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WO2005001472A1 - 抗がん作用物質のスクリーニング方法及び装置 - Google Patents

抗がん作用物質のスクリーニング方法及び装置 Download PDF

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WO2005001472A1
WO2005001472A1 PCT/JP2004/008634 JP2004008634W WO2005001472A1 WO 2005001472 A1 WO2005001472 A1 WO 2005001472A1 JP 2004008634 W JP2004008634 W JP 2004008634W WO 2005001472 A1 WO2005001472 A1 WO 2005001472A1
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WO
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surface plasmon
plasmon resonance
change
rate
target
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Toshihiro Ona
Atsushi Kosaihira
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Japan Science and Technology Agency
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Japan Science and Technology Agency
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Publication date
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    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
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    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity

Definitions

  • the present invention relates to a method and an apparatus for measuring a cellular response to a physiologically active ingredient such as an active substance for a pile cancer, and more particularly to a screening method and an apparatus for determining the presence or absence of an action on a pile cancer.
  • Fluorescence observation has recently been established as an image analysis technique for cell dynamics. Fluorescence observation can visualize real-time changes in cells, and has high specificity for the target substance and is very effective for understanding the reaction mechanism.
  • biosensors using an optical phenomenon called surface plasmon resonance (SPR) can measure a wide range of phenomena in real time by capturing changes in the dielectric constant due to the coupling between molecules.
  • SPR surface plasmon resonance
  • a composite device capable of simultaneously performing surface plasmon resonance angle measurement and fluorescence observation has been proposed (see JP-A-2002-62255).
  • the surface plasmon resonance method can be used as a method for analyzing cell dynamics, but is used as a screening method.
  • the inventors of the present invention have found that when an anticancer substance is acted on cancer cells, its pile cancer action and its change in a time zone in which the rate of change of surface plasmon resonance angle with time is stable are stable.
  • the present inventors have found that there is a correlation between the ratio and the ratio, and utilized the relationship for the screening of a pile cancer active substance, thereby completing the present invention.
  • the present invention is a screening method for evaluating whether or not a target reagent has an anticancer effect, and an effective concentration thereof, wherein the target reagent is used for a sample containing cancer cells. Reacting the reagent to be treated, measuring the surface plasmon resonance angle of the sample after the reagent action, and determining the rate of change of the obtained surface plasmon resonance angle in a time zone in which the rate of change with time is stable. And a step of evaluating the degree of anticancer action of the target reagent on target cancer cells based on the obtained rate of change in surface plasmon resonance angle.
  • the time zone in which the rate of change of the surface plasmon resonance angle with respect to time is stable is a time zone in which the rate of change in a longer time zone is substantially equal to the rate of change.
  • substantially equal means that they match within ⁇ 10%.
  • the time period is an appropriate time period 25 minutes after the target reagent is applied to the sample containing the target cancer cells.
  • the only measurement time required for screening is the time for measuring the rate of change in surface plasmon resonance angle.
  • the time can be as short as 1 to 50 minutes, for example, and the process can be performed quickly. Therefore, it is easy to automate the measurement by preparing a plurality of samples and sequentially performing the surface plasmon resonance angle measurement for that time.
  • the change of the surface plasmon resonance with respect to time can be measured as the time change of the surface plasmon resonance angle or the time change of the reflected light intensity at the surface plasmon resonance angle in the initial state.
  • SPR surface plasmon resonance
  • a metal surface is resonantly excited using an evanescent wave obtained by light such as laser light.
  • the evanescent wave can be generated on the opposite side of the reflecting surface by causing total reflection in the prism.
  • the evanescent wave passes through the metal layer and passes through the surface plasmon of the metal opposite surface. Is excited by resonance.
  • Factors that determine the conditions that cause resonance include the dielectric constant of the material that forms an interface with the metal layer.Since the intermolecular interaction involves a change in the dielectric constant, the resonance conditions are determined by this.
  • the condition of the evanescent wave that can induce resonance also changes.Conversely, by knowing the change in the condition of the evanescent wave that induces resonance, it is possible to know the change in dielectric constant, fins, and finally the coupling between molecules. Can be. Actually, the condition of the evanescent wave changes depending on the incident angle ⁇ of the incident laser light. The angle of incidence and the angle of reflection are defined as the angle to the normal of the substrate as shown in Fig. 4 (B).
  • the evanescent wave is affected by the substance on the metal layer, so that the reflected light intensity sharply decreases as shown in FIG. 4 (A). This change in reflected light intensity is detected by a detector, and the incident angle (resonance angle) at which the reflected light intensity is attenuated is plotted, whereby a change in a minute area on the metal layer can be known.
  • the surface plasmon resonance method is widely used as a protein interaction analysis technique, but usually, the practicality and sensitivity are improved by immobilizing the protein by binding a monomolecular film or the like to the surface of the metal thin film.
  • An example of culturing cells directly on a metal thin film and measuring the cell response has also been reported (see Michihiro Hide, Tomoko Tsutsui, Analytical Biochemistry. 302, 28-37 (2002)). This is an analysis technology that can be used to determine the response of the Itoda cell in situ.
  • the degree of the pile cancer action in the screening it is preferable to prepare a calibration curve. Therefore, the relationship between the degree of pile cancer action and the rate of change in surface plasmon resonance when a known anticancer agent is applied to a sample containing the target cancer cells is separately determined and used as calibration curve data, and screening is performed. In the evaluation step in, the degree of the anticancer effect of the target reagent on the target cancer cell may be evaluated based on the calibration curve data.
  • the degree of anticancer action for obtaining calibration curve data the reduction in cancer cells due to the action of the anticancer agent on the target cancer cells is determined by counting the number of cells, or It can be obtained by measuring fluorescence from cells. As the fluorescence, natural fluorescence of the cell may be used in some cases. However, in order to perform measurement with higher sensitivity, it is preferable to measure the fluorescence from a fluorescent reagent obtained by converting cancer cells into a fluorescent derivative.
  • the apparatus for realizing the screening method of the present invention includes a surface plasmon resonance measuring apparatus (SPR) 2 for measuring surface plasmon resonance and a sample containing a target cancer cell.
  • SPR surface plasmon resonance measuring apparatus
  • a surface plasmon resonance angle change rate calculation unit 4 for obtaining a change rate of a surface plasmon resonance angle at a predetermined time by the surface plasmon resonance measurement device 2 after the target reagent is applied, and a surface plasmon resonance angle change rate calculation unit
  • a screening unit 8 for evaluating the anticancer effect of the target reagent on the target cancer cells based on the surface plasmon resonance angle change rate obtained in 4 above.
  • calibration curve data showing the relationship between the degree of anticancer action on target cancer cells and the rate of change in surface plasmon resonance angle are used. It is preferable that a calibration curve data holding unit 6 is further provided.
  • the screening unit 8 uses the surface plasmon resonance angle change rate calculated by the surface plasmon resonance angle change rate calculation unit 4 and the calibration curve data stored in the calibration curve data storage unit 6 to determine the objective for the target cancer cell. Evaluate the anticancer effect of the reagent.
  • the surface plasmon resonance measurement apparatus 2 is equipped with a fluorescence microscope 10 as an integral part, so as to enable the measurement of cell kinetics simultaneously or separately with the surface plasmon resonance measurement. It's preferable that there is.
  • the dynamics of cells refer to nucleic acids, proteins and sugar chains that are biomolecules, and hormones and phosphates that are chemical components.
  • the calibration curve data holding unit 6 stores the results of the surface plasmon resonance angle change rate calculation unit 4 when a known anticancer agent is applied to target cancer cells, Calibration curve data separately obtained based on the result of measurement of the decrease in cancer cells due to this can be retained.
  • the calibration curve data holding unit 6 also allows a known anticancer substance to act on the target cancer cell.
  • the results obtained by the surface plasmon resonance angle change rate calculation unit 4 and the intensity of the fluorescence generated by exciting the target cancer cell or a fluorescent reagent derived from the target cancer cell by fluorescence derivation are measured using a fluorescence microscope 10 to determine the Calibration curve data created based on the results obtained by reducing the number of cancer cells caused by the action of a cancer agent can also be retained.
  • the screening method and apparatus of the present invention allow a sample containing a target cancer cell to act on a target reagent, measure the surface plasmon resonance angle of the sample after the action of the reagent, and determine the rate of change with respect to time.
  • the rate of change in the time period during which is stable was evaluated to evaluate the degree of anticancer action of the target reagent on target cancer cells.
  • the measurement time required for screening was determined by the surface plasmon resonance angle change. Only the time for measuring the rate is required, and the processing can be performed quickly.
  • the screening device of the present invention includes a surface plasmon resonance angle measuring device and a fluorescence microscope as one body, it becomes possible to perform both surface plasmon resonance angle measurement and cell dynamics measurement.
  • FIG. 1 is a block diagram schematically showing a device of the present invention.
  • FIG. 2 is a block diagram schematically showing another embodiment of the device of the present invention.
  • FIG. 3 is a view schematically showing a screening apparatus of an embodiment.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining the principle of surface plasmon resonance, where (A) is a graph showing the dependence of the reflectance on the incident angle, and (B) is a diagram showing the incident angle and the reflection angle.
  • FIG. 5 is a chemical structural formula showing a reagent used in an example.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between each reagent concentration and cell viability.
  • FIG. 7 is a graph showing a time change of a surface plasmon resonance signal after administration of each reagent.
  • FIG. 8 is a graph showing a relationship between each reagent concentration and a surface plasmon resonance signal change rate.
  • FIG. 9 is a graph showing the relationship between cell viability and surface plasmon resonance signal change rate.
  • FIG. 10 is a fluorescence image showing the response of cancer cells to taercetin (reagent) and control.
  • FIG. 11 is a fluorescence image showing the response of cancer cells to trans-resveratrol (reagent) and rutin (reagent).
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing a screening apparatus according to one embodiment.
  • the surface plasmon resonance includes a light source 22 for allowing incident light 24 to enter the sensor chip 20 installed on the sample table under the condition of total reflection, and a light receiving device 28 for receiving the reflected light 26.
  • the prism 30 is provided to reflect all the light.
  • the light source 22 and the light receiving device 28 scan the surface plasmon resonance by simultaneously changing the incident angle ⁇ and the reflection angle ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ with respect to the vertical line of the incident surface of the sensor chip 20 and measuring the intensity change of the reflected light 26. Supported by
  • the sensor chip 20 is a metal layer formed on a glass substrate, for example, a gold thin film by a method such as vapor deposition, and a cell 32 is provided as a sample on the metal layer. .
  • a reagent whose anti-cancer effect is to be evaluated acts on the cells 32.
  • a fluorescence microscope is provided integrally with this surface plasmon resonance apparatus.
  • Reference numeral 34 denotes an objective lens of the fluorescence microscope, which can be visually observed by an eyepiece 36.
  • the fluorescence microscope is equipped with a xenon lamp (75W) as an excitation light source, and is equipped with respective spectroscopes for selecting an excitation wavelength and a fluorescence detection wavelength.
  • the fluorescent image can be captured by an imaging device 38 such as a CCD camera, so that the number of cells in the field of view can be counted, and the fluorescence intensity can be detected simultaneously with or separately from the measurement of surface plasmon resonance. I have.
  • a control device 40 is provided to control the operation of the surface plasmon resonance device and change the incident angle and the reflection angle ⁇ to obtain the surface plasmon resonance angle.
  • the control device 40 is composed of a computer, and also implements the functions of the surface plasmon resonance change rate calculation unit 4 and the screening unit 8 shown in FIGS. 1 and 2 and a storage device that implements the calibration curve data holding unit 6. It also has.
  • the control device 40 also controls the operations of counting the number of cells via the fluorescence microscope 10 and detecting the fluorescence intensity, thereby realizing a function of creating calibration curve data.
  • Extracts quercetin which is considered to have antiproliferative activity as a reagent
  • tiger Trans-resveratrol and rutin which is considered to have no such antiproliferative effect
  • the measurement was performed using a surface plasmon resonance device and a fluorescence microscope.
  • anti-cancer effects of luteolin (Luteolin) as an extract component having anti-proliferative effect and harceptin (Herein tin) as an antibody pile cancer drug used clinically were measured by a proliferation test and surface plasmon resonance measurement device. It was determined from the measurement and compared with the calibration curve data of the anticancer effect obtained with quercetin, resveratrol, rutin, and control.
  • FIG. 5 shows the chemical structural formulas of these four types of reagents (the structural formulas are omitted because noceptin is an antibody).
  • human spleen cancer cells (cell line: MIA PaCa_2, obtained from Human Science Research Resource Bank) were used.
  • EMEM Eagle's minimum essential medium
  • FBS Fetal bovine serum
  • NEAA non-essential amino acids
  • Cells in a logarithmic growth phase cultured in a 6 cm diameter petri dish are detached from the petri dish using EDTA-trypsin, and the cells are collected by centrifugation, stained with 0.1% trypan blue, and counted using a hemocytometer. The cells were prepared and adjusted to a cell concentration of 5 ⁇ 10 4 cells / ml and subcultured.
  • the medium was replaced with a medium containing 10, 25, 50, and 100 ⁇ l of taercetin, trans-resveratrol, and rutin, respectively.
  • a medium in which DMSO (dimethyl sulfoxide) used for dissolving the reagent was added to a medium of the same concentration (0.1%) was prepared and used in the same manner as the medium containing the reagent.
  • FIG. 6 shows the results.
  • the anti-proliferative effect of trans-resveratrol shows a concentration-dependent anti-proliferative effect
  • the anti-proliferative effect of quercetin is scarcely observed below 10 aM, but at higher concentrations it shows a concentration-dependent anti-proliferative effect.
  • Rutin has no antiproliferative effect.
  • quercetin has been shown to affect many cancer cells, including the cell line used in the examples. In contrast, it has been shown to induce apoptosis (Michelle Mouria, Anna
  • the measurement was performed for one hour. Immediately after the sensor chip was set in the measuring section of the apparatus shown in Fig. 3, the medium was filled with the medium and measurement was started. Ten minutes later, the medium containing 10, 25, 50, and 100 / iM Taercetin, trans-resveratrol, and rutin was exchanged with a medium containing DMSO as a control, and measurement was continued for another 50 minutes. Was.
  • FIG. 7 shows the results obtained by exchanging the medium with each containing 100 ⁇ l of taercetin, trans-resveratrol and rutin.
  • the measurement results were expressed as the time change from the start of the measurement of the incident angle for exciting the resonance.
  • taercetin, luteolin and trans-resveratrol there was a clear change in surface plasmon resonance response several minutes after administration. In contrast, no change was observed in the administration of the medium containing rutin.
  • the slope of a curve obtained by surface plasmon resonance response for 5 minutes of 2700 to 3000 seconds (45 to 50 minutes) after the start of measurement was determined.
  • the time region is a region in which the time change of the surface resonance angle is stable.
  • Fig. 8 shows the slope, that is, the correlation between the time rate of change of the surface sounding angle and the reagent concentration.
  • FIG. 9 shows the correlation between the survival rate for each concentration of the reagent and the slope of the surface plasmon resonance response.
  • the results of luteolin and herceptin were also added. It can be seen that there is a linear correlation between the cell viability and the slope of the surface plasmon resonance response. If this result is used as a calibration curve, the cell survival rate, that is, the anticancer effect can be quantitatively evaluated by measuring the change rate of the surface plasmon resonance response in a predetermined short time.
  • One method of analyzing cell response by fluorescence observation is to monitor changes in intracellular pH.
  • the initial response of a cell to a substance that has some effect on the cell is a phenomenon that changes the intracellular pH, such as phosphorylation or changes in calcium ion concentration.
  • intracellular pH decreases as an early step in apoptosis induced by quercetin and transresveratrol (Matsuyama, S., Llopis, J "Deveraux, QL, Tsien, RY & Reed, J. Shi. Nature Cell Biol. 2, 318-325 (2000)) Therefore, as one index for analyzing cell response, the change in intracellular pH is measured by the fluorescence intensity of a pH-sensitive fluorescent finger. It was measured as a change.
  • 5- (and-6) -Carboxy SNAFL-1 Diacetate a pH-sensitive fluorescent reagent
  • the medium was again placed under culture conditions for 1 hour, the medium was replaced again to remove the fluorescent reagent, and then the measurement was performed.
  • a xenon lamp 75 W was used as the excitation light source, with an excitation wavelength of 460 500 nm and a detection wavelength of 510 560 ⁇ . m.
  • the medium was replaced with 100 / iM of taercetin, transresveratrol, rutin, or control medium, respectively.
  • the results are shown in FIGS. 10 and 11.
  • the fluorescence images are shown at the start of the measurement (0 minutes), at the lapse of 45 minutes and 50 minutes, which are the screening index time zones, and at 60 minutes at the end of the measurement.
  • the control medium no change was observed, whereas in the cells to which ⁇ of quercetin and trans-resveratrol were administered, a clear decrease in the fluorescence intensity due to intracellular acidification was observed.
  • a cellular response to a reagent having a carcinogenic effect was observed.
  • the results provide strong evidence that the results of surface plasmon resonance measurements capture cellular responses.
  • the fluorescence intensity by a fluorescence microscope can be used.
  • a calibration curve as shown in FIG. 9 can be created.
  • results obtained by the fluorescence microscope are not only supported by the results obtained by surface plasmon resonance, but also by means of changing the measurement target to allow a deeper understanding of the physiological activities of the extracted components. Very useful as well.
  • the present invention can be used for screening to evaluate the degree of anticancer effect of a target reagent on a target cancer cell.

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Abstract

　好ましい一実施例として、細胞を培養したセンサチップを測定部にセットし、培地を測定部に満たして測定を開始し、その１０分後に１０、２５、５０、１００μＭのクェルセチン、レスベラトロール及びルチンをそれぞれ含む培地と、コントロールとしてＤＭＳＯを含む培地とに交換し、さらに測定を続ける。測定開始後、２７００～３０００秒の５分間における表面プラズモン共鳴角の時間変化率を求め、細胞生存率との相関を求めると直線関係が得られた。この結果を検量線とすれば、所定の短時間での表面プラズモン共鳴角の時間変化率を測定することにより、抗がん作用を定量的に評価することができる。実際に、他の抗がん作用物質として抽出成分のルテオリン、抗体抗がん剤のハーセプチンを用いて、生存率および表面プラズモン共鳴角測定から時間変化率を算出したところ、前述の検量線と一致する結果が得られた。

Description

明 細 書
抗がん作用物質のスクリーニング方法及び装置
技術分野
[0001] 本発明は、杭がん作用物質等の生理活性成分に対する細胞応答を計測する方法 と装置に関するものであり、特に杭がん作用の有無を判定するスクリーニング方法と 装置に関するものである。
^景技術
[0002] 近年、森林資源の有効活用に向け様々な取り組みがなされており、その中でも特 に生理活性を有する抽出成分についてその有用性が期待されている。抽出成分の もつ多様な生理活性の評価法に求められるのは、汎用性の高レ、スクリーニング手法 であるが、一般には動物や培養細胞に対する投与実験が最も汎用性の高い手法と して用いられている。しかし、その活性を知るには多大な労力と時間が必要である。
[0003] 細胞動態のイメージ解析技術として近年確立されてきたものとして蛍光観察がある 。蛍光観察は、細胞内のリアルタイムの変化を可視化することができ、しかも対象とす る物質に対し特異性が高く反応機構を理解するのに非常に有効である。
[0004] 一方、表面プラズモン共鳴（SPR)という光学現象を利用したバイオセンサーは、分 子同士の結合などによる誘電率の変化を捉えることで広範な現象をリアルタイムで計 測することが可能なため、タンパク質の相互作用解析などで成果を上げている。 また、表面プラズモン共鳴角測定と蛍光観察とを同時に行なえるようにした複合装 置も提案されてレ、る（特開 2002-62255号公報参照。）。
[0005] 抗がん作用物質のスクリーニング又は細胞動態解析を行なう手段として、細胞増殖 試験のほか、特定分子の蛍光誘導体化による蛍光観察等が行なわれるが、測定に 長時間を要する問題がある。
また表面プラズモン共鳴法は細胞動態の解析方法として利用可能であるが、スクリ 一二ング方法としては利用されてレヽなレ、。
[0006] 本発明の目的は、抗がん作用物質に対するがん細胞の応答を迅速に求められるス クリーニング方法とその装置を提供することである。 発明の開示
[0007] 本発明者らは、がん細胞に抗がん作用物質を作用させたとき、その杭がん作用と、 表面プラズモン共鳴角の時間に対する変化率が安定している時間帯におけるその 変化率との間に相関関係があることを見出し、その関係を杭がん作用物質のスクリー ユングに利用して本発明をなすに至ったものである。
[0008] すなわち、本発明は目的とする試薬に抗がん作用があるか否力、、及びその有効濃 度を評価するスクリーニング方法であって、対象となるがん細胞を含む試料に目的と する試薬を作用させる工程と、前記試薬作用後の試料の表面プラズモン共鳴角を測 定する工程と、得られた表面プラズモン共鳴角の時間に対する変化率が安定してい る時間帯におけるその変化率を求める工程と、得られた表面プラズモン共鳴角変化 率に基づいて対象がん細胞に対する前記目的試薬の抗がん作用の程度を評価する 工程とを備えている。
[0009] 表面プラズモン共鳴角の時間に対する変化率が安定している時間帯とは、それより 長時間の時間帯における変化率と実質的に等しい変化率をもつ時間帯である。ここ で、「実質的に等しい」とは、 ± 10%以内で一致していることを意味している。
具体的には、その時間帯は対象となるがん細胞を含む試料に目的とする試薬を作 用させてから 25分経過後の適当な時間帯である。
[0010] 本発明ではスクリーニングのために必要な測定時間は表面プラズモン共鳴角変化 率を測定する時間だけである。その時間は例えば、 1分から 50分というような短時間 ですみ、迅速な処理を行なうことができる。そのため、複数の試料を用意しておき、そ の時間だけ順次表面プラズモン共鳴角測定を行なうようにすることにより、測定を自 動化することが容易である。
[0011] 表面プラズモン共鳴の測定は、プリズム用いた光を全反射させる方法のほか、回折 格子を用いて光の回折を利用する方法も使用することができる。
また、表面プラズモン共鳴の時間に対する変化の測定は、表面プラズモン共鳴角 の時間変化や、初期状態での表面プラズモン共鳴角における反射光強度の時間変 化などとして求めることができる。
[0012] ここで、表面プラズモン共鳴の原理を説明しておく。プリズムを用いた場合を説明す ると、表面プラズモン共鳴（SPR : Surface Plasmon Resonance)は、金属表面： ンをレーザー光などの光により得られるエバネッセント波を用いて共鳴励起すること で起こる現象である。エバネッセント波はプリズム内で全反射を起こすことによりその 反射面の反対側に発生させることができ、プリズム上に薄い金属層が存在するときェ バネッセント波は金属層を抜けて金属反対面の表面プラズモンを共鳴励起する。共 鳴を起こす条件を決定する要因として金属層と界面をなしている物質の誘電率等が あり、分子間相互作用には誘電率等の変化が伴うことから、これにより共鳴条件が決 定される。この時共鳴を誘起できるエバネッセント波の条件も変化するので、逆に共 鳴を誘起するエバネッセント波の条件の変化を知ることで誘電率の変化、ひレ、ては 分子同士の結合などを知ることができる。実際には、エバネッセント波の条件は入射 するレーザー光の入射角 Θにより変化する。入射角と反射角は等しぐ図 4 (B)に図 示されているように基板の法線に対する角度と定義する。共鳴現象が起こるとき、ェ バネッセント波は金属層上の物質により影響を受けるため、図 4 (A)に示すように、反 射光強度の急激な減衰が起こる。この反射光強度の変化を検出器により検出し、反 射光強度の減衰が起きた入射角度（共鳴角）をプロットしていくことにより、金属層上 の微小な領域における変化を知ることができる。
[0013] 表面プラズモン共鳴法はタンパク質の相互作用解析技術として幅広く用いられてい るが、通常は単分子膜などを金属薄膜表面に結合させることによりタンパク質を固定 化することで実用性、感度の向上を図っている。金属薄膜上に直接、細胞を培養し その細胞応答を測定した例も報告（Michihiro Hide, Tomoko Tsutsui, Analytical Biochemistry. 302, 28-37 (2002)参照。）されており、迅速、簡便、かつ in situでの糸田 胞応答を知ることのできる解析技術である。
[0014] スクリーニングにおける杭がん作用の程度の評価を定量ィ匕するためには、検量線を 用意しておくのが好ましい。そこで、対象がん細胞を含む試料に対し既知の抗がん 作用物質を作用させたときの杭がん作用の程度と表面プラズモン共鳴変化率との関 係を別途求めて検量線データとし、スクリーニングにおける評価工程ではその検量線 データに基づいて対象がん細胞に対する目的試薬の抗がん作用の程度を評価する ようにすればよい。 [0015] 検量線データを求めるための抗がん作用の程度を求めるために、対象がん細胞に 抗がん作用物質を作用させたことによるがん細胞の減少を細胞数の計数によって、 又は細胞からの蛍光の測定によって得ることができる。蛍光としては、細胞の自然蛍 光を利用できる場合もあるが、より高感度な測定を行なうためにはがん細胞を蛍光誘 導体化した蛍光試薬からの蛍光を測定するのが好ましい。
[0016] 本発明のスクリーニング方法を実現する装置は、図 1に示されるように、表面プラズ モン共鳴を測定する表面プラズモン共鳴測定装置（SPR) 2と、対象となるがん細胞 を含む試料に対し目的とする試薬を作用させた後の表面プラズモン共鳴測定装置 2 による所定の時間における表面プラズモン共鳴角の変化率を求める表面プラズモン 共鳴角変化率算出部 4と、表面プラズモン共鳴角変化率算出部 4が求めた表面ブラ ズモン共鳴角変化率に基づいて対象がん細胞に対する目的試薬の抗がん作用を評 価するスクリーニング部 8とを備えている。
[0017] スクリーニングにおける抗がん作用の程度の評価を定量ィ匕するためには、対象がん 細胞に対する抗がん作用の程度と表面プラズモン共鳴角変化率との関係を示す検 量線データを保持している検量線データ保持部 6をさらに備えていることが好ましい。 この場合、スクリーニング部 8は表面プラズモン共鳴角変化率算出部 4が求めた表面 プラズモン共鳴角変化率と検量線データ保持部 6に保持されている検量線データと に基づいて対象がん細胞に対する目的試薬の抗がん作用を評価する。
[0018] 表面プラズモン共鳴測定と同時に又は別個に細胞の動態計測を可能にするため に、図 2に示されるように、表面プラズモン共鳴測定装置 2は蛍光顕微鏡 10を一体と して備えたものであることが好ましレ、。
ここで、細胞の動態とは生体分子である核酸、タンパク質及び糖鎖、並びに化学成 分であるホルモンやリン酸などを指す。
[0019] 検量線データ保持部 6は、対象がん細胞に既知の抗がん作用物質を作用させたと きの、表面プラズモン共鳴角変化率算出部 4による結果と、杭がん作用物質を作用さ せたことによるがん細胞の減少を測定した結果とに基づいて別途求めた検量線デー タを保持することができる。
[0020] 検量線データ保持部 6はまた、対象がん細胞に既知の抗がん作用物質を作用させ たときの表面プラズモン共鳴角変化率算出部 4による結果と、対象がん細胞又は対 象がん細胞を蛍光誘導体化した蛍光試薬を励起こして発生した蛍光の強度を蛍光 顕微鏡 10で測定して抗がん作用物質を作用させたことによるがん細胞の減少を求め た結果とに基づいて作成した検量線データを保持することもできる。
[0021] 本発明のスクリーニング方法と装置は、対象となるがん細胞を含む試料に目的とす る試薬を作用させ、試薬作用後の試料の表面プラズモン共鳴角を測定してその時間 に対する変化率が安定している時間帯におけるその変化率を求めて対象がん細胞 に対する目的試薬の抗がん作用の程度を評価するようにしたので、スクリーニングの ために必要な測定時間は表面プラズモン共鳴角変化率を測定する時間だけですみ 、迅速な処理を行なうことができるようになる。
[0022] スクリーニングにおける杭がん作用の程度の評価を検量線を用いて行なうようにす れば、定量ィ匕することができる。
本発明のスクリーニング装置が表面プラズモン共鳴角測定装置と蛍光顕微鏡を一 体として備えたものとすれば、表面プラズモン共鳴角測定と細胞の動態計測をともに 行なうことができるようになる。
図面の簡単な説明
[0023] [図 1]本発明装置を概略的に示すブロック図である。
[図 2]本発明装置の他の形態を概略的に示すブロック図である。
[図 3]—実施例のスクリーニング装置を概略的に示す図である。
[図 4]表面プラズモン共鳴の原理を説明するための図であり、 (A)は反射率の入射角 依存性を示すグラフ、 (B)は入射角と反射角を示す図である。
[図 5]実施例で使用した試薬を示す化学構造式である。
[図 6]各試薬濃度と細胞の生存率の関係を示すグラフである。
[図 7]各試薬投与後の表面プラズモン共鳴信号の時間変化を示すグラフである。
[図 8]各試薬濃度と表面プラズモン共鳴信号変化率の関係を示すグラフである。
[図 9]細胞の生存率と表面プラズモン共鳴信号変化率の関係を示すグラフである。
[図 10]タエルセチン (試薬）とコントロールに対するがん細胞の応答を示す蛍光画像 である。 [図 11]トランス-レスベラトロール (試薬）とルチン (試薬）に対するがん細胞の応答を示 す蛍光画像である。
発明を実施するための最良の形態
[0024] 図 3は一実施例のスクリーニング装置を概略的に示す図である。表面プラズモン共 鳴は、試料台に設置されたセンサチップ 20に対し、入射光 24を全反射の条件で入 射させる光源 22と、その反射光 26を受光する受光装置 28を備え、入射光 24を全反 射させるために、プリズム 30を備えている。光源 22と受光装置 28はセンサチップ 20 の入射面の垂直線に対する入射角 Θと反射角 Θを同時に変化させて反射光 26の 強度変化を測定することにより表面プラズモン共鳴を検出するように走査機構に支持 されている。
[0025] センサチップ 20はガラス基板に金属層として、例えば金薄膜が蒸着などの方法に より形成されたものであり、その金属層上に試料として細胞 32が付着して設けられた ものである。その細胞 32に抗がん作用を評価しょうとする試薬が作用させられる。
[0026] この表面プラズモン共鳴装置には蛍光顕微鏡が一体として設けられている。 34は その蛍光顕微鏡の対物レンズであり、接眼レンズ 36によって目視観察できるようにな つている。蛍光顕微鏡は励起光源としてキセノンランプ（75W)を備え、励起波長と蛍 光検出波長を選択するそれぞれの分光器を備えている。蛍光像は CCDカメラなどの 撮像装置 38によって撮像することができ、視野内の細胞数を計数したり、表面プラズ モン共鳴の測定と同時、または別々に蛍光強度を検出したりできるようになつている。
[0027] 表面プラズモン共鳴装置の動作を制御して入射角と反射角 Θを変化させて表面プ ラズモン共鳴角を求めるために、制御装置 40が備えられている。制御装置 40はコン ピュータからなり、図 1及び図 2に示された表面プラズモン共鳴変化率算出部 4及び スクリーニング部 8の機能も実現しており、検量線データ保持部 6を実現する記憶装 置も備えている。また制御装置 40は、蛍光顕微鏡 10を介して細胞数を計数したり、 蛍光強度を検出したりする動作も制御して、検量線データを作成する機能も実現して いる。
[0028] (試薬の抗増殖作用評価）
試薬として抗増殖作用を有するとされている抽出成分タエルセチン（quercetin)、トラ ンス -レスべラトロール（trans-resveratrol)と、そのような抗増殖作用はないとされてレヽ るルチン (rutin)とをそれぞれヒト勝臓がん細胞に投与し、それにより得られる細胞応 答を表面プラズモン共鳴装置と蛍光顕微鏡により測定した。また、抗増殖作用を有す る抽出成分としてルテオリン (Luteolin)、臨床利用されている抗体杭がん剤としてハ ーセプチン (Here印 tin)の抗がん作用を増殖試験ならびに表面プラズモン共鳴測定 装置による測定から求め、クヱルセチン、レスべラトロール、ルチン、コントロールによ り得られた抗がん作用の検量線データと比較した。
[0029] 図 5にそれら 4種類の試薬の化学構造式を示す (ノヽーセプチンは抗体のため構造 式は省略する）。
供試細胞はヒト瞎臓ガン細胞（細胞株： MIA PaCa_2、ヒューマンサイエンス研究 資源バンクより入手）を用いた。培地として EMEM (Eagle's minimum essential medium)、血清として FBS (Fatal bovine serum)、その他抗生物質、非必須アミノ酸（ NEAA)等を用いた。直径 6cmのシャーレに培養され対数増殖期にある細胞を、 ED TA—トリプシンによりシャーレから剥離し、遠心により細胞を集めた後、 0.1 %トリパン ブルーにより染色し、血球計算盤を用いて細胞数を求め、 5 X 104cells/mlの細胞 濃度となるように調製して、継代した。
[0030] 継代後 24時間経過してから、それぞれ 10、 25、 50及び 100 μ Μのタエルセチン、 トランス-レスべラトロール及びルチンをそれぞれ含む培地と交換した。コントロールと して、試薬の溶解に用いた DMSO (dimethyl sulfoxide)を同濃度（0.1 %)培地に加 えたものを用意し、試薬を含む培地と同様に使用した。
[0031] 培地交換から 48時間後、継代時と同様にシャーレから EDTA—トリプシンにより糸田 胞を剥離し、遠心により集めてから 0.1 %トリパンブルーによる染色の後、血球計算盤 で細胞数を求めた。コントロールの細胞数を 100%として生存率を求めた。
[0032] 結果を図 6に示す。トランス-レスベラトロールによる抗増殖作用は濃度依存的な抗 増殖作用を示し、クヱルセチンによる抗増殖作用は 10 a M以下ではあまり認められ ないが、更に高い濃度では濃度依存的な抗増殖作用を示し、 50 μ Μ以上でほぼ横 ばレ、となった。ルチンには抗増殖作用はみられなレ、。
[0033] 報告によれば、クヱルセチンは実施例で用いた細胞株を含め、多くのがん細胞に 対し、アポトーシスを誘導することが分かっている（Michelle Mouria, Anna
S.Gukovskaya, Int. j. Cancer. 98， 761-769 (2002)及び Lung- Ta Lee, Ying- Tang Huang,. Anticancer Research. 22， 1615-1628 (2002)参照。）。しかしながら、図 6に示 したクヱルセチン濃度と細胞生存率の相関と、報告されているクヱルセチン濃度とァ ポトーシスした細胞数の相関を比較すると、必ずしも一致は見られず、この実施例で 得られた結果はアポトーシスに限らずクヱルセチンが供試細胞の増殖性に対し影響 しているものと推測される。
[0034] (表面プラズモン共鳴測定により細胞応答測定）
次に表面プラズモン共鳴測定により細胞応答測定を行なった。
上の測定と同様に継代された細胞を、細胞濃度 2 X 106cells/mlとなるように調製 し、金薄膜 (膜厚 50nm)が蒸着されたガラス基板（センサチップ）上に 100 μ 1滴下し 、 20時間、 37°C、 5% CO濃度下で培養した。
2
測定は、 1時間行なった。センサチップを図 3の装置の測定部にセットした後、直ち に培地を測定部に満たし測定を開始した。その 10分後に 10、 25、 50、 100 /i Mの タエルセチン、トランス-レスベラトロール及びルチンをそれぞれ含む培地と、コント口 ールとして DMSOを含む培地とに交換し、さらに 50分間測定を続けた。
[0035] 100 μ Μのタエルセチン、トランス-レスベラトロール及びルチンをそれぞれ含む培 地と交換したものの結果を図 7に示す。測定結果は、共鳴を励起する入射角度の測 定開始時からの時間変化として表した。タエルセチン、ルテオリンならびにトランス-レ スベラトロールについては、投与から数分後には明らかに表面プラズモン共鳴応答 に変化が見られた。それに対してルチンを含む培地の投与では変化が見られなかつ た。
[0036] 本発明では、迅速な測定を目的とするため、測定開始後、 2700— 3000秒 (45— 50分）の 5分間における表面プラズモン共鳴応答により得られたカーブの傾きを求め た。その時間領域は、表面 共鳴角の時間変化が安定してレ、る領域である 。その傾き、すなわち表面 唭鳴角の時間変化率と試薬濃度との相関を図 8 に示す。
[0037] 1時間以上の測定における表面 共鳴応答の変化量の大きさを比較して も同様の結果が得られたが、 目的の一つに挙げている迅速なスクリーニングという観 点から見た時、試薬投与後 1500— 3000秒（25— 50分）付近における表面プラズモ ン共鳴応答の傾きは、より長時間の測定による変化量の大きさを反映していることか ら、その時間帯における 1一 10分間、例えば 5分間という短時間の表面プラズモン共 鳴応答の変化に着目した。
[0038] 図 9に各濃度の試薬に対する生存率と表面プラズモン共鳴応答の傾きとの相関を 示す。図 9ではさらにルテオリンとハーセプチンの測定結果も追加した。細胞生存率 と表面プラズモン共鳴応答の傾きとの間には直線的な相関関係にあることがわかる。 この結果を検量線とすれば、所定の短時間での表面プラズモン共鳴応答の変化率 を測定することにより、細胞の生存率、すなわち抗がん作用を定量的に評価すること ができる。
[0039] (蛍光観察による細胞応答測定）
蛍光観察により細胞応答を解析する手段の一つとして、細胞内の pHの変化をモニ タリングする方法がある。一般的に、細胞に何らかの作用を及ぼす物質に対する細 胞の初期応答として、リン酸化やカルシウムイオン濃度の変化など、細胞内の pHに 変化を及ぼす現象が起こる。また特に、クヱルセチンおよびトランスレスべラトロール により誘導されるアポトーシスの初期過程として細胞内の pHが低下することが報告さ れてレヽる (Matsuyama, S. , Llopis, J" Deveraux, Q.L. , Tsien, R.Y. & Reed, J.し. Nature Cell Biol. 2， 318-325 (2000)参照）。このため、細胞応答を解析する一つの 指標として細胞内 pHの変化を pH感応性の蛍光指薬の蛍光強度変化として測定し た。
[0040] 上記の測定と同様に、 2 X 106cellsZmlの細胞懸濁液を、センサチップ上に 100 μ 1滴下し、 20時間、 37°C、 5% CO濃度下で培養した。
測定開始 1時間前に細胞活性の指示薬として pH感応性蛍光試薬である 5-(and-6)-Carboxy SNAFL-1 Diacetateを最終濃度 2 μ Mとなるように培地により調 製し、センサチップ上に 100 μ ΐ滴下した。その後 1時間培養条件下に置いてから再 び培地を交換して蛍光試薬を除いてから、測定を行なった。蛍光観察は、励起光源 にキセノンランプ（75W)を使用し、励起波長 460 500nm、検出波長 510 560η mで行なった。測定開始の 10分後に 100 /i Mのタエルセチン、トランスレスべラトロー ノレ、ルチン、又はコントロール培地にそれぞれ交換した。
[0041] 結果を図 10と図 11に示す。測定開始時 (0分）、スクリーニング指標となる時間帯で ある 45分経過時及び 50分経過時、並びに測定終了時 60分の蛍光像を示している。 コントロール培地の場合は変化がみられないのに対し、 ΙΟΟ μ Μのクヱルセチン、トラ ンス-レスべラトロールを投与した細胞では細胞内の酸性化にもとづく明らかな蛍光 強度の減少が観察され、杭がん作用を有する試薬に対する細胞応答が観察された。 同時に、この結果は、表面プラズモン共鳴による測定の結果が細胞応答を捉えたも のであることを裏付ける有力な証拠である。
[0042] 図 9の横軸の細胞生存率に対応するものとして、蛍光顕微鏡による蛍光強度を用 レ、ることもできる。その蛍光強度と表面プラズモン共鳴信号変化率との対応を求めて 図 9のような検量線を作成することもできる。
[0043] 実施例の測定から、抽出成分の生理活性評価において表面プラズモン共鳴による 測定は、 1分一 10分程度の短時間での測定により得られた結果で培養実験と良い相 関を示すことができ、し力も誘電率の変化など、広範な反応に対する汎用性の高い 測定対象を有していることから、汎用性の高さ、迅速性という点で非常に有力なスクリ 一二ング手法となる。
[0044] また、蛍光顕微鏡によって得られた結果は、表面プラズモン共鳴により得られた結 果を支持するだけにとどまらず、測定対象を変えることで抽出成分の生理活性をより 深く理解するための手段としても非常に有用である。
これらのことから、表面プラズモン共鳴と蛍光顕微鏡の組合わせはバイオ情報科学 装置として有用である。
産業上の利用可能性
[0045] 本願発明は、対象がん細胞に対する目的試薬の抗がん作用の程度を評価するスク リーユングに利用することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 対象となるがん細胞を含む試料に目的とする試薬を作用させる工程と、
前記試薬作用後の試料の表面プラズモン共鳴を測定する工程と、
得られた表面プラズモン共鳴角の時間に対する変化率が安定している時間帯にお けるその変化率を求める工程と、
得られた表面プラズモン共鳴角変化率に基づいて対象がん細胞に対する前記目 的試薬の抗がん作用の程度を評価する工程と、を備えたことを特徴とする抗がん作 用物質のスクリーニング方法。
[2] 表面プラズモン共鳴角の時間に対する変化率が安定している時間帯は、それより 長時間の時間帯における変化率と実質的に等しい変化率をもつ時間帯である請求 の範囲第 1項に記載のスクリーニング方法。
[3] 表面プラズモン共鳴角の時間に対する変化率が安定している時間帯は、対象とな るがん細胞を含む試料に目的とする試薬を作用させてから 25分経過後の適当な時 間帯である請求の範囲第 1項に記載のスクリーニング方法。
[4] 前記表面プラズモン共鳴角変化率は前記時間帯における 1分から 50分の時間に おける表面プラズモン共鳴角変化の勾配である請求の範囲第 1項に記載のスクリー ユング方法。
[5] 対象がん細胞を含む試料に対し既知の抗がん作用物質を作用させたときの抗がん 作用の程度と前記表面プラズモン共鳴角変化率との関係を別途求めて検量線デー タとし、前記評価工程では検量線データに基づいて対象がん細胞に対する目的試 薬の杭がん作用の程度を評価する請求の範囲第 1項に記載のスクリーニング方法。
[6] 検量線データを求めるための抗がん作用の程度を求めるために、対象がん細胞に 抗がん作用物質を作用させたことによるがん細胞の減少を細胞数の計数によって得 る請求の範囲第 5項に記載のスクリーニング方法。
[7] 検量線データを求めるための抗がん作用の程度を求めるために、対象がん細胞に 抗がん作用物質を作用させたことによるがん細胞の減少をがん細胞からの蛍光の測 定によって得る請求の範囲第 5項に記載のスクリーニング方法。
[8] 前記蛍光はがん細胞を蛍光誘導体化した蛍光試薬からの蛍光である請求の範囲 第 7項に記載のスクリーニング方法。
[9] 表面プラズモン共鳴を測定する表面プラズモン共鳴測定装置と、
対象となるがん細胞を含む試料に対し目的とする試薬を作用させた後の前記表面 プラズモン共鳴測定装置による所定の時間における表面プラズモン共鳴角の変化率 を求める表面プラズモン共鳴変化率算出部と、
前記表面プラズモン共鳴角変化率算出部が求めた表面プラズモン共鳴角変化率 に基づいて対象がん細胞に対する目的試薬の抗がん作用を評価するスクリーニング 部と、
を備えたことを特徴とする杭がん作用物質のスクリーニング装置。
[10] 対象がん細胞に対する抗がん作用の程度と表面プラズモン共鳴角変化率との関係 を示す検量線データを保持している検量線データ保持部をさらに備え、
前記スクリーニング部は前記表面プラズモン共鳴角変化率算出部が求めた表面プ ラズモン共鳴角変化率と前記検量線データ保持部に保持されている検量線データと に基づいて対象がん細胞に対する目的試薬の抗がん作用を評価するものである請 求の範囲第 9項に記載のスクリーニング装置。
[11] 前記表面プラズモン共鳴測定装置は蛍光顕微鏡を一体として備え、同一試料につ レ、て表面プラズモン共鳴と蛍光像をともに計測する機能を備えたものである請求の範 囲第 9項又は 10項に記載のスクリーニング装置。
[12] 前記検量線データ保持部は、対象がん細胞に既知の抗がん作用物質を作用させ たときの、前記表面プラズモン共鳴角変化率算出部による結果と、前記杭がん作用 物質を作用させたことによるがん細胞の減少を測定した結果とに基づいて別途求め た検量線データを保持する請求の範囲第 10項に記載のスクリーニング装置。
[13] 前記検量線データ保持部は、対象がん細胞に既知の杭がん作用物質を作用させ たときの前記表面プラズモン共鳴角変化率算出部による結果と、対象がん細胞又は 対象がん細胞を蛍光誘導体化した蛍光試薬を励起こして発生した蛍光の強度を前 記蛍光顕微鏡で測定して前記杭がん作用物質を作用させたことによるがん細胞の減 少を求めた結果とに基づいて作成した検量線データを保持する請求の範囲第 10項 に記載のスクリーニング装置。
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