JP5622215B2 - 周期構造を有するマイクロプレート、並びに、それを用いた表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡、蛍光マイクロプレートリーダーおよび特異的な抗原抗体反応の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance、以下ＳＰＲとも記す）によって発生する表面プラズモン共鳴光により、蛍光物質を励起して蛍光を発生させる表面プラズモン励起増強蛍光（Surface Plasmon Fluorescence）を用いた高感度蛍光顕微鏡およびマイクロプレートリーダーに関する。

汎用のエピ蛍光（落射蛍光）顕微鏡を用いて試料の蛍光観察を行う場合、暗くて十分に見えないときや、バックグラウンドが非常に高くて（明るくて）試料が十分に見えないときには、より高感度でＳ／Ｎの高い測定が必要とされる。これまでは全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）や、高分解能を特徴とする共焦点顕微鏡を用いて観測されてきた。

一方、表面プラズモン共鳴顕微鏡に関して、種々の論文や特許出願（下記特許文献１〜５参照）がなされており、装置として市販もされている。しかし、特許文献１〜５に開示されている基本光学系を応用して、蛍光顕微鏡であるＳＰＦＭ（Surface Plasmon Fluorescence Microscopy）を実現することは現状では不可能である。その理由は、市販の表面プラズモン共鳴顕微鏡では、入射光学系に高屈折率対物レンズを用いており、この対物レンズの屈折率の制限によって使用可能な光の波長が近赤外領域に制限されることになり、一般的な蛍光分子の励起光として用いることができないからである。

これに対し、下記特許文献６、７には、プリズムを用いた光学系をもつ表面プラズモン共鳴顕微鏡からＳＰＦＭへの展開が開示されている。

特開２００１−２４２０７１号公報 特開２００１−２５５２６７号公報 特開２００３−８３８８６号公報 特開２００４−１１７１８１号公報 特開２００６−３２８２号公報 特開平１０−３０７１４１号公報 特開２００６−２０８２９４号公報

上記したように、高感度・高分解能蛍光検出が可能な顕微鏡として、全反射顕微鏡、あるいは共焦点顕微鏡があるが、高出力レーザー等を装備していることが多く、光学系が複雑なシステムであり、そのため操作が複雑であり、且つ高価格であるという問題がある。

上記した特許文献６、７に開示されたＳＰＦＭに関しても、図１９に示すクレッチマン型の配置を採用しているために光学系が複雑であり、操作が複雑である問題がある。

一方、蛍光を観測するための別の装置として、マイクロプレートリーダーがある。従来のマイクロプレートリーダーで蛍光検出する場合、十分な強度の蛍光を発生させるためには、高濃度でかつ微量とは言えない程度の試料を準備する必要がある問題がある。

本発明は、上記の課題を解決すべく、単純な光学系を採用し操作が簡便であり、且つ低価格の高感度な蛍光検出を実現する表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。

また本発明は、既存の蛍光マイクロプレートリーダーよりも高感度な表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダーを提供することも目的とする。

本願発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、周期構造上に金属および消光抑制膜を調製した基板で発生した表面プラズモンを利用することによって、プリズムを使用しない高感度の蛍光顕微鏡および蛍光マイクロプレートリーダーを実現できることを見出した。

すなわち、本発明は、以下に示す態様を含むものである。

本発明に係る第１のマイクロプレートは、蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて使用され、観測対象の試料を搭載し、蛍光標識二次抗体を利用して特異的な抗原抗体反応を増強蛍光により検出するためのマイクロプレートであって、表面に周期構造を有するベース基板と、前記周期構造の上に形成された金属層と、前記金属層の上に形成された消光抑制層とを備え、前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、前記消光抑制層の表面に抗体が吸着あるいは結合されており、前記マイクロプレートに光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記消光抑制層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光が検出され、前記ベース基板側から入射される前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴としている。

また、本発明に係る第２のマイクロプレートは、第１のマイクロプレートにおいて、前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、５度から４６度の範囲内であることを特徴としている。

また、本発明に係る第３のマイクロプレートは、第２のマイクロプレートにおいて、前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、５度から２５度の範囲内であることを特徴としている。

また、本発明に係る第４のマイクロプレートは、第１のマイクロプレートにおいて、前記周期構造の周期が１０ｎｍ以上１μｍ以下であることを特徴としている。

また、本発明に係る第５のマイクロプレートは、第４のマイクロプレートにおいて、前記周期構造が、前記一方向と交差する方向に沿って形成された複数の溝部をさらに備えることを特徴としている。

また、本発明に係る第６のマイクロプレートは、第１〜５の何れかのマイクロプレートにおいて、前記消光抑制層の厚さが１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることを特徴としている。

また、本発明に係る第７のマイクロプレートは、第１〜６の何れかのマイクロプレートにおいて、前記金属層が遷移金属の膜厚１０〜５００ｎｍの薄膜で形成されていることを特徴としている。

また、本発明に係る第８のマイクロプレートは、第１〜７の何れかのマイクロプレートにおいて、前記ベース基板と前記金属層との間に、膜厚０．１〜３ｎｍの接着層を備え、前記金属層と前記消光抑制層との間に、膜厚０．１〜３ｎｍの接着および酸化防止層を備えていることを特徴としている。

また、本発明に係る第９のマイクロプレートは、第８のマイクロプレートにおいて、前記金属層が銀で形成され、前記消光抑制層がＳｉＯ₂で形成されていることを特徴としている。

また、本発明に係る第１０のマイクロプレートは、第９のマイクロプレートにおいて、前記消光抑制層の厚さが１０〜５０ｎｍであることを特徴としている。

また、本発明に係る第１１のマイクロプレートは、第１〜８の何れかのマイクロプレートにおいて、前記金属層が金で形成され、前記消光抑制層の厚さが１０〜７０ｎｍであることを特徴としている。

また、本発明に係る第１２のマイクロプレートは、第４のマイクロプレートにおいて、前記ベース基板の表面の前記周期構造が、矩形の周期構造であり、前記金属層が、矩形の段差部分に対応する表面に前記スロープを有し、厚さ２００ｎｍに形成され、前記周期に対する前記スロープの長さの割合が１０±５％であり、前記溝部の深さをｄｎｍとし、前記周期に対する山の長さの割合をＭ％として、５≦ｄ＜１５、且つ、０＜Ｍ＜７０、若しくは７０＜Ｍ＜１００、１５≦ｄ＜２５、且つ、０＜Ｍ＜８０、若しくは８０＜Ｍ＜１００、２５≦ｄ＜３５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００、または、３５≦ｄ＜４５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００であることを特徴としている。

また、本発明に係る第１３のマイクロプレートは、第１〜１２の何れかのマイクロプレートにおいて、前記マイクロプレートの前記消光抑制層の表面に、蛋白質または細胞を吸着または結合させるために、前記消光抑制層の前記表面にアミノ化またはアルキル化の処理が施されることを特徴としている。

また、本発明に係る第１４のマイクロプレートは、第１３のマイクロプレートにおいて、前記マイクロプレートの前記消光抑制層の表面が、さらに末端が活性エステル化カルボキシル基で修飾されたビオチン化ポリエチレングリコールと反応させられ、ストレプトアビジンを含む蛍光標識抗原または抗体との結合の検出に使用されることを特徴としている。

本発明に係る第１の検出方法は、蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて、マイクロプレートを用いて、蛍光標識二次抗体を利用して特異的な抗原抗体反応を増強蛍光により検出する方法であって、前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、前記周期構造の上に形成された金属層と、前記金属層の上に形成された消光抑制層とを備え、前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、前記消光抑制層の表面に抗体が吸着あるいは結合されており、前記方法が、前記マイクロプレートに光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記消光抑制層側のいずれかから検出するステップとを含み、前記ベース基板側から入射される前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴としている。

また、本発明に係る第２の検出方法は、第１の検出方法において、前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、５度から４６度の範囲内であることを特徴としている。

また、本発明に係る第３の検出方法は、第２の検出方法において、前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、５度から２５度の範囲内であることを特徴としている。

また、本発明に係る第１の表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡は、観測対象の試料を搭載し、蛍光標識二次抗体を利用して特異的な抗原抗体反応を増強蛍光により検出するためのマイクロプレートを有する蛍光顕微鏡であって、前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、該ベース基板の前記周期構造の上に形成された金属層と、該金属層の上に形成された消光抑制層とを備え、前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、前記消光抑制層の表面に抗体が吸着あるいは結合されており、前記マイクロプレートが、前記マイクロプレートに光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、発生させた該電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記消光抑制層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光が検出され、前記ベース基板側から入射される前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴としている。

また、本発明に係る第２の蛍光顕微鏡は、第１の蛍光顕微鏡において、前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、５度から４６度の範囲内であることを特徴としている。

また、本発明に係る第３の蛍光顕微鏡は、第２の蛍光顕微鏡において、前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、５度から２５度の範囲内であることを特徴としている。

また、本発明に係る第１の表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダーは、観測対象の試料を搭載し、蛍光標識二次抗体を利用して特異的な抗原抗体反応を増強蛍光により検出するためのマイクロプレートを有する蛍光マイクロプレートリーダーであって、前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、該ベース基板の前記周期構造の上に形成された金属層と、該金属層の上に形成された消光抑制層とを備え、前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、前記消光抑制層の表面に抗体が吸着あるいは結合されており、前記マイクロプレートが、前記マイクロプレートに光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、発生させた該電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記消光抑制層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光が検出され、前記ベース基板側から入射される前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光が発生する程度に小さい角度であることを特徴としている。

また、本発明に係る第２の蛍光マイクロプレートリーダーは、第１の蛍光マイクロプレートリーダーにおいて、前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、５度から４６度の範囲内であることを特徴としている。

また、本発明に係る第３の蛍光マイクロプレートリーダーは、第２の蛍光マイクロプレートリーダーにおいて、前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、５度から２５度の範囲内であることを特徴としている。

本発明によれば、クレッチマン型のようなプリズムを使用することなく、光の入射角度を小さくすることができるので、従来の落射照明または透過照明を採用した正立または倒立蛍光顕微鏡の何れをも使用することができる。従って、操作が簡単であり、ＮＡの小さい対物レンズを使用することができ、明るい蛍光観測が可能である。

また、蛍光観察において空間選択性を高くすること、即ち、マイクロプレート界面だけ（マイクロプレート表面から２００ｎｍ未満の範囲）を観測することができるので、バックグラウンドによるノイズの影響をほとんど受けず、検体の注入後、リンス（洗浄）操作をせずに計測することが可能である
また、マイクロプレート界面の表面プラズモン共鳴光は入射光強度の１００倍以上に増強されるので、高出力のレーザーを用いる必要がなく、ランプ光源でも既存のエピ蛍光顕微鏡よりも１００倍程度明るい蛍光を観測することができる。

また、ランプ光源を用いることで、適当な光学フィルターを選択することで広範囲に波長選択可能になるので、レーザーを装備した顕微鏡に比べてコンパクトであり、低価格である。

従来の全反射顕微鏡、あるいは共焦点顕微鏡では、高出力レーザー等を装備していることが多く、また、光学系が複雑なシステムであり、操作の複雑性と高価格が問題となり、一般に広く普及することが難しい状況であったが、本発明によると、これらの問題を解決することができるので、汎用型の高感度蛍光顕微鏡として普及することが期待できる。特に、蛍光標識を行って試料を観測する医療・生物分野の普及に大きく貢献することが期待できる。

また、本発明を蛍光マイクロプレートリーダーに適用した場合、蛍光の増幅が期待でき、照明の入射角も低角でよいため、既存のマイクロプレートリーダーでも、低濃度試料や極微量試料の測定が可能となる。

また、本発明のマイクロプレートは、特異的な抗原抗体反応を検出するのに有効である。即ち、マイクロプレートの消光抑制層の表面に抗体を吸着あるいは結合させ、リンス操作を行うことなく、蛍光標識二次抗体を利用して特異的な抗原抗体反応を増強蛍光により検出することができる。

本発明の対象である蛍光顕微鏡における、照明光の入射方向と蛍光の観測方向との可能な組み合わせを示す図である。 本発明の実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡の光学配置の一例を示す図である。 本発明の実施の形態に係るマイクロプレートの構成を示す断面図である。 入射光の偏光方向と格子の方向との関係を示す図である。 入射光の偏光方向と格子の方向との関係を示す図であり、マイクロプレートが図４の状態から９０度回転されて配置されている。 ２次元周期構造を示す平面図である。 本発明の実施の形態に係る蛍光マイクロプレートリーダー用のマイクロプレートの構成を示す断面図および平面図である。 周期構造基板において、入射角に依存する反射率計測の結果を示すグラフであり、消光抑制層側から光を入射した場合とベース基板側からの入射した場合の両方の結果を示している。 入射光の偏光面と格子の方向との関係を示す図である。 ベース基板表面の周期構造を示す断面図である。 基板１及び基板２に関する測定結果を示すグラフである。 スロープを有する周期構造を示す断面図である。 シミュレーション結果を示すグラフである。 スロープを有しない周期構造を示す断面図である。 顕微鏡写真であり、（ａ）は、透過照明によるCy５−蛍光標識蛋白質結合ビーズの正立蛍光顕微鏡観察結果を示し、（ｂ）落射照明によるＤｉＩ蛍光標識細胞の倒立蛍光顕微鏡観察結果を示す。 基板表面を化学処理した際の蛋白質の吸着量を表面プラズモン共鳴法により計測した結果を示すグラフである。 周期構造のあるマイクロプレートに、蛍光標識蛋白が特異的に結合した基板と非特異吸着した基板（コントロール）における、入射角に依存した反射率と蛍光強度の計測結果を示すグラフである。 入射光の方向と蛍光の観測方向による観測される蛍光強度の違いについて検証した結果を示すグラフである。 クレッチマン型の光学配置を示す断面図である。

以下に、添付の図面を参照して本発明の実施の形態について詳細に説明する。

まず、蛍光顕微鏡には、図１に示したように、観測対象Ａに対する照明光Ｌiの入射方向および蛍光Ｌｐの観測方向の組み合わせに応じて４種類がある。具体的には、次の通りである。
落射型正立顕微鏡の場合、照明光の入射方向がＩＮ１であり、観測方向がＴである
落射型倒立顕微鏡の場合、照明光の入射方向がＩＮ２であり、観測方向がＢである。
透過型正立顕微鏡の場合、照明光の入射方向がＩＮ２であり、観測方向がＴである。
透過型倒立顕微鏡の場合、照明光の入射方向がＩＮ１であり、観測方向がＢである。
本発明はこれら全てを対象とするが、以下では、説明を簡潔にするために、適宜これらの一部について説明する。

図２は、本発明の実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡（以下、ＳＰＦＭという）の一例を示す図である。図２に示したＳＰＦＭ１は、顕微鏡本体（以下、本体という）２と、顕微鏡ステージ（以下、ステージという）３の上に搭載されるマイクロプレート４とを備えている。図２では、マイクロプレート４の上に試料Ａが搭載され、照明光Ｌｉが下から入射し、観測光（プラズモン励起増強蛍光）Ｌｐが上から観測される様子を示している。即ち、図２のＳＰＦＭ１は、透過型正立顕微鏡に分類される。

本ＳＰＦＭ１は、マイクロプレート４に特徴を有し、それ以外の蛍光顕微鏡として機能する上で必要な、本体２の構成要素は従来の蛍光顕微鏡と同じである。即ち、本体２の構成要素である光源、対物レンズ、接眼レンズ、干渉ミラー（ダイクロイックミラー）、干渉フィルター（励起フィルター）、蛍光フィルターなどは、公知の蛍光顕微鏡と同じものを使用する。従って、それらに関する説明を省略する。

図３は、本実施の形態に係るマイクロプレート４の構成を示す断面図である。マイクロプレート４は、ベース基板５と、ベース基板５の表面に形成された金属層６および消光抑制層７とを備えて構成されている。なお、図３では省略しているが、ベース基板５と金属層６との間、金属層６と消光抑制層７との間には、それぞれ、隣接する２つの層を接着するための層（以下、接着層という）を備えていることが好ましい。

ベース基板５は、表面に周期的構造である格子が形成されている。ベース基板５は、入射光Ｌｉおよび観測光Ｌｐに対して透明な材質、例えばガラス、プラスチックなどで形成されていれば、落射および透過型の何れの蛍光顕微鏡観察においても使用できる。落射の観察に限るのであれば、ベース基板５は透明である必要はない。周期構造は、例えば一方向に沿ってほぼ等間隔に配置された複数の溝を有する形状であり、溝は、例えば鋸歯状溝、正弦波状溝、矩形状溝である。周期構造の周期、即ち隣接する溝の間隔は、観察に使用する波長以下、例えば１０〜１０００ｎｍ（ナノメートル）であり、好ましくは１００〜６００ｎｍである。周期構造の高さ（溝の深さ）は４〜４００ｎｍ、アスペクト比は０．００５〜１０である。

なお、ナノスケールの周期構造をもつ周期構造は、例えば、特許第３３５０７１１号公報、特許第２８３２３３７号公報、特開２００４−１１７８１０号公報などに開示されている方法を使用して形成することができる。

金属層６は、金、銀、銅、プラチナ、ニッケルなどの遷移金属であることが好ましい。金属層６の膜厚は、１０〜５００ｎｍが好ましく、より好ましくは５０〜２００ｎｍである。しかし、金属層６は、遷移金属に限定されず、表面プラズモンを発生可能な金属であればよく、その場合にも膜厚は１０〜５００ｎｍが好ましく、より好ましくは５０〜２００ｎｍである。

消光抑制層７には、ポリカーボネートやポリメタクリル酸メチルのような有機高分子やシリカ（ＳｉＯ₂）など、観察に用いる入射光や発生する蛍光の波長領域で吸収のない（若しくは吸収の少ない）透明な薄膜を用いる。表面プラズモン励起増強蛍光法の特徴である増強蛍光は、蛍光分子と金属との距離が近いと、強い励起場で励起された蛍光も金属表面にエネルギー移動して消光されてしまう。従って、試料を金属層６から所定距離だけ離隔させて消光を抑制することが必要である。また、表面プラズモン共鳴による励起場は近接場であるために、金属表面から離れるにしたがってその電場強度は減衰するため、金属表面からおよそ１００ｎｍ以内に存在する蛍光分子のみが効率よく励起される。そのために、消光抑制層７の膜厚は、約１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲で金属層６の種類に応じて決定される。たとえば、膜厚の最適値は、金属層６が銀の場合１０〜５０ｎｍであり、より好ましくは２０〜５０ｎｍである。金の場合、膜厚の最適値は１０〜７０ｎｍであり、より好ましくは４０〜７０ｎｍである。

試料を含む水溶液（燐酸緩衝液など）をマイクロプレート４上に搭載して観測する場合が想定される。従って、金属層６に銀を使用する場合には、水中で非常に不安定な銀を保護するために、ベース基板５と銀との間および銀と消光抑制層７（例えば、ＳｉＯ₂）との間に、酸化を防止する層（以下、酸化防止層という）を形成することが望ましい。なお、酸化防止層は、少なくとも銀と消光抑制層７との間にあればよい。例えば、ベース基板５と銀との間に接着層として機能する第１層を形成し、銀と消光抑制層７との間に接着および酸化防止層として機能する第２層を形成する。例えば、第１層および第２層は、それぞれ膜厚０．１〜３ｎｍの薄膜として形成される。第２層は、銀を保護できる材質の層であればよく、例えばクロム（Ｃｒ）、アルミニウム、チタン、パラジウムで形成される。なお、第２層は消光抑制層７の接着性を高める役割をもする材質が望ましく、この意味でもクロム（Ｃｒ）が適している。

次に、図４を参照して、入射光の偏光方向と周期構造の方向との関係について説明する。図４は、周期構造が形成された平面の一方から光が入射することを示しており、上からの入射に限定されることを意味する訳ではない。表面プラズモン共鳴光の発生には、ｐ偏光の光が必要である。また、周期構造の配置との関係では、ｐ偏光が、周期構造の方向（格子の溝に垂直な方向）の成分を含んでいることが必要である。

図４の（ａ）は、マイクロプレート４に光が入射する状態を示す斜視図であり、（ｂ）はその平面図である。平面Ｕ１、Ｕ２は、マイクロプレート４の表面に垂直であり、且つマイクロプレート４表面に形成された格子８の方向（格子の溝に垂直な方向）Ｖ１と平行な平面Ｕ１と、それに直交する平面Ｕ２である。入射光Ｌ１、Ｌ２は、光源から出力され、対物レンズによって円錐形に集光されてマイクロプレート４に入射する光のうち、それぞれ平面Ｕ１内、Ｕ２内を進行する光である。ここで、入射光Ｌ１、Ｌ２は、偏光フィルターなどによる偏光を受けていない光であるとする。従って、マイクロプレート４に対する入射光Ｌ１、Ｌ２のｐ偏光成分Ｖ２、Ｖ３の成分のうちＶ１と平行な成分によって表面プラズモン共鳴光が発生する。このように、マイクロプレート４への入射光が偏光していない場合、マイクロプレート４の表面に形成された格子８の方向Ｖ１に平行な成分をもつ入射光のｐ偏光によって表面プラズモン共鳴光が発生する。

その一方、入射光が偏光フィルターなどによって所定の方向に偏光されている場合、マイクロプレート４の配置によっては、表面プラズモン共鳴光がほとんど発生しない場合がある。図５は、図４と同様の斜視図であるが、マイクロプレート４が図４の状態から９０度回転されて配置されている。また、図５では、偏光フィルターなどによって偏光軸Ｓの入射光が対物レンズによって円錐形に集光されているが、平面Ｕ１およびＵ２内を伝播する光Ｌ１、Ｌ２に対しては、平面Ｕ１の面内方向と、平面Ｕ２に対する法線方向にそれぞれ偏光（Ｖ２とＶ４）されることとなる。この場合、ｐ偏光成分Ｖ２が格子の方向Ｖ１と直交しており、Ｖ４はマイクロプレート４に対してｓ偏光になるため、光Ｌ１、Ｌ２の何れによっても表面プラズモン共鳴光が発生しない。Ｌ１、Ｌ２以外の入射光に対してもｐ偏光性とＶ１との平行性が低いために効率よく表面プラズモン共鳴光は発生しない。よって、図５のような偏光軸の入射光と格子の配置では、明るい蛍光画像は得られない。

従来の蛍光顕微鏡において、偏光子を挿入しなくとも、通常組み込まれているフィルターセットの中に偏光依存性のある素子（ダイクロイックミラーなど）が含まれている場合、上記したように表面プラズモン共鳴光が効率よく発生するように、マイクロプレート４の配置、即ち格子の方向を調節することが必要である。

以上、本発明の実施の形態を、蛍光顕微鏡に適用する場合について説明したが、本発明は上記の実施の形態に限定されず、種々変更して実施することができる。特に、本発明のマイクロプレートは、落射型正立顕微鏡、落射型倒立顕微鏡、透過型正立顕微鏡、透過型倒立顕微鏡の何れの蛍光顕微鏡においても使用され得ることを明記しておく。また、本発明は、蛍光マイクロプレートリーダーに対しても同様に適用可能である。

また、周期構造の形状は、上記した一方向に溝を有する形状に限定されず、図６に示すような、ベース基板５’の表面に交差する２方向に溝を形成した２次元周期構造や円形（フレネル）の周期構造であってもよい。図６は、２次元周期構造が形成されたベース基板５’の平面図である。ベース基板５’の表面には、複数の溝部９が直交する２方向に、即ち凸部１０が直交する２方向に配列している。なお、溝９を形成する２方向は、直交していなくてもよく、斜めであってもよい。

２次元周期構造が形成されたベース基板を用いる場合、偏光した入射光を使用する場合にも、マイクロプレートの配置による蛍光強度への影響を小さくすることができる。また、偏光していない光を使用する場合、入射光の利用効率が高くなり、より明るい蛍光を観測することができる。

蛍光マイクロプレートリーダーに使用する本発明に係るマイクロプレートに関しては、図７（上側は縦断面図、下側は平面図）に示したように、ベース基板５表面上の、アレイ状に配置された複数の領域１１に周期構造を形成した後、ベース基板５の上に金属層６、消光抑制層７を順に形成すればよい。このとき、全ての領域１１において周期構造の溝を同じ方向になるように形成することが望ましい。蛍光マイクロプレートリーダーで観測する場合、これらの複数の領域１１の上に微量の試料をスポッティングして観測する。

また、図７では、ベース基板５の表面全体に金属層６および消光抑制層７を形成しているが、これに限定されず、少なくとも周期構造が形成された領域１１の上に金属層６および消光抑制層７が形成されていればよい。また、各領域１１に、図６に示した２次元周期構造を形成してもよい。

以下に、実施例を示し、本発明の特徴をさらに明らかにする。

ベース基板としてガラス基板を使用し、その表面に観測波長オーダー以下の周期構造（周期：４８０ｎｍ、深さ：３１ｎｍ、Ｍ：４０％（図１０参照、詳細は後述する））をもつ格子を形成し、さらにその上に接着層（Ｃｒ、膜厚０．３ｎｍ）、金属薄膜（銀、膜厚１００ｎｍ）、接着および酸化防止層（Ｃｒ、膜厚１ｎｍ）、消光抑制層（ＳｉＯ₂、膜厚２０ｎｍ）をスパッター法により形成してマイクロプレートを製作した。コントロール（比較対照）として周期構造のないスライドガラスにも同様に成膜した。

波長６３２．８ｎｍのｐ偏光入射光をベース基板側または消光抑制層側から入射して観測したマイクロプレートの反射率（即ち、落射で観測）の結果を図８に示す。入射光の偏光面と格子の方向Ｖ１との関係は平行である。図８では、ベース基板側からの入射による反射率カーブを点線で、消光抑制層側からの入射による反射率カーブを実線で描いている。

図８のグラフから、周期構造基板のベース基板側からの入射、および消光抑制層側からの入射、どちらにおいても表面プラズモン共鳴光の発生が観測できることが分かる。図８では、ベース基板側からの入射でΨ＝０（度）、φ＝２２（度）である場合に、表面プラズモン共鳴光が最も強く発生しており、消光抑制層側からの入射ではΨ＝０（度）、φ＝１６（度）で表面プラズモン共鳴光が最も強く発生している（Ψは、図９に示したように、入射光の偏光面と格子の方向の成す角度である）。従って、ＮＡの小さい対物レンズでも十分明るい蛍光観測が可能になることを示唆している。その一方で、このような表面プラズモン共鳴光が効率よく発生するのはｐ偏光入射光のときのみならず、角度Ψ回転させた光を用いて入射した場合にも発生させることができる。コントロールの周期構造のない基板では、入射角に依存せず、すべて８０％以上の反射率（従って、表面プラズモン共鳴光の観測が難しい）を示した。

よって、図８の結果から、マイクロプレートのどちら側から光を入射しても、表面プラズモン共鳴場を発生させ得ることがわかった。実際には、試料を搭載したマイクロプレートの配置および入射光の角度を調節し、最適状態を決定することが望ましい。

さらに本願発明者は、類似した周期構造を形成した基板を用いても、増強蛍光効果を生じさせる表面プラズモン共鳴場を発生しない基板が存在することを見出した。これについて、実験結果とシミュレーション結果との比較検討を行い、表面プラズモン共鳴発生の条件として、周期構造のデューティ比（duty ratio）、溝部の深さ、形状が重要であることを見出した。そして、シミュレーションにより、これら条件の望ましい範囲を決定することができた。以下に、具体的に説明する。

（１）まず、類似した周期構造をもつ次の２枚のベース基板（ＳｉＯ_２）を用いて、スパッター法により、ベース基板の周期構造上に金属層および消光抑制層を調製してマイクロプレートを製作した。具体的には、周期構造の上に約200nmの厚さで銀薄膜を形成し、さらにその上に約20nmの厚さで消光抑制層としてＳｉＯ_２を形成した。そして、これらのマイクロプレートを用いて、実施例１と同様に表面プラズモン共鳴を観測した。
基板１：周期が480nm、溝部の深さが31nm、デューティ比が0.4
基板２：周期が480nm、溝部の深さが39nm、デューティ比が0.54
ここで、ベース基板表面の周期構造は、断面形状が図１０に示した矩形状である。デューティ比は、周期に対する凸部の長さの割合をＭ％、周期に対する凹部の長さの割合をＶ％として、Ｍ／（Ｍ＋Ｖ）である。

観測結果を図１１に示す。図１１の（ａ）、（ｂ）は、それぞれ基板１及び基板２に関する観測結果である。図１１から分かるように、基板１では表面プラズモン共鳴が観測されたが、基板２では表面プラズモン共鳴が観測されなかった。

基板１、２を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で検査したところ、ベース基板表面は矩形状の周期構造であるが、その上に形成された金属層の表面は、図１２に示すように周期構造の段差部分に対応する部分が傾斜（以下、この部分をスロープという）していることが分かった。図１２では、金属層の上の消光抑制層は省略している。周期構造の山（Ｍ％）、谷（Ｖ％）、スロープ（ＳＬ％）の比率は、基板１に関してはＶ：Ｍ：ＳＬ＝33：39：14であり、基板２に関してはＶ：Ｍ：ＳＬ＝24：60：8であった。

そこで、公知の厳密結合波解析（ＲＣＷＡ）によるシミュレーションを行った。その結果を図１３に示す。図１３の（ａ）、（ｂ）は、それぞれ基板１、２に関するシミュレーション結果であり、実験データである図１１の（ａ）、（ｂ）を再現できていることが分かる。なお、シミュレーションは、実際のマイクロプレートとは異なり、銀薄膜の上に形成されたＳｉＯ_２が銀薄膜の平らな山及び谷のみに存在し、スロープ上には存在しない条件で行った。

（２）次に、図１２に示した形状において、周期構造の山（Ｍ％）、谷（Ｖ％）、スロープ（ＳＬ％）の比率を変化させて、厳密結合波解析（ＲＣＷＡ）によるシミュレーションを行った。

その結果、次のことが分かった。
i） 図１４のように表面がほぼ垂直なスロープ（傾斜角度αが90度）をもつ周期構造では、表面プラズモン共鳴はデューティ比に敏感に依存し、プラズモン共鳴場が発生する条件が制限されるが、図１２のような表面にスロープ（高さ１０〜５０ｎｍ、且つＳＬ＝４０〜１００ｎｍ、即ち傾斜角度αが６〜５０度）のある構造では、表面プラズモン共鳴発生のデューティ比への依存度が小さく、限られた一部の条件でプラズモン共鳴が発生しないことが分かった。特にスロープの傾斜が緩い程、表面プラズモン共鳴のデューティ比への依存度は小さくなる。
ii） 金属層表面にスロープをもたせた構造にすることで、表面プラズモン共鳴の溝部の深さへの依存度も軽減される。
iii） 表面プラズモン共鳴は周期にはあまり依存しない。

金属層（特に銀薄膜）の厚さが約２００ｎｍの場合の望ましい条件を具体的に示せば、次のとおりである。
金属層表面にスロープが無く垂直な段差が形成されている（α＝９０°）場合、ベース基板の凹部の深さをｄ（ｎｍ）として、
ｄ＝１０±５（５以上１５未満）、且つ、１５≦Ｍ＜４５、４５＜Ｍ＜８５、若しくは８５＜Ｍ＜１００、
ｄ＝２０±５（１５以上２５未満）、且つ、１０≦Ｍ＜１００、
ｄ＝３０±５（２５以上３５未満）、且つ、１０≦Ｍ≦４０、６０≦Ｍ≦７０、若しくは７５≦Ｍ≦９５、
ｄ＝４０±５（３５以上４５未満）、且つ、０＜Ｍ≦４０、４５≦Ｍ≦５５、若しくは６０≦Ｍ≦７０
である。
金属層表面がスロープを有し（α＜９０°）、ＳＬ＝１０±５の場合（ベース基板はα＝９０°）、ベース基板の凹部の深さをｄ（ｎｍ）として、
ｄ＝１０±５（５ｎｍ以上１５ｎｍ未満、即ちαが約１２度）、且つ、０＜Ｍ＜７０、または７０＜Ｍ＜１００
ｄ＝２０±５（１５ｎｍ以上２５ｎｍ未満、即ちαが約２３度）、且つ、０＜Ｍ＜８０、または８０＜Ｍ＜１００
ｄ＝３０±５（２５ｎｍ以上３５ｎｍ未満、即ちαが約３２度）、且つ、０＜Ｍ＜６０、または６０＜Ｍ＜１００
ｄ＝３０±５（３５ｎｍ以上５５ｎｍ未満、即ちαが約４０度）、且つ、０＜Ｍ＜６０、または６０＜Ｍ＜１００
である。

周期構造（周期：４８０ｎｍ、深さ：３１ｎｍ、Ｍ：４０％）を形成したガラスの上に接着層(Ｃｒ、膜厚０．３ｎｍ)、金属薄膜（銀、膜厚１００ｎｍ）、接着および酸化防止層（Ｃｒ、膜厚１ｎｍ）、消光抑制層（ＳｉＯ₂、膜厚２０ｎｍ）を成膜し、消光抑制層の表面を１％アミノプロピルトリエトキシシランによってアミノ化したものを調製した。試料として、Ｃｙ５蛍光標識蛋白（ストレプトアビジン）で結合されたビオチン化マイクロビーズを基板に吸着させて透過型正立顕微鏡で蛍光観測した。また、ＤｉＩ蛍光標識された細胞を基板に吸着させて落射型倒立顕微鏡で蛍光観測した。蛍光観測においては、どちらもハロゲンランプを用い、フィルターとして前者では発光側にＣｙ５用フィルター、入射側に６３３ｎｍ干渉フィルターを挿入し、後者ではＣｙ３フィルターキューブを用いた。

観測結果を図１５に示す。図１５の（ａ）が透過型正立顕微鏡で観察したビーズの蛍光像、図１５の（ｂ）が落射型倒立顕微鏡による細胞の蛍光像である。このように、周期構造マイクロプレートに吸着した細胞からの増強蛍光が観測された。

実施例３では、周期構造基板上に金属膜などを成膜し、さらにその表面をアミノ化して顕微鏡観測用のプレートとして利用したが、これは蛋白質を吸着させやすくするための基板表面処理である。ここでは、ＬａＳＦＮ９（ドイツ・ヘルマ社）という高屈折率ガラス基板上に膜厚４８ｎｍの金を成膜し、末端がメルカプト基の下記６種類のチオール化合物の数μＭ（マイクロモラー（モラー＝モル／リットル））エタノール溶液に１５分〜１時間浸漬後洗浄して、消光抑制層の表面を修飾した。チオール化合物は以下のとおりである。
（１）メルカプト−ポリエチレングリコール（末端ヒドロキシル基）
（２）メルカプト−ポリエチレングリコールカルボン酸（末端カルボキシル基）
（３）メルカプト−ウンデカノール（末端ヒドロキシル基）
（４）メルカプト−ドデカン（末端メチル基）
（５）メルカプト−アミノウンデカン（末端アミノ基）
（６）メルカプト−ビオチン化ポリエチレングリコール（末端ビオチン）
表面に数μＭの蛋白質ストレプトアビジン溶液を注入して、その吸着量を図１９に示すようなプリズムカップリング表面プラズモン共鳴法（クレッチマン型）により、評価した。その結果が図１６である。

表面がヒドロキシル基やカルボキシル基の場合には、ほとんど蛋白質は吸着しないが、メチル基（アルキル化表面）では特異的結合の６割強、アミノ化表面では９割強の吸着がおこっている。よって、表面の構造をアルキル化、好ましくはアミノ化することで、観察する蛋白質や細胞をより高密度に結合あるいは吸着させることが可能なプレートにすることができることがわかった。

ベース基板として厚さ１ｍｍのプラスチック基板を使用し、その表面に観測波長オーダー以下の周期構造（周期：４８０ｎｍ、深さ：３０ｎｍ、Ｍ：４５％）をもつ格子を形成し、さらにその上に接着層（Ｃｒ、膜厚０．３ｎｍ）金属薄膜（銀、膜厚１００ｎｍ）、接着および酸化防止層（Ｃｒ、膜厚１ｎｍ）、消光抑制層（ＳｉＯ₂、膜厚２０ｎｍ）を形成してマイクロプレートを製作した。

消光抑制層表面を１％アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液で化学処理（室温で４０分間）し、さらに末端が活性エステル化カルボキシル基で修飾されたビオチン化ポリエチレングリコール２ｍＭりん酸緩衝溶液を滴下し、約１時間インキュベートしアミノ基と反応させてミリＱ水にて洗浄した。

このビオチン化基板表面に両面テープで径１５ｍｍのカバーガラスをとりつけ、ここへ８ｎＭ（ナノモラー）蛍光標識蛋白質（Ｃｙ５−ストレプトアビジン）りん酸緩衝水溶液２０μＬ（マイクロリットル）を注入し、蛋白質を表面に結合させ、リンス（洗浄）操作なしで、入射角に対する反射率および蛍光強度を計測する装置にセットした。またコントロールとして、２０ｎＭ蛍光標識蛋白質（Ｃｙ５−抗ＧＦＰ抗体）りん酸緩衝水溶液２０μＬを注入し、蛋白質を非特異吸着させ、同様にリンス操作なしで、入射角に対する反射率および蛍光強度を計測する装置にセットした。

波長６３２．８ｎｍのｐ偏光をベース基板側から入射して入射角に対する反射率および蛍光強度計測を行った。その結果を図１７に示す。

図１７の（ａ）に示されたように、８ｎＭＣｙ５−ストレプトアビジン水溶液を注入して１５分後、２２度に見られる表面プラズモン共鳴角（反射率曲線における極小点）が観測された。また、この表面プラズモン共鳴角に対応する増強蛍光のピークも観測された。よって、ベース基板側からの光入射によっても、消光抑制層表面に吸着した蛍光分子からの増強蛍光を検出することができるプレートであることが確認できた。

また、図１７の（ｂ）に示されたように、同じ構造の基板を用いてコントロール実験をしたところ、２０ｎＭＣｙ５−抗ＧＦＰ抗体水溶液を注入して１５分後、表面プラズモン共鳴角に対応する増強蛍光は見られなかった。

よって、本マイクロプレートを用いることで、リンス操作なしの試料注入の１ステップで背景光が抑制され、低濃度でも非特異吸着と特異的結合を区別することのできる非常に高感度かつ高いＳ／Ｎ比の計測ができたことが示された。

入射光の方向と蛍光の観測方向による観測される蛍光強度の違いについて検証した。具体的には、実施例５と同様に、５ｎＭＣｙ５−ストレプトアビジンの特異的吸着を洗浄（リンス）なしで格子カップリング表面プラズモン共鳴による増強蛍光から計測した。その結果を図１８に示す。

図１８において、（ａ）は、消光抑制層側から光を入射し、消光抑制層側から蛍光を検出した結果であり、（ｂ）は、ベース基板側から光を入射し、消光抑制層側から蛍光を検出した結果である。（ａ）では、溶液中に存在する未吸着の蛍光分子からの蛍光が背景光として３０％以上を占めているが、（ｂ）では、背景光の影響が３％未満である。このように、ベース基板側からの照射により、背景光が抑制されるので、消光抑制層側からの照射に比べて、蛍光観察におけるＳ／Ｎを大きく改善することができる。よって、ベース基板側から光を入射することによって、リンス操作が不要なマイクロプレートを実現することができる。

１ 表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡（ＳＰＦＭ）
２ 本体
３ ステージ
４ マイクロプレート
５、５’ ベース基板
６ 金属層
７ 消光抑制層
８ 周期構造
９ 溝部
１０ 凸部
ＩＮ１ 消光抑制層側からの光の入射
ＩＮ２ ベース基板側からの光の入射
Ｔ 消光抑制層側からの蛍光の検出
Ｂ ベース基板側からの蛍光の検出
Ａ 試料
Ｌｉ 照明光
Ｌｐ 観測光（プラズモン励起増強蛍光）
Ｌ１、Ｌ２ 入射光
Ｖ１ 格子の方向
Ｖ２、Ｖ３ 入射光のｐ偏光成分
Ｖ４ 入射光のｓ偏光成分
φ 入射角度
Ｕ１、Ｕ２ 入射平面

Claims (12)

1. 蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて、マイクロプレートを用いて、蛍光標識二次抗体を利用して特異的な抗原抗体反応を増強蛍光により検出する方法であって、
   前記マイクロプレートが、
   表面に周期構造を有するベース基板と、
   前記周期構造の上に形成された非透光性の金属層と、
   前記金属層の上に形成された消光抑制層とを備え、
   前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、前記消光抑制層の表面に抗体が吸着あるいは結合されており、
   前記方法が、
   前記マイクロプレートに光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、
   発生させた前記電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記消光抑制層側のいずれかから検出するステップとを含み、
   前記ベース基板側から入射される前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光を発生させて前記増強蛍光を供与する程度に小さい角度であることを特徴とする検出方法。
2. 前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、５度から４６度の範囲内であることを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
3. 前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、５度から２５度の範囲内であることを特徴とする、請求項２に記載の検出方法。
4. 前記周期構造の周期が１０ｎｍ以上１μｍ以下であり、
   前記ベース基板の表面の前記周期構造が、矩形の周期構造であり、
   前記金属層が、矩形の段差部分に対応する表面に前記スロープを有し、厚さ２００ｎｍに形成され、
   前記周期に対する前記スロープの長さの割合が１０±５％であり、
   前記溝部の深さをｄｎｍとし、前記周期に対する山の長さの割合をＭ％として、
   ５≦ｄ＜１５、且つ、０＜Ｍ＜７０、若しくは７０＜Ｍ＜１００、
   １５≦ｄ＜２５、且つ、０＜Ｍ＜８０、若しくは８０＜Ｍ＜１００、
   ２５≦ｄ＜３５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００、または、
   ３５≦ｄ＜４５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００
   であることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
5. 観測対象の試料を搭載し、蛍光標識二次抗体を利用して特異的な抗原抗体反応を増強蛍光により検出するためのマイクロプレートを有する蛍光顕微鏡であって、
   前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、該ベース基板の前記周期構造の上に形成された非透光性の金属層と、該金属層の上に形成された消光抑制層とを備え、前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、前記消光抑制層の表面に抗体が吸着あるいは結合されており、
   前記蛍光顕微鏡が、
   前記マイクロプレートに光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、発生させた該電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記消光抑制層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光を検出し、
   前記ベース基板側から入射される前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光を発生させて前記増強蛍光を供与する程度に小さい角度であることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡。
6. 前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、５度から４６度の範囲内であることを特徴とする、請求項５に記載の表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡。
7. 前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、５度から２５度の範囲内であることを特徴とする、請求項６に記載の表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡。
8. 前記周期構造の周期が１０ｎｍ以上１μｍ以下であり、
   前記ベース基板の表面の前記周期構造が、矩形の周期構造であり、
   前記金属層が、矩形の段差部分に対応する表面に前記スロープを有し、厚さ２００ｎｍに形成され、
   前記周期に対する前記スロープの長さの割合が１０±５％であり、
   前記溝部の深さをｄｎｍとし、前記周期に対する山の長さの割合をＭ％として、
   ５≦ｄ＜１５、且つ、０＜Ｍ＜７０、若しくは７０＜Ｍ＜１００、
   １５≦ｄ＜２５、且つ、０＜Ｍ＜８０、若しくは８０＜Ｍ＜１００、
   ２５≦ｄ＜３５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００、または、
   ３５≦ｄ＜４５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００
   であることを特徴とする請求項５に記載の表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡。
9. 観測対象の試料を搭載し、蛍光標識二次抗体を利用して特異的な抗原抗体反応を増強蛍光により検出するためのマイクロプレートを有する蛍光マイクロプレートリーダーであって、
   前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、該ベース基板の前記周期構造の上に形成された非透光性の金属層と、該金属層の上に形成された消光抑制層とを備え、前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、前記金属層が表面にスロープを有し、前記金属層が、伝播型の表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、前記消光抑制層の表面に抗体が吸着あるいは結合されており、
   前記蛍光マイクロプレートリーダーが、
   前記マイクロプレートに光を入射させて、前記表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させるステップと、発生させた該電場を蛍光分子の励起場として、前記増強蛍光を、前記ベース基板側または前記消光抑制層側のいずれかから検出するステップとを含む方法により、前記マイクロプレートからの前記増強蛍光を検出し、
   前記ベース基板側から入射される前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす角度が、前記光が屈曲手段によって屈曲されなくても、前記マイクロプレートに入射可能な角度であり、かつ、前記表面プラズモン共鳴光を発生させて前記増強蛍光を供与する程度に小さい角度であることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダー。
10. 前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、５度から４６度の範囲内であることを特徴とする、請求項９に記載の表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡。
11. 前記光の入射方向と、前記ベース基板の前記光が入射される平面の垂線とがなす前記角度が、５度から２５度の範囲内であることを特徴とする、請求項１０に記載の表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダー。
12. 前記周期構造の周期が１０ｎｍ以上１μｍ以下であり、
    前記ベース基板の表面の前記周期構造が、矩形の周期構造であり、
    前記金属層が、矩形の段差部分に対応する表面に前記スロープを有し、厚さ２００ｎｍに形成され、
    前記周期に対する前記スロープの長さの割合が１０±５％であり、
    前記溝部の深さをｄｎｍとし、前記周期に対する山の長さの割合をＭ％として、
    ５≦ｄ＜１５、且つ、０＜Ｍ＜７０、若しくは７０＜Ｍ＜１００、
    １５≦ｄ＜２５、且つ、０＜Ｍ＜８０、若しくは８０＜Ｍ＜１００、
    ２５≦ｄ＜３５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００、または、
    ３５≦ｄ＜４５、且つ、０＜Ｍ＜６０、若しくは６０＜Ｍ＜１００
    であることを特徴とする請求項９に記載の表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダー。