WO2005078084A1

WO2005078084A1 - ２本鎖オリゴ核酸を担持したポリイオンコンプレックスおよびその製造法とそれを含む医薬組成物

Info

Publication number: WO2005078084A1
Application number: PCT/JP2004/011957
Authority: WO
Inventors: Kazunori Kataoka; Keiji Itaka; Shigeto Fukushima; Naoki Kanayama
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; Todai TLO Ltd
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Todai TLO Ltd
Priority date: 2004-02-13
Filing date: 2004-08-13
Publication date: 2005-08-25
Anticipated expiration: 2006-08-13
Also published as: JPWO2005078084A1

Abstract

本発明は、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとのブロック共重合体に遺伝子ノックダウン用2本鎖オリゴ核酸が担持された、静電結合型ポリイオンコンプレックス及び当該ポリイオンコンプレックスを含む医薬組成物を提供する。

Description

明細

2本鎖オリゴ核酸を担持したポリイオンコンプレックスおよび

その製造法とそれを含む医薬組成物技術分野

本発明は、遺伝子ノックダウンを目的とする 2本鎖ォリゴ核酸のデリバリ一システムに関する。背景技術

近年、生体内での遺伝子発現やその機能コントロールにおいて、小さな核酸分子が非常に大きな役割を果たしていることが明らかとなり、そのメカニズムが活発に探求されている。その端緒となったのが、小さな 2本鎖 RNAによって、配列特異的に遺伝子発現が抑制 (ノックダウン)される現象、即ち RNA千渉 (RNA interference (以下、 RNAi と略称する))である。これは従来植物の細胞などでは観察されていた現象であるが、最近になって哺乳動物細胞においても、 21〜23塩基程度の小さな 2本鎖 RNA 分子 (siRNA)を利用すると、 RNAiを生じさせることが明らかとなった。即ち、 siRNA が細胞内に入ると、 RISC (RNA-induced silencing complex) と呼ばれる siRNA-夕ンパク複合体が形成され、配列特異的に mRNAが分解される。 RISCは一度形成されると非常に安定で、繰り返し mRNAに働きかけることが出来るこめ、従来より行われていた遺伝子ノックダウン法であるアンチセンス（antisense) DNA法と比べて、非常に効率よく遺伝子発現を抑制させることができる。そのため、この RNAi を用いて細胞や組織の生物学的機能を遺伝子レベルでコントロールすることによる、新規治療法開発への展望が開け、従来治療が困難であった難治性疾患等への有効な治療法として、期待は非常に高い。

RNAiを起こす核酸分子として、 siRNAのほか、ヘアピン構造を持つ RNA分子である short hairpin RNA(shRNA)も同様の効果を持ち、また従来のアンチセンス DNA のように、遺伝子ノックダウンは RNA分子に限らず、 2本鎖ォリゴ DNA(dsODN)、 RNA DNAハイプリッドオリゴ核酸も有効である可能性が検討されている。また、 RNAiと類似した現象として、種々の細胞で内在性の数百種類の小さな RNAフアミリーが発見され、時期、部位特異的な遺伝子発現コントロールを通じて、広範な生命現象に関与していることが明らかとなってきた。この micro RNA(miRNA)と呼ばれる小さな RNA分子は、 siRNAによるノックダウンと異なり、標的遺伝子と完全に配列が一致しない場合でも、 mRNA の翻訳を抑制することによって、遺伝子発現をコントロールする。このように、小さな 2本鎖核酸を用いることによって、遺伝子の発現やその機能を自在にコントロールできる可能性があり、その応用範囲は非常に広範にわたると考えられる。

しかしながら、 2本鎖オリゴ核酸をそのまま細胞、組織へ投与しても、（i) 生体内、細胞内における核酸分解酵素 (ヌクレアーゼ)のため、安定に存在できない、（ii) 核酸自体が陰性荷電を持っため、細胞の取り込みが起こりにくい、などの理由により、本来その 2本鎖ォリゴ核酸が有する機能を充分に発揮することが出来ない。

現在、この問題点を解決するため、例えば 2本鎖オリゴ核酸のひとつである siRNA においては、 Oligofectamine (Invitrogen社)や RNAiFect (QIAGEN社)などのカチォン性脂質をベースにした siRNA導入試薬を用いる手法が一般的となっている。しかし、これら脂質をベースにした siRNAデリバリーは、血清成分やタンパクの影響を受けやすく、 RNAiを実際の臨床へ応用することを考えた場合、このようなシステムは現実的ではない。従って、 siRNAなどの 2本鎖オリゴ核酸の機能を損なわずに、安定に標的とする細胞、組織へ送達するデリバリーシステムの開発が急務となっている。

本発明者らは、荷電性タンパク質や DNAのデリバリーシステムとして、ブロック共重合体とのポリイオンコンプレックスが有用であることをすでに報告している（特許第 2 6 9 0 2 7 6号公報、 K. Kakizawa, K. Kataoka, Block copolymer micelles for delivery of gene and related compounds, Advanced Drug Delivery Reviews 54(2002)203-222.) 。しかしながら 2本鎖オリゴ核酸については、デリノ、'リーに適したブロック共重合体の構造ゃポリイオンコンプレックスの作製法についての検討はされていなかった。発明の開示

本発明は、遺伝子ノックダウンに機能する 2本鎖オリゴ核酸の細胞又は組織への送達に有用なデリパリ一システムを提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 2本鎖オリゴ核酸の細胞、組織への送達にポリイオンコンプレックスを採用することにより、効率的にデリバリーしうることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下の通りである。

(1) 非荷電性セグメントと荷電性セグメントからなるブロック共重合体と、 2本鎖オリゴ核酸とを含んでなるポリイオンコンプレックス。

(2) コア部に 2本鎖オリゴ核酸を担持したポリマ一ミセルの形態にある（1) 記載のポリイオンコンプレックス。

(3) 非荷電性セグメントがポリエチレングリコールまたはその誘導体である（1) または（2) 記載のポリイオンコンプレックス。

(4)荷電性セグメントがポリアミノ酸もしくはその誘導体またはそれらの塩である (1) 〜（3) のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

(5) ブロック共重合体の構造が一般式（ I ) もしくは（II) またはそれらの塩である（ 1) または（2) 記載のポリイオンコンプレックス。

R^1aO-(CH₂CH₂0)_m— L¹-(COCHNH)_nJy— (COR^2aCHNH)_y ~ (COCHNH)_z一 R³ ^b C=0 (CH₂)₄ (I)

C=0 R^5b NHR^6a

R^5a

(式中、 R^{1 a}及び R^{l b}はそれぞれ独立して水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の Cい ₁₂アルキル基を表し、 L ¹および L ²は連結基を表し、 R^2a、 R^2b、 R^{2 <:}及び R^2dはそれぞれ独立してメチレン基またはェチレン基を表し、 R ³は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、 R⁴は R 又は R^5dと同一であるかまたは開始剤残基であり、 R^5a、 R^5b、 R^5e及び R ^5dはそれぞれ独立して水酸基、ォキシベンジル基、一 NH— (CH₂) _a— X基を表し、ここで Xはそれぞれ独立して一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニゥム塩の内一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはァミンでない化合物残基であり、 aは 1〜5の整数であり、 "及び! ^61>はそれぞれ独立して水素原子または保護基であり、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられている Z基、 B o c基、ァセチル基、トリフルォロアセチル基等であり、 mは 5〜20, 000の整数であり、 nは 2〜5， 000の整数であり、 yは 0〜5， 000の整数であり、 zは 0〜5， 000の整数であるが、 y + zは nより大きくないものとする。）

(6) R^{l a}又は R^{l b}がメチル基である（5) 記載のポリイオンコンプレックス。

(7) R^{1 a}又は R ^{l b}が置換された直鎖もしくは分枝 C ₂アルキル基を表し、ここで置換基がァセ夕一ル化ホルミル基、シァノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、 C アルコキシカルボニル基、 C₂_₇ァシルアミド基、同一もしくは異なるトリ— C i— 6アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基である（5) 記載のポリイオンコンプレックス。

(8) L¹が一（CH₂) _b— NH—であり、ここで bは；！〜 5の整数である（5) 〜（7) のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

(9) L²が— （CH₂) _C_C〇—であり、ここで cは 1〜 5の整数である（5) 〜（7) のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

(1 0) R^{2 a}、 R^2b、 R^{2 c}及び R^2dがメチレン基である（5) 〜（9) のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

(1 1) Xが下記に示す式で表される基からなる群から選ばれるいずれかのものである（5) 〜（10) のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

- (CH₂)厂 NH₂ - (NR^7a(CH₂)_d1)_e「NHR^8a - N(CH₃)₂

N(CH₂CH₃)₂ -(NR^7b(CH₂)_d2)_e2-(NR^7c(CH₂)_d3)_e3-NHR^8b

(式中、 X ²は水素原子または C〖アルキル基もしくはァミノ C卜 _fiアルキル基を表し、 R^{7 a}、 R^7b及び R^{7 e}はそれぞれ独立して水素原子またはメチル基を表し、 d l、 d 2及び d 3はそれぞれ独立して 1〜 5の整数を表し、 e l、 e 2及び e 3はそれぞれ独立して 1〜 5の整数を表し、 f は 0〜 1 5の整数を表し、 R

^{8 a}及び R ^{8 b}はそれぞれ独立して水素原子または保護基を表し、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられている Z基、 B o c基、ァセチル基、トリフルォロアセチル基等を表し、 gは 0〜 1 5の整数を表す。）

(1 2 ) R^5a及び R^5bの合計の 85%以上が一 NH— (CH₂) _a— (NR^{7 a} (C H₂) _d1) _e1— NHR^8aである（5) 、（6) 、（7) 、（8) 、（10) 及び（ 1 1 ) のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。 (1 3) R^5c及び R^5dの合計の 85%以上が— NH_ (CH₂) _a— （NR^7a (C H₂) _d1) _e1— NHR^8aである（5) 、（6) 、（7) 、（9) 、（10) 及び（1 1) のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

(14) R^5a及び R^5bの合計の 85 %以上が—NH— (CH₂) ₃— NH— (C H₂) ₃— NH₂である（5) 、（6) 、（7) 、（8) 、（ 1 0 ) 及び（ 1 1 ) のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

(1 5) R^{5 c}及び R^5dの合計の 85 %以上が一 NH_ (CH₂) ₃— NH— (C H₂) ₃— NH₂である（5) 、（6) 、（7) 、（9) 、（ 1 0 ) 及び（ 1 1 ) のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

(1 6) z = 0である（5) 〜（1 5) のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

( 1 7) R³がァセチル基、ァクリロイル基またはメタクリロイル基である（5)、 (6) 、（7) 、（8) 、（1 0) 、（1 1) 、（1 2) 、（14) 及び（16) のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

(1 8) R⁴が— NH— R⁹であり、ここで R ⁹は未置換または置換された直鎖または分枝の (：卜^アルキル基を表す（5) 、（6) 、（7) 、（9) 、（1 0) 、 (1 1) 、（1 3) 、（1 5) 及び（1 6) のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

( 1 9 ) 2本鎖オリゴ核酸が、遺伝子ノックダウン能を有する核酸分子である（ 1 ) 〜（1 8) のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

(20) 遺伝子ノックダウン用核酸を、非荷電性セグメントと荷電性セグメントからなるブロック共重合体に静電結合させることを特徴とする、ポリイオンコンプレックスの製造方法。

(21) (1) 〜（19) のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを含む医薬組成物。図面の簡単な説明

図 1は、 PEG-PLL/dsODN、 PEG.DPT/dsODN、 PEG-DPT/siRNAの各コンプレックス形成を電気泳動により示す図である。

図 2は、 PEG-PLL/dsODNコンプレックス、 PEG-DPT/dsODNコンプレックスの動的光散乱測定による粒径を測定した結果を示す図である。

図 3は、 PEG-PLL/siRNAコンプレックスを用いたルシフェラーゼ遺伝子発現抑制効果を示す図である。

図 4は、 PEG-DET/siRNAコンプレックス、 PEG-DPT/siRNAコンプレックス、たルシフェラーゼ遺伝子発現抑制効果を示す図である。

図 5は、 siRNA担持ポリイオンコンプレックスの血清中でのィンキュベ一シヨン後の、ルシフェラーゼ遺伝子発現抑制効果を示す図である。

図 6は、 siRNA担持ポリイオンコンプレックスによる内在性遺伝子 LaminA/C のノックダウン効果を示す図である。

図 7は、 siRNA担持ポリイオンコンプレックスによる内在性遺伝子 ATXのノックダウン効果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、遺伝子ノックダウンを起こさせる核酸を、ブロック共重合体とポリィォンコンプレックスを形成させることにより、標的の組織又は細胞内の遺伝子発現を抑制できる静電結合型の高分子（ポリマー）ミセル医薬組成物に関する。

1 . ブロック共重合体

本発明に用いられるプロック共重合体は、非荷電性セグメン卜と荷電性セグメントから構成され、荷電性セグメントが遺伝子ノックダウン用核酸とポリイオンコンプレックスを形成することが可能なものである。

非荷電性セグメントとしては、例えばポリエチレングリコール (PEG)、ポリプロピレンダリコール等のポリアルキレングリコール、ポリアルキレンォキシド、ポリサッカライド、ポリアクリルアミド、ポリ置換アクリルアミド、ポリメ夕クリルアミド、ポリ置換メ夕クリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸エステル、ポリメ夕クリル酸エステル、もしくはそれらの誘導体由来の各種セグメント等が例示される。非荷電性セグメントの好ましい分子量は、 2 00〜 1， 00 0， 000、より好ましくは 500〜 2 00， 0 00、特に好ましくは 1 , 000〜 50， 000である。

荷電性セグメントとしては、例えばポリアミノ酸もしくはその誘導体またはそれらの塩が挙げられ、より具体的には、ポリリシン (PLL)、ポリアルギニン、ポリヒスチジン等のポリアミノ酸や、ポリァスパラギン酸またはポリグルタミン酸のエステルまたは酸アミドの側鎖に荷電性基を有するもの等が挙げられる。またポリアクリル酸、ポリメタクリル酸等のエステルまたは酸アミドの側鎖に荷電性基を有するものも挙げることができる。荷電性セグメントの好ましい分子量は、 200〜1 , 000， 000、より好ましくは 5 00〜 200, 000、特に好ましくは 1， 000〜 50， 000である。

本発明で用いられるブロック共重合体の一般式（I) 及び（ I I ) を下記に示す。

上記の一般式（ I ) または（II) において、 ¹³及び1^¹¹¹はそれぞれ独立して水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の C i— i ₂アルキル基を表すが、 Cい ₁₂アルキルとしては、メチル、ェチル、 n _プロピル、 i s o 一プロピル、 n—ブチル、 s e c—ブチル、 t e r t—ブチル、 n—ペンチル、 n—へキシル、デシル、ゥンデシル等が挙げられる。また置換された場合の置換基としてはァセタール化ホルミル基、シァノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、 Cぃ₆アルコキシカルボニル基、 C₂— ₇ァシルアミド基、同一もしくは異なるトリー Cぃ₆アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基が挙げられる。置換基がァセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して他の置換基であるホルミル基（_CH〇：またはアルデヒド基）に転化できる。かようなホルミル基、またはカルボキシル基もしくはアミノ基は、例えば、本発明に従う共重合体と核酸または陰イオン性タンパク質とのポリィォンコンプレックスミセルのシェル部に存在することができ、これらの基を介して、抗体もしくはその特異結合性を有する断片（F(ab')2、 F(ab)、等）およびその他の機能性もしくは標的指向性を該ミセルに付与し得るタンパク質等を該ミセルに共有結合するのに利用できる。このような官能基を片末端に有する P E Gセグメントは、例えば、 WO 9 6/3 2 4 3 4, WO 9 6/3 3 2 3 3 , WO 9 7/0 6 2 0 2に記載のブロック共重合体の P EGセグメント部の製造法によつて、都合よく形成できる。

こうして形成される P E Gセグメント部分とポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメント部分とは、上記一般式（ I ) または（Π) の共重合体の製造方法に応じて、どのような連結様式をもとり得、そして本発明の目的に沿う限り、どのような連結基で結合されていてもよい。

上記共重合体の製造方法は特に限定されるものではないが、一つの方法として、例えば、末端にアミノ基を有する P EG誘導体を用いて、そのアミノ末端に、 (3 —ベンジル—L—ァスパルテート、 Ν ε — Z _L—リシン等の保護アミノ酸の Ν 一力ルボン酸無水物（NCA) を重合させてブロック共重合体を合成し、その後側鎖を変換することにより、本発明の共重合体を得る方法が挙げられる。この場合、共重合体の構造は一般式（ I ) となり、連結基 L ¹は、用いた P E G誘導体等の末端構造に由来する構造となる力好ましくは—（CH₂) _b— NH—であり、かつ bは 1〜 5の整数である。

また、ポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメント部分を合成してから、 P EGセグメント部分と結合させる方法でも、本発明の共重合体は製造可能であり、この場合結果的に上記の方法で製造したものと同一の構造となることもあるが、一般式（II) の構造となることもある。連結基 L ²は特に限定されるものではないが、好ましくは— （CH₂) _c— CO—であり、かつ cは 1〜5の整数である。一般式（ I ) または（II) 中の R^5a、 R^5b、 R^5c及び R^5dはそれぞれ独立して水酸基、ォキシベンジル基、 — NH_ (CH₂) _a— X基であることができるが、大部分 (一般的には R ^{5 a}及び R ^{5 b}の合計の 85%以上、好ましくは 95%以上、より好ましくは 98%以上、特に好ましくは 100%、 R ⁵ c及び R ^{5 d}の合計の 85%以上、好ましくは 95%以上、より好ましくは 98%以上、特に好ましくは 100%)が— N H— (CH₂) _a_X基であること、 _NH— (CH₂) _a- (NR^{7 a} (CH₂) _d1) _e1— NHR^{8 a}であること、あるいは、一 NH— (CH₂) 3- H- (CH₂) ₃ — NH₂であることが好ましい（R^7a、 d l、 e l、 R^8aに関しては後述）。なお、 aは 1〜5の整数である。

また一般式（ I ) または（Π) 中の R^6a及び R^6bはそれぞれ独立して水素原子または保護基であることができるが、大部分が水素原子であることが好ましい。ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられている Z基、 B o c基、ァセチル基、トリフルォロアセチル基等のことである。

Xは共重合体が本発明の条件を満たす限り特に制限されないが、それぞれ独立して一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニゥム塩の内一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基である力、、あるいはァミンでない化合物残基であり、例として下記式のような残基が挙げられる。下記式中、 X²は、水素原子または Ci— eアルキル基もしくはァミノアルキル基であり、 R^{7 a}、 R^7b及び R^7c はそれぞれ独立して水素原子またはメチル基であり、 d l、 d 2及び d 3はそれぞれ独立して 1〜 5の整数であり、 e l、 e 2及び e 3はそれぞれ独立して 1〜 5の整数であり、 f は 0から 1 5の整数であり、 R ^{8 a}及び R ^{8 b}はそれぞれ独立して水素原子またはァミノ基の保護基として通常用いられている Z基、 B o c基、ァセチル基、トリフルォロアセチル基等の保護基であり、 gは 0〜1 5の整数であることができる。

一 (CH₂)_f— NH₂ — (NR^7a(CH₂)_d1)_e1—NHR^8a — N(CH₃)₂

N(CH₂CH₃)₂ — (NR^7b(CH₂)_d2)_e2 - (NR^7c(CH₂)_d3)_e3— NHR^8b

ポリアミノ酸構造の側鎖にこれらの残基を導入する方法は、特にポリァスパラギン酸構造の場合には、例えば、特許第 2 7 7 7 5 3 0号公報に記載されているようなポリ（/3—ベンジル— L—ァスパルテート）部分のアミノリシスによるェステルからアミドへの交換反応によって都合よく製造することができる。別法としてはべンジルエステルを接触還元、酸、アルカリ等により加水分解しポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸に変換した後、縮合剤等を用いてこれらの残基を有する化合物を結合させるという方法でも製造できる。

一般式（ I ) または（II) で表されるブロック共重合体は、その塩を形成していてもよい。この場合塩を形成する対イオンとしては C 1 —、 B r—、 I—、 ( 1 S 0₄) —、 N0₃—、（1Z2 C〇₃) -、（ 1ノ 3 P0₄) —、 CH₃C〇0一、 CF₃C〇〇—、 CH₃S0₃—、 C F ₃ S 0₃—等が挙げられる。

一般式（ I ) または（II) における R^{2 a}、 R^2b、 R^{2 c}及び R^2dは、それぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表すが、 R ^{2 a}及び R ^{2 b}のいずれもがメチレン基の場合はポリ（ァスパラギン酸誘導体）、エチレン基の場合はポリ（ダル夕ミン酸誘導体）に、 R^{2 c}及び R^2dのいずれもがメチレン基の場合はポリ（ァスパラギン酸誘導体）、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当する。これらの一般式中、 R^2a及び R^2b (R^{2 b}及び R^2a) がメチレン基およびェチレン基の両者を表す場合、及び R^{2 e}及び R^2d (R^2d及び R^2c) がメチレン基およびエチレン基の両者を表す場合、ァスパラギン酸誘導体およびグルタミン酸誘導体の反復単位は、それぞれブロックを形成して存在するか、あるいはランダムに存在できる。

ポリエチレングリコール一ポリ（)3—べンジルー L—ァスパルテー卜）ブロック共重合体にジプロピレントリアミンを反応させてァミノリシスを行った下記式 (III) に示す構造のブロック共重合体 (PEG-DPT と略記する）は、本発明において特に好ましいブロック共重合体のひとつである。

CH₃0— (CH₂CH₂0)rirCH2CH₂CH2NH(COCHNH)_n-CCH₃

NH2CH2CH2CH2NHCH2CH2CH2NHCCH2 ο ^(ΙΠ

Ο また、上記のポリエチレングリコール一ポリ（/3—ベンジル— Lーァスパルテ一卜）ブロック共重合体にスペルミンを反応させて得ることのできる下記式（IV) に示す構造のブロック共重合体 (PEG-SPM と略記する）も、本発明において特に好ましいプロック共重合体のひとつである。 PEG-SPMは、 2本鎖オリゴ核酸（下記 2. 参照）のほか、 ssDNAやアンチセンス RNAなどの 1本鎖オリゴ核酸、プラスミド DNAなどの環状核酸、例えば環状核酸を切断して得られる線状核酸とポリイオンコンプレックス (PIC)ミセルを形成することもできる。 CH3O- (CH₂CH₂0) _m-CH₂CH₂CH₂NH (COCHNH) _n-CCH₃

H₂NCH₂CH₂CH₂NHCH₂CH₂CH₂CH₂NHCH₂CH₂CH₂NHCCH₂ 0 (_iv)

0

一般式（ I ) における R ³は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表すが、保護基としては。エアルキルカルボニル基が挙げられ、好ましくはァセチル基である。疎水性基としてはベンゼン、ナフ夕レン、アントラセン、ピレン等の誘導体が挙げられる。重合性基としてはメタクリロイル基、ァクリロイル基が挙げられ、かような重合性基を一般式（ I ) の共重合体が有する場合には、これらの共重合体は、所謂、マクロマーとして使用でき、例えば、 PICミセルを形成した後、必要により他のコモノマーを用い、これらの重合性基を介して架橋させることもできる。

これらの保護基、疎水性基、重合性基を共重合体の末端に導入する方法としては、酸ハロゲン化物を用いる方法、酸無水物を用いる方法、活性エステルを用いる方法等、通常の合成で用いられている手法が挙げられる。

一般式（Π) における R⁴は R^5e又は R^5dと同じくそれぞれ独立して水酸基、ォキシベンジル基、一 NH— (CH₂) _a_X基であることができる。または R⁴ は開始剤残基である。つまり、低分子の開始剤を用いて保護アミノ酸の NCAを重合させてポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメントを合成してから PEG セグメントと結合させる方法でブロック共重合体を製造する場合には、使用した開始剤に由来する構造、すなわち一 NH— R ⁹であって R ⁹が未置換または置換された直鎖または分枝の C ^ 2。アルキル基をとることもできる。

PEGセグメントの鎖長およびポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメントの鎖長を規定する、 mおよび nは、 mについては 5〜20, 000の整数、好ましくは 10〜 5, 000、特に好ましくは 40〜500であり、 nについては 2 〜5, 000の整数、より好ましくは 5〜 1 , 000、特に好ましくは 10〜2 00であるが、一般式（ I ) または（II) の共重合体が、核酸または陰イオン性タンパク質と PICミセルを形成するものであれば、限定されるものではない。したがって、本明細書では便宜上、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸等と称しているが、「ポリ」の語には、所謂、「オリゴ」に分類されるものも包合される概念として用いている。

またポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメントの構成割合を規定する、 y、 zは、いずれも 0〜 5， 0 0 0の整数（ただし y + zは nより大きくない。）である（例えば z = 0または z = nとすることができる。また、 z = l〜(！ 1-1)のトリブロック共重合体も、本発明のブロック共重合体に含まれる。）。また各構成成分はランダムに分布していることもブロック状に分布していることもどちらも可能であり、表記上順番に書いているがこれに限定されるものではない。

例えば、 z= 1のトリブロック共重合体も、本発明のブロック共重合体に含まれる。

本発明のポリイオンコンプレックスがポリマーミセルの形態にある場合、ミセルのコア部には 2本鎖ォリゴ核酸が担持されており、シェル部には非荷電性セグメントが存在すると考えられる。

本発明において、好ましいブロック共重合体としては、上記の PEG-DPT、 PEG-SPMの他、片末端一級アミノ基のポリエチレングリコールと Ν ε _ Z—L _ リシン N カルボン酸無水物を反応させた後、 Z基を脱保護して得られるポリエチレングリコール—ポリリシンブロック共重合体（PEG-PLLと略記する）、ポリエチレンダリコール- block-ポリ（/3 -ベンジル -L-ァスパルテ一ト）ブロック共重合体（PEG-PBLA と略記する）にジエチレントリアミンを反応させて得られるプロック共重合体（PEG-DET と略記する）、ポリエチレングリコール- block-ポリ（/3 -ベンジル -L-ァスパルテート） -block-ポリ（N ε -Z-L-リシン）トリブロック共重合体 (PEG-PBLA-PLL(Z))に 4-(3-ァミノプロピル)モルホリンを反応させた後、 Z基を脱保護して得られるトリブロック共重合体 (PEG-APM-PLL と略記する)等を例示することができる。特に、 PEG-DETを含む PICミセルは細胞毒性が少ないという特徴を有する。

2 . 遺伝子ノックダウン用核酸

本発明において、上記プロック共重合体からなる高分子ミセル中に静電的に担持させる核酸は、遺伝子ノックダウンを目的とした 2本鎖オリゴ核酸である限り、その種類に限定されるものではない。ここで、「遺伝子ノックダウン」とは、遺伝子の発現をオリゴ核酸を用いて抑制することの総称であり、そのノックダウン用核酸としては、 siRNA、 shRNA、 dsDNA、 RNA-DNAハイブリッドオリゴ核酸を含めた 2本鎖オリゴ核酸の少なくとも 1つである。

(1) siRNA, shRNA

近年、二本鎖 RNA が遺伝子ノックダウンを起こす現象が発見され、 RNA 千渉 (RNAi) と名付けられた。ハエ、線虫だけではなく、哺乳動物細胞でも siRNAや shRNAが mRNAを破壊することが明らかとなっている。

siRNA(short interference RNA, small interfering RNA)は、夕一ケッ卜と 3 'る遺伝子に相補的な配列を有する短い二本鎖 RNAであり、ターゲットとなる遺伝子の発現を強力に抑制する作用を有する。 shRNA(short hairpin RNA)は、センス鎖とアンチセンス鎖がループを介して繋がり、ノックダウン効果の発現にはさらに細胞内でのプロセシングを経て、 siRNAとなる。また、近年内在性の遺伝子発現調節機構として発見された miRNA(micro RNA)では、 siRNAと同様の機構が推測されながら、標的 mRNA と完全な相補性を持たないことが多いことも明らかとなっている。従って、 siRNA のターゲット配列との完全な相補性は必ずしも絶対の条件ではない。 siRNA の長さは、 10〜： 100 ヌクレオチド (nt)、好ましくは 10〜50 nt、より好ましくは 18〜 25 ntである。

(2) dsODN, DNA-RNAハイブリッドオリゴ核酸

従来遺伝子ノックダウンの得るための手段として、 1本鎖オリゴ DNAである、アンチセンス DNAが用いられてきた。これは種々の評価系で一定のノックダウン効果を示したが、オリゴ DNAの不安定性、細胞への取り込みの悪さのため、臨床応用等には不十分な効果しか得られなかった。

一方、 RNAi においては、 2本鎖オリゴ RNAが RISC複合体に取り込まれ、 siRNAの解離、活性化を経て、その高いノックダウン効率が発揮されると考えられる。しかし、そのメカニズムの詳細はまだ不明の点も多く、細胞内へ有効にデリノリーされれば、オリゴ DNAでも同様のノックダウン効果が得られる、との報告もある。従って、 2本鎖オリゴ核酸として、 dsODN、および RNA-DNAハイプリッドオリゴ核酸も細胞内での遺伝子ノックダウン機能を有する可能性が想定される。これらのオリゴ核酸も同様に高分子ミセルに担持させることが出来る。これらの核酸とブロック共重合体とのポリイオンコンプレックスを製造する方法としては、それぞれの溶液を適切な混合比で混合することにより、核酸をプロック共重合体に静電結合させることを基本とする。つまり、核酸とブロック共重合体とを混合すると、核酸の負電荷とブロック共重合体の正電荷によって、ミセルの形態のポリイオンコンプレックスが形成する。

ここで、核酸とブロック共重合体との混合比は、 2本鎖オリゴ核酸分子内のリン酸基とブロック共重合体中のカチオンとの比率（N/P 比）で表すことができる。 N/P 比とは、次式によって定義される量であり、以後断りの無い限り、 N/P 比とはこの量のことを指す。

N/P比 = 〔溶液中の 2本鎖オリゴ核酸中のヌクレオチドの総数〕

/ 〔溶液中のブロック共重合体中のカチオンの総数〕本発明において、 N/P比は、ポリイオンコンプレックスを形成できる限り限定されず、ブロック共重合体に含まれる非荷電性セグメント又は荷電性セグメントの性質によって異なる。本発明における適当な N/P比は、当業者であれば、適宜選択することができる。

さらに、透析、攪拌、希釈、濃縮、超音波処理、温度制御、 pH 制御、イオン強度制御、有機溶媒の添加等の操作を適宜付加することができる。

3 . 医薬組成物

本発明においては、上記のように得られる高分子ブロック共重合体に 2本鎖オリゴ核酸を担持させることにより、遺伝子治療を目的とした医薬組成物として使用することができる。

本発明において、高分子ブロック共重合体に担持させる 2本鎖オリゴ核酸として、 siRNA、 shRNA, dsODN, RNA-DNAハイブリッドオリゴ核酸等、前述の 2本鎖ォリゴ核酸を用いることができ、単独で、又は適宜組み合わせて使用することができる。本発明の医薬組成物の投与形態としては注射が挙げられ、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、筋肉、関節内、皮下、皮内等に局所投与することができる。さらに、カテーテルを用いた投与形態を採用することも可能である。この場合、通常は単位投与量アンプル又は多投与量容器の形態で提供され、使用する際に適当な担体、例えばパィロジェンフリーの滅菌した水で再溶解させる粉体であってもよい。また、これらの剤形に対し、製剤上一般に使用される添加剤を含有させることもできる。その投与量は、治療目的、ミセルの形態、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができ、本発明の医薬組成物に含まれる 2本鎖オリゴ核酸の量は、当業者であれば適宜設定することができる。例えば、本発明の医薬組成物の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重 lkgあたり 10 g〜： !OOOO g であり、 3日間から 4週間間隔で投与される。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。本実施例では、 2本鎖オリゴ核酸である siRNA, dsODNを用いて、ポリイオンコンプレックス（PIC) を調製し、その形成の確認、物性および遺伝子ノックダウン能の評価を行った。実施例 1

2本鎖ォリゴ核酸を担持させた PICの調製

(1)材料及び方法

GL3、 GFP、 LaminA/Cをターゲットとする siRNAサンプル (targeting siRNA)は QIAGENより購入した。 Autotaxin (ATX)をターゲットとする下記の siRNA、夕ーゲット配列：（AA)GCCTTACTTGAAACAGCAC (配列番号 1 ) は、 QIAGENよりカスタム合成されたものを購入した。配列番号 1で示される配列中、かっこ内の塩基は、オーバーハングである。 dsODNは、 GL3 targeting siRNA と同一の塩基配列をもつオリゴ (01igo) DNA(21bps) (Sigma) のセンス (sense)及びァンチセンス (antisense)鎖をそれぞれ購入し、両者をァニール (anneal)させることによつて調製した。 2本鎖が形成されていることを電気泳動（PAGE) で確認した後、実験に用いた。 siRNA transfection試薬である RNAiFectは、 QIAGENより購入した。 dsODNおよび siRNA を担持させた PICは、各オリゴ核酸溶液に対して、各プロック共重合体 (block copolymer)溶液を体積比 2:1で添加、混合することによつて調製した。

PEG PLL PEG PBLA, PEG-DPT PEG-SPM, PEG-DET、 PEG-APM PLL (D 各ブロック共重合体は、以下の通り合成した。

(例 1 ) PEG-PLLプロック共重合体の合成

Ν ε — Z— L _リシン Nカルボン酸無水物を、片末端一級ァミノ基のポリェチレングリコールを開始剤として重合した。反応溶液を、冷エーテル中に滴下し生じたポリエチレングリコール—ポリ（Ν ε — Z— L —リシン）ブロック共重合体 (PEG-PLL(Z))を濾過で回収した。 PEG-PLL(Z)をトリフルォロ酢酸に溶解させ、 HBr酢酸を用いて脱保護反応を行い、エーテル再沈、透析、凍結乾燥によりポリエチレングリコール—ポリリシンブロック共重合体（PEG-PLL) を得た。

(例 2 ) PEG-PBLAブロック共重合体の合成

片末端メトキシ、片末端アミノプロピルで平均分子量が 12,000 のポリエチレングリコールを塩化メチレンに溶解し、 /3 -ベンジル -L-ァスパルテート -N-カルボン酸無水物 (BLA-NCA)を Ν,Ν-ジメチルホルムアミド (DMF)と塩化メチレンの混合溶媒に溶解して加え、 40 で 2日間反応させ、さらに無水酢酸により Ν末端のァセチル化を行い、ポリエチレングリコール- block-ポリ（)3 -ベンジル -L-ァスパルテート）（PEG-PBLA) を得た。 NMRによる解析から PBLA部分の重合度は 68 であった。以下、 PEGの分子量が 12,000、 PBLA部分の重合度 68のブロック共重合体を PEG-PBLA(12-68)のように表記することがある（かっこ内の数字 12が分子量 12,000を表し、 68が重合度を表している）。

(例 3 ) PEG-DPTブロック共重合体の合成

PEG-block-ポリ（ 3—ベンジル—Lーァスパルテート）（PEG-PBLA)をべンゼンに溶解させ凍結乾燥を行った後、アルゴン雰囲気下で乾燥ジメチルホルムアミド (DMF)に溶解させた。この溶液に、蒸留により乾燥 ·精製したジプロピレン卜リアミンを 50倍当量添加し、アルゴン雰囲気下 40でで 24時間攪拌した。反応溶液を 10%酢酸に滴下し、分画分子量 3500の透析膜を用い 0.1N-HC1に対して透析を行い、透析膜内液を回収 ·濃縮 ·凍結乾燥することで PEG-DPTブロック共重合体を白色固体として得た。

(例 4 ) PEG-SPMブロック共重合体の合成

PEG-PBLA(12-68)をベンゼンに溶解させ凍結乾燥を行った後、アルゴン雰囲気下で乾燥ジメチルホルムアミド (DMF)に溶解させた。この溶液に、ベンゼンに溶解させ凍結乾燥を行い脱水したスペルミンを乾燥 DMFに溶解させた溶液を添加し、アルゴン雰囲気下 40でで 24時間攪拌した。スペルミンの量はべンジルエステルに対して 50倍当量用いた。反応溶液を 10%酢酸に滴下し、分画分子量 6-8000 の透析膜を用い 0.1N-HC1に対して透析を行い、透析膜内液を回収し、凍結乾燥することで下記式 (IV)に示す PEG-SPMブロック共重合体を白色固体として得た。

CH₃0- (CH₂CH₂0) _m-CH₂CH₂CH₂NH (COCHNH) _n-CCH₃ H₂NCH₂CH₂CH₂NHCH₂CH₂CH₂CH₂NHCH₂CH₂CH₂NHCCH₂ 0 (_iv)

0

(例 5 ) PEG-DETブロック共重合体の合成

PEG-PBLA(12-68)をベンゼンに溶解させ凍結乾燥を行った後、アルゴン雰囲気下で乾燥ジメチルホルムアミド (DMF)に溶解させた。この溶液に、蒸留により乾燥 ·精製したジエチレントリアミンをべンジルエステルに対して 50 倍当量添加し、アルゴン雰囲気下 40 で 24時間攪拌した。反応溶液を 10%酢酸に滴下し、分画分子量 3500の透析膜を用いて 0.1N-HC1に対して透析を行い、透析膜内液を回収、凍結乾燥することで下記式 (V)に示す PEG-DET ブロック共重合体を白色固体として得た。

CH₃0- (CH₂CH₂0) _m - CH₂CH₂CH₂NH (COCHNH) _n - CCH₃

H2NCH2CH2NHCH2CH2NHCCH2 0 (_v)

0

(例 6 ) PEG-APM-PLLプロック共重合体の合成

ポリエチレンダリコール- block-ポリ（ /3 -ベンジル -L-ァスパルテ一ト） -block-ポリ（N ε -Z-L-リシン）トリプロック共重合体 (PEG-PBLA-PLL(Z))を合成し、 N末端を無水酢酸を用いてァセチル化した。 PEG の分子量は 12000 であり、 PBLA、 PLL(Z)の重合度はそれぞれ 36、 50であった（12-36-50と表記)。このポリマーをベンゼンに溶解させ凍結乾燥を行った後、アルゴン雰囲気下で乾燥ジメチルホルムアミド (DMF)に溶解させた。この溶液に蒸留により乾燥'精製した 4-(3-ァミノプロピル)モルホリンをべンジルエステルに対し 50倍当量添加し、アルゴン雰囲気下 40でで 24時間攪拌した。反応溶液をエーテル再沈し、ろ過、乾燥して回収したポリマーを卜リフルォロ酢酸に溶解し、 30%HBr/酢酸を用いて脱保護反応を行った。反応後エーテル再沈、濾過、乾燥して回収したポリマ一を水に溶解し、分画分子量 6-8000の透析膜を用いて 0.1N-HC1に対して透析を行い、透析膜内液を回収、凍結乾燥することで下記に示す PEG-APM-PLL トリブロック共重合体を白色固体として得た。

(2) dsODNおよび siRNAとプロック共重合体の complex調製とその物性評価

(i) 電気泳動

まず、 Complex形成を確認する目的で、 2本鎖オリゴ核酸分子内のリン酸基とプロック共重合体中のカチオンとの比率 (N/P 比）を変化させた各サンプルを、 20%ポリアクリルアミドゲル (Novex TBE Gel, Invitrogen)中で電気泳動をおこなった。

結果を図 1に示す。図 1において、左パネルは PEG-PLLに dsODNを担持させたときの complex(PEG-PLL(12-48)/dsODN)の電気泳動結果、中央パネルは PEG-DPT に dsODNを担持させたときの complex (PEG-DPT(l2-68)/dsODN) の電気泳動結果、右パネルは PEG-DPT に siRNA を担持させたときの complex (PEG-DPT(l2-68)/siRNA) の電気泳動結果である。

各レーンは以下の通りである。

PEG-PLL(12-48)/dsODN：左側から順にマーカ一（レーン 1) 、 free ODN (レーン 2) 、 N/P比 =0.25， 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2， 3， 5， 10 (レーン 3〜： 11)

PEG-DPT(12-68)/dsODN：左側から順にマーカ一（レーン 1) 、 free ODN (レーン 2) 、 N/P比 = 0.5， 1, 1.5， 2, 3， 4, 6, 10， 20 (レーン 3〜： 11)

PEG-DPT(12-68)/siRNA：左側から順にマーカ一（レーン 1) 、 free ODN (レーン 2) 、 N/P比 = 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 10, 20 (レーン 3〜9)

図 1に示すように、ブロック共重合体として PEG-PLL (左パネル）、 PEG-DPT (中央および右パネル）を用いた場合、いずれも N/P 比 = 2前後までにフリーの dsODNのバンドは消失し、 dsODNとブロック共重合体との complex形成が確認された。また、 PEG-DPTに対して siRNAをコンプレックス化させた場合、 dsODNとほぼ同一の結果が得られ、 complex形成に際して、 siRNAと dsODNは同等の挙動を示すことが示された。

(ii) 動的光散乱測定

電気泳動によつて形成が確認された、ブロック共重合体と dsODNからなるコンプレックスの動的光散乱測定を行った。測定結果を図 2に示す。

PEG-PLLと dsODNを N/P比を 2として混和したとき、粒径が 72 ナノメータの単峰性の会合体の存在が確認された。同様に PEG-DPTと dsODNを N/P比を 4として混和したものについても、粒径が 64 ナノメータの単峰性の会合体の存在が確認された。また、これらの会合体の ζ-ポテンシャルを測定したところ、それぞれ 1.5 mV、 3.5 mVであり、静電的にほぼ中性であることがわかった。さらに、このコンプレツクス溶液は調整後、長期間に渡り目立った凝集体（沈殿）を示さず水溶性の高い会合体であることが確認された。

以上の結果を総合的に解釈すると、形成される会合体は外殻に PEG層を有し、内核部にポリカチオンブロックと 2本鎖ォリゴ核酸のポリイオンコンプレックスを有するいわゆるコアーシェル構造のミセル様の形態の会合体であることが示された。なお、 dsODNと同一の配列を持つ siRNAを用いた場合も、ほぼ同様の会合体が形成されることは容易に推察できる。実施例 2

遺伝子ノックダウン機能の評価（ルシフェラーゼ遺伝子ノックダウン）

(1) 材料と方法

細胞に対して、ゥミホタル (GL3)及びゥミシィ夕ケ (RL)の異なった 2種のルシフエラ一ゼ遺伝子をトランスフエクシヨンし、次いで GL3 をターゲットとした siRNA complexを投与することによって、選択的に GL3の発現を阻害し、 RL発現をコントロールとして、そのノックダウン効果を評価した。

方法は、以下の通りである。まず、 HuH-7細胞を 24well dishに 2.5X 10⁴ cells/well になるように蒔き、 10%血清入り DMEM中で 24時間インキュベーションした後、実験を行った。培地を Opti-MEM (Invitrogen)に交換し、 pGL3及び pRLの 2種のルシフェラーゼ遺伝子をそれぞれコードした pDNA (Promega) を、同時に LipofectAMINE (Invitrogen)を用いてトランスフエクシヨンした。 4時間後、細胞を洗浄し、培地を 10%血清入り DMEMに交換し、先に調製した siRNA complexを、 siRNA量として 1 /i g/well添加した。 48時間後、 DuaHuciferase reporter assay system (Promega)を用いて、 2種のルシフェラーゼ (GL3及び RL)発現を定量した。遺伝子ノックダウンは、 GL3 targeting siRNAによる GL3の選択的な発現抑制を、 RLの発現量を標準とした GL3の相対的発現量によって評価し、 siRNAを投与していない mock細胞の GL3と RLの発現量比（GL3/RL) を基準に表示した。

(2) 結果

(i) PEG-PLL/siRNA complexを用いたルシフェラ一ゼ遺伝子ノックダウン図 3に示すように、 PEG-PLL/siRNA complex によって、市販の siRNA導入試薬である RNAiFect によるノックダウン効果にはやや及ばないものの、 GL3の発現は 60-70%も抑制された。 Complex を形成せず、核酸そのものの状態である naked siRNA では全くノックダウンが見られず、陰性対照の配列である GFP targeting siRNAによるノックダウンも見られなかった。従って、 PEG-PLL/siRNA complex によつて、有効な siRNA delivery及び遺伝子ノックダウンが得られたことが示された。 (ii) PEG-DPT/siRNA complexを用いたルシフェラーゼ遺伝子発現抑制

次に、 PEG-DET, PEG DPT, PEG APM PLLの各ブロック共重合体を用いた。図 4に示すように、各ブロック共重合体によって，良好なルシフェラーゼ遺伝子発現抑制が見られた。特に、 PEG-DPT では PEG-PLLをさらに上回る遺伝子発現の抑制が得られ、特に N/P比 =20では 80%近い抑制が得られ、 RNAiFectを上回る抑制効果となった。実施例 3

complexの血清中でのィンキュベーシヨン後の遺伝子ノックダウン

(1) 材料と方法

臨床において 2本鎖オリゴ核酸の delivery を有効に達成するためには、 complex の生理的環境下での安定性が非常に重要となる。しかし、従来これらの deliveryに用いられてきたのは、ほとんどが脂質をベースとして調製された試薬であつたが、生理的環境下では血清等の影響を非常に受けやすいため、期待される性能を発揮できないことが多く、実際の臨床応用に対して問題があった。

本実施例では、 2本鎖オリゴ核酸のひとつである siRNA complexの血清中での安定性評価を目的とし、前述のように調製された complexを 50%血清中でインキュべーシヨンした後に、遺伝子ノックダウン実験に用いた。

方法は、実施例 2と同様に、 HuH-7細胞に対し、 pGL3及び pRLの 2種のルシフエラ一ゼ遺伝子をコードした pDNAをトランスフエクシヨンした後、 GL3の選択的なノックダウンによって行った。 siRNA complex として、 PEG_DPT/siRNA、 PEG-PLL/siRNAの 2種を用いた。投与前の血清中でのィンキュベーシヨンとして、 complex溶液に等量の血清を添加し、 37でで 30分インキュベーションを行った後、実験に使用した。遺伝子ノックダウンの評価は実施例 2と同様に、 RLの発現量を標準とした GL3の相対的発現量によって評価した。

(2) 結果

図 5に示すように、ブロック共重合体を用いた系では、 PEG-PLL及び PEG-DPT ともに、血清中でのィンキュベーション後もその遺伝子ノックダウン効果は比較的変化が少なく保たれるのに対し、脂質をべ一スとした RNAiFectではそのノックダウン効果は約 1/2に減少した。

従って、ブロック共重合体と siRNAとの complex化によって得られる、外殻が PEG によって覆われ内核に siRNAを内包するといぅミセル構造は、生理的環境下にても非常に安定したノックダウン機能を発揮するのに有効であることが示された。実施例 4

内在性遺伝子 (endogenous gene)のノックダウン（LaminA/C)

本実施例では、プロック共重合体による siRNA delivery ifi endogenous geneのノックダウンに対しても同様に機能しうることを確認するため、核タンパクの一種である LaminA/Cを夕一ゲットとした siRNAを用レ、 LaminA/C mRNAのノックダウンを定量 PCR法にて評価した。

(1) 材料と方法

HuH-7細胞および 293T細胞をそれぞれ 6well dishに蒔き、 10%血清入り DMEM 中で 24時間ィンキュベ一シヨンをした後、実験を行った。 Mediumを交換し、各 well に 10 %血清入り DMEM を 1ml カ卩え、先に調製した siRNA complex (PEG-DPT/siRNA, PEG-PLL/siRNA)を、 siRNA量として 4 g/wellずつ添加した。

48時間のインキュベーション後、 RNAeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて、各 well より RNA を抽出、精製した。 Real-time PCR システム（Prism7000， Applied Biosystems)を用いて、 LaminA/Cおよび内部標準である GAPDHの mRNA発現量を定量した。 LaminA/C のノックダウンの評価は、 GAPDH 発現量を標準とした LaminA/Cの相対的発現定量として行い、 siRNAを投与していない mock細胞の発現量比 (LaminA/C I GAPDH)を基準として表示した。

(2) 結果

図 6に示すように、 HuH-7細胞（上パネル）、 293T細胞（下パネル）のいずれにおいても、各 siRNA complexによる LaminA/C mRNAの発現抑制が見られた。陰性対照として、 GL3 targeting siRNAの評価も RNAiFect及び PEG-DPTを用いて行つたが、いずれも全く LaminA/C mRNA の発現抑制は見られず、上記発現抑制は、 Lamin A/C targeting siRNAによる配列特異的な RNAiによるものであることが確認された。

実施例 2と同様に complex の血清中でのインキュベーションの影響を調べたところ、 PEG-DPTではインキュベーション後もほぼ同等の発現抑制が得られたのに対し、 RNAiFectではその抑制効率は大きく低下し、その生理的環境下での安定性が確認された。実施例 5

内在性遺 to子 (endogenous gene)のノックダウン (Autotaxin)

本実施例では、さらに他の内在性遺伝子に対しても遺伝子ノックダウンが可能であることを確認する目的で、細胞走化因子である Autotaxin (ATX)を夕一ゲットとした遺伝子ノックダウンを行った。実施例 4と同様に、 ATX mRNAのノックダウンを定量 PCR法にて評価した。

(1) 材料と方法

実施例 4と同様に、 HuH-7細胞を 6well dishに蒔き、 10%血清入り DMEM中で 24時間インキュベーションをした後、実験を行った。 Medium を交換し、各 well に 10 %血清入り DMEM を 1ml 加え、先に調製した siRNA complex (PEG DPT/siRNA, PEG-SPM/siRNA)を、 siRNA量として 4 g/wellずつ添加した。 48時間のインキュベーション後、 RNAeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて、各 well より RNA を抽出、精製した。 Real-time PCR システム（Prism7000， Applied Biosystems)を用いて、 ATXおよび内部標準である GAPDHの mRNA 発現量を定量した。 ATXのノックダウンの評価は、 GAPDH発現量を標準とした ATXの相対的発現定量として行い、 siRNAを投与していない mock細胞の発現量比 (ATX / GAPDH)を基準として表示した。

(2)結果

図 7に示すように、いずれの complexにおいても、 90%を超える ATX mRNA の発現抑制が見られた。 PEG-SPM/siRNAは PEG-DPT/siRNAと同程度の ATX mRNAの発現抑制を示した。陰性対照として、 GL3 targeting siRNAを用いた complexでは、全く ATX mRNAの発現抑制は見られず、 ATX targeting siRNA による配列特異的な遺伝子ノックダウンであることが確認された。実施例 5における Lamin A/C ノックダウンとくらべ、さらに効率の高い遺伝子ノックダウンが得られたことは、遺伝子の細胞内での恒常的な発現パターンの違い、 siRNA配列の有効性の違いが影響しているものと考えられる。以上から、ブロック共重合体による siRNA deliveryが、内在性遺伝子のノックダウンに対して、普遍的に機能しうることが確認された。 <まとめ >

非荷電性セグメントと荷電性セグメントからなるブロック共重合体と 2 本鎖オリゴ核酸を混和することで、ポリイオンコンプレックスが形成されることが確認された。 2本鎖オリゴ核酸のひとつである siRNAと、非荷電性セグメントと荷電性セグメントからなるブロック共重合体とをコンプレックス化することにより、内在性遺伝子のノックダウンを含めて、効率のよい遺伝子ノックダウンが可能であった。そのノックダウン効果は、塩基配列特異的であり、有効に siRNAが細胞内にデリバリーされたことによる RNAiであることが確認された。ノックダウンの効率は、脂質をベースとした市販 siRNA導入試薬と異なり、血清中でのインキュベーション後でも、非常に良好に保持された。以上より、本発明は、 siRNA をはじめとする 2本鎖オリゴ核酸を、生理的環境下においてもその機能を損なわずに安定に担持することが出来る、非常に実用性に優れたシステムであることが明らかとなった。従って、本発明の PIC は、 2本鎖オリゴ核酸を用いた疾患治療に必要となる、臨床応用可能なデリバリーシステムとして、非常に有用である。産業上の利用の可能性

本発明により、 siRNA等の 2本鎖オリゴ核酸の、組織又は細胞への優れた送達システム（delivery system) が提供される。本発明の 2本鎖オリゴ核酸担持ポリィォンコンプレックスは、生理環境下における安定性が高く、臨床応用可能な薬物送達システムとして機能する。また、本発明のポリイオンコンプレックスを医薬組成物として使用すると、組織又は細胞内の標的遺伝子を特異的にノックダウンすることが可能である。配列表フリーテキスト

配列番号 1 ： siRNA配列

Claims

1. 非荷電性セグメントと荷電性セグメントからなるブロック共重合体と、 2本鎖ォリゴ核酸とを含んでなるポリイオンコンプレックス。

2. コァ部に 2本鎖ォリゴ核酸を担持したポリマーミセルの形態にある請求項 1記載のポリイオンコンプレックス。

3.非荷電性セグメントがポリエチレングリコールまたはその誘導体である請求項 1 または 2記載のポリイオンコンプレックス。

言

4.荷電性セグメントがポリアミノ酸もしくはその誘導体またはそれらの塩である請求項 1〜3のいずれかに記載のポリイのオンコンプレックス。

5. 範

ブロック共重合体の構造が一般式（ I ) もしくは（II) またはそれらの塩で囲

ある請求項 1または 2記載のポリイオンコンプレックス。

(式中、 R ^{1 a}及び R ^{1 b}はそれぞれ独立して水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の〇ぃ₁₂アルキル基を表し、 L¹および L²は連結基を表し、 R^2A、 R^2B、 R^2E及び R^2Dはそれぞれ独立してメチレン基またはエチレン基を表し、 R³は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、 R⁴は R^5C又は R^5Dと同一であるかまたは開始剤残基であり、 R^5A、 R 5b、 R^{5 c}及び R^5Dはそれぞれ独立して水酸基、ォキシベンジル基、一 N H— (CH₂) _a— X基を表し、ここで Xはそれぞれ独立して一級、二級、三級ァミンまたは四級アンモニゥム塩の内一種類または二種類以上を含むァミン化合物残基であるか、あるいはァミンでない化合物残基であり、 aは 1 5の整数であり、 R ^{6 a}及び R ^{6 b}はそれぞれ独立して水素原子または保護基であり、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられている Z基、 B o c基、ァセチル基、トリフルォロアセチル基等であり、 mは 5 20, 000の整数であり、 nは 2 5, 000の整数であり、 yは 0 5, 00

0の整数であり、 zは 0 5 000の整数であるが、 y + zは nより大きくないものとする。）

6. R ^{1 a}又は R ^{1 b}がメチル基である請求項 5記載のポリイオンコンプレックス。

7. R^{l a}又は R^{l b}が置換された直鎖もしくは分枝 ₁₂アルキル基を表し、ここで置換基がァセタール化ホルミル基、シァノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、 C ₆アルコキシカルボニル基、 C₂-₇ァシルアミド基、同一もしくは異なるトリ—C ₆アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基である請求項 5記載のポリイオンコンプレックス。

8. L¹がー（CH₂) _b_NH—であり、ここで bは 1 5の整数である請求項 5 7のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

9. L²が— （CH₂) _c— CO—であり、ここで cは 1 5の整数である請求項 5 7のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

10. R^{2 a} R^2b R^{2 c}及び R^2dがメチレン基である請求項 5 9のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

1 1. Xが下記に示す式で表される基からなる群から選ばれるいずれかのものである請求項 5 1 0のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

一 (CH₂)厂 NH₂ -(NR^7a(CH₂)_d1)_e -, -NHR^8a 一 N(CH₃)₂

N(CH₂CH₃)₂ 一 (NR^7b(CH₂)_d2)_e2 - (NR^7c(CH₂)_d3)_e3 - NHR^8b

(式中、 X ²は水素原子または C卜₆アルキル基もしくはァミノ Cぃ₆アルキル基を表し、 R^{7 a}、 R^7b及び R^7eはそれぞれ独立して水素原子またはメチル基を表し、 d l、 d 2及び d 3はそれぞれ独立して 1〜 5の整数を表し、 e 1、 e 2及び e 3はそれぞれ独立して 1〜5の整数を表し、 f は 0〜 1 5の整数を表し、 R^8a及び R^8bはそれぞれ独立して水素原子または保護基を表し、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられている Z基、 B o c 基、ァセチル基、トリフルォロアセチル基等を表し、 gは 0〜1 5の整数を表す。）

1 2. R^{5 a}及び R^5bの合計の 85 %以上が— NH— (CH₂) _a- (NR^{7 a} (C H₂) _d1) _e1_NHR^8aである請求項 5、 6、 7、 8、 10及び 1 1のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

1 3. R^5c及び R^5dの合計の 8 5 %以上が— NH_ (CH₂) _a— (NR^{7 a} (C H₂) _d1) _e1— NHR^8aである請求項項 5、 6、 7、 9、 10及び 1 1のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

14. R^5a及び R^5bの合計の 85%以上が— NH— (CH₂) ₃— NH— (CH₂) 3— NH₂である請求項 5、 6、 7、 8、 1 0及び 1 1のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

1 5. R^5c及び R^5dの合計の 85%以上が— NH— (CH₂) ₃— NH— (CH₂) 3_NH₂である請求項 5、 6、 7、 9、 10及び 1 1のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

1 6. z = 0である請求項 5〜1 5のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

1 7. R³がァセチル基、ァクリロイル基またはメタクリロイル基である請求項 5、 6、 7、 8、 1 0、 1 1、 1 2、 14及び 16のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

1 8. R⁴が— NH— R⁹であり、ここで R⁹は未置換または置換された直鎖または分枝のじ卜 ₂。アルキル基を表す請求項 5、 6、 7、 9、 10、 1 1、 1 3、

1 5及び 1 6のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

1 9. 2本鎖オリゴ核酸が、遺伝子ノックダウン能を有する核酸分子である請求項 1〜 1 8のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

20. 遺伝子ノックダウン用核酸を、非荷電性セグメントと荷電性セグメントからなるブロック共重合体に静電結合させることを特徴とする、ポリイオンコンプレツクスの製造方法。

21. 請求項 1〜19のいずれか 1項に記載のポリイオンコンプレックスを含む医薬組成物。