: 3611-3617, Bergmeier et al.,
  • the antibody of the present invention itself has an action of activating platelets, and has a weak action for inducing thrombocytopenia in vivo, and preferably has little action.
  • Platelet activity f can be measured by a known method, and the expression level of platelet surface antigen, preferably CD 6 2 P, can be used as an index.
  • the activation of platelets by the antibody of the present invention is less than 5 times that of control platelets at a dose or concentration that at least partially eliminates GPVI on platelets, using CD 6 2 P expression as an indicator.
  • it is 2 g or less, more preferably 1.5 ⁇ sound or less, more preferably about the same level.
  • the presence or absence of blood and platelet reduction in the living body is determined by measuring blood platelets over time after administration of the antibody of the present invention to the living body and measuring the platelet count by a conventional method. Confirm by comparing with the number. Specific methods are shown in the examples.
  • the change in the number of platelets by the antibody of the present invention is as follows: at a dose or concentration that at least partially eliminates G ⁇ ⁇ VI on platelets, the pre-dose value or the control group value is 100%, 50% or more, Preferably it is 70% or more, more preferably 90% or more, more preferably about the same. .
  • the antibody of the present invention has the effect of reducing the ability of collagen to aggregate human platelets, that is, the ability of I & L platelets to aggregate in response to collagen when administered in vivo and brought into contact with platelets.
  • the action of the antibody of the present invention is administered during the life and contact with platelets, and then the platelets are separated over time, and collagen-induced platelet aggregation is measured.
  • platelet aggregation can be measured by a well-known person: ⁇ Measured by calculating the aggregation rate using blood transmissivity as an index, for example, with blood j, plate aggregability measuring device, etc.
  • the antibody of the present invention is preferably Or lmg Z kg, more preferably 0. S mg Z kg, preferably 40% or more, more preferably 80% or more, compared to the pre-dose value or the control group value.
  • the antibody of the present invention preferably has a dose or concentration that has little effect on aggregation caused by substances other than collagen that cause platelet coagulation, such as AID P or thrombin, and affects collagen aggregation ability.
  • the maximum aggregation rate is preferably 80% or more of the control, more preferably 90% or more of the control, and still more preferably 95% or more of the crowd.
  • a method for measuring the inhibition of human blood platelet aggregation by substances that induce platelet aggregation other than collagen can be performed by a conventional method.
  • the antibody of the invention of the present invention is an antibody that has a weak bleeding effect, preferably has no significant prolonged action, and more preferably has substantially no prolonged action.
  • the bleeding time can be determined by a known method [specifically, the method described in Example 28 can be applied.
  • the kinetics and stability in the living body are excellent in antibody molecules such as IgG even in its natural form.
  • the half-life in blood is much longer for IgG than for i ", such as Fab, etc., and thrombosis, especially dominant diseases such as thrombosis associated with atrial fibrillation and long-term antibody administration
  • a molecular state with a long half-life in blood, particularly IgG is desirable.
  • the antibody of the present invention may specifically inhibit the binding between GPVI and collagen on platelets.
  • the antibody of the present invention preferably binds GPVI to collagen at 100 g / mL or less, more preferably 10 JJL g / mL or less, more preferably 1 g.
  • the method for measuring the binding between collagen and GPVI is not limited to a specific method, and can be performed by other conventional methods.
  • the second aspect of the present invention is a novel GPVI recognition region, binding site or ehe.
  • Anti-GPV I antibody defined by Tope preferably monoclonal.
  • the recognition region on the GPVI of the antibody of the present invention can be confirmed or estimated by a known method. For example, this can be achieved by applying the method of the first aspect of the present invention and measuring the reactivity with the peptide of the eighth aspect or the polypeptide of the ninth aspect. Specific methods are shown in the examples.
  • the reactivity or inhibition rate is significantly changed compared to a control (eg hGP VI-Fc), eg 50 ° / 0 , preferably 30 %, More preferably 10 * 3 ⁇ 4 or less, and values such as ⁇ and IC 50 change significantly, for example, 3 times, 1 times, more preferably 3 times, and even more preferably 100 times.
  • a control eg hGP VI-Fc
  • eg 50 ° / 0 eg 50 ° / 0 , preferably 30 %, More preferably 10 * 3 ⁇ 4 or less
  • a third variant of the present invention is an anti-human GPVI antibody containing a novel CDR amino acid sequence or variable region amidic acid sequence.
  • variable regions on the N-terminal side of the heavy and light chains of the antibody which are called the heavy chain variable region (VH) and the light chain variable region (VL), respectively.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • CDR ⁇ coiri 1 ement ar i t y determining region
  • the heavy chain variable region has three complements: the first complementarity determining region (CDR1), the second complementarity determining region (CDR2), and the third complementarity determining region (CDR3). There is a gender area.
  • the three complementarity-determining regions in the heavy chain variable region are collectively referred to as the heavy-chain complementarity determining region.
  • the first complementarity determining region (CDR 1), the second phase capture determining region (CDR2) and the third complementarity determining region (CDRL 3) There is a phase determination area.
  • Three complementarity determinations in the light chain variable region page f The region is collectively referred to as the light chain complementarity determining region.
  • preferred combinations of amino acid sequences as VH CDR1, VH CDR2 and VH CDR3, and preferred combinations of amino acid sequences as VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3 are:
  • suitable combinations of amino acid sequences as VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, 'VL CDRU VL CDR2 and VL CDR3 are shown in Tables S and 9 and Tables 12 and 13 .
  • Preferred is an antibody containing any one or more of the CDR amino acid sequences of an antibody that recognizes loop 9 3 ⁇ 4r of GPVI, preferably 3 of the H chain, and more preferably all amino acid sequences.
  • Amino acid other than C D R Amino acid B B IJ is not particularly limited, and amino acid sequences other than C D R are derived from other antibodies, in particular, so-called C D R-grafted antibody power S.
  • the antibodies of the present invention are included.
  • humanized antibodies whose amino acid sequences other than CDR are derived from humans are preferable, and if necessary, one to several amino acid residues are added, deleted, substituted and / or inserted into the framework region (FR). May be accompanied.
  • a publicly known method can be used as a method for producing a humanized antibody, and a specific method is shown in Examples.
  • amino acid sequence of VH and VL of the antibody of the present invention is not necessarily limited. However, as a preferred antibody, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 S 1 as VH or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 85 as An antibody containing any one or more, or VH as an amino acid sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 83 or VL containing one or more amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 85 is there.
  • the antibodies of the present invention are not necessarily limited to those having a specific amino acid sequence. “ ⁇ ⁇ In the range that does not substantially affect the activity and / or antigenicity of the antibodies of the present invention, In, for example, addition, deletion, substitution and / or insertion of one to several amino acid residues are allowed in the variable region, particularly in the FR part.
  • the antibody of the present invention is an antibody in which the constant region of the antibody is preferably a human antibody, more preferably a human IgG, and more preferably a human IgG4 amino acid sequence.
  • the antibody of the present invention is not necessarily limited to a specific molecular species.
  • the structure of an ifc body, that is, an immunoglobulin is composed of a heavy chain (H chain) and a light chain (L chain). Depending on the heavy chain class ( ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ ), five isotypes ( IgG, IgA, IgM, IgD, IgE).
  • IgG and Ig heavy chains for example, human O, y 1 y 2, y 3, y 4, al, a 2
  • subclasses eg IgG, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2 in the case of humans.
  • Chains are classified as either ⁇ or I.
  • the antibody of the present invention is not limited to class, subtype or isotype, and may be classified into any of them.
  • the antibody is preferably an antibody with an isotype of SlgG, and more preferably an antibody with a subclass of IgG4 in that there is no complement binding.
  • the antibody of the present invention may be a fragment or a part of an antibody as long as it has activity, for example, ability to bind GPVI.
  • an antibody for example, Soma, Fab (fragment of antigen binding), Fab ', (Fab') 2 , Single chain antibody (scFv), Disulfide stabilized antibody
  • the antibody of the present invention is not necessarily limited to its antigen binding value f, and may be a monovalent antibody such as Fab or scE, in vivo, particularly in blood. From the viewpoint of stability at high temperature, binding to GPVI, or strength of action or action, it is preferable to be more than bivalent antibody, for example, bivalent, trivalent, tetravalent or decavalent antibody. Is a bivalent antibody.
  • a polynucleotide or nucleic acid encoding the antibody of the first to third aspects of the present invention.
  • the polynucleotide is not necessarily limited as long as it encodes the amino acid sequence of the body of the present invention, and the polynucleotide * ⁇ tide includes DNA and RNA.
  • the polynucleotide encoding the CDR sequence of the antibody of the present invention is not necessarily limited, but a suitable combination of nucleotide sequences encoding amino acid sequences as VH CDR1, VH CDR2 and VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 and Preferred combinations of nucleotide sequences that encode amino acid sequences as VL are further preferred combinations of nucleotide sequences that encode amino acid sequences as VH CCR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3. Are shown in Tables 8 and 9 and Tables 12 and 13.
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence of VH and VL of the antibody of the present invention is not necessarily limited, but preferably SB column numbers 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, encoding the amino acid sequence as VH, 101, 103, 105, 107 and 109 nucleotide sequences, Or one of the base sequences of SEQ ID NOs: 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 and 110 encoding the amino acid sequence as VL, more preferably both bases
  • the polynucleotide encoding the constant region of the antibody of the present invention preferably contains a human antibody, more preferably human IgG, and more preferably human IgG4.
  • a cell capable of producing the antibody of the present invention By transferring a vector or gene containing the nucleotide sequence of the antibody of the present invention to a cell, a cell capable of producing the antibody of the present invention can be produced.
  • the transfer method can follow a known method, and a specific method is shown in the examples.
  • a cell producing the antibody of the present efforts examples include a hybridoma, a transformant, or a genetically modified cell into which the antibody gene of the present invention has been introduced.
  • Specific examples of hybridomas producing antibodies include the clones shown in Tables 6 and 11.
  • the present invention also provides an antibody produced by the cell of the above invention.
  • novel peptides or polypeptides related to GPVI are provided. These peptides and the like are publicly known (can be prepared by the method, and specific methods are shown in the Examples.
  • the peptide of the eighth aspect or the polypeptide of the ninth aspect is used to produce an anti-GPVI antibody. It can be used as an O administration antigen for immunization, or as an antigen for detecting an anti-GPVI antibody.
  • an anti-production method is provided.
  • the method for producing the antibody of the present invention is not necessarily limited, but it can also be produced by the method described below.
  • human GPVI or a fragment thereof or a derivative thereof, eg, human GPVI—Fc is administered as an antigen to an animal such as a mouse, and lymphocytes are collected from the terminal sterilized mouse.
  • a hybridoma with a myeloma cell is prepared.
  • Produced An antibody produced by hybridoma is obtained, an antibody having the ability to bind to GPVI and having the characteristics of the first to third antibodies is selected, and a cell producing this antibody is obtained. By culturing the cells, the antibody of the present invention can be obtained.
  • the antibodies of the present invention can be produced by the methods of wisdom (Nature, 312: 643, 1984,
  • a nucleic acid encoding VH or VL such as cDNA
  • a cell that produces the antibody of the present invention such as a lymphocyte, and preferably a hybridoma that produces a GPVI monoclonal antibody. And determine the amino acid sequence.
  • the obtained cDN encoding VH and VL is used as an expression vector for animal cells containing a gene encoding human antibody CH and / or human antibody CL prepared from the same cell or another human cell.
  • a human antibody expression vector can be constructed by inserting each, and introduced into an animal cell for expression.
  • the method for preparing a gene to be introduced into an animal cell The gene can be obtained from genomic DNA or cDNA derived from a hybridoma, obtained from a hybridoma mRNA by PCR, or obtained by chemical synthesis. Also good.
  • the vector incorporating the nucleic acid encoding the VH or VL of the antibody of the present invention is not necessarily limited to a vector widely used for expression of protein genes and the like, and particularly suitable for expression of antibody genes or vectors for high expression. preferable. Suitable examples include vectors containing an EF promoter and a CMV enhancer, such as pEF-BOS or the vectors used in the examples.
  • an expression vector usually incorporating a nucleic acid encoding VH or VL is prepared and cot r a n s f e c t into the host cell, but it may also be incorporated into a single expression vector.
  • the host cell into which the expression vector is introduced is not necessarily limited, but a cell that is used for the expression of a protein gene or the like and is particularly suitable for the expression of an antibody gene is preferred.
  • bacteria large 3 bacteria, etc.
  • actinomycetes yeast
  • insect cells SF9, etc.
  • mammalian cells mammalian cells
  • a recombinant animal cell line for example, a CHO cell line, which stably produces the ifc body stably is used. Generation, cloning, gene amplification and screening for high expression of such recombinant cell lines are well known.
  • the ife can be used (see, for example, Omasa T .: J. Biosci. Bioeng., 94, 600-605, 2002, etc.).
  • two types of promoters are used, but different combinations of promoter activities, such as those with high and low activity, are used for IJ. Accordingly, a clone with high expression ability can be efficiently obtained by using a promoter having a relatively weak activity as a promoter for the selection marker. Examples of suitable promoter combinations and specific methods are given in the examples.
  • C ⁇ y 1 or Cy 4 as the human anti-body chain constant region
  • C // as the human antibody light chain constant region.
  • the constant region of any human antibody such as c can be used.
  • an antibody containing a human amino acid sequence is a combinatorial library consisting of a variable heavy chain and a variable light chain in addition to an antibody naturally present in the human body, such as a human antibody phage library.
  • the human antibody phage library is a library in which the activity of an antibody such as Fab or a single chain antibody is expressed on the phage surface by inserting an antibody gene prepared from human B cells into a phage gene.
  • the antibodies of the present invention can also be obtained by screening these libraries.
  • phages that express an active fragment of an antibody having a desired antigen-binding activity can be recovered using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index.
  • the active fragment of the antibody can also be converted into human antibody components consisting of two complete heavy chains and two complete light chains by genetic methods. 2T is possible.
  • the present invention includes an active fragment of the antibody of the present invention in addition to an antibody comprising two child chains and two light chains.
  • active fragments of antibodies include Fab (fragment of antigen binding), Fab, and F (ab ') 2 , and the active fragments of antibodies are bound by a linker etc.
  • Single chain Fv: scFv and disulfide stabilized antibody
  • dsFv disulfide stabilized Fv
  • a peptide containing an active fragment of the antibody for example, a peptide containing CDR;
  • ⁇ a method of treating the antibody of the invention with an appropriate proteolytic enzyme, or a gene recombination technique.
  • the Fab of the present invention can be obtained by treating the anti-GPVI antibody of the present invention with the proteolytic enzyme pepsin in the case of IgM and with the proteolytic enzyme papain in the case of IgG.
  • the DNA encoding the Fab of the antibody into a current vector for prokaryotes or an expression vector for eukaryotes, and introducing the vector into a prokaryote fe or eukaryote. It can be expressed to produce Fab.
  • F (ab,) 2 of the present invention can be obtained by treating the anti-GP ⁇ I antibody of the present invention with the proteolytic enzyme pepsin.
  • the following Fab ′ can be prepared by thioether bond or disulfide bond.
  • the Fab ′ of the present invention can be obtained by treating F (ab ′) 2 that specifically reacts with GPVI with a reducing agent thiothreitol.
  • any of the hybridoma of the present invention any of the hybridoma of the present invention; the produced antibody or human antibody can be used.
  • ScFvi of the present invention by obtaining cDNA encoding VH Oyopi VL of the anti-GPVI antibodies of the present invention, the scFv Constructs a co 1 to sul DNA, said DNA- an expression vector for prokaryote or eukaryote
  • a scFv can be produced by inserting the expression vector into an expression vector and expressing the expression vector by introducing the prokaryotic cell into a eukaryotic organism.
  • dsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VTH and VL is substituted with a cysteine residue, and bonded via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue substituted for the cysteine residue is based on the prediction of the three-dimensional structure of the antibody according to the method shown by Reiter et al. [Protein Engineering, 7, 697 (1994)]. Can be selected.
  • VH and VL contained in the dsFv of the present invention those derived from either the antibody of the first or second aspect of the present invention can be used.
  • the dsFv of the present invention obtains cDNA encoding the VH and VL of the anti-GPVI antibody of the present invention, constructs a DNA encoding the dsFv, and expresses the DNA for a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression.
  • DsFv can be produced by inserting the expression vector into a vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • the peptide containing CDR is composed of at least the region of H chain or L chain CDR. Multiple CDRs can be linked directly or via an appropriate peptide linker.
  • the peptide containing the CDR of the present invention is obtained by obtaining cDNA encoding the VH and VL of the anti-GPVI antibody of the present invention, constructing a DNA encoding CDR, and using the DNA for a prokaryotic expression vector or eukaryotic It can be inserted into an expression vector and expressed by introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism to produce a peptide containing CDR.
  • a peptide containing CDR can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycanolbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • Examples of the antibody or active fragment of the present invention or derivatives thereof include antibodies produced by a hybridoma, antibodies produced by cells transformed with EBV, recombinant antibodies expressed from cDNA, or those antibodies.
  • Active fragment This includes antibodies chemically bound to radioisotopes, proteins, peptides or low molecular weight compounds, or antibodies fused by genetic engineering.
  • an antibody conjugated with polyethylene glycol is one of the preferred examples because it is highly useful in terms of stable individualization.
  • the anti-GPVI antibody of the present invention or the H-chain or L-chain of the active fragment of the antibody or the N-terminal side or the L-chain thereof is the C-terminal side, an appropriate substituent or side chain in the antibody or the active fragment of the antibody, and the antibody or Radioactive isotopes, proteins, peptides, or low molecular weight compounds etc. are combined with the sugar chain of the active fragment of the antibody by chemical methods [Introduction to Antibody Engineering (Osamu Kanemitsu 1 9 94, Jinjinshokan Co., Ltd.)] Can be manufactured.
  • a hybridoma means a cell that produces a monoclonal antibody having a desired antigen specificity, obtained by cell fusion of lymphocytes with myeloma cells derived from humans, mice, rats, etc. However, it can be produced by a known method. When producing a monoclonal antibody, it is preferable to select in consideration of compatibility with the myeloma cell used for cell fusion.
  • the myeloma cell various known cells can be used as the myeloma cell. This includes human-derived SK01007, human mouse heteromyeloma SHM-D33, mouse-derived P3, P3U1, SP2 / 0, NS-1 and rat-derived YB2Z0.
  • Y3 Includes myeloma cells such as Ag 1, 2, and 3.
  • hybridomas are produced by using lymphocyte activation by in vitro immunity, and hybridomas are prepared using animals that have been recombinantly transformed with human antibody genes, particularly transgenic mice, such as KM mice.
  • the production method is mentioned.
  • WO 2 0 02/0 70 6 48 (Special Table 2005-504507), WO 20 02/04 3478 (Special Table 2004-515230)
  • Heterogeneous G.PV I for example mouse GP VI to partial GP amino acid of human GPVI
  • the protein incorporating the sequence may be expressed by a human amino acid sequence, preferably an epitope, which is incorporated without reacting with the amino acid sequence of the mouse of GPVI when immunized to an upper SB transgenic animal such as a mouse.
  • the human antibody obtained by this method is useful as a human antibody having the characteristics of the antibody of the first or second aspect of the present invention, and the method is particularly useful.
  • the cells used for the production of the hyperidoma are not necessarily limited, but when producing a human antibody, it is preferable that at least one of the plurality of cells used for the production of the hybridoma is a human-derived cell.
  • human-derived cells human lymphocytes such as peripheral blood, lymph nodes or spleen are used, and human lymphocytes that have been confirmed to produce autoantibodies are particularly preferred.
  • the activation of lymphocytes can be performed by a known method. For example, by collecting B cells from human tree blood or spleen and stimulating the antigen by in vitro introduction, a method for producing hybridomas with chick B cell-derived myeloma cells or mouse 3fe myeloma cells, EBV Transformed with mouse myeloma cells, and stimulated with mitogen such as PWM, polyclonal B cells (methods for activating and fusing (immune experimental procedures I ⁇ II, Shunsuke Ueda et al., Nankodo), etc.) Is preferred. '
  • the administration antigen to immunize the animal, or the antigen fc used to stimulate the cells fc There is no limitation.
  • the animal from which the antigen protein is derived can be selected as appropriate according to the intended use of the antibody, but it can be selected from natural products, genetically engineered, chemically synthesized, and other proteins and peptides. Any fusion protein, etc.
  • platelets, platelet membranes, purified GPV I, recombinant GPVI, GPV ⁇ I-Fc can be used, preferably GPV I-Fc.
  • the peptide of the eighth aspect or the polypeptide of the ninth aspect of the present invention can be suitably used as an antigen for immunization for producing an anti-GPV I antibody.
  • Fusion of activated lymphocytes and myeloma cells can be performed using a known method such as Milstein et al. (Methods in Enzymol., P. 73-3). ⁇ For example, methods using polyethylene glycol (PEG) as a fusing agent (Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures, Minami Ando ⁇ Chiba: 3tZ, Kodansha) or electrofusion methods.
  • PEG polyethylene glycol
  • the PEG concentration is not necessarily limited, but it is preferably 50%. It is also possible to add a scavenger such as dimethyl sulfoxide (DMSO) as a fusion efficiency promoter. Fusion starts by adding PEG solution warmed to 37 ° C to the mixed cells, and is terminated by adding medium after reacting for 1-5 minutes.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the hybridoma formed by this fusion is cultured for 1 to 10 days in a selective medium such as hypoxanthine, thymidine and aminobuterin-containing medium (HAT culture medium; 1 ⁇ 2), and separated from unfused cells.
  • a selective medium such as hypoxanthine, thymidine and aminobuterin-containing medium (HAT culture medium; 1 ⁇ 2)
  • HAT culture medium 1 ⁇ 2
  • the resulting hyperidoma is further selected according to the antibody it produces.
  • the selected hybridoma is monocloned according to a known limiting dilution method and established as a monoclonal antibody-producing hybridoma.
  • a known method can be used as a method for detecting the sex of the antibody produced by the hybridoma.
  • the antibody activity is determined as the first step to the GPV I antigen ( ⁇ binding ability, and as the second step, the activity to inhibit the binding of GPV I to collagen is detected.
  • Detection of the first step activity Examples of methods include the EL ISA method, Western plot method, and radioimmunoassay method. Examples include ELISA method (binding inhibition type), protein interaction analysis method (BICORE etc.), and platelet aggregation inhibition measurement method.
  • the peptide of the eighth aspect or the polypeptide of the ninth aspect can be used as an antigen to detect anti-G "PVI antibodies. Specific methods are shown in the Examples.
  • the established hybridoma is cultured by a known O method, and a monoclonal antibody can be obtained from the culture supernatant.
  • Purification of the antibody can be performed using a known purification method such as salting-out, gel filtration, ion exchange chromatography, or semifinity chromatography.
  • the concentration of the antibody can be measured by a known protein assay method, for example, measurement of absorbance at 2800 nm.
  • a firefly antibody method an immunoenzyme antibody method (ELISA), Radiolabeled immuno-antibody method (RIA), immunohistochemical staining method such as immunohistochemical staining method, immune cell staining method (ABC method, CSA method, etc.), u: ⁇ stamp lotting method, immunoprecipitation method, Kami Kami Enzyme immunoassay as described in Sand ⁇ r
  • the antibody of the present invention specifically binds to human GPVI ⁇ , and comprises the antibody of the present invention, an active fragment of the antibody, a modified antibody bound to a chemical substance, or a composition containing these CO mixtures.
  • Various uses include the use of prevention, diagnosis and treatment of human diseases, and the detection of human GPV I. in test materials, cells and tissues.
  • the antibody of the present invention has a high specificity for binding to human GPVI, and the activity of human platelets alone or the effect of promoting or inducing thrombocytopenia by itself alone is low.
  • Diseases such as platelet activation or aggregation, or vascular endothelial damage It is effective in the prevention and / or treatment of diseases caused by arteriosclerotic reactions, and is used for the prevention and / or treatment of diseases caused by thrombi or emboli, such as thrombosis and embolism. can do. These diseases include not only arterial thrombosis but also venous thrombosis, and also include cerebral infarction caused by atrial fibrillation.
  • Prophylactic and Z or? Specific examples of human diseases or conditions that can be treated include myocardial infarction, thrombolytic therapy, percutaneous coronary lumen dilatation, stenting, and bypass surgery. These are the results of vascular endothelium thickening, vascular restenosis, angina pectoris or myocardial infarction, atrial fibrillation or heart, atrial flutter and thrombosis resulting from these, embolism or cerebral infarction.
  • the antibody of the present invention can also be administered alone or in combination with other pharmacological ingredients for the above-mentioned prophylactic reaction / or disease to be treated.
  • pharmacologically active ingredients include, for example, known thrombolytic agents (for example, tissue plasminogen agglutinator (t_PA) and derivatives thereof (modified or fc> so-called second generation).
  • Uronase, streptokinase), or known antiplatelet drugs eg aspirin, ticlovidin, clopidogre /, topoxampan antagonist, thrombosan synthesis inhibitor, GPII b / III a antagonist
  • known anticoagulants for example, phafarin, heparin, low molecular weight heparin, pentasaccharide, thrombin inhibitor, FXa inhibitor, FVIIa inhibitor
  • the term “combination” as used herein refers to administration of a combination containing both the antibody of the present month and the pharmacologically active ingredient, and the antibody of the invention and the pharmacologically active ingredient are separately produced.
  • the dosage form is not limited as long as it is present as an agent at a time or at different times, and is present in the patient's blood 1 ⁇ simultaneously.
  • the pharmaceutical product containing the antibody of the present invention and a pharmaceutically acceptable composition as an active ingredient can be prepared by using, for example, tablets, injections, or the like using commonly used pharmaceutical carriers, shell-shaped agents, and other additives. Prepared as a suppository, powder, suppository, etc. and administered to humans and other animals.
  • the administration route When applied to hemorrhoids, the administration route includes coagulation, intravenous administration (bolus injection, continuous infusion, intermittent infusion), subcutaneous administration, muscle administration, intra-articular administration, transdermal administration, transvaginal administration, etc. Usually, it is administered orally or intravenously.
  • the clinical dose of the antibody of the present invention for humans is determined in consideration of the patient's requirements, body weight, age, sex, etc., but is usually 1 to 1 0 0 0 O mg, preferably ⁇ or 1 0 to 1 0 0 O mg, which should be administered once or several times. Since the dosage varies depending on various conditions, an amount smaller than the above dosage range may be sufficient.
  • the antibody of the present invention is common in that it recognizes GPVI
  • the present invention encompasses various antibodies having the following mechanism.
  • antibodies that directly inhibit GPVI-collagen binding, or that inhibit platelet activation or Z or aggregation by cleaving GPVI are compared. It may be useful during the acute phase of the disease (eg, during myocardial infarction or PTCA cold or just before or after them). In such cases, preferably a relatively large amount of antibody is administered to bind the antibody of the present invention to the GPVI portion of the platelet surface in the blood, for example, single J1I or divided or intravenous infusion. Can.
  • antibodies that incorporate GPVI into the interior may not have immediate effects, but the life of human platelets in blood (after 9-10 days) and the blood of human antibodies Considering the medium half-life (several weeks in the case of IgG), a sustained effect can be expected. For example, during the disease's life cycle (eg, after myocardial infarction or PTCA, several days to several months) May be a moon. In such a case, the antibody necessary to eliminate GPVI on the platelet surface should be removed to such an extent that the reactivity of blood platelets to collagen is partially, preferably completely, blocked.
  • the parenteral-administered composition usually contains an acceptable carrier, preferably a solution of immunoglobulin dissolved in an aqueous carrier or a mixture thereof.
  • aqueous carriers such as water, buffered ice, phosphate buffered saline (PBS), 0.4% saline, 0.3% glycine, human albumin solution and the like can be used.
  • compositions can be sterilized by conventional, well-known sterilization methods.
  • the composition may be prepared as required to reach physiological conditions, as required by pharmaceutically acceptable scavengers, such as pH regulators and buffers, toxicity regulators, etc., e.g. sodium acetate, salt sodium May contain salt, sodium chloride, calcium chloride and sodium lactate.
  • pharmaceutically acceptable scavengers such as pH regulators and buffers, toxicity regulators, etc.
  • concentration of antibodies in these formulations varies widely, ie, from less than about 0.05% by weight (typically at least about 1% by weight) to as high as 15 or 20% by weight.
  • compositions suitable for lavage or other routes are selected according to the specific use intended.
  • Some pharmaceutical compositions may contain an anti-GPVI antibody and other therapeutic agents commonly used in the disease. In either case, continuous administration of porous injection may be applied.
  • the prophylactic or therapeutic effective dose is determined according to the target disease, the condition and the condition of the patient.
  • the antibodies of the invention can be frozen or lyophilized for storage and reconstituted in a suitable carrier prior to use. This technique is known to be effective in conventional immunoglobulins, and known lyophilization and reconstitution techniques can be used. Lyophilization and reconstitution can lead to various degrees of antibody activity loss (eg, conventional immunization) Globulin, Ig M antibody ⁇ , Ig G antibody tend to cause greater loss of activity), and that usage levels may have to be adjusted to capture it This is to be recognized by those skilled in the art.
  • the method of detecting GPVI in a test specimen using the antibody or antibody active fragment of the present invention comprises a step of contacting a test sample with the antibody of the present invention or an active fragment of the antibody, or the antibody or antibody of the present invention.
  • the method may further comprise a step of quantifying GPVI in the test sample.
  • Methods for detecting GPVI in a test sample using the antibody of the present invention include Sandwich ELISA system, Inhibition ELISA system, fluorescence anti-method, immunohistochemical staining method, radiolabeled immuno-antibody method, Western Plotty : ⁇ Method, immunoprecipitation method, etc., but are not limited to these.
  • the test sample to be tested is not limited, but biological samples are used.
  • the body fluids of animals, especially humans, or tissues, cells and fungi, and their extracts, culture supernatants, and powders are used. Specimens * 5 and sections are listed, but 'platelet or plasma or serum is preferred'.
  • Example 1 The present invention will be described in more detail by the following examples, but the present invention should not be understood as being limited to these examples.
  • Example 1 The present invention will be described in more detail by the following examples, but the present invention should not be understood as being limited to these examples.
  • GPVI extracellular domain-Fc fusion protein production A. Preparation of human GPV I extracellular region-mouse Fc fusion protein (hG PVI-mFc) (1) Construction of hGP V I-mFc fusion protein present plasmid
  • MIgG2a-a SEQ ID NO: 152
  • mIgG2a-c SEQ ID NO: 154
  • mIgG2a-b SEQ ID NO: 153
  • mIgG2a-e SEQ ID NO: 156
  • mIgG2a-d SEQ ID NO: 155
  • U3 ⁇ 4IgG2a-g SEQ ID NO: 158
  • amplification products DNA fragments encoding heavy chain constant region (Cy2a) linked to each domain.
  • amplification product is pT7-BlueT vector
  • the DNA fragment encoding the mouse Fc region was excised with the restriction enzymes Bam HI and Kpn I to prepare the fragment ⁇
  • the DNA fragment encoding the extracellular domain of human GPV I from the pCAGGS-GPV I-Fc plasmid was excised with restriction enzymes Xba I and: Bgl II to prepare fragment B.
  • fragments were digested with Xba I and Kpn I, and fragment A + fragment B downstream of the EF promoter of the expression vector pEF2cew prepared.
  • the plasmid (pTK-2249) expressing hGPV I-mFc (SEQ ID NO: 222) was constructed (2) Expression purification of hGP V I-mFc fusion protein
  • COS-1 cells were subcultured in 10% fetal bovine serum human Rubecco MEM medium, and pTK-2249 was mixed with an appropriate amount of Transfusion reagent (FuGENE6, Roche Diagnostics). Later, transfection was performed by dripping in serum-free Dulbecco's MEM medium and replacing it with culture. 5% C0 2 presence and cultured for 3 days at 37 ° C, protein A column the culture supernatant of its (Prosep - A, MILLIP0RE) was the original anti-human GPV I antibody for producing a material obtained by spinning at .
  • primers mGP V I-e SEQ ID NO: 161
  • mG-PVI-q SEQ ID NO: 171
  • mG PVI-r cathode [J number 172)
  • mG PVI-s catalyst U number 173
  • mG PVI-c and PCR reaction was performed to obtain an amplified product in which each fragment was ligated, and this amplified product was cloned into the pT7-BlueT vector to obtain pTK-2437.
  • 2437 Mouse G ⁇ VI
  • the gene region containing the outer domain has a recognition site for the restriction enzyme Nhe I on the 5th side and a recognition site for BamHI on the 3 'side.
  • the DNA fragment was prepared by cleaving with these enzymes.
  • the mouse mGPV I—Fc ego plasmid (pTK—240) was constructed by pulsing this fragment with pTK-2233 prepared by digestion with restriction enzymes Xba I and Bam HI.
  • D. Force-quizal GPV I extracellular region-human Fc fusion 3 ⁇ 4 Construction of white matter expression plasmid (1) Construction of the power two quizanore D1D2-human D3 chimeric GPV I-human Fc fusion protein expression plasmid Based on the genetic information of human GPV I, which is a known sequence, appropriate primer pairs are designed and prepared. Using these human GPV I primers, a PCR reaction using the genomic DNA of Riki quizanore as a saddle is performed. By doing so, a part of the force-quizal GPVI gene IJ was determined.
  • amplification product M was obtained by PCR reaction using pTK-2233 as a saddle type and macG ⁇ V Ih (SEQ ID NO: 179) and IgGl-i (J (183)). The product was mixed to form a cocoon, and PCR with macGPV Ia and IgG ⁇ i was performed again.
  • the amplified product obtained by this operation was D1 and! PTK-2233, which contains the chimeric GP VI gene combined with human 1) 3, and cleaved with restriction enzymes Nhe I and Bam HI and then with restriction enzymes Xba I and Bam KI.
  • h GPV I-mF prepared in Example 1A. Dilute 20 ⁇ in 500 ⁇ l of saline and mix with 500 / X 1 bronze complete adjuvant (DIFCO), then female New Zealand white rabbit (Kitayama Labes) 2. 1 1 2. 2 kg subcutaneously on the back. After 2 hours, again dilute 20 ⁇ g of hGPV I-mF c in 500 ⁇ l of physiological saline, mix with an equal volume of 5 001 Freund's incomplete adjuvant (DI FCO), and then subcutaneously Administered.
  • DI FCO Freund's incomplete adjuvant
  • the obtained fraction was neutralized quickly with 1M Tris-HCl buffer (pH 7.0), dialyzed with D-PBS, and the protein concentration was calculated from the absorbance at 28 O nm (extinction coefficient: 0 7 1 4mg / mL).
  • the obtained antibody is referred to as an anti-GPVI polyclonal antibody.
  • GPV I—mFc 2 O g and Freund's complete adjuvant (D I FCO) were mixed in equal amounts to give the antigen to be administered.
  • Female d dY mice (8 weeks old, SLC) were administered the administration antigen twice, and 3 days later, lymphocytes were separated from lymph nodes. The resulting lymphocytes were mixed with ⁇ 3 X 6 3 -Ag. 8 .U 1 (ATTC) and then used with polyethylene glycol (PEG 1 500, Sigma). Cell fusion was performed according to “Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedure” (Kodansha, p. 8 3). Hybridomas were selected by HAT medium, and one week later, hybridomas producing the desired antibody were screened by two methods. That is, the binding activity to hGPV I-hFc immobilized on a plate was used as an indicator: the ⁇ method and the method using the binding inhibitory activity between collagen and GPV I as an indicator.
  • HGPV I—hF c prepared in Example 1 B was diluted to 2 ⁇ g / mL with D— ⁇ S, and added to an immunoplate (Maxisorp, NUNC) at 50 ⁇ L / well. 3 After reaction at 7 ° C for 1 hour, wash 5 times with deionized water L, 100 ⁇ L of D—PBS (pK 7.4) containing 2% Stabi 1 Guard (Surmodics) in each well Added and blocked. Then add the culture supernatant to ⁇ & Well, 3 After reacting at 7 ° C. for 1 hour, the plate was washed 3 times with physiological saline containing 0.05% Tween 20.
  • Peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (DA3 O, P 2 60) was diluted 1000-fold with D-PBS containing 10% Usagi serum, and 5 ⁇ l / i L was added to each flask. 3 After 1 hour of reaction at 7 ° C, wash 5 times in the same manner and add TMB solution (BioFix) to each well. After reacting at room temperature for 10 minutes, the reaction was stopped with 0.5 M sulfuric acid solution, and the plate spectrophotometer (Multiscan JX, Dainippon Pharmaceutical) was measured for absorbance at 450 nm.
  • DA3 O Peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody
  • Collagen (Ho rn) was diluted to 10 ⁇ g / mL with D-PBS, and 50 L / well was added to the immunobrate (Ma X isorp, NUNC). After reacting overnight at 4, it was washed 5 times with ion-exchanged water and blocked with D-PBS containing 5% BSA. Next, add 25 ⁇ LZ well of the culture supernatant, add 25 L / well of hGPV I—hF c prepared to 2 z gZ mL with D—PBS, and react at 37 ° C for 1 hour.
  • Hybridomas that produce anti-GP VI antibodies should be cultured in 10% FC SZRPM I-1 S40 medium (Sigma) and then replaced with Hybrido ma—S FM medium (Inv ⁇ trogen).
  • the antibody was purified from the culture supernatant using a protein A column (Prosep-rA, Millipo).
  • the obtained culture supernatant was applied to a protein A column (P rosep—A, Mi 1 1 ipore) previously equilibrated with D—PBS, and the non-adsorbed protein was treated with D—PBS. After washing, the adsorbed surface was eluted with 25 mM glycine monohydrochloride buffer (pH 3.0).
  • hGPV I-hF c was diluted to 2 g / mL with D—PB S>, and 50 ⁇ L / tool force B was applied to an immunoplate (M axis + rp, NUNC). After reacting at 37 ° C for 1 hour, the plate was washed 5 times with ion exchange water, and D—PBS containing 2% Stabi 1 Guard was added to each well and blocked. The next, above the labeled antibody 25 mu L each purified antibody 25 ⁇ L was added to Ueru, After 1 hour at 37 ° C, 5 times with physiological saline containing 0.
  • Group i is competing with (i), (ii), (v), (vii i) as group a.
  • Group b is the one that conflicts with (i), (v) and (vii). Labeled antibody
  • the group that competed with (i), (ii), (vii), (viii) was designated as group c.
  • the group that competed with labeled antibodies (iii) and (iv) was designated as group d.
  • the labeled antibodies (iii) and (vi) were designated as group f.
  • Group g and Group h were those that did not show the rule 'I'.
  • Group G and Group h were classified as 3 IJ groups because they did not compete with each other. Therefore, the anti-GPVI monoclonal antibody produced was It was confirmed that at least 8 types of areas on the surface of GPVI were recognized and laid out Example 4
  • the dissociation constant of the anti-GPV I monoclonal antibody prepared as described in Example 2 was measured using a protein interaction angle analyzer BI ACORE 3 000 (BI ACORE>.
  • the GPV I substitutes (hGPV IH HH-h F c and F FH -h F c) prepared in Example 1 were bound to a CM 5 chip (BI AC ORE) according to the manual. Dilute with EP buffer (BI ACORE) and prepare a dilution series from 1. 25 to 40 nM and analyze with EI ACORE 3 00 00.
  • Example 2 the anti-GPV I polymorphic antibody obtained in Example 2 was labeled with peroxidase as in Example 3.
  • an anti-GPVI polyclonal antibody-immobilized plate was prepared. Specifically, the antibody was diluted to 10 ⁇ g / ⁇ L with D-PBS, added to each well of an immunoplate (Maxisrp, NUNC), and allowed to react at 45 ° C. for 30 minutes. Next, the plate was washed 5 times with ion-exchanged water, and blocked by adding 100 L of D-PBS containing 2% Stable Guard (Surmodics) to each unite.
  • Human GPV I ( ⁇ part of the amino acid sequence was replaced with mouse amino acid sequence (J), and the recognition region of the anti-GPV I antibody was narrowed down by changing the reactivity of the antibody by 1 ⁇ .
  • the extracellular region of GPV I, a platelet membrane protein, is an immunoglobulin-like region 1 or 2 (may be referred to as domain 1 or D 1, domain 2 or D 2 2) and a mucin-like region (domain 3) Or D 3) (Fig. 1). Therefore, we created a body for each domain, and conducted anti-PVI antibody binding experiments for each domain. went.
  • human GPVI was modeled to predict the region structure into which amino acid mutations can be introduced (Fig. 1). Then, human GP V I and mouse G: P VI amino acid substitution expression plasmids in these loop regions were constructed, and anti-GPV I antibody binding experiments were conducted for each substitution. As a result, it was possible to confirm the domain and loop region of GP V I recognized by each GPIII monoclonal antibody. In the present specification, GPVI domain or amino acid substitution mutants may be simply referred to as GPVI substitutes. Table 3. The amino acid sequence of each loop in human soluble GPVI domains 1 and 2.
  • HG PV I-hFc prepared in Example 1 (hereinafter referred to as GPVI- ⁇ -hFc,
  • Expression plasmid ( ⁇ 2233) and mGPV I-hFc (hereinafter referred to as GPV I-MMM-hFc), SEQ ID NO: 136) expression plasmid (P TK2440) and ⁇ , was constructed GPV I substituents expression plasmid obtained by substituting the domain of the human G PV I and mouse GPV I.
  • GPVI-MHH-hFc a GPVI substitution
  • GPVI-MHH-hFc a GPVI substitution
  • Sense primer 1 Table 4, SEQ ID NO: 184
  • mouse GPVI domain 1 C-terminal 15mer and human GPVI domain 2 N-terminal 15mer linked to mouse GPVI PCR was performed using the antisense primer 3 (Table 4, SEQ ID NO: 186).
  • a DNA fragment (417 bp) of domain 1 of VI was amplified.
  • antisense primer 2 (Table 4, SEQ ID NO: 185) designed on the hFc sequence with pTK2233 as a saddle type, and mouse GPVI domain 1 C-terminal 15mer and human GPVI domain 2 N-terminal 15mer PCR was performed using Sense Primer 4 (Table 4, SEQ ID NO: 187) linked to human GP.
  • a DNA fragment (571 bp) up to the N-terminal side of domain 2, domain 3, and hFc of V I was amplified.
  • sense primer 1 and antisense primer 2 mouse GPV I domain 1, human GPV I domain 2, domain 3, hFc N
  • a DNA fragment (973 bp) linked to the terminal sequence was amplified.
  • This amplified DNA fragment was cleaved with restriction enzymes Xbal and BamHI and inserted into the Xbal and BamHI sites of pTK2233 to construct a GPV I-MHH-hFc expression plasmid.
  • GPV I domain 1 is human
  • domain 2 is mouse
  • domain 3 is human sequence
  • GPV I substitute hereinafter referred to as GPV I-HMH-hFc, SEQ ID NO: 138
  • GPV I domain 1 and domain 2 are mouse and domain 3 is human GPVI substitution (hereinafter referred to as GPVI-MMH-hFc, SEQ ID NO:
  • a GP I-substituted expression plasmid in which one loop region that can be a recognition region of an anti-GPV I monoclonal antibody was substituted with the corresponding amino acid sequence of mouse GPV I was constructed as follows. First, the human GPV I lure. Sense primer that replaces the amino acid sequence of human with the mouse amino acid sequence in region L2 ⁇ : Substituting the base sequence and linking the base sequence of 11mer upstream and 13mer human GPVI downstream 10 (Table 4) and antisense primer 9 (Table 4) were produced.
  • PCR was performed using pTK2233 as a saddle and using sense primer 1 and antisense primer 9, and the loop region L2 was replaced with the mass sequence of human GPVI N-terminal DNA fragment (215 bp) Was amplified.
  • pTK2233 is used as a saddle type, PCR is performed using sense primer 10 and antisense primer 2, and loop region L2 force S of human GP ⁇ I replaced with S mouse sequence A DNA fragment (773 bp) in which the N-terminal sequence of hFc was linked to the C-terminal region was amplified.
  • PCR was performed after the two amplified DNA fragments, sense primer 1 and antisense primer 2, and DNA in which the loop region L2 was replaced with the mouse sequence was linked to the N-terminal sequence of hFc.
  • a fragment (958 bp) was amplified.
  • This amplified DNA fragment was cleaved with the IJ restriction enzymes XbaI and BamHI, inserted into the XbaI and BamHI sites of pTK2233, and the GPV I region L2 was replaced with the mouse GPV I amino acid sequence.
  • Substrate hereinafter referred to as hGPV I-mL2-hFc, SEQ ID NO: 46
  • An expression plasmid was constructed.
  • hGPVI-mL14 -hFc. N-terminal SEQ ID NO: 1 84 SEQ ID NO: 21 4
  • Example 7 The GPV I-substituted plasmids pTK2233 and TK2440 constructed in (1) and (2) were introduced into COS-! _ Cells in the same manner as in Example 1 for expression. From the resulting culture supernatant, the desired GPV I-substituted product was purified using “Koutin A column (Prosep-A, Millipore). The degree of purification of the obtained GPV I-substituted product was both reduced and non-iS source. SDS-PAGE was performed under conditions and confirmed by silver staining.
  • a rabbit anti-human IgG antibody (DAKO) was immobilized on a plate (Maxisorp, Nunc) with g / raL and then blocked with 2% StabiliGuard (SurModics).
  • GPVI substitute diluted with 0.1% BSA / PBS, and react at 37 ° C for 1 hour. Wash with 0.9% saline containing 0.05% Tween-20, block with 1% human serum (Cosmo Bio) diluted with 0.1% BSA / E3 ⁇ 4S for 1 hour at 37 ° C, and again
  • the peroleoxidase labeled antibody prepared in Example 3 was diluted to 0.5 / ⁇ with 0.1% BSA / PBS, and added at 37 ° C. : Reacted for 1 hour. Finally, after washing with 0.9% saline containing 0.05% Tween-20, The color was developed using H202 / TMB solution, the reaction was stopped with 0.5 M sulfuric acid, and the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm.
  • domain 1 was replaced with Maces GPVI GPVI -MHH- Fc, GP VI-MMH -The binding activity to hFc and GP V I- MM-hFc was significantly reduced. This revealed that the recognition region of these antibodies resides in domain 1 of GPVI.
  • the F1232-7-1, F1232_19-1, F1232-37-2, F1232- 17—1, F1232—18—3, and F1232-241 the GPV I- with domain 2 replaced with mouse GPV I- -HFc, GP
  • Table 5 shows the antigen recognition region of each anti-GPVI antibody.
  • GP VI Company- hFc, GP VI-mL2- hFc, hGP VI— mL3- hFe, hGP VI-mL4- hFc, hGPV I— mL5-hFc, hGP VI one mL6— hFc, hG PVI one raL7— hFc, hGP VI 1 mL8-hFc, hGPV I— mL9-: hFc, hG PVI -rnLlO-hFc, hG PVI -mLL 1 1 hFc, hGP VI-mL13- hFc and hG P "I -mL14-hFc and each anti-GPVI monochrome The binding activity with a single antibody was measured.
  • the measurement method is the same as the method described in Example 7 (4), and the peroxidase-labeled antibody prepared in Example 3 is adjusted to a concentration that can be measured according to the affinity of each antibody for GPV I-HHH-hFc. It was diluted with O.1% BSA / PBS and used. As a result, F1232- 10-2,
  • Each anti-GPVI monoclonal antibody prepared in Example 2 was treated with (About 6 kg) were administered intravenously at 0.3 mg / kg and lrag / kg at 24-hour intervals. Blood samples were collected before administration, 24 hours and 48 hours after the first administration, and the reciprocal number of blood clot, expression level of CD62P protein (platelet activation marker), platelet membrane protein (GPIlb / IIIa; CD41a and GPV I; CD42a) The expression level, the expression level of platelet GP VI, and the platelet aggregation ability (reactivity to collagen and ADP) were measured.
  • CD62P protein platelet activation marker
  • platelet membrane protein GPIlb / IIIa
  • CD41a and GPV I CD42a
  • the number of platelets in the collected citrate blood was measured using Sysmex F-820. Clone No. F 1 232— 1 8— 3, F 1 232— 3L 0— 2, F 1 232— 14 1 2, F 1 2 32— 43— 3, F 1 201— 20, F 1232— 37— 2 No decrease in platelet count was observed in the animals treated with the drug (decrease rate was less than 20%; indicated by 1 in Table 6). In addition, a decrease in the number of platelets was observed in monkeys treated with F 1 201-18 and F 1232-1 7-1 (reduction rate was 2 O% to 40%; indicated in soil in Table 6) .
  • Plated Rich Plasma was prepared by centrifuging the collected citrate phlebotomy at 100 g at 25 ° C. for 2 O minutes. Is PRP 0.5% inactivated so that the platelet count is 1 X 10 8 cells / mL? After diluting with PBS containing 8 ⁇ and 2.5 ml VI EDTA (hereinafter referred to as FACS buffer), anti-human CD62P—PE (BD: Biosciences Pharmingen) was used to reduce the expression of CD 62 P protein on the platelets. Investigated with AC S.
  • CD41a and CD42a protein expression levels on monkey platelets were measured by preparing PRP in the same manner as CD 62 P, and using anti-human hCD41a-FITC (BD Biosciences Pharmingen) and anti-human CD42a-PE (BD Biosciences).
  • PRP showed no effect on the expression of CD41a and CD42a proteins (the rate of disappearance after administration of lmg / kg was less than 30%; indicated by one in Table 6).
  • the loss rate is 70% or more; indicated by a toe in Table 6), especially F 1 232— 7— 1, F 1232— 18— 3, F 1232— 1 0 2, F 1 232— 21— 1, F 1232- 43-3, F 1 232— 17-1 and F 123 2-19-1 were prominent (disappearance rate after 0.3 mg / kg administration was 70% or more; indicated by ++ in Table 6) .
  • blood samples were collected from monkeys administered with F 1232-24-1, F 1232-1 4-2, and prepared PRP [where partial disappearance was observed (the disappearance rate after administration of lmg / kg 30% to 70%; displayed as soil in Table 6).
  • Platelet agglutination positive for collagen and ADP was measured using a platelet aggregation analyzer (PA-20O Aggregation Analyzer, Kowa) "First, physiological saline so that the platelet count of PRP would be 3 X 108 cells / mL After diluting with a solution, add a final concentration of IraM CaCl2 solution. Added and incubated at 37 ° C for 3 minutes. Further, a collagen solution having a final concentration of ⁇ g / ml or an ADP solution having a final concentration of 10 ⁇ was added and incubated at 37 ° C for 12 minutes.
  • PA-20O Aggregation Analyzer Kowa
  • Platelet aggregation rate was determined by measuring light transmittance with PA-200 Aggregation Analyzer (Ko a). As a result, blood was collected from monkeys administered with F 1 2 32—7-1 and F 1201—: 20, and the prepared PRP showed a decrease in collagen-responsive blood micronucleus aggregation ability (lmg / kg administration). The disappearance rate after 70% or more; indicated by 10 in Table 6), especially F 1232—18—3, F 1232—10—2, F 1232-21 one 1, F 12
  • F 1232- 43-3, F 1232- 37-2, F 1 232-17-1 and F 1232-19-1 were prominent (the rate of decrease after administration of 0.3 mg / kg was 70). % Or more; displayed in Table 6 as ++).
  • partial reductions were observed in the PRP collected from the blood administered with F 1232-24-1 (reduction rate after administration of lmg / kg was 30% to 70%; Table 6 ⁇ r Displayed in soil).
  • F 12 32-14-2 showed almost no effect on platelet aggregation (disappearance rate after administration of lmg / kg was less than 30%; indicated by 1 in Table 6).
  • the following shows an example of determining the ⁇ ”mino acid sequence of the variable region of an anti-GPVI antibody (clone No. F1232-7-1).
  • the amino acid sequence of the variable region can also be determined using the same experimental procedure for other anti-GPVI antibodies. It was determined.
  • RNeasy Micro Kit (Qiagen) is extracted from a noprido that produces the desired anti-GPV I monoclonal antibody, and total RNA is extracted, and then extracted with the Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR kit (Invitrogen). Main chain cDNA was synthesized. Mouse Ig-Primer Set using the obtained single-stranded cDNA as a cage
  • variable region was amplified by PCR by (Novagen) and the base sequence was determined.
  • the ⁇ blueprint near the starting code ⁇ searched the database for sequence information and designed a 5 'primer (' F1232-7- 1 heavy chain 5 'primer: 1232H-b (Sequence No. 216), light chain 5′-side primer ′ 1: 1232K-a (SEQ ID NO: 218)).
  • the 3 'sequence of the variable region is a restriction enzyme recognition site that can be linked to the human constant region without changing the amino acid sequence J (heavy chain is Nhe I recognition sequence, light chain is Bsi WI recognition sequence) )
  • was designed (F1232-7—1 heavy chain 3, side primer: 1031H-b (SEQ ID NO: 217), light chain 3 ′ primer: mlgK-BsiWI (SEQ ID NO: 219)).
  • PCR is performed again using these new primers to amplify the heavy chain variable region and light chain variable region.
  • the base sequences of the heavy chain variable region and the light chain 3 ⁇ 4 ⁇ variable region are determined according to a conventional method, the base sequences (heavy chain variable region; SEQ ID NO: 87, light chain variable region; SEQ ID NO: 88) and the encoded sequences thereof.
  • amino acid sequence (heavy chain variable region: ⁇ ; SEQ ID NO: 111, light chain variable region; SEQ ID NO: 112) is also shown, and the base sequence and amino acid sequence of the other clones other than F1232-7-1 were determined in the same manner. (Table 7).
  • Tables 8 and 9 show the sequences of CDR portions in the amino acid sequence of the variable region.
  • the number in the box after the sequence represents the sequence number.
  • An antibody (chimeric antibody) was prepared in which the V region having antigen-binding activity was derived from a hybridoma antibody, that is, derived from a mouse antibody, and the c region was derived from a human.
  • Anti-GPVI antibody (clone NO. F1232-7-1) A mouse-human killer antibody expression plasmid was constructed as follows.
  • pTK-2464 was cleaved with restriction enzymes EcoR I and he I to prepare gene fragment C encoding a heavyweight variable region.
  • pTK-2232 (see TO20O5 / 78O0 Example 10) was cleaved with restriction enzymes Eco 47 ⁇ and Bam HI to prepare gene fragment D encoding heavy chain constant region ((: 4)).
  • a heavy chain ego plasmid (pTK-2468) was constructed by ligating the fragment of this fragment with EcoR I and Bam HI into the expression vector pEF2cew downstream of the EF promoter downstream of the EF promoter. did.
  • pTK-2466 was cleaved with restriction enzymes EcoR I and BsiW I to prepare DNA fragment E encoding the light chain variable region.
  • PCR was performed with the ⁇ primer BsiWI-hlgK (SEQ ID NO: 220) and IgK-e (SEQ ID NO: 221), and the human light chain constant region (CK) was cloned into pT-7BlueT.
  • pT7_hIgK was cleaved with restriction enzymes Bsi WI and Bam HI, and DNA fragment F was prepared.
  • Each light chain expression plasmid (pTK-2474) was constructed by ligating downstream of the EF promoter of the expression vector pEF2cew prepared by cutting Bam HI so as to be fragment E + fragment F.
  • mouse-human chimeric antibody expression plasmid was carried out in the same manner as described in Example 1. That is, the plasmid and light chain expression plasmid of mouse-human chimeric antibody of the desired clone were cotransfected into COS-1 cells, cultured at 37 ° C for 3 days, The culture supernatant was purified with a protein A column. The resulting mouse-human chimera is SDS-? A After purification by GE, the binding ability to human GP VI and monkey GP VI was confirmed.
  • the GPV I-substituted product, hGPV I-h F c or GPV I—F FH-h F c prepared in Example 1 was diluted to 2 g / mL with D—PB S, and the immunoplate (Maxisorp, NUNC ) Was added 50 LZ uel.
  • the immunoplate Maxisorp, NUNC
  • framework residues are selected according to the general method of Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029, 1989).
  • the human eye G ⁇ 'J is a mouse anti-GPV I monoclonal antibody based on the light / heavy chain sequence database of Kabat et al. (Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed., US Department of Health and Human Services, 1991). Select a sequence with high framework homology to (Clone No. F1232-7-1).
  • the amino acid in the most suitable framework is modified by computer analysis. Specifically, the computer program ENCAD (Levitt, J. Mol. Boil. 168 * 595 (1983)), Ho thighology (Accelrys), FAMS (SG I
  • the molecular model of the F 1232- 7-1 antibody variable region is constructed using a protein modeling tool.
  • CDR and F on the Yupputer model differ from the original human antibody model by performing amino acid substitution in the FR region that shows significant contact. Contact force between CDR and FR is improved.
  • amino acid residues in FRs that appear rarely at that position in the human antibody database are substituted with amino acids derived from mouse antibodies. Substituting with sans amino acids Since the quality of amino acid substitutions will be confirmed by actual life, several types of antibodies with different amino acid substitutions are produced.
  • Example 1 Based on the sequence selected in 1 A (1), a gene encoding an amino acid sequence including a signal peptide, a splice donor signal and a restriction site (for example, Eco RI) is constructed.
  • the constructed gene is prepared so that several kinds of synthetic nucleotides (about 80 base length) overlap. That is, the oligo is paired and annealed and extended with a DNA polymerase K 1 enow fragment to obtain a double-stranded fragment. This fragment is denatured to form a single strand, and then similarly treated and extended with a K1enow fragment of DNA polymerase to obtain a double-stranded fragment encoding the full-length gene.
  • the resulting fragments are amplified by PCR, and after purification, they are cleaved with restriction enzymes (eg Eco RI and Nhe I) and purified.
  • the purified fragment was ligated with a gene fragment containing human IgG4 constant region gene (CT / 4) from CHI exon to CH 3 exon (eg, pTK-2232 cut with Nhe I and BamHI), and EF of expression vector pEF2cew
  • CT / 4 human IgG4 constant region gene
  • a humanized heavy chain expression plasmid is constructed by incorporating it downstream of the promoter (cut by Eco RI and BamHI).
  • amino acid mutations can be introduced into the expression plasmid by site-directed mutagenesis.
  • the light chain variable region sequence can be constructed in the same manner as described above.
  • the seven C ⁇ region was excised from pT7-hlgK and expressed in the expression vector P EF2cew It is linked to the light chain variable region sequence downstream of the EF promoter.
  • the heavy and light chain plasmids were cleaved with restriction enzymes and linearized, and then in mouse myeloma cells S p2_0-ag 1 4 (ATCC C RL 1 5 8 1) Introduced using Heigen Pulser (BI ORAD). For example, approximately 20 ⁇ g of the linearized DNA fragment is electroporated onto a 1X10 7 cell with a capacitance of 360 V and 25 ⁇ FD. Next, inoculate the cells into a 96 3 ⁇ 4 plate, and after culturing for 2 days, select 10% FCS, IX
  • Carry D-EM (Sigma) containing My cophenolicacid and incubate for another 2 weeks.
  • Select the target cell line that produces the human F-1232-7-1 antibody by analyzing the antibody in the supernatant after culturing.
  • Sunaochi combined with GPV I antigen the antibody is immobilized in the culture supernatant, to detect antibodies that bind with Bae Les oxidase-labeled anti-human I g G4 antibodies.
  • the antibody-producing cell line with binding confirmed is cultured in a medium containing 10% FCS until confluent and replaced with serum-free medium (Hybridoma S FM, Invitrogen).
  • the culture supernatant is collected, and the antibody contained in the culture supernatant is bound to protein A (Prose p-A, Millipo) and eluted with 0.1M glycine hydrochloride (pH 3.0).
  • the purified antibody is dialyzed against PBS- (Sigma), and the antibody concentration is calculated from the absorbance of 28 Onm (the antibody lmgZmL shows an absorbance of about 1 ⁇ 3).
  • the method of transplanting together the sequence of the original FR region is also effective.
  • Which amino acids are involved in maintaining the domain structure can be estimated from the nature of the amino acids in the FR (hydrophobic, hydrophilic, acidic, basic, molecular, etc.) and can be estimated by computer modeling In other words, modeling is performed using software QUAN TA / CHARMm or Modeler (Silver Simulation) that runs on silicon graphics.
  • B ro ok haven P rotein Data Bat Ban (P DB ) Search for the three-dimensional structure of the antibody having high homology with the VH and VL regions of the F1232-7-1 antibody from the human antibody sequences registered in), and based on that, the three-dimensional structure of the F1232-7 antibody A group of amino acids in the FR region (group 1) that are ⁇ K-bonded to the CDRs of the heavy and light chains on the putative three-dimensional structure are selected, and are also water-binding to them.
  • the constructed gene is a combination of Amersham kit (Oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis system version 2) and PCR, a method of amplifying several kinds of long-chain synthetic nucleotides together, VH or VL gene of chimeric antibody
  • the amplified gene A full-length gene fragment is obtained by using a child fragment as a saddle type.
  • the obtained amplified gene fragment was ligated with the constant region fragment of the plasmid described in Example 1 1A (2) (pTK-2232, ⁇ : pT7-IgK), and the EF promoter of the expression vector pEF2cew— -A humanized antibody expression plasmid is constructed by incorporating it downstream.
  • the prepared plasmid is introduced into cells by the method described in Example 1 1A (2) to obtain a transformant, and a purified antibody is prepared in the same manner. In addition, the antibody is evaluated in the same manner as in Example 1 1A (3).
  • GP VI deficient patients (Tateo Sugiyaraa, 5 others, Blood, (USA), 1987, 69th, No. 6, p. 1712—172 0) Antibiotics in blood
  • the recognition domain analysis of the GPV I antibody was performed using various recombinant proteins.
  • Patient-specific purified anti-diaphragm: and recombinant human substitution described in Example 7 were mixed and allowed to invert on a polypropylene plate for 2 hours at 37 ° C.
  • 50 juLZ was added to a recombinant hOPV I-hFc solid phase plate prepared in the same manner as described, and allowed to react at 37 ° C for 1 hour.
  • peroxidase-labeled anti-human c and L chain antibodies were diluted 100-fold with D—PBS (pH7.4) containing 10% Usagi serum to each well. Add 50 ⁇ L. After reacting at 37 for 1 hour, the absorbance was measured in the same manner as described in Example 2. Nami (compared with constant absorbance of the recombinant human G ⁇ VI loop without the addition of recombinant human G ⁇ VI loop, and GPV I deficient patients from the results of the loop substitution that showed no or no decrease in absorbance. The antigen recognition site of the anti-GVI antibody contained in each autoantibody was estimated.
  • mice anti-human GPVI monoclonal antibodies F 1 199-6 and F 1 232—37-2 prepared by a method similar to that described in Example 2 are included in GPVI-deficient patients. Competed with anti-G ⁇ VI antibodies. The results are shown in 13 ⁇ 4.
  • Example 13
  • lymphocytes were separated from the lymph nodes or spleen, and cell fusion was carried out in the same manner as described in Example 2 to select a hybridoma.
  • Example 1 Prepared purification: hGPV I _hF c or h GP VI—mL9—hFc diluted with D—PB S (pH 7.4) to g Zm L and diluted with immunoplate (Ma X isorb, NUNC) with 50 LZ wells. Then, it was solid-phased in the same manner as described in Example 2. Next, the culture solution was added to each well and allowed to react at room temperature for 1 hour, and then the method described in Example 2 was used.
  • hGP V I-mF c fusion protein or L 9 and L 11 loops derived from human [rat GPVI-m F c fusion protein substituted with J (ratG PVI -hL9 / hll-mFc) (self-column number 288) was used as the administration antigen.
  • Rat VI is rat bone marrow
  • the RNA was made into a saddle type, cDNA was synthesized by a transcription reaction using a Rigo dT primer, and then the full-length gene was squeezed by PCR using this as a saddle type.
  • the primer pairs used for PCR are (mG PVI—a: CCACATAGCTCAGGACTGGG (SEQ ID NO: 289), mG I 3 V
  • Example 14 One week later, it was screened by the method described in 14 above with a high-pridoma producing the desired antibody. As a result, purified human GPV I-hF bound to purified human GPV I-hFc (absorbance 1 or more Jn), and L9 was replaced with mouse L9. Selects cells producing antibody and clones by the method described in Example 2 to produce rat anti-human GPV I antibody. Got. In the same manner as in Example 2B (3), the obtained hyperidoma was cultured, and the monoclonal antibody was purified. The subtype of each antibody was determined using Rat MonoAB ID / SP Kit (ZYMED). Example 14
  • Example 13 In order to analyze the characteristics of each antibody obtained in Example 13, binding to human GPV Ihc, competition with the F1232-37-2 antibody described in Example 4, and specificity for the L9 loop were determined. Examined. That is, the binding activity to human GPV I was measured for the binding activity to the immobilized antigen according to the method of Example 2. As for the binding activity, the absorbance was expressed as + from 0-5 to 1.0, from 1.0 to 2.0 as +10, and from 2 to O as +++.
  • F 1 F 1
  • a peroxidase (Froyobo) labeled antibody was prepared according to F 1232-37 1-2 according to the method of Nakane et al. (J. Histoch em-Cytoch em., 2 2, 1 084, 1974), and the amount of antibody used Based on this, the antibody concentration was calculated. Next, the peroxidase-labeled antibody was used to perform competitive assay with each purified antibody.
  • the L 9 loop specificity is measured according to the method described in 13-1 of Example 13, and when the reactivity decreases by 50% or more, it is determined that the L 9 loop is recognized. Table 11
  • Example 14 The dissociation constant of each antibody obtained in Example 14 was examined in the same manner as described in Example 5. The results are shown in Table 11 as relative values to the dissociation constant of F 1 2 3 2-3 7-2. Example 1 5
  • the amino acid sequence of the variable region of the anti-human G ⁇ VI antibody prepared in Example 13 was determined by the same method as described in Example 9. The clones obtained by determining the nucleotide sequence of the antibody variable region are shown in Tables 12 and 13 and the sequence table (see Table 14), and the CDR and variable region bases and the deduced amino acid sequence are shown.
  • Antibody variable region: ⁇ From the results of gene sequence analysis, these antibody sequences are considered to be derived from several types of constant antibody inheritance " ? ⁇ , And the repertoire selection of antibodies that recognize loop 9 of human GPVI 5 Table 1 2 Anti-GPVI antibody heavy chain CDR sequences
  • Base sequence of anti-GPVI monoclonal antibody variable region amino acid sequence clone number base sequence amino acid sequence
  • Expression plasmids prepared in the same manner as in Example 10 were introduced into COS-1 cells by the following method to carry out transient expression of chimeric anti-! ⁇ .
  • C F 1232- 18-3 Mae monoclonal antibody F1232- 18-3 mouse / human chimerized antibody is referred to as CF1232-18-3.
  • Other mouse monoclonal antibodies are also indicated in the same manner.
  • For expression perform co-transfection with heavy chain expression plasmid pTK-2471 and light chain expression lasmid ⁇ ⁇ -2475, and cF l 232— 4 3-3, c F 1232-10-1 or c
  • ⁇ -25 17 or ⁇ ⁇ -2510 and ⁇ ⁇ -2511 were c o- t r a n s f e e t i o n respectively.
  • COS-1 cells were planted in cell stack 1 O Channoichi (CORN I NG) in 2 ⁇ 1 XI O 6 ce 1 1 sZ stage, and cultured at 37 ° C for 4 days. After discarding the culture solution, the cells were washed twice with D-MEM, and the following FuGENE ZDNA / production medium mixture was added in an amount of about 1.3 L per chamber. FuGEN "E 6 (Roche Diagnostics) 2. Mix 12m 1 with the heavy chain expression plasmid and 530 g each of the light chain expression plasmid according to the protocol. nvitrogen) 1. Added to 3 L. After adding FxiGENE / DN AZ production medium mixture, culture supernatant was collected for 3-4 days at 37 ° C.
  • the specifically bound body is eluted with 100 mM glycine monohydrochloride buffer ( PH 3.0).
  • the volume of the eluate was measured, and 1Z10 volume of 1 MT ris—HC 1 (H 7.0) was immediately added to restore the pH to neutral.
  • the obtained sample was dialyzed against 0.9% NaC1 aqueous solution to obtain a purified sample.
  • cF 1 2 3 2— 4 3-3, c F 1 2 3 2— 1 0— 1 or c F 1 2 3 2— 1 8— 3 were purified.
  • Example 14 In order to compare the antigen-binding activity of the mouse / human chimeric antibody and the corresponding mouse monoclonal antibody, the oxidase-labeled F1232-37-2, F1232- 18-3, F1232-43 were used in the same manner as described in Example 14. -3 and F1232-10-1 and unlabeled mouse / human chimera corresponding to the binding reaction system between these labeled antibodies and solid phase f ⁇ hGPV I- hFc The binding activity of human monoclonal antibody 7re and the corresponding mouse / human chimeric antibody to human GP VI was compared by the method described in Example 14: 14_1 (Example 14: 1). As a result, as shown in Fig. 4, there was no difference between the two.
  • each antibody examined as shown in FIG. 5 inhibits the binding between GPVI and collagen.
  • the activity of inhibiting the binding between the chimeric antibody and the mouse hybridoma antibody GP VI and collagen was similar.
  • hGP VI-hF PVI prepared in Example 7 with peroxidase-labeled F1232-37-2 or CF1232-37-2 by the method described in Example 14 on a plate immobilized with 4 g / mL of hGP VI -hFc, mGP VI-hFc, hGP VI-mL3-liFc, or hG PVI -K59E-hFc prepared by the same method as described in Example 1 (Replace the 59th lysine of human GPVI with glutamic acid The 1 amino acid mutant human GPVI extracellular domain and human Fc fusion protein) were diluted with 0.1% BSA / PBS, mixed, and added to the plate, followed by reaction at 37 ° C for 1 hour. After the reaction, color was developed using a TMB solution, and the absorbance was determined by measuring the absorbance at 450 nm.
  • the measurement method was performed according to the method of 17-3.
  • the resulting PRP was diluted with PPP to PRP so that the concentration of platelets becomes 3.33 X 10 8 cells / mL, and ⁇ Ka ⁇ the antibody a final concentration of 1 ⁇ 10 ⁇ ⁇ / ⁇ , 37 ° C Incubated for 30 minutes. After incubation, paraformaldehyde (final concentration 1%) was added and fixed at 4 ° C for 1 hour. 0.5. After washing with PBS containing 5% inactivated FBS (hereinafter FBS, buffer), anti-human CD62P-PE (BECKMA COULTER) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes under agitation. After 30 minutes, after washing platelets with FBS buffer, flow cytometer
  • CD62P The expression of CD62P was analyzed by measuring the fluorescence intensity of platelets with CYT0MICS FC500 (BECKMAN COULTER).
  • the F1199-6 antibody activated human platelets or force cynomolgus platelets in a concentration-dependent manner, but the F1232-37-2 antibody showed almost no platelet activation effect.
  • the effect of CF1232-37-2 on human platelets or cynomolgus platelets was also similar.
  • the chimeric antibodies prepared in Example 16, cF 1 249-1 8-2, c F 1 24 5-7-l, c F 1 246-l-1, c F 1 24 9-2 4 When ⁇ , cF 1 24 5— 4 — 1, c F 1 24 9— 22— 1 and c F 1 25 1— 1 1 were examined in the same way, the activation of monkey platelets was I was not able to admit.
  • mice were not chimerized, and some mouse antibodies showed an effect of activating platelets, but the effect disappeared by chimerization.
  • the mouse monoclonal antibody prepared in Example 2 was examined in the same manner, and none of the antibodies was found to have a human platelet activity-inhibitory action.
  • F1199-6 caused aggregation of human blood plasma in a concentration-dependent manner, but almost no platelet aggregation-inducing action of F1232-37-2 and cF1232-37-2 was observed. " It was.
  • F1232-37-2 and CF1232-37-2 inhibited the aggregation of collagen platelet-induced human platelets in a concentration-dependent manner.
  • the anti-GPV I antibody concentration was measured by the sandwich EIA method. That is, hG PVI—h F c with the sequence of human GPV I prepared in the same manner as in Example 1 as a solid-phased protein, and Anti-Huma Kappa Light Chins HRP (D AKO ) was used to create a San German IA system. .
  • the anti-GPV I antibody prepared in Example 16 was used as a standard product.
  • hG P V I — h F c was diluted with PB S (pH 7.4) to 4 gZnn L, and 50 ⁇ L was added to each nonole of NUN C—I mrm u nop la te Max i sorp (NUNC).
  • each membrane protein was analyzed by measuring the fluorescence intensity of platelets with COULTER. We also analyzed the expression of each membrane protein by Western blotting using the obtained PRP. Method: follow the steps below. Monkey ex vivo test The various PRPs obtained in this procedure were washed twice with 2.5 mM EDTA / PBS, and 0.5 X 10 6 blood / plate / ⁇ U kon yotsutsu [this 1 X Sample Bufrer (+ ⁇ -mercaptoetnanol, Protease
  • a secondary antibody diluted with BlockAce / TPBS was added, and the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes while rotating.
  • As the secondary antibody GPIIIa and GPVI used Anti-Rabbit Igs HRP, and GPK used Anti-Goat Igs HRP (both DakoCytomation).
  • After the secondary antibody reaction wash well with TPBS, ECL Plus (Amersham
  • reactivity to collagen and ADP was carried out as follows. First, PRP was diluted with PPP so that the platelet concentration would be 3 ⁇ 10 8 cells / mL, and then a final concentration of ImM CaCl solution was added, followed by incubation at 37 ° C. for 3 minutes. Add a collagen solution with a final concentration of 2 ⁇ g / ml or an ADP solution with a final concentration of 20 ⁇ , and incubate for 12 minutes at 37 ° C. Collagen or ADP response 'platelet aggregation was determined by measuring at 313M (Mem Shi' Medical).
  • mouse monoclonal antibody F1232-37-2 and mouse monoclonal antibody F1199-6 were administered intravenously at 0.3 mg / kg, platelet GPVI levels decreased and platelet platelet response was observed 1 day after administration. A decrease in sex was observed, and the effect persisted for more than 2 days with mouse monoclonal antibody F1232-3-2.
  • CF1232-37-2 was administered intravenously at 0.1, 0.3, lmg / kg to force-quizzed monkeys (male). As shown in Fig. 13, in 0.1, 0.3, lmg / kg cF1232-37-2 treated animals, the responsiveness to blood / J and collagen of the plate decreased immediately after administration, and the effect was 0.3 and lmg / kg. The animals treated with kg lasted for more than 2 days. The animals treated with 0. lmg / kg CF1232-37-2 showed a decrease in responsiveness to collagen over 2 hours after administration, and the effects persisted for 1 day.
  • CF1232-37-2 was administered 4 times every other day to male cynomolgus monkeys (male), and blood sampling was performed before each administration, on the day after each administration, and on the day after the last administration to 17 days after the last administration.
  • blood obtained by blood sampling 1) platelet count, 2) platelet membrane protein
  • GPIIb / GPIIIa (CD41a), GPIX (CD42a), GPIIIa (CD61) expression, 3) expression of platelet GP1, 4) collagen-induced platelet aggregation and ADP-induced platelet reactivity were measured.
  • Fig. 14 shows the changes in the ability of coagulation-inducible aggregation of GP2 I, GPIIIa and GPIX in the power cynomolgus platelets in the 0.3 mg / kg repeated dose test. In this test, the expression of platelet membrane proteins GPIX (CD42a) and GPIIIa [CD61) did not change significantly;
  • the obtained mouse monoclonal antibody F1232-237-2 was treated with Lysyl Endopeptidase.
  • Fab of F1232-37-2 the purified mouse monoclonal antibody F1232-37-2 obtained in Example 2 was treated with Papain (Wako).
  • purified mouse monoclonal anti-f ⁇ : F 1232—37— 2 was replaced with 1 mM Cysteine, 20 mM DTA / D-PBS— (pH 7. 4) buffer, and Papain (W ako) was replaced with antibody.
  • Added to the enzyme 30: 1 (weight ratio) and reacted at 25 ° C for 16 hours.
  • I o do a c e t am i d e (W a k o) was added so that the final concentration was 30 mM.
  • Fab was purified.
  • the antibody treated with Papain was subjected to ProseparA (Mi11ipore). Further, this non-adsorbed fraction was subjected to Superdex75 (An_ersham) to remove Papain and to obtain Fb32-37-2 Fab.
  • the obtained Fa b was dialyzed with physiological saline (Otsuka), and the purity of the antibody was evaluated by analyzing it on an acrylamide gel.
  • the antibody concentration was determined by the Bradfo Id method using the Bovine IgG standard. did. 21 -3 F1232- 37— 2 antibody F (ab ') and Fab antigen binding reactivity
  • F 1232-37-2 (Wix o 1 e antibody) prepared in Example 2 and F (ab,) prepared in 22-1 and 21-2.
  • dissociation constant of Fab were measured using a protein interaction analyzer BI AC ORE 3000 ( ⁇ ACORE). That is, hGPV I-hFc prepared in Example 1 was combined with a CM5 chip (BI ACORE) according to the manual for the sensor chip. Next, dilution series from 0 to 800 nM was prepared for each antibody with HBS-EP gentle solution (BI ACORE) and analyzed with BIACORE 3000. The chip was regenerated with glycine buffer (BI ACORE) with pH 1.5 for each anti- ⁇ : binding.
  • F1232-37-2 F (ab ') 2 prepared in Example 21 was administered subcutaneously in a force quiz at a dose of lmg / kg, and obtained by subsequent blood sampling after administration. Using the collected blood as a sample, the expression of platelet GPVI and the platelet aggregation ability (reactivity to collagen and ADP) were determined.
  • cF l 2 3 2— 3 7 — 2 heavy chain expression plasmid ( ⁇ ⁇ ⁇ - 2 5 1 0) was cleaved with Eco RI and Nco. A fragment (sense strand 5, AATTCGCCGCCACC 3 ′ (sense strand 5, J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) between the start codon and Kozak. SEQ ID NO: 291), antisense strand 5, CATGGTGGCGGCG 3 ′ (SEQ ID NO: 292)) were inserted to construct: ⁇ ⁇ — 2 5 7 1. Similarly c F l 2 3 2— 3 7— 2 Light The Kozak sequence was also inserted into the chain expression plasmid (p TK-2 5 1 1) to construct p TK-2 5 7 2.
  • ⁇ ⁇ — 2 5 7 2 is cleaved with restriction enzymes Ssp I and Sse 83871, and the end of the obtained fragment is slid into a light chain expression unit (EF promoter, antibody light chain).
  • Gene Oppi Poly A signal sequence was prepared.
  • TK- 2 5 7 1 is cleaved with the restriction enzyme Sse 83871 that does not cleave the heavy chain expression unit, and then lubricated, and the light chain expression unit and marker unit are inserted together in this site.
  • Sse 83871 that does not cleave the heavy chain expression unit
  • marker unit are inserted together in this site.
  • mDHFR mouse dihydrofolate reductase
  • ⁇ promoter thymidine kinase " ⁇ promoter
  • SV40 promoter / enhancer SV40 promoter
  • the expression plasmid ⁇ -2577 constructed in Example 25-1 was tranized into DHFR gene-deficient CHO cells to establish a chimeric antibody-producing transformed CHO. That is, HT me dia Supplement (50 X> Hybri— Max (Sigma; used at a final concentration of 1 X) and 200 mM L—G 1 ut amine (Sigma; used at a final concentration of 4 mM) ) After centrifuging CHO DXB 1 1 conditioned in EX—CEL IL 3 25 PF CHO (JRH Bioscience) containing transfec X ion on the same day, a flask with a concentration of 8 X 06 cells / 150 cm 2 Roux Using FuGENE 6 (Roche Diagnostics) 12 5 ⁇ 1, prepare the expression plasmid ⁇ ⁇ —257 7 12.
  • the CHO DXB11 strain was transformed with CF1232-37-2 expressing plasmids pTK— 2 5 50, pTK— 2 5 7 5 and ⁇ — 2 5 7 6, and the resulting assembled cells were Production cF1232-37-2 / CH0 was measured by the EIA method described in ⁇ 9.
  • the productivity of CF1232-37-2 / CH0 varies depending on the type of mDHFR used as a selection marker. It was confirmed that a high expression quorum can be obtained by using the low-reactivity promoter of No. 1 as an expression promoter for the selection marker.
  • Example 25-2 the transformant obtained in Example 25-2 was suspended in 30- or 100-nM MT X-containing EX-CE LL (HT-) medium, and introduced into a 96-well plate. Every 3 or 4 days, half of the medium was replaced with fresh 30 or 10 OnM MTX-containing EX—CEL L (HT—), and the culture was continued at 5% CO 2 and 37 ° C. until colonies formed. . Expression level of the obtained colonies in the culture supernatant was confirmed by the 3 ⁇ 4 ⁇ IA method, and clones with increased production were selected. As a result, it was possible to obtain a transformation ladder with an increase in production of about 2 to 10 times. This gene is amplified By subjecting the transformed strain to selective culture in a medium with an MTX concentration increased 3 to 10 times, clones with further increased production can be obtained.
  • HT- OnM MTX-containing EX—CEL L
  • MTX-containing EX-CELL (HT—) medium was inoculated at 1.5 ⁇ 10 5 ce 1 1 sm 1 and cultured at 37 ° C. for 7 days. The obtained culture supernatant was used for the following purification.
  • CH0 cell line prepared in 25-4 t culture supernatant, capsule cartridge filter (Toyo Filter Paper Co., Ltd.) with a pore size of ⁇ as a prefilter, and 0.222 jum pore size as this filter
  • PALL fluorodyne filter
  • the clarified culture supernatant is adsorbed to protein A (r mp Protein A. Seharose Fast Flow, GE Healthcare, Amersham Bioscience) previously equilibrated with P 3 S- (S i gma) After washing the non-adsorbed protein with PBS-, the protein adsorbed specifically to excretion was eluted with 10 XPB S- (Sigma).
  • the antibody bound to protein A was eluted with 100 mM glycine monohydrochloride buffer (pH 3.0). The volume of the eluate was measured, and immediately: L 10 volumes of 2 M Tris—HC 1 (pH 8.5) was added to make the pH neutral and purified antibody eluate.
  • the purified antibody eluate is concentrated by ultrafiltration using Amicon ⁇ 10 ⁇ ⁇ IMPORE filtration disk (MI LL I PORE), then dialyzed against physiological saline (Otsuka raw food injection, Otsuka Pharmaceutical Factory): The final purified antibody solution was used.
  • c F 1232— 37— 2 / CHO In order to confirm the growth of CHO, it was prepared by a transient gene expression system using cells as an indicator of the ability to bind to hGPV I—b_ F c c F 1 23 2— 37 _ 2 A competition experiment was conducted. The measurement method followed the method described in Example 17, 17-3. Use hGP VI—hF c as a solid phase protein, labeled c F 1 232-37 _ 2 No COS binding, unlabeled c F 1232— 3 7— 2 / C HO or c F 1 232- 37- 2 / COS was added at different concentrations to confirm its competitive activity. The results are shown in Fig. 19. c F 1232—37_2NO O was confirmed to show the same reactivity as c F 1232-37-2 ZCOS.
  • F1 232-37-2 was selected as the first candidate for the design and production of reshaped human antibodies.
  • a humanized antibody was designed by replacing the three CDRs of each variable region of this antibody with the CDRs of known antibodies derived from human myeloma.
  • the heavy chain was selected as NEW (Saul, F. et al., J. Biol.
  • this gene by incorporating the EF promoter downstream of the expression vector pEF2 C ew, the plasmid Doga ⁇ Built capable of expressing each humanized antibody, respectively, pTK- 25 60 (NEW - HA ), pTK- 2632 (Eu-HC), pTK-2561 (REI-KA) and pTK-2631 (Eu-KA).
  • Each of these humanized antibody expression plasmids is expressed in combination with a chimeric antibody expression plasmid (heavy chain: pTK-2571. Light chain: ⁇ -2572), and the binding activity to the produced antibody f antigen is retained.
  • a chimeric antibody expression plasmid dashed chain: pTK-2571. Light chain: ⁇ -2572
  • EW- ⁇ was not expressed or binding in any combination. Therefore, mutations (translation from human sequence to mouse sequence) were introduced into the amino acid sequences of each FR of NEW-HA, and various mutants were prepared and antigen binding activity was compared.
  • NEW-HA which is a version with 4 mutations, it was confirmed that the expression of the antibody molecule and the binding activity to the antigen were restored.
  • Example 28 The chimeric antibody cF 1 249-24-1 or cF l 249-22-1 prepared in Example 16 was intravenously administered to l diseases (male) at lmg / kg. Various analyzes were carried out by the methods shown in Example 20. As a result, both antibodies cause a decrease in platelet GPVI after administration and a decrease in platelet responsiveness to collagen. The effect is shown in Fig. 23 for more than 2 days with c F 12 49-24-1, c F 1 249— 2 2— 1 lasted 6 hours. Neither antibody significantly affected the expression level of platelet membrane protein (GPIIIa (CD61)). ' Example 28
  • HeLa genomic DNA is in a saddle type, C / i 1 region with primer pair (IgM-b and; t g M_c), C 2 region with primer pair (IgM-d and IgM-e), primer pair (IgM -f and IgM-g) (3 regions, primer pair IgM-j) amplified the C ⁇ 4 region.
  • Each amplification product is mixed to form a cocoon-type primer pair (Nae-IgM and
  • pTK_2510 (CF1232-37-2 IgG 4-type heavy chain expression plasmid of CF1232-37-2 described in Example 16) was cleaved with Bam HI and ⁇ to remove the gene fragment encoding the constant region of ⁇ 4 chain. The remaining vector fragment (including the EF-1 promoter for expression and the variable region of CF1232-37-2) was obtained.
  • This gene fragment, pT7-IgM 0 ⁇ 3 ⁇ 4e I) was cleaved with Bam HI and I to identify the gene fragment encoding the ⁇ -chain constant region, and the constant region of CF1232-37-2 was identified as ⁇ .
  • a 1232-37-2 expression plasmid (pTK-2820) was constructed. In the same way,
  • a chimeric IgM type F1232-43-3 projecting plasmid (pTK-2822) was constructed from the IgG4 type heavy chain expression plasmid (pTK-2504) of C F1232-43-3. 3) Cloning and construction of expression plasmid for human.
  • the sequence was analyzed and confirmed to be a gene sequence coding for human J, and designated pT7-IgJ. After cleaving pT7-IgJ with 3 ⁇ 4a I and am HI to obtain a gene fragment encoding the J chain, insert it at the 3 ⁇ 4 «s I and as HI sites downstream of the EF-1 promoter in the expression vector (pEFScew). As a result, a human J chain expression plasmid (pTK- 2393 ) was constructed.
  • IgJ- e AAACATCCGAATTATTGTTCCTCTGAACAA (SEQ ID NO: 306)
  • Ion expression with the plasmid p TK— 2 4 7 4 and the J chain plasmid p T 2 3 93 3 2-4 3-3 was derived from the heavy chain expression plasmid p TK— 2 8 2 2, the light chain expression plasmid p TK— 25. L 4 and the J chain plasmid.
  • Co-transfeetioi with P TK2 3 9 3 After transfection, incubate for 3 days at 37 ° C in 5% CO 2-95% air, salt out and concentrate the culture supernatant with 60% ammonium sulfate,
  • the product was purified by affinity chromatography according to (ImmunoPua: eImmoblyzedProteinre PIERCE).
  • CF 1 2 32— 37— 2 (I gM) and c F 1 232— 43— 3 (I gM) were prepared on an immunoplate with hGPV I-hF c immobilized (prepared by the method described in Example 2). Was added to each well and reacted at 37 ° C for 1 hour. 0. After washing with physiological saline containing 05% Tween 20, peroxidase-labeled anti-human ⁇ -chain antibody (D ⁇ , ⁇ 0322) is diluted 2000-fold with D-PBS containing 10% Usagi serum and 5 OjuL per well I'm sorry.
  • Example 18-2 power cynomolgus monkey human PRP prepared by the method described in Example 1-8 was diluted with a FACS knocker to a platelet concentration of 3.75 ⁇ 10 8 cells / mL.
  • 'CF 1 232- 37-2 (IgM) or cF1 2 32-43-3 (IgM) prepared in 29-2 above is diluted to a final concentration of 3 to 4 ⁇ g / mL in diluted PRP.
  • the plate was allowed to stand at 25 ° C for 30 minutes, and then the blood was washed with a FACS buffer; the plate was washed.
  • Platelet rich plasma was prepared from monkey whole blood by a method according to Example 18-1, 18-1.
  • ACD-A acid-citrate-dextrose
  • HEPES Buffer pH 7.4
  • Washed platelets were placed in a microtube so as to be 1.5 ⁇ 10 7 PLT / tube, and 2 ⁇ L each of lOmM CaCl 2 and 10 mM MgCl 2 was added thereto, and the volume was increased to 18 ⁇ L with PBS.
  • 5.0 ig / mL Convulxin, cF1232-37-2, cF1249-22-22, cF1249-24-1 and cF1249-18-2 (each concentration 1 mg / mL) were added, mixed, and allowed to react at room temperature for 1 hour .
  • GPVI was detected.
  • GPVI antigen was detected in the supernatant after the reaction when Convulxin was added: T, CF1232-37-2, cF1249-22-1, 1, cF1249-24-1, and When CF1249-18-2 was added, GPVI antigen was not detected in the supernatant, and GPVI antigen shedding did not occur with the anti-GPVI antibodies evaluated.
  • the F 123 2-37-2 Fab antibody prepared in 21-2 of Example 21 was PEGylated in the same manner as described above. It was.
  • the PEGylated Fab antibody ( ⁇ purification was performed using Superde X 75 (Amersh am). Purity was evaluated by analysis on an acrylamide gel (Fig. 26). Calculated from Bradford method (Bio-Rad) using B o Vine Ig G as a standard 31 -3 Antigen of F1232-37-2 antibody!
  • FGP-I-hFc-immobilized immunoplate prepared by the method described in Example 2 and adjusted to the same concentration of PEGylated antibodies of F1232-3-7-2 and F1232-37-2 Add to each well and react at 37 ° C for 1 hour. After washing with physiological saline containing 0.05% Tween 20, peroxidase-labeled anti-mouse immunoglopurine antibody (DAKO, P260) was diluted 1000-fold with D—PB S containing 10% Usagi serum to each well. 50 L was added.
  • Example 9 Repertoire gene analysis of anti-GP antibody
  • the anti-GPV monoclonal antibody sequences described in Example 9 and Example 15 are considered to be derived from several specific antibody genes, and are recognized to be characteristic of the repertoire selection of the body that recognizes loop 9 of human GPVI. It was.
  • the antibody gene is composed of a combination of germ-line anti-f gene segments (heavy chain H, D and J, and light chain V and J), and more often with somatic mutation. Formed
  • variable region nucleobase sequence of each antibody is the mouse murine-1 ine antibody heavy chain gene H segment, D segment and J segment
  • V H , DH and J H segments V segment and J segment (V L and J L ) showed high agreement (Identity 0 / *).
  • V L and J L V segment and J segment
  • Table 16 up to 3 segments were recorded in descending order of score for each clone. Of these, it is presumed that these are segments that constitute the germ-1 ine antibody gene from which the pre-antibody gene is derived. However, among these, for each clone, It is most likely derived from heredity that is composed of yarn and assemblage.
  • the antibodies of the present invention are particularly useful for the prevention and / or treatment of human diseases such as Jtk platelet activation or aggregation, or vascular endothelial dysfunction or arteriosclerotic reactions. It can be used for prevention and Z or treatment of diseases caused by thrombus or embolism, such as f, thrombosis, embolism or arteriosclerotic disease.
  • GPVI can be detected in a test sample using the antibody of the present antibody; the disease can be diagnosed by the method. In particular, it can be used for diagnosis of t-type diseases such as thrombus' fe, embolic or atherosclerotic diseases.
  • W 200 can be used for diagnosis of t-type diseases such as thrombus' fe, embolic or atherosclerotic diseases.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、以下の性質を有する抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体を提供する；ａ）ヒト血小板膜糖蛋白質VI（GPVI）と特異的に結合し、ｂ）血小板を活性化させる作用、及び／または、生体内における血小板減少を惹起する作用が弱く、及び、ｃ）血小板と接触させることにより血小板膜上のGPVIを少なくとも部分的に消失させる。

Description

明細書
抗血小板膜糖蛋白質 VIモノク 口ーナル抗体 技術分野
本発明は、 ヒト血小板膜糖蛋白質 VI. (以下、 G P V Iと略称することがある） に対する抗体および該抗体の認識領域に関するものである。 背景技術 '
血小板は血栓形成 ·生体防御において極めて重要な役割を担っており、 生理的 な役割から種々の病態における関わりが解明されつつある。 特に、 血小板は止血 血栓を形成するという機能において注目されており、 例えば、 血管内皮細胞が損 傷を受けると、 血管内皮下の主要なマトリックス蛋白質であるコラーゲンが露出 し、 ここへ血小板が粘着する。 次に、 コラーゲンからのシグナルにより血小板が 活性化され、 最終的にはフイブリノ一ゲンを介して血小板が凝集する。 そして場 合によってはこれが血栓塞栓性疾患のような病的状態の原因となることから治療 の標的として注目されている。
従来、 血小板凝集に基づく血栓症の治療'予防の目的で、 アスピリン、 チクロ ビジン、 0?11 1) /111 &ァンタゴ-スト等の抗1&1_小板薬が用ぃられてきたが、 有 効性おょぴ出血等の副作用の面から多くの間題が指摘されており、 これらの問題 の無い、 十分な安全性、 および確実かつ適切な作用を有する優れた抗血小板薬の 登場が望まれている。
血小板膜上に存在する G P V Iは、 血小板のコラーゲン受容体であり、 コラー ゲン刺激による血小板の活性化に中心的役割を扭つていることが明らかにされて いる （高山博史， 日本血栓止血学会誌， 2 0 0 3年， 第 1 4卷， 第 2号， p . 7 5 - 8 1参照） 。 すなわち、 スギヤマらは自己 疫性血小板減少患者の血小板で は 6 2 k D aの膜蛋白質が特異的に欠損しており、 コラーゲンによる血小板凝集 が認められないこと （タテオ' スギヤマ （Tateo Sugiyama) 、 外 5名， プラッド (Blood) ， （米国） ， 1 9 8 7年， 第 6 9卷， 第 6号， p . 1 7 1 2 - 1 7 2 0参照） 、 さらに、 この患者の血小板で欠損していた蛋白が G P V Iであり、 患 者の血清より精製した抗体の Fab断片がコラ一ゲン惹起血小板凝集を抑制するこ とを報告している （タテオ 'スギヤマ （Tateo Sugiyama) 、 外 5各， ブラッド (Blood) ， （米国） ， 1987年， 第 69卷， 第 6号， p. 1 7 1 2— 1 72 0 ；およぴマサアキ 'モロィ （Masaaki Moroi) 、 外 3名， ジャーサ,レ ·ォブ · ' クリニカル -インべスティゲーシヨン (Journal of Clinical Investigation) (米国） ， 1 989年， 第 84卷， 第 5号， p. 1440-144 5参照） 。 これまでに自己免疫疾患患者由来の抗ヒト GPV I自己抗体は、 スギヤマら (タテオ.スギヤマ （Tateo Sugiyama) 、 外 5名， ブラッド （Blood) ， （米 国） ， 1 987年， 第 69卷， 第 6号， p. 1712— 1 720参照） やタカハ シら (ホウユウ ·タカハシ (Hoyu Takahashi) 、 外 1名， ァメリ ン ·ジャーナ ノレ ·オフ ·へマト口シー (American Journal of Hematology; ， (米国) ， 20 01年， 第 67卷， 第 4号， p. 262— 267参照） が報告している。 しかし ながら、 スギヤマらの報告では患者血漿から精製した抗ヒト I自己抗体に は血小板凝集を惹起する作用があるため、 直ちに医薬応用することはできない。 タカハシらの文献 （ホウユウ ·タカハシ （Hoyu Takahashi) 、 外 L名， アメリカ ン .ジャ1 "~ナノレ ·ォブ ·へマトロン一 (American Journal of Hematology) ， (米国） ， 2001年， 第 67巻， 第 4号， p. 262— 267) には、 GPV Iと推測される約 62kDaの蛋白に対する自己抗体の存在、 及ぴ、 この抗体が血小 板凝集を惹起することが記載されている。 また、 これらの患者由 の抗 GPV I 抗体を医薬として臨床応用するためには安全性の高い抗体を安定した品質で大量 に生産する必要があるが、 工業的に生産する方法は未だ確立されていない。
現在までに作製されている抗 GPV I抗体として、 マウス Iに対するモ ノクローナルラット抗体 （欧州特許出願公開公報第 1228768号参照） 、 お よびヒト GPV Iに対するモノクローナルマウス抗体がある （国 特許出願公開 公報第 01 00810号および国際特許出願公開公報第 02ZO 80968号 参照； Thromb Haemost. 2003 Jun; 89 (6) :996- 1003) 。
また、 ヒ ト GPV Iを認識するヒトー本鎖抗体 （scFv： single chain Fv) 力 S ファージディスプレー法等を用いて作製されている （国際特許出顧公開公報第 0 1/00810号、 国際特許出願公開公報第 02/080968号： およびピー タ1 A · スメサースト （Peter A Smethurst) 、 外 1 5名、 ブラッド （B]_ ood) ，
(米 Ο) ， 2 00 2年， 第 1 00卷， 第 1 1号， p. 4 74 a参照）。 これらの 一本鎖抗体はヒト抗体の重鎖可変領域 （VH) と軽鎖可変領域 （VL) をぺプチ ドリンカーで結合させたものであり、 ヒ ト由来の可変領域を有する抗体で る力 細胞; ¾S産生する通常のィムノグロブリンに比べると、 一般的に抗原への親 ^口性が 低く、 生体内での半減期も短い。 また、 スメサ一ス トらは、 一本鎖抗体の内、 血 小板凝集を抑制するクローン （1 0 B 1 2) について GP V I上のェピト■ ~プを .解析し、 5 9番目のリジン （Ly s 5 9) が関与する可能性を示唆した （ホウュ ゥ ·タカノヽシ (Hoyu Takahashi) 、 外 1名， アメリカン 'ジャーナル ·ォブ、 *へ マトロジー (American Journal of Hematology) ， （米国） ， 2001年， 第 6 7卷， 第 4号， p. 262— 2 6 7 ；およびピーター · A ·スメサ一スト
(Peter A Smethurst) 、 外 1 5名、 ブラッド （Blood) ， （米国） ， 20 G 2年， 第 1 O 0卷， 第 1 1号， p. 4 74 a) 。
このように、 現在まで報告されているヒト GPV Iに対する抗体のほとんどは、 前記ヒ ト自己抗体を含めて、 in vitroにおいて抗体単独で血小板を活性化させる 作用、 及ぴノまたは、 血小板凝集を惹起もしくは促進する作用を有することから、 生体に投与した場合、 血小板減少を引き起こす可能性が考えられる。 事実、
Nieswandtらは、 in vivoで血小板上の G P V Iを消失させるモノクロ一ナ レ抗体 (JAQ1、 JAQ2及ぴ JAQ3) を複数報告しているが、 何れの抗体も投与後に血 d、板減 少を惹起した。
近年、 GPV Iのァゴニス トであるコラーゲン、 convulxin及び CRPならびに G PV Iと.コラーゲンの結合を阻害する抗体 （9012.2) が血小板を活性化し、 それ に伴ってメタ口プロテアーゼを介した切断により血小板からの G P V Iの sheddingが生じることが報告された （S t e p h e n s G外 4名、 B 1 o o d. 20 O 5 J a n 1 ； 1 0 5 (1) : 1 86— 9 1 ; Gardiner EE外 4 ^， Blood. 2004； 104:3611-3617； Bergmeier
Figure imgf000004_0001
Thromb Haemost.
2004；91：951-958.) 。 さらに、 9012.2抗体等を用いて G P V I上のコラ一 ンと の相 3：作用に関与するアミノ酸残基 （Val34, Leu36) が推定された （Lecut C外 7名， J Biol Chem. 2004 ;279 :52293— 52299. )。 また、 高山らは、 自己免疫疾患患者のリンパ球を用いて抗ヒト GPV I抗体を クローン化し、 その性質を i n V i t r oにおいて検討した （国際特許出願公 開公報第 05/007800号） 。
し力 し、 現在までの何れの報告においても、 血小板を活性化させず、 及び/ま たは、 生体内における血小板減少を惹起せずに、 血小板膜上の GPV Iを消失さ せる作用を有する抗体は開示されていない。 発明の開示
このように抗血小板薬として、 安全性が高く、 有効性が優れ、 かつ使いやすい 薬剤が求められている状況において、 生体に投与可能な、 抗 GPV I抗体が切望 されている。
本発明の目的は、 ヒト血小板膜上に存在する糖蛋白質である GPV Iに特異的 に結合する新規な抗体、 好ましく はモノクローナル抗体を提供するものである。 特に生体に投与可能で、 有効でかつ血小板減少等の副作用の点で問題のない、 抗 GPV I抗体を提供するものである。 また、 ヒト GPV Iに特異的に結合し新規 な CD R配列を含有する抗体を提供するものである。 さらに、 これらの抗体を産 生する細胞を提供するものである。
本発明者らは、 上記の課題を角 決すべく、 GPV Iに対する抗体を産生するマ ウスノ'、イブリ ドーマを多数樹立し、 それらの産生する抗体の性状を解析すること を着想した。 この着想に基づき、 鋭意研究を重ねた結果、 GPV Iとの結合能を 有し、 コラーゲンによる血小板凝集能を低下させる活性を有する抗体を産生する ハイブリ ドーマを得ることに成功した。 そして、 各抗体の G P V I上の認識領域 を解析し、 GPV Iのェピトープに関する有益な情報を得た。 また、 当該クロー ンを単離し、 さらに検討を重ねこ結果、 該抗体をコードする遺伝子を得ることに 成功し、 この抗体の CI Rのアミ ノ酸配列が新規の配列であることを明らかにし た。 さらに、 遺伝子組換技術に り組換抗体を作製し、 本発明を完成した。 なお、 本明細書においては、 ノヽイブリ ドーマ （例えば、 クローン F 1232- 18) が産生する抗体を F123 2— 18抗体のように記載することがある。 本発明の第 1の態様は、 特定の機能または特性を示す、 ヒト GPVIと特異的 に結合する抗体、 好ましくはモノク ーナル抗体 （以下抗ヒト GPV I抗体及ぴ ヒ ト GPV Iモノクローナノレ抗体と 々記載することがある） もしくは^ の活性 断片またはそれらの誘導体である。 ^体的には、
(1) 以下の性質を有する抗体も しくはその活性断片またはそれらの爾導体；' a) ヒト血小板膜糖蛋白質 VI (GP V I) と特異的に結合し、
b) 血小板を活性化させる作用、 及 /または、 生体内における血小板 少を惹 起する作用が弱く、 及び、
c) 血小板と接触させることにより J&L小板膜上の GPV Iを少なくとも 分的に 消失させる、
(2) 血小板 GPVIの shedding, 特に、 血小板の活性化に伴うメタロプ テア一 ゼを介した切断による血小板からの GPVIの sheddingを介さずに、 血小ォ及と接触 させることにより血小板膜上の GPVIを少なくとも部分的に消失させる抗^:もしく はその活性断片またはそれらの誘導体、
(3) 生体内において血小板 έ接 虫させることにより血小板膜上の G PV Iを 少なくとも部分的に消失させる、 （ 1) 又は （2).の抗体もしくはその 性断片 またはそれらの誘導体、
(4) 生体内に投与して血小板と接触させることにより血小板がコラーゲンに 応答して凝集する能力を低下もしく は欠如させる、 （1) または （3) の抗体も しくはその活性断片またはそれらの誘導体、
(5) 出血時間の延長作用が弱い、 (1) ないし （4) の抗体もしく はその活 性断片またはそれらの誘導体、
(6) GPV Iとの解離定数が 4 X 10— 8M以下である、 （1) ないし （5) の抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体である。
前記 （1) ないし （6) の抗体ぼ、 単独ではヒ ト血小板凝集を惹起しない抗体 が好ましい。 好適な例として、 表 6 及び表 1 1に挙げられたクローン、 子ましく は GPVIのループ 9を認識する抗！ ^またはそれをヒト I gG、 より好ま しくはヒ ト. I gG4と組み替えたキメラ抗 ίφ:もしくはヒト化抗体が挙げられる。 また、 本 発明の抗体は、 ヒト GPV Iと抗 ^との解離定数 （Kd値） が好ましく は 10一8 M以下、 より好ましくは 4 X 10—9M以下の抗体である。 本発明の抗体ちしくは その活性断片またはそれらの誘導体には、 GPV Iとの結合能を有する限りにお いて、 例免ば、 キメラ抗体及ぴヒト化抗体、 Fab (Fragment of antigen
binding) 、 Fab' , F(ab')2、 一本鎖抗体 （scFv) 、 ジスルフィド安定化抗体
(dsFv) 、 diabody、 nanobody及ぴ CDRを含むペプチド等、 ならびに、 標識抗体、' コンジユゲート抗体及び抗体融合蛋白質等を包含する。
また、 本発明第 1の態様の抗体等は、 ヒ ト GPV Iに特異的に結合し、 コラー ゲンによる血小板の凝集能を特異的に低下させるが他のァゴニスト、 例えば、 A DPまた fまトロンビンに対する凝集能には影響しないものが好ましい。 また、 単 独ではヒ ト血小板凝集を惹起しないものが 子ましい。 該抗体は、 コラーゲンによ るヒト血 J、板の凝集を抑制する濃度または月量と同等、 好ましくは 10倍、 より 好ましく f 100倍、 さらに好ましくは 1 000倍において、 単独ではヒト血小 板凝集を有意に惹起しなレ、。
ここで前記 （1) ないし （6) の抗体は、 その特性を有する限り、 ヒ ト GPV Iとコラーゲンとの結合を阻害する抗体であっても良く、 好ましくは 10_8M以 下、 より好ましくは 10— 9M以下、 さらに好ましくは 10— ieM以下の解離定数
(Kd値） でヒト GPV Iとコラーゲンとの結合を阻害する抗体である。
本発明の抗体は必ずしも特定のクローンに限定されるものではなく、 本発明の 好ましい例と同様の作用を有する抗体は本 ¾明の範囲に包含される。 本発明の抗 体の作用の有無は実施例に示される方法まナこは公知の方法によつて確認し得る。 また、 本発明の好ましい抗体と G P V I上の認識領域、 結合部位もしくはェピ トープが同一力少なくとも部分的に共通である抗体、 例えば、 GPV Iとの結合 において ISいに競合する関係にある抗体は本発明の範囲に包含される。 本発明の 抗体との認識領域または結合部位の共通性の有無は実施例に記載の方法に準じて、 または公知の方法によって確認し得る。 すなわち、 本発明により、 本発明の特定 の抗体と GPV I結合において競合する抗体が提供される。 本発明の実施例の 合実験に: ける分類では、 表 1に挙げられる 8種類のグループ、 好ましくはグノレ ープ d、 eまたは h、 より好ましくはグノレープ dまたは eに分類される抗体が本 発明の抗体として挙げられる。
本発明の第 2の態様は、 新規な GPV I 上の認識領域、 結合部位もしくはェ 卜ープによって規定される抗 GPV I抗体であり、 好ましくはモノクローナル抗 体である。 具体的には、
(7) ヒ ト GPV I ドメイン 1のループ 2、 /レープ 3とループ 5、 もしくはノレ ープ 4とループ 5、 または、 ドメイン 2のループ 9、 もしくはループ 9とループ 1 1、 好ましくはドメイン 2のループ 9またはドメイン 1のループ 2、 より好ま しくはドメイン 2のループ 9の少なくとも一部分を含むアミノ酸配列または GP V I上の構造を特異的に認識する抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導 体、
(8) ヒ ト GPV I ドメイン 1のループ 2、 / ープ 3とループ 5、 もしくはル ープ 4とループ 5、 または、 ドメイン 2のループ 9、 もしくはループ 9とループ
1 1の少なくとも一部分がループ 2の E 21、 K22および P 23、 ループ 3の G 33とループ 5の A57、 K59および L62、 もしくはループ 4の S 43、 S 44、 S 45、 R46および E 48とループ 5の A 57、 K 59および L 62、 または、 ループ 9の T 116、 R117、 Gi l 9および Q 122、 もしくはル ープ 9の T 1 16、 R117、 G 119および Q 122とループ 11の R 139 である、 （7) の抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体、
(9) ヒ ト GPV I ドメイン 1のループ 2、 z ープ 3とループ 5、 もしくはル ープ 4とループ 5、 または、 ドメイン 2のループ 9、 もしくはループ 9とループ 1 1、·好ましくはドメイン 2のループ 9またはドメイン 1のループ 2、 より好ま しくはドメイン 2のループ 9と特異的に結合する、 （7) または （8) の抗体も しくはその活性断片またはそれらの誘導体である。 さらに、 好ましくは、
(10) ヒ ト GPV I ドメイン 1の 7レープ 2、 ノレープ 3とループ 5、 もしくは レープ 4とループ 5、 または、 ドメイン 2のループ 9、 もしくはループ.9とルー プ 11、 好ましくはドメィン.2のループ 9また ドメイン 1のループ 2、 より好 ましくはドメイン 2のループ 9の少なく とも一音|5を含むァミノ酸配列または G P V I上の構造を認識する、 （1) ないし （6) の抗体もしくはその活性断片また ίまそれらの誘導体、
(11) ヒ ト GPV I ドメイン 1のノレープ 2の Ε 21、 Κ22および Ρ 23、 7レープ 3の G 33とループ 5の A 57、 K59および L 62、 もしくはループ 4 の S 43、 S 44、 S 45、 R 4 6および E 48とループ 5の A 57、 K59お よび L 62、 または、 ドメイン 2のループ 9の T 1 1 6、 R 1 1 7、 G" 1 1 9お よび Q 122、 もしくはループ 9の Τ 1 1 6、 R1 1 7、 Gi l 9お ぴ Q 1 2 2とループ 1 1の R 139を含むブミノ酸配列または GPV I上の構造を特異的 に認識する、 （1) ないし （6) の抗体もしくはその活性断片または れらの誘 導体、
(12)ヒ ト GP.V I ドメイン 1のループ 2、 ループ 3とループ 5、 しくはノレ ープ 4とループ 5、 または、 ドメイン 2のループ 9、 もしくはループ 9とループ 1 1、 好ましくはドメイン 2のループ 9またはドメイン 1のループ 2、 より好ま しくはドメイン 2のループ 9と特異的に結合する、 （1) ないし （6) の抗体も しくはその活性断片またはそれらの誘導体である。
ここで、 上記の各ループの少なくとも一部分は、 例えば、 ヒ ト GP Iにおい て異種 GPV I、 例えばマウスまたはラット GPV Iと対応するアミ Z酸残基が 異なる残基である。 GP V I、例えば、 ヒ ト GPV Iのモデリング構造は実施例 に記載する方法により推定可能であり、 各ループ構造の位置を図 1及び 3に示し た。 上記のループの内、 ドメイン 2のループ 9及びドメイン 1のルーブ 2、 好ま しくはドメイン 2のループ 9は本 明の抗体の認識領域として重要で feり、 これ らを認識する抗体は好ましいもの ある。 好適な例として、 表 6及ぴ L 1に挙げ られた抗体またはそれをヒト I g G、 より好ましくはヒト I g G4と糸且み替えた キメラ抗体もしくはヒト化抗体が举げられる。
本発明の第 2の態様の抗体は、 ：本発明第 8の態様のぺプチド及ぴ または第 9 の態様のポリペプチドとの結合性によって、 分類すること、 または、 結合領域を 確認することができる。 すなわち、 本発明は、 本発明第 8の態様のペプチド及び または第 9の態様のポリペプチ ドの内、 特定のものとの結合性が異なる、 好ま しくは低下した抗 GPV I抗体を提供する。 具体的には、 特定の GP V I変異体 との結合性が、 ヒ ト G P V I及ぴノまたは他の G P V I変異体との結合性と有意 に異なる、 好ましくは低下した抗 GP V I抗体である。 具体的な確認方法、 用い るポリペプチド等、 好適な分類及 好適な抗体の例は実施例示されてレヽる。 本発 明の抗体は、 その抗原結合価は必^ fしも限定されず、 Fabもしくは scF のような —価抗体でも良いが、 生体内、 特に血中での安定性、 GP VIへの結合性または 作用の強度の観点から、 好ましくは、 二価以上の多価抗体、 例;^ば、 二価、 三価、 四価もしくは十価の抗体、 より好ましくは、 二価抗体である。 つて、 本発明の 第二の態様において、 GPV I上の特定の領域、 特に、 ループ 9、 を認識する一 価の抗体及び二価以上の多価抗体、 例えば、 二価、 三価、 四価 しくは十価の抗 体、 好ましくは、 二価抗体が提供される。 ここで、 四価抗体の何としては I gA、 十価抗体の例としては I gMが挙げられるが、 これらに限定さ ない。 また、 三 価抗体は生理的には存在しなレ、が、 固有の三量体ィヒ特性を有する天然または合成 ぺプチド、 例えば、 テナシン ( t e n a s c i n) 分子のドメ ン （M 110 - 139、 Swissprot #P10039(ニヮトリ）、 または Swissprot #P24821 (ヒ ト）） を利用し、 化 学的または遺伝子工学的に一価抗体 （scFvもしくは Fab等） に結合させることで 三価抗体を調製可能である （特表 2004- 508828号公報参照） 。 な:お、 本発明第二 の態様の抗体は、 好ましくは、 第一の態様の抗体の特定の機能 たは特性を示す ものである。
本発明の第 3の態様は、新規な CDRアミノ酸配列または可変領域アミノ酸配 列を含有する抗 GPV I抗体であり、 好ましくは、 ヒト I gG、 特にヒト I gG 4と組み替えたキメラ抗体、 より好ましくは C DR移植抗体、 待にヒト化抗体で ある。 具体的には、 '
(Γ3) 少なくとも抗体の: H鎖または L鎖の一方の 3組の CDR、 好ましくは 抗体の H鎖おょぴ L鎖両方の 6組の CDRが、 表 8、 9、 12 _¾ぴ 1 3に記載の クローン、 好ましくは GPVIの/ ープ 9を認識するする抗体の CD Rのアミノ酸配 列を、 それぞれ対応する CDRのアミノ酸配列として含有する ¾¾GPV I抗体も しくはその活性断片またはそれらの誘導体、
(14) 配列番号 15、 16及ぴ 17のアミノ酸配列、 配列番号 18、 19及ぴ 20のアミ ノ酸配列、 配列番号 21、 22及び 23、 配列番号 24、 25及ぴ 26、 配歹 ϋ番号 27、 28及び 29、 配列番号 30、 31及ぴ 32、 配列番号 33、 34及び 35、 配列番号 36、 37及び 38、 配 列番号 39、 40及ぴ 41、 配列番号 42、 43及ぴ 44、 配列番号 45、 46及び 47、 または、 配列番号 48、 49及ぴ 50のァミノ酸配列を、 または表 12に記載 Ο何れかのクロー ンの VH CDR1、 VH CDR2及ぴ VH CDR3をそれぞれ VH CDR1、 VH CDR2^O?VH CDR3に有 lO する抗 G P V I抗体の重鎖もしくはその活性断片またはそれらの誘導体、
( 1 5 ) 配列番号 51、 52及び 53のアミノ酸配列、 配列番号 54、 55及び 56のアミ ノ酸配列、 配列番号 57、 58及び 59、 配列番号 60、 61及ぴ 62、 配列番号 63、 64及び 65、 配列番号 66、 67及ぴ 68、 配列番号 69、 70及び 71、 配列番号 72、 73及 74、 配 列番号 75、 76及び 77、 配列番号 78、 79及び 80、 配列番号 81、 82及び 83、 £たは、 配列番号 84、 85及ぴ 86のァミノ酸配列を、 または表 1 3に記載の何れか Oクロー ンの VL CDR1、 VL CDR2及び VL CDR3をそ ぞれ VL CDR1、 VL CDR2及び VL CDR3に有 する抗 G P V I抗体の軽鎖もしくはその活性断片またはそれらの誘導体、
( 1 6 ) 配列番号 15、 16、 17、 51、 52及ぴ 53のアミノ酸配列、 配列番 H8、 19、 20、 54、 55及ぴ 56のアミノ酸配列、 配列番号 21、 22、 23、 57、 58及び 590ァミノ 酸配列、 配列番号 24、 25、 26、 60、 61及び 62のアミノ酸配列、 配列番号 27、 28、 29、 63、 64及ぴ 65のアミノ酸配列、 配列番号 30、 31、 32、 66、 67及ぴ 680ァミノ 酸配列、 配列番号 33、 34、 35、 69、 70及ひ71のアミノ酸配列、 配列番号 36、 37、 38、 72、 73及び 74のアミノ酸配列、 配列番号 39、 40、 41、 75、 76及ぴ 770ァミノ 酸配列、 配列番号 42、 43、 44、— 78、 79及び 80のアミノ酸配列、 配列番号 45、 46、 47、 81、 82及び 83のアミノ酸配列、 また fま、 配列番号 48、 49、 50、 84、 85及ぴ 86 のアミノ酸配列を、 または表 1 2及び 1 3に記載の何れかのクローンの VH CDR1、 VH CDR2、 VH CDR3、 VL CDR1、 VL CDR2及び VL CDR3をそれぞれ VH CDR1、 VH CDR2、 VH CDR3、 VL CDR1、 VL CDR2及び VL CDR3 こ有する抗 G P V I抗体もしく ίまその活 性断片またはそれらの誘導体、
( 1 7 ) 少なくとも抗体の Η鎖または L鎖の可変領域、 好ましくは抗^:の Η鎖 および L鎖両方の可変領域が、 表 7また fま表 1 4に記載のクローン、 好ましくは GPVIのループ 9を認識する抗体が有する 変領域のアミノ酸配列を、 それぞれ対 応する可変領域のアミノ酸配列として含有する抗ヒト G P V I抗体、 特にヒト I g G、 好ましくはヒト I g G 4と組み替えたキメラ抗体もしくはその活†生断片ま たはそれらの誘導体である。 第 3の態様の抗体は、 好ましくは、 第 1の嬉様及び ノまたは第 2の態様の抗体等の特性及ぴノまたは認識領域特異性を有するもので める G
本発明の第 4の態様は、 第 1ないし笫 3の態様の抗体もしくはその活'! ^断片ま たはそれらの誘導体の少なくとも H鎖もしくは L鎖の一方の 3 aの CDR、 好ま しくは H鎖及び L鎖の 6組の CDR、 または、 可変領域をコー する塩基配列を 含有するポリヌクレオチ ドまたは核酸である。 具体的には、
(18) 第 1ないし第 3の態様の抗体もしくはその活性断片 たはそれらの誘 導体の H鎖及び/または L鎖をコードする塩基配列を含有する リヌクレオチド、
(19) 少なくとも抗体の H鎖または L鎖の一方の 3組の CE R、 好ましくは 抗体の H鎖または L鎖の两方の 6組の CD Rをコードする塩基酉己列として、 表 8 及ぴ 9または表 12及ぴ 13に記載のクローン、 好ましくは GPVIのループ 9を認 識する抗体の遺伝子におけるそれぞれ対応する C D Rをコード 1~る塩基配列を含 有する （18) のポリヌ クレオチド、
(20) 少なくとも抗体の H鎖または L鎖の可変領域、 好ましくは抗体の H鎖 および L鎖両方の可変鎮域として、 表 7または表 14に記載のグローン GPVIのル ープ 9を認識する抗体の遺伝子におけるそれぞれ対応する可変慎域をコードする 塩基配列を含有するポリ ヌクレオチド、
(21) H鎖の可変镇域をコードする配列番号 280の塩基酉己列と、 L鎖の可 変領域をコードする配列番号 284の塩基配列とを含有するポ！； ヌクレオチド、 または H鎖の可変領域をコードする配列番号 282の塩基配列と、 L鎖の可変領 域をコードする配列番 284の塩基配列とを含有するポリヌグレオチドである。 また、 本発明は、 特定のマウス germ- line抗体遺伝子セグメントの組合せを含有 する抗体遺伝子に由来する、 抗ヒト GPV [抗体遺伝子又はその重鎮もしくは軽鎖可 変領域遺伝子を提供する。 すなわち、
(22) 表 16に記载されたマウス germ- line抗体遺伝子セグメント VH、 DH 及ぴ J Hの何れかの組合せを含有する抗体重鎖遺伝子に由来する、 抗ヒト GPVI抗 体遺伝子又はその重鎖可変領域遺伝子、
(23) 前記抗体重鎮可変領域遣伝子の CDRァミノ酸配列をコードするヌクレ ォチド配列を含有する抗ヒト GPVI抗体遺伝子又はその重鎖可変鎮域遺伝子、
(24) 表 16に記载されたマウス germ-line抗体遺伝子セグメント VL及び
J Lの何れかの組合せを含有する抗体軽鎖遺伝子に 来する、 抗ヒト GPVI抗体遣 伝子又はその軽鎖可変慎域遺伝子、 ' (25) 前記抗体軽鎖可変領域遺伝子の CDRァミノ酸配列をコードするヌクレ ォチド配 jを含有する抗ヒト GPVI抗体遺伝子又はその軽鎖可変領域遺伝子である。 ここで、 表 16に記載されたマウス germ- line抗体遺伝子セグメントの内、 各 $t 体クローンの最上段に示されたスコアの高いセグメントの組合せ、 例えば、 クロ' ーン F1246- 1- 1の重鎖遺伝子では VH (3:3.9) 、 DH (DSP2.7又は DSP2.5) 及び
JH (JH4) の組合せが好ましい。 また、 前 f己抗体遺伝子に由来する遺伝子に 、 それがコ一ドする.抗体が同様な抗原特異性を示す限り、 その抗体遺伝子自体又 f
1塩基以上の変異を伴つた遺伝子を包含し、 その変異は天然に生じたもの及び 為的に導； したものの何れであっても良い。 同時に、 本発明は、 特定のマウス germ- line抗体遺伝子セグメントの組合せを會有する抗体遺伝子に由来する、 ヒ ト GPVI抗体遺伝子又はその重鎖もしくは軽鎖可変領域遺伝子にコードされる拭 体もしく はその活性断片またはそれらの誘導体を提供する。 すなわち、
(26 ) 前記 （22) 〜 （23) の抗体遺伝子又はその重鎖可変領域遺伝子 こ コードされる抗ヒト GPVI抗体又はその重鎖可変領域ポリぺプチド、
(27 ) 前記 （24) 〜 （25) の抗体遺伝子又はその軽鎖可変領域遺伝子に コードされる抗ヒト GPVI抗体又はその軽鎖可変領域ポリぺプチドである。
さらに、 本発明は、 ポリエチレングリコーノレ (PEG) 化された抗ヒ ト GPVI抗鉢、 具体的には、 前記本発明の抗体、 好ましくは、 GPVIのループ 9を認識する抗体、 もしぐはその活性断片またはそれらの誘導体を提供する。 抗体等に PEGを結合さ せる方 feiま公知の方法 （例えば、 Roberts M.J. et al. Advanced Drug delivery Reviews 54(2002)459- 476参照） に従うこと力 Sでき、 具体的には実施例 31に曾己 載されて 1/ヽる。
本 ¾明の第 5の態様は、 第 1ないし第 3の態様の抗体もしくはその活性断片ま たはそれらの誘導体を産生する細胞、 または、 第 4の態様のポリヌクレオチド 含有する 田胞である。 具体的には、
(28 ) 前記 （1) ないし （17) に記載のいずれかの抗体もしくはその活' h生 断片またはそれらの誘導体を産生する細.胞、 特に、 形質転換細胞、 またはハイブ リ ドーマ、
(29 ) 前記 （18) ないし （21) に記載のいずれかのポリヌクレオチド 含有する細胞、 特に、 形質転換細胞、 またはハイブリドーマである。 本発明の第 6の嬉様は、 第 4の態様のポリヌクレオチ もしくはそれを含有す る発現ベクター、 または第 5の態様の細胞を用いることを特徴とする、 第 1ない し第 3の態様の抗体を製造する方法である。 具体的には、
(30) 前記 （2 8) または（29)の細胞を培養する II程おょぴ、 該細胞が産 生するモノクローナル抗体を採取する工程を含む、 第 1 ¾:いし第 3の態様の抗体 を製造する方法、.
(31) 前記（1 7)ないし（21)のポリヌクレオチド、 それを含有する発現べ クタ一、 （28) または （29) の細胞の何れかを用いる工程を含む、 第 1ない し第 3の態様の抗体の製造方法である。
本発明の第 7の態様は、 本件第 1ないし第 3の態様の *fc体もしくはその活性断 片またはそれらの誘導体を有効成分として含有する医薬 &成物に関するもので、 好ましくは血栓性、 塞栓性または動脈硬化性の疾患の予!^および Zまたは治療の ための医薬組成物である。 本発明の抗体は、 血小板の活' fe化作用、 血小板凝集作 用、 血小板減少作用及び出血時間の延長作用等の副作用力 ほとんどなく、 上記疾 患等の予防およぴ または治療に有用である。
本発明の第 8の態様は、 GPV I土の特定の構造、 特に、 ループ構造を構成す るペプチド、 具体的には、
(32) ヒ ト GP V I ドメイン 1のループ 2、 ループ 3 とループ 5、 もしくは ループ 4とノレープ 5、 または、 ドメイン 2のループ 9、 ^しくはループ 9とルー プ 11を含有するペプチド、 特に、 それらの何れかのアミ ノ酸配列からなるぺプ チドである。 ここで、 該ペプチドは異種の GPV I由来 Oアミノ酸配列または G PV I以外のポリペプチド、 例えば、 F cのアミノ酸配歹 CJを含有しても良い。 本発明の第 9の態様は、 特定の GPV I変異体、 例え f 、 アミノ酸置換体、 種 間でのドメィン置換体または種間での部分配列置換体、 何えばループ置換体等で ある。 好ましくは図 1及ぴ 3に示される GPV Iの 1もしくは 2以上め'ループ構 造を構成するアミゾ酸を他のアミノ酸または多種 （例え ίま、 ヒ ト、 マウス及びラ ット） の対応する/レープのアミノ酸で置 mした変異体で り、 具体例は表 4また は実施例に記載されている。 具体的には、 (33) 配列番号 137なレ、し 151のアミノ酸配列を含有するポ ペプチドである。 本発明の第 10の態様 ίま、 以下の工程を含む、 抗体もしくはその活性断片また はそれらの誘導体のスクリ一-ング方法である。
a) ヒト血小板膜糖蛋白霞 VI (GPV I) どの結合性を測定する工程、
b) 血小板を活性化させる作用、 及びまたは、 生体內における ώι小板減少を惹起 する作用を測定する工程、 及び、
c) 血小板と接触させることにより血小板膜上の GPV Iを少なくとも部分的に 消失させる活性を測定する工程。
本発明の第 11の態様 ίま、 第 8の態様のペプチドまたは第 9の態様のポリぺプ チドと抗体との反応性、 例えば、 結合性を測定する工程を含む、 抗体のェピトー プの推定方法、 または、 抗体の認識領域の同定方法である。
本発明の第 12の態様 ίま、 本発明第 8の態様のぺプチドまた ί 第 9の態様のポ リペプチド等を用いることを特徴とする GPV Iに特異的な抗体の製造方法、 具 体的には、
(34) 本発明第 8の態様のペプチドまたは第 9の態様のポジペプチド等を免 疫用の投与抗原として、 または、 体外免疫用の抗原として用いること特徴とする GP VIに特異的な抗体、 好ましくは、 本発明の第 1ないし第 3の態様の抗体の 製造方法、
(35) 本発明第 8の饞様のペプチドまたは第 9の態様のポジペプチド等を抗 体の検出または同定用の抗原として用いること特徴とする GPV Iに特異的な抗 体、 好ましくは、 本発明の第 1ないし第 3の態様の抗体の製造方法である。 すな わち、 本発明の抗体が認識しうるヒト GPV I上のアミノ酸酉己歹 lj、 例えば、 ルー プ構造に対応するアミノ酸配列がマウス GPV I上に組み込まれた GPV I組換 体は、 それ自身を免疫原及び/または検出用抗原として同じ認識領域を認識しう る新たな抗体を得ることカミできる。 ヒ ト治療用抗体のより好ましい作製方法とし て、 ヒト抗体遺伝子トランスジエニック非ヒト動物を用いた方法が開示されてい る （WO 2002/07 O 648 (特表 2005- 504507) 、 WO 2 002ノ 043 478 (特表 2004 - 515230) ) 。 異種の QPV I、 例えばマウス G P V Iにヒト GPV Iの部分ァミノ酸酉己列を組み込んだ蛋白質は、 上記のトランスジェニック 動物、 例えばマウスに免疫した場合、 GPV Iのマウスのアミ ノ酸配列には反応 せずに組み込まれたヒトアミノ酸配列、 好ましくはェピトープ、 により反応する ヒト抗体が効率的に得られると考えられる。 よって、 この方法で得られたヒト抗 体は、 本発明の第 1または第 2態様の抗体の特徴を有するヒ ト抗体として有用で' あり、 該方法は特に有用である。
本発明の第 13の態様は、 第 1ないし第 3の態様の抗体を用いて試料中の GP V Iを検出または定量する方法である。 該方法は、 血小板上の GPV Iまたは体 液、 特に血液中の GPV Iを測定でき、 疾患の診断をする方法、 好ましくは血栓 形成を伴う疾患の診断をする方法に応用可能である。 また、 詼方法は、 GPV I と関連した治療のモニタリング、 特に、 血小板上の GPV Iを指標として、 抗 G P V I抗体の効果予測もしくは判定、 または予後の判定等に応用しうる。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト可溶型 GP V Iおよびマウス可溶型 GPV Iのアミノ酸列のァラ ィメントである。 四角は、 GPV Iの各ドメイン領域おょぴモデリングによって 予測されたループ領域の位置 （L 1—L 14) を示す。
図 2は、 GPV I欠損,患者の抗体とマウス抗ヒト GPV Iモノクローナル抗体 との競合試験の結果を表す。 YA- Abs_88およひ ΎΑ-Abs- 03は GP "V I欠損患者の抗 GPV I抗体を示す。
図 3は、 ヒト可溶型 GP V Iおよぴラット可溶型 GPV Iのアミノ酸列のァラ ィメントである。 四角は、 の各ドメイン領域おょぴモデリングによって予測され たループ領域の位置 （L 1一 L 14 ) を示す。 ,
図 4は、 マウスハイプリ ドーマ抗体とキメラ抗体の反応性を調べた結果を示す。 図 5は、 キメラ化した抗体とマウスハイプリドーマ抗体の G PV Iとコラーゲ ンとの結合阻害を示す。 '
図 6は、 抗ヒト GPV I抗体の GPV I変異体との結合特' を調べた結果を表 す。 .
図 7は、 CF1232- 37- 2の各種 hGP V Iマウスループ置換体との反応性を調べ た結果を表す。 図 8は、 ヒト血小板および力二クイザル血小板活性化作用を示 ~。 ヒト血小板 (A) および力二クイザル血小板 （B) の CD62P (Pセレクチン発現量） を FACSによ り測定し、 平均蛍光強度 （ FI) で示した。
図 9は、 ヒ ト血小板に对する凝集惹起作用を示す。
図 1 0は、 コラーゲン惹起ヒ ト血小板凝集に対する F1232 - 37 - 2の作用を表す。 図 1 1は、 ADP惹起ヒト血小板凝集に対する F1232- 37-2の作用を表す。
図 1 2は、 マウス抗ヒト G P V Iモノクローナル抗体 F1232 - 37 - 2および F1199- 6の力二クイザルへの静脈内投与試験の結果を示す。
図 1 3は、 マウス/ヒトキメラ抗ヒト G P V I抗体の力二クイザノレ ex vivo試験 (単回静脈内試験 cF1232- 37- 2単回静脈内投与試験） の結果を示す。
図 1 4は、 cマウス/ヒ トキメラ抗ヒト G P V I抗体の力二クイザノレ ex vivo試 験 （反復静脈内投与試験） の結果を示す。 力二クイザルに cF1232 - 37- 2を 0. 3 mg/kgを 1日おきに 4回投与したときのコラーゲン惹起血小板凝集能 （A) およぴ血 小板 GPVI量 （B) を測定した。
図 1 5は、 cマウス/ヒ トキメラ抗ヒト G P V I抗体の力二クイザル ex vivo試 験 （皮下投与試験） の結果を示す。 力二クイザルに CF1232-37- 2を 下投与した 後、 経時的に採血し、 2 μ. g/mL コラーゲンで惹起される血小板凝集能 （A) およ ぴ血小板 GPVI量 （B) を測定した。
図 1 6は、 F1232- 37- 2 Fabのコラーゲン惹起血小板凝集抑制作用を示す。
図 1 7は、 F1232- 37- 2 F (ab，）2の力二クイザル ex vivo試験の結^:を示す。 図 1 8は、 CF1232- 37-2両鎖安定共発現プラスミドの構築を示す。
図 1 9は、 COS細胞で発現させた CF1232-37-2と CH0細胞で発現させた CF1232- 37- 2の抗原結合反応性を す。
図 2 0は、 重鎖可変領嫁のァミノ酸配列とそのヒト化について示す。
図 2 1は、 軽鎖可変領 のアミノ酸配列とそのヒト化について示す。
図 2 .2は、 ヒト化抗体の G P V I結合特異性を示す。
図 2 3は、 キメラ抗 G P V I抗体を投与された力二クイザル血/ J、板のコラーゲ ン惹起凝集能試験の結果を表す。
' 図 2 4は、 力二クイザノレ出血時間試験の結果を表す。 A ： eptif ibatide投与静 脈内投与後 5分後および抗 G PV I抗体 cF1232- 37- 2投与 48時間後の血小板のコ ラーゲン惹起凝集能を示す。 B ： eptifibatide投与 脈内投与後 5分後およびお ¾ GPV I抗体 cF 1232- 37-2投与 48時間後の出血時間を各群薬物投与前値と比較し た結果を示す。 ' 図 25は、 抗 GPV I抗体による血小板 G P V I ί¾原 shedding確認試験の結;^: を示す。
図 26は、 抗 P V I抗体全抗体および Fab抗体の PEG化の結果を表す。 各レ^ ~ ンは、 1 ： F1232- 37- 2全抗体； 2 ： F1232-37-2の PEGf匕反応物； 3 ： PEG化 F1232— 37- 2精製物； 4 ： F1232-37-2 Fab抗体； 5 ： F1232- 37- 2 Fabの PEG化反応物； 6 ： PEG化 F1232— 37- 2 Fab精製物を表す。
図 27は、 PEG化抗 G P V I抗体の G P V I抗原結合活性試験の結果を表す。 発明を実施するための最良の形態
(構成）
本件発明の抗体は、 ヒ ト血小板上に存在する膜糖匿白質である GPV Iを特異 的に認識するものである。 なお、 本発明の抗体が認識する GPV Iは必ずしも ifeL 小板上のものに限られず、 例えば、 巨核球の GP VI をも認識し得るものであ 。 以下に、 本 明をさらに詳しく説明する。 なお、 本日月細書中では、 アミノ酸酉己 IJ を 1文字表記または 3文字表記で記載することがあ 5。
本 明の抗 は、 ポリクローナル抗体でもよいが、 好ましくは、 モノクロー^" ル抗体である。 このモノクローナル抗体の作製方法には特定の方法に限らず、 えばハイプリ ドーマが産生したモノクローナル抗体、 抗体の遺伝子を組み込ん^ ί 組換え細胞が直生したモノクローナル抗体、 または EBV (ェプスタイン 'バ1 ~ ウィルス） によ り形質転換した細胞が産生するモノクローナル抗体のいずれで ¾ つてもよい。 また、 本努明のモノクローナル抗体を なくとも一つ含有する抗 の混合物もしく はポリクローナル抗体、 または複数 ( 本発明のモノクローナル^: 体の混合物で ¾ つてもよい。 さらに、 本発明の抗体ほ、 二重特異性 （b i s p e c i f i c) 体または多重特異性 （p o l y s p e c i f i c) 抗体も包含す る。 本発明の抗体はヒ ト GPV I と特異的に結合する抗体である。 本発明の^:体と ヒ ト GPV Iとの結合は公知の方法で洹 U定可能であり、 具体的には、 実施 に示 された方法が挙げられる。 本発明の抗体はヒト GPV Iと抗体との解離定^: (K d値） 力 4 X 10— 8M、 好ましくは 1 0— 8M以下、 より好ましくは 4 X 1 —9 M 以下、 さらに好ましくは 10— 9M以下である。 ヒ ト GPV Iと抗体との解離 数 を測定する方法は特定の方法に限定されず、 常法により行うことができる。 例え ば、 チップ上に固定化した GPV I-Fcを用いて B I ACORE3000のよう な蛋白質相互作用解析装置により測定することができる。 具体的には、 実 1¾例 5 に示されている。
本発明の第 1の態様の抗体は、 血小板と接触させることにより、 特に、 体内 において接触させることにより、 血小板膜上の GPV Iを少なくとも部分 fr¾に消 失させる作用を有するものである。 その作用は、 本発明の抗体と血小板と ¾r一定 時間接触させた後、 血小板を分離し、 その表面上の GPV I発現量を測定 tるこ とにより確認しうる。 GPV I発現量 ί F AC S等を用いた常法により測 でき、 具体的な方法は実施例に示されている。 本発明の抗体は、 好ましくは lmsZk g、 より好ましくは 0. 3mgZk gの投与量で、 投与前値または対照群 ( 値と 比較して、 好ましくは 40%以上、 より好ましくは 80%以上、 血小板上 ( GP V Iを消失させる作用を有する。
本発明の抗体は、 血小板 GPVIの shedding、 特に、 血小板の活性化に伴う タ口 プロテアーゼを介した切断による血小板からの GPVIの sheddingを介さなレ、GPVI 消失作用を有するもの、 または、 該 sheddingをほとんど又は実質的に惹起せずに、 血小板と接触させることにより血小板膜上の GPVIを少なくとも部分的に消 させ る抗体である。 ここで、 sheddingの有無は公知の方法 （S t e p h e n s G外 4名、 B l o o d. 200, 5 J a m 1 ; 105 (1) : 186— 91_ ； Gardiner EE et al.， Blood. 2004; 104 :3611—3617、 Bergmeier et al.，
Thromb Haemost. 2004； 91 :951-958. ) で検出しうるが、 具体的には、 実施^ ΐΐ 30 に記載された方法を適用できる。
本発明の抗体は、 それ自体では血小板を活性化させる作用、 及ぴ Ζまた 、 生 体内における血小板減少を惹起する作翔が弱い、 好ましくはほとんど作用 Sない ものである。 血小板の活性 f匕は公知の方法で測定しうるが、 血小板表面抗原、 好 ましくは C D 6 2 Pの発現量を指標とすることができる。 何えば、 本発明の抗体 を投与した生体から一定時間経過後に血小板を分離し、 そ C D 6 2 Pの発現量 を常法により測定する方法、 及ぴ、 生体から分離した血小板と本発明の抗体を接 触させ、 一定時間経過後にその C D 6 2 Pの発現量を常法により測定する方法等 が挙げられる。 その具体的な方法は実施例に示されている。 本発明の抗体による 血小板の活性化は、 C D 6 2 Pの発現量を指標とした場合、 血小板上の G P V I を少なくとも部分的に消失させる投与量または濃度において、 対照となる血小板 の 5倍以下、 好ましくは 2 g以下、 より好ましくは 1 . 5 {音以下、 さらに好まし くはほぼ同程度である。
また、 生体内における血 、板減少の有無は、 本発明の抗体を生体に投与後経時 的に採血して血小板数を常法により測定し、 投与前値また ί 対照となる個体の血 小板数と比較することにより確認する。 具体的な方法は実施例に示されている。 本発明の抗体による血小板数の変化は、 血小板上の G Ρ V Iを少なくとも部分的 に消失させる投与量または濃度において、 投与前値または対照群の値を 1 0 0 % として、 5 0 %以上、 好ましくは 7 0 %以上、 より好ましくは 9 0 %以上、 さら に好ましくはほぼ同程度である。 .
本発明の抗体は、 コラータンによるヒ ト血小板の凝集能を低下させる作用、 す なわち、 生体内に投与して血小板と接触させることにより I&L小板がコラーゲンに 応答して凝集する能力を低" rもしくは欠如させる作用を有するものである。 その 作用は、 本発明の抗体を生休内に投与して血小板と接触させた後、 経時的に血小 板を分離し、 コラーゲン惹起血小板凝集を測定することにより確認できる。 ここ で、 血小板凝集は公知の方:^去で測定し得るが、 例えば、 血 j、板凝集能測定装置等 で光透過率を指標として凝集率を計算することにより測定でき、 一般的には、 光 透過率が最大となる点の凝集率 （以下、 最大凝集率と称することがある） で表さ れる。 後述の実施例 8等に霍己載された方法において、 本発明の抗体は、 好ましく は l m g Z k g、 より好ま しくは 0 . S m g Z k gの投与量で、 投与前値または 対照群の値と比較して、好ましくは 4 0 %以上、 より好ましくは 8 0 %以上、 血 小板のコラーゲン凝集能を 下させる作用を有する。 . 本発明の抗体は、 好ましくは、 コラーゲン以外の血小板凝無を惹起する物質、 例えば A ID Pまたはトロンビンによる凝集に対してはほとんど影響せず、 コラー ゲン凝集能に影響する投与量または濃度で、 最大凝集率が好おしくは対照の 80% 以上、 よ り好ましくは対照の 90%以上、 さらに好ましくは対賑の 95%以上である。 コラーゲン以外の血小板凝集を惹起する物質によるヒト血小ネ の凝集の抑制を測 定する方法は常法によって行うことができる。
また、 才発明の抗体は、 出血時間の延長作用が弱い、 好ましくは有意な延長作 用がない、 より好ましくは実質的に延長作用がない抗体であ 。 出血時間は公知 の方法で 【J定でき、 具体的には実施例 2 8に記載された方法 §r適用できる。
現在まで報告されているヒト G P V Iに対する抗体のほと^どは、 前記ヒト自 己抗体を含めて、 in vitroにおいて抗体単独で血小板を活性ィ匕させる作用、 及び Zまたは、 血小板凝集を惹起もしくは促進する作用を有することから、 生体に投 与した場合、 血小板減少を引き起こす可能性が考えられる。 F a b断片等の形態 では、 血 ^、板凝集を惹起しないものも報告されているが、 生^:内においては、 何 らかの原因により F a bが架橋または凝集して、 I g G等と^!様な挙動を示す可 能性も完全には否定できない。 よって、 抗体の活性断片では く完全な抗体分子、 例えば、 I g Gの形態でも、 そのような作用を示さない、 ま fこは、 そのような作 用が低い抗 G P V I抗体が好ましい。
また、 生体内における動態及び安定性は、 自然の形態であら抗体分子、 例えば、 I g G等 優れている。 一般に、 血中半減期は F a b等の断 i "に比べて I g Gの 方が遥かに長く、 血栓症、 特に、 心房細動に伴う血栓症等の優性的疾患や長期間 の抗体投与が必要な病態においては、 血中半減期の長い分子衫態、 特に I g Gが 望ましい。
本宪明の抗体は血小板上の G P V Iとコラーゲンとの結合 ¾r特異的に阻害する ものであってもよい。 例えば、 後述の実施例に記載された方 feにおいて、 本発明 の抗体は G P V Iとコラーゲンの結合を好ましくは 100 g/mL以下で、 より好ま しくほ 10 JJL g/mL以下、 さらに好ましくは 1 g/mL以下、 特に好ましくは 0. 1 μ g/mL の濃度で 5 0 %阻害する抗体である。 コラーゲンと G P V Iとの結合を測定する 方法は特定の方法に限定されず、 他の常法により行うことができる。 本発明の第 2の態様は、 新規な G P V I の認識領域、 結合部位もしくはェヒ。 トープによって規定される抗 GPV I抗体であり、 好ましくはモノクローナル 体である。 本発明の抗体の G P V I上の認鐵領域等は公知の方法によって確認^ たは推定しうる。 例えば、 本発明の第 1 1の態様の方法を応用し、 第 8の態様 ペプチドまたは第 9の態様のポリペプチドとの反応性を測定することにより実: できる。 具体的な方法は実施例に示されてレヽる。 例えば、 実施例 7または実施 J 18に記載された方法において、 反応性もしくは阻害率が対照 （例えば、 hGP V I -Fc) と比較して有意に変化する、 例えば、 50 °/0、 好ましくは 30 %、 よ り好ましくは 10*¾以下となる場合、 また ί 、 I C 50等の値が有意に変化す 、 例えば、 3倍、 1 Ο倍、 より好ましくは 3 Ο倍、 さらに好ましくは 100倍と る場合を基準として確認又は推定しうる。 GP V I上の認識領域、 結合部位もし くはェピトープが據認された抗体は、 単独でまたは他の抗体との組合せにより、 特定の GPV I分子種を検出するために、 または、 GPV Iの構造及ぴ機能の圏 係を解析する目的においても有用である。
本発明の第 3の德様として、 新規な CDRアミノ酸配列または可変領域アミゾ 酸配列を含有する抗ヒト GP V I抗体がある。
抗体の重鎖およ 軽鎖の N末端側には可変領域が存在し、 それぞれ重鎖可変慎 域 （VH) 、 軽鎖可変領域 （VL) と呼ばれる。 可変領域内には相補性決定領域
^ coiri 1 ement ar i t y determining region; CDR) 力 Sォ子； f土し、 この部分力 f几原 識 の特異性を担って Χヽる。 可変領域の CD R以外の部分は、 CDRの構造を保持 1~ る役割を有し、 フ レームワーク領域 （FR) と呼ばれる。 重鎖おょぴ軽鎖の C 端側には定常領域: ^存在し、 それぞれ重鎖定常領域 (CH) 、 軽鎖定常領域
L) と呼ばれる。
重鎖可変領域中 ίこは、 第 1.の相補性決定領域 （ C D R 1 ) 、 第 2の相補性決 領域 （CDR2) ：およぴ第 3の相補性決定領域 （CDR3) の 3つの相補性決 領域が存在する。 重鎖可変領域中の 3つの相補性決定領域をまとめて重鎖相補' 決定領域と呼ぶ。 輕鎖可変領域中にも 様に、 第 1の相補性決定領域 （CDR 1) 、 第 2の相捕 生決定領域 （CDR2) およぴ第 3の相補性決定領域 （CDRL 3) の 3つの相捕寸生決定領域が存在する。 軽鎖可変領域中の 3つの相補性決定 f頁 域をまとめて軽鎖相補性決定領域と呼ぶ。
本 明の抗体の C D R配列は必ずしも限定されないが、 VH CDR1、 VH CDR2及び VH CDR3としてのアミノ酸配列の好適な組合せ、 VL CDR1、 VL CDR2及び VL CDR3と してのアミノ酸配列の好適な組合せは、 さらに、 VH CDR1、 VH CDR2、 VH CDR3、 ' VL CDRU VL CDR2及び VL CDR3としてのアミノ酸配列の好適な糸且合せは表 S及ぴ 9ならぴに表 1 2及ぴ 1 3に示されている。 好ましくは GPVIのループ 9 ¾r認識す る抗体の CDRァミノ酸配列のうち、 いずれか 1つ以上、 好ましくは H鎖の：3つ、 より好ましくは全てのアミノ酸配列を含有する抗体である。 C D R以外 ァミノ 酸酉 B歹 IJは特に限定されず、 C D R以外のアミノ酸配列が他の抗体、 特に、 他種の 抗体由来である、 いわゆる C D R移植抗体力 S本発明の抗体に包含される。 この内、 C D R以外のアミノ酸配列がヒト由来であるヒト化抗体が好ましく、 必要に応じ てフ レームワーク領域 （F R) に 1ないし数個のアミノ酸残基の付加、 失、 置 換及び/または挿入を伴っていてもよい。 ヒ ト化抗体の作製方法は公知 方法を 用いることができ、 具体的な方法は実施例に示されている。
本 明の抗体の V Hおよび V Lのァミノ陵配列は必ずしも限定されな Vヽが、 好 ましい抗体として、 V Hとして配列番号 2 S 1のアミノ酸配列もしくは とし て配冽番号 2 8 5のアミノ酸配列のいずれ 1つ以上を含有する抗体、 たは V Hと して配列番号 2 8 3のァミノ酸配列もしくは V Lとして配列番号 2 8 5のァ ミノ酸配列のいずれか 1つ以上を含有する^ ΐ体がある。
なお、 本発明の抗体は必ずしも特定のアミノ酸配列のものに限定され" Γ\ その 活个生及び/または抗原性に実質的に影響のない範囲で、 本発明の抗体の厂ミノ酸 配歹 Uにおいて、 例えば可変領域、 特に F R部分において 1ないし数個の厂ミノ酸 残基の付加、 欠夹、 置換及び/または挿入 許容される。
本 明の抗体は、 抗体の定常領域が好ましくはヒト抗体、 より好ましく はヒト I g G、 さらに好ましくはヒト I g G 4由 のアミノ酸配列からなる抗 である。 本件発明の抗体は特定の分子種に必ずし 限定されるものではない。 ifc体、 す なわち免疫グロブリンの構造は重鎖 （H鎖） およぴ軽鎖 （L鎖） とから り、 重 鎖のクラス （γ、 α、 μ、 δ、 ε ) により 5つのイソタイプ （IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE) に分けられる。 このうち IgGと Ig ま重鎖の違い （例えばヒト O場合、 y 1 y 2 , y 3、 y 4 , a l、 a 2 ) からサブクラス （例えばヒ トの場合 IgGュ、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl、 IgA2) に分けられる。 鎖は、 κまたは； Iのいずれカ のタイプこ分類される。 本発明の抗体はクラス、 サブタイプまたはイソタイプ ίま 限定されず、 いずれに分類されるものでもあってもよい。 好ましくはイソタイ 力 SlgGの抗体であり、 さらに好ましくは補体結合生のないという点においてサブ クラスが I gG4の抗体である。
本発明の抗体としては、 その活性、 例えば、 G P V Iとの結合能を有する限 において、 抗体の断片または一部でもよい。 例え Ϊま、、 Fab (fragment of antigen binding) 、 Fab'、 （Fab')2、 一本鎖抗体 （scFv) 、 ジスルフィド安定化抗体
(dsFv) 、 diabody、 sc(Fv)2 (例えば、 Orita T, Blood. 2005; 105:562-566参照） 、 nanobody (例えば、 Cortez-Retamozo V" Cancer Research 64, 2853-2857, 2004参照） 及び CDRを含有するペプチド等が挙げられる。 ¾た、 本発明の抗体は、 その抗 原結合価 fま必ずしも限定されず、 Fabもしくは scE のような一価抗体でも良いカヨ、 生体内、 特に血中での安定性、 G P V Iへの結合 生または作用の強度の観点から、 好ましく ίま、 二価以上の多価抗体、 例えば、 二価、 三価、 四価もしくは十価の^ ΐ 体、 より好ましくは、 二価抗体である。
本発明の第 4の態様として、 本発明第 1ないし第 3の態様の抗体をコードする ポリヌクレオチドまたは核酸が提供される。 該ポ リヌクレオチドは、 本発明の 体のアミノ酸配列をコードするものであれば必ずしも限定されず、 ポリヌクレ *~ チドとしては、 D NA及ぴ R NAが含まれる。
本発明の抗体の C D R配列をコードするポリヌ クレオチドは必ずしも限定は いが、 VH CDR1、 VH CDR2及ぴ VH CDR3としてのァミノ酸配列をコードする塩基配 列の好適な組合せ、 VL CDR1、 VL CDR2及び VL としてのアミノ酸配列をコー ドする塩基配列の好適な組合せは、 さらに、 VH C R1、 VH CDR2、 VH CDR3、 VL CDR1、 VL CDR2及ぴ VL CDR3としてのアミノ酸配列をコードする塩基配列の好適 組み合わせは、 表 8および 9ならびに表 1 2及び 1 3に示されている。
本発明の抗体の V Hおよび V Lのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド は必ずしも限定はないが、 好ましくは VHとしてのアミノ酸配列をコードする SB 列番号 87、 89、 91、 93、 95、 97、 99、 101、 103、 105、 107及び 109の塩基配列、 または V Lとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号 88、 90、 92、 94、 96、 98、 100、 102、 104、 106、 108及び 110の 基配列のいずれか 1つ、 よ 好ましくは両 方の塩基配列を含有するポリヌクレオチドであり、 また、 好ましく は V Hとして のアミノ酸配列をコードする配列番号の塩基配列、 または V Lとしてのアミノ酸 配列をコードする配列番号の塩基配 ijのいずれか 1つ、 より好ましくは両方の塩 基配列を含有するポリヌクレオチドである。
本発明の抗体の定常領域をコードするポリヌクレオチドは、 好 しくはヒト抗 体、 より好ましくはヒ ト I g G、 さ らに好ましくはヒ ト I g G 4お来の塩基配列 を含有する。
本発明の抗体のヌクレオチド配列を含有するべクターまたは遺伝子を細胞に移 入することにより、 本発明の抗体を產生する細胞を製造すること力 できる。 移入 方法は公知の方法に従うことができ、 具体的な方法は実施例に示されている。 本発明第 5の態様として、 本努明の抗体を産生する細胞が提供される。 このよ うな細胞の例としては、 ハイプリ ドーマ、 形質転換体、 または本 ¾明の抗体の遺 伝子を導入した遺伝子組換え細胞等がある。 抗体を産生するハイブリ ドーマとし ては、 具体的には表 6及ぴ 1 1に示されたクローンが挙げられる。 また、 本発明 により上記発明の細胞が産生する抗体が提供される。
本発明の第 8の態様及び第 9の態様により、 G P V Iに関連し 新規なぺプチ ドまたはポリぺプチドが提供される。 これらのぺプチド等は公知 ( 方法で作製で き、 具体的な方法は実施例に示されている。 第 8の態様のペプチドまたは第 9の 態様のポリペプチドは、 抗 G P V I抗体を作製するための免疫用 O投与抗原とし て、 または、 抗 G P V I抗体を検出するための抗原として使用し得る。
(製法） .
本努明の第 6の態様として、 抗 の生産方法が提供される。 本発明の抗体を作 製する方法には必ずしも限定はないが、 以下に記載の方法でも作製しうる。 すな わち、 ヒト G P V Iもしくはその断片またはそれらの誘導体、 例;^ば、 ヒ ト G P V I— F cを抗原として動物、 例えば、 マウスに投与し、 その末消血からリンパ 球を採取し、 マウスミエローマ細胞とのハイブリ ドーマを作製する。 作製したハ イブリ ドーマが産生する抗体を得て、 G P V Iとの結合能を有し、 第 1ないし第 3の抗体の特性を有する抗体を選択し、 この抗体を産生する 胞を得る。 この細 胞を培養することにより、 本発明の抗体を得ることができる。
本発明の抗体は、 么知の方法 （それぞれ Nature, 312 : 643, 1984 、
Nature, 321 : 522， 1986 以来、 多くの方法が開発されている） を用いた組換えヒ ト 抗体としても作製できる。 まず、 本発明の抗体を産生する細 包、 例えば、 リンパ 球、 好ましくは、 . G P V Iモノクローナル抗体を生産するノ、ィブリ ドーマより、 VHまたは VLをコードする核酸、 例えば cDNAを取得し、 塩基配 IJおよびァミノ酸配 列を決定する。 次に、 取得した VHおよび VLをコードする cDN を同一細胞又は別の ヒ ト細胞より作製したヒ ト抗体 CHおよび/またはヒ ト抗体 CLをコードする遺伝子 を含有する動物細胞用発現べクタ一にそれぞれ挿入してヒ ト抗体発現べクタ一を 構築し、 動物細胞へ導入し発現させることにより製造するこ とができる。 動物細 胞に導入する遺伝子の作製方法には限定はなく、 ハイプリ ドーマ由来のゲノム DNAまたは cDNAから得てもよく、 ハイブリドーマの mR Aから PCRによって得てもよ く、 また化学合成によっても得てもよい。
本発明の抗体の VHまたは VLをコードする核酸を組み込むベクタ一としては、 必 ずしも限定されない力 蛋白質遺伝子等の発現に汎用され、 特に抗体遺伝子の発 現に適合するベクターまたは高発現用ベクターが好ましい。 好適な例としては、 EFプロモーター及ぴノまたは CMVェンハンサーを含有するベクターが挙げられ、 例えば、 pEF-BOSまたは実施例で用いたベクターがある。 また、 通常 VHまたは VL をコードする核酸を組み込んだ発現べクターをそれぞれ作製し、 宿主細胞に c o t r a n s f e c tするが、 単一の発現ベクターに組み込んでも良い。
発現ベクターを導入する宿主細胞としては、 必ずしも限 されないが、 蛋白質 遺伝子等の発現に^ L用され、 特に抗体遺伝子の発現に適合する細胞が好ましい。 例えば、 細菌 （大 3 菌等） 、 放線菌、 酵母、 昆虫細胞 （SF9等） 、 哺乳類細胞
(COS- 1、 CH0、 ミエローマ細胞等） が挙げられる。
組換抗体を工業的に生産するためには、 一般的には当該 ifc体を安定して高生産 する ,袓換動物細胞拔、 例えば、 C H O細胞株が利用される。 そのような組換細胞 株の作製、 クローン化、 高発現のための遺伝子増幅及びスグ リーユングは公知の 方 ifeを用いることができる （例えば、 Omasa T.： J. Biosci. Bioeng., 94, 600- 605， 2002等参照） 。 また、 安定高生産動物細胞株の樹立にぉレ、て、 2種類のプ 口モータを使用するが、 プロモータ活性の異なる組合せ、 例えば、 活性の高いも の及ぴ低いもの、 を禾 IJ用することによって、 好ましくは相対的に活性の弱いプロ' モーターを選択マーカーの発我プロモーターとして利用するこ とで発現能の高い クローンを効率的 （選択的） ίこ取得し得る。 好適なプロモータ の組合せの例及び 具体的な方法は実施例に示されて ヽる。
糸且換えヒ ト抗体の作製に用 ヽるヒ ト抗体の定常領域としては、 例えば、 ヒト抗 体重鎖定常領域としては C<y 1や Cy 4、 ヒ ト抗体軽鎖定常領 としては C /c等 の任意のヒ ト抗体の定常領域を用いることができる。
本発明の抗体の内、 ヒトのアミノ酸配列を含有する抗体は、 ヒ ト体内に天然に 存在する抗体の他に、 可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブ ラリー、 例えば、 ヒ ト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジ エニック動物から得られる抗ィ本等も含まれる。 ヒト抗体ファージライブラリ一は、 ヒト B細胞から調製した抗体遣伝子をファージ遺伝子に揷入することにより Fab 、 一本鎖抗体等の抗体の活性断 をファージ表面に発現させたライブラリーである。 これらのライブラリーをスク リー ングすることによつても本 明の抗体は入手 され得る。 これらの方法およ 他の方法は、 当業者に周知である （Hu s eら， S c i e n c e 246 : 12 75— 1 281 (1989) 、 Wi n t e rおよ び： H[ a r r i s, I mmu n o 1. To d a y 14 : 243― 246 (1 99 3) ； Wa r dら， Na t u r e 341 ： 544-546 (1 989) ； Ha r 1 o wおよぴ L a n e， 前出， 1 988) ； H i l y a r d ら， P r o t e i n En g i n e e r i ng - A p r a c t i c a l a p p r o a c h (I R L P r e s s 1 992) ； .B o r r a b e c k, An t i b o d y E n g i n e e r i n g, 第 2版 (O x f o r d Un i v e r s i t y P r e s s 1 995) ) 。 該ライブラリーより、 抗原を固定ィ匕した基質に^する結合活性を指 標として所望の抗原結合活性を有する抗体の活性断片を発現レているファージを 回収することができる。 該抗体の活性断片は、 更に遺伝子ェ 的手法により、 2 本の完全な H鎖および 2本の完全な L鎖からなるヒト抗体分^ ~^ ·も変換すること 2T ができる。
本発明は童鎖 2本と軽鎖 2本からなる抗体のほかに、 本発明の抗体の活性断片 等も含まれる。 抗体の活性断片としては、 例えば Fab (fragment of antigen binding ) 、 Fab，、 F (ab' ) 2があり、 抗体の活性断片をリンカ一等で結合したも ■ のとして例免ば一本鎖抗体 （single chai n Fv ： scFv ) やジスルフイド安定化 抗体 （disul fide stabilized Fv ： dsFv) があり、 抗体の活性断片を含むぺプチ ドとして例えば CDR を含有するペプチド; 挙げられる。 これらは、 ；^:発明の抗体 を適当な蛋白分解酵素で処理する方法ま は遺伝子組換技術等、 公 の方法で製 造すること力 Sできる。
本発明の Fab は、 本発明の抗 G P V I抗体を IgMの場合はタンパク賀分解酵素 ペプシンで処理して、 IgGの場合はタンパク分解酵素パパインで処理 して得るこ とができる。 または、 該抗体の Fab をコ——ドする DNA を原核生物用 現ベクター あるいは真核生物用発現べクタ一に挿入し、 該べクタ一を原核生物 feるいは真核 生物へ導入することにより発現させ、 Fab を製造することができる。
本発明の F (ab，）2 は、 本発明の抗 G P ^ I抗体をタンパク質分解酵素ペプシン で処理して得ることができる。 または、 下記の Fab'をチォエーテル結合あるいは ジスルフィ ド結合させ、 作製することができる。
本発明の Fab'は、 G P V Iに特異的に反応する F (ab' ) 2 を還元剤 チオスレィ トール処理して得ることができる。
本発明の s cFvに含まれる VHおよび VLは、 本発明のハイプリ ドーマ; 産生する抗 体またはヒ ト抗体のいずれをも用いることができる。 本発明の scFvi 、 本発明の 抗 G P V I抗体の VHおよぴ VLをコードする cDNAを取得し、 scFvをコ1 ~ドする DNA を構築し、 該 DNA—を原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発與ベクターに 揷入し、該発現べクターを原核生物あるレヽは真核生物へ導入することにより発現 させ、 scFvを製造することができる。
dsFvは、 VTHおよび VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換した ポリべプチドを該システィン残基間のジスルブイド結合を介して結合させたもの をいう。 システィン残基に置換するアミノ酸残基は Reiterらにより示された方法 [Protein Engineering, 7, 697 (1994) ] に従って、 抗体の立体構造予測に基づ いて選択することができる。 本発明の dsFvに含まれる VHおよび VLは本発明の第 1 または第 2の態様の抗体のいずれに由来するものをも用いることができる。
本発明の dsFvは、 本発明の抗 G P V I抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取 得し、 dsFvをコードする DNA を構築し、 該 DNA を原核生物用発現ベクターあるい は真核生物用発現ベクターに挿入し、 該発現ベクターを原核生物あるいは真核生 物へ導入することにより発現させ、 dsFvを製造することができる。
CDR を含むペプチドは、 H 鎖または L鎖 CDRの少なくともュ領域以上を含んで 構成される。 複数の CDR は、 直接または適当なペプチドリンカ一を介して結合さ せることができる。 本発明の CDR を含むペプチドは、 本発明の抗 G P V I抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得した後、 CDR をコードする DNA を構築し、 該 DNA を原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、 該発 現ベクターを原核生物あるい fま真核生物へ導入することにより発現させ、 CDRを 含むペプチドを製造すること力 Sできる。 また、 CDR を含むペプチドは、 Fmoc法 (フルォレニルメチルォキシカノレボニル法) 、 tBoc法 (t-ブチルォキシカルボ二 ル法） 等の化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗体もしくは活性断片またはそれらの誘導体には、 例えばハイプリド 一マが産生する抗体、 E B Vを用いて形質転換した細胞が産生する抗体、 c D N Aより発現した組換え抗体、 またはそれらの抗体の活性断片 こ放射性同位元素、 タンパク質、 ペプチドまたは低分子の化合物などを化学的に結合させた抗体、 ま たは遺伝子工学的に融合させた抗体も含まれる。 例えば、 ポリエチレングリコー ル等を結合した抗体は、 安定个生等の点で有用性が高く、 好ま乙い例の一つである。 本発明の抗 G P V I抗体また fま抗体の活性断片の H鎖或いは L鎖の N末端側或レヽ は C末端側、 抗体または抗体の活性断片中の適当な置換基あるいは側鎖、 さらに は抗体または抗体の活性断片 ·の糖鎖に放射性同位元素、 タンパク質、 ペプチド あるいは低分子の化合物などを化学的手法 [抗体工学入門 （金光修著 1 9 9 4 年 （株） 地人書館） ] により凝合させることにより製造することができる。
ハイプリ ドーマとは、 リンノ 球と、 ヒト、 マウス、 ラット等に由来するミエ口 一マ細胞とを細胞融合させて得られる、 所望の抗原特異性を有したモノクローナ ル抗体を産生する細胞を意味し、 公知の方法により作製しうる。 モノクローナル抗体を作製する場合は、 細胞融合に使用するミエローマ細胞と の適合性を考慮して選択することが好ましい。 ミエローマ細胞は、 公知の種々の 細胞が使用可能である。 これにはヒ ト由来の SK〇一 007、 ヒトマウスへテロ ミエローマである SHM— D 3 3、 マウス由来の P 3、 P 3U 1、 S P 2/0、 NS— 1、 ラット由来の YB 2Z0及ぴ Y3— Ag 1， 2, 3等の骨髄腫細胞が 含まれる。
ヒト抗体の場合、 体外免疫によるリンパ球の活性化を利用してハイブリ ドーマ を作製する方法、 及び、 ヒ 卜抗体遺伝子を組み換えた動物、 特にトランスジェニ ックマウス、 例えば、 KMマウスを用いてハイプリ ドーマを作製する方法が挙げ られる。 （WO 2 0 02/0 70 6 48 (特表 2005 - 504507) 、 WO 20 02/ 04 3478 (特表 2004-515230) ) 異種の G.PV I、 例えばマウス GP V Iに ヒト G P V Iの部分ァミノ酸配列を組み込んだ蛋白質は、 上 SBのトランスジェ二 ック動物、 例えばマウスに免疫した場合、 GPV Iのマウスのアミノ酸配列には 反応せずに組み込まれたヒ 卜アミノ酸配列、 好ましくはェピトープ、 により反応 するヒ ト抗体が効率的に得られると考えられる。 よって、 この方法で得られたヒ ト抗体は、 本発明の第 1または第 2態様の抗体の特徴を有するヒ ト抗体として 用であり、 該方法は特に有用である。 ハイプリドーマ作製に用いる細胞としては、 必ずしも限定はざれないが、 ヒト抗体を作製する場合はハイブリ ドーマ作製に用 いる複数の細胞のうち少なく とも 1種はヒト由来の細胞であることが好ましい。 ヒト由来の細胞としては、 末梢血、 リンパ節または脾臓等のヒ トのリンパ球が用 いられ、 特に自己抗体の産生が確認されているヒトのリンパ球が好ましい。
リンパ球の活性化は公知の方法により行なうことができる。 例えば、 ヒトの 梢血又は脾臓から B細胞を採取し、 i n v i t r o i m ii n i z a t i o n法により抗原刺激し、 ヒ 卜の B細胞由来のミエローマ細胞あるいはマウス由 3fe のミエローマ細胞とのハィブリ ドーマを作製する方法、 EBVでトランスフォー ムし、 マウスミエローマ細胞と融合させる方法、 PWM等のマイトジヱンで刺 ¾ し B細胞をポリクローナル【こ活性化し融合させる方法 （免疫実験操作法 I · II、 右田俊介他編集、 南江堂） 等が好ましい。 '
動物を免疫するための投与抗原、 または、 細胞を刺激するテこめに用いる抗原 fc、 必ずしも限定はない。 抗原とするタンパク質の由来動物は、 抗体の使用目的に応 じて適宜選択し得るが、 天然物由来のもの、 遺伝子工学的に作成したもの、 化学 的に合成したもの、 他のタンパク質やペプチドとの融合タンパク質等、 レ、ずれで もよレヽ。 例えば血小板、 血小板の膜、 精製 GPV I、 組換え GPVI、 GPV · I - Fcを用いることができ、 好ましく は GPV I- Fcである。 また、 本発明第 8の 態様のぺプチドまたは第 9の態様のポリべプチドは、 抗 GPV I抗体を作製する ための免疫用の投.与抗原として好適 こ使用し得る。
活性化リンパ球とミエローマ細胞との融合は、 Milstein等の方法 (Methods in Enzymol. , 73卷 3頁） 等の公知の;^法を用いて行なうことができる。 · Μえば、 融合剤としてポリエチレングリコー レ （PEG) を使用する方法 （単クローン抗 体実験操作法入門、 安東民衛 ·千葉: 3tZ著、 講談社） または電気融合法等が挙げ られる。 免疫細胞とミエローマ細胞との混合比は、 それらが融合できる 1=匕率であ れば限定されないが、 活性化リンパ球に対し、 ミエローマ細胞を 1/1〇量ない し等量を使用することが好ましい。 ： PEG (平均分子量 1， 000〜4， 00 0) を使用して細胞融合を行なう方法では PEG濃度は必ずしも限定されないが 50 %で行なうことが好ましい。 また、 融合効率促進剤としてジメチルスルフォ キシド （DMSO) 等の捕助剤を添カロしてもよレ、。 融合は 37°Cに加温した PE G溶液を混合した細胞に添加するこ とにより開始し、 1〜 5分間反応後、 培地を 添加することにより終了する。
この融合により形成されたハイブリ ドーマをヒポキサンチン、 チミジン及ぴァ ミノブテリンを含む培地 （H AT培; ½) 等の選択培地で 1日〜 10日間培養し、 未融合細胞と分離する。 得られたハイプリドーマをその産生する抗体により更に 選択する。 選択したハイプリ ドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化 し、 単一クローン性抗体産生ハイプリ ドーマとして樹立する。
ハイプリ ドーマの産生する抗体の 性を検出する方法は公知の方法を梗用する ことができる。 ここで抗体の活性は、 第一段階として、 GPV I抗原へ (^結合能 を、 第二段階として、. GPV Iとコラーゲンの結合を阻害する活性を検 Hiする。 第一段階の活性の検出方法としては、 例えば EL I SA法、 ウェスタンプロット 法、 ラジオィムノアッセィ法が挙げられる。 第二段階の活性の検出法と！^ては、 例えば E L I S A法 （結合阻害型） 、 タンパク相互作用解析法 （B I C O R E 等） 、 血小板凝集抑制測定法が挙げ、られる。 また、 第 8の態様のペプ ドまたは 第 9の態様のポリペプチドは、抗 G" P V I抗体を検出するための抗原と して使用 し得る。 具体的方法は実施例に示されている。
樹立したハイプリ ドーマを公知 O方法で培養し、 その培養上清より ΐ "ノクロー ナル抗体を得ることができる。
抗体の精製は、.塩析法、 ゲル濾過法、 イオン交換クロマト法または厂フィニテ ィークロマト法等の公知の精製手 を用いて行うことができる。
抗体の濃度は公知のタンパク質 Ο定量方法、 例えば 2 8 0 n mにお^る吸光度 の測定により測定することができる。
本発明の抗 G P V I抗体の抗原 合性を確認する方法、 または本努 の抗 G P V I抗体を用いて生物試料中の G V Iを検出する方法としては、 蛍) 抗体法、 免疫酵素抗体法 (ELISA) 、 放射性 質標識免疫抗体法 (RIA) 、 免疫組 染色法、 免疫細胞染色法などの免疫組織化 染色法 （ABC法、 CSA法等） 、 ゥ:^スタンプ ロッテイング法、 免疫沈降法、 上霄己に記した酵素免疫測定法、 サンド^ rツチ
ELISA法 [単クローン抗体実験マニュアル （講談社サイェンティフィ ク、 1987 年） 、 続生化学実験講座 5免疫生匕学研究法 （東京化学同人、 1986年） ] などを 用いることができる。 (用途）
本発明の抗体は、 ヒ ト G P V I ίこ特異的に結合するものであり、 本 明の抗体、 抗体の活性断片、 化学物質と結合させた抗体の修飾物、 またはこれら CO混液を含 む組成物等は、 ヒトの疾患の予防、 診断および治療の用途、 また被験^;料、 細胞 および組織等のヒ ト G P V I.の検出の用途等を含めて、 種々の用途が foる。 用途：医薬
■ 本発明の抗体はヒト G P V Iへの結合の特異性が高く、 かつ、 単独ではヒト血 小板の活性ィ匕及ぴ または血小板減少を促進または惹起する作用が低レヽことから、 特に、 ヒトの疾患、 例えば、 血小板の活性化もしくは凝集、 または血管内皮障害 も しくは動脈硬化性の反応によって引き起こされる疾病の予防及び/ま は治療 に有効であり、 また、 血栓もしくは塞栓に起因する疾患、 例えば、 血栓定及び塞 症等の予防及び/または治療に利用することができる。 これらの疾患こは、 動 鹏 '性血栓症のみならず、 静脈性血栓症も まれ、 また、 心房細動に起因" る脳梗 塞も含まれる。
本発明の抗体により予防及び Zまたは？台療が可能なヒトの疾患または病態とし ては、 具体的には.、 心筋梗塞、 血栓溶解療法時、 経皮的冠静脈内腔拡張銜施行時、 ステント施行時、 バイパス手術施行時も しくは人工血管施行時の、 また Ϊ これら 後の血管内皮肥厚、 血管再狭窄、 狭心症もしくは心筋梗塞、 心房細動 しくは 心、房粗動及びこれらに起因する血栓症、 塞栓症もしくは脳梗塞、 閉塞性 ώι栓性血 管炎、 急性動脈閉塞症、 閉塞性動脈硬化症または深部静脈血栓症等があり、 脳梗 塞 （ァテローム性血栓性梗塞、 ラクナ梗塞、 心原性梗塞） 、 一過性脳虚 ώι発作、 く も膜下出血後の脳血管攣縮、 肺血栓、 J市塞栓症、 血管性紫斑病、 特発†生血小板 咸少 'I生紫斑病、 血栓性血小板減少性紫斑病、 播種性血管内凝固症候群、 体外循環 での血液凝固防止、 全身性エリテマトーデス、 多発性動脈炎、 抗リン I旨質抗体 侯群、 紫斑病性腎炎、 糖尿病に伴う内皮細胞傷害、 糖尿病性腎炎、 糖 病性網 漠症、 腎塞栓、 移植治療に伴う合併症 （月干静脈閉塞症、 移植片対宿主病） 等が挙 デられる。
本発明の抗体は、 また、 先述の予防反ぴ /または治療対象の疾患に対して、 単 独で投与されるか、 あるいは他の薬理 ί&性成分と併用されることもできる。 かか る薬理活性成分とは、 例えば公知の血栓溶解剤 （例えば組織プラスミノーゲンァ グチベータ一 （t _ P A) ならびにそ らの誘導体 （改変体あるいはい fc>ゆる第 二世代といわれるものも含む） 、 ゥロ ナーゼ、 ストレプトキナーゼ） 、 あるい ίま公知の抗血小板薬 （例えばアスピリン、 チクロビジン、 クロピドグレ / 、 ト口 ンポキサンアンタゴニスト、 トロンポ サン合成阻害剤、 GPII b /III a アンタ ゴニスト） 、 公知の抗凝固薬 （例えばヮーフアリン、 へパリン、 低分子へパリン、 ペンタサッカライド、 トロンビン阻害剤、 F X a阻害剤、 FVII a阻害剤） など 力 S挙げられる。 ここで併用とは、 本発 0月の抗体と、 当該薬理活性成分とをともに 含む合剤を投与する他、 本発明の抗体と 当該薬理活性成分とがそれぞれ別個の製 剤として一時期にもしくは時間をずらして 与される場合をも含み、 患者の血1 ψ におレヽて同時に存在する限りにおいて投与 形態は問われない。
本発明の抗体ならびに製剤学的に許容さ; ^る組成物を有効成分として含有する 医薬品は、 通常用いられる製剤用の担体や貝武形剤、 その他の添加剤を用いて例え ば錠剤、 注射剤、 散剤、 坐剤等に調製ざれ、 人間その他の動物に対して投与さ^ る。
ヒ 卜に適用する場合、 その投与経路は、 凝口投与、 静脈内投与 （ボーラス投 、 連続点滴、 間欠的点滴） 、 皮下投与、 筋肉 投与、 関節内投与、 経皮投与、 経濞 投与等があるが、 通常、 経口投与または静赚内投与である。 本発明の抗体のヒ ト に対する臨床投与量は適用される患者の症求、 体重、 年齢や性別等を考慮して 31 宜決定されるが、 通常成人一日あたり、 静赚内投与で 1〜1 0 0 0 O m g、 好ま しく ίま 1 0〜1 0 0 O m gであり、 これを 1回あるいは数回にわけて投与する。 投与量は種々の条件で変動するので、 上記 与量範囲より少ない量で十分な場 もある。
ここで、 本発明の抗体は G P V Iを認識寸る点で共通するものの、 本発明は なる機序を有する多様な抗体を包含するも である。 例えば、 G P V Iとコラー ゲンの結合を直接阻害する、 または G P V Iを切断することにより血小板の活 4生 化及ぴ Zまたは凝集を抑制する抗体は比較^)即時的な効果を期待できるので、 なく とも疾患の急性期 （例えば、 心筋梗塞時もしくは P T C A寒施時またはそ^ L らの直前もしくは直後） において有用である可能性がある。 このような場合には、 好ましくは血中の血小板表面の G P V Iの 部分に本発明の抗体を結合させる めに 匕較的大量の抗体を投与、 例えば、 単 J1Iもしくは分割静注または点滴静注す ることができる。 また、 G P V Iを内部に: ¾り込ませる抗体は即時的効果を期 寺 することはできないかもしれないが、 ヒト 小板の血中での寿命 （9〜1 0日 後） 及びヒト抗体の血中半減期 （I g Gの場合、 数週間） を考慮すると持続的な 効果が期待できるので、 例えば、 疾患の慢 生期 （例えば、 心筋梗塞発症後または P T C A実施後数日〜数ケ月） において有月である可能性がある。 このような場 合に ί 、 血中の血小板のコラーゲンに対する反応性を部分的に、 好ましくは完全 に、 阻止する程度に血小板表面の G P V I を消失させるために必要な量の抗体を 比較的間隔を置レヽて、 例えば、 1クールを数日から数適間として、 投与、 例えば、 単回もしくは分割静注または点滴静注することができる。 従って、 好ましい態様 において、 本発明の抗体はこれらの効果を併せ持つて 良い。 また、 それぞれの 効果が期待できる抗 G P V I抗体を複数組み合わせた？台療を実施しても良い。 . 非経口投与のこめの組成物は、 通常、 許容される担 f本、 好ましくは水性担体中 に溶解された免疫グロブリンの溶液又はそれの混液を含む。 種々の水性担体、 例 えば、 水、 緩衝氷、 リン酸塩緩衝生理食塩水 （P B S ) 、 0 . 4 %生理食塩水、 0 . 3 %グリシン、 ヒトアルブミン溶液等が用いられ得る。 これらの溶液は、 無 菌であり、 そして一般的には微粒子物質が存在しない。 これらの組成物は、 慣用 の、 良く知られた滅菌方法により滅菌されうる。 組成物は、 生理学的条件に近づ けるために、 要求に応じて、 薬学的に許容できる捕助物質、 例えば p H調節及び 緩衝化剤、 毒性調節剤等、 例えば酢酸ナトリゥム、 塩ィ匕ナトリゥム、 塩ィ匕カリゥ ム、 塩化カルシウム及ぴ乳酸ナトリウムを含みうる。 これらの製剤中の抗体の濃 度は、 広範囲に、 即ち、 約 0 . 0 0 5重量％未満 （通 は、 少なくとも約 1重 量％) から 1 5又は 2 0重量％と大きい量まで変化することができ、 主として、 選択された投与の特定の様式に従って、 液容量、 粘性等に基づいて選択される。 非経口投与組成物を調製するための現実の方法は、 才技術分野の熟練者にとつ て公知又は明白であり、 例えば、 レミントンズ ファーマシューティカル サイエ ンス （第 1 5版、 マック パブリッシング カンパニー、 ィーストン、 ペンシルノ ニァ、 1 9 8 0 ) (本引例をもって本明細書の一部と威す） に更に詳細に記载さ れている。 洗浄 （ l a v a g e ) 又はその他のルートのために適した組成物は、 意図される特定の使用に従って選択される。 いくつかの薬学的組成物は、 抗 G P V I抗体及びそ (^疾患に於いて常用される他の治療剤を含みうる。 いずれの場合 も、 ポーラス投 おょぴ持続投与が適用されうる。 まプこ、 予防的または治療的有 効量は、 対象疾患、、 病態おょぴ患者の状態等によって 31宜決定される。
本発明の抗体 ί 、 貯蔵のため凍結又は凍結乾燥され、 使用に先だって適当な担 体中で再構成されうる。 この技術は、 慣例の免疫グロブリンにおいて有効である と知られており、 公知の、 凍結乾燥及び再構成技術が月いられ得る。 凍結乾燥及 ぴ再構成が、 様 な程度の抗体の活性損失をもたらし うる （例えば、 慣例の免疫 グロブリン、 I g M抗体 ί 、 I g G抗体よりも大きい活性撗失を生じる傾向にあ る） ということ、 及び使用レベルが、 それを捕うために調節されなければならな いかもしれないということは、 当業者にとって認識されるこ とである。 用途： G P V I検出
本発明の抗体または抗体の活性断片を用いて、 被検試科中の G P V Iを検出す る方法は、 被験試料と本発明の抗体または抗体の活性断片を接触させる工程、 本 発明の抗体または抗体の活性断片に結合した被検試料中の G" P V Iを検出するェ 程を含み得る。 被検試料中の G P V Iを定量する工程を更に含んでも良い。 被験 試料中の G P V Iを検出する方法により、 疾患の診断を行う ことができる。 特に、 ヒトの疾患、 例えば、 血 ¾k性、 塞栓性または動脈硬化性の疾患の診断に利用する ことができる。
本発明の抗体を用いて、 被検試料中の G P V Iを検出する方法としては、 サン ドィツチ E L I S A系、 インヒピション ELISA系、 蛍光抗 法、 免疫組織化学染 色法、 放射性物質標識免疫抗体法、 ウェスタンプロッティ：^グ法、 免疫沈降法な どがあげられるが、 これらに限定されるものではない。 対象となる被検試料は限 定されないが生物試料が用いられ、 動物、 特にヒトの体液 ¾>るいは、 組織、 細胞 およぴ菌体ならぴにそれらの抽出液、 培養上清、 塗末標本 *5よび切片が挙げられ るが、'血小板または血漿あるいは血清であることが好まし ヽ。
また、 血小板上の G P "V Iを測定することにより、 G P Iと関連した治療の モニタリング、 特に、 血 、板上の G Ρ V Iの消失を指標として、 抗 G Ρ V I抗体 の効果予測もしくは判定、 または予後の判定等に応用しう 。 実施例
以下の実施例により本努明を更に詳述するが、 本発明はこれら実施例に限定し て理解されるべきもので ίまない。 実施例 1 ―
. G P V I細胞外領域 - Fc融合蛋白質の作製 A. ヒト GPV I細胞外領域-マウス Fc融合蛋白質 （hG P V I - mFc) の作製 (1) hGP V I- mFc融合蛋白 現プラスミ ドの構築
マウスゲノム DNAを铸型とし、 マウスィムノグロブリン （mIgG2a> 重鎖定常領 域の各ドメインをコードする遣ィ云子領域を増幅した。 すなわち、 下のプライマ 一対で PCR反応を行った。 その結果、 mIgG2a-a (配列番号 152) お^び mIgG2a - c (配列番号 154) では CH1ドメイ ン、 mIgG2a- b (配列番号 153) および mIgG2a - e (配列番号 156) ではヒンジ部分、 mIgG2a-d (配列番号 155) およ U¾IgG2a- g (配 列番号 158) では CH2ドメイン、 ； mIgG2a- f (配列番号 157) および mIgG2a- h (配列 番号 159) では CH3ドメイン増幅した。 次にこれら 4種の増幅産物 混合し、 プラ ィマー mIgG2a - aおよび mIgG2a- hを用いた PCR反応を行うことで、 各 ドメィンが連 結された増幅産物 （重鎖定常領域 (Cy2a) をコードする DNA断片） を得た。 この 増幅産物を pT7 - BlueTベクター【こクローニングした後、 マウス Fc領域をコードす る DNA断片を制限酵素 Bam HIおよび Kpn Iで切り出して断片 Αを調 した。 一方、 pCAGGS-G P V I- Fcプラスミドカ らヒト GPV Iの細胞外ドメイ をコードする DNA断片を制限酵素 Xba Iおよび、: Bgl IIで切り出し、 断片 Bを調製した。 これらの 断片を、 Xba I および Kpn Iで切断して調製した発現ベクター pEF2cewの EFプロモ —ター下流に、 断片 A+断片 Bとなるように連結し、 hGPV I- mFc (配列番号 222) を発現するプラスミド （pTK- 2249) を構築した。 (2) hGP V I-mFc融合蛋白質の発現おょぴ精製
COS- 1細胞は 10%牛胎児血清人りの^ルべッコ MEM培地で継代し、 pTK- 2249をト ランスフエクシヨン試薬 （FuGENE6、 ロシュダイァグノスティックス） と適当量 混和した後に、 無血清のダルベッコ MEM培地に滴下し、 これを培養 と交換する ことでトランスフエクショ を行った。 5% C02存在下、 37°Cで 3日 間培養し、 そ の培養上清をプロテイン Aカラム （Prosep - A、 MILLIP0RE) にて精 したものを 抗ヒト GPV I抗体作製用の 原とした。
B. ヒ ト GP V I細胞外領域- ヒ ト Fc融合蛋白質 QiGPV I- hFc) 発現プラス ミド TK- 2233) の構築お 発現 ' ヒト hGP V I - hFcをコードする遺伝子をもつプテスミ ド （pCAGGS - GP V I - Fc) を制限酵素 Xba Iおよひ 'Eco T22Iで切断して得 れた断片 J、 制限酵素 Eco T22Iおよび Bgl 切断して得られた断片 Kとそれぞれ調製し、 発現プラスミ ド pEF2cewの EF- 1α ロモーター下流に断片 J+Kとなるように連結して hG P V I -' hFc発現プラスミド、 (pTK-2233) を構築した。 なお、 hG Ρ V I - hFcの発 |¾および 精製は hG P V I - mFcの場合と同様に行つた。 ，
C. マウス GPV I細胞外領域-ヒ ト Fc融合蛋白質 （niGPV I- hF c) 発現 プラスミ ド （pTK-2440) の構築
マウスゲノム DNAを铸型とし、 表記のプライマー针で PCR反応を行った。 その結 果、 mGPV I- h (酉己列番号 162) および mGPV I - i (配列番号 163) で PCRlf幅 産物 hi、 mGPV I -j (配列番号 164) および mGP I- k (配列番号 165) で PCR 増幅産物 jk、 mGP V I- 1 (配列番号 166) および niG"PV I- m (配列番号 L 67) で PCR増幅産物 lm、 mGPV I- n (配列番号 168) およ 0½G P V I -o (配列番号 169) で PCR増幅産物 no、 mG P V I -p (配列番号 170) および mGPV I- c (配列 番号 160) で PCR增幅産物 pcが得られた。 これらの增 Φ畐産物を混合して铸 とし、 さらにプライマー mGP V I- e (配列番号 161) 、 mG- P V I -q (配列番号 171) 、 mG P V I -r (配歹【J番号 172) 、 mG P V I - s (配歹 U番号 173) および mG P V I— c を混合して PCR反 を行うことで、 各断片が連結された増幅産物を得た。 この増 幅産物を pT7- BlueTベクターにクローユングし、 pTK— 2437とした。 ρΤΚ- 2437のマ ウス G Ρ V Iの細月包外ドメインを含む遺伝子領域には 5，側に制限酵素 Nhe Iの認 識部位、 3'側には Bam HIの認識部位を有しており、 これらの酵素で切断し、 DNA 断片を調製した。 そしてこの断片を制限酵素 Xba Iおよび Bam HIで切断して調製 した pTK - 2233に揷スしてマウス mGPV I— F c発我プラスミド （pTK— 2 40) を 構築した。
D. 力-クイザル GPV I細胞外領域-ヒト Fc融合 ¾白質発現プラスミ の構築 (1) 力二クイザノレ D1D2 -ヒト D3キメラ GPV I -ヒト Fc融合蛋白質発現ブラス ミドの構築 既知配列であるヒト GPV Iの遺伝子情 に基づき、 適当なプライマー対を設 計および調製し、 これらのヒ ト GPV Iプライマーを用いて、 力二クイザノレのゲ ノム DNAを铸型とした PCR反応を行うことで、 力-クイザル G P V I遺伝子配 IJの 一部を決定した。 次に、 その配列を基に新ナこに力二クイザル用のプライマー対を 設計および調製し、 各プライマー対で力-クイザルのゲノム DNAを铸型とした: PCR 反応を再度行い、 macGPV I- a (配列番号 174) および macG P V I - b (配列潘 号 175) で増幅産物 abを、 hGPV I- d (配 lj番号 180) および macGPV I- c (配 列番号 176) で増幅産物 dcを、 macGPV I— d (配列番号 177) および hGPV I - h (配列番号 182) で増幅産物 dhを、 hGPV I -g (配列番号 181) および macGPV I-g (配列番号 178) で増幅産物 ggを得た。 一方、 pTK- 2233を錄型とし、 macG Ρ V I-h (配列番号 179) および IgGl- i (配 (J番号 183) を用いた PCR反応で増幅産 物 Mを得た。 以上の 5種類の増幅産物を混合して铸型とし、 macGPV I-aおよ ぴ IgG卜 iによる PCRを再度行つ-た。 この操作で得られた増幅産物は、 力二クイ ザ ノレ GP V Iの D1および!) 2と、 ヒ トの 1)3を¾合したキメラ GP V I遺伝子を含んで おり、 制限酵素 Nhe Iおよび Bam HIによる切断後、 制限酵素 Xba Iおよぴ Bam K Iで 切断して調製した pTK- 2233に揷入して、 力二クイザル D1D2 -ヒト D3キメラ G Ρ V I -ヒト Fc融合蛋白質 （GPV I- FFH— h F c、 配列番号 223) 発現プラス ミド (pTK-2462) を構築した。 実施例 2
抗ヒ.ト GPV I抗体の作製
Α. ゥサギポリクローナル抗体の作製
ヒト GPV Iに対するポリクローナル ¾t体を作製するため、 ゥサギに免疫 ¾r行 つた。 すなわち、 実施例 1 Aで調製した h GPV I-mF。 20 δを 50 0 μ 1の生理食塩水に希釈し、 500 /X 1のブ ロインド完全アジュパント （D I F C O) と等量混合した後、 雌性ニュージーヲ ンド白色ゥサギ （北山ラベス） 2. 1 一 2. 2 k gの背部皮下に投与した。 2 間後、 再度、 hGPV I- mF c 2 0 μ gを 500 μ 1の生理食塩水に希釈し、 5 00 1のフロインド不完全アジュ バント （D I FCO) と等量混合後、 背 ¾5皮下に投与した。 投与終了 1週間錢耳 静脈より採血し、 定 にしたがい抗血清を分離し、 抗体を精製した。 すなわち、 抗血清に最終飽和濃度 3 3 %となるように硫酸ァンモニゥムを添加し、 4でで 1 時間攪拌後、 析出しこ沈殿を遠心分離した。 次に沈殿をダ / べッコリン酸緩衝液 (以下、 D— PBSと記載） で溶解し、 D— PB Sにて一夜透析した。 透析液を 濾過後、 プロテイン カラム （プロセップ A、 ミリポア） ίこ供し、 結合した I g G画分を 0. 1Mグリ シン塩酸緩衝液（p H3. 0)で溶出することにより、 精製 抗体を得た。 得られこ溶出画分は 1Mのトリス塩酸バッファー （pH7.0) にて 速やかに中和し、 D— PB Sで透析後、 2 8 O nmの吸光度より蛋白濃度を算出 した （吸光係数： 0. 7 1 4mg/mL) 。 以降、 得られた抗体を抗 G P V Iポ リクローナル抗体と言己载する。
B. 抗ヒト GPV Iモノクローナル抗体の作製
GPV I— mF c 2 O gとフロインド完全アジュバント （D I FCO) を等 量混合し、 投与抗原と した。 雌性 d dYマウス （8週令、 S LC) に投与抗原を 2回投与し、 3日後 ίこ、 リンパ節よりリンパ球を分離した。 得られたリンパ球を Ρ 3 X 6 3 -Ag. 8 . U 1 (ATTC) と混合した後、 ポリエチレングリコー ル （PEG 1 500、 S i gma) を用いて安東民衛 ·千集丈 著 「単クローン 抗体実験操作入門」 （講談社、 p 8 3) にしたがって細胞融合を行った。 HAT 培地によりハイプリ ドーマを選択し、 1週間後目的の抗体を産生しているハイブ リドーマのスクリーニングを 2種類の方法で行った。 すなわち、 プレートに固相 化した hGPV I- h F cに対する結合活性を指標とする:^法及びコラーゲンと GPV Iの結合阻害活性を指標とする方法を使用した。
(1) 結合活性を指標としたハイプリ ドーマのスクリーニング
実施例 1 Bにより調製した hGPV I— hF cを D— Ρ Β· Sで 2 μ g/mLに 希釈し、 ィムノプレート （Ma x i s o r p、 NUNC) こ 5 0 μ L/ゥエル添 加した。 3 7°Cで 1時間反応後、 イオン交换水で 5回洗浄 L、 2 % S t a b i 1 Gu a r d (S u rmo d i c s) を含む D— P B S (pK 7. 4) を各ゥエル に 100 μ L添加してブロッキングした。 次に培養上清を^ &ゥエルに添加し、 3 7 °Cで 1時間反応させた後、 0. 0 5%Tw e e n 20を含む生理食塩: で 3回 洗浄した。 ペルォキシダーゼ標識抗マウスィムノグロブリン抗体 （DA3 O、 P 2 6 0) を 1 0%ゥサギ血清含有 D— P B Sで 1 000倍に希釈し各ゥュルに 5 Ο /i L添加した。 3 7°Cで 1時間反 j ^後、 同様に 5回洗浄し TMB溶液 （B i o F i x) を各ゥエルに添カ卩した。 室温で 1 0分間反応後、 0. 5M硫酸蒋液で反 応を停止し、 プレート分光光度計 （マルチスキャン J X、 大日本製薬） 4 50 nmの吸光度を測定した。 その結果、 hGPV I- h F cと反応した細包を選択 し、 限界希釈法 （安東民衛 ·千葉丈,著 「単クローン抗体実験操作入門」 （講談 社、 p 97) によりクローニングを行った。 8日後、 同様にスクリーニングを行 レ、、 hGPV I- h F cと反応する抗体を選択した。
(2) コラーゲン- GP V I結合阻害活性を指標としたハイプリ ドーマ Oスクリ 一二ング
D-PB Sでコラーゲン (Ho r n) を 1 0 μ g/mLに希釈し、 ィ ムノブレ ート （Ma X i s o r p、 NUNC) に 50 L/ゥエル添加した。 4 で一夜 反応後、 イオン交換水で 5回洗净し、 5%B S Aを含む D— PB Sでブロッキン グした。 次に培養上清を 25 μ LZゥエル添加し、 さらに D— PB Sで 2 z gZ mLに調製した hGPV I— hF cを 2 5 L/ゥエル添加し、 37°Cで 1時間 反応させた後、 0. 0 5%Twe e ra 20を含む生理食塩水で 3回洗浄した。 ぺ ルォキシダーゼ標識した抗一ヒト I g G抗体 （B i oMe d a) を 1 0 /0ャギ血 清を含む D— PB Sで 1 000倍に希釈し各ゥエルに 50 μ L添加した。 3 7°C で 1時間反応後、 同様に 5回洗浄し ΤΓΜΒ溶液 (B i o F i x) を备ゥエルに添 カロした。 室温で 1 0分間反応後、 0. 5 M硫酸溶液で反応を停止し、 ブレート分 光光度計 （マルチスキャン J.X、 大日本製薬） で 450 nmの吸光度を: 定し、 抗体無添力卩のゥエルの吸光度に対して 5 0%以上吸光度が低下したゥヱルを、 抗 GPV I抗体を産生するハイブリドーマとして選択した。
その結果、 複数回の細胞融合（F番号が 1回分を示す） により、 コラーゲンと GPV Iの結合阻害活性を有するハイプリ ドーマを選択した。 (3) ハイブリ ドーマが産生する抗体の作製
抗 GP V I抗体を産生するハイブリドーマを 1 0%FC SZRPM I - 1 S 4 0培地 （ S i gma) で培養後、 Hyb r i d o ma— S FM培地 （ I n v ί t r o g e n) に交換して培養することにより抗 を産生させ、 培養上清からプロ ティン Aカラム （P r o s e p— rA、 ミリポ ） を用いて抗体を精製した。 す なわち、 得られた培養上清を予め D— PB Sにて平衡ィ匕したプロティン Aカラム (P r o s e p— A、 Mi 1 1 i p o r e) に 着させ、 非吸着蛋白質を D— P BSにて洗挣した後、 25 mM グリシン一塩酸バッファー （pH 3. 0) にて吸着面分を溶出した。 その後、 生理食塩水 ίこて透析を行った。 得られた^:体 の濃度は 2 80 nmの吸光度より吸光係数 （El° ： 1.4) を用いて算出した。 ¾ 降、 得られた抗体を抗 GPV Iモノクローナル^:体と記載する。 実施例 3
抗 G P V Iモノクローナル抗体のグループ分鎮
実施例 2で得られた抗体を GPV Iへの結合 性、 すなわち結合領域の違レ、に より分類するため、 F 1199、 F 1201、 1202, F 1210及び F 1 211の各抗体を用いて競合アツセィを行なつこ。 まず、 中根らの方法 （J. H i s t o c h em. Cy t o c h em. ， 22， 1084, 1974) に従レ、、 各抗 G P V Iモノクローナル抗体のペルォキシダーゼ標識抗体を調製した。
次にこれらのペルォキシダーゼ標識抗体を用 Vヽて各精製抗体との競合アツセィ を行い、 抗体を分類した。 すなわち、 D— PB S>で hGPV I- hF cを 2 g /mLに希釈し、 ィムノプレート （M a x i s ひ r p、 NUNC) に 50 μ L/ ゥヱル添力 Bした。 37°Cで 1時間反応後、 イオ 交換水で 5回洗浄し、 2%S t a b i 1 G u a r dを含む D— PB Sを各ウエノレに添カ卩しブロッキングした。 次 に、 上記の標識抗体 25 μ Lと各精製抗体 25 ^ Lをゥエルに添加し、 37°Cで 1時間反応させた後、 0. 05%Twe e n2 Oを含む生理食塩水で 5回洗净し、 TMB溶液 （B i o F i.x) で発色させた。 室温で 10分間反応後、 0. 5M硫 酸溶液で反 を停止し、 プレート分光光度計 （ ルチスキャン J X、 大日本製 薬） で 45 0 nmの吸光度を測定した。 精製抗体を添加していないときの吸光度を 1 0 0 %として、 各標識抗体に対す る阻害活性を算出し、 各精製抗体の分類を行った。 そ o結果、 標識抗体
(i)，（ii)， (v) , (vii i)と競合したものをグループ aとしナこ。 標識抗体
(i)， (v) , (vii)と競合反したものをグループ bとした。 標識抗体
(i)，（ii)，（vii), (viii)と競合したものをグループ cと した。 また、 標識抗体 (iii) , (iv)と競合したものをグループ dとした。 標識^:体（iii)， (iv) , (vi)と競 合したものをグループ eとした。 標識抗体 (iii) , (vi)としたものをグループ f と した。 また、 規則' I"生が見られなかったものをグループ g及ぴグループ hとした。 グループ gとグループ hはお互いには競合しないので 3 IJグループとした。 従って、 作製した抗 G P V I モノクローナル抗体は G P V Iの表面上の少なくとも 8種類 の領域を認識してレヽることが確認された。 実施例 4
サル e x V i V o試験に供した抗体のグループ分顏
作製した抗ヒト G P V Iモノクローナル抗体のうち、 サル G P V I と結合し e X v i v o試験に使用可能な抗体を実施例 3で行つ グループ分類の方法に従 つて分類した。 すなわち、 実施例 3で作製した各標識抗体を用いて実施例 3と同 様の方法で競合アンセィを行い、 各抗体を分類した。 表 1に示すように実施例 3 同様に少なくとも 7種類の領域を認識する抗体群に分顏された。 表 1
グループ a F1232-10-1
グループ b F1232-16-1
グループ c F1232 - 39 - 3 F1232-21-1 F1232-13-3
グループ d F1232-7-1 F1232- 9 - 1 F1232-11-1
F1232-19-1 F1232-37-2 F1201-1S
グループ e F1232-17-1 F1232-18-3
グループ f F1232 - 8- 3 F1232-14-2 F1232-15-1 F1232-24-1
F1232-38-1 F1232-45-1 F1232-29-2
グループ g F12O1-20 F1232 - 27 1
グループ li F1232-43-3 実施例 5
抗 G P V Iモ Zクローナル抗体の解離定数の算出
実施例 2におレヽて作製した抗 GPV Iモノクローナル抗体の解離定数を、 蛋白 相互作用角军析装置 B I ACORE 3 000 (B I ACORE> を用いて測定した。 すなわち、 セン 1^ "一チップに実施例 1で作製した GPV I置換体 （hGPV I H HH-h F c及び F FH - h F c) をマニュアルに従って CM 5チップ (B I AC ORE) に結合レた。 つぎに、 各抗体を HB S- E P緩衝液 （B I ACORE) で希釈し、 1. 2 5から 40 nMまでの希釈系列を調製し、 E I ACORE 3 0 00にて解析した。 各抗体の結合ごとに pH l. 5のグリシン緩衝液 (B I AC ORE) でチップを再生した。 得られた結果を e V a 1 u a t i o nソフ ト （B I ACORE) COB i v a 1 e n t a n a 1 y t eを用いて解析し、 解離定数 を算出した。 結果を表 2に示す。 今回作製した各抗 GPV Iモノクローナル抗体 は GPV I -HHH- F cに対して、 十分な親和性を有していることが示され た。 表 2
分類 抗体名 解離定数 (KD) M
ヒト GPVI サル GPVI
ダル -プ a F1232- 10- -2 8.33X10一10 1.09X10"9
ダル -プ c F1232- ■21- -1 1.39X10— 9 3.56 X 10—9
グル^" -プ d F 1232 - ■7-1 3.47 X 10—8 3.43 X 10"7
F1232- 19- -1 1.75X10—9 2.35 X 10— 9
F1232- -37- -2 4.03 X 10"10 1.00X10-9
F1201- ■18 1.16X10 6.19 X 10"10
ダル -プ e F1232- -17- -1 5.22 X 10— 10 1.77 X 10"10
F1232- -18- -3 1.65X10—9 3.65 XI 0ー7
グル^" -プ f F1232- -14- -2 1.56X10—8 2.14X10-8
F1232- ■24- -i 2.5 X 10— 10 7.1 X 10"10
グル^" -プ g F1201- -20 1.50X10-8 7.55X10
グル -プ h F1232- -43- -3 1.36X10 1.69X10一9 実施例 6
' 抗 GPV Iポリクローナル抗体を用いたサンドイッチ E I A系の作製 サンドイッチ E L I S A系を作製するため、 実施例 2で得られた抗 GPV Iポ リク口一ナル抗 を実施例 3と同様にペルォキシダーゼで標識した。 次に抗 G P V Iポリクロー ル抗体固相化プレートを調製した。 すなわち、 抗体を D— PB Sで 10 μ g/πχ Lに希釈し、 ィムノプレート （Ma x i s r p , NUNC) · の各ゥエルに 50 添加し、 45 °Cにて 30分間反応させた。 次にイオン交換 水で 5回洗浄し、 2%S t a b i l Gu a r d (Su rmo d i c s) を含む D 一 PBSを各ゥ ノレに 100 L添加しブロッキングした。 標準品は精製 GPV 1 _11? を0. 1 %B S A/D— PB Sで 0. 75、 1.5、 3. 1. 6.25、 12. 5、 25、 50 n g/m 1に希釈し調製した。 ブラングは 0. 1%BSA を含む D_ PB S を使用した。 測定は、 まずプレートのブロ キング剤を廃棄し、 調製した標準品反ぴブランクを 50 1分注し 25 °Cで一晩反応した。 プレート を 0. 05%Tw e e n 20含有生理食塩水で 3回洗浄し、 続けて 10%ゥサギ 血清、 0. l%Twe e n 20を含む D— PBSにより 2 μ g /m 1に希釈したぺ ルォキシダーゼ標識抗 G P V Iポリクローナル抗体を 50 1添加し、 37でで 反応した。 同様に 5回洗浄後、 TMB溶液 （B i o F i X) を各ゥエルに添カロし 室温で 20分閭 応後、 0. 5 M硫酸溶液で反応を停止し、 プレート分光光度計 (マルチスキャ J X、 大日本製薬） で 45 Onmの吸光度を測定し、 標準曲線 を作成した。 実施例 7
抗 G P V I抗 の認識領域の解析
ヒト GPV I (^アミノ酸配列の一部をマウスのアミノ酸配歹 (Jに置換し、 抗体の 反応性の変化を 1^ベることにより抗 GPV I抗体の認識領域を絞り込んだ。 すな わち、 血小板膜蛋白質である, GPV Iの細胞外領域が免疫グ ブリン様領域 1、 2 (ドメイン 1またま D 1、 ドメイン 2または D 2と記載することがある 2) および ムチン様領域 （ドメイン 3または D 3と記載することがある） の三つのドメイン で構成されている （図 1) こと力 ら、 各ドメイン単位での置奥体を作製し、 各置 換体に対する抗 P V I抗体の結合実験を行った。
' また、 抗 GP I抗体認識領域の更なる絞込みを行う目的 "CGP V I免疫グロ ブリン様領域と PDB (プロティンデータバンク）登録タンパク質の中から、 ァミノ 酸配列の相同性が比較的高いヒト NK細胞活性化受容体 Nkp46、 Ig-like
transcript 2 (ILT2) の情報を基にヒ ト G P V Iのモデリングを行い、 アミノ酸 変異を導入可能な領域構造を予測した （図 1) 。 そしてそれらのループ領域にお' けるヒ ト GP V Iとマウス G： P VIのアミノ酸置換体発現プラスミド 構築し、 各置換体に対する抗 GPV I抗体の結合実験を行った。 その結果、 各 ¾¾GPV I モノクローナル抗体が認識する G P V Iの各ドメィンおよびループ領 を確認で きた。 なお、 本明細書中では、 GP V Iのドメインまたはアミノ酸置與変異体を 単に GPV I置換体と標記することがある。 表 3. ヒト可溶型 GPVIのドメイン 1および 2領域における各ループの ミノ酸配 列 .
Figure imgf000046_0001
(1)ヒト GPV Iとマウス GPV Iのドメイン置換体発現プラスミドの構築
実施例 1にて作製した h G PV I- hFc (以下 G P V I -麵- hFcと |Ε载、 配列 番号 135) 発現プラスミド （ρΤΚ2233) および mGPV I- hFc (以下 G P V I- MMM - hFcと記載、 配列番号 136) 発現プラスミド （PTK2440) を铸型とし、 ヒト G PV Iとマウス GPV Iのドメインを置換した GPV I置換体発現プラスミドを 構築した。 すなわち、 GPV Iのドメイン 1がマウス、 ドメイン 2およびドメイン 3がヒ ト の配列からなる G P V I置換体 （以下 G P V I -MHH-hFcと記載、 配列番号 137) 発現プラスミ ドを構築するために、 PTK2440を铸型とし、 マウス GP V I配列の 上流に設計したセンスプライマー 1 (表 4、 配列番号 184) およびマウス GPV I のドメイン 1の C末側 15merにヒ ト G P V Iのドメイン 2の N末側 15merを連結したァ ンチセンスプライマー 3 (表 4、 配列番号 186) を用いて PCRを行い、 マウス GP
V Iのドメイン 1の DNA断片 （417bp) を増幅した。 次に pTK2233を錡型とし hFc配 列上に設計したアンチセンスプライマー 2 (表 4、 配列番号 185) 、 およびマウス G P V Iのドメイン 1の C末側 15merにヒ ト G P V Iのドメイン 2の N末側 15merを連 結したセンスプライマー 4 (表 4、 配列番号 187) を用いて PCRを行い、 ヒ ト GP
V Iのドメイン 2, ドメイン 3, hFcの N末側までの DNA断片 （571bp) を増幅した。 そ して、 増幅した 2つの DNA断片、 センスプライマー 1、 アンチセンスプライマー 2を 用いて PCRを行うことにより、 マウス GPV Iのドメイン 1、 ヒ ト GPV Iのドメ イン 2, ドメイン 3、 hFcの N末側配列を連結した DNA断片 （973bp) を増幅した。 こ の増幅された DNA断片を制限酵素 Xbal, BamHIで切断した後、 pTK2233の Xbal, BamHI サイ トに揷入し、 GPV I- MHH- hFc発現プラスミ ドを構築した。
GP'V Iのドメイン 1がヒ ト、 ドメイン 2がマウス、 ドメイン 3がヒ トの配列力、 らなる GPV I置換体 （以下 GPV I-HMH-hFcと記載、 配列番号 138) 発現ブラ スミ ド、 および GPV Iのドメイン 1およびドメイン 2がマウス、 ドメイン 3がヒ トの配列からなる G P V I置換体 （以下 G P V I -MMH-hFcと記載、 配列番号
139) 発現プラスミ ドも同様の方法にて置換したい GPV Iのドメインのつなぎ 目の位置でヒ トとマウスの GPV I配列を 15merずつ連結して作製したセンス (表 4、 配列番号 191) およびアンチセンスプライマー （表 4、 配列番号 190) 、 センスプライマー 1、 アンチセンスプライマー 2を用いて必要な DNA断片を増幅し、 制限酵素 Xbal, BamHIで切断した後 pTK2233の Xbal, BamHIサイトに揷入することに よって構築した。 また、 今回実験に使用した 5種類の GPV I置換体のアミノ酸 配列を配列番号 141〜151に示した。
(2)ヒ ト GPV Iのループ領域をマウスのアミノ酸配列に置換した GPV I置換 体発現プラスミドの構築
抗 GPV Iモノクローナル抗体の認識領域となり得る 一ループ領域をそれに 対応するマウス G PV Iのアミノ酸配列に置換した GP I置換体発現プラスミ ドを以下のように構築した。 まず、 ヒト GPV Iのルーァ。領域 L2においてヒ トの アミノ酸配列をマウスのアミノ酸配列へ置き換わるよう^:基配列を置換し、 さら に置換した塩基から上流に 11 mer、 下流に 13 merヒト GP V Iの塩基配列を連結 したセンスプライマー 10 (表 4) およびアンチセンスプティマー 9 (表 4) を作 製した。 次に、 pTK2233を铸型として、 センスプライマー 1とアンチセンスプライ マー 9を用いて PCRを行うことにより、 ループ領域 L2がマ スの配列に置換された ヒト G P V Iの N末側 DNA断片 （215bp) を増幅した。 同様 &こ、 pTK2233を铸型とし て、 センスプライマー 10とアンチセンスプライマー 2を用 Χ、て PCRを行うことによ り、 ループ領域 L2力 Sマウスの配列に置換されたヒ ト GP ^ Iの C末側領域に hFcの N末側配列が連結した DNA断片 （773bp) を増幅した。 そし 、 増幅した 2つの DNA 断片、 センスプライマー 1、 アンチセンスプライマー 2を后いて PCRを行い、 ルー プ領域 L2がマゥスの配列に置換されたヒ ト G P V Iに hFcの N末側配列が連結した DNA断片 （958bp) を増幅した。 この増幅された DNA断片を讳 IJ限酵素 XbaI，BamHIで 切断した後、 pTK2233の XbaI,BamHIサイトに揷入し、 ヒ ト GPV Iの領域 L2をマ ウス GPV Iのアミノ酸配列に置換した GPV I置換体 〈以下 hGPV I - mL2- hFcど記載、 配列番号 46) 発現プラスミドを構築した。
その他のループ領域を置換した G P V I置換体、 hG P V I - mL3- hFc, hGPV I -fflL4-hFCj hGPV I -mL5-hFc, hGPV I— raL6— hFc, GF» V I— mL7— hFc, hGPV I -mL8-hFc, hGPV I mL9— hFc, hGPV I mL10— hFc, hG P V I—mLll— hFc, hG P V I -mL13-hFc, hG P V I _mL14- hFcの発現プラスミドも阔様の方法にて構築した。 それぞれの GPV I置換体発現プラスミドの構築に使用したプライマー配列を表 4に示した。 また、 .作製した G P V I置換体のァミノ酸 IE列を配列番号 47-5 7に示した。
• 表 4. 各 GPVI置換体努現プラスミ ドの構築に使用したプライマーの組合せおょぴ 増幅領域 ンスプライマ
GPVI置換体 増幅領域 マー
GPVI-HHH-hFc
(配歹 U番号 1 3
5)
GPVI-MMM-hFc
(配歹 j番号 1 3
6) 一
GPVI-MHH-hFc マウスドメイン 1 配歹 U番号 184 配列番号 1 86 (配列番号 1 3
ヒ ト ドメイン 2， 3 配歹 U番号 18 7 配列番号 1 85 7)
GPVI-HMH-hFc ヒ トドメイン 1 配歹 U番号 184 配列番号 1 88 (配歹 lj番号ェ 3 マウスドメイン 2 配列番号 189 配列番号 1 90
8) ヒ トドメイン 3 配歹 11番号 1 9 1 配列番号 1 85
GPVI-MMH-hFc マウスドメイン 1， 配歹 lj番号 184 配列番号 1 90 (配冽番号 1 3 2
9) ヒ トドメイン 3 配歹 lj番号 1 9 1 配列番号 1 85 hGPVI-mL2-hFc N末側 配歹 U番号 184 配列番号 1 92 (配列番号 14
C末側 配歹番号 1 93 配列番号 1 85 0)
hGPVI-mL3- Fc N末側 配歹 [J番号 184 配列番号 1 94 (配歹 [J番号 14
C末側 配歹 U番号 1 95 配列番号 1 85 1)
hGPVI-mL4-hFc N末側 酉 S歹 lj番号 184 配列番号 1 96 (配列番号 14
C末側 配歹 tl番号 19 7 配列番号 1 85 2) ■
hGPVI-mL5-hFc N末側 配 lj番号 184 配列番号 1 98 (配 j番号 14
C末側 配 ！ 1番号 1 99 配列番号 1 85 3)
hGPVI-mL6-hFc N末側 配歹 ίΐ番号 184 配列番号 2 00 (配冽番号 14
C末側 配 j番号 201 配列番号 1 85 4)
hGP7I-mL7-hFc N末側 配 』番号 184 酉 S歹 lj番号 2 02 (配冽番号 14
C末側 配 番号 203. 配列番号: L 85 5)
hGPYI-mL8-hFc 眛側 配 [J番号 184 配列番号 2 04 • (配列番号 14
C末側 酉己 U番号 205 配列番号 L 85
6)
hGP7I-mL9-hFc N末側 酉 S U番号 184 配列番号 2 06 (配冽番号 14
C末側 配 lj番号 207 配列番号 L 85 7) hGPVI-mLlO-hFc N末側 配列番号 1 84 配列番号 208 (配列番 14
C末側 配列番号 2 09 配列番号 18 5 8)
hGPVI-mL -hFc N末側 配列番号 1 84 配列番号 21 0
(配列番^ 14
C末側 配列番号 2 1 1 配列番号 18 5 9)
hGPVI-mL13-hFc 眛側 配列番号 1 84 配列番号 21 2
(配列番 1 5
C末側 配列番号 2 1 3 配列番号 18 5 0)
hGPVI-mL14:-hFc . N末側 配列番号 1 84 配列番号 21 4
(配列番"^ 1 5
C末側 配列番号 2 1 5 配列番号 18 5 1)
(3)GPV I置換体の調製
実施例 7 (1)， (2)で構築した G P V I置換体発現ブラスミ ドぉよび pTK2233、 ΡΤΚ2440を実施例 1に示されている方法と同様に COS- !_細胞に導入し、 発現させた。 得られこ培養上清から、 目的の GPV I置換体を "口ティン Aカラム （Prosep- A、 ミリポア） で精製した。 得られた GPV I置換体め精製度は、 還元 ·非 iS元 の両条件で SDS - PAGEを行い、 銀染色にて確認した。
(4)ヒト GPV I とマウス GPV Iのドメイン置換体との結合活性
ヒ ト GP V Iのドメインをマウス GPV Iのドメイ ンに置換することに <tり、 抗体の認、識領域を絞込んだ。 すなわち、 G P V I -HHH-hFc, GP V I -MHH-hRc, G P V I -HMH-hFc, GPV I -MMH-hFc,及び G P V I - MM— hFcと各抗 G P V I ノク 口一ナル^体との結合活性測定を行つた。
まず、 プレート（Maxisorp、 Nunc)に g/raLでゥサギ抗ヒト IgG抗体 （DAKO) を 固相化し、 2% StabiliGuard (SurModics) でブロッ ングした。 次に、 ブ ツキ ング液を除去し、 0.1%BSA/PBSで希釈した G P V I置換体を添カ卩して 37°Cで 1時 間反応しこ。 0.05%Tween- 20を含む 0.9%生理食塩水にて洗浄後、 0.1%BSA/E¾Sで 希釈した 1%ヒ ト血清 （コスモバイオ） で 37°C、 1時間ブロッキングし、 再び
0.05%TVeen - 20を含む 0.9%生理食塩水にて洗浄後、 実施例 3で作製したぺノレオ キシダーぜ標識した抗体を 0.1%BSA/PBSで 0.5 /虬に希釈して添加し、 37°C：、 1 時間反応した。 最後に 0.05%Tween- 20を含む 0.9%生理食塩水にて洗浄後、 H202/TMB溶液を用いて発色させ、 0.5M硫酸で反応を停止した後、 吸光度を 450nm の波長にて測定した。
その結果、 F1232-10-2, F1232-21-1, F1201-20, F1232- 43- 3及び F1232- 14- 2抗体 ではドメイン 1をマケス G P V Iに置換した G P V I -MHH- Fc, GP V I - MMH- hFc及び GP V I- MM- hFcに対する結合活性が顕著に低下した。 このことから、 これらの抗体の認識領域は G P V Iのドメイン 1に存在することが明らかとなつ た。 一方、 F1232- 7- 1，F1232_19 - 1，F1232 - 37 - 2, F1232- 17— 1, F1232— 18— 3, F1232 - 24-1抗体では、 ドメイン 2をマウス GPV Iに置換した GPV I-画- hFc， GP
V I -MMH-hFc, GP\T I -MM- hFcに対する結合活性が顕著に低下し、 これらの抗 体の認識領域は G P "V Iのドメイン 2に存在することが推測された。
各抗 G P V I抗体の抗原認識領域を表 5に示した。
(5)ヒ ト GPV Iのゾレープ領域をマウスのアミノ酸配列に置換した GPV I置換 体との結合活性
GP V I—顧- hFc, GP V I - mL2- hFc, hGP V I— mL3- hFe， hGP V I - mL4- hFc, hGPV I— mL5 - hFc， hGP V I一 mL6— hFc, hG P V I一 raL7— hFc, hGP V I一 mL8 - hFc, hGPV I— mL9 -: hFc, hG P V I -rnLlO - hFc， hG P V I -mLL 1一 hFc, hGP V I - mL13- hFc及ぴ hG P " I -mL14 - hFcと各抗 G P V Iモノクロ一ナル抗体との結合活 性測定を行った。
ヒト GPV Iのループ領域をマウスのループ領域に置換した GPV I置換体と ヒト GPV Iに対する結合活性を比較することで、 抗体の 識領域を置換したル 一プ領域まで絞り込んだ。
測定方法は実施例 7 (4)に記載の方法と同様に、 実施例 3 で作製したペルォキ シダーゼ標識した抗体を、 各抗体の GPV I-HHH-hFc に対する親和性に合わせ て測定可能な濃度に O.1%BSA/PBSで希釈し用いた。 その結果、 F1232- 10 - 2，
F1232- 21- 1,F1232- 43- 3抗体では、 hG P V I - mL2- hFc、 F1232- 14- 2抗体は hG P
V I - mL3_hFcおよぴ： hG P V I - mL5- hFc、 F12CU- 20抗体は hO P V I - mL4- hFcおよ ぴ hGP V I- mL5-hFcに対する結合活性が低下した。 また、 F1232-7 - 1， F1232- 37 - 2，F1232-17- 1，F1232— 18 - 3及ぴ F1232- 24- 1抗体では hGPV I _mL9 - hFc、 F1232- 19- 1抗体では hG P V I一 mL9- hFcおよび hG P V I - mLll- hFcに対する結合活性が 低下した。 各抗 G P V I 抗体の抗原認識領域を表 5に示した。 表 5
Figure imgf000052_0001
·：各ループを置換した GPVI変異体に対する抗体の結合 性が hGPVI-hFcに対す る結合活性の 30%以下に低下したもの 表 6
Figure imgf000053_0001
¾¾ qs¾K ¥ v ίsfョ s + sヨ sΛ s.t一:}:: : - , ,
Figure imgf000053_0002
実施例 8
力二クイザル ex vivo実験による抗 GPV Iモノクローナル抗体の評価
' 実施例 2にて作製した各抗 G P V Iモノクローナル抗体を雄性力二クイ fノレ (約 6kg) に 24時間間隔で 0.3mg/kg及び lrag/kg静脈内投与した。 投与前、 初回 投与 24時間後及び 48時間後に採血し、 血小ネ反数、 CD62P蛋白質 （血小板の活性 化マーカー） の発現量、 血小板膜蛋白質 （GPIlb/IIIa； CD41aおよび GPV I ； CD42a) の発現量、 血小板 GP V Iの宪現量、 及び血小板凝集能 （コラーゲンお よび ADPに対する反応性） を測定した。
A. 血小板数の測定
採血したクェン酸カ卩血の血小板数を Sysmex F- 820を用いて測定した。 クローン No. F 1 232— 1 8— 3、 F 1 232— 3L 0— 2、 F 1 232— 14一 2、 F 1 2 32— 43— 3、 F 1 201— 20、 F 1232— 37— 2を投与したサ ルでま血小板数の減少は認められなかった （滅少率が 20 %未満；表 6中に一で 表示） 。 また、 F 1 201— 18、 F 1232-1 7- 1を投与したサルでは血 小板数の減少傾向が認められた （減少率が 2 O %〜 40 %；表 6中に土で表示） 。 一方、 F 1 232- 7- 1, F 1232— 24— 1、 F 1 232— 21— 1を投 与し广こサルでは明らかな血小板数の減少が見られ （減少率が 40 %〜 60 %；表 6中【こ +で表示） 、 特に F 1232- 19- 1.においては顕著であった （減少率 が 6 O %以上；表 6中に ++で表示） 。
B. CD62P蛋白質の確認
採血したクェン酸カ卩血を、 X100g、 25°Cで 2 O分間遠心分離することにより多血 小板血漿 (Platelet Rich Plasma; PRP) を調梨した。 PRPの血小板数が 1 X 108 cells/mLとなるように 0.5%非働化？8≤と2.5 mlVI EDTAを含む PBS (以下、 FACSパッ ファー） で希釈した後、 抗ヒト CD62P— PE (BD： Biosciences Pharmingen) を用レヽ てサ /レ血小板上の CD 62 P蛋白質の発現を F AC Sにて調べた。 すなわち、 P RP【こ抗ヒ ト CD62P - PEを添加して室温で 30分静置した後、 FACSバッファーで血小 板を洗浄し、 フローサイトメーター CYTOMICS FC500 (BECK画 COULTER) で血小 板の紫光強度を測定した。 その結果、 いずれの抗 G P V Iモノクローナル抗体を 投与したサルから採血、 調製した PR Pにおレヽても、 投与前と比較して CD 62 ?の 現の上昇は認められなかった （発現誘導が 2倍未満；表 6中に—で表示） 。 C. CD41aおよび CD42a蛋白質の確認
サル血小板上における CD41aおよび CD42a蛋白質発現量の測定は、 CD 62 Pの 場合と同様に PR Pを調製し、 それぞれ抗ヒ " hCD41a-FITC (BD Biosciences Pharmingen) 、 抗ヒ 卜 CD42a- PE (BD Biosciences Pharmingen) を用いた F C S解析 こて行った。 その結果、 F 1232— 2 1— 1および F 1232— 1 9 - 1を投与したサルから採血、 調製した P R P ίこおいて CD41aおよび CD42a蛋白質の 軽度の減少が認められた （lmg/kg投与後の消失率が 30 %〜 70 %；表 6中 δこ土 で表示） ものの、 その他の抗 GPV Iモノクローナル抗体を投与したサルから採 血、調製した PRPでは CD41aおよび CD42a蛋白質の発現に影響は認められな^、つ た （lmg/kg投与後の消失率が 30 %未満；表 6中に一で表示） 。
P. G F V I蛋白質の確認
サル血小板上における GPV I蛋白質の確認は、 CD 62 Pの場合と同様 δこ P RPを調製し、 蛍光色素 Af 488で標識した抗& P V Iポリクローナル抗体を后い た F A C S解析にて行った。 その結果、 F 1 20 1— 18、 F 1201 - 2 0、 F 12 32-37-2を投与したサルから採血、 調製した PRPにおいて G P V I蛋白質の消失が認められ （lmg/kg投与後の Γ肖失率が 70 %以上；表 6中に斗で 表示） 、 特に F 1 232— 7— 1、 F 1232— 18— 3、 F 1232— 1 0 2、 F 1 232— 21— 1、 F 1232 - 43 - 3、 F 1 232— 17 - 1、 F 123 2-19- 1においては顕著であった （0.3mg/kg投与後の消失率が 7 0 % 以上；表 6中に ++で表示） 。 一方、 F 1232— 24— 1、 F 1232— 1 4 - 2を投与したサルから採血、 調製した PR P〔こおいては部分的な消失が認め られ た （lmg/kg投与後の消失率が 30%〜 70% ；表 6中に土で表示） 。
E. 血小板凝集能の測定
コラ一ゲンおよび ADPに対する血小板凝集肯 を血小板凝集測定装置 （PA- 20O Aggregation Analyzer, Kowa) を用いて測定" Uた。 まず、 PRPの血小板数が 3 X 108 cells/mLとなるように生理食塩液で希軟した後、 終濃度 IraMの CaCl2溶液を 添加し、 37°Cで 3分間インキュベートした。 さらに終濃度 ^g/mlのコラーゲン溶 液あるいは終濃度で 10 μΜの ADP溶液を添加し、 37°Cで 12分間インキュベートした。 血小板凝集率は光の透過率を PA-200 Aggregation Analyzer (Ko a) で測定する ことにより求めた。 その結果、 F 1 2 32— 7— 1、 F 1201—： 20を投与し たサルから採血、 調製した PR Pにおいてコラーゲン応答性の血小核凝集能の低 下が認められ （lmg/kg投与後の消失率が 70%以上；表 6中に十で表示） 、 特に F 1232— 18— 3、 F 1232— 10— 2、 F 1232-21一 1、 F 12
01— 18、 F 1232— 43— 3、 F 1232— 37— 2、 F 1 232— 17 ー 1、 F 1232-19-1においては顕著であった （0.3mg/kg投与後の低下率 が 70 %以上；表 6中に ++で表示） 。 また、 F 1232— 24— 1 投与したサ ルから採血、 調製した PR Pにおいては部分的な低下が認められた （lmg/kg投与 後の低下率が 30 %〜 70 %；表 6†rに土で表示） 。 一方、 F 12 32- 14- 2においては血小板凝集能にほとんど影響を示さなかった （lmg/kg 与後の消失 率が 30 %未満；表 6中に一で表示） 。
また、 AD P応答性の血小板凝集 については、 F 1232_1 0— 2、 F 1
232-21一 1を投与したサルから採血、 調製した PR Pにおい" T部分的に低 下したが （lmg/kg投与後の消失率が 3 0%〜70 %；表 6中に-土で表示） 、 その 他の抗 GPV Iモノクローナル抗体を投与したサルから採血、 調製 "Uた PRPに おいて血小板凝集に影響は認められなかつた （lmg/kg投与後の消失率が 30 %未 満；表 6中に—で表示） 。 実施例 9
抗 G P V I抗体の可変領域ァミノ酸配列の決定
以下に抗 GPVI抗体 （クローン No. F1232-7-1) の可変領域の: Γ"ミノ酸配列 決定の例を示すが、 他の抗 G P V I抗体についても同様の実験操作—で可変領域の アミノ酸配列を決定した。
すなわち、 目的とする抗 GPV I ノクローナル抗体を産生するノヽィプリ ドー から RNeasy Micro Kit (キアゲン）を月いてトータル RNAを抽出し、 Superscript III First-Strand Synthesis System for RT— PCRキット（Invitrogen)にて一本鎖 cDNAを合成した。 得られた一本鎖 cDNAを铸型とした Mouse Ig-Primer Set
(Novagen) による PCRで可変領域を増幅し、 塩基酉己列を決定した。 開始コド ^付 近の†青報はデータベース上の配列情報を検索し、 ¾度 5'側プライマーを設計レた ' (F1232 - 7- 1重鎖 5'側プライマー： 1232H- b (配列潘号 216) 、 軽鎖 5'側プライマ ' 一： 1232K- a (配列番号 218) ) 。 一方、 可変領域の 3'側配列は、 アミノ酸配歹 Jを 変えることなく、 ヒト定常領域との連結可能な制限酵素認識部位 （重鎖は Nhe I 認識酉己列、 軽鎖は Bsi WI認識配列） を付したブライマ一を設計した (F1232 - 7— 1 重鎖 3，側プライマー： 1031H- b (配列番号 217) 、 軽鎖 3'側プライマー： mlgK- BsiWI (配列番号 219) ) 。 これらの新規プライマーを用いて再度 PCRを行うこ により重鎖可変領域および軽鎖可変領域を増幅し、 p T 7 B l u e Tベクター
(N o V a g e n )を用いてクローユングした （重鎖可変領域をコードする遺伝子 断片をもつプラスミドを pTK-2464、 軽鎖可変領：^をコードする遺伝子断片を^つ プラスミドを ρΤΚ-2466とした） 。 次に、 常法に従い重鎖可変領域および軽鎖 ¾Γ変 領域の塩基配列を決定し、 その塩基配列 （重鎖可変領域；配列番号 87、 軽鎖 変 領域； 配列番号 88) およびそれらにコードされるアミノ酸配列 （重鎖可変領:^； 配列番号 111、 軽鎖可変領域；配列番号 112) を示すとともに F1232- 7- 1以外の汐 ローンについても同様に塩基配列おょぴアミノ酸配列を決定した （表 7 ) 。 た、 可変領域のァミノ酸配列における CDR部分の配列を表 8およぴ表 9に示した。 表 7
Figure imgf000057_0001
Fl 232-24-1 I配列番号 109 I配列番号 110 I配列番 133 I配列番号 134 I 表 8
Figure imgf000058_0001
配列後ろのカツコ内の数字は配列番号を表す。
表 9
Figure imgf000058_0002
配列後ろ o力ッコ内の数字は配列番号を表す,
実施例 1 0 遺伝子組換えによるマウス-ヒトキメラ抗体の産生
抗原結合活性を有する V領域がハイプリ ドーマ抗体由来、 ~なわちマウス抗体 由来であり、 c領域がヒト由来の抗体 （キメラ抗体） を作製した。 ( 1 ) マウス-ヒ トキメラ抗体発現プラスミドの構築
抗 G P V I抗体 （クローン NO. F1232-7- 1) マウス-ヒトキ ラ抗体発現プラス ミドの構築は以下のように行った。
まず pTK-2464を制限酵素 EcoR Iおよび he Iで切断し、 重鎮可変領域をコード する遺伝子断片 Cを調製した。 一方、 pTK- 2232 (TO20O5/78O0実施例 10参照） を制 限酵素 Eco 47ΙΙ Ιおよび Bam HIで切断し、 重鎖定常領域 （(： 4) をコードする遺 伝子断片 Dを調製した。 これらの断片を、 EcoR I および Bam HIで切断して調製 した発現べクタ一 pEF2cewの EFプロモーター下流に、 断片 C +斷片 Dとなるように 連結し、 重鎖発我プラスミド （pTK-2468) を構築した。
次に pTK- 2466を制限酵素 EcoR Iおよび BsiW Iで切断し、 軽鎖可変領域をコード する DNA断片 Eを調製した。 一方、 HeLaゲノム DNAを铸型とし" Γプライマー BsiWI- hlgK (配列番号 220) および IgK- e (配列番号 221) による PCRを行い、 ヒ ト軽鎖定 常領域 （C K ) を pT- 7BlueTにクローニングした（pT7-hIgK)。 pT7- hlgKからヒト軽 鎖定常領域を切り出すために制限酵素 Bsi WIと Bam HIにて pT7_hIgKを切断し、 DNA断片 Fを調製した。 これらの断片を EcoR I および Bam HI 切断して調製した 発現ベクター pEF2cewの EFプロモーター下流に断片 E +断片 F となるように連結し、 各軽鎖発現プラスミド （pTK- 2474) を構築した。
( 2 ) 組換えマウス-ヒ トキメラ抗体の発現および G P V Uこ対する結合活性の 確認
+ . 構築したマウス-ヒトキメラ抗体発現プラスミドの発現お tぴ精製は実施例 1 に示した方法と同様に行った。 すなわち、 目的とするクローンのマウス-ヒトキ メラ抗体の重鐄 現プラスミ ドおよび軽鎖発現プラスミドを C O S— 1細胞に対 してコトランスフエクシヨンし、 3 7 °Cにて 3日間培養後、 その培養上清をプロ ティン Aカラムにて精製した。 得られ マウス-ヒトキメラ 体は S D S— ? A GEにてその精製度を ½霧した後、 ヒト GP V Iおよびサル GP V Iに対する結 合能を確認した。 まず、 実施例 1にて作製した GPV I置換体、 hGPV I -h F cもしくは GPV I— F FH-h F cを D— PB Sで 2 gノ mLに希釈し、 ィムノプレート （Ma x i s o r p、 NUNC) に 50 LZゥエル添加した。 次に、 3 7°Cで 1時間反^後、 イオン交換水で 5回洗浄し、 2%S t a b i 1 G u a r d (S u r mo d i c s ) を含む D— P B Sを各ゥェ 7 に 1 0 0 L添加 することによりブロッキングした。 次に精製したマウス -ヒ トキメラ抗体を各ゥ エルに添加し 3 7。Cで 1 時間反応させた後、 0. 0 5%Twe e n 2 0を含む生 理食塩水で 3回洗浄した。 ペルォキシダーゼ標識抗ヒト軽鎖 K抗体 （DAKO) を 1 0%ゥサギ血清含有; D— P B Sで 1000倍に希釈し、 各ゥエルに 5 0 L 添加した。 3 7°Cで 1時閒反応後、 同様に 5回洗浄し TMB溶液 （B i o F i ) を各ゥエルに添加した。 室温で 1 0分間反応後、 0. 5 M硫酸溶液で反応を 停止し、 プレート分光光度計 （マルチスキャン J X、 大日本製薬） で 4 5 0 nm の吸光度を測定した。 その結果、 作製したマウス-ヒ トキメラ抗体はヒ トおよび サルの GPV Iに特異的に結合することが確認された。 実施例 1 1
ヒト化抗体の作製
A. ヒト化抗体の作製 （方法 1)
(1) ヒト化 F抗体可変領域のコンピューターモデリング
ヒト化抗体で高い親和性を保持するために、 クィーンらの一般的な方法 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86： 10029, 1989) に準じてフレームワーク残基の選択を行 う。 ヒト目 G歹' Jは K a b a tら (Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed. , U.S. Department of Health and Human Services, 1991) の/ 軽鎖及び重鎖配列データベースに基づきマウス抗 GPV Iモノクローナル抗 体 （クローン No. F 1232— 7-1) に高いフレームワーク相同性を有する配列を選択 する。 さらに、 コンピューター解析により最も適したフレームワーク中のアミノ 酸の改変を行う。 具体的にはコンピュータープログラム ENCAD (レビッ ト、 J.Mol.Boil.168*595(1983)) や、 Ho腿 ology (アクセルリス社）、 FAMS (SG I 社） などのタンパク質モデリングツールを用いて F 1232- 7-1抗体可変領域の分子 モデルの構築を行う。 抗体データベース り得られたヒト E u抗体分子モデル
(S t e p h e n sら、 Immunology 85 (4), 668-674 (1995)に F 1232- 7-1抗体 の C D R配列を F R中に移植する。 分子最適化計算や分子動力学計算などの最適 化やシミュレーション解析を通じて、 ユンピューターモデル上で CDRと F が 本来のヒ ト抗体モデルとは異なり、 有意な接触を示す F R領域で、 アミノ酸置換 を行うことにより. CD Rと F Rとの接触力 S改善されると予想される位置について マウス抗体由来のアミノ酸への置換を行う。 また、 ヒ ト抗体のデータベース中で その位置においてまれにしか現れない F R中のアミノ酸残基はそれらの位置にお けるヒ トコンセンサンスアミノ酸に置換する。 アミノ酸置換の良否は実際の活十生 により確認することになるため、 アミノ酸置換の異なるタイプの抗体を数種類作 製する。
(2) ヒト化抗体の構築
実施例 1 1 A ( 1) で選択された配列を基に、 シグナルペプチド、 スプライス 供与シグナル及び制限サイト （例えば Eco RI) を含むアミノ酸配列をコードする 遺伝子を構築する。 構築した遺伝子は合成ヌクレオチド （8 0塩基長程度） を数 種類オーバーラップするように調製する。 すなわち、 オリゴを対にしてァニーノレ し、 DNAポリメラーゼの K 1 e n ow断片で伸長し、 2本鎖断片を得る。 この 断片を変性し 1本鎖にした後、 同様にァ -ールし、 DNAポリメラーゼの K 1 e n o w断片で伸長し、 全長の遺伝子をコードする 2本鎖断片を得る。 得られる断 片を P C Rで增幅し、 精製後に制限酵素 （例えば Eco RIと Nhe I) で切断し精製 する。 精製した断片をヒト IgG4定常領域遺伝子 （CT/4) の CHIェクソンから C H 3ェクソンまでを含む遺伝子断片 （例 ば pTK - 2232を Nhe Iおよび BamHIで切 断） と連結し、 発現ベクター pEF2cewの EFプロモーター下流 （Eco RIと BamHIで切 断） に組み込むことでヒト化重鎖発現プラスミ ドを構築する。 また、 置換するァ ミノ酸の数が少ない場合は部位特異的突然変異法によりアミノ酸変異を発現ブラ スミ ドに導入することも可能である。 軽鎖可変領域配列は上記と同様に構築可能 である。 この場合七ト C κ領域は pT7- hlgKから切り出し、 発現ベクター PEF2cew の EFプロモーター下流に、 軽鎖可変領域配列と連結し、 組み込むこととなる。 抗体を産生する形質転換体を作製するため、 重鎖及ぴ軽鎖プラスミドを制限酵 素で切断し直線ィ匕後、 マウスミエローマ細胞 S p2_0- a g 1 4 (ATCC C RL 1 5 8 1) 中へジーンパルサー （B I ORAD) を用いて導入する。 例えば 直線化した DNA断片約 20μ gを 1X107細胞に 360 V、 25 ^ F Dのキャパシタン スでエレク トポレーシヨンを行う。 次に細胞を 96 ¾プレートに植え込み、 2日間 培養後、 プラスミ ド断片が組み込まれた細胞を選 するため、 10%FCS、 IX
HT 、I n v i t r o g e n) 、 0.25m g/m丄） a n t n i n e、 1μ g / m 1
My c o p h e n o l i c a c i dを含む D— EM (S i g m a ) を添カロし、 更こ 2週間培養する。 培養後上清中の抗体を解析することにより、 目的とするヒ トイヒ F 1232- 7-1抗体産生細胞株を選択する。 すなおち、 培養上清中の抗体が固相 化した GPV I抗原と結合し、 結合する抗体をぺ レオキシダーゼ標識抗ヒト I g G4抗体で検出する。 結合が認められた抗体産生 胞株はコンフルェントになる まで 10% F C Sを含む培地で培養し、 無血清培地 （Hy b r i d oma S FM、 I n v i t r o g e n) に交換する。 培養上清を回収し、 培養上清中に含まれる 抗体をプロテイン A (P r o s e p- A、 ミリポ ） に結合させ、 0.1M グリシ ン塩酸 （p H3. 0) で溶出する。 精製抗体を P B S- (S i gma) で透析し、 2 8 Onmの吸光度より抗体濃度を算出する （ヒ 卜抗体 lmgZmLは約 1 · 3の吸光 度を示す） 。
(3) ヒト化抗体の評価
ヒト化抗体と元のマウス抗体の GPV I抗原と 結合能を、 B I ACOREシ ステム （B I ACORE社） を用いて測定し、 比載する。 すなわち、 B i ACO RE 3 000をのマニュアルにしたがって CM5チップ （B I ACORE社） に 精製 hGP V I-mFcを固定化する。 次に HB S- E パッファー （B I ACORE 社） で希釈した抗体希釈列を作製し、 各サンプル インジエタトする。 得られた データを B I AC0REの解析プログラム （B H E v a l u a t i o ns B I ACORE) を用いて解析し、 ァフィ二ティー （Kd) を算出する。 B. ヒト化抗体の作製 （方法 2)
(1) ヒト化抗体遺伝子の作製
ヒ ト化抗体において移植する CD R配列が活性を有する適 ^0なドメイン構造と して維持させるためには元の F R領域の配列も合わせて移植" Tる方法もまた有効 である。 CD Rドメイン構造の維持にどのアミノ酸が関与し 、ているかは、 FR 中のアミノ酸の性質 （疎水性、 親水性、 酸性、 塩基性、 分子 イズ等） から推定 でき、 またコンピューターを用いたモデリングにより推定可 である。 すなわち、 シリコングラフィック上で起動するソフトウェアー QUAN TA/CHARMm あるいは Mo d e l e r (モレキュラー ·シユミレーシヨンス、） を用いてモデリ ングを行う。 B r o ok h a v e n P r o t e i n D a t a B a n k (P DB) に登録されているヒ ト抗体配列より F 1232- 7-1抗体の VH及び VL領域と 相同性の高い抗体の三次元構造を検索し、 それに基づき F 1232- 7抗体の三次元構 造を推定する。 推定三次元構造上で重鎖及び軽鎖の CDRに^ K素結合している F R領域中のアミノ酸群 （第 1群） を選出し、 更にそれらに水禁結合している FR 領域中のアミノ酸群 （第 2群） を選出する。 同様に、 CDRに静電的相互作用や ファンデルワールス力等のエネルギー結合により結合していると推定される FR 領域中のアミノ酸群 （第 1群） と更にそれらに結合している と推定される FR領 域中のアミノ酸群 （第 2群） を選択する。 このようにして選 した FR領域中の アミノ酸群を CD Rアミノ酸と併せてヒト抗体配列上に移植するが、 Kabatらの 分頸 (Sequences of proteins oi immunological interest, 5th ed. , U.S.
Department of Health and Human Services, 1991) や NCB I (National Center for Biotechnology Information) 等より得られるヒ ト抗体配列の可変領 域アミノ酸には存在しなレヽような配列が生じる場合は、 そのアミノ酸は移植しな い。 このようにして得られた情報に基づきヒト抗体配列 VH及ぴ VLに移植する 配列を決定し、 ヒト化抗体作製に用いる遺伝子を構築する。
構築した遺伝子はアマシャムのキット （Oligonucleotide— directed in vitro mutagenesis system vers ion 2) と P C R法を組み合わせる方法、 また数種類の 長鎖合成ヌクレオチドを糸且み合わせて増幅する方法、 キメラ抗体の VHあるいは VL遺伝子を铸型に数種類のプライマーを用いて増幅後、 さ らにそれら増幅遺伝 子断片を鎵型として全長遺伝子昕片を得る方法により作製する。 得ら:^た増幅遺 伝子断片を、 実施例 1 1A (2) 記載のプラスミド （pTK- 2232あるレ、^： pT7- IgK) の定常領域断片と連結し、 発現ベクター pEF2cewの EFプロモータ——下流に組 み込むことで、 ヒト化抗体発現プラスミドを構築する。 作製したプラスミ ドは実 施例 1 1A (2) 記載の方法によ り細胞に導入し、 形質転換体を得、 様に精製 抗体を作製する。 また、 実施例 1 1A (3) と同様に抗体の評価を行 う。 実施例 12
GP V I欠損患者の GP VI 体の抗原結合特性とマウス抗ヒト G PV Iモノ クローナル抗体の抗原結合特性
12-1 ヒ ト GPV Iループ置換体を用いた G P V I欠損患者の抗 G P V I抗 体の抗原結合特性解析
GP V I欠損患者 （タテオ.スギヤマ （Tateo Sugiyaraa) 、 外 5名， ブラッド (Blood) ， （米国） ， 1987年， 第 69卷， 第 6号， p. 1712— 172 0) 血中に含まれる抗 GPV I抗体の認識ドメイン解析を各種組換えタンパクを 用いて行った。 患者特異精製抗 ίφ:と実施例 7に記載される組換えヒ ト ル ープ置換体を混合し、 37°Cで 2時間ポリプロピレンプレート上で反 ^させた後、 混合サンプルを実施例 2に記載の方法と同様にして作製した組換え h OPV I - h F c固相プレートに 50 juLZゥヱルで添加し、 37°Cで 1時間反 )Sさせた。 次いで、 ペルォキシダーゼ標識抗ヒ ト c及ぴ; L鎖抗体 （DAKO、 P 130， P 129) を 10%ゥサギ血清を含む D— PB S (pH7. 4) で 10 00倍に希 釈し各ゥエルに 50 μ L添加 すこ。 37でで 1時間反応後、 実施例 2 に記載の方 法と同様に吸光度を測定した。 浪 (J定値を、 組換えヒト G Ρ V Iループ 換体を添 加しないときの吸光度と比較し、 吸光度低下がないか、 あるいは吸光 低下の程 度が小さくなるループ置換体の結果から GPV I欠損患者の自己抗体に含まれる 抗 G Ρ V I抗体の抗原認識部位を推定した。
その結果を表 10に示した。 ΙΤΡ発症攀早期の患者抗体 （#930819) を対象と した場合、 hGPV I— hFc— mL4 (組換えヒト GPVI— hFcのループ 4 をマウスの配列に変換しタンパグを示す。 以下同様に記載する） 、 h GPV I - h F c—mL 5、 hGP V I— h F c— niL 9、 h G P V I— h F c _m L 13 を用いた時、 その吸光度は減少しなかった。 つまりは実験対象とした GPV 1 損患、者の抗 GPV I抗体にはループ 4、 5、 9、 1 3を認識している抗体を含ん でレゝる事が解った。 一方、 ITP発症から長期経 した患者抗体 （#021004) を対 ' 象と した場合においては、 hGPV I— hF c— mL 9、 および hGP V I— h F c —mL 1 3を用いた時、 その吸光度は減少" なかった。 つまりは実験対象と しこ GPV I欠損患者の抗 GPV I抗体にはル1 ~~プ 9、 1 3を認識している抗体 を んでいる事が解った。 表 1 0
GPVI欠損患者抗体のマウスループ置換体による吸 実験
Figure imgf000065_0001
+ ：吸収抗原として添加したときに、 吸光度の低下がない ヽ またはその低下が小さい揚合
一：吸収抗原として添加したときに、 吸光度の低下が非置 体 （hGPVI-hFc)と同程度である場合
12 -2 GPVI欠損患者の抗体とマウス抗ヒト GPVIモノクローナル抗体との競合 試
案施例 2で作製したマウス抗 GPV Iハイプリ ドーマ抗体と GPV I欠損患者 血^に含まれる抗 GPVI抗体との競合実験を行った。 すなわち、 GPVI欠損患者由 来 抗 GPVI抗体を 12— 1に記載の: h GPVI— hFc固相化プレートに 50 μ LZ ェノレにて添加し、 4 °Cでー晚反応させた。 そこ ^こペルォキシダーゼ標識マウス fe¾ GP V Iハイプリ ドーマ抗体を吸光度 0. .5〜 1. 0になるよう添加し、 37°€ で 4 5分反応させ、 実施例 2に記載の方法と同様にして吸光度を測定した。 その 結果、 実施例 2に記載の方法と同様の方法で作製されたマウス抗ヒト GPVIモノク ローナル抗体 F 1 199-6および F 1 232— 37— 2は、 GPVI欠損患者 I£L 中 ίこ含まれる抗 G Ρ VI抗体と競合した。 結果を 1¾ 2に示す。 実施例 13
ドメイン 2 (L 9ループ） 特異的抗ヒト GP VI抗体の作製
1 3-1 マウス抗ヒト GPV Iモノクローナル抗体の作製
実施例 1により調製した精製 hGPV I- mF c融 タンパク 20μ gと A 1 urn(P I ERCE)、 オリゴ CpGを混合し、 投与抗原とした。 d dYマウス
(メス、 8週令、. SLC) に投与し、 さらに投与抗原 20 μ gを投与した。 3日 後、 リンパ節又は脾臓よりリンパ球を分離し、 実施例 2に記載の方法と同様の方 法で細胞融合を行い、 ハイプリ ドーマを選択した。
1週間後目的の抗体を産生しているハイプリ ドーマを実施例 7で作製した hG P "V I- hFc及び hGPV I— mL9— hFcに対する結合 性を指標としてスクリー ユングした。 すなわち、 実施例 1により調製した精製: hGPV I _hF cまたは h GP V I— mL9— hFcを D— PB S (pH7. 4 ) で ュ g Zm Lに希釈し、 ィ ムノプレート （Ma X i s o r b、 NUNC) に 50 LZゥエル添カ卩し、 実施 例 2の記載の方法と同様にして固相化した。 次に培養 _h清を各ゥエルに添力卩し室 温で 1時間反応させた後、 実施例 2に記載の方法と同様にしてペルォキシダーゼ 標識抗マウスィムノグロブリン抗体 （DAKO、 P 2 € 0) を用いて反応を行い、 吸光度を測定した。 その結果、 精製 hGPV I- hF e と結合し （吸光度 1以 上） 、 hGP V I— mL9-hFcとは結合しない （吸光度 O . 5以下） 抗体を産生し ている細胞を選択し、 実施例 2に記載の方法によりク —二ングした。 8〜10 曰後、 同様にスクリーニングを行い、 L9特異的マウス ヒ ト GPV I抗体を産生 するハイプリ ドーマを得た。 実施例 2B (3) と同様 ίこ、 得られたハイプリ ドー マを培養し、 モノクローナル抗体を精製した。 各抗体 サブタイプは IsoS trip Mouse Mon0clonal antibody Isotyping Kit(Roche)を レヽて ¾ζ;¾Εした。
1 3-2 ラット抗ヒト GPV Iモノクローナル抗体 作製
精製 hGP V I-mF c融合タンパク 又は L 9及び L 11ループをヒト由来 配 【Jに置換したラット G P V I - m F c融合蛋白質 （ratG P V I -hL9/hll-mFc) (酉己列番号 288) を投与抗原とした。 なお、 ラット V Iは、 ラット骨髄 RNAを鍚型とし、 才リゴ dTプライマーを用いた 転写反応で cDNAを合成し t後、 これをさらに铸型とした PCRで全長遺伝子をク口一ユングした。 PCRに使用 Lたプ ライマー対は （mG P V I— a:CCACATAGCTCAGGACTGGG (配列番号 289) 、 mG I3 V
1 -d:CCAAGTTATTTCTAGGCCAGTGG (配列番号 290) ) である。 投与抗原 20 μ gと' フロイントコンァ。リートアジュパント（D I F C O)を等量混合し、 Wi s a r ラット （メス、 8週令、 S LC) に投与し、 2週間後リンパ節よりリンパ球を分 離した。 SP2,0— Ag l 4 (ATTC) と混合後、 実施例 2に記載の方法と 同様の方法で細包融合を行い、 ハイブリ ドーマを選択した。
1週間後目的の抗体を産生しているハイプリ ドーマにより上記 14一 こ記載 の方法によりスグリーニングした。 その結果、 精製ヒト GPV I- hFcと結合 し （吸光度 1以 Jn) 、 L 9をマウス L 9に置換した精製ヒ ト GPV I-hF 。と は結合しない （P及光度 0. 5以下） 抗体を産生している細胞を選択し、 実 例 2 に記載される方 ¾によりクローニングし、 ラッ ト抗ヒト GPV I抗体を産住する ハイプリ ドーマを得た。 実施例 2B (3) と同様に、 得られたハイプリドーマを 培養し、 モノクローナル抗体を精製した。 各抗体のサブタイプは Rat MonoAB ID/SP Kit(ZYMED)を用いて決定した。 実施例 14
抗 G P V Iモ Zクローナル抗体の特性解析
14-1 抗原洁合特性
実施例 13で得られた各抗体の特性を解析するため、 ヒト GPV I-h cと の結合、 実施例 4に記載の F 1232— 37— 2抗体との競合、 L 9ループに対 する特異性を調べた。 すなわち、 ヒ ト GPV I こ対する結合は実施例 2の 法に 従い固定ィヒした抗原に対する結合活性を測定した。 結合活性は吸光度が 0 - 5〜 1. 0までを +、 1. 0〜2. 0を +十、 2. O以上を + + +と表示した。 F 1
232— 37— 2との競合は以下のように行った。 すなわち、 F 1232— 37 一 2を中根らの方法 (J. H i s t o c h em- Cy t o c h em. , 2 2, 1 084， 1974) に従いペルォキシダーゼ （凍洋紡） 標識抗体を調製し、 使用 した抗体量より抗体濃度を算出した。 次にこのペルナキシダーゼ標識抗体を用いて各精製抗体との競合ァッセ^ rを行 つた。 すなわち、 上記の標識抗体 25 μ Lと各精製抗体 25 μ Lを hGP- hFc固 相化プレートのクエルに添カ卩し、 37°Cで 1時間反応させた後、 0. 05°/6Tw e e n 20を含む生理食塩水で 5回洗浄し、 TMB溶液 （B i o F i x) で発色 させた。 室温で 1 0分間反応後、 0. 5 M硫酸溶液で反応を停止し、 プレート分 光光度計 （マルチスキャン JX、 大日本製薬） で 450 nmの吸光度を測赵した。 その結果を表 11.に示す。 阻止活性は阻止抗体無添 ¾1の吸光度から 50%£Λ上阻 止する場合を ++十、 30%〜50%阻止する場合を +十、 10%〜30。/6阻止 する場合を十と表示した。
L 9ループ特異性は実施例 13の 13— 1記載の方法に従い測定し、 反^性が 50%以上低下する場合を +すなわち L 9ループを認識していると判断しこ。 表 11
実施例 14で作製された抗ヒト GPVIモノクローナル抗体
hGPVI-hFc
コラーゲン/ h
に対する
抗ビト GPVIモノクロ一ナ レ抗体 種 hGPVI-Fcとの結合 GPVI-Fc結合に D
F1232-37-2
対する阻害
との競合
F1249-18-2 マウス ++ + -1— Η· ++ 1.12E-10
F1245-7-1 マウス ++ - + 3.1 SE-10
. F1246-1-1 マウス ++ - + 9.6 -4E-08
F1249-5-1 マウス ++ ++ 3.1 1E-10
F1249-20-1 マウス +++ 一 ++ 2.23E-10
F1249-24-1 マウス +++ +++ 8.95E-10
F1249-30-1 マウス +++ - +++ 3.7 SE-08
F1245-5-1 マウス ++ -+ ++ 1.56E-07
F1245-6-2 マウス ++ -+ +++ 1.33E-08
F1249-3-2 マウス + ■+ ++ 1.73E-07
F1245-4-1 マウス +++ ■+ ++ 4.65E-10
F1249-22-1 マウス + -*-+ + 2.25E-07
F1251-H マウス + ■+ + 8.5 E-07
F1257-3-1 ラッ卜 +++ - - 3.25E-10 14-2 GPV I—コラーゲン結合阻害活性
' 実施例 13で^られた各抗体のコラーゲン- GPV I結合阻害活性を実施^ 12 と同様の方法で調べた。 抗体無添加のゥエルの吸光度 ίこ対して 5 0 %以上吸光度 が低下した場合を + + "十、 3 0 %〜5 0 %低下した場合を +十、 1 0 %〜3 Ο ^ο 低下した場合を十と表示した （表 1 1 ) 。 1 4 - 3 解離定数の測定
実施例 1 4で得られた各抗体の解離定数は実施例 5 ίこ記載の方法と同様の方 去 により調べた。 結果を F 1 2 3 2 - 3 7— 2の解離定数に対する相対値として表 1 1に示した。 実施例 1 5
抗 G P V I抗体の可変領域アミノ酸の決定 （2 )
実施例 1 3で作製した抗ヒ ト G Ρ V I抗体の可変領域のァミノ酸配列は、 実 例 9に記載の方法と同様の方法により決定した。 抗体可変領域の塩基配列を決： ¾ したクローンについて、 C D R及ぴ可変領域の埠基配 および推定されるアミノ 酸配列を表 1 2及び 1 3ならびに配列表 （表 1 4参照） に示した。 抗体可変領:^ 遺伝子の配列解析の結果から、 これらの抗体の配列は数種類の一定の抗体遺伝" =?· に由来すると考えられ、 ヒ ト GPVIのループ 9を認識する抗体のレパートァ選択 5こ 特徴のあることが認められた。 表 1 2 抗 GPVI抗体重鎖の CDR配列
クローン 重鎖
番号 CDR1 CDR2 CDR3
F1245-4-1- SYWMH MIHPNSDNT画 EKFKS HYYDYVDY
F1245-5-1 SYWMH MIHPNSGSTHY EKFKS GGVTPVAY
F1245-6-2 SY MH MIHPNSGST画 EKFKS GGVTPVAY
F1245-7-1 SYWMH MIHPNSGST画 EKFKS PVTAVVEYYFDY -
F1246-1-1 SYGMS TISNGGTYTYYPDSVKG LRDYYAMDY
F1249-3-2 SYGMS TISSGGSYTYYSDSVKG DSGYFDY
F1249-5-1 SYWMH MIHPNSDITNYNEKFKN LGDYYAMDY
F1249 - 18- 2 SYWMH MIHPNSDITNYNEKFKN SGDYYAMDY
F1249-20-1 DYAMH VISTYYGDTSY QKFKG AEDYDPWFAY
F1249-22-1 SYWMQ EIDPSDSYTNY QKFKG GAITTATLDY F1249-24-1 DYAMH VISTYYGDTSYNQKFKG AEDYDPWFA.Y
F1249- 30- 1 DYAMH VISTYYGDTSYNQKFKG AEDYDPWFA.Y
F1251-1-1 DYYIH YINPNSGYTNYNEKFKS CNSGYGDWFAY
F1257-3-1 TSGMVVS AIDWDGDKYYNPSLKS TPYYGYKE YYFDY 抗 GPVI抗体軽鎖の CDR配歹 U
Figure imgf000070_0001
抗 GPVIモノクローナル抗体可変領域の塩基配列おょぴ: ミノ酸配列 クローン番号 塩基配列 アミノ酸配列
重鎖 軽鎖 重鎖 軽鎖
F1245 - 4 - 1 配歹 U番号 224 酉己列番号 226 配列番号 225 配列番号 227
F1245-5-1 配列番号 228 酉己列番号 230 配列番号 229 配列番号 231
F1245-6-2 配列番号 232 酉己列番号 234 配列番号 233 配列番号 235
F1245-7-1 配列番号 236 酉 3列番号 238 配列番号 237 配列番号 239
F1246-1-1 配列番号 240 酉己歹 U番号 242 配列番号 241 配列番号 243
F1249-3-2 配列番号 244 酉 S列番号 246 配列番号 245 配列番号 247
F1249-5-1 配列番号 248 酉己列番号 250 配列番号 249 配列番号 251
F1249- 18 - 2 配列番号 252 酉己歹 U番号 254 配列番号 253 配列番号 255
F1249-20-1 配列番号 256 酉己列番号 258 配列番号 257 配列番号 259
F1249-22-1 配列番号 260 酉己列番号 262 配列番号 261 配列番号 263
F1249-24-1 配列番号 264 酉 S列番号 266 配列番号 265 配列番号 267
F1249-30-1 配列番号 268 配列番号 270 配列番号 269 配列番号 271
F1251-1-1 配列番号 272 酉己列番号 274 配列番号 273 配列番号 275 F1257-3-1 配列番号 276 酉己列番号 278 配列番号 277 配列 号 279
NEW-HAN 配列番号 280 ― 配列番号 281 一
Eu-HC 配列番号 282 一 配列番号 283 —一
REI-KA 一 酉己列番号 284 一 配列者号 285
Eu-KA ― 酉己列番号 286 一 配列 号 287 · 実施例 16
マウス/ヒトキメラ抗 GPV I抗体の生産 (2)
16-1 マウス/ヒトキメラ抗体の生産
実施例 10の方法と同様の方 で作製した発現プラスミ ドを下記の方法で C O S— 1細胞に導入し、 キメラ抗!^の一過性発現を行った。 なお、 c F 1232- 1 8 - 3 (マウスモノクローナゾレ抗体 F1232- 18 - 3のマウス/ヒ トキメラ化抗体を CF1232- 18- 3と表記する。 以下、 他のマウスモノクローナル抗体も同様に表記す る。 ） 発現には重鎖発現プラスミ ド pTK— 2471と、 軽鎖発現 ラスミド ρ ΤΚ- 2475との c o— t r a n s f e c t i o nを行い、 cF l 232— 4 3— 3、 c F 1232— 10— 1 あるいは c F 1232— 37— 2についてはそ れぞれ pTK— 2504と pTK!— 2514、 pTK— 2509と！） ΤΚ— 25 17あるいは ρ ΤΚ— 2510と ρ ΤΚ— 2511をそれぞれ c o— t r a n s f e e t i o nした。'
COS— 1細胞を 2 · 1 XI O 6c e 1 1 sZ段でセルスタック 1 Oチャンノ 一 （CORN I NG社） に植え iZ ^み、 37 °Cで 4日間培養を行った。 培養液を廃 棄後に、 細胞を D— MEMで二度洗浄した後に、 以下の F uGENE ZDNA/ 生産培地混合液をチヤンバー 1台あたり約 1· 3L添加した。 FuGEN" E 6 (ロシ ュ .ダイァグノスティックス社） 2. 12m 1と重鎖発現プラスミド、 '軽鎖発現 プラスミド各 530 gとを添 プロトコールに従い混合した後に、 Hy b r i d oma -S FM ( I n v i t r o g e n社） 1. 3Lへ加えた。 FxiGENE /DN AZ生産培地混合液添加後、 37 °Cの条件下で 3〜 4日間培蹇行 ヽ、 上清 'を回収した。 Hy b r i d oma — SFM培地 1. 3 1をセルスタダク · 10チ ヤンパーに新たに加え、 さらに 3〜4目間培養行い、 再度上清を回 IK:した。 これ らの上清中にマウス/ヒトキメラ抗体が発現しており、 以下の精製に月いた。 1 6— 2 マウス/ヒトキメラ抗体の精製
精製操作は、 記載が無い限り 4 °Cにて実 ½した。
1 6— 1で調製された c F 1 2 3 2— 3 7— 2 CO S培養液を、 プレフイノレ ターとして 1 mの孔径を有するカプセル ^一トリッジフィルター （東洋濾紙株 式会社） 、 本フィルタ一として 0. 22 μ :mの孔径を有するフルォロダインフィ ルター （PAL L) をそれぞれ用い、 室温にて清澄化し培養上清を得た。 こ の培 養上清を予め P B S— （S i gma) にて^ F衡ィ匕した r mp P r o t e i n A S e p h a r o s e F a s t F l o w 、Am e r s a m B i o s c i e n c e s ) に吸着させ、 非吸着蛋白質を P B S—にて洗浄後、 非特異的に吸着 している蛋白質を 1. 5 M N a C lを含 1 0 0 mMリン酸バッファ一にて 溶出した。 その後、 特異的に結合している 体を、 1 0 0 mM グリシン一塩 酸バッファー （P H 3. 0) にて溶出しブこ。 溶出液はその容量を測定し、 直ぐ に 1Z1 0容量の 1 M T r i s— HC 1 ( H 7. 0) を添カロし、 p Hを中 性に戻した。 得られた標品を 0. 9% N a C 1水溶液に対して透析し、 精製標 品とした。 同様の操作で c F 1 2 3 2— 4 3— 3、 c F 1 2 3 2— 1 0— 1 ある いは c F 1 2 3 2— 1 8— 3を精製した。
なお、 実施例 1 3でクローン化したモノ クローナノレ抗体の内、 F 1 24 9 — 1 8— 2、 F 1 24 5— 7— 1、 F 1 24 6 — 1一 1、 F 1 24 9— 2 4— 1、 F 1 24 5— 4— 1、 F 1 2 4 9— 2 2— 1及ぴ F 1 2 5 1— 1— 1についても同 様の方法でキメラ抗体発現プラスミドの作梨、 CO S— 1細胞での発現及び精製 を行なった。 実施例 1 7
マウス/ヒトキメラ抗体の抗原結合特性
1 7 - 1 マウス/ヒトキメラ抗体の抗原結合活性
1 6— 2で作製した各キメラ抗体の解離定数を、 蛋白相互作用解析装置 B I A CORE 3 00 0 (B I ACORE) を用いて実施例 5と同様の方法で測定した < 作製したキメラ抗体は h GPV I -hF c に対して十分な親和性を有して Vゝるこ とが示された。 ' . 17- 2 マウス/ヒトキメラ抗体と対応するマウスモノクローナル抗体との杭 原結合'卜生比較
マウス/ヒ トキメラ抗体と対応マウスモノクロ一 ル抗体との抗原結合活性を 比較するために、 実施例 14に記載の方法と同様に ルォキシダーゼ標識 F1232— 37-2, F1232- 18- 3、 F1232- 43- 3、 および F1232 - 10 - 1を作製し、 これらの標識抗 ί本 と固相 f匕 hGPV I- hFcとの結合反応系に対応する非標識マウス/ヒトキメラ^: 体を添カ卩する競合法 （実施例 14の 14_ 1記載の:^法） により、 マウスモノク ローナ 7レ抗体と対応するマウス/ヒ トキメラ抗体のヒ ト GP V Iに対する結合活 性を比較した。 その結果、 図 4に示すように両者には差がなかった。 また、 GP V Iとコラーゲンの結合に対する各抗体の阻害活性 定を実施例 2あるいは実拖 例 14 こ記載の方法のより行った。 本実験の結果、 図 5に示すように検討を行つ た各抗体による GPV Iとコラーゲンとの結合阻害 性が確認された。 キメラ ヒ した抗体とマウスハイプリ ドーマ抗体の GP VI と コラーゲンとの結合阻害活'挂 は同等であった。
17- 3 抗ヒト GPV I抗体の GPV I変異体との結合特性
hGP V I - hFcを 4 g/mLで固相化したプレートに、 実施例 14に記載の方法で ペルォキシダーゼ標識した F1232- 37- 2または CF1232- 37- 2と実施例 7にて作製し た hG P V I - hFc、 mGP V I - hFc、 hGP V I - mL3- liFc、 または、 実施例 1に記 載の方法と同様の方法で作製した hG P V I -K59E-hFc (ヒト G P V Iの 59番目の リジンをグルタミン酸に置換した 1ァミノ酸変異ヒ ト G P V I細胞外領域とヒ卜 Fcからなる融合蛋白質） を 0.1%BSA/PBSで希釈し混合した後にプレートに添カ卩し、 37°Cで一時間反応させた。 反応後、 TMB溶液を用いて発色させ吸光度を 450nmの较 長にて浅 !J定した。
本実験の結果、 ペルォキシダーゼ標識された F1232- 37 - 2あるいは cF1232-37- 2 と hGP V I - hFcとの結合は hGP V I- hFc、 hG P V" I - mL3— hFc、 および hGP V I - K59E-hFcにより阻害されたが、 mGP V I- hFcでは阻害されなかった。 この結 果は F1232-37- 2あるいは CF1232- 37- 2で同等であつナこ。 一方、 実施例 2に記載さ れた方法と同様の方 で作製されたマウスモノクローナル抗体 F1199- 6ではこれ とは異なる現象が認められた。 すなわち、 ペルォキシダーゼ標識した F1199-6抗 体と hGPV I— hFcとの結合は、 hGP V I一 hFcおよび hGP V I— mL3 - hFcによ り阻害されたが、 hGPV I - mFc および G P V I - K59E-hFdこは阻害されなかつ た。 結果を図 6に示す。
1 7- 4 マウス/ヒ トキメラ F1232 - 37 - 2抗体のェピトープ解析
CF1232- 37- 2抗体の抗原認識部位を確認するために、 G P V I -匪- hFc、 G P V I一匪— hFcヽ hGPV I - mL2 - hFc、 hGPV I一 mL3— hFc、 hG P V I—mL4— hFc、 h GP V I - mL5- hFc、 hGPV I - mL6- hFc、 hGPV I - mL7 hFc、 hGP V I - mL8 - hFc、 hGP V I - mL9—hFc、 hGPV I - mLlO- hFc、 hGPV I— mLll- hFc、 hGPV I - mL13- hFc、 hGP I - mL 14 - hFc (以上実施例 7で作製） と cF1232- 37-2抗体と の結合活性測定を行つた。
即ち、 ヒ ト GPV I のループ領域をマウスのループ領域に量換することにより、 抗体の結合活性が置換前のヒト GP V Iに対する結合活性と 較して低下した場 合、 置換したループ鎮域に抗体の認識領域が存在すると推測される。 またマウス GPV Iのループ領敏をヒ トのループ領域に置換した置換体において、 抗体の結 合活性が回復した場合、 置換したループ領域が抗体の認識镇域であると推測する ことができ、 これら两実験より抗体の反応領域の絞込みが可 であると考えられ る。
測定方法は 17— 3の方法に準じ行った。
得られた結果を解析したところ、 図 7に示すように、 cF1232 - 37-2は hGPV I-mL9- hFcにおいて顕著に活性が低下していた。 この結果よ り CF1232- 37-2はル ープ 9領域を認識するちのと考えられる。 実施例 18
マウス抗 GPV Iモノクローナル抗体おょぴマウス/ヒトキメラ抗 GP V Iモ ノクローナル抗体の血小板に対する作用
18- 1 ヒト血小板およぴカニクイザル血小板活性化作甩 正常人あるいは力-クイザルから採血したクェン酸力卩血を Sysmex F - 820に供し、 血小板数等を求めた後、 ヒ トでは 170Xg、 25°C、 15分間、 サルでは 115Xg、 25°C、 20分間遠心分離すること ίこより多血小板血漿 （Platelet Rich Plasma; PRP) を、 引き続き、 1300Xg、 25°C、 15分間遠心分離することにより乏 jftL小板血漿
(Platelet Poor Plasma; PPP) を得た。
次に得られた PRPを血小板の濃度が 3.33 X 108 cells/mLとなるように PRPを PPP で希釈した後、 終濃度 1〜10μ §/ιΛの抗体を添カ卩し， 37°Cで 30分間インキュベー トした。 インキュベート後パラホルムアルデヒド （終濃度 1%) を加えて、 4°Cで 1 時間固定ィ匕を実施した。 0. 5%非働化 FBSを含む PBS (以下、 FBS, ッファー） で洗 浄後、 抗ヒト CD62P-PE (BECKMA COULTER) を添加して室温、 遊光下で 30分静置 した。 30分後、 FBSバッファーで血小板を洗浄後、 フローサイ 卜 メーター
CYT0MICS FC500 (BECKMAN COULTER) で血小板の蛍光強度を測定することにより CD62Pの発現について解析した。
図 8に示すように、 F1199-6抗体は濃度依存的にヒト血小板 るいは力二クイ ザル血小板を活性化したが， F1232-37- 2抗体に血小板活性化作用はほとんど認め られなかった。 また、 CF1232 - 37-2のヒト血小板あるいは力二クイザル血小板へ の作用も同様であった。 また、 実施例 1 6で作製したキメラ抗体、 c F 1 249 - 1 8 - 2, c F 1 24 5 - 7 - l , c F 1 246— l— 1、 c F 1 24 9 ~ 2 4一 Γ、 c F 1 24 5— 4 — 1、 c F 1 24 9— 22— 1及び c F 1 25 1— 1 一 1について同様の方法でサル血小板活性化作用を検討したところ、 活性化作用 は認められなかった。 一音 のクローンでは、 キメラ化していなレ、マウス抗体でサ ル血小板活性化作用を示すものもあったが、 キメラ化すること こよりその作用は 消失した。 なお、 実施例 2で作製したマウスモノクローナル抗体についても同様 に検討したところ、 何れの抗体もヒト血小板活性ィ匕作用は認められなかつた。
1 8- 2 ヒト血小板凝集惹起作用
1 9 - 1に記載の方法で調製された PRPを血小板の濃度が 3.33 X 108 cells/mL となるように PPPで希釈した後、 終濃度 1〜10μ g/mLの抗体を添カロし， 37°Cで 5分 間ィンキュベートした。 ここに終濃度 ImMの CaCl2溶液を添力卩し、 37°Cで 12分間ィ ンキュベートしながら PRPの光の透過率を MCMへマトレーサー 313M (ェム ·シー · メディカル） で測定することにより血小板凝集を求め：こ。
図 9に示すように、 F1199- 6は濃度依存的にヒト血小才反の凝集を惹起したが、 F1232-37 - 2および c F1232- 37- 2の血小板凝集惹起作用ほほとんど認められなか" た。
18-3 コラーゲン惹起ヒ ト血小板凝集抑制作用
18-1に記載の方法〖こより調製された PRPを血小板の濃度が 3.33 X108 cells/mLとなるように PPPで希釈した後、 終濃度 1〜10 ^ g/mLの抗体を添加し， 37°Cで 5分間インキュベートした。 ここに終濃度 ImMの CaCl2溶液を添加し、 さら に 37°Cで 3分間インキュベートした後， 終濃度 lAig/mlc コラーゲン溶液を添加 し、 37°Cで 12分間ィンキュベートしながら PRPの光の透過率を MCMへマトレーサー 313M (ェム .シー ·メディ力 /レ） で測定することによりコラーゲン応答性の血小板凝 集を求めた。
図 10に示すように、 F1232- 37- 2および CF1232- 37 - 2は濃度依存的にコラ一^ザ ン惹起ヒ ト血小板の凝集を抑制した。
18-4 ADP惹起ヒト血小板凝集抑制作用
18- 1に記載の方法【こより調製された PRPを血小板の濃度が 3.33 X108 cells/mLとなるように PPPで希釈した後、 終濃度 1〜： !O g/mLの抗体を添カロし， 37°Cで 5分間インキュベートした。 ここに終濃度 ImMの CaCl2溶液を添加し、 さら に 37°Cで 3分間インキュベートした後， 終濃度 5μΜの ADP溶液を添カ卩し、 37°Cでュ2 分間ィンキュベートしな; ¾ ら PRPの光の透過率を MCMへマトレーサー 313M (ェム · シー ·メディカル） で測定することにより ADP応答性の 小板凝集を求めた。
の結果を図 11に示す。
F1232- 37- 2および c F1232- 37- 2に ADP惹起ヒ ト血小板凝集の凝集抑制作用は認 められなかった。 - 実施例 1 9 7S 抗 GPV I抗体の測定系 （E I A)
サンドイッチ E I A法により抗 GPV I抗体濃度を測定した。 すなわち、 固相 化蛋白質として実施例 1と同様の方法で調製したヒト GPV Iの配列を つ hG P V I— h F c、 および、 標識抗体として An t i Huma n K a p p a L i g h t Ch a i n s HRP (D AKO) を用いたサンドイツ I A 系を作製した。 .
標準品として実施例 1 6で調製した抗 GPV I抗体を用いた。 hG P V I — h F cを PB S (pH7. 4) で 4 gZnn Lに希釈し、 NUN C— I m rm u n o p l a t e Ma x i s o r p (NUNC ) の各ウエノレに 50 μ L添カロした。
4 °Cでー晚反応後、 氷冷水で 5回洗浄し、 2%S t a b i l Gu a r d (S u r Mo d i c s , I n c. ) を含む PBS (p H 7. 4) を各ゥエルに 1 0 0 L 添カロし、 ブロッキングした。 次に 0. 1%B S Aを含む PB S (pH 7 . 4) を 希釈液として測定試料および標準品の希釈検体を調製した。 プレートのブロッキ ング剤を廃棄し、 各ゥヱルに希釈検体 5 O μ Lを添カ卩し、 3 7 °Cで 1時間反応さ せた。 反応終了後、 0. 05%Twe e n 2 0Z0. 9 %塩化ナトリウム溶液で 3回洗浄した。 次に 1 0%ゥサギ血清を含む PB S (pH7. 4) で希 した標 識抗体を調製し、 各ゥエルに 5 0 β L添カ卩し、 3 7 °Cで 1時間反応させた。 反応 終了後、 0. 05%Twe e n 2 0/0. 9 %塩化ナトリウム溶液で 3 回洗浄し、 テトラメチルベンジジン溶液 (B i 0 FX) を各ゥヱルに 5 0 μ Lずつ添カ卩した。 室温で約 1 0分反応後、 1 m ο 1 Z L塩酸溶液 50 μ L·で反応停止し、 プレート 分光光度計で 450 nmの吸光度を測定した。
また、 サル血漿中の GPV I抗体濃度を測定する際には、 標識抗体希 ¾液とし て 1 0%サル血漿おょぴ 1 0%ゥサギ血駭を含む PB S (pH7. 4) を用い、 同様に測定した。 実施例 20
力二クイザル viV0実験による抗 GP V Iモノクローナル抗体の評価 ( 2 ) 試験開始にあたり、 まず被験力二クイザルの体重測定および薬物投年前採血を 行った。 抗 GPV I抗体投与後 0.5時間〜 2週間後に採血し、 1) 血小板数、 2) 血小板膜蛋白質 （GPIIb/GPIIIa (CD41a) 、 GPIX (CD42a) ) の発現、 3 ) it小板 G P V Iの発現、 4 ) 血小板凝集 （コラーゲンおよび ADPに対する反応性） 測 定し、 各抗体の評価を行った。
すなわち、 力二クイザル （雄、 約 5kg) の脚静脈から採血したクェン酸加 I±Lを' Sysmex F- 820に供し、 血小板数等を求めだ後、 115 X g、 25°C、 15分間遠心 離す ることにより多血小板血漿 （Platelet Rich Plasma; PRP) を、 引き続き、 830 X g、 25°C、 20分間遠心分離すること δこより乏血小板血漿 （Platelet Poor Plasma ; PPP) を得た。 次に得られた PRPを 0_ 5%非挺化？8≤と2. 5 mM EDTAを含む PBS <以下、 FACSバッファー） で希釈し、 CD41aの発現については抗ヒト CD41a- FITC (BD
Biosciences Pharmingen) を、 CD42aの発現については抗ヒト CD42a-FITC (BD Biosciences Pharmingen) を、 G P V Iの発現については蛍光色素 Af488で標識 したゥサギ抗 G P V I _mFcポリクローナル抗体おょぴマウス抗 G P V I - mFcモノ クローナル抗体を添加して室温、 遮光下で 30分静置した。 30分後、 FACSパ ファ 一で血小板を洗浄後、 フローサイ卜メーター CYT0MICS FC500 (BECKMAN
COULTER) で血小板の蛍光強度を測定することにより各膜蛋白質の発現につ ヽて 解析した。 また得られた PRPを使用 し Western Blotting により各膜タンパグ質の 発現について解析も行った。 方法 ίま以下の通りである。 サル ex vivo試験 こお いて得られた各種 PRPを 2. 5 mM EDTA/PBSにより 2回洗浄し、 0. 5 X 106血/卜板/ μ Uこ'なるよつ【こ 1 X Sample Bufrer (+ β - mercaptoetnanol ， Protease
inhibitor cocktail (Roche) ， Phosphatase inhibitor cocktail (PIERCn ) を 添加し、 99°Cで 5分間熱処理を行つナこ。 処理したサンプルは液体窒素により ¾乘結 し、 使用直前まで - 30°Cで保存した。
Western Blottingによりサル PRP中の各タンパク質を解析するために、 ま " 5 SDS - PAGEによりタンパク質の分離を行つた。 5-20%の濃度勾配ポリアタリ Jレアミ ドゲル （ATT0) を使用し、 1レーンあたり 2. 5 X 106血小板になるようにサ Zプノレ をチャージし、 ゲル一枚につき 30 mAで泳動を行った。 ブロッテイングは常 去に 従い、 セミドライ法により低蛍光のメンブレン （Immobilon - FL
PVDF, MILLIP0RE) に転写した。 ブロッテイング後、 0. 1 % Tween 20 /PBS
(TPBS) で軽くすすぎ、 BlockAce (大日本製薬株式会社） により 4°Cでー晚づ口 ッキングを行った。 ブロッキング反応後、 10 % BlockAce/TPBSで希釈した一次 抗体を添加、 室温で一時間、 回転混合しながら反応させた。 使用した一次抗体は 抗 GPIIIa抗体 （Anti- Integrin 3， Santa Cruz) 、 抗 G P V I抗体 （ヒ ト G P V I合成べプチドを抗原としたポリク口ーナル抗体） 、 抗 GPIX抗体 （Anti- CD42a， Santa Cruz) である。 一次抗体反応後、 TPBSによりよくすすレヽだ後に、 TPBSで洗浄した。 洗浄後、 10 °/。 BlockAce/TPBSにより希釈した二次抗体を添加し 室温で 30分間回転混合しながら反応させた。 二次抗体は GPIIIa及び G P V Iは Anti-Rabbit Igs HRP、 GPKは Anti- Goat Igs HRP (共に DakoCytomation) を使用 した。 二次抗体反応後、 TPBSによりよく洗浄し、 ECL Plus (Amersham
Biosciences)により検出を行なった。 反応後、 Typhoon9410 (Amershaia
Biosciences) により発光検出を行った。 検出条件は Fluorescenceモー ドを使用 した。 このモードにより ECL Plus発光中間体を検出した。 検出された z ンドを解 析ソフト ImageQuant5. 2を使用し、 発現タンパク質の定量を行った。
—方、 コラーゲンおよぴ ADPに対する反応性については以下のように行った。 先ず、 血小板の濃度が 3 X 108 cells/mLとなるように PRPを PPPで希釈しブこ後、 終 濃度 ImMの CaCl溶液を添加し、 37°Cで 3分間ィンキュベートした。 さら ίこ終濃度 2 μ g/mlのコラ一ゲン溶液あるいは終濃度で 20 μ Μの ADP溶液を添加し、 37°Cで 12分 間ィンキュベートしながら PRPの光の透過率を MCMへマトレーサー 313M (ェム ·シ 一'メディカル） で測定することにより コラーゲンあるいは ADP応答' の血小板 凝集を求めた。
2 0 - 1 マウス抗ヒト G P V Iモノク ローナル抗体の力二クイザル ex vivo試 .
マウスモノクローナル抗体 F1232- 37- 2およぴマウスモノクローナル抗体 F1199- 6の 0. 3mg/ k gで静脈内投与した場合、 投与 1日後には血小板 G P V I 量の低下 が認められとともに血小板のコラ ゲンに対する応答性の低下が認められ、 その 作用はマウスモノクローナル抗体 F1232— 3ァ- 2では 2日以上持続した。
また、 F1199- 6投与力二クイザルにおレヽては、 投与後に血小板数減 が見られ たが、 F1237 - 2投与力二クイザルでは血/ J、板数に大きな変動は見られ かった。 結果を図 1 2に示す。
20- 2 マウス/ヒトキメラ抗ヒト GP V I抗体の力-クイザノレ ex vivo試験
(1) 単回静脈内試験
力-クイザル （雄） に CF1232- 37-2を 0.1, 0.3， lmg/kgにて静脈内投与した。 図 1 3に示すように、 0.1， 0.3, lmg/kg cF1232- 37- 2投与動物では投与後速や かに血/ J、板のコラーゲンに対する応答性が低下し、 その作用は 0.3および lmg/kg 投与動物では 2日間以上持続した. また、 0. lmg/kg CF1232-37- 2投与動物は投与 後 2時間ほどかけてコラーゲンに対する応答性が低下し、 その作用は 1日間持続し た。
20- 3 マウス/ヒトキメラ抗ヒト GP V I抗体の力-クイザル ex vivo試験
(2) 反復静脈内投与試験
力二クイザル （雄） に cF1232- 37- 2を 1日おきに 4回投与し， 各投与前、 各投与 翌日， 最終投与翌日〜 17日後の採血というスケジュールにて行った。 また、 採血 により得られた血液については、 1) 血小板数、 2) 血小板膜蛋白質
GPIIb/GPIIIa (CD41a) 、 GPIX (CD42a) 、 GPIIIa (CD61)の発現、 3) 血小板 GP 1の 現、 4) コラーゲン惹起血小板凝集および ADP惹起血小板惹起に対する 反応性を測定した。
初回投与の翌日から血小板 GPV I量の低下おょぴ血小板のコラーゲンに対す る応答十生の低下が認められ， コラーゲンに対する応答性の低下は 0. lmg/kg投与動 物は最終投与後 2日間， 0.3mg/kg投与動物は最終投与後 10日間以上持続した。 図 14に 0.3mg/kg反復投与試験における力二クイザル血小板のコ ーゲン惹起凝集 能おょぴ血小板 GPV I、 GPIIIaおよび GPIXの推移を示した。 なお、 この試験に おいて、 血小板膜蛋白質 GPIX (CD42a) 、 GPIIIa〔CD61)の発現掌は大きく変化し なかつ;^。
20— 4 マウス/ヒトキメラ抗ヒト GP V I抗体の力二クイザル ex vivo試験
(3) 単回皮下投与試験 力二クイザル （雄） に CF1232- 37- 2を 0.1, 0.3, lmg/kgにて皮下投与し、 投与 前および投与後継時的な採血により得られた血液を試料として、 1 ) 血小板数、 2) 血小板膜蛋白質 (GPIIb/GPIIIa (CD41a) 、 GPIX (CD42a) 、 GPIIIa (CD61) ) の発現、 3) 血小板 GPV I の発現、 4) 血小板凝集 （コラーゲンおよび ADPに' 対する反応性） を測定した。 結果を図 1 5に示す。
lmg/kgおよび 0.3mg/kg皮下投与動物においては投与 3時^後から血小板のコラ 一ゲンに対する応答性の低下がみられ、 投与翌日には血小核 GPVI量の低下が認め られた。 コラーゲンに対する応答性の低下は 0.3mg/kg投与動物は投与後 1週間以 上、 lmg/kg投与動物は 2週間以上持続した。 また、 0. lmg/kg投与動物においても 投与当日にコラーゲンに対する応答性の低下が認められた。 また、 血小板膜蛋白 質 （GPIIb/GPIIIa (CD41a) 、 GPIX (CD42a) 、 GPIIIa (CD6L)) の発現量は大きく 変化しなかった。 実施例 21
抗 G P V Iモノクローナノレ抗体の Fabおよび F(ab' )2の調製
21 - 1 マウスモノクローナル抗体 F 1232— 37— 2の F (a b，） ；;作製 マウスモノクローナル抗^: F 1232— 37— 2の F ( a b，） 2を作製するた めに、 実施例 2で得られたマウスモノクローナル抗体 F 1 232— 37— 2を L y s y l En d o p e p t i d a s eを用いて処理した。 すなわち、 精製マウス モノクローナル抗体 F 123 2— 37— 2に 1 10量の 1Mトリス緩衝液 （p
H 8. 5) を添加し、 Ly s y l En d o p e p t i d a s e (W a k o ) を抗 体：酵素 = 30 : 1 (モル _b匕） になるように添加し、 37。<C 3時間反応した。 反 応終了時には終濃度 3 OmMとなるように TLCK (S I MA) を添加した。 次に F (a b') 2の精製を行った。 まず未切断の抗体と F c部位を取り除く目 的.で、 Ly s y l En d o p e p t i d a s e処理した in你を P r o s e p r
A (M i 1 1 i p o r e ) ίこ供した。 ざらにこの非吸着画 を S u p e r d e x
75 (Am e r s h a m) ί.こ力ける事で L y s y 1 E n d o p e p t i d a s e を取り除き F 1232— 3 7 — 2の F ( a b，） 2を得た。 続いて得られた F (a b') 2を生理食塩水 （大塚） で透析し、 抗体の純度をアクリルアミドゲル上で分 析することにより評価し、 抗体濃度を B o v i n e I g Gスタンダードによる B r a d f o r d法 こて定量した。
21— 2 1232— 37— 2の 3ゎ作製
F 1232— 37— 2の F a bを作製するために、 実; Ife例 2で得られた精製マ ウスモノクローナル抗体 F 1232— 37— 2を P a p a i n (W a k o ) を用 いて処理した。 すなわち、 精製マウスモノクローナル抗 f^:F 1232— 37— 2 を 1 mMC y s t e i n e , 20 mME D T A/D - P B S— (p H 7. 4) バ ッファー中に置換し、 P a p a i n (W a k o ) を抗体： 酵素 = 30 : 1 (重量 比） になるように添カロし、 25°C16時間反応した。 反 終了時には終濃度 30 mMとなるように I o d o a c e t am i d e (W a k o ) を添カロした。
次に F a bの精製を行った。 まず未切断の抗体と Fc¾3位を取り除く目的で、 P a p a i n処理した抗体を P r o s e p r A (Mi 1 1 i p o r e) に供し た。 さらにこの非吸着画分を S u p e r d e x 75 (An_ e r s h a m) にかけ る事で P a p a i nを取り除き F 1232— 37— 2の F a bを得た。 続いて得 られた Fa bを生理食塩水 （大塚） で透析し、 抗体の純度をアクリルアミドゲル 上で分析することにより評価し、 抗体濃度を B o v i n e I gGスタンダード による B r a d f o I d法にて定量した。 21 -3 F1232- 37— 2抗体の F (ab' )およぴ Fabの抗原結合反応性
実施例 2において作製した F 1232— 37— 2 (Wix o 1 e抗体） 、 およぴ 22— 1および 21— 2で作製した F (a b，） 。および F a bそれぞれの解離定 数を蛋白相互作用解析装置 B I AC ORE 3000 (Β Γ ACORE) を用いて 測定した。 すなわち、 センサーチップに実施例 1で作製した hGPV I- hFcを マニュアルに従って CM5チップ （B I ACORE) に洁合した。 つぎに、 各抗 体を HBS- EP緩銜液 (B I ACORE) で 0から 80 0 nMまでの希釈系列 を調製し、 B IACORE 3000にて.解析した。 各抗^:の結合ごとに p H 1. 5のグリシン緩衝液 (B I ACORE) でチップを再生した。 得られた結果を1T h o i e抗体及び F (a b，） ,に関しては e v a 1 u a t i o nソフト （B I A CORE) の B i v a l e n t a n a 1 y t eを用いて解析し、 F a bに関し ては 1 ： I B i nd i n gを用いて解析し、 解離定数を算出した。 その結果、 F 1232-3 7— 2抗体の F (a b， ） 2及び F a bの解顧定数は、 Wh o 1 e 抗体のそれを 1として約 0. 7及び 0. 6であり、 Wh o 1 e抗体と比較して同 等な親和性を有してレ、る事が示された。 実施例 22
抗 GPV I抗体 Fabの力二クイザル in vitro試験
力-クイザルから実施例 20に記載の方法で力-クイザルより採血し、 調製し た PRPを血小板の濃度力 S3.33X 108 cells/mLとなるように PPPで希釈した後、 終濃 度 1〜： LOO^ug/mLの F1232- 37- 2Fabを添加し， 37°Cで 5分間ィ ンキュペートした。 こ こに終濃度 lmMの CaCl0溶液を添加し、 さらに 37°Cで 3分間ィンキュベートした後， 終濃度 2/i g/mlのコラ一ゲン溶液を添加し、 37°Cで 12分間ィンキュベートしなが ら PRPの光の透過率を MCMへマトレーサー 313M (ェム ·シー ·メディカル） で測定 することによりコラーゲン応答性の血小板凝集を求めた。 結果を図 16に示す。
F1232-37-2 Fabのコラーゲン惹起血小板凝集抑制作用は cF1232- 37- 2より弱か つた。 実施例 23
抗 GPV I抗体 F(ab， ）2の力二クイザル ex vivo試験
実施例 21にて調製した F1232- 37 - 2の F(ab' )2を lmg/kgの投与量で力二クイザ ルに皮下投与し、 投与前おょぴ投与後継時的な採血により 得られた血液を試料と して、 血小板 G P V I の発現およぴ血小板凝集能 （コラーゲンおよぴ ADPに対す る反応性） を彻 J定し广こ。
図 17に示すよう〖こ、 F1232- 37 - 2F(ab' )2投与動物では役与 12時間後からコラ 一ゲンに対する応答十生の低下がみられ、 投与翌日には GP V Iの発現低下が認め られた。 コラーゲン^:対する応答性の 下は 2日間以上持鏡した。 また、 血小板 膜蛋白質 （FcyRII (CD32) 、 GPIX (CD42a) 、 GPIIIa(CDSl)) の発現量は大きく 変化しなかった。 ' 実施例 2 4
サル出血 B 間測定
出血時間の測定にあたっては先ず力二クイザルの体重を測定した後、 血液学的 パラメータ、 凝固系パラメータ， 血小板機能に異常がないことを確認し、 lmg/kg の cF1232- 37— 2を皮下に投与してその 3時間および 48時間後に測定というスケジュ 一ノレにて行う。 .
力二クイザル （雄、 2. 5〜5kg) の両側尾静脈に注射針を刺入した後、 出血時間 を測定する。
CF1232-37— 2投与動物において投与前と比較して著明な出血時間の延長は認め られない。 実施例 2 5
マウス/ヒ トキメラ抗 G P V I抗体発現 CH0細胞の作製
2 5 - 1 マウス/ヒ トキメラ F 1 2 3 2 - 3 7— 2 現プラスミ ドの作製
まず、 発現効率を高める目的で、 c F l 2 3 2— 3 7 — 2重鎖発現プラスミド ( ρ·ΤΚ- 2 5 1 0 ) を Eco RIと Nco. Iで切断し、 プロ ΐ "一ターと開始コドンの間 に、 Kozak配歹 !J (Kozak, M. et al. , J. Mol. Biol. , 196， 947—950, 1987) を有す る断片 （センス鎖 5， AATTCGCCGCCACC 3 ' (配列番号 291) 、 アンチセンス鎖 5， CATGGTGGCGGCG 3 ' (配列番号 292) ) を揷入し、 ： ρ ΤΚ— 2 5 7 1を構築した。 同様に c F l 2 3 2— 3 7— 2軽鎖発現プラスミド （p TK— 2 5 1 1 ) にも Kozak 配列を挿入し、 p TK— 2 5 7 2を構築した。
次に、 ρ ΤΚ— 2 5 7 2を制限酵素 Ssp Iおよび Sse 83871で切断し、 得られた断 片の末端を∑P滑ィ匕することで、 軽鎖発現ユニット （EFプロモーター、 抗体軽鎖遺 伝子おょぴポリ Aシグナル配列） を調製した。 一方、 TK— 2 5 7 1は、 重鎖宪現 ユニットを切断しない制限酵素 Sse 83871で切断後、 ^滑化処理を行い、 この部 位に軽鎖発現ュニットおよびマーカーュニットを一緒 こ揷入することで、 3ュニ ットを 1つのベクター上にもつ両鎖安定共発現プラスミドを構築した。 なお、 マ 一力ーュニントは遺伝子增幅の為のマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ （mDHFR) 遺伝子に、 適当なプロモータ一/ェンハンサーおよぴポリ Aシグナノレ配列を付した 遺伝子断片であり、 4種類 （アデノウイルスプロモータ、 チミジンキナ一" ^プロ モーター、 SV40プロモーター/ェンハンサーおよぴ SV40プロモーター） のァ。ロモ 一ター/ェンハンサーを合成して用意した結果、 4種類の両鎖安定共発現 ラス ミド （それぞれ、 pTK— 25 50、 ΤΚ- 2575、 ρ ΤΚ- 2576お Jぴ ρ ΤΚ- 2577) を構築した （図 IL 8参照） 。
25-2 マウス/ヒトキメラ F 1 232-37— 2を発現する C ΗΟ細！ ¾开質 転換株の作製
DHFR遺伝子欠損 CHO細胞に実施例 25— 1で構築した発現プラス ド ρ ΤΚ- 2577を t r a n s f e c t i o nし、 キメラ抗体産生形質転換 CHO を樹立した。 即ち、 HT me d i a S u p p l eme n t (50 X> H y b r i— M a x (S i gma ；終濃度 1 Xで使用） 及び 200 mM L— G 1 u t am i n e ( S i g m a ；終濃度 4 mMで使用） を含む E X— C E L IL 3 25 P F CHO (J RH B i o s c i e n c e ) にて馴化培養した C HO DXB 1 1を t r a n s f e c X i o n当日に遠心後、 8 X l 06c e l l s/ 150 c m2 Ro u xの濃度 フラスコに植え込んだ。 F uGENE 6 (ロッ シュダイァグノテイクス） 12 5 μ 1を用いて、 発現プラスミド ρ ΤΚ— 257 7 12. 5 μ gを F u GENE 6添付プロトコールに準じ調製し、 先の CHO DXB 1 1へ導入した。 5 % C〇2で 37 °C、 2日間培養した後に、 細胞 ¾r回収 し、 HT不含 4mM L— G 1 u t am i n e含有 EX— CELL 325 P F CHO培地 （以下 EX— CELL. (HT— ) と記載） で二度洗浄し、 EX_ CELL (HT— ) に再度懸濁した。 次に 1 2， 500〜 50, O O O c e l l s/w e l lで 96we l l— ： l a t eに細胞を蒔き直し、 5%C02、 3 7°Cで培養を続け、 3日あるい ί 4日毎に培地の半量を新しい EX— CE1LL
(ΗΤ-) に交換した。 約 1ヶ月間培養を続けた後、 コロニーが発生した エル 内の細胞を新しいプレートに移し、 培養上清中の CH0細胞を宿主として発？ ¾する CF1232- 37- 2を実施例 1 9に記載の E I Α法で測定した。 上清中に c F 1 232 —37— 2ZCHOの発現が確認された細胞を c F 1232-37— 2 CHO 産生形質転換株として得た。
同様にして、 CF1232- 37- 2発現ブラスミドの p TK— 2 5 5 0、 pTK— 2 5 7 5、 および ρΤΚ— 2 5 7 6で CHO DXB11株を形質転換し、 得られる組挺え細胞が 産生する c F1232- 37-2/CH0を実施^ Μ 9に記載の E I A法で測定した。 その結果、 表 1 5に示すように、 選択マーカ——として利用している mDHFRのプロ ΐ "一ターの 種類によって CF1232- 37- 2/CH0の生産性が異なっていおり、 相対的に^性の弱レヽ プロモーターを選択マーカーの発現プロモーターとして利用することで高発現ク 口ーンが得られることを確認した。 表 1 5
各種 CF1232-37-2/CH0発現プラスミ ドのトランスフエクション成辕
Figure imgf000086_0001
2 5 - 3 Me t h o t r e x a t eを用いた遺伝子増幅
2 6一 2で得られたキメラ抗体 現形質転換 CHO株を、 Me t h o t r e x a t e (以下 MTXと表記） を含む EX— CE L L (HT— ) 培地で遷択培養す ることにより、 遺伝子増幅作業を行い目的のキメラ抗体の生産量が上 ~している クローンの選択を行った。
即ち、 実施例 2 5— 2で得られた形質転換株を 3 0あるいは 1 00 n M MT X含有 EX— CE L L (HT -） 培地に懸濁し、 9 6 w e l l — p l a t eに卷 き込んだ。 3日あるいは 4日毎に培地の半量を新しい 3 0あるいは 1 0 O nM MTX含有 EX— CEL L (HT—） に交換し、 コロニーが生じるまで 5 % C O 2、 3 7°Cで培養を続けた。 得られたコロニーの培養上清中への発現量 ¾τΕ I A 法で確認し、 生産量の増加しているクローンを選択した。 その結果、 産量が約 2ないし 1 0倍上昇した形質転換梯を得ることができた。 尚、 この遺伝子増幅し た形質転換株を、 MT X濃度を 3ないし 10倍上げた培地で選択培養 繰り返す ことにより、 さらに生産量が増加するクローンを得ることができる。
25-4 CF1232- 37- 2発現 CHO細胞による CF1232- 37- 2の生産
25— 3で得られた CHO— G 32 D S 25 H 8細胞クローンを 1ひ 0 nM
MTX含有 EX—CELL (HT—） 培地に 1. 5 X 105c e 1 1 s m 1で 植え込み、 37°Cで 7日間培養した。 得られた培養上清を以下の精製 ίこ用いた。
25-5 c F 1232— 37— 2ZCHOの精製
以後の操作は特に記載が無い限り 4 °Cにて実施した。
25— 4で調製された CH0細胞株: t咅養上清を、 プレフィルタ一として Ι μπιの 孔径を有するカプセルカートリッジフィルター （東洋濾紙株式会社） 、 本フィル ターとして 0. 22 jumの孔径を有するフルォロダインフィルター （PALL) をそれぞれ用い、 室温にて清澄化した。 清澄化後の培養上清を予め P 3 S- (S i gma) にて平衡化したプロティン A (r mp P r o t e i n A. S e h a r o s e F a s t F l ow、 G E He a l t h c a r e,アマシャム バイオサイエンス） に吸着させ、 非吸着蛋白質を PBS-にて洗浄後、 排特異的 に吸着している蛋白質を 10 XPB S- (S i gma) にて溶出した。 その後、 プロテイン Aに結合している抗体を、 100 mM グリシン一塩酸バ ッファー (pH 3. 0) にて溶出した。 溶出液はその容量を測定し、 直ぐに: L 10容 量の 2 M T r i s— HC 1 (pH 8. 5) を添加し、 pHを中性こ戻し精製 抗体溶出液とした。 この精製抗体溶出液を、 アミコン ΡΜ 10 Ρ艮外ろ過ディスク (MI LL I PORE) を用いた限外濾過により濃縮したのち、 生理食塩液 （大 塚生食注、 大塚製薬工場） に対し: 透析し、 最終的な精製抗体溶液とした。
25-6 c F 1232— 37— 2ノ CHOの抗原結合反応个生
実施例 5と同様の方法にて、 c F 1232— 37— 2ZCHOの hGP V I - hF cに対する解離定数を測定した。 その結果、 c F 1232— 37— 2ZCH Oは h G P V I— h F cに対して十分な親和性を有し、 COS細胞で一過 4生に発現 ST 調製した c F 1232— 37— 2 ( cF1232- 37- 2/C0Sと略記する場合がある Q ) と同程度であることが示された。
25-7 c F 1 232— 37— 2/CFIOの反応性確認
c F 1232— 37— 2/CHOの反 寸生を確認するため、 hGPV I— b_ F cに対する結合能を指標に細胞による一過的遺伝子発現系で調製した c F 1 23 2— 37 _ 2との競合実験を行った。 測定方法は実施例 1 7の 17— 3記载 方 法に従った。 固相化タンパク質として hGP V I—hF cを用レ、、 標識した c F 1 232-37 _ 2ノ COSの結合に対して、 未標識の c F 1232— 3 7— 2 /C HOあるいは c F 1 232— 37— 2 /C O Sの濃度を変えて添加し、 その 競合活性を確認した。 その結果を図 19【こ示す。 c F 1232— 37_2ノ Oは c F 1232- 37— 2 ZCOSと同様の反応性を示すことが確認されブこ。 実施例 26
ヒ ト化抗ヒト GPV Iモノクローナル抗体の作製
4種類のマウス抗 GPV I抗体の中から、 再構成ヒト抗体の設計および作製の 為の第一候補として、 F1 232— 37— 2を選択した。 この抗体の各可変鎮域 の 3つの CDRを、 ヒトミエローマ由来の既知抗体の CDRと置換することで、 ヒ ト化 抗体の設計を行った。 重鎖として選択したのは、 NEW (Saul, F.ら、 J. Biol.
Chem. 253， 585-597) および Eu (Cunningrham B. ら、 Biochemistry 9,. 3161) で、 軽鎖 （κ鎖） としては REI (Epp, 0.ら、 Eur. J. Biochem. 45, 513 - 524) および Euのフレームワーク （以下 FR) を受容体とした。 それぞれ、 NEW- HA、 Eu- HA、 REI-KAおよび Eu - KAとして、 最初の各ァミ ノ酸配列 （バージョン A；図 20および 21) を設計した。 伹し Eu- HAは、 その FRL3および FR4において極めて希な配 IJが 存在することから、 より一^的な配列に変更して、 バージョン C (Eu-HC) を 設 計した。 次に、 これらのアミノ酸配列から、 それらを発現可能な遺伝子配列 ¾考 案し、 全長配列を数個に分割して DNA断 ^を合成し、 リガーゼによって各断片を つなぎあわせることで、 可変領域をコー ト、する遺伝子断片を得た。 これを、 当 な制限酵素切断部位を有するプライマー （基礎出願実施例 10参照） で増幅する ことで、 ヒ ト抗体定常領域 （重鎖は IgG4、 軽鎖は κ鎖） との結 が可能となり、 ヒト化抗体全長遺伝子を得た。 さらに、 この遺伝子を発現ベク ター pEF2Cewの EF プロモーター下流に組み込むことで、 各ヒト化抗体を発現可能なプラスミ ドが構 築され、 それぞれ、 pTK— 25 60 (NEW - HA) 、 pTK- 2632 (Eu-HC) 、 p TK-256 1 (REI-KA) および p TK— 263 1 (Eu-KA) とした。
これら各ヒ ト化抗体発現プラスミドをキメラ抗体発現プラス ミ ド （重鎖： pTK - 2571. 軽鎖： ρΤΚ—25 72) と組み合わせて発現させ、 産生された抗体 f 抗原に対する結合活性が保持されているかの検討を行った。 その結果、 Eu— HC、 REI - KAおよび Eu_KAにおいては、 キメラ抗体あるいはヒト ίヒ抗体のどの組み 合わせにおいても、 発現おょぴ結合活性が認められた。 一方、 ： EW - ΗΑは、 どの組 み合わせにおいても、 発現および結合活性が認められなかった。 そこで、 NEW-HA の各 FRのアミノ酸配列中に変異 （ヒト配列からマウス配列への覚換） を導入して 様々な変異体を作製および抗原結合活性を比較検討した結果、 最終的に FR1に 4 箇所の変異を導入したバージョンである NEW- HA において、 ヒ卜化抗体分子の発 現と、 抗原への結合活性が回復することが確認された。
さらに、 ループ置換 GPV I— Fcを用いた競合アツセィによっても、 各ヒト化 抗体は、 もとのキメラ抗体と同じ結合特異性を示すことが認め られた （図 22) 。 実施例 27
力二クイザル ex vivo実験に^る抗 GPVIモノクローナル抗体の評価 （2)
27-1 マウス/ヒトキメラ抗 GPVI抗体の力二クイザル ex vivo試験 （2) (単回静脈内投与試験その 2)
力二クイザル （雄） に実施例 16で作製したキメラ抗体 c F 1 249-24- 1又は c F l 249-22- 1を lmg/kgにて静脈内投与した。 実施例 20に示した 方法にて各種解析を実施した。 その結果、 両抗体とも投与後血小板 GPVI量の低下 を引き起こすとともに血小板のコラーゲンに対する応答性を低下させ、 その効果 は図 23に示すように c F 12 49— 24— 1で 2日間以上、 c F 1 249— 2 2— 1で 6時間持続した。 また、 両抗体ともに血小板膜蛋白質 (GPIIIa(CD61)) の発現量には大きく影響しなかった。 ' 実施例 28
力二クイザル出血時間測定 （2)
先ず力二クイザル （雄、 2.5〜5kg) の体重を測定した後、 血液学的パラ^ータ、 凝固系パラメータ， 血小板機能に異常がないことを確認し、 lmg/kgの c F 1 23 2-37-2を皮下に投与した。 投与前ならびに投与 3時間おょぴ 48時間後 こ下 記の方法により出血時間を測定した。 また、 ヒ較のために eptifibatideを O . 0 3、 0. 1、 および 0. 3mg/k gにて静脈内投与し、 投与 5分後に同様 方 法で出血時間を測定した。 なお、 出血時間測定時における血小板のコラーゲン惹 起凝集能を実施例 20に記載の方法により測定した。
力二クイザルの両側尾静脈に注射針を刺入した後、 ストップウォッチを 動し 直ちに針を抜き取った。 血管から湧出してくる血液を 5秒間隔で濾紙 （AdvsnteC、 定性濾紙 No.2、 150mm) に吸い取らせ、 濾紙に血液が付着しなくなるまでこ 操 作を繰り返し、 血痕のついた濾紙の数を 5倍して出血時間 （秒） とした。
その結果、 ept ibatide投与群では血小板のコラーゲン惹起凝集能が抑 ¾され ている状況下に出血時間の有意な延長が認められたが、 C F 1 23 2-3 7- - 2 lmg/kg皮下投与群では、 血小板のコラーゲン惹起凝集能が抑制されている; ^況下 においても投与前と比較して有意な出血時聞の延長は認められなかった （ 2 4) 。· 実施例 2 9
多価抗 GPVI抗体の調製と抗原結合活性
29- 1 IgM型抗 GPVI抗体発現プラスミドの作製
1) ヒ ト w鎖定常領域遺伝子のクローニング
HeLaゲノム DNAを铸型とし、 プライマー対 （IgM-bおよび； tgM_c) で C/i 1鎮域を、 プライマー対 （IgM - dおよび IgM - e) で C 2領域を、 プライマー対 （IgM- fおよび IgM-g) で ( 3領域を、 プライマー対 ょぴ IgM- j) で C^4領域をそ^ Lぞ れ増幅した。 各増幅産物を混合して铸型とし、 プライマー対 （Nae-IgMおよ
IgM-j) で再度 PCRを行うことで、 各領域が連結された遺伝子断片を増幅し、 PT7 - Blue (T)べク ターへ TAクローニングを行った。 配列を解析し、 ヒト μ鎖定常領域 をコードする遺伝子配列であることを確認し、 ρΤ7 - IgM Ofee I)とした。
IgM-b GGAGTGCATCCGCCCCAACCCTT (配列番号 293)
GCAGCTCGGCAATCACTGGAAGAGGCACGT (配列番"^ 294)
IgM-d ACGTGCCTCTTCCAGTGATTGCCGAGCTGC (配列番 295)
Igk-e TGGCTGTGTCTTGATCGGGGCCACACATGG (配列番 296)
IgM-f CCATGTGTGGCCCCGATCAAGACACAGCCA (配列番"^ 297)
IgM-g TGTGCAGGGCCACCCCCTTGGGCCGGGAGA (配列番 298)
IgM-h TCTCCCGGCCCAAGGGGGTGGCCCTGCACA (配列番^" 299)
IgM-j GTTGACACGGTTAGTTTGCATGCA (配列番号300)
Nae-IgM GCCGGCAGTGCATCCGCCCCAACC (配列番号 301 )
2 ) キメラ I gM型 F1232- 37- 2発現プラスミ ドの構築
先ず、 pTK_2510 (実施例 1 6に記載の CF1232- 37- 2の IgG 4型重鎖発現プラスミ ド） を Bam HIおよび δΙΗΙで切断することで、 γ 4鎖の定常領域をコードする 遺伝子断片を除去し、 残りのベクター断片 （発現用の EF- 1ひ プロモーターおよび CF1232- 37- 2の可変領域を含む） を得た。 このベクター断片こ、 pT7- IgM 0\¾e I) を Bam HIおよび Iで切断することで得られた μ鎖定常領 をコードする遺伝 子断片を揷 し、 CF1232- 37- 2の定常領域を γ 4鎖から^鎖こ置換したキメラ IgM 型？1232-37—2発現プラスミド （pTK- 2820) を構築した。 ま/こ、 同様の方法にて、
C F1232-43— 3の IgG4型重鎖発現プラスミド （p TK - 2504) より、 キメラ IgM型 F1232- 43-3突現プラスミド （pTK- 2822) を構築した。 3 ) ヒト. Τ鎮のクローニングと発現プラスミドの構築
HeLaゲノ > DNAを铸型とし、 プライマー対 （IgJ- aおよび Ig:J - d) で第 1ェクソ ン断片を、 ブライマー対 （IgJ - cおよび]:. gj- f) で第 2ェクゾン断片を、 プライマ 一対 （IgJ - eおよび IgJ - h) で第 3ェクソン断片を、 プライ"^ ^一対 （IgJ-gおよび IgJ-j) で第 4ェクソンをそれぞれ増幅した。 各遺伝子断片を混合して鎳型とし、 プライマー対（IgJ- bおよび IgJ- i) で再度 PCRを行うことで、 各領域が連結され た遺伝子断片を得て、 pT7 - Blue(T)ベクターへ TAクローニン 、を行った。 配列を 解析し、 ヒト J鎮をコ一ドする遺伝子配列であることを確認し、 pT7-IgJとした。 pT7-IgJを ¾a Iと am HIで切断して J鎖をコードする遺伝子斷片を得た後、 発現 ベクター （pEFScew) の EF - 1ひプロモーターの下流にある ¾«s Iと as HI部位に揷 入することで、 ヒ ト J鎖発現プラスミ ド （pTK -2393) を構築した。
IgJ-a CACTCCTTATAGATCACACACCT (配列番号 302)
IgJ- b GTGAAGTCAAGATGAAGAACC (配列番号 303)
IgJ- c CTGTTCATGTGAAAGCCCMGAAGATGAAA (配列番号 304)
IgJ- d TTTCATCTTCTTGGGCTTTCACATGAACAG (配列番号 305)
IgJ- e AAACATCCGAATTATTGTTCCTCTGAACAA (配列番号 306)
IgJ- f TTGTTCAGAGGAACAATAATTCGGATGTTT (配列番号 307)
IgJ-g CCATTTGTCTGACCTCTGTAAAAAATGTGA (配列番号 308)
IgJ- h TCACATTTTTTACAGAGGTCAGACAAATGG (配列番号 309)
IgJ- i TTAGTCAGGATAGCAGGCATCTG (配列番号 310)
IgJ-j AGAGCTATGCAGTGAGC (配列番号 311)
2 9 - 2 IgM型マウス/ヒ トキメラ抗 GPVI抗体の調製
_上記 2 9— 1で作製した発現プラスミ ドをトランスフエグシヨン試薬 （FuG ENE 6、 ロシュタィァグノスティックス） と適当量混和し、 この混合液を CO S細胞培養系に滴了し、 トランスフエクシヨンを行い、 キ^ラ抗体の一過性発現 を行った。 マウスノヒトキメラ F1232- 37— 2の IgM型 （以下、 c F 1 2 3 2— 3 7— 2 ( I gM) と略言己） 発現には重鎖発現プラスミド p TK— 2 8 2 0、 軽鎖発現 プラスミド p TK— 2 4 7 4、 および J鎖プラスミド p T 2 3 9 3との c o— t r a n s f e c t. i o nにより行い、 マウス/ヒトキメラ F1232— 43—3の IgM型 (以下、 c F 1 2 3 2— 4 3— 3 ( I gM) と略記） の発 は、 重鎖発現プラス ミド p TK— 2 8 2 2、 軽鎖発現プラスミド p TK— 25. L 4、 およぴ J鎖プラ スミド P TK2 3 9 3との c o— t r a n s f e e t i o i により行った。 トランスフエクション後に 5 % C O 2 - 95 %空気下に 3 7 °Cで 3日間培養し、 その培養上清を 60%硫酸アンモニゥムで塩析 ·濃縮後、 プ ティン Lカラム
( I mm u n o P u a: e I mmo b i l i z e d P r o t e i nレ P I E RCE) によるァフニティクロマトグラフィーにて精製した。
29-3 IgM型マクス /ヒ トキメラ抗 GPVI抗体の抗原結合活'性確認
hGPV I-hF c を固相化したィムノプレート （実施例 2他に記載の方法で 調製した） に C F 1 2 32— 37— 2 (I gM) および c F 1 232— 43— 3 (I gM) を各ゥェ /レに添加し、 37 °Cで 1時間反応させた。 0. 05%Twe e n 20を含む生理食塩水で洗浄後、 ペルォキシダーゼ標識抗ヒト μ鎖抗体 （D ΑΚΟ、 Ρ 0322) を 10%ゥサギ血清含有 D— PBSで 2000倍に希釈し 各ゥエルに 5 OjuL添カ卩した。 37でで1時間反応後、 TM IB基質により発色反 応を行い、 プレート分光光度計 (Mo l e c l a r D e v i c e s, Wa k o) で 450 nmの吸光度を測定した。 その結果、 c F 12 32— 37— 2 (I gM) およぴ cF l 2 32-43-3 (I gM) の両抗体ともに hGPV I— h F cに結合すること S確認された。
実施例 1 8の 18— 1に記載の方法により調製された力二クイザルぉよぴヒト PRPを血小板の濃度 3.75 X 108cells/mLとなるように FACSノ ッファーで希釈 した。 '希釈した PRPに上記 29-2で作製した C F 1 232— 37— 2 ( I g M) もしくは c F 1 2 32— 43— 3 (I gM) を終濃度 3ないし 4μ g/mLとなる ように添カ卩し 25°Cで 30分静置した後、 FACSパッファ一で血小;板を洗浄した。 続い て、 抗ヒト IgM- FITC (BD Biosciences Pharmingen) を添加して室温で；30分静置 した後、 FACSバッファ一で血小板を洗浄し、 フロ一サイトメ一ター CYT0MICS FC500 (BECKMA COULTER) で血小板の蛍光強度を測定した。 その結果、 c F 12 32-37- 2 (I gM) および c F 1232— 43— 3 ( I gM) の両抗体と もサルならびにヒト血小板に結合することが確認された。 実施例 30 '
抗 GPVI抗体による血小板 GPVI抗原消失誘導作用の確認 (in vitro) 実施例 1 8の 18- 1に準じた方法によりサル全血より多血小板血漿 （Platelet Rich Plasma; PRP) を調製した。 観製した PRPに ACD- A (acid-citrate- dextrose) を添加し pH6.5に調整した。 調製後、 2000rpmで遠心し血小板 沈殿さ せた後に、 血小板を HEPES Buffer (ACD- Aにより pH6.5に調整） により洗争した。 ' その後、 HEPES Buffer (pH7.4)を適当量添加し血小板を懸濁した。 Sysme^により 調製した洗浄血小板数を測定した。
洗浄血小板を 1.5 X107 PLT/tubeとなるようにマイクロチューブにとり;^け、 そこに lOmM CaCl2及び 10mM MgCl2をそれぞれ 2 μ L添カ卩し、 PBSにより 18^ Lにメ スアップした。 5.0 ig/mL Convulxin, cF1232-37- 2、 cF1249- 22- 1、 cF1249- 24 - 1、 cF1249-18-2 (各濃度 1 mg/mL) を 添加、 混合し、 室温において 1 間反応 させた。 反応後、 10mM EDTAを 10 L添カ卩し反応を停止させた後に 15000rprn、室温 で 1分間遠心し、 上清と沈殿に分離、 各画分に Sample Bufferを添カ卩し、 9S°Cにお いて 5分間熱処理を行った。 このサンプルは- 30°Cにおいて保存し、 使用 β前に解 凍し使用した。
実施例 20の方法に準じ SDS-PAGE、 Western Blottingを行い各サンプル冲の
GPVIの検出を行った。 その結果、 図 2 5に示すように Convulxin添加では、 反応 後の上清に GPVI抗原が検出され.: Tこが、 CF1232- 37- 2、 cF1249- 22- 1、 cF1249- 24- 1、 および CF1249-18 - 2添加では、 上清に GPVI抗原が検出されず、 評価した抗 GPVI抗 体でば GPVI抗原の Sheddingが起こ らなかった。 実施例 31
PEG化抗 GPVI抗体の調製と抗原結合活性
3 1 - 1 F1232— 37-2抗体の PEG{ヒ
F 1 23 2— 3 7— 2の PEGィ匕抗体を作製するために、 精製 F 1 23 2— 3 7— 2にスクシイミド基を持った 20KDの直鎖状の PEG (NEKT^R) を 反応させた。 すなわち、 精製 F 1 2 3 2— 3 7— 2を PB S (pH7. 4=) のバ ッファー中へ交換し、 抗体： PE G= l .: 1 0 (モル比） になるように 加し、 3 7°C1時間反応した。
次に P E G化抗体の精製を行つナこ。 未修飾の抗体と P E G化抗体を分維する目 的で、 PEG化処理を行った抗体を陰イオン交換カラム Q S e p h a r o s e HP (Ame r s h a m) に供しこ。 純度をアクリルアミド ル上で分析するこ とにより評価し （図 26) 、 抗体農度は B o v i n e I g G-をスタンダードに 用いた B r a d f o r d法 （B i o — Ra d) により算出しこ。
31 -2 F1232- 37 - 2Fab抗体の PEG化
F 1 232-37-2 F a b抗体の P E G化抗体を作製するために、 実施例 21の 21— 2で作製した F 123 2-37-2 F a b抗 を上記方法と同様 に PEG化を行った。
次に PEG化された F a b抗体 (^精製を S u p e r d e X 7 5 (Ame r s h am) を用いて行った。 純度をァグ リルアミドゲル上で分析することにより評価 し （図 26) 、 抗体濃度は B o V i n e I g Gをスタンダー ドに用いた B r a d f o r d法 （B i o—R a d) ίこより算出した。 31 -3 F1232- 37- 2抗体の抗原！^合活性
抗原に対する結合活性を EL I S Αにて確認した。 hGPV I- hF cを固相 化したィムノプレート （実施例 2慨に記載の方法で調製した） に F 1 232— 3 7— 2と F 1 232— 37— 2の P E G化抗体を同じ濃度に調整して各ゥエルに 添加し、 37 °Cで 1時間反応させこ。 0. 05%Twe e n 2 0を含む生理食塩 水で洗浄後、 ペルォキシダーゼ標龜抗マウスィムノグロプリン抗体 （DAKO、 P 260) を 10%ゥサギ血清含 D— PB Sで 1000倍に希釈し各ゥエルに 50 L添加した。 37°Cで 1時^反応後、 TMB基質により 色反応を行い、 プレート分光光度計 （Mo l e c u l a r De v i c e s、 "Wa k o) で 45 0 nmの吸光度を測定した。 その維果、 F 1232-37- 2 と F 1232— 3 7— 2の PEG化抗体はほぼ同等の結合活性を有していること： 確認された （図 27) 0 実施例 32
抗 GP抗体のレパトァ遺伝子解折 実施例 9および実施例 1 5に記載の抗 GPVモノグローナル抗体の配列は数種類 の一定の抗体遺伝子に由来すると考えられ、 ヒ ト GPVIのループ 9を認識する 体 のレパートァ選択に特徴のあることが認められた。 抗体遺伝子は germ- line抗 f本 遺伝子セグメント （重鎖の H、 D及び J、 ならびに、 軽鎖の V及び J) の糸且合せによ つて構成され、 さらに多く の場合、 体細胞変異を伴って形成される
(Immunoglobulin Genes 2nd eds. T. honjo and F. W. Alt, Academic Press 1995等参照） 。 そこで、 これらの抗体の重鎖可変領域の核酸塩基配列および 鎖 可変領域の核酸塩基配列をクエリー配列として、 NCBI (National Center for Biotechnology Information)の Ig germ-line Vifc伝子のテータベースを 象 して Ig- BLASTサーチ （http：〃 www. ncbi. nlm. nih. gov/igblast/) を行った。 tの 結果、 表 1 6に示したよう に、 各抗体の可変領域核酸塩基配列は、 それぞれ待定 のマウス germ - 1 ine抗体重鎖遺伝子 Hセグメント、 Dセグメント及び Jセグメン卜
(VH、 DH及ぴ J Hセグメ ント） 、 ならびに抗体輕鎖遺伝子 Vセグメントおよび J セグメント （V L及び J L) と高い一致率 （Identi ty0/*) を示した。 。 なお、 表 1 6には、 各クローンに对してスコアの高い順に セグメントを 3つまで記敏し た。 それらの 、ずれかが备抗体遺伝子の由来する germ- 1 ine抗体遺伝子を構成" T るセグメントであると推定されるが、 これらの内、 各クローンについては最_^段 に示した各セグメントの糸且合せで構成された遺伝 に由来している可能性が最も 高いと考えられる。 産業上の利用可能十生
本発明の抗体は、 特に、 ヒトの疾患、 例えば、 Jtk小板の活性化もしくは凝集、 または血管内皮障害もしく は動脈硬化性の反応によって引き起こされる疾病 o予 防及び/または治療に有効であり、 血栓もしくは塞栓に起因する疾患、 例え fま、 血栓症、 塞栓症または動脈硬化性の疾患等の予防及び Zまたは治療に利用す 5こ とができる。 また、 本 眄の抗体を用いた被験試料中の G P V Iを検出する； 法 により、 疾患の診断を行う ことができる。 特に、 tトの疾患、 例えば、 血栓' fe、 塞栓性または動脈硬化性の疾患の診断に利用することができる。 W 200
1 6
Figure imgf000097_0001
箬簦 え用 S (規則 26) 96/1
(続き)
Figure imgf000098_0001
鎏簪 え用紙 (mm) 96/2 (続き）
Figure imgf000099_0001

Claims

97 請求の範囲
1 . 以下の性質を有する抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体； a ) ヒ ト血小板膜糠蛋白質 VI (GPVI) と特異的に結合し、
b ) 血小板を活性ィ匕させる作用、 及ぴ Zまたは、 生体内における血小板減少を惹 起する作用が弱く、 及び、
c ) 血小板と接触させることにより血小板膜上の GPVIを少なくとも部分的に消失 させる。
2 . 血小板 GPVIの sheddingを介さずに、 血小板と接触させることにより血小板 膜上の GPVIを少なく とも部分的に消失させる抗体もしくはその活性断片またはそ れらの誘導体。
3 . 生体内におレゝて血小板と接触させることにより血小板膜上の GPVIを少なく とも部分的に消失させる、 請求項 1の抗体もしくはその活性断片またはそれらの 誘導体。
4 . 生体内に投 して血小板と接触させることにより血小板カ コラーゲンに応 答して凝集する能力を低下もしくは欠如させる、 請求項 1また^: 2の抗体もしく はその活性断片まャ Z はそれらの誘導体。
5 . 出血時間延長作用の弱い、 （1 ) ないし （3 ) の抗体も" Uくはその活性断 片またはそれらの ft導体。
6 . GPVIとの解離定数が 4 X 1 0 - 8M以下である、 請求項 1 いし 5の抗体も しくはその活性断 またはそれらの誘導体。
7 . ヒト GPVIドメイン 1のループ 2、 ループ 3とループ 5、 しくはループ 4 とループ 5、 また【ま、 ドメイン 2のループ 9、 もしくはループ 9とループ 1 1の 少なくとも一部分を含むアミノ酸配列または GPVI上の構造を特異的に認識する抗 体もしくはその活'1¾断片またはそれらの誘導体。
8 . ヒト GPVIド イン 1のループ 2、 ループ 3とループ 5、 しくはノレープ 4 とループ 5、 また fま、 ドメイン 2のループ 9、 もしくはループ 9とループ 1 1の 少なくとも一部分力 ループ 2の E 2 1、 K 2 2および P 2 3、 ノレ プ 3の G 3 3 とループ 5の A 5 ァ、 K 5 9および L 6 2、 もしくはノレープ 4 S 4 3、 S 4 4 98
S 4 5、 R 4 6および E 4 8 とループ 5の A 5 7、 K 5 9および L 6 2 、 または、 ループ 9の T 1 1 6、 R l l 7、 G i l 9および Q 1 2 2、 もしくは Λ ^—プ 9の T 1 1 6、 R 1 1 7、 G i l 9および Q 1 2 2とループ 1 1の R 1 3 9 である、 請求項 7の抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体。
9 . ヒ ト GPVIドメイン 1のループ 2、 ノレープ 3とループ 5、 もしく ^ ^ループ 4 とループ 5、 または、 ドメイ ン 2のループ 9、 もしくはループ 9とループ 1 1と 特異的に結合する.、 請求項 7または 8の抗体もしくはその活性断片ま はそれら の誘導体。
1 0 · ヒト GPVIドメイン 1 のループ 2、 ノレープ 3とループ 5、 もしく はループ 4とノレープ 5、 または、 ドメイン 2のループ 9、 もしくはループ 9とノ I ^一プ 1 1 の少なくとも一部を含むァミ ノ酸配列または GPVI上の構造を認識する、 請求項 1 ないし 6の抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体。
1 1 . 配列番号 15、 16及ぴ 17のアミノ酸配列、 配列番号 18、 19及び 20のァミノ 酸配列、 配列番号 21、 22及び 23、 配列番号 24、 25及ぴ 26、 配列番号 27、 28及び 29、 配列番号 30、 31及ぴ 32、 配歹 U番号 33、 34及び 35、 配列番号 36、 37及ぴ 38、 配列番 号 39、 40及び 41、 配列番号 42、 43及ぴ 44、 配列番号 45、 46及び 47、 まこは、 配列 番号 48、 49及ぴ 50のアミノ酸配列を、 それぞれ VH CDR1、 VH CDR2及ぴ VH CDR3に 有する抗体の重鎖もしくはその活性断片。
1 2 . 配列番号 51、 52及ぴ 53のアミノ酸配列、 配列番号 54、 55及び 56のァミノ 酸配列、 配列番号 57、 58及び 59、 配列番号 60、 61及ぴ 62、 配列番号 63、 64及び 65、 配列番号 66、 67及ぴ 68、 配歹 fj番号 69、 70及ぴ 71、 配列番号 72、 73及ぴ 74、 配列番 号 75、 76及ぴ 77、 配列番号 78、 79及ぴ 80、 配列番号 81、 82及ぴ 83、 ま fciは、 配列 番号 84、 85及ぴ 86のアミノ酸配列を、 それぞれ VL CDR1、 VL CDR2及ぴ VIL CDR3に 有する抗体の軽鎖もしくはその活性断片またはそれらの誘導体。
1 3 . 配列番号 15、 16、 17、 51、 52及ぴ 53のアミノ酸配列、 配列番号 18、 19、 20、 54、 55及び 56のアミノ酸配列、 配列番号 21、 22、 23、 57、 58及ぴ 59のァミノ 酸配列、 配列番号 24、 25、 26、 60、 61及ぴ 62のアミノ酸配列、 配列番号27、 28、 29、 63、 64及ぴ 65のアミノ酸配列、 配列番号 30、 31、 32、 66、 67及ぴ 6Sのァミノ 酸配列、 配列番号 33、 34、 35、 69、 70及ぴ 71のアミノ酸配列、 配列番号 36、 37、 99
38、 72、 73及ぴ 74のアミノ酸配列、 配列番号 39、 40、 41、 75、 76及ぴ 77のァミノ 酸配列、 配列番号 42、 43、 44、 78、 79及ぴ 80のアミノ酸配列、 酉己列番号 45、 46、 47、 81、 82及ぴ 83のアミノ酸配列、 または、 配列番号 48、 49、 50、 84、 85及び 86 のアミノ酸配列をそれぞれ VH CDR1、 VH CDR2、 VH CDR3、 VL CDR1、 VL CDR2及ぴ' VL CDR3にそれぞれ有する抗体もしくはその活性断片またはそれらの誘導体。
1 4 . 請求項 1ないし 1 3の抗体もしくはその活性断片また ίまそれらの誘導体 を産生する細胞。 .
1 5 . 請求項 1ないし 1 3の抗体もしくはその活性断片また ίまそれらの誘導体 の Η鎖及び/または L鎖をコードする塩基配列を含有するポリ クレオチド。
1 6 . 表 1 6に記載されたマウス germ- line抗体遺伝子セグメント VH、 D H及 び J Hの何れかの組合せを含有する抗体重鎖遺伝子に由来する、 ヒ ト GPVI抗体 遺伝子又はその重鎖可変領域遺伝子。
1 7 . 前記抗体重鎖可変慎域遺伝子の CDRァミノ酸配列をコー ドするヌクレオ チド配列を含有する抗ヒト GPVI抗体遺伝子又はその重鎖可変領威遺伝子。
1 8 . 表 1 6に記載され マウス germ- line抗体遺伝子セグメ ント V L及び J L の何れかの組合せを含有する抗体軽鎖遺伝子に由来する、 抗ヒ卜 GPVI抗体遺伝子 又はその軽鎖可変領域遺伝子。 .
1 9 . 前記抗体軽鎖可変偵域遺伝子の CDRァミノ酸配列をコー ドするヌクレオ チド配列を含有する抗ヒト GFVI抗体遺伝子又はその軽鎖可変領威遺伝子。
2 0 . 請求項 1 · 6〜 1 7の抗体遺伝子又はその重鎖可変領域遺伝子にコードさ れる抗ヒト GPVI抗体又はその重鎖可変領域ポリぺプチド。
2 1 . 請求項 1 8〜： L 9の抗体遺伝子又はその軽鎖可変領域遣伝子にコードさ れる抗ヒト GPVI抗体又はその軽鎖可変領域ポリぺプチド。
2 2 . ポリエチレングリ コール （P E G) ィ匕された請求項 1ないし 1 3及び請 求項 2 0または 2 1の抗体もしくはその活性断片またはそれら 誘導体。
2 3 . 請求項 1 4の細胞または請求項 1 5のポリヌクレオチドを用いることを 特徴とする、 抗体もしくはその活性断 またはそれらの誘導体の製造方法。
2 4 . 請求項 1ないし 1 3の抗体もしくはその活性断片また ί それらの誘導体 を有効成分として含有する医薬組成物。 100
2 5 . ヒ ト GPVIドメイン 1のノレープ 2、 ノレープ 3とループ 5、 もしくはループ 4 とループ 5、 または、 ドメイン 2のループ 9、 もしくはルー 7" 9とループ 1 1 を含有するぺプチド。
2 6 . ヒ ト GPVIドメイン 1のループ 2、 ループ 3とループ 5、 'もしくはループ 4 とループ 5、 または、 ドメイン 2のループ 9、 もしくはルー 9とループ 1 1 らなるペプチド。
2 7 . 配列番号 135、 136、 137、 138または 139のアミノ酸配列を含有するポリ ぺプチド。
2 8 . 以下の工程を含む、 抗体もしくはその活性断片または れらの誘導体の スクリーニング方法；
a ) ヒ ト血小板膜糖蛋白質 VI (GPVI) との結合性を測定するェ稳、
b ) 血小板を活性化させる作用、 及び Zまたは、 生体内におけ ζ>血小板減少を惹 起する作用を測定する工程、 及び、
c ) 血小板と接触させることにより血小板膜上の GPVIを少なく とも部分的に消失 させる活性を測定する工程。
2 9 . 請求項 1 6のぺプチドまたは請求項 1 7のポリぺプチ をとの反応性を 浪 定する工程を含む、 抗体の認識領域の同定方法。
3 0 . 請求項 1 6のペプチドまたは請求項 1 7のポリぺプチ を用いることを 特徴とする、 抗体の製造方法
PCT/JP2006/301818 2005-04-28 2006-01-27 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体 Ceased WO2006117910A1 (ja)

Priority Applications (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/816,233 US20090041783A1 (en) 2005-04-28 2006-01-27 Anti-platelet membrane glycoprotein vi monoclonal antibody
PCT/JP2006/309431 WO2006118350A1 (ja) 2005-04-28 2006-04-28 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体
JP2007514878A JP4185555B2 (ja) 2005-04-28 2006-04-28 抗血小板膜糖蛋白質ｖｉモノクローナル抗体
CN2006800230882A CN101253264B (zh) 2005-04-28 2006-04-28 抗血小板膜糖蛋白ⅵ单克隆抗体
CN2012102783100A CN102875679A (zh) 2005-04-28 2006-04-28 抗血小板膜糖蛋白vi单克隆抗体
CA002606450A CA2606450A1 (en) 2005-04-28 2006-04-28 Anti-platelet membrane glycoprotein vi monoclonal antibody
EP06746241A EP1876240B1 (en) 2005-04-28 2006-04-28 Anti-human platelet membrane glycoprotein vi monoclonal antibody
US11/912,757 US7977461B2 (en) 2005-04-28 2006-04-28 Anti-platelet membrane glycoprotein VI monoclonal antibody
EP11160861A EP2363416A3 (en) 2005-04-28 2006-04-28 Anti-platelet membrane glycoprotein VI monoclonal antibody
JP2007078649A JP5224707B2 (ja) 2005-04-28 2007-03-26 抗血小板膜糖蛋白質ｖｉモノクローナル抗体
US13/095,098 US8389692B2 (en) 2005-04-28 2011-04-27 Anti-platelet membrane glycoprotein VI monoclonal antibody
US13/721,547 US8524870B2 (en) 2005-04-28 2012-12-20 Anti-platelet membrane glycoprotein VI monoclonal antibody
US13/949,515 US20140044723A1 (en) 2005-04-28 2013-07-24 Anti-platelet membrane glycoprotein vi monoclonal antibody

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005132665 2005-04-28
JP2005-132665 2005-04-28
JP2005348534 2005-12-01
JP2005-348534 2005-12-01

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/309431 Continuation WO2006118350A1 (ja) 2005-04-28 2006-04-28 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体
US91275708A Continuation 2005-04-28 2008-11-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006117910A1 true WO2006117910A1 (ja) 2006-11-09

Family

ID=37307716

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/301818 Ceased WO2006117910A1 (ja) 2005-04-28 2006-01-27 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体

Country Status (5)

Country Link
US (5) US20090041783A1 (ja)
EP (1) EP2363416A3 (ja)
JP (1) JP4185555B2 (ja)
CN (2) CN101253264B (ja)
WO (1) WO2006117910A1 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007091719A1 (ja) * 2006-02-07 2007-08-16 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 抗gpvi抗体の併用療法及び新規医薬用途
WO2010005068A1 (ja) * 2008-07-10 2010-01-14 東レ株式会社 癌の治療及び予防用医薬組成物
WO2009142738A3 (en) * 2008-05-21 2010-03-18 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
JP2010512152A (ja) * 2006-12-07 2010-04-22 ノバルティス アーゲー ＥｐｈＢ３に対するアンタゴニスト抗体
WO2012032766A1 (ja) 2010-09-07 2012-03-15 持田製薬株式会社 血中可溶型ｇｐｖｉを用いたアルツハイマー病の診断方法
CN118043349A (zh) * 2021-06-11 2024-05-14 丰华生物有限公司 一种人源化抗人GPVI单克隆抗体Fab片段及其应用
WO2024189203A1 (en) 2023-03-16 2024-09-19 Emfret Analytics Gmbh & Co. Kg Anti-gpvi antibodies and functional fragments thereof

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006117910A1 (ja) 2005-04-28 2006-11-09 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体
US8323905B2 (en) * 2006-03-31 2012-12-04 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Methods of detection GPVI
EP2164972B1 (en) 2007-06-29 2011-11-30 F. Hoffmann-La Roche AG Promoter
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
WO2009062050A2 (en) 2007-11-08 2009-05-14 Neogenix Oncology, Inc. Recombinant monoclonal antibodies and corresponding antigens for colon and pancreatic cancers
MY159837A (en) 2009-08-29 2017-02-15 Abbvie Inc Therapeutic dll4 binding proteins
AU2010289677B2 (en) 2009-09-03 2014-07-31 Merck Sharp & Dohme Llc Anti-GITR antibodies
WO2011063237A2 (en) 2009-11-19 2011-05-26 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Jagged-binding agents and uses thereof
TW201132759A (en) * 2009-12-18 2011-10-01 Sanofi Aventis Novel antagonist antibodies and their FaB fragments against GPVI and uses thereof
EP2397495A1 (en) * 2010-06-21 2011-12-21 Sanofi Novel antagonist antibodies and their Fab fragments against GPVI and uses thereof
EP2336188A1 (en) * 2009-12-18 2011-06-22 Sanofi-Aventis Novel antagonist antibodies and their Fab fragments against GPVI and uses thereof
SG183872A1 (en) * 2010-03-02 2012-11-29 Abbvie Inc Therapeutic dll4 binding proteins
AU2011226672B2 (en) 2010-03-12 2015-07-23 Immunogen, Inc. CD37-binding molecules and immunoconjugates thereof
US20140206849A1 (en) * 2010-04-30 2014-07-24 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Antibodies having reduced immunogenicity in a human
NZ608318A (en) 2010-09-02 2015-03-27 Vaccinex Inc Anti-cxcl13 antibodies and methods of using the same
CA2813796C (en) * 2010-10-18 2019-01-15 Mediapharma S.R.L. Erbb3 binding antibody
CN109700763A (zh) 2011-01-26 2019-05-03 阿勒根公司 用于治疗眼科病症的雄性激素组合物
US20130344074A1 (en) 2011-03-16 2013-12-26 Sanofi Uses of a dual v region antibody-like protein
SG193447A1 (en) 2011-04-01 2013-10-30 Immunogen Inc Cd37-binding molecules and immunoconjugates thereof
WO2013006490A2 (en) * 2011-07-01 2013-01-10 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to tim3
US9890213B2 (en) 2012-03-02 2018-02-13 Vaccinex, Inc. Methods for the treatment of B cell-mediated inflammatory diseases
AU2013232087B2 (en) 2012-03-15 2018-02-08 Janssen Biotech, Inc. Human anti-CD27 antibodies, methods and uses
JP2016509582A (ja) * 2012-12-19 2016-03-31 アンプリミューン， インコーポレイテッド 抗ヒトｂ７−ｈ４抗体およびその使用
EP2951204B1 (en) 2013-01-31 2019-05-22 Vaccinex, Inc. Methods for increasing immunoglobulin a levels
US10081678B2 (en) 2013-02-04 2018-09-25 Emory University Specific binding antibodies of glycoprotein IB alpha as selective ectodomain shedding inhibitors
EP3381940B1 (en) 2013-07-29 2022-09-07 Samsung Electronics Co., Ltd. Anti-ang2 antibody
CN103396492A (zh) * 2013-08-06 2013-11-20 安徽新标志科技有限公司 抗人血小板胶原蛋白受体的人源性单克隆抗体片段及其应用
US20160264684A1 (en) * 2013-10-10 2016-09-15 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
KR102349370B1 (ko) 2014-05-26 2022-01-10 삼성전자주식회사 인간화 또는 친화도 성숙된 항 앤지오포이에틴-2 항체 및 그의 용도
WO2015200073A1 (en) * 2014-06-23 2015-12-30 Bionomics, Inc. Antibodies that bind lgr4
WO2016073860A1 (en) * 2014-11-06 2016-05-12 Medimmune, Llc Binding molecules specific for staphylococcus protein a and uses thereof
US9879087B2 (en) 2014-11-12 2018-01-30 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
ES2941897T3 (es) 2014-11-12 2023-05-26 Seagen Inc Compuestos que interaccionan con glicanos y procedimientos de uso
CA2977544C (en) 2015-03-06 2023-12-19 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Anti-lilrb antibodies and their use in detecting and treating cancer
CN107530429B (zh) * 2015-03-30 2021-12-07 斯特库比股份有限公司 特异性针对糖基化的pd-l1的抗体及其使用方法
US11933786B2 (en) 2015-03-30 2024-03-19 Stcube, Inc. Antibodies specific to glycosylated PD-L1 and methods of use thereof
BR112017026027A2 (pt) 2015-06-08 2018-08-14 Debiopharm Int Sa combinações de imunoconjugado anti-cd37 e anticorpo anti-cd20
EP4091628A1 (en) 2015-08-05 2022-11-23 Acticor Biotech Novel anti-human gpvi antibodies and uses thereof
CN108699144B (zh) * 2015-08-28 2022-07-19 德彪发姆国际有限公司 用于检测cd37的抗体和测定
SG11201803213XA (en) 2015-11-12 2018-05-30 Siamab Therapeutics Inc Glycan-interacting compounds and methods of use
KR102809728B1 (ko) 2015-12-02 2025-05-21 주식회사 에스티큐브 글리코실화된 pd-1에 대해 특이적인 항체 및 이의 사용 방법
CN109069628A (zh) * 2016-01-14 2018-12-21 Bps生物科学有限公司 抗pd-1抗体及其用途
WO2017160587A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Abeome Corporation Neutralizing monoclonal antibodies to il-25 and uses thereof
EP3432927A4 (en) 2016-03-24 2019-11-20 Gensun Biopharma Inc. TRIPLE-SPECIFIC INHIBITORS FOR CANCER TREATMENT
MX2018011939A (es) 2016-03-29 2019-05-20 Stcube Inc Anticuerpos de funcion doble especificos para pd-l1 glicosilada y metodos de uso de los mismos.
CN109071636A (zh) 2016-03-29 2018-12-21 斯特库比股份有限公司 用于选择特异性结合糖基化免疫检查点蛋白的抗体的方法
CN109715666B (zh) 2016-07-20 2023-02-21 斯特库比股份有限公司 癌症治疗方法和使用结合糖基化pd-l1的抗体的组合的疗法
US11278629B2 (en) 2016-11-02 2022-03-22 Debiopharm International, S.A. Methods for improving anti-CD37 immunoconjugate therapy
EP3541847A4 (en) 2016-11-17 2020-07-08 Seattle Genetics, Inc. COMPOUNDS INTERACTING WITH GLYCANE AND METHODS OF USE
EP3544628A4 (en) 2016-11-23 2020-11-18 Immunoah Therapeutics, Inc. 4-1BB BINDING PROTEINS AND THEIR USES
CN109071656B (zh) 2017-01-05 2021-05-18 璟尚生物制药公司 检查点调节物拮抗剂
AU2018214222C1 (en) 2017-02-03 2021-08-05 Acticor Biotech Inhibition of platelet aggregation using anti-human GPVI antibodies
JP2020510671A (ja) 2017-03-03 2020-04-09 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド グリカン相互作用化合物および使用の方法
CN109810193B (zh) * 2017-11-21 2020-11-03 深圳市中科艾深医药有限公司 抗dr5的抗体及其制备方法和应用
CN110003332B (zh) * 2018-01-05 2021-05-11 上海原能细胞医学技术有限公司 Cd137抗体及其应用
MX2020010094A (es) 2018-04-06 2021-01-15 Dana Farber Cancer Inst Inc Kir3dl3 como receptor de hhla2, anticuerpos anti-hhla2 y usos de estos.
EP3774898A4 (en) * 2018-04-13 2022-01-26 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Anti-cd27 antibodies and use thereof
IL278323B2 (en) * 2018-05-16 2025-05-01 Morphosys Ag Antibodies directed against glycoprotein IV
JP2021525735A (ja) 2018-05-30 2021-09-27 デビオファーム インターナショナル， エス． アー． 抗ｃｄ３７免疫コンジュゲート投薬レジメン
EP3813864A4 (en) 2018-06-29 2022-07-20 Gensun Biopharma Inc. Antitumor antagonists
WO2020102779A1 (en) * 2018-11-16 2020-05-22 Albert Einstein College Of Medicine MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST IgV DOMAIN OF B7-H3 AND USES THEREOF
CN109988770B (zh) * 2019-01-10 2022-11-22 中国人民解放军第四军医大学 一种c-di-AMP合成酶单克隆抗体的重链和轻链可变区基因和编码的多肽及其应用
CN113784984A (zh) * 2019-03-04 2021-12-10 齐鲁普吉湾生物治疗公司 抗SIRPα抗体
WO2020263312A1 (en) 2019-06-28 2020-12-30 Gensun Biopharma, Inc. ANTITUMOR ANTAGONIST CONSISTING OF A MUTATED TGFβ1 - RII EXTRACELLULAR DOMAIN AND AN IMMUNOGLOBULIN SCAFFOLD
CN110951866A (zh) * 2019-12-27 2020-04-03 河南中医药大学 一种检测gpvi基因启动子区甲基化水平的引物及其检测方法
WO2021225954A1 (en) * 2020-05-04 2021-11-11 The Regents Of The University Of California Inhibiting anti-enpp1 antibodies
CN113303285B (zh) * 2021-07-29 2021-11-23 澎立生物医药技术（上海）有限公司 一种血小板特异抗原诱导猴itp模型的构建方法
KR20240114678A (ko) * 2023-01-16 2024-07-24 주식회사 드노보 바이오테라퓨틱스 신규한 항-NKp46 항체 및 이의 용도
CN120485126B (zh) * 2025-07-18 2025-10-10 中国农业科学院生物技术研究所 一种耐除草剂蛋白杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0100810A3 (de) 1982-07-15 1985-01-23 IGM - Industriegeräte- und Maschinenfabriks-gesellschaft mbH Untersetzungsgetriebe
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
CZ303703B6 (cs) 1998-12-23 2013-03-20 Pfizer Inc. Monoklonální protilátka nebo její antigen-vázající fragment, farmaceutická kompozice obsahující tuto protilátku nebo fragment, bunecná linie produkující tuto protilátku nebo fragment, zpusob prípravy této protilátky, izolovaná nukleová kyselina kóduj
HUP0201049A2 (hu) 1999-05-07 2002-07-29 Merck Patent Gmbh. Rekombináns vérlemezke Glikoprotein-VI kollagénreceptor és gyógyászati alkalmazása
US7291714B1 (en) 1999-06-30 2007-11-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Glycoprotein VI and uses thereof
US20040001826A1 (en) 1999-06-30 2004-01-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Glycoprotein VI and uses thereof
AU7097400A (en) 1999-09-01 2001-03-26 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Platelet membrane glycoprotein vi (gpvi) dna and protein sequences, and uses thereof
DE10045592A1 (de) 2000-09-15 2002-03-28 Klaus Pfizenmaier Ein Antikörper-TNF-TNF Inhibitor Fusionsprotein (TNF-Selektokin) als zielspezifisches Prozytokin zur Tumortherapie
JP3797974B2 (ja) 2000-11-17 2006-07-19 ヘマテック，エルエルシー クローン化トランスジェニック有蹄動物における異種（ヒト）免疫グロブリンの発現
IL155977A0 (en) 2000-11-30 2003-12-23 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
WO2002057800A1 (es) 2001-01-22 2002-07-25 Sociedad Anónima De Instalaciones De Control Veleta y anemómetro de flexión
EP1224942A1 (en) 2001-01-23 2002-07-24 Bernhard Dr. Nieswandt Use of JAQ1 (monoclonal antibody anti GPVI) as a medicament for the protection against thrombotic diseases
JP2005511005A (ja) 2001-07-18 2005-04-28 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 糖タンパク質ｖｉ融合タンパク質
KR100453877B1 (ko) 2001-07-26 2004-10-20 메덱스젠 주식회사 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체
KR20100120246A (ko) 2001-11-14 2010-11-12 센토코 오르토 바이오테크 인코포레이티드 항 ｉｌ-6 항체, 조성물, 방법 및 용도
GB0130543D0 (en) * 2001-12-20 2002-02-06 Univ Cambridge Tech Human antibodies and their use
EP1538165A1 (en) * 2003-12-03 2005-06-08 Procorde GmbH Inhibitors of glycoprotein VI based on monoclonal antibody hgp 5c4
EP1369128A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-10 Procorde GmbH Inhibitors of glycoprotein VI and their therapeutic use
CA2502552C (en) 2002-10-17 2019-02-12 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
KR100999316B1 (ko) 2003-06-09 2010-12-10 와이어쓰 엘엘씨 ｃＤＮＡ로부터의 비분절 네가티브 쇄 ＲＮＡ 바이러스의회수를 위한 개선된 방법
WO2005007800A2 (ja) * 2003-07-18 2005-01-27 Mochida Pharm Co Ltd 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体
US7348001B2 (en) 2003-08-12 2008-03-25 Dyax Corp. Tie1-binding ligands
JP4639648B2 (ja) 2004-06-03 2011-02-23 富士電機システムズ株式会社 インバータ装置
WO2006117910A1 (ja) * 2005-04-28 2006-11-09 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体
KR20090079043A (ko) 2008-01-16 2009-07-21 삼성전자주식회사 제빙유닛 및 이를 갖춘 냉장고

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GARDINER E.E. ET AL.: "Regulation of platelet membrane levels of glycoprotein VI by a platelet-derived metalloproteinase", BLOOD, vol. 104, no. 12, 2004, pages 3611 - 3617, XP002999997 *
LECUT C. ET AL.: "Identification of residues within human glycoprotein VI involved in the binding to collagen", J. BIOL. CHEM., vol. 279, no. 50, 2004, pages 52293 - 52299, XP002399837 *
STEPHENS G. ET AL.: "Platelet activation induces metalloproteinase-dependent GP VI cleavage to down-regulate platelet reactivity to collagen", BLOOD, vol. 105, no. 1, January 2005 (2005-01-01), pages 186 - 191, XP002999996 *
TAKAYAMA H.: "Ko Kesshoban Ryoho", KESSEN TO JUNKAN, vol. 13, no. 1, 10 March 2005 (2005-03-10), pages 56 - 59, XP003004738 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007091719A1 (ja) * 2006-02-07 2007-08-16 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 抗gpvi抗体の併用療法及び新規医薬用途
JP2010512152A (ja) * 2006-12-07 2010-04-22 ノバルティス アーゲー ＥｐｈＢ３に対するアンタゴニスト抗体
US8455623B2 (en) 2008-05-21 2013-06-04 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
WO2009142738A3 (en) * 2008-05-21 2010-03-18 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
AU2009270181B2 (en) * 2008-07-10 2014-05-29 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and prevention of cancer
WO2010005068A1 (ja) * 2008-07-10 2010-01-14 東レ株式会社 癌の治療及び予防用医薬組成物
JP5573156B2 (ja) * 2008-07-10 2014-08-20 東レ株式会社 癌の治療及び予防用医薬組成物
RU2533460C2 (ru) * 2008-07-10 2014-11-20 Торэй Индастриз, Инк. Фармацевтическая композиция для лечения и предупреждения рака
CN102089004B (zh) * 2008-07-10 2018-06-01 东丽株式会社 癌的治疗及预防用药物组合物
US10611835B2 (en) 2008-07-10 2020-04-07 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and prevention of cancer
US11993650B2 (en) 2008-07-10 2024-05-28 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and prevention of cancer
WO2012032766A1 (ja) 2010-09-07 2012-03-15 持田製薬株式会社 血中可溶型ｇｐｖｉを用いたアルツハイマー病の診断方法
CN118043349A (zh) * 2021-06-11 2024-05-14 丰华生物有限公司 一种人源化抗人GPVI单克隆抗体Fab片段及其应用
WO2024189203A1 (en) 2023-03-16 2024-09-19 Emfret Analytics Gmbh & Co. Kg Anti-gpvi antibodies and functional fragments thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20140044723A1 (en) 2014-02-13
US20110217318A1 (en) 2011-09-08
CN101253264B (zh) 2012-09-26
US8389692B2 (en) 2013-03-05
US20130095120A1 (en) 2013-04-18
JPWO2006118350A1 (ja) 2008-12-18
CN101253264A (zh) 2008-08-27
EP2363416A2 (en) 2011-09-07
US20090092612A1 (en) 2009-04-09
JP4185555B2 (ja) 2008-11-26
US20090041783A1 (en) 2009-02-12
CN102875679A (zh) 2013-01-16
EP2363416A3 (en) 2012-04-11
US7977461B2 (en) 2011-07-12
US8524870B2 (en) 2013-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2006117910A1 (ja) 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体
JP6684369B2 (ja) 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）に対する最適化されたモノクローナル抗体
JP2022137092A (ja) 治療的低密度リポタンパク質関連タンパク質６（ｌｒｐ６）抗体の組成物および使用方法
KR101692085B1 (ko) 조직 인자 경로 억제제 (ｔｆｐｉ)에 대한 모노클로날 항체
JP2019059749A (ja) 代謝障害を治療するための方法
EP1647596A2 (en) Monoclonal antibody against platelet membrane glycoprotein vi
US20160297892A1 (en) Novel Methods and Antibodies for Treating Coagulapathy
KR20140019375A (ko) 인간 조직 인자 항체 및 이의 용도
EP1876240B1 (en) Anti-human platelet membrane glycoprotein vi monoclonal antibody
AU2021202612B2 (en) Inhibition of platelet aggregation using anti-human GPVI antibodies
CN115925935A (zh) 抗人gpvi抗体及其用途
US11542329B2 (en) Antibodies targeting Glycoprotein VI
RU2741802C2 (ru) АНТИТЕЛО К Myl9
KR20250096769A (ko) 글리피칸-3에 대한 이중특이성 항체 및 이의 용도
JP5224707B2 (ja) 抗血小板膜糖蛋白質ｖｉモノクローナル抗体
JP2014520765A (ja) フィコリン−３の治療標的
CN121175339A (zh) 抗fxi抗体及其用途
TW202409089A (zh) １型大麻素受體結合蛋白及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11816233

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: RU

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06712961

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1