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WO2006112400A1 - 癌の転移性及び浸潤能の検査方法 - Google Patents

癌の転移性及び浸潤能の検査方法 Download PDF

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WO2006112400A1
WO2006112400A1 PCT/JP2006/307949 JP2006307949W WO2006112400A1 WO 2006112400 A1 WO2006112400 A1 WO 2006112400A1 JP 2006307949 W JP2006307949 W JP 2006307949W WO 2006112400 A1 WO2006112400 A1 WO 2006112400A1
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cancer
expression
protein
cell
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Masatoshi Kitagawa
Yun Gao
Kyoko Kitagawa
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Hamamatsu University School of Medicine NUC
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    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH

Definitions

  • the present invention relates to a method for examining cancer, particularly cancer with a poor prognosis, and more particularly, a gene involved in metastatic invasive ability in cells and tissues of a patient suspected of having cancer, particularly with a poor prognosis.
  • the present invention relates to a method for examining metastasis and invasiveness of cancer by examining the expression of. Background art
  • GPR48 which was found by the present inventors to be associated with cancer with poor prognosis and metastasis invasion of cancer cells, is a G protein binding containing a leucine-rich repeat belonging to a superfamily of proteins having 7-pass domains. Force known to be a receptor The function was unknown (Non-Patent Documents 4 and 5).
  • Non-Patent Document 1 Nature Medicine 1997 Feb; 3 (2): 222-5.
  • Non-Patent Document 2 Nature Medicine 1997 Feb; 3 (2): 227_30.
  • Non Patent Literature 3 Nature Medicine 1997 Feb; 3 (2): 231_4
  • Non-Patent Document 4 Mol Endocrinol. 2004 Sep; 18 (9): 2241-54. Epub 2004 Jun 10.
  • Non-Patent Document 5 Mol Endocrinol. 1998 Dec; 12 (12): 1830-45.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 To elucidate the cause, we analyzed the gene expression caused by the decreased expression of p27 Kipl , and elucidated the cause of the poor prognosis.
  • the present invention provides a method for screening cancer, particularly cancer with poor prognosis.
  • the present inventors created a model in which the expression level of p27 Kipl was reduced, and analyzed the fluctuating gene using a microarray. That is, a cell (HCT-hp27-hKO) in which the p27 Kipl gene of the human colorectal cancer cell line HCT116 was knocked out by gene targeting method was created, and it was confirmed that the expression level of p27 Kipl was reduced. did. Genes whose expression was changed in HCT-hp27-hKO compared to the parent strain HCT116 were analyzed using a microarray. As a result, it was revealed that the expression of the G protein-coupled receptor GPR48 gene (AF25 7182) was significantly increased in HCT-hp27-hKO.
  • GPR48 has a function of enhancing the invasion ability of cancer cells, and have completed the present invention.
  • the present invention is a method for detecting cancer metastasis comprising detecting the expression of G protein-coupled receptor GPR48 in a cell or tissue to be examined. Is a method for examining the invasion ability of cancer, comprising detecting the expression of GPR48 in the tissue.
  • the present invention uses GRT48 expression levels in cancer tissue samples of cancer patients by quantitative RT-PCR or immunohistochemical methods such as immunohistochemical staining using enzyme-immunoantibody methods such as anti-GPR48 antibodies. It is a method of diagnosing the possibility.
  • the present invention detects the expression of GPR48 based on the finding that the G protein-coupled receptor GPR48 has a function of promoting the invasive ability of cancer cells and serves as an indicator of cancer invasive metastasis. This is a screening method for metastasis and invasion ability of cancer.
  • the cancer to be examined may be any cancer, for example, colon cancer, breast cancer, stomach cancer, lung cancer, biliary tract cancer (bile duct cancer, gallbladder cancer), knee cancer, esophageal cancer, hepatocellular carcinoma, laryngeal cancer, pharyngeal cancer. , Thyroid cancer, uterine cancer, ovarian cancer, renal cell cancer, prostate cancer, bladder cancer, malignant melanoma, brain tumor, etc. It is done.
  • the cell or tissue to be examined is also a biopsy sample from a suspected cancer patient or a patient suspected of cancer by a surgical technique, preferably a cell or tissue collected from a subject. More preferably, it is a cell or tissue.
  • the method for detecting the expression of GPR48 is not particularly limited, but includes antigen-antibody reaction, RT-PCR, cDNA microarray, Northern blotting, mass spectrometry analysis, protein chip analysis, and the like. These may be performed according to conventional methods in each field.
  • RT-PCR may be normal RT-PCR or real-time RT-PCR.
  • Primers that specifically amplify human GPR48 mRNA are designed from human GPR48 (SEQ ID NO: 1) according to conventional methods.
  • the primer sequence is not particularly limited as long as it is a sequence in human GPR48 mRNA and exhibits specific amplification.
  • the expression level of GPR48 in the cells can be examined by RT-PCR using two appropriate primers in the sequence of G protein-coupled receptor GPR48.
  • an antibody using a peptide corresponding to the extracellular domain of human GPR48 (SEQ ID NO: 2) as an antigen.
  • This extracellular domain is amino acids Nol to 542 of human GPR48 (SEQ ID NO: 2), and may be an antibody against the entire extracellular domain or a part thereof.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody of the present invention reacts with GPR48 present in a specimen. Further, a probe that recognizes this antibody is reacted. Examples of this probe include anti-human IgG antibody, protein G, protein A, and protein L. This probe is usually labeled. These labels include radioisotopes ( 125 ⁇ ), enzymes (peroxidase)
  • a DNA chip on which a number of probes (DNA) corresponding to mRNA derived from human GPR48 (SEQ ID NO: 1) are immobilized is prepared.
  • a cell fraction or tissue force to be examined or RNA fraction or mRNA is prepared, and DNA complementary thereto is labeled with a fluorescent dye and synthesized.
  • the expression of GPR48 can be detected by measuring the fluorescence by pairing this with the above DNA chip.
  • RNA fractionated by electrophoresis is immobilized on a nitrocellulose membrane or the like from a gel. This can be paired with a labeled DNA (probe) prepared from human GPR48 (SEQ ID NO: 1), and the expressed mRNA can be detected to know the expression of GPR48.
  • protein expression can be extracted from a sample, analyzed with a mass spectrometer, and the amount of fragments having the amino acid sequence of GPR48 can be measured to determine the expression of GPR48.
  • Isogen manufactured by Wako
  • RNA was converted into a vertical form, and then used for hundamorikovima 1 ⁇ ; cDNA was synthesized with supenscript Reverse ranscnptase (Invitrogen).
  • Primer set and sample cDNA are stored in a reaction solution containing thermostable polymerase. Set on a PCR machine (Light Cycler, Roche), 94. The amount of GPR48 mRNA was quantified by performing cyclic amplification at 54 ° C. for 20 seconds and 72 ° C. for 20 seconds after heat denaturation for C 15 seconds.
  • Matrigel invasion chamber (Matrigel invasion chamber, manufactured by BD Bioscience, 24-wel 1 plate size), Matrigel coated PET membrane (PET membrane, pore size 8.0- ⁇ m) chamber These cells were seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / well.
  • remove from the 37 ° C CO incubator remove cells above chamber 1 with a cotton swab, pass through Matrigenore, and infiltrate cells below chamber 1 with Diff-Quik kit (International Reagents Co ⁇ ). oration) and observed with a microscope at 100 times magnification, and the cells in all fields were counted.
  • GPR48 expression plasmid pcDNA4-HisMax_hGPR48
  • empty vector pcDNA4_HisMax
  • Figure 2 is a photograph of stained infiltrated cells.
  • Figure 3 shows the results in a graph and statistical processing. * Indicates that GPR48-19 and GPR48-33 are significantly more invasive than control vectors at a risk rate of 0.01 or less. As a result, it was found that GPR48-19 and GPR48-33 cells expressing GPR48 mRNA at a high level were clearly more invasive than the control group Vector 2 and Vector 6.
  • GPR48 can promote cancer cell invasion.
  • GPR48 expression was analyzed by quantitative RT-PCR in 29 human colorectal cancer specimens with informed consent.
  • Figure 4 shows the expression level of GPR 48 mRNA in 29 cancerous and normal areas.
  • a peptide (CQEQKMLRTLDL) having a sequence of amino acids 339 to 350 at the extracellular position of human GPR48 (SEQ ID NO: 2) was chemically synthesized, conjugated with KLH, and then immunized with a rabbit. After confirming that the antibody titer had increased, whole blood was collected to obtain antiserum.
  • Extracts of 293 cells or HCT116 cells transfected with a GPR48 expression vector (pcDNA4-HisMax-hGPR48) were separated by SDS polyacrylamide electrophoresis and subjected to Western plot analysis. As a result, a human GPR48 band was detected at a molecular weight of 104 kD.
  • Immunohistological staining was performed using the Histofme SAB kit (Nichirei). Specifically, paraffin-embedded tissue sections were deparaffinized and then treated with a microwave oven in 10 mM citrate buffer to remove endogenous peroxidase with 0.3% hydrogen peroxide. Next, it was immersed in a purified anti-GPR48 antibody diluted 1: 200 and allowed to react overnight at 4 ° C. Subsequently, it was reacted with a piotine-conjugated secondary antibody (anti-rabbit IgG), then reacted with streptavidin-conjugated horseradish peroxidase, and after washing, it was immersed in a coloring solution containing diaminobenzidine for color development. Furthermore, the nucleus was dyed blue with hematoxylin, mounted with cover glass, and observed with a microscope.
  • FIG. 5 shows a staining example in which the same colon cancer specimen as in Example 1 was analyzed using this immunohistological staining method.
  • FIG. 1 is a graph showing the expression level of GPR48 mRNA in human colon cancer cells into which a GPR48 expression plasmid has been introduced.
  • FIG. 3 A graph showing the number of cells infiltrated in human colon cancer cells into which a GPR48 expression plasmid was introduced.
  • the vertical axis shows the number of cells that infiltrated and passed through the pores (holes) of a Matrigel-coated PET membrane (pore size 8 ⁇ 0 ⁇ m) (total number of infiltrated cells per chamber). Number).
  • FIG. 5 is a diagram showing expression analysis (immunohistological staining) of GPR48 in human colon cancer specimens.
  • black circles blue in color, and due to hematoxylin-eosin staining
  • GPR48 the part of the cytoplasm around the nucleus that is stained gray (gray near black, dark brown in color)
  • GPR48 the part of the cytoplasm around the nucleus that is stained gray (gray near black, dark brown in color)
  • the unstained part (white) in the meantime is stromal cells (normal).
  • the response of GPR48 shown in gray is very weak.

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Abstract

　【課題】　　予後不良の癌を検査するための方法を提供する。 　【解決手段】　　本発明者らは、Ｇタンパク共役型受容体GPR48遺伝子(AF257182)の発現が予後不良の癌で有意に亢進していることを見出し、更にGPR48と転移との関係を解明する研究を行った結果、GPR48が癌細胞の浸潤能を亢進させる機能を持つことを解明し、この結果を予後不良の癌の診断に応用した。本発明は、検査対象の細胞又は組織におけるＧタンパク共役型受容体ＧＰＲ４８の発現を検出することからなる癌の転移性の検査方法及び癌の浸潤能の検査方法である。 　

Description

明 細 書
癌の転移性及び浸潤能の検查方法
技術分野
[0001] この発明は、癌、特に予後不良の癌の検査方法に関し、より詳細には、癌、特に予 後不良の癌の疑いのある患者の細胞及び組織における転移浸潤能に関与する遺伝 子の発現を調べることにより、癌の転移性及び浸潤性を検查する方法に関する。 背景技術
[0002] 癌の治療では、外科手術、放射線治療、免疫療法、化学療法等の治療法が行わ れており、それらの進歩により癌の治癒率は上昇している。し力しこれらの治療法は 原発癌に限られ、転移性の高い癌は予後不良で治癒率は総じて低い。また、従来の 転移浸潤に代表される予後の診断法は、信頼性、感度、簡便性が不足している。 一方、大腸癌、乳癌、胃癌、肺癌等の癌において、細胞周期制御因子である CDK 阻害タンパク質 p27Kiplの発現量低下が見出され、 p27Kiplの発現量が低下している癌 では予後が悪いという報告がある（非特許文献 1〜3)。しかし p27Kiplの発現量低下で 何故予後が悪いのかは不明であった。
なお本発明者らにより予後不良の癌及び癌細胞の転移浸潤性に関連することが解 明された GPR48は、 7回貫通ドメインを有するタンパク質のスーパーファミリーに属す るロイシンリッチリピートを含む Gタンパク質結合レセプターであることは知られていた 力 その機能は不明であった (非特許文献 4, 5)。
[0003] 非特許文献 1： Nature Medicine 1997 Feb;3(2):222-5.
非特許文献 2： Nature Medicine 1997 Feb;3(2):227_30.
非特許文献 3： Nature Medicine 1997 Feb;3(2):231_4
非特許文献 4 : Mol Endocrinol. 2004 Sep; 18(9):2241-54. Epub 2004 Jun 10.
非特許文献 5 : Mol Endocrinol. 1998 Dec; 12(12): 1830-45.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明者らは、 p27Kiplの発現量が低下している癌では予後が悪い（非特許文献 1〜 3)ことの原因を解明するために、 p27Kiplの発現量低下によっておこる遺伝子発現を 解析し、予後不良化の原因を解明すれば、癌の診断に応用できると考えた。
即ち、本発明は、癌、特に予後不良の癌を検查するための方法を提供する。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは、 p27Kiplの発現量が低下したモデルを作成し、変動している遺伝子を マイクロアレイを用いて解析した。即ち、ヒト大腸癌細胞株 HCT116の p27Kipl遺伝子を ジーンターゲティング法により片側ノックアウトした細胞（HCT-hp27-hKO)を作成し、 p27Kiplの発現量が低下していることを確認してモデル細胞とした。親株の HCT116に 比べ HCT-hp27-hKOで発現変動している遺伝子をマイクロアレイを用いて解析した 。その結果、 HCT-hp27-hKOにおいて Gタンパク共役型受容体 GPR48遺伝子 (AF25 7182)の発現が有意に亢進していることが明らかになった。
本発明者らは、更に GPR48と転移との関係を解明する研究を行った結果、 GPR48 が癌細胞の浸潤能を亢進させる機能を持つことを見出し、本発明を完成させるに至 つた。
[0006] 即ち、本発明は、検查対象の細胞又は組織における Gタンパク共役型受容体 GPR 48の発現を検出することからなる癌の転移性の検查方法であり、検查対象の細胞又 は組織における Gタンパク共役型受容体 GPR48の発現を検出することからなる癌の 浸潤能の検查方法である。
また、本発明は、癌患者の癌部組織検体を用いて GPR48の発現量を定量的 RT 一 PCR又は抗 GPR48抗体を用いた免疫組織染色や酵素免疫抗体法等の免疫学 的方法により転移の可能性を診断する方法である。
発明を実施するための最良の形態
[0007] 本発明は、 Gタンパク共役型受容体 GPR48が癌細胞の浸潤能を促進する機能を 持ち、癌の浸潤転移の指標となることを見出したことに基づぐ GPR48の発現を検出 することからなる癌の転移性及び浸潤能の検查方法である。
検査の対象となる癌は如何なる癌でもよぐ例えば、大腸癌、乳癌、胃癌、肺癌、胆 道癌 (胆管細胞癌、胆嚢癌）、膝癌、食道癌、肝細胞癌、喉頭癌、咽頭癌、甲状腺癌 、子宮癌、卵巣癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱癌、悪性黒色腫、脳腫瘍などが挙げ られる。
検查対象の細胞又は組織は、被検者から採取した細胞又は組織であることが好ま しぐ癌の疑いのある患者からの生検試料又は外科的手法によって癌の疑いのある 患者力も採取された細胞又は組織であることがより好ましい。
[0008] GPR48の発現を検出する方法に特に制限は無レ、が、抗原抗体反応、 RT-PCR 、 cDNAマイクロアレイ、ノーザンブロッテイング、マススぺタトロメトリー解析、プロティ ンチップ解析等が挙げられる。これらは各分野の常法に従って行えばよい。
[0009] RT— PCRとしては、通常の RT— PCR又はリアルタイム RT— PCRでもよレ、。
ヒト GPR48 (配列番号 1)から、常法に従ってヒト GPR48mRNAを特異的に増幅す るプライマーを設計する。プライマーの配列はヒト GPR48mRNA中の配列で特異的 な増幅を示すものあれば特に制限するものではない。 Gタンパク共役型受容体 GPR 48の配列中の適当な 2つのプライマーを用いた RT— PCR法により、前記細胞にお ける GPR48の発現量を調べることができる。
[0010] 抗原抗体反応を検知する方法に特に制限はないが、免疫組織染色（蛍光染色含 む）、 FACS (フローサイトメトリー）、ィムノブロット法、ドットブロット法、 ELISA等を用 レ、ることができる。
ヒト GPR48 (配列番号 2)の細胞外ドメインに相当するペプチドを抗原として抗体を 作成することが好ましレ、。この細胞外ドメインは、ヒト GPR48 (配列番号 2)のアミノ酸 N o.l〜542であり、この細胞外ドメイン全体あるいはその部分に対する抗体であればよ レ、。また、抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよレ、。この抗体は、 この抗体を主成分とする癌の検査薬、特に予後不良の癌の検査薬として利用できる 検查方法の例を挙げると，本発明の抗体を、検体中に存在する GPR48と反応させ 、更にこの抗体を認識するプローブを反応させる。このプローブとしては、抗ヒト IgG抗 体、プロテイン G、プロテイン A、プロテイン Lなどが挙げられる。このプローブには通 常標識を付す。この標識としては、放射性同位元素（125ι)、酵素 (ペルォキシダーゼ
、アルカリフォスファターゼ）、蛍光物質、発光物質等が挙げられる。酵素抗体を用い た場合には、基質を反応させてその変化 (着色等)を観察すればよい。 [0011] cDNAマイクロアレイの場合には、ヒト GPR48 (配列番号 1)由来の mRNAに対応 する多数のプローブ（DNA)を固定した DNAチップを用意する。一方、検查対象の 細胞又は組織力 RNA分画又は mRNAを調製し、これと相補的な DNAを蛍光色 素で標識して合成する。これを上記 DNAチップに対合させて蛍光を測定することに より、 GPR48の発現を検出することができる。
ノーザンブロッテイングの場合には、検体から RNA分画あるいは mRNAを調整した後 、電気泳動により分画した RNAを、ゲルからニトロセルロース膜等に固定する。これ にヒト GPR48 (配列番号 1)から作成した標識 DNA (プローブ）に対合させて、発現 する mRNAを検出して、 GPR48の発現を知ることができる。
マススぺタトロメトリー（質量分析)解析には、検体からタンパク質を抽出し、質量分 析機で分析し、 GPR48のアミノ酸配列を持つ断片の量を測定することにより GPR48 の発現を知ることができる。
プロテインチップ解析の場合には、検体からタンパク質を抽出し、 GPR48の抗体等 を固定したチップと反応させ、洗浄後、発色させプロテインチップ解析装置により量を 測定することにより GPR48の発現を知ることができる。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものでは なレ、。
[0012] 本実施例及び参考例において、定量的 RT-PCR(QRT-PCR)法は以下の手順で行 つた。
培養細胞（又は凍結検体）に Isogen (和光社製)試薬を加え、ポリトロンホモジナイザ 一でホモジナイズし遠心し、エタノール沈殿し、 RNAを抽出した。この RNAを铸型にし 飞、フンダムォリコフフイマ1 ~ 用レヽて； supenscript Reverse Ί ranscnptase (Invitrogen 社製）で cDNAを合成した。
次に GPR48の発現量を定量するため、 CAGTACCCAGTGAAGCCATT (配歹番号 3)及び TGTTGTCATCCAGCCACAGA (配歹 1J番号 4)をヒト GPR48のプライマーセット とし、定量的 RT-PCR (Cyber Green法）を行った。タックマン法等他の QRT-PCR法を 用いてもよい。
耐熱性ポリメラーゼを含む反応液にプライマーセットと検体の cDNAをカ卩え、リアルタ ィム PCR機（ロッシュ社製、 Light Cycler)にセットし、 94。C15秒の熱変性のあと、 54°C2 0秒及び 72°C20秒のサイクル増幅を行うことにより GPR48mRNA量を定量した。
[0013] また、本実施例及び参考例にぉレ、て、細胞の浸潤能は下記の方法で調べた。
マ卜リゲル浸潤チャンノ ー (Matrigel invasion chamber, BD Bioscience社製、 24-wel 1 plate size)を用レ、、マトリゲル (matrigel)でコーティングされた PET膜（PET membrane 、ポアサイズ 8.0- μ m)の chamberの上にこれらの細胞を 5 X 104 cells/wellの数で播ぃ た。チャンバ一の下のゥエル（well)中には、ケモアトラクタント（chemo-attractant)とし て 10 μ g/mlフイブロネクチン (fibronectin、 Roche製)を含んだ培地 750 μ 1をいれた。 36 時間後、 37°Cの COインキュベーターから出して、綿棒でチャンバ一の上の細胞を取 り除き、マトリゲノレを通り抜け、チャンバ一の下へ浸潤した細胞を Diff-Quik kit (Intern ational Reagents Co卬 oration社製)で染色し、顕微鏡で 100倍拡大の条件で観察し、 全視野の細胞を数えた。 3回実験を行い、毎回の実験で 1サンプノレについて、 3ゥェ ルずつ実験を行った。
[0014] 参考例 1
GPR48の癌細胞における機能を調べるために GPR48発現プラスミド (pcDNA4-HisM ax_hGPR48)又は空ベクター (pcDNA4_HisMax)をヒト大腸癌細胞 HCT116にトランスフ ェタトし、導入された細胞を Zeocinで選択し、安定発現細胞株 (GPR48-19、 GPR48-33 、 Vector 2及び Vector 6)を得た。これらの細胞における GPR48発現を、定量的 RT- P CR法により調べた。その結果を図 1に示す。 pcDNA4_HisMax_hGPR48が導入された GPR48-19, GPR48-33において GPR48mRNAが高発現していることが確認された。 次に、培養細胞の浸潤能を調べた。図 2は、浸潤した細胞を染色した写真である。 図 3はその結果をグラフで表し、統計処理したものを示す。 *印は、 0.01以下の危険 率で有意に GPR48-19, GPR48-33が対照のベクターより浸潤能が高いことを示す。 その結果、 GPR48mRNAを高発現している GPR48-19, GPR48-33細胞は対照群の V ector 2, Vector 6より明らかに浸潤能が高いことがわかった。
即ち、 GPR48は癌細胞の浸潤を促進するといえる。
実施例 1
[0015] 本実施例では、定量的 RT-PCR法によるヒト大腸癌検体における GPR48の発現解 析を行った。
インフォームドコンセントを取った 29例のヒト大腸癌検体にっレ、て、定量的 RT-PCR 法によって GPR48の発現解析を行った。図 4に 29例の癌部及び正常部における GPR 48mRNAの発現量を示す。
14例は癌部と正常部で発現に大きな差がな力つた。一方 *印で示した Case No 1， 2, 3， 4， 5, 7， 11, 12， 15， 18, 21, 24, 26, 27, 28の 15例は正常部に比較して癌部で 2 倍以上 GPR48mRNAの発現量が亢進してレ、た。
実施例 2
ヒト大腸癌検体の GPR48の発現量を調べ、病理所見との相関性を調べた。その結 果を表 1に示す。なお、表中の P値 (危険率）は、統計処理後の危険率 (例えば、この 値が 0.02だと 2%)で有意であるとされる。一般に 0.05以下が有意性があり、低いほど 有意性が高レヽ (信頼性が高レ、、危険率が低レ、）とされる。
[表 1]
病理所見 例数 GPR48 発現量 （癌部/正常部)
年齢
< 65 2.659
> 65 4.129 0.15 性別
男性 2.854
女性 4.534 0.16 癌の大きさ （cm)
<5 4.248
>5 2.597 0.18 分化度
高分化 2.383
中程度 6.283 0.004 血管浸潤
無 3.369
有 3.417 0.972 リンパ管浸潤
無 2.199
有 5.348 0.020 リンパ節転移
2.111
5.603 0.013 その結果、分化度（中程度）、リンパ管浸潤（有)及びリンパ節転移 (有)と GPR48の 発現亢進が有意な相関を示した。 GPR48は癌細胞の浸潤を促進する機能を持って いること（参考例 1)を考え合わせると、 GPR48の発現亢進はヒトの癌の転移浸潤性の 亢進を導レヽてレ、ると考えられる。
実施例 3
本実施例では、免疫組織学的解析によるヒト大腸癌検体における GPR48の発現解 析を行った。
ヒト GPR48 (配列番号 2)の細胞外部位のアミノ酸 339から 350の配列をもつペプチド（ CQEQKMLRTLDL)をィ匕学合成し、 KLHと結合させた後ゥサギに 4回免疫した。抗体 価が上がったのを確認し、全採血して抗血清を得た。抗原であるこのペプチドを共有 結合させたレジンを作成し、これに抗血清を吸着させて洗浄後、低 pH溶出液により 溶出させて中和して、精製抗ヒト GPR48抗体とした。 GPR48発現ベクター (pcDNA4-Hi sMax-hGPR48)をトランスフエクシヨンした 293細胞又は HCT116細胞の抽出液を SDS ポリアクリルアミド電気泳動で分離し、ウェスタンプロット解析した。その結果、分子量 104kDにヒト GPR48のバンドが検出された。
同時に免疫蛍光染色を行い GPR48の発現に対応した反応性を確認し、本抗体が G PR48に対する特異抗体であることを確認した。
免疫組織学的染色は Histofme SABキット（ニチレイ社）を用いて行った。具体的に は、パラフィン包埋した組織の切片を脱パラフィン後、 10 mMのクェン酸緩衝液中マ イク口ウェーブオーブンで処理し、 0.3%過酸化水素で内因性パーォキシダーゼを消 去した。次に 200分の 1に希釈した精製抗 GPR48抗体で浸し、 4°Cで一夜反応させた 。続いてピオチン結合 2次抗体 (抗ゥサギ IgG)と反応させ、その後ストレプトアビジン 結合西洋わさびパーォキシダーゼと反応させ、洗浄後ジァミノベンチジンを含む発色 液に漬けて発色させた。さらにへマトキシリンで核を青に染め、カバー硝子でマウント し、顕微鏡観察した。
この免疫組織学的染色法を用いて、実施例 1と同じ大腸癌検体を解析した染色例 を図 5に示す。
強陽性例では癌細胞が強く褐色に染色され、正常細胞はほとんど染色されなかつ た。一方、陰性例では癌細胞、正常細胞ともに弱く染色されるにとどまった。 Case No 1, 2, 3， 4, 6， 7, 8，9 10, 11， 12, 13, 14， 15, 16， 24, 28について解析した結果、 Case No 1， 2， 3, 4， 7, 11， 12， 15, 24, 28の癌部で中〜強陽性を示し、それ以外の Case N 0 6, 8，9 10, 13， 14, 16，では弱陽性から陰性であった。
この免疫組織学的染色の結果は、表 2に示すように、実施例 1の GPR48mRNAの発 現量の測定結果と一致した。 [表 2] 定量的 RT-PCR法 免疫組織染色
Case No. GPRmRNA (癌部 1 正常部） GPRタンパク質
1 5.94 +++
2 3.70 ++
3 4.30 ++
4 3.18 ++
6 1.03 +
7 0.88 +
8 1.28 -
9 1.32 +
10 1.34 +
11 1.00 -
12 1.10 -
13 1.58 +
14 1.20 -
15 3.22 +++
16 1.41 -
24 8.83 ++++
28 4.35 +++ 図面の簡単な説明
[図 1]GPR48発現プラスミドを導入したヒト大腸癌細胞における GPR48mRNAの発現量 を示す図である。
園 2]GPR48発現プラスミドを導入したヒト大腸癌細胞において細胞が浸潤しているこ とを示す写真である。各写真の横幅は 0.34mmである。灰色の点はマトリゲルでコーテ イングされた PET membraneのポア（穴）、黒色の点は浸潤して通り抜けた細胞を示す 。（1 )は HCT116細胞に pcDNA4-His Maxベクターを導入した対照群の浸潤細胞を 示し、（2)は HCT116細胞に pcDNA4-His Max_GPR48を導入した GPR48高発現細胞 の浸潤細胞を示す。
園 3]GPR48発現プラスミドを導入したヒト大腸癌細胞において浸潤した細胞数を示 す図である。縦軸は、マトリゲルでコーティングされた PET membrane (ポアサイズ 8·0_ μ m)のポア（穴）を浸潤して通り抜けた細胞の数 (1チャンバ一あたりの浸潤細胞の総 数)を示す。
園 4]ヒト大腸癌検体における GPR48の発現解析（定量的 RT-PCR)を示す図である。 横軸は各検体の GPR48の発現量を GAPDHの発現量で割って補正した値を示す。 園 5]ヒト大腸癌検体における GPR48の発現解析 (免疫組織染色）を示す図である。 図中、黒丸（カラーでは青色で、へマトキシリン -ェォジン染色によるものである）は核 を示す。陽性例で、核の周りの細胞質で灰色（黒に近い灰色、カラーでは濃い茶色) に染まっている部分が GPR48であり、癌部を示す。その間の染まっていない部分（白 色）は間質細胞（正常）である。陰性例は、灰色（カラーでは茶色）で示される GPR48 の反応が非常に弱い。

Claims

請求の範囲
[1] 検査対象の細胞又は組織における Gタンパク共役型受容体 GPR48の発現を検出 することからなる癌の転移性の検査方法。
[2] 検査対象の細胞又は組織における Gタンパク共役型受容体 GPR48の発現を検出 することからなる癌の浸潤能の検査方法。
[3] 前記検出の方法が、抗原抗体反応、 RT-PCR, cDNAマイクロアレイ、ノーザンブ ロッテイング、マススぺタトロメトリー解析、又はプロテインチップ解析によるものである 請求項 1又は 2に記載の方法。
[4] 前記細胞又は組織が、癌の疑いのある患者からの生検試料又は外科的手法によつ て癌の疑いのある患者から採取された細胞又は組織である請求項 1〜3のいずれか 一項に記載の方法。
[5] Gタンパク共役型受容体 GPR48の細胞外ドメインに相当するペプチドに対する抗体 を用いて、前記細胞のこの抗体に対する反応性を調べることから成る請求項 1〜4の レ、ずれか一項に記載の方法。
[6] Gタンパク共役型受容体 GPR48の細胞外ドメインに相当するペプチドに対する抗体 を主成分とする癌の検査薬。
[7] Gタンパク共役型受容体 GPR48の配列中の適当な 2つのプライマーを用いた RT_
PCR法により、前記細胞における GPR48の発現量を調べることから成る請求項 1〜
4のいずれか一項に記載の方法。
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