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WO2005063975A1 - Helle, stabile, staub- und geruchsarme enzymgranulate - Google Patents

Helle, stabile, staub- und geruchsarme enzymgranulate Download PDF

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Publication number
WO2005063975A1
WO2005063975A1 PCT/EP2004/014286 EP2004014286W WO2005063975A1 WO 2005063975 A1 WO2005063975 A1 WO 2005063975A1 EP 2004014286 W EP2004014286 W EP 2004014286W WO 2005063975 A1 WO2005063975 A1 WO 2005063975A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
enzyme
particularly preferably
concentration
chromatography
granules
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2004/014286
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dieter Baur
Lars Kucka
Jens Van Holt
Udo Sturm
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Priority to EP04803905A priority Critical patent/EP1694836A1/de
Priority to JP2006544329A priority patent/JP2007515166A/ja
Publication of WO2005063975A1 publication Critical patent/WO2005063975A1/de
Priority to US11/471,239 priority patent/US20070185001A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/98—Preparation of granular or free-flowing enzyme compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D17/00—Detergent materials or soaps characterised by their shape or physical properties
    • C11D17/0039—Coated compositions or coated components in the compositions, (micro)capsules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38672—Granulated or coated enzymes

Definitions

  • the present invention is in the field of packaging technical enzymes. It relates to enzyme granules, which can be traced back to chromatographically and therefore gently decolorized and deodorized enzyme concentrates.
  • enzymes themselves are the effective agents of the products.
  • the enzymes In the fields of textile production and processing or food production, they primarily serve as aids to convert the raw materials into the actual product.
  • Technical enzymes are usually provided in liquid form or converted into the form of solid granules, depending on the type of use intended for them.
  • amylases Numerous different enzymes have been established for use in detergents and cleaning agents, with amylases, proteases, cellulases and lipases being of particular importance. Appropriate means are described in detail in the prior art. As examples of the corresponding use of amylases, reference is made to the following applications: WO 02/44350 A2 (for a cyclodextrin glucanotransferase with amylase activity); WO 02/10356 A2, WO 03/014358 A2, WO 03/002711 A2, WO 03/054177 A2, DE 10309803.8 A1 ( ⁇ -amylases); DE 102004048590.9 and DE 102004048591.7 (machine dishwashing detergents containing ⁇ -amylase; both not previously published).
  • WO 96/34092 A2 WO 01/32817 A1 and WO 93/22414 A1 relate to cellulases and cellulase-containing detergents and cleaning agents.
  • WO 97/08281 A1 WO 95/27029 A1 and WO 97/41212 A1 relate to lipases and lipase-containing washing and cleaning agents.
  • WO 91/02792 A1 WO 92/21760 A1, WO 95/23221 A1, WO 03/038082 A2, WO 02/088340 A2, WO 03 / 054185 A1, WO 03/056017 A2, WO 03/055974 A2, WO 03/054184 A1, DE 102004027091.0, DE 10360805.2 and DE 102004019751.2 (the last three not previously published).
  • application WO 98/55579 A1 describes that two different proteases can also be used side by side in detergents and even better in cleaning agents.
  • Enzymes are usually produced by fermentation of microorganisms and then purified from the liquid media in question. Purification or enrichment processes for obtaining concentrated enzyme solutions are described in detail in the prior art. Techniques based on filtration, sedimentation or precipitation are mostly used for the purification, whereby the biomass is first separated and then the enzyme concentrate is obtained using increasingly more sensitive methods such as separation, microfiltration or ultrafiltration.
  • application WO 01/37628 A2 discloses a process for obtaining biotechnologically produced valuable substances from culture and / or fermenter solutions, which involves separating the water-insoluble solids from the aqueous solution containing the valuable substances, then filtering the resulting solution and concentrating it the valuable solution by means of ultrafiltration. It is characterized in that the separated solids are subjected to a washing step, the filtrate from the concentration stage being used as the washing liquid.
  • the prior art also describes methods for decolorizing and deodorising concentrated enzyme solutions.
  • This includes precipitation methods, for example with organic solvents or polymers, but especially the salting out of the protein of interest with sodium sulfate (described in H. Ruttloff (1994): “Industrial Enzymes”Behr's Verlag, Hamburg, Chapter 6.3.3.6, pages 376 to 379)
  • the protein is precipitated, the accompanying substances remaining in the supernatant.
  • part of the protein is irreversibly denatured by the precipitation and resuspending and the overall stability is impaired; not least because stabilizing compounds are also separated. Approx. 50% of the yield to be achieved is given in the table on page 378 of this textbook.
  • Examples of the adsorptive purification of enzymes can also be found in the patent literature, for example the publications WO 97/41212 A1 and WO 93/22414 A1.
  • the first of these two publications describes several alkaline lipases that are suitable for use in detergents and cleaning agents.
  • the preparation described therein comprises chromatography steps in several cases, after which size fractionation is carried out via gel filtration and / or the enzymes of interest are bound to a column material via ion exchange chromatography and then eluted as clean fractions and thus largely purified.
  • WO 93/22414 A1 describes detergent formulations with a mixture of different cellulase types. The latter are obtained by separating more complex cellulase mixtures via gel filtration for size fractionation and via ion exchange chromatography for fractionation via certain physico-chemical properties.
  • the further processing provides, inter alia, a mixture with further solutions, for example stabilizers. Further processing into solid granules is not specifically described in this application.
  • a process for the production of enzyme granules from enzyme solutions is disclosed, for example, in application WO 92/11347 A2. Accordingly, the concentrated fermentation broth is mixed with an additive which contains 10 to 35% by weight of cereal flour (based on the finished granulate). Accordingly, a coating with a water-soluble, film-forming polymer, which contains dye or pigment, can additionally be applied to such granules in order to mask the intrinsic color of the granules. In the example, it is a layer of titanium dioxide and polyethylene glycol that is applied during the fluidized bed drying. A possible decolorization or deodorization of the introduced enzyme concentrates is not disclosed.
  • the application WO 95 / 02031A1 mentions among other things the task of covering the intrinsic color of the uncoated granules and of suppressing a possibly disruptive odor by preventing the diffusion of the odorous substances.
  • a coating system which contains finely divided inorganic pigment, an alcohol or an alcohol mixture with a melting point in the range from 45-65 ° C., an emulsifier for the alcohol, a dispersant for the pigment and water.
  • the application WO 98/26037A2 also deals specifically with the problems of covering, in addition to increasing the storage stability, the inherent color attributable to the enzyme concentrate and a possibly disruptive odor of the granules.
  • a coating system that contains finely divided, water-insoluble pigment (for example titanium dioxide), a water-soluble organic material that is solid at room temperature (for example an ethoxylated fatty alcohol) and optionally a flow improver.
  • finely divided, water-insoluble pigment for example titanium dioxide
  • a water-soluble organic material that is solid at room temperature
  • optionally a flow improver for example an ethoxylated fatty alcohol
  • the task was to provide a solid enzyme granulate which is comparatively stable in storage, has a low odor and has an appealing color.
  • These enzyme granules should be able to be coated or coated, the coated enzyme granules obtained having a color which is as light as that of conventionally coated enzyme granules, but should tend to produce less dust when subjected to mechanical stress.
  • Such an enzyme granulate or such a coated enzyme granulate should be particularly suitable for incorporation into detergents and cleaning agents.
  • a method for producing an enzyme granulate from an aqueous, purified enzyme solution was invented, which is characterized by the following steps:
  • the ion exchange chromatography in process step (a) causes gentle decolorization and deodorization of the enzyme concentrate, which is further processed to an enzyme granulate via steps (b) and (c).
  • Such enzyme concentrates are, as shown in the previously unpublished application DE 10304066, more stable than concentrates decolorized and deodorized in another way. According to the present invention, this also results in greater stability for the granules.
  • the decolorization has a lighter color and weaker smell than conventionally prepared enzyme concentrates. This benefits the granules derived from this in that they also have a more appealing, that is, light color and reduced odor.
  • these coated granules In the event of a subsequent coating of these granules, less pigment needs to be added to them because of the lighter intrinsic color, so that these coated granules in turn have further advantageous properties. This includes, in particular, reduced dust formation when subjected to mechanical loads. Such granules are therefore particularly suitable for further processing, in particular for incorporation into corresponding formulations, such as in washing or cleaning agents.
  • the present invention thus relates to processes for the production of enzyme granules which are characterized by the steps mentioned, in particular ion-exchange chromatography.
  • step (d) is followed by a coating of these granules.
  • Further subject matter of the invention are the granules obtained in accordance with the process and agents which contain such granules, including in particular detergents and cleaning agents.
  • Processes for the preparation of an aqueous, purified enzyme solution preceding process step (a) are known to the person skilled in the art from the prior art and are generally referred to as downstream processing, which takes place after the fermentation and precedes the packaging. It is used to obtain largely biomass-free, preferably enriched, aqueous enzyme solutions. As a rule, it comprises several sub-steps, such as cell disruption, removal of the cell debris, in particular by pelleting, decanting and centrifugation steps. Separation, micro, ultra or sterile filtration, deodorization and concentration, i.e. removal of the solvent up to a medium concentration range of the enzyme, can already be used at this point or can be inserted as optional steps.
  • the optimum working range must be determined individually for each enzyme, not only with regard to the temperature, the pH and the ionic strength, but in particular with regard to the enzyme concentration range to be set before step (a).
  • the enrichment should be controlled, in particular by timely termination of the concentration, in such a way that the enzyme concentrate obtained just barely has any (quantitative) protein precipitation.
  • the optimal concentration range for the protease from Bacillus lentus examined therein is 700,000 to 800,000 HPE / g. Above this range, the proportion of precipitated solids will soon increase disproportionately depending on the activity, which is accompanied by a drastically increasing loss of good product due to denaturation and precipitation.
  • a commercially available Rotavapor or a commercially available thin-film evaporator can be used.
  • the separation in particular of the precipitates (solids) resulting from the concentration, relates in particular to foreign proteins and / or inactive enzymes, particularly in the vicinity of the solubility product. This step is also called separation. It is also carried out according to methods known per se, for example using a separator; Filtration steps are also possible in principle. Ultrafiltration is also possible; this is described for example in WO 01/37628 A2. This gives comparatively pure enzyme solutions with a low solids content which have already been enriched to an average concentration.
  • the enzyme solution should also be adjusted to a pH value that is compatible with the enzyme and at which it has a positive charge.
  • Step (a) represents the core of the invention with the decolorization of the previously purified enzyme solution via an anion exchanger (adsorber).
  • the colored accompanying substances in particular the Maillard compounds in particular, and the odorous substances adsorb to the resin, while the strongly positive charge of the exchanger does not bind the proteins, which are also positively charged under the conditions to be selected, on the resin, but are obtained with the eluate in a largely clear solution.
  • Step (a) thus represents a selective separation of the dyes from the concentrated enzyme solution, while the enzyme of interest and at least some of the enzyme-stabilizing factors remain in solution; chemically, the latter are mostly also proteins.
  • the accompanying substances bound to the resin are, as indicated in FIG. 1 by corresponding thick arrows, subsequently, that is to say after the phase containing the valuable substance (of the good product) has emerged and, if appropriate, an after-run in a separate step.
  • This is done, for example, with solutions with high ionic strength, such as concentrated NaCl solutions.
  • the anion exchanger material can be regenerated via appropriate counterions, for example NaOH.
  • other simple salts may be more suitable.
  • the system is therefore "CIP" capable (for "cleaning in place”).
  • the liquid enzyme is largely free of troublesome streaks, precipitates and dyes. It remains bright, clear and bright even when stored for a long time at different temperatures and at the same time has a high degree of stability.
  • This refined concentrated enzyme solution is clearly depleted, especially with regard to the colored impurities, but still contains practically colorless accompanying substances, which are very welcome due to their partially stabilizing effect and do not need to / should not be separated from the concentrated enzyme solution.
  • additional intermediate steps can be forwarded, inserted, connected or carried out together with the steps mentioned.
  • one possibility is to separate additional accompanying substances from the concentrated enzyme solution in a targeted manner by means of one or more additional chromatography steps, in particular via other carrier materials. This can be done at any point in time that appears sensible in individual cases, advantageously immediately before or after the chromatography step described under (a). if separated from each other by intermediate steps such as filtration or re-solubilization.
  • step (c) Methods for converting enzyme solutions into solid granules according to step (c) are also described in detail in the prior art. They usually start by mixing the enzyme with certain additives and deliver particles. These include, for example, the methods of fluidized bed granulation, mixed granulation in vertical mixers, countercurrent pellet mixers, Flexomix agglomerators, ploughshare mixers or Ruberg mixers, roll granulation, for example in granulating drums or granulating plates, or press granulation, which can be carried out, for example, with presses or extruders. These techniques are described in textbooks such as the "Handbuch der Agglomerationstechnik" by G. Heinze (1999, publisher Wiley-VCH, Weinheim, Germany, ISBN 3-527-29788-X, pp. 65-170).
  • a preferred method can be found, for example, in European patent EP 168526 B1, according to which the enzyme granules contain starch which is swellable in water, zeolite and water-soluble granulation aid.
  • the production process proposed here consists essentially in concentrating the fermenter solution freed from insoluble constituents, adding the additives mentioned, granulating the resulting mixture and, if appropriate, enveloping the granules with film-forming polymers and dyes.
  • enzyme granules produced by an alternative process with favorable properties for use in granular detergents and cleaning agents contain enzyme, swellable starch, water-soluble organic polymer as a granulating aid, cereal flour and some water. This composition of the additives enables enzyme processing without major loss of activity.
  • the processes are characterized by an additional step (d) coating (coating).
  • coating a largely colorless and odorless enzyme granulate makes sense to protect the ingredient against adverse external influences. These include, in particular, moisture, which can swell and disintegrate the particle and activate the enzyme contained in the particle, as well as the influence of atmospheric oxygen, which can lead to oxidative inactivation.
  • the granules obtained according to (c) are first of all spheronized, for example in a Marumerizer, then the water content is reduced, for example via a fluidized bed reactor, and only then is the protective layer applied.
  • the latter can take place, for example, in conventional mixers, for example from the Lödige company (Germany) or in the fluidized bed.
  • a protective layer is applied via a so-called melt coating.
  • a polymer for example a polymeric alcohol
  • an emulsifier for this polymer advantageously together with a pigment which gives the resulting coated particles their color.
  • a method is described, for example, in WO 95/02031 A1, in particular for use in detergents and cleaning agents.
  • the white titanium dioxide is preferably used as the pigment.
  • Preferred processes are characterized in that anion exchange chromatography is carried out in step (a), preferably using a material which has a maximum exchange capacity in the pH range from 5 to 11 and particularly preferably from 6 to 8. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • alkaline proteins such as the enzymes secreted by alkaliphilic microorganisms, in particular proteases
  • alkaline proteins have an isoelectric point in the alkaline range and are therefore positively charged in the preferred pH range in which the ion exchanger works optimally and therefore do not bind to it material in question.
  • an ideal pH value for this method must be determined experimentally and adjusted with regard to step (a). In Example 1, this value for the selected alkaline protease was 7.5.
  • an anion exchanger is selected whose maximum exchange capacity corresponds to the IEP of the enzyme of interest.
  • the anion exchanger for step (a) has quaternary ammonium groups as functional groups, preferably substituted with at least two alkyl groups, particularly preferably with at least two alkyl groups with 1 or 2 carbon atoms, optionally additionally with a 1 or Hydroxyalkyl group having 2 carbon atoms. Because of their chemical properties, these have proven to be particularly suitable for step (a).
  • anion exchange chromatography processes which are characterized in that the anion exchanger for step (a) has trimethyl-ammonium or dimethylethanol-ammonium groups as functional groups.
  • the latter is somewhat weaker basic than the first, so that this variation can be used to optimize for corresponding proteins.
  • anion exchange chromatography is carried out in a pH range from 5 to 9, preferably from 6 to 8.5, particularly preferably from 7 to 8. All integer and non-integer values between these numbers are included. According to what has been said above, this depends on the isoelectric point of the (preferably alkaline; see below) enzyme and the optimally selected optimum working range of the ion exchanger.
  • the ion exchanger for step (a) has an exchange capacity of 0.7 to 1.2 meq / ml, preferably 0.8 to 1.1 meq / ml, and particularly preferably 0.9 to 1, 0 meq / ml. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • This value for the exchange capacity indicates how densely the material is occupied by the functional groups.
  • the specified ranges have proven empirically, in particular in Example 1 of the present application, to be advantageous and depend on how high the concentration of the accompanying substances, which are difficult to quantify, in the enzyme solution. Suitable work areas must be determined experimentally in individual cases and depend in particular on how many of these accompanying substances have already been separated off by the preceding steps together with the higher molecular weight compounds.
  • Preferred processes are characterized in that the ion exchanger for step (a) has effective pore sizes of 0.2 to 0.7 mm, preferably 0.3 to 0.6 mm, particularly preferably 0.4 to 0.5 mm. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • a chromatography material For the protease investigated in the example with a molecular weight of approx. 27 kD, a chromatography material has been found to be useful, the effective pore size of which is 0.45 mm. For significantly larger or smaller proteins, chromatography materials with correspondingly larger or smaller effective pore sizes should be selected.
  • the material of the ion exchanger for step (a) has a particle size distribution of 150 to 3,000 ⁇ m, preferably 175 to 1,500 ⁇ m, particularly preferably 200 to 800 ⁇ m. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • ion exchanger for step (a) is based on a porous plastic polymer, preferably a styrene-DVB copolymer.
  • DIAION ® series Chromatography materials that have the properties just discussed are described in detail in the prior art. Examples from the DIAION ® series are described in the “DIAION ® . Manual of ion exchange resins and synthetic adsorbent, Volume I "by Mitsubishi Kasei Corp. (Tokyo, Japan), June 1995, on pages 104 to 108 and in the" Product Line Brochure DIAION ® “, as of June 1st, 2001, described on pages 4 to 6, which is available from the manufacturer or Summit Chemicals Europe GmbH, Düsseldorf, Germany.
  • the series DIAION ® SA, DIAION ® PA and DIAION ® HPA are described as strong basic anion exchangers. A representative thereof, namely DIAION ® PA308L was successfully used in Example 1 for the present application.
  • the implementation conditions also determine the success of the chromatography according to the invention.
  • this includes a certain bed volume, which is the volume ratio of the solution applied to that of the column, and a certain residence time, which is indicated by the amount of enzyme per g of material and unit of time.
  • step (a) is carried out with a bed volume ratio of 0.1 to 100, preferably 0.5 to 40, particularly preferably 1 to 4. Locked in are all integer and non-integer values between these numbers.
  • step (a) with an average residence time of 0.01 to 2 g, preferably 0.025 to 0.1 g, particularly preferably 0.04 to 0.06 g and very particularly preferably from 0.05 g of enzyme per g of ion exchange material and minute. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • thermodynamic value describes the separation process and has been found to be optimal in Example 1. It must be determined individually, depending on the properties of the material and the enzyme to be purified.
  • Particularly suitable methods are characterized in that they are largely controlled automatically.
  • step (a) is controlled via the conductivity of the eluate, in particular the separation between the leading and good product and / or good product and trailing.
  • a particularly easy control option is based on the fact that the conductivity (measurable as ⁇ S / cm) of a processed good is determined at critical points and used for control. In this way, the transition from the lead to the good product and its end can be detected via corresponding changes in conductivity. A corresponding control unit then forwards the respective liquid flows accordingly.
  • those methods are preferred which are characterized in that the chromatography in step (a) is carried out with recirculation of at least part of the leading and / or trailing ion exchange chromatography into the enzyme solution before the chromatography.
  • Preferred processes are characterized in that a suitable concentration is set in step (b) by concentrating the enzyme solution.
  • step (a) may be very highly concentrated, so that additional solvent must be added in step (b) in order to set a suitable concentration.
  • the solution will be diluted too much because the separation efficiency of the chromatography and the overall yield of the good product depend on an optimal dilution. Concentration of the enzyme solution is therefore preferred. According to the invention, however, this is less about failures and resumption in a smaller volume, because, as explained above, the desired accompanying substances would also be lost. Rather, methods are preferred in which only the volume of the solvent present after the chromatography is reduced. Such methods are known per se from the prior art and have already been presented above as preparation for step (a).
  • a commercially available Rotavapor or a commercially available thin-film evaporator can also be used at this point, for example. They can be controlled via the respective device parameters and the respective reaction time.
  • step (b) concentration in step (b) with a concentration ratio of 1.01 to 10, preferably from 1.1 to 8, particularly preferably from 1.2 to 4, in each case based on the associated volumes. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • This measure describing the concentration is calculated from the ratio of the initial volume of the chromatographed solution to that of the concentrated solution. To a certain extent, this step is a preparation for the subsequent granulation, in which further water is removed.
  • the final volume to be aimed for and all of the parameters listed below depend not only on the concentration of the enzyme solution after chromatography, but also on the requirements of the subsequent granulation step (c). They may have to be optimized based on experience with the relevant devices used for granulation. This is familiar to the person skilled in the art.
  • Processes which are characterized in that the dry substance content at the start of the concentration in step (b) are 0.1 to 40% by weight, preferably 0.5 to 20% by weight, particularly preferably 1 up to 15% by weight. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • This value which is also to be empirically optimized, depends primarily on the implementation of the chromatography. It is crucial that this is done with an optimal separation. The following step must be adapted to this. If the dry matter content is close to or significantly below the lower limit, the concentration can be carried out in two successive steps and if necessary. Carry out using two different processes or devices that work differently.
  • This value which is easy to set via the respective device settings, depends in particular on the properties of the assembled enzyme. High temperatures accelerate the process, but usually have a detrimental effect on the enzyme. An optimal value is to be determined empirically. In the example of the present application, approximately 35 ° C. at approximately 50 mbar have proven to be advantageous for the packaging of a subtilisin.
  • Preferred among the processes according to the invention are those which are characterized in that the dry substance content at the end of the adjustment of the suitable concentration in step (b) is 8 to 50% by weight, preferably 9 to 40% by weight, particularly preferably 10 to 35 wt .-% is. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • This value determines the biophysical properties of the enzyme price, for example the viscosity or for the miscibility with the subsequently added compounds and the dilution which may result therefrom and is therefore decisive for the success of the subsequent granulation step.
  • the choice of the respective granulation system thus determines the optimal dry matter content and must be determined experimentally in individual cases. Variations also result from the choice of process, such as thin-film evaporation or ultrafiltration. In the latter case, a characteristic upper limit cannot be exceeded.
  • Preferred methods according to the invention are those which are characterized in that the concentrate in step (b) is adjusted to a viscosity of 1 to 1,000 mPas, preferably 1 to 500 mPas, particularly preferably 1 to 200 mPas. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • this value depends in particular on the requirements of the subsequent granulation.
  • enzymes which are made up according to the invention. Enzymes are preferred embodiments because, on the one hand, they are of particular technical interest. Nonetheless, this method can be applied to all water-soluble proteins, provided that corresponding solvent systems and chromatography materials can be found and appropriate detection reactions can be established. For example, this applies to peptides, such as peptide hormones, oligopeptides with pharmacological importance or to antibodies. Antibodies could also be used for detection, for example. For the purposes of the present invention, all these proteins are to be understood as enzymes.
  • the focus of interest is on technically usable enzymes in the conventional sense.
  • This is preferably a hydrolase or an oxidoreductase, particularly preferably a protease, amylase, cellulase, hemicellulase, lipase, cutinase or a peroxidase.
  • they are correspondingly preferred, provided that they can advantageously be added to the intended use in the form of solid granules.
  • These include, for example, proteases and amylases, as described, for example, for liquid use in application DE 10304066.
  • proteases are preferred because they are the most important enzymes for detergents and cleaning agents.
  • the successful production of a protease granulate is described in the example for the present application.
  • the proteolytic activity (specified in HPE) can be measured as follows, based on the method described in Tenside 7 (1970), 125, by a discontinuous determination using casein as substrate:
  • concentrations of the substrate solution are 12 mg per ml of casein (manufactured according to Hammarsten; supplier: Merck, Darmstadt, No. 2242) and 30 mM Tris in synthetic tap water (aqueous solution of 0.029% (w / v) CaCI 2 * 2 H 2 0, 0.014% (W / V) MgCl 2 * 6 H 2 O and 0.021% (w / V) NaHCO 3 ) with a hardness of 15 degrees dH (German hardness).
  • the substrate solution is heated to 70 ° C and the pH is adjusted to pH 8.5 with 0.1 N NaOH at 50 ° C.
  • the protease solution is prepared with 2% (w / v) anhydrous pentasodium tripolyphosphate in synthetic tap water, the pH being adjusted to 8.5 with hydrochloric acid.
  • 200 ⁇ l of the enzyme solution are added to 600 ⁇ l of the casein substrate solution.
  • the mixture is incubated at 50 ° C for 15 min.
  • the reaction is terminated by adding 600 ⁇ l of 0.44 M trichloroacetic acid (TCA), 0.22 M sodium acetate in 3% (v / v) acetic acid.
  • TCA trichloroacetic acid
  • TCA-insoluble protein After cooling on ice within 15 min, the TCA-insoluble protein is removed by centrifugation, an aliquot of 900 ml is mixed with 300 ⁇ l of 2N NaOH, and the extinction of this mixture, which contains TCA-soluble peptides, is 290 nm added.
  • Control values are prepared by adding 600 ⁇ l of the TCA solution to 600 ⁇ l casein solution followed by 200 ⁇ l enzyme solution.
  • a protease solution that produces an absorbance change of 0.500 OD at 290 nm under the conditions of this experiment has an activity of 10 Pe per ml.
  • the concentration setting depends on what activity the granules obtained by step (c) or (d) should have.
  • a final activity of approx. 1,000,000 HPE / g has proven to be advantageous for use in detergents and cleaning agents; this content was also concentrated according to Example 1.
  • Additional ingredients can be added to the enzyme preparation, particularly in the course of adjusting the concentration. Since solid enzyme preparations also tend to denature and thereby lose their activity during storage, it is advantageous to add a stabilizer or a stabilizer mixture in particular at this point.
  • Such connections are known per se from the prior art. These are, for example, those which have a biophysical effect on the regulation of water activity, for example stabilizing against temperature fluctuations, such as polyols and among these preferably glycerol or particularly preferably 1,2-propanediol, and those which reversibly inactivate proteases, in particular those containing boric or boric acid Protease inhibitors, or those that provide protection against oxidation.
  • the latter compounds include, for example, reducing agents, antioxidants and transition metal compounds. They are advantageously added in liquid form to provide a solution and / or an optimal one To achieve mixing. The water can be withdrawn at a later time (see below).
  • Additional ingredients can be added before the granulation if the intended area of use makes this appear appropriate.
  • These include, for example, surfactants, builders, perfume or other ingredients for the use of the granules in detergents and cleaning agents.
  • surfactants for example, surfactants, builders, perfume or other ingredients for the use of the granules in detergents and cleaning agents.
  • cyclodextrin, its precursors or derivatives as color transfer inhibitors into the granules.
  • Preferred methods according to the invention are those which are characterized in that the granulation in step (c) is carried out by extrusion.
  • This method with devices which can advantageously be used for this has already been described above.
  • the use of a twin-screw extruder is particularly advantageous and is illustrated by the example of the present application.
  • the extrudate obtained, which is generally still moist can then be transferred to a fluidized bed dryer for drying (see below). If granulation is carried out from the outset in such a fluidized bed dryer, this transfer is spared.
  • the extrusion gives granules which are stable in storage and at the same time show a favorable dissolving behavior, which is particularly beneficial for use in detergents and cleaning agents.
  • step (c) preference is given to those which are characterized in that the granulation in step (c) is controlled in such a way that an average particle size of 100 to 10,000 ⁇ m, preferably 200 to 5,000 ⁇ m, particularly preferably 400 to 1,000 ⁇ m is achieved during extrusion, in particular via the size of the perforated plates or the speed of the knife. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • the size of the particles obtained depends in particular on the area of use. For example, when used in detergents and cleaning agents, the requirements for mechanical stability and for the fastest possible dissolution in the wash liquor must be taken into account. Optimal sizes need become experimental and can be obtained via the granulation regulation systems known per se to the person skilled in the art.
  • Preferred among the methods according to the invention are those which are characterized in that the granulation in step (c) while mixing the enzyme concentrate from step (b) with one or more ingredients selected from the group consisting of cereal flour, starch, starch derivatives, cellulose, cellulose derivatives, Lubricants (plasticizers), sugar and enzyme stabilizers are used.
  • the mixtures according to the invention for granulation have already been mentioned above with reference to corresponding documents.
  • the composition of the ingredients determines the physical properties of the granules or coated particles obtained. This includes mechanical stability and the rate of dissolution, which depends crucially on how quickly water can penetrate the capillaries of the particles and thereby trigger their decay. This is controlled, for example, via swellable and / or soluble connections. All of these ingredients are known per se from the prior art.
  • polyols such as polyethylene glycol or polyvinyl alcohol serve as lubricants (plasticizers).
  • solvents for these lubricants can also be added, which are advantageously removed during the subsequent drying.
  • Sugar is primarily to be understood as mono- or oligosaccharides or mixtures thereof; In the example of the present application, sucrose is used for this.
  • Preferred methods according to the invention are those which are characterized in that the granules obtained by step (c) are dried.
  • this can be carried out by transferring it to another device or, if possible, in the same device in which the granulation took place.
  • the purpose is that an enzyme preparation, in particular one of hydrolytic enzymes, is generally more stable the less water is present.
  • the water contained accelerates a process of dissolving the particles that is intended later during use.
  • step (d) Particularly advantageous and correspondingly preferred are those processes with step (d) which are characterized in that the coating in step (d) with
  • plasticizer 0 to 30% by weight plasticizer
  • the granules obtained according to (c) have a lighter color and a lower odor than conventional granules. For this reason, there is no need for a coating in individual cases; otherwise a thinner coating is usually sufficient, especially one with less pigment. This applies in particular to a coating with a white pigment.
  • the properties of the particles such as the elasticity, in particular the surface properties, such as the dust rate, are determined more by the other coating components.
  • granules with less pigment form less abrasion and therefore represent less dust pollution. In addition, there is a financial effect because less raw material is required.
  • a coating of polyethylene glycol 20,000 and 6 to 20% by weight of titanium dioxide has proven particularly advantageous.
  • Commercially available devices known for this purpose can be used for this, in the example concerned this is a top spray fluidized bed coater.
  • the stabilizers already mentioned above can also be added at this point as optional ingredients. Furthermore, it is advantageous and therefore correspondingly preferred if additional substances are added which benefit the later use of the granules. As mentioned above, this includes, for example, surfactants or builders for use in detergents and cleaning agents. Another example of this is, for example, according to WO 95/17493 A1, the addition of silver corrosion inhibitors, bleaching agents and / or bleach activators, in particular for later use in automatic dishwashing agents. Also preferred are those processes which are characterized in that the coating contains 2.5 to 27.5% by weight, preferably 5 to 25% by weight, of pigment. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • the coating contains 0.5 to 15% by weight, preferably 1 to 5% by weight, of plasticizer. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • This value depends in particular on the flowability of the film former under the set conditions. According to the invention, however, it is lower than usual in the prior art because the flowability automatically increases with a smaller proportion of brittle, dry pigment.
  • the coating contains 7.5 to 95% by weight, preferably 10 to 90% by weight, particularly preferably 20 to 80% by weight, of film-forming agent. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • the thickness of the coating is 1 to 150 ⁇ m, preferably 5 to 50 ⁇ m, particularly preferably 10 to 30 ⁇ m. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • the layer thickness can therefore be below the values customary hitherto because a considerable proportion of pigment can be dispensed with.
  • the coating of approximately 80% by weight of PEG and approximately 20% by weight of titanium dioxide described in Example 1 has an average layer thickness of approximately 20 ⁇ m.
  • an industrially usable enzyme is introduced in step (a), preferably a protease, particularly preferably an alkaline protease.
  • granules obtained by step (d), in particular by controlling the granulation in step (c), have an average particle size of 110 to 5,000 ⁇ m, preferably 200 to 2,000 ⁇ m, particularly preferably receives from 400 to 1,200 microns. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • step (a) a protease is introduced in step (a) and the granules obtained by step (c) or (d) are average, in particular by adjusting the concentration in step (b) Activity of 50,000 to 500,000 HPE / g, preferably from 100,000 to 450,000 HPE / g, particularly preferably from 140,000 to 380,000 HPE / g. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • a separate subject of the invention is an enzyme granulate which has been obtained by one of the previously described processes and which accordingly has favorable properties.
  • an agent containing such an enzyme granulate is to be understood as any formulation or formulation which contains such a granulate as an active component. The rest of its composition is determined by the area in which the agent is used. It is particularly advantageous here to use coated granules according to the invention, since such ingredients contain other ingredients which could endanger the stability of the granules according to the invention or the enzyme contained therein.
  • agents in solid form overall preferably in powder form or compacted, of which particularly preferably compacted into tablets.
  • it is a detergent or a cleaning agent.
  • cleaning agents both concentrates and agents to be used undiluted, for use on a commercial scale, in the washing machine or for hand washing or cleaning.
  • cleaning agents include, for example, detergents for textiles, carpets or natural fibers, for which the term detergent is used according to the present invention.
  • detergents for textiles, carpets or natural fibers for which the term detergent is used according to the present invention.
  • Any type of detergent or cleaning agent represents an embodiment of the present invention, provided that it is enriched with an enzyme granulate produced according to the invention.
  • Embodiments of the present invention include all administration forms established according to the prior art and / or all expedient administration forms of the washing or cleaning agents according to the invention. According to the above, this includes, in particular, solid, powdery agents, optionally also of several phases, compressed or uncompressed; it also includes, for example: extrudates, granules, tablets or pouches, both in large containers and packaged in portions. Liquid, pasty or gel-like embodiments are also included, provided that the enzyme granules processed according to the invention can be stably obtained therein.
  • This also includes detergents and cleaning agents for commercial use, as well as those designed especially for the end user via the dosage form and the selection of ingredients.
  • the washing or cleaning agents according to the invention contain active enzymes in an amount from 2 ⁇ g to 20 mg, preferably from 5 ⁇ g to 17.5 mg, particularly preferably from 20 ⁇ g to 15 mg, very particularly preferably from 50 ⁇ g to 10 mg per gram of the agent. All integer and non-integer values between these numbers are included.
  • a washing or cleaning agent according to the invention optionally contains further ingredients known from the prior art, such as, for example, enzyme stabilizers, surfactants, for example nonionic, anionic and / or amphoteric surfactants, bleaching agents, bleach activators, bleaching catalysts, builders, Solvents, thickeners and, if appropriate, other conventional ingredients, sequestrants, electrolytes, optical brighteners, graying inhibitors, color transfer inhibitors, foam inhibitors, dyes and / or fragrances, antimicrobial agents and / or UV absorbers, to list only the most important classes of substances. Corresponding recipes are described in detail in the prior art.
  • Step 0 preparation of an aqueous, purified enzyme solution
  • a concentrated protease solution was prepared from a fermentation supernatant of protease-forming and secreting gram-positive bacteria.
  • the principle of separation is based on the fact that the enzyme is repelled from the carrier material and is thus carried along in the liquid stream while the accompanying substances are adsorbed on the immobile carrier. Part of the wake was passed over the column again to increase the yield. Subsequently, by rinsing with NaCl and NaOH Solutions washed out the compounds adsorbed on the column (especially dyes and odors) and in this way regenerated the fixed bed.
  • the technique of thermal concentration was chosen to classify the concentration of the protease concentrate obtained in step (a).
  • the enzyme solution was concentrated to a final activity of approx. 1,000,000 HPE / g using a commercially available rotary evaporator (Rotavapor, Büchi, Switzerland) at approx. 35 ° C and approx. 50 mbar.
  • the granulation was carried out using the extrusion technique.
  • the protease solution concentrated after step (b) was mixed in a batch mixer (from Lödige) with the following commercially available additives: corn starch, wheat flour, PEG 2,000 (from BASF, Germany), cellulose, sucrose.
  • step (c) The granules obtained from step (c) were then coated with an aqueous suspension of PEG 20,000 (from BASF) and rutile-type titanium dioxide (from Huntsman, Great Britain).
  • PEG 20,000 from BASF
  • rutile-type titanium dioxide from Huntsman, Great Britain.
  • a commercially available topspray fluidized bed coater (WSG 5, Glatt) was used for this and a temperature of less than 40 ° C. was maintained.
  • the coating obtained consisted of approximately 80% by weight of PEG and approximately 20% by weight of titanium dioxide and had an average layer thickness of approximately 20 ⁇ m.
  • the titanium dioxide content of the coating of granules according to the invention could be reduced to up to about 6% by weight, with
  • Figure 1 Block flow diagram for the production of a
  • Enzyme granules including the optional coating step. The following steps are shown, which follow the preparation of an aqueous, purified enzyme solution:
  • the end product after step (c) is an enzyme granulate according to the invention or after step (d) is a coated enzyme granulate according to the invention.

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Abstract

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Enzymgranulats aus einer wäßrigen, gereinigten Enzymlösung, gekennzeichnet durch die Schritte (a) lonenaustausch-Chromatographie, während der das interessierende Enzym in Lösung bleibt, (b) Einstellung einer geeigneten Konzentration und (c) Granulation. Optional kann als Schritt (d) eine Beschichtung (Coating) angeschlossen werden. Die erhaltenen Enzymgranulate gehen somit auf chromatographisch und damit schonend entfärbte und desodorierte Enzymkonzentrate zurück und weisen dementsprechend vorteilhafte Eigenschaften auf. Im Falle der Beschichtung können sie zur Erzielung einer hellen Farbe mit weniger Pigment in der Coatingschicht versehen werden, als bisher zur Erzielung derselben Farbe notwendig war. Damit erhöht sich die Elastizität der Beschichtung, und die beschichteten Granulate neigen dadurch weniger zur Staubbildung. Sie eignen sich insbesondere für die Einarbeitung in Wasch- und Reinigungsmittel.

Description

Helle, stabile, staub- und geruchsarme Enzymgranulate
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Konfektionierung technischer Enzyme. Sie betrifft Enzymgranulate, die auf chromatographisch und somit schonend entfärbte und desodorierte Enzymkonzentrate zurückgehen.
Wichtige technische Einsatzgebiete für Enzyme sind unter anderem Wasch- und Reinigungsmittel und Kosmetika. In diesen Bereichen stellen die Enzyme selbst die wirksamen Agentien der Produkte dar. Auf den Gebieten der Textilherstellung und - Verarbeitung oder der Lebensmittelherstellung dienen sie in erster Linie als Hilfsmittel, um die Rohstoffe zum eigentlichen Produkt umzusetzen. Technische Enzyme werden üblicherweise je nach Art des für sie beabsichtigten Einsatzes in flüssiger Form bereitgestellt oder in die Form fester Granulate überführt.
Für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln sind zahlreiche verschiedene Enzyme etabliert, wobei Amylasen, Proteasen, Cellulasen und Lipasen besondere Bedeutung besitzen. Entsprechende Mittel werden im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Als Beispiele für den entsprechenden Einsatz von Amylasen sei auf folgende Anmeldungen verwiesen: WO 02/44350 A2 (für eine Cyclodextrin-Glucanotransferase mit -Amylase-Aktivität); WO 02/10356 A2, WO 03/014358 A2, WO 03/002711 A2, WO 03/054177 A2, DE 10309803.8 A1 (α-Amylasen); DE 102004048590.9 und DE 102004048591.7 (α-Amylase-haltige maschinelle Geschirrspülmittel; beide nicht vorveröffentlicht). Beispielsweise WO 96/34092 A2, WO 01/32817 A1 und WO 93/22414 A1 betreffen Cellulasen und Cellulase-haltige Wasch- und Reinigungsmittel. WO 97/08281 A1 , WO 95/27029 A1 und WO 97/41212 A1 betreffen Lipasen und Lipase-haltige Wasch- und Reinigungsmittel. Und folgende beispielhafte Dokumente betreffen Proteasen und den Einsatz von Proteasen in Wasch- und Reinigungsmitteln: WO 91/02792 A1 , WO 92/21760 A1 , WO 95/23221 A1 , WO 03/038082 A2, WO 02/088340 A2, WO 03/054185 A1, WO 03/056017 A2, WO 03/055974 A2, WO 03/054184 A1 , DE 102004027091.0, DE 10360805.2 und DE 102004019751.2 (die letzten drei nicht vorveröffentlicht). Beispielsweise die Anmeldung WO 98/55579 A1 beschreibt, daß auch zwei verschiedene Proteasen nebeneinander in Wasch- und noch besser in Reinigungsmitteln eingesetzt werden können. Enzyme werden meist durch Fermentation von Mikroorganismen produziert und anschließend aus den betreffenden Flüssigmedien aufgereinigt. Reinigungs- oder Anreicherungsverfahren zur Gewinnung konzentrierter Enzymlösungen sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Zum Zweck der Reinigung kommen zumeist auf Filtration, Sedimentation oder Ausfällung beruhende Techniken zur Anwendung, wobei zunächst die Biomasse abgetrennt wird und anschließend über zunehmend sensitivere Methoden wie Separation, Mikrofiltration oder Ultrafiltration das Enzymkonzentrat erhalten wird.
So geht beispielsweise aus der Anmeldung WO 01/37628 A2 ein Verfahren zur Gewinnung von biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus Kultur- und/oder Fermenterlösungen hervor, welches das Trennen der wasserunlöslichen Feststoffe von der wäßrigen, die Wertstoffe enthaltenden Lösung, anschließendes Filtrieren der erhaltenen Lösung und Aufkonzentrieren der wertstoffhaltigen Lösung mittels Ultrafiltration umfaßt. Es ist dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennten Feststoffe einem Waschschritt unterzogen werden, wobei als Waschflüssigkeit das Filtrat aus der Aufkonzentrierungsstufe verwendet wird.
Die meisten Veredelungsmethoden sind nur in unzureichendem Maße geeignet, aus einem von der Biomasse abgetrennten Enzymkonzentrat denaturierte Proteine und farbige Verbindungen zu entfernen; oder sie entfernen zusammen mit diesen auch einen Großteil an stabilisierenden Faktoren. Die Folge davon ist in jedem Fall eine nicht zufriedenstellende Produktqualität. Denn entweder weist das Enzymkonzentrat Schlieren und/oder Schwebstoffe bis hin zu ausgefällten Stoffen auf oder es verfügt bei klarer Lösung über eine unzureichende Enzym-Stabilität. Diese Nachteile wirken sich auch auf die Produkte aus, in welche das betreffende Konzentrat eingearbeitet wird, insbesondere die hiervon abgeleiteten Enzymgranulate.
Im Stand der Technik sind auch Verfahren zur Entfärbung und Desodorierung von konzentrierten Enzymlösungen beschrieben. Hierzu gehören Fällungsmethoden, zum Beispiel mit organischen Lösungsmitteln oder Polymeren, insbesondere aber das Aussalzen des interessierenden Proteins mit Natriumsulfat (beschrieben in H.Ruttloff (1994): „Industrielle Enzyme" Behr's Verlag, Hamburg, Kapitel 6.3.3.6, Seiten 376 bis 379). Hierbei wird das Protein gefällt, wobei die Begleitstoffe im Überstand bleiben. Allerdings wird durch das Ausfällen und Resuspendieren ein Teil des Proteins irreversibel denaturiert und insgesamt die Stabilität beeinträchtigt; nicht zuletzt auch deshalb, weil auch stabilisierende Verbindungen abgetrennt werden. Als zu erzielende Ausbeute werden in der Tabelle auf Seite 378 dieses Lehrbuchs ca. 50% angegeben.
Eine weitere Alternative besteht in der adsorptiven Reinigung der Enzyme, beispielsweise über ein lonenaustausch-Harz (H.Ruttloff (1994): „Industrielle Enzyme" Behr's Verlag, Hamburg, Kapitel 6.3.3.7 und 6.3.3.8, Seiten 379 bis 396). Hierbei binden die interessierenden Proteine an ein Chromatographie-Material und werden anschließend mit einem anderen Medium eluiert. Allerdings werden hierdurch aufgrund von Denaturierungs- und Faltungseffekten ebenfalls zumeist nur schlechte Ausbeuten erzielt. So werden für verschiedene Chromatographieverfahren (außer der Affinitätschromatographie) in der Tabelle auf Seite 378 Ausbeutewerte von maximal ca. 60% angegeben. Die spezifischen, insbesondere die Affinitätschromatographie- Materialien sind im allgemeinen leistungsfähiger, aber sehr empfindlich und aufwendig herzustellen. Letztere finden daher überwiegend in der Medizintechnik Anwendung, jedoch praktisch nicht in der großtechnischen Enzymherstellung.
Beispiele für die adsorptive Reinigung von Enzymen können auch der Patentliteratur entnommen werden, etwa den Veröffentlichungen WO 97/41212 A1 und WO 93/22414 A1. In der ersten dieser beiden Schriften werden mehrere alkalische Lipasen beschrieben, die für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet sind. Ihre dort beschriebene Präparation umfaßt in mehreren Fällen Chromatographieschritte, wonach über Gelfiltrationen eine Größenfraktionierung erfolgt und/oder über lonenaustauschchromatographie die interessierenden Enzyme an ein Säulenmateriai gebunden und anschließend als saubere Fraktionen eluiert und somit weitgehend gereinigt erhalten werden. WO 93/22414 A1 beschreibt Waschmittelrezepturen mit einer Mischung verschiedener Cellulasetypen. Letztere werden dadurch erhalten, daß komplexere Cellulasegemische über Gelfiltrationen zur Größenfraktionierung und über lonenaustauschchromatographie zur Fraktionierung über gewisse physiko-chemische Eigenschaften aufgetrennt werden.
Der umgekehrte Ansatz, gezielt die Verunreinigungen über ein Trägermaterial aus der flüssigen Lösung abzureichern, ist bislang nur für Nahrungsmittelrohstoffe gewählt worden. So wird in dem Handbuch „DIAION®. Manual of ion exchange resins and synthetic adsorbent, Band II" von der Firma Mitsubishi Kasei Corp. (Tokyo, Japan), 2. Druck, 1.5.1993, auf den Seiten 93 bis 100 die Entfärbung von Zucker unter anderem über nacheinandergeschaltete, verschiedene lonenaustauschchromatographie-Schritte beschrieben. Durch diesen umgekehrten Ansatz ergeben sich grundsätzlich mehrere, im einzelnen jeweils sehr selektive Aufreinigungsschritte, bei denen die jeweils abtrennbare Verunreinigung auf dem entsprechenden Material verbleibt.
Die bislang unveröffentlichte Anmeldung DE 10304066 befaßt sich ebenfalls mit dem Problem, Enzymkonzentrate von Feststoffen, insbesondere von irreversibel denaturierten Proteinen zu befreien und gleichzeitig so gezielt zu entfärben - das heißt von den farbigen, meist braunen Verbindungen, die bei der der Fermentation vorangegangenen Sterilisation der Medienbestandteile entstanden sind, zu befreien - daß eine möglichst hohe Lagerstabilität der Konzentrate erhalten bleibt. Letzteres, möglichst ohne die Faktoren, die die Stabilität des interessierenden Proteins erhöhen, ebenfalls abzutrennen. Als Lösung dieser Aufgabe wurde demnach ein Verfahren zur Veredelung konzentrierter Enzymlösungen entwickelt, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
(a) Herstellung einer konzentrierten Enzymlösung,
(b) Abtrennung von Feststoffen, insbesondere von Fremdproteinen und/oder inaktiven Enzymen und
(c) starkbasische Anionenaustausch-Chromatographie.
Die Weiterverarbeitung sieht gemäß dieser Anmeldung unter anderem eine Mischung mit weiteren Lösungen, beispielsweise Stabilisatoren vor. Eine Weiterverarbeitung zu festen Granulaten wird in dieser Anmeldung jedoch nicht konkret beschrieben.
Auch für die Konfektionierungsmethode der Granulation besteht ein reichhaltiger Stand der Technik. Die wichtigsten Methoden hierfür sind in Lehrbüchern wie beispielsweise dem „Handbuch der Agglomerationstechnik" von G. Heinze (1999, Verlag Wiley-VCH, Weinheim, Deutschland, ISBN 3-527-29788-X, S. 65-170) beschrieben.
Ein großer Teil der Patentliteratur befaßt sich auch mit Beschichtungen (Coatings) für Enzymgranulate. In einigen Schriften wird sogar vorgeschlagen, die Enzyme selbst als eine Schicht unter mehreren aufzutragen. Dies erfüllt beispielsweise gemäß WO 93/07263 A2 einen mehrfachen Zweck, nämlich unter anderem die betreffenden Enzyme zeitverzögert freizusetzen, sie gegen äußere Einflüsse zu schützen und gleichzeitig das Maß an Enzymstaub, der von diesen Partikeln ausgeht, geringzuhalten. Die Eigenfärbung oder der Geruch der eingebrachten Enzyme werden hier jedoch ebensowenig diskutiert wie die eventuelle Aufgabe, diese zu überdecken. Die Anmeldung WO 93/07260 A1 diskutiert die eingebrachten Enzymkonzentrate lediglich in Hinblick auf ihre biophysikalischen Eigenschaften und schlägt beispielsweise vor, ihnen Binder oder Pulver zusetzen, um die weitere Verarbeitung zu erleichtern.
Ein Verfahren zur Herstellung von Enzymgranulaten aus Enzymlösungen geht beispielsweise aus der Anmeldung WO 92/11347 A2 hervor. Demnach wird die aufkonzentrierte Fermentationsbrühe mit einem Zuschlagsstoff vermischt, der 10 bis 35 Gew.-% Getreidemehl (bezogen auf das fertige Granulat) enthält. Optional kann demgemäß auf derartige Granulate zusätzlich ein Überzug mit einem wasserlöslichen, filmbildenden Polymer aufgebracht werden, welcher Farbstoff oder Pigment enthält, um die Eigenfärbung der Granulate zu überdecken. Im Beispiel handelt es sich um eine Schicht aus Titandioxid und Polyethylenglykol, die während der Wirbelschichttrockung aufgebracht wird. Eine eventuelle Entfärbung oder Desodorierung der eingebrachten Enzymkonzentrate wird nicht offenbart.
In der Anmeldung WO 97/40128 A1 werden ähnliche Enzymgranulate offenbart, die als Granulierhilfsmittel eine phophatierte Stärke enthalten. Auch hier wird eine eventuelle Entfärbung oder Desodorierung der eingebrachten Enzymkonzentrate nicht diskutiert. Stattdessen wird wiederum vorgeschlagen, die auf das Enzymkonzentrat zurückzuführende Eigenfarbe des Granulats mit Pigmenten zu überdecken. Hierfür wird im Beispiel wiederum Titandioxid verwendet, welches auf den meist Polyethylenglykol enthaltenden Partikeln haftet.
Die Anmeldung WO 95/02031A1 nennt als Aufgabe unter anderem, die Eigenfärbung des nicht umhüllten Granulats zu überdecken und einen eventuell störenden Geruch durch Verhinderung der Diffusion der Geruchsstoffe zu unterdrücken. Als Lösung hierfür offenbart sie ein Umhüllungssystem, das feinteiliges anorganisches Pigment, einen Alkohol oder ein Alkoholgemisch mit einem Schmelzpunkt im Bereich von 45 - 65°C, einen Emulgator für den Alkohol, ein Dispergiermittel für das Pigment und Wasser enthält. Mit den Problemen, neben einer Erhöhung der Lagerstabilität die auf das Enzymkonzentrat zurückzuführende Eigenfarbe sowie einen eventuell störenden Geruch des Granulats zu überdecken, befaßt sich auch gezielt die Anmeldung WO 98/26037A2. Hierfür stellt sie ein Umhüllungssystem zur Verfügung, das feinteiliges, wasserunlösliches Pigment (zum Beispiel Titandioxid), ein bei Raumtemperatur festes wasserlösliches organisches Material (zum Beispiel einen ethoxylierten Fettalkohol) und optional einen Rieselfähigkeitsverbesserer enthält. Auch hier wird also wiederum ein Überdecken der unerwünschten Eigenschaften vorgenommen und nicht eine Beseitigung der Verbindungen, auf die diese Eigenschaften zurückzuführen sind.
Wie aus den hier diskutierten Dokumenten hervorgeht, ist es einerseits bekannt, bei der Aufarbeitung von Enzymkonzentraten, diese zu stabilisieren und störende Begleitstoffe abzutrennen. Andererseits werden flüssige Enzymkonzentrate zu festen Granulaten weiterverarbeitet, bei denen es unter anderem als wünschenswert angesehen wird, Geruch und Farbe der enthaltenen Enzymkomponente zu überdecken, insbesondere über Beschichtungen. Demgegenüber ist jedoch bislang nicht angedacht worden, Farbe und Geruch von Enzymgranulaten dadurch zu verbessern, daß bereits entsprechend aufgearbeitete Enzymkonzentrate eingebracht werden. Möglicherweise stand dem auch das niedrige Maß an Stabilität von jenen Enzymkonzentraten entgegen, die auf herkömmliche Weise entfärbt und desodoriert werden.
Bislang existiert noch kein Stand der Technik, nach welchem besonders schonend aufgearbeitete Enzymkonzentrate zu festen Granulaten verarbeitet werden sollen. Insbesondere deren Weiterverarbeitung, etwa durch Beschichtung, und die Eigenschaften solcher beschichteter Granulate sind bislang noch nicht offenbart oder vorgeschlagen worden.
Es stellte sich die Aufgabe, ein festes Enzymgranulat zur Verfügung zu stellen, welches vergleichsweise lagerstabil ist, geruchsarm ist und über eine ansprechende Farbe verfügt. Dieses Enzymgranulat sollte beschichtet werden können oder beschichtet sein, wobei das erhaltene beschichtete Enzymgranulat eine ebenso helle Farbe wie herkömmlich beschichtete Enzymgranulate aufweisen, bei mechanischer Belastung aber zu einer geringeren Staubbildung neigen sollte. Solch ein Enzymgranulat beziehungsweise solch ein beschichtetes Enzymgranulat sollte insbesondere für die Einarbeitung in Wasch- und Reinigungsmittel geeignet sein. Zur Lösung dieser Aufgabe wurde ein Verfahren zur Herstellung eines Enzymgranulats aus einer wäßrigen, gereinigten Enzymlösung erfunden, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
(a) lonenaustausch-Chromatographie, während der das interessierende Enzym in Lösung bleibt,
(b) Einstellung einer geeigneten Konzentration und
(c) Granulation.
Die lonenaustausch-Chromatographie in Verfahrensschritt (a) bewirkt eine schonende Entfärbung und Desodorierung des Enzymkonzentrats, welches über die Schritte (b) und (c) zu einem Enzymgranulat weiterverarbeitet wird. Solche Enzymkonzentrate sind wie in der bislang unveröffentlichte Anmeldung DE 10304066 dargestellt ist, stabiler als auf eine andere Weise entfärbte und desodorierte Konzentrate. Dadurch wird der vorliegenden Erfindung zufolge auch für das Granulat eine höhere Stabilität erzielt. Gleichzeitig besitzen die Enzymkonzentrate über die Entfärbung eine hellere Farbe und schwächeren Geruch als konventionell zubereitete Enzymkonzentrate. Dies kommt den hiervon abgeleiteten Granulaten insofern zugute, als diese ebenfalls eine ansprechendere, das heißt helle Farbe und einen vermindeterten Geruch aufweisen.
Im Falle einer anschließenden Beschichtung dieser Granulate braucht ihnen aufgrund der helleren Eigenfarbe weniger Pigment zugesetzt zu werden, so daß diese beschichteten Granulate wiederum über weitere vorteilhafte Eigenschaften verfügen. Hierzu gehört insbesondere eine verringerte Staubbildung bei mechanischer Belastung. Deshalb eignen sich besonders solche Granulate zur Weiterverarbeitung, insbesondere zur Einarbeitung in entsprechende Rezepturen wie etwa in Wasch- oder Reinigungsmittel.
Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind somit Verfahren zur Herstellung von Enzymgranulaten, die durch die genannten Schritte, insbesondere die lonenaustausch- Chromatographie gekennzeichnet sind. Optional schließt sich als Schritt (d) eine Beschichtung dieser Granulate an. Weitere Erfindungsgegenstände sind die verfahrensgemäß erhaltenen Granulate sowie Mittel, welche derartige Granulate enthalten, hierunter insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel. Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden im folgenden detailliert ausgeführt.
Verfahren zu der dem Verfahrensschritt (a) vorangehenden Herstellung einer wäßrigen, gereinigten Enzymlösung sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt und werden allgemein als Downstream-Processing bezeichnet, welches im Anschluß an die Fermentierung erfolgt und der Konfektionierung vorangeht. Es dient der Gewinnung von weitgehend biomassefreien, vorzugsweise angereicherten, wäßrigen Enzymlösungen. In der Regel umfaßt es mehrere Teilschritte, wie Zellaufschluß, Entfernung der Zelltrümmer, insbesondere durch Pelletieren, Dekantieren und Zentrifugationsschritte. Auch Separation, Mikro-, Ultra- oder Steril-Filtrationen, Desodorierung und die Einkonzentrierung, das heißt Entfernung des Lösungsmittels bis zu einem mittleren Konzentrationsbereich des Enzyms können bereits an dieser Stelle zum Einsatz kommen oder als optionale Schritte eingefügt werden.
Der optimale Arbeitsbereich muß dabei für.jedes Enzym individuell ermittelt werden, und zwar nicht nur hinsichtlich der Temperatur, dem pH-Wert und der lonenstärke sondern insbesondere hinsichtlich des vor Schritt (a) einzustellenden Enzym- Konzentrationsbereichs. Die Anreicherung soll insbesondere durch rechtzeitigen Abbruch der Konzentrierung so gesteuert werden, daß das erhaltene Enzymkonzentrat gerade noch keine (quantitative) Proteinausfällung aufweist. Gemäß der Anmeldung DE 10304066 liegt der optimale Konzentrationsbereich für die darin untersuchte Protease aus Bacillus lentus bei 700.000 bis 800.000 HPE/g. Oberhalb dieses Bereichs steigt der Anteil an ausgefällten Feststoffen in Abhängigkeit von der Aktivität bald überproportional an, was durch Denaturierung und Ausfällung mit einem drastisch steigenden Verlust an Gutprodukt einhergeht. Für eine vorangehende Einkonzentrierung können beispielsweise ein handelsüblicher Rotavapor oder ein handelsüblicher Dünnschichtverdampfer eingesetzt werden.
Vorteilhaft ist ferner, die Enzymlösung auf einen Schweb- oder Feststoffanteil von unter 1 Vol.-% einzustellen, wie dies beispielsweise über Zentrifugation mit einer eine Tischzentrifuge für 10 min bei 7.000 g überprüft werden kann. Ansonsten steigen die Verluste in den nachfolgenden Schritten unvorteilhaft stark an. Die Abtrennung insbesondere der durch die Aufkonzentrierung entstandenen Ausfällungen (Feststoffe) betrifft insbesondere Fremdproteine und/oder inaktive Enzyme, besonders in der Nähe des Löslichkeitsprodukts. Dieser Schritt wird auch als Separation bezeichnet. Sie erfolgt ebenfalls nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise über einen Separator; auch Filtrationsschritte sind hierfür prinzipiell möglich. Auch eine Ultrafiltration ist möglich; das wird beispielsweise in WO 01/37628 A2 beschrieben. Man erhält dadurch vergleichsweise reine, bereits auf einen mittleren Konzentrationswert angereicherte Enzymlösungen mit einem niedrigen Feststoffgehalt.
Die Enzymlösung sollte zudem auf einen pH-Wert eingestellt werden, der für das Enzym verträglich ist und bei dem es eine positive Ladung aufweist.
Schritt (a) stellt mit der Entfärbung der zuvor gereinigten Enzymlösung über einen Anionenaustauscher (Adsorber) den Kern der Erfindung dar. Bei diesem Schritt adsorbieren vor allem die farbigen Begleitstoffe, hierunter insbesondere die Maillard- Verbindungen, und die Geruchsstoffe an das Harz, während durch die stark positive Ladung des Austauschers die unter entsprechend zu wählenden Bedingungen ebenfalls positiv geladenen Proteine nicht auf dem Harz gebunden, sondern mit dem Eluat in einer weitgehend klaren Lösung erhalten werden. Schritt (a) stellt somit eine selektive Abtrennung der Farbstoffe aus der konzentrierten Enzymlösung dar, während das interessierende Enzym und zumindest ein Teil der enzymstabilisierenden Faktoren in Lösung bleiben; bei letzteren handelt es sich chemisch gesehen zumeist ebenfalls um Proteine.
Dabei handelt es sich streng genommen somit nicht um eine Chromatographie des Produkts, weil nicht dieses Produkt sondern die abzutrennenden Begleitstoffe an dem Chromatographiematerial adsorbieren. Man könnte deshalb auch von einer Art Filtration sprechen. Da in der Tat aber ein echtes Chromatographiematerial eingesetzt werden soll und dieses auch als Chromatographiematerial wirkt, nämlich indem es zunächst Stoffe bindet und diese anschließend unter Regeneration des Materials wieder eluiert werden, ist der Vorgang am treffendsten mit dem Begriff Chromatographie zu beschreiben. Insbesondere Figur 1 macht deutlich, daß der Durchfluß (das Eluat) der Chromatographie in die nachfolgende Einkonzentrierung eingebracht wird und damit das interessierende Gutprodukt darstellt, während mit der Regeneration die unerwünschten Begleitstoffe, insbesondere Färb- und Geruchsstoffe über das Regenerat ausgewaschen werden. Der Vorteil dieses Verfahrens gegenüber den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren besteht darin, daß die interessierenden Wertstoffe, das heißt die Enzymproteine in Lösung bleiben und deshalb nicht denaturiert und renaturiert werden müssen, sondern in ihrer räumlichen Struktur unverändert bleiben können. Sie verbleiben damit auch in der weiter zu prozessierenden Phase und werden nicht aus dem System ausgetragen. Dadurch konnten die oben erwähnten hohen Ausbeuten erreicht werden.
Die an das Harz gebundenen Begleitstoffe werden, wie dies in Figur 1 durch entsprechende dicke Pfeile angedeutet ist, anschließend, das heißt nach Austritt der Wertstoff enthaltenden Phase (des Gutprodukts) und gegebenenfalls einem Nachlauf in einem separaten Schritt eluiert. Dies geschieht beispielsweise mit Lösungen mit hoher lonenstärke, etwa konzentrierte NaCI-Lösungen. Über entsprechende Gegenionen, beispielsweise NaOH, ist das Anionenaustauscher-Material regenerierbar. Je nach Chromatographie-Material können andere einfache Salze besser geeignet sein. Daß dieses Material mit derartigen - zudem kostengünstigen - Verbindungen behandelt werden kann, führt neben dem Reinigungseffekt zu einer Sterilisation. Das System ist somit „CIP"-fähig (für „cleaning in place").
Das Flüssigenzym ist im Anschluß an den Verfahrenschritt (a) weitgehend frei von störenden Schlieren, Ausfällungen und Farbstoffen. Es bleibt auch bei längerer Lagerung bei verschiedenen Temperatur hell, klar und blank und weist gleichzeitig ein hohes Maß an Stabilität auf. Diese veredelte konzentrierte Enzymlösung ist insbesondere hinsichtlich der farbigen Verunreinigungen deutlich abgreichert, enthält jedoch noch praktisch farblose Begleitstoffe, die aufgrund ihrer zum Teil stabilisierenden Wirkung hochwillkommen sind und aus der konzentrierten Enzymlösung nicht abgetrennt zu werden brauchen/sollen.
Zusätzliche Zwischenschritte können je nach Trennproblem vorausgeschickt, eingefügt, angeschlossen oder zusammen mit den genannten Schritten durchgeführt werden. So besteht eine Möglichkeit beispielsweise darin, durch einen oder mehrere zusätzliche Chromatographieschritte, insbesondere über andere Trägermaterialien weitere Begleitstoffe aus der konzentrierten Enzymlösung gezielt abzutrennen. Dies kann zu jedem im Einzelfall sinnvoll erscheinenden Verfahrenszeitpunkt, vorteilhafterweise unmittelbar vor oder nach dem unter (a) beschriebenen Chromatographieschritt erfolgen, gegebenen- falls voneinander durch Zwischenschritte wie Filtrationen oder Umsolubilisierungen getrennt.
Möglichkeiten zur Einstellung einer geeigneten Konzentration gemäß Schritt (b) sind dem Fachmann an sich bekannt. Hierfür gilt insbesondere das oben für die Ausgangs- Enzymlösung Gesagte.
Auch Verfahren zur Überführung von Enzymlösungen in feste Granulate gemäß Schritt (c) sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Sie beginnen in der Regel mit der Mischung des Enzyms mit bestimmten Zuschlagsstoffen und liefern Partikel. Hierzu gehören beispielsweise die Methoden der Wirbelschichtgranulierung, der Mischgranulierung in Vertikalmischern, Gegenstrompelletiermischem, Flexomix- Agglomeratoren, Pflugscharmischern oder Rubergmischern, der Rollgranulierung, etwa in Granuliertrommeln oder Granuliertellern, oder der Preßgranulierung, durchführbar beispielsweise mit Pressen, Extrudern oder Wälzdruckmaschinen. Diese Techniken sind in Lehrbüchern wie beispielsweise dem „Handbuch der Agglomerationstechnik" von G. Heinze (1999, Verlag Wiley-VCH, Weinheim, Deutschland, ISBN 3-527-29788-X, S. 65-170) beschrieben.
Ein bevorzugtes Verfahren geht beispielsweise aus der europäischen Patentschrift EP 168526 B1 hervor, wonach die Enzymgranulate in Wasser quellfähige Stärke, Zeolith und wasserlösliches Granulierhilfsmittel enthalten. Das hierin vorgeschlagene Herstellungsverfahren be steht im wesentlichen darin, die von unlöslichen Bestandteilen befreite Fermenterlösung aufzukonzentrieren, mit den genannten Zuschlagstoffen zu versetzten, das entstandene Gemisch zu granulieren und gegebenenfalls das Granulat mit filmbildenden Polymeren und Farbstoffen zu umhüllen. Gemäß WO 92/11347 A2 enthalten nach einem alternativen Verfahren hergestellte Enzymgranulate mit günstigen Eigenschaften für den Einsatz in körnigen Wasch- und Reinigungsmitteln Enzym, quellfähige Stärke, wasserlösliches organisches Polymer als Granulierhilfsmittel, Getreidemehl und etwas Wasser. Durch diese Zusammensetzung der Zuschlagsstoffe wird die Enzymverarbeitung ohne größere Aktivitätsverluste möglich.
Ein günstiges und somit ebenfalls bevorzugtes Extrusionsverfahren, welches ein gutlösliches Enzymgranulat liefert, wird beispielsweise in der Anmeldung WO 97/40128 A1 beschrieben, wonach die Granulate neben Enzymen und Träger wie Polyethylenglykol und/oder Polyethoxylat eine phophatidierte Stärke als Granulierhilfsmittel enthalten können.
Weitere günstige Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands gehen aus den nachfolgenden Ausführungen hervor.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um Verfahren, die durch einen zusätzlichen Schritt (d) Beschichtung (Coating) gekennzeichnet sind.
Grundsätzlich ist eine Beschichtung auch eines weitgehend farblosen und geruchsneutralen Enzymgranulats sinnvoll, um den Inhaltsstoff gegen widrige Einflüsse von außen zu schützen. Hierzu zählen insbesondere Feuchtigkeit, die das Partikel quellen und zerfallen lassen und das im Partikel enthaltene Enzym aktivieren kann, sowie der Einfluß von Luftsauerstoff, der zur oxidativen Inaktivierung führen kann.
Es sind prinzipiell alle Arten von Beschichtungen möglich, die im Stand der Technik für Enzympartikel beschrieben und dem Fachmann an sich bekannt sind. Günstigerweise werden die nach (c) erhaltenen Granulate zunächst spheronisiert, beispielsweise in einem Marumerizer, anschließend der Wassergehalt verringert, etwa über einen Fließbettreaktor und erst dann die Schutzschicht aufgetragen. Letzteres kann beispielsweise in konventionellen Mischern, etwa von der Firma Lödige (Deutschland) oder in der Wirbelschicht erfolgen.
Hierzu gehören beispielsweise Verfahren, nach denen eine Schutzschicht über ein sogenanntes Schmelzcoating aufgebracht wird. Dabei wird ein Polymer, beispielsweise ein polymerer Alkohol zusammen mit einem Emulgator für dieses Polymer aufgebracht, vorteilhafterweise zusammen mit einem Pigment, welches den resultierenden beschichteten Partikeln seine Farbe verleiht. Solch ein Verfahren wird beispielsweise in WO 95/02031 A1 insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln beschrieben. Als Pigment wird vorzugsweise das weiße Titandioxid eingesetzt.
Ein alternatives, bevorzugtes Verfahren, nach welchem kein Lösungsmittel zugesetzt und nach dem Beschichten wieder entfernt werden muß, folgt beispielsweise der Anmeldung WO 98/26037 A2. Hiernach wird feines, anorganisches, wasserunlösliches Pigments gegebenenfalls zusammen mit einem schüttfähigkeitsverbessernden Agens und einer organischen Substanz mit einem Schmelzpunkt von 40-70°C aufgebracht. Diese Beschichtung eignet sich ebenfalls besonders für Partikel, die anschließend in Wasch- und Reinigungsmittel eingearbeitet werden.
Bevorzugte Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a) eine Anionenaustausch-Chromatographie durchgeführt wird, vorzugsweise mit einem Material, das im pH-Bereich von 5 bis 11 und besonders bevorzugt von 6 bis 8 maximale Austauschkapazität aufweist. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Es handelt sich somit um eine eher basische bis starkbasische Anionenaustausch- Chromatographie, die mit Schritt (a) den Kern des erfindungsgemäßen Verfahrens bildet. Unter diesen Bedingungen adsorbieren die vor allem farbigen Begleitstoffe an das Material, die gleichzeitig positiv geladenen Proteine jedoch gerade nicht. Aufgrund der Tatsache, daß die meisten natürlichen wasserlöslichen, insbesondere sekretierten Proteine eher bei mittleren pH-Werten wasserlöslich sind, ist es besonders vorteilhaft, keinen extremen sondern nur einen schwach basischen bis neutralen pH-Bereich auszuwählen.
Insbesondere alkalische Proteine, wie beispielsweise die von alkaliphilen Mikroorganismen sekretierten Enzyme, insbesondere Proteasen, weisen einen im alkalischen Bereich liegenden isoelektrischen Punkt auf, sind deshalb in dem bevorzugten pH- Bereich, in welchem der Ionenaustauscher optimal arbeitet, positiv geladen und binden deshalb nicht an das betreffende Material. Für jedes Protein muß ein für dieses Verfahren idealer pH-Wert experimentell ermittelt und in Hinblick auf diesen Schritt (a) eingestellt werden. In Beispiel 1 lag dieser Wert für die gewählte alkalische Protease bei 7,5. Im Einzelfall wird also ein Anionenaustauscher gewählt, dessen maximale Austauschkapazität mit dem IEP des interessierenden Enzyms übereinstimmt.
Bevorzugte Anionenaustausch-Chromatographie-Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß der Anionenaustauscher für Schritt (a) als funktioneile Gruppen quartäre Ammoniumgruppen aufweist, vorzugsweise substituiert mit mindestens zwei Alkylgruppen, besonders bevorzugt mit mindestens zwei Alkylgruppen mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen, optional zusätzlich mit einer 1 oder 2 Kohlenstoffatomen aufweisenden Hydroxyalkylgruppe. Denn solche haben sich aufgrund ihrer chemischen Eigenchaften als besonders geeignet für Schritt (a) herausgestellt. Entscheidend, und im Einzelfall zu optimieren ist das Bindevermögen für die insbesondere farbigen Begleitstoffe und das Nichtbinden der interessierenden Enzyme.
Weiterhin sind solche Anionenaustausch-Chromatographie-Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß der Anionenaustauscher für Schritt (a) als funktioneile Gruppen Trimethyl-ammonium- oder Dimethylethanol-ammonium-Gruppen aufweist. Letzterer ist etwas schwächer basisch als der zuerst genannte, so daß insbesondere über diese Variation auf entsprechende Proteine optimiert werden kann.
Weiterhin bevorzugte Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß die Anionenaustausch-Chromatographie in einem pH-Bereich von 5 bis 9 vorzugsweise von 6 bis 8,5, besonders bevorzugt von 7 bis 8 durchgeführt wird. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte. Das richtet sich entsprechend dem oben Gesagten nach dem isoelektrischen Punkt des (vorzugsweise alkalischen; siehe unten) Enzyms und dem hierzu passend ausgewählten optimalen Arbeitsbereich des Ionenaustauschers.
Bevorzugte Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß der Ionenaustauscher für Schritt (a) eine Austauschkapazität von 0,7 bis 1,2 meq/ml vorzugsweise von 0,8 bis 1,1 meq/ml, und besonders bevorzugt von 0,9 bis 1 ,0 meq/ml aufweist. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Dieser in Mol Äquivalent pro Volumeneinheit angegebene Wert für die Austauschkapazität besagt, wie dicht das Material mit den funktionellen Gruppen besetzt ist. Die angegebenen Bereiche haben sich empirisch, insbesondere bei Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung als vorteilhaft herausgestellt und hängen davon ab, wie hoch die Konzentration der quantitativ nur schwer bestimmbaren Begleitstoffe in der Enzymlösung ist. Geeignete Arbeitsbereiche müssen im Einzelfall experimentell ermittelt werden und hängen insbesondere davon ab, wieviele dieser Begleitstoffe durch die vorangegangenen Schritte zusammen mit den höhermolekularen Verbindungen bereits abgetrennt worden sind. Bevorzugte Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß der Ionenaustauscher für Schritt (a) effektive Porengrößen von 0,2 bis 0,7 mm, vorzugsweise von 0,3 bis 0,6 mm, besonders bevorzugt von 0,4 bis 0,5 mm aufweist. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Auch hierbei handelt es sich um einen empirisch ermittelten Bereich, der insbesondere von der Größe des aufzureinigenden Enzyms und der Reinheit der Enzymlösung abhängt. Je mehr höhermolekulare Verbindungen noch enthalten sind, desto leichter verblockt die Säule und desto eher sollte auf ein großporigeres Material ausgewichen werden. Hingegen verstärkt sich die Trennschärfe bei zunehmend kleineren Poren. Somit müssen auch hier geeignete Arbeitsbereiche im Einzelfall experimentell ermittelt werden. Für die im Beispiel untersuchte Protease mit einem Molekulargewicht von ca. 27 kD hat sich ein Chromatographiematerial als brauchbar herausgestellt, dessen effektive Porengröße bei 0,45 mm liegt. Für deutlich größere oder kleinere Proteine sollten Chromatographie-Materialien mit entsprechend größeren oder kleineren effektiven Porengrößen gewählt werden.
Bevorzugte Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß das Material des Ionenaustauschers für Schritt (a) eine Partikelgrößenverteilung von 150 bis 3.000 μm, vorzugsweise von 175 bis 1.500 μm, besonders bevorzugt von 200 bis 800 μm aufweist. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Auch hierbei handelt es sich um einen gemäß Beispiel 1 empirisch ermittelten Bereich, der im Einzelfall experimentell überprüft und gegebenenfalls angepaßt werden muß.
Bevorzugte Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß der Ionenaustauscher für Schritt (a) auf einem porösen Kunststoffpolymer beruht, vorzugsweise einem Styrol- DVB-Copolymer.
Prinzipiell sind als Träger für erfindungsgemäß einzusetzende starkbasische Anionenaustauscher alle im Stand der Technik hierfür beschriebenen Materialien einsetzbar, beispielsweise auch gelförmige Träger. Demgegenüber sind aufgrund ihrer technischen Eigenschaften solche starkbasischen Anionenaustauscher für Schritt (a) bevorzugt, die auf einem porösen Kunststoffpolymer beruhen. Als besonders vorteilhaft haben sich solche auf der Basis eines Styrol-DVB-Copolymers herausgestellt. Denn solche Materialien sind inert, einem Angriff von begleitenden Stoffen, etwa hydrolytischen Enzymen praktisch nicht zugänglich und robust gegenüber den nachfolgenden Regenerationsschritten, die beispielsweise mit NaOH durchgeführt werden können.
Chromatographiematerialien, die die soeben diskutierten Eigenschaften aufweisen, sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Solche aus den DIAION®-Serien werden beipielsweise in dem Handbuch „DIAION®. Manual of ion exchange resins and synthetic adsorbent, Band I" von der Firma Mitsubishi Kasei Corp. (Tokyo, Japan), Juni 1995, auf den Seiten 104 bis 108 und in der „Product Line Brochure DIAION®", Stand 1.6.2001 , auf den Seiten 4 bis 6 beschrieben, welche von dem Hersteller, beziehungsweise Summit Chemicals Europe GmbH, Düsseldorf, Deutschland erhältlich ist. Als stark basische Anionenaustauscher werden dort die Serien DIAION®SA, DIAION®PA und DIAION®HPA beschrieben. Ein Vertreter davon, nämlich DIAION®PA308L wurde in Beispiel 1 zur vorliegenden Anmeldung erfolgreich eingesetzt.
Chemisch ähnliche, brauchbare Materialien sind entsprechend den oben gemachten Angaben zu bevorzugten Eigenschaften von entsprechenden Fachleuten herstellbar oder auch von anderen kommerziellen Herstellern erhältlich und charakterisieren ebenso bevorzugte Ausführungsformen. Vergleichbare Ergebnisse werden beispielsweise mit den Materialien DOW MSA Marathon® von der Firma Dow Chemicals und Amberlite®900CL von der Firma Rohm & Haas erzielt.
Neben dem Material entscheiden auch die Durchführungsbedingungen über den Erfolg der erfindungsgemäßen Chromatographie. Hierzu gehören insbesondere ein gewisses Bettvolumen, wobei es sich um das Volumenverhältnis der aufgetragenen Lösung zu dem der Säule handelt, und eine gewisse Verweilzeit, die über die Menge Enzym pro g des Materials und Zeiteinheit angegeben wird.
So sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Chromatographie in Schritt (a) mit einem Bettvolumenverhältnis von 0,1 bis 100, vorzugsweise 0,5 bis 40, besonders bevorzugt 1 bis 4 durchgeführt wird. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Hierbei handelt es sich um das gemäß Beispiel 1 experimentell ermittelte Optimum, um das Filtrat möglichst rein und gleichzeitig möglichst konzentriert zu halten. Es muß abhängig von den Eigenschaften des Materials und des zu reinigenden Enzyms im Einzelfall individuell bestimmt werden.
Weiterhin sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Chromatographie in Schritt (a) bei einer durchschnittlichen Verweilzeit von 0,01 bis 2 g, vorzugsweise 0,025 bis 0,1 g, besonders bevorzugt 0,04 bis 0,06 g und ganz besonders bevorzugt von 0,05 g Enzym pro g lonenaustauschermaterial und Minute erfolgt. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Dieser thermodynamische Wert beschreibt den Trennprozeß und hat sich im Beispiel 1 als optimal herausgestellt. Er muß abhängig von den Eigenschaften des Materials und des zu reinigenden Enzyms im Einzelfall individuell bestimmt werden.
Besonders geeignete Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß sie weitgehend automatisch gesteuert sind.
Weiterhin sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Chromatographie in Schritt (a) über die Leitfähigkeit des Eluats gesteuert wird, hierbei insbesondere die Trennung zwischen Vorlauf und Gutprodukt und/oder Gutprodukt und Nachlauf.
Denn eine besonders leicht zu realisierende Steuerungsmöglichkeit beruht darauf, daß die Leitfähigkeit (meßbar als μS/cm) eines prozessierten Guts an kritischen Stellen ermittelt und zur Steuerung eingesetzt wird. So können der Übergang vom Vorlauf zum Gutprodukt und dessen Ende über entsprechende Leitfähigkeitsänderungen detektiert werden. Eine entsprechende Steuerungseinheit leitet die jeweiligen Flüssigkeitsströme dann entsprechend weiter. Weiterhin sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Chromatographie in Schritt (a) unter Rückführung wenigstens eines Teils des Vor- und/oder des Nachlaufs der lonenaustausch-Chromatographie in die Enzymlösung vor der Chromatographie erfolgt.
So ist zur Ausbeutesteigerung bereits in der Anmeldung WO 01/37628 A2 vorgeschlagen worden, Filtrat für einen zusätzlichen Waschschritt einzusetzen. Hierdurch wird eine zusätzliche Anreicherung der betreffenden Fraktion mit solchen Enzymmolekülen erreicht, die gegen Ende des Peaks noch nicht aus der Säule ausgewaschen worden sind. Limitiert wird dieser Schritt prinzipiell durch die Verunreinigungen, die von der Säule möglicherweise mitausgewaschen werden. Im Einzelfall ist zwischen erzielbarer Konzentration und Produktqualität, das heißt Reinheit abzuwägen.
Bevorzugte Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß die Einstellung einer geeigneten Konzentration in Schritt (b) durch Einkonzentrierung der Enzymlösung erfolgt.
Denn möglicherweise ist die Enzymlösung nach Schritt (a) sehr hoch konzentriert, so daß zur Einstellung einer geeigneten Konzentration in Schritt (b) zusätzliches Lösungsmittel zugesetzt werden muß. In der Regel wird die Lösung jedoch eher zu stark verdünnt sein, weil die Trennleistung der Chromatographie und die insgesamt zu erzielende Ausbeute des Gutprodukts von einer optimalen Verdünnung abhängen. Somit ist eine Einkonzentrierung der Enzymlösung bevorzugt. Hierbei handelt es sich erfindungsgemäß jedoch weniger um Ausfällen und Wiederaufnahme in einem kleineren Volumen, weil dadurch wie oben erläutert auch die erwünschten Begleitstoffe verlorengehen würden. Vielmehr sind Verfahren bevorzugt, bei denen lediglich das Volumen des nach der Chromatographie vorhandenen Lösungsmittels verringert wird. Solche Verfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und wurden weiter oben als Vorbereitung für Schritt (a) bereits vorgestellt. Auch an dieser Stellen können beispielsweise ein handelsüblicher Rotavapor oder ein handelsüblicher Dünnschichtverdampfer eingesetzt werden. Sie sind über die jeweiligen Geräteparameter und über die jeweilige Reaktionsdauer steuerbar.
Hierunter sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Konzentrierung in Schritt (b) mit einem Einkonzentrierungsverhältnis von 1,01 bis 10, vorzugsweise von 1,1 bis 8, besonders bevorzugt von 1,2 bis 4 erfolgt, jeweils bezogen auf die zugehörigen Volumina. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Dieses die Konzentrierung beschreibende Maß errechnet sich aus dem Verhältnis des Ausgangsvolumens der chromatographierten Lösung zu dem der einkonzentrierten Lösung. Dieser Schritt stellt gewissermaßen eine Vorbereitung der nachfolgenden Granulation dar, in welcher weiter Wasser entzogen wird. Somit richten sich das anzustrebende Endvolumen sowie alle nachfolgend aufgeführten Parameter nicht nur nach der Konzentration der Enzymlösung nach der Chromatographie sondern auch nach den Anforderungen des anschließenden Granulationsschritts (c). Sie müssen gegebenenfalls nach den Erfahrungen mit den betreffenden für die Granulation eingesetzten Geräte optimiert werden. Dies ist dem Fachmann geläufig.
Weiterhin sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß der Trockensubstanzgehalt beim Start der Einkonzentrierung in Schritt (b) bei 0,1 bis 40 Gew.-%, vorzugsweise bei 0,5 bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt bei 1 bis 15 Gew.-% liegt. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Dieser ebenfalls empirisch zu optimierende Wert hängt in erster Linie von der Durchführung der Chromatographie ab. Entscheidend ist, daß diese mit einer optimalen Trennung erfolgt. Hieran ist der nachfolgende Schritt anzupassen. Sollte der Trockensubstanzgehalt nahe der unteren Grenze oder deutlich darunter liegen, kann man die Einkonzentrierung in zwei nacheinanderfolgenden Schritten und ggff. über zwei verschiedene Verfahren oder unterschiedlich arbeitende Geräte durchführen.
Weiterhin sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Einkonzentrierung thermisch erfolgt.
Weiterhin sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die thermische Einkonzentrierung der Enzymlösung in Schritt (b) bei 5 bis 70°C, bevorzugt bei 10 bis 60°C, besonders bevorzugt bei 20 bis 40°C, ganz besonders bevorzugt bei 35°C erfolgt, jeweils bezogen auf den zugehörigen Dampfdruck. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Dieser über die jeweiligen Geräteeinstellungen einfach einzustellende Wert richtet sich insbesondere nach den Eigenschaften des konfektionierten Enzyms. Hohe Temperaturen beschleunigen den Prozeß, wirken sich in der Regel aber schädlich auf das Enzym aus. Ein optimaler Wert ist empirisch zu ermitteln. Im Beispiel der vorliegenden Anmeldung haben sich ca. 35°C bei ca. 50 mbar als vorteilhaft für die Konfektionierung eines Subtilisins herausgestellt.
Unter den erfindungsgemäßen Verfahren sind solche bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß der Trockensubstanzgehalt am Ende der Einstellung der geeigneten Konzentration in Schritt (b) bei 8 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise bei 9 bis 40 Gew.-%, besonders bevorzugt bei 10 bis 35 Gew.-% liegt. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Dieser Wert bestimmt die biophysikalischen Eigenschaften des Enzymbreis, beispielsweise die Viskosität oder für die Mischbarkeit mit den nachfolgend zugesetzten Verbindungen und die hieraus gegebenenfalls resultierende Verdünnung und ist somit für den Erfolg des nachfolgenden Granulationsschritt entscheidend. Die Wahl des jeweiligen Granulationssystems bestimmt somit den optimalen Trockensubstanzgehalt und ist im Einzelfall experimentell zu ermitteln. Variationsmöglichkeiten ergeben sich auch durch die Wahl des Verfahrens, etwa Dünnschichtverdampfen oder Ultrafiltration. Bei letzterer kann eine jeweils charakteristische Obergrenze nicht überschritten werden.
Unter den erfindungsgemäßen Verfahren sind solche bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das Konzentrat in Schritt (b) auf eine Viskosität von 1 bis 1.000 mPas eingestellt wird, vorzugsweise auf 1 bis 500 mPas, besonders bevorzugt auf 1 bis 200 mPas. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Entsprechend dem oben Gesagten hängt dieser Wert insbesondere von den Anforderungen der nachfolgenden Granulation ab. Unter den erfindungsgemäßen Verfahren sind solche bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um eine Protease handelt, deren Aktivität in Schritt (b) auf 200.000 bis 2.000.000 HPE pro g Konzentrat eingestellt wird, vorzugsweise auf 500.000 bis 1.500.000 HPE pro g Konzentrat, besonders bevorzugt auf 800.000 bis 1.200.000 HPE pro g Konzentrat. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Bislang wurde von Enzymen gesprochen, die erfindungsgemäß konfektioniert werden. Enzyme stellen bevorzugte Ausführungsformen dar, weil sie einerseits von besonderem technischem Interesse sind. Nichtsdestoweniger ist dieses Verfahren auf alle wasserlöslichen Proteine anwendbar, sofern sich zu diesen entsprechende Lösungsmittelsysteme und Chromatographiematerialien finden und entsprechende Nachweisreaktionen etablieren lassen. Beispielsweise gilt dies für Peptide, etwa Peptidhormone, Oligopeptide mit pharmakologischer Bedeutung oder für Antikörper. Antikörper kämen beispielsweise auch für die Detektion in Frage. All diese Proteine sollen im Sinne der vorliegenden Erfindung als Enzyme verstanden werden.
Im Mittelpunkt des Interesses stehen technisch einsetzbare Enzyme im herkömmlichen Sinne. Dabei handelt es sich vorzugsweise um eine Hydrolase oder eine Oxidoreduktase, besonders bevorzugt um eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Lipase, Cutinase oder um eine Peroxidase. Sie sind abhängig von der Bedeutung ihrer jeweiligen Einsatzgebiete entsprechend bevorzugt, sofern sie dem Anwendungszweck günstigerweise in Form fester Granulate zugesetzt werden können. Hierzu gehören beispielsweise Proteasen und Amylasen, wie sie etwa für die flüssige Anwendung in der Anmeldung DE 10304066 beschrieben sind. Hierunter sind Proteasen bevorzugt, weil es sich bei diesen um die wichtigsten Enzyme für Wasch- und Reinigungsmittel handelt. Außerdem ist in dem Beispiel zur vorliegenden Anmeldung die erfolgreiche Herstellung eines Proteasegranulats beschrieben.
Die proteolytische Aktivität (angegeben in HPE) kann in Anlehnung an die in Tenside 7 (1970), 125 beschriebene Methode durch eine diskontinuierliche Bestimmung unter Verwendung von Casein als Substrat wie folgt gemessen werden: Die Konzentrationen der Substrat-Lösung betragen 12 mg pro ml Casein (hergestellt gemäß Hammarsten; Lieferant: Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 2242) und 30 mM Tris in synthetischem Leitungswasser (wäßrige Lösung von 0,029 % (Gew./V) CaCI2 * 2 H20, 0,014 % (Gew./V) MgCI2 * 6 H2O und 0,021 % (Gew./V) NaHCO3) mit einer Härte von 15 Grad dH (deutsche Härte). Die Substrat-Lösung wird auf 70°C erwärmt, und der pH wird mit 0,1 N NaOH bei 50°C auf pH 8,5 eingestellt. Die Protease-Lösung wird mit 2% (Gew./V) wasserfreiem Pentanatrium-Tripolyphosphat in synthetischem Leitungswasser hergestellt, wobei der pH mit Salzsäure auf 8,5 eingestellt wird. Zu 600 μl der Casein- Subtrat-Lösung werden 200 μl der Enzym-Lösung zugegeben. Das Gemisch wird 15 min bei 50°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 600 μl 0,44 M Trichloressigsäure (TCA) 0,22 M Natriumacetat in 3% (V/V) Essigsäure beendet. Nach Abkühlen auf Eis innerhalb von 15 min wird das TCA-unlösliche Protein durch Zentri- fugieren entfernt, ein Aliquot von 900 ml wird mit 300 μl 2 N NaOH gemischt, und die Extinktion dieses Gemisches, das TCA-Iösliche Peptide enthält, wird bei 290 nm aufgenommen. Kontrollwerte werden hergestellt durch Hinzufügen von 600 μl der TCA-Lö- sung zu 600 μl Casein-Lösung gefolgt von 200 μl Enzym-Lösung. Definitionsgemäß besitzt eine Protease-Lösung, die unter den Bedingungen dieses Versuchs eine Extinktionsänderung von 0,500 OD bei 290 nm hervorruft, eine Aktivität von 10 Pe pro ml.
Die Konzentrationseinstellung hängt davon ab, welche Aktivität die durch Schritt (c) beziehungsweise (d) erhaltenen Granulate aufweisen sollen. Für die Anwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln hat sich eine Endaktivität von ca. 1.000.000 HPE/g als vorteilhaft erwiesen; auf diesen Gehalt wurde auch gemäß Beispiel 1 einkonzentriert.
Insbesondere im Zuge der Konzentrationseinstellung können der Enzympräparation weitere Inhaltsstoffe zugesetzt werden. Da auch feste Enzympräparationen während der Lagerung dazu neigen, zu denaturieren und dadurch ihre Aktivität zu verlieren, ist es vorteilhaft, insbesondere an dieser Stelle einen Stabilisator oder ein Stabilisatorgemisch zuzusetzen. Solche Verbindungen sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt. Es handelt sich beispielsweise um solche, die über Regulation der Wasseraktivität biophysikalisch, beispielsweise gegenüber Temperaturschwankungen stabilisierend wirken, wie Polyole und hierunter bevorzugt Glycerin oder besonders bevorzugt 1,2- Propandioi, um solche, die Proteasen reversibel inaktivieren, insbesondere Bor- oder Borsäure-haltige Proteaseinhibitoren, oder solche, die Schutz gegen Oxidation darstellen. Zu den zuletztgenannten Verbindungen zählen beispielsweise reduzierende Agentien, Antioxidantien und Übergangsmetallverbindungen. Sie werden vorteilhafterweise in flüssiger Form zugesetzt, um eine Lösung und/oder eine optimale Vermischung zu erzielen. Das Wasser kann zu einem späteren Zeitpunkt (siehe unten) wieder entzogen werden.
Es können vor der Granulation noch weitere Inhaltsstoffe zugesetzt werden, wenn das beabsichtigte Einsatzgebiet dies angebracht erscheinen läßt. Hierzu gehören beispielsweise für den Einsatz der Granulate in Wasch- und Reinigungsmitteln Tenside, Builder, Parfüm oder weitere Inhaltsstoffe. So ist es beispielsweise in Anwendung der WO 98/50511 A1 auch vorteilhaft, Cyclodextrin, dessen Vorläufer oder Derivate als Farbübertragunsinhibitoren bereits in das Granulat einzuarbeiten.
Unter den erfindungsgemäßen Verfahren sind solche bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Granulation in Schritt (c) durch Extrusion erfolgt. Dieses Verfahren mit vorteilhaft hierfür einsetzbaren Geräten ist oben bereits ausgeführt worden. Besonders vorteilhaft und mit dem Beispiel der vorliegenden Anmeldung belegt ist der Einsatz eines Zweiwellenextruders. Das erhaltene, in der Regel noch feuchte Extrudat kann anschließend zum Trocknen beispielsweise in einen Wirbelschichttrockner überführt werden (siehe unten). Wird von vornherein in einem solchen Wirbelschichttrockner granuliert, so erspart man sich diese Überführung. Durch die Extrusion werden Granulate erhalten, die lagerstabil sind und gleichzeitig ein günstiges Lösungsverhalten zeigen, was insbesondere dem Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zugute kommt.
Unter den erfindungsgemäßen Verfahren sind solche bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Granulation in Schritt (c) so gesteuert wird, daß eine durchschnittliche Partikelgröße von 100 bis 10.000 μm, vorzugsweise von 200 bis 5.000 μm, besonders bevorzugt von 400 bis 1.000 μm erzielt wird, bei der Extrusion insbesondere über die Größe der Lochplatten oder die Geschwindigkeit des Messers. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Die Größe der erhaltenen Partikel richtet sich insbesondere nach dem Einsatzgebiet. So müssen beispielsweise bei dem in Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln insbesondere die Anforderungen an eine mechanische Stabilität und an eine möglichst rasche Auflösung in der Waschflotte bedacht werden. Optimale Größen müssen experimentell werden und können über die dem Fachmann an sich bekannten Regulationssysteme der Granulation erhalten werden.
Unter den erfindungsgemäßen Verfahren sind solche bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Granulation in Schritt (c) unter Vermischung des Enzymkonzentrats aus Schritt (b) mit einem oder mehreren Inhaltsstoffen, ausgewählt aus der Gruppe Getreidemehl, Stärke, Stärkederivate, Cellulose, Cellulosederivate, Gleitmittel (Weichmacher), Zucker und Enzym-Stabilisatoren erfolgt.
Die erfindungsgemäß bevorzugten Mischungen zur Granulation sind unter Verweis auf entsprechende Schriften bereits oben ausgeführt worden. Die Zusammensetzung der Inhaltsstoffe entscheidet über die physikalischen Eigenschaften der erhaltenen Granulate beziehungsweise beschichteten Partikel. Dazu gehören die mechanische Stabilität und die Auflösungsgeschwindigkeit, welche entscheidend davon abhängt, wie rasch Wasser in die Kapillaren der Partikel eindringen und hierdurch dessen Zerfall auslösen kann. Dies wird beispielsweise über quellbare und/oder lösliche Verbindungen gesteuert. All diese Inhaltsstoffe sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt. Als Gleitmittel (Weichmacher) dienen insbesondere Polyole wie beispielsweise Polyethylenglykol oder Polyvinylalkohol. Optional können noch Lösungsmittel für diese Gleitmittel zugesetzt werden, die vorteilhafterweise bei der nachfolgenden Trocknung entfernt werden. Unter Zuckern sind in erster Linie Mono- oder Oligosaccharide oder deren Gemische zu verstehen; im Beispiel zur vorliegenden Anmeldung wird hierfür Saccharose eingesetzt.
Unter den erfindungsgemäßen Verfahren sind solche bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die durch Schritt (c) erhaltenen Granulate getrocknet werden.
Dies kann wie oben erwähnt unter Überführung in ein anderes Gerät oder wenn möglich im selben Gerät durchgeführt werden, in dem auch die Granulation stattgefunden hat. Der Zweck besteht darin, daß eine Enzymzubereitung, insbesondere eine von hydrolytischen Enzymen im allgemeinen umso stabiler ist, je weniger Wasser zugegen ist. Andererseits beschleunigt enthaltenes Wasser einen später während des Einsatzes beabsichtigten Auflösungsprozeß der Partikel. Zum optionalen Schritt (d) sind bereits oben einige vorteilhafte Ausführungsformen beschrieben worden.
Besonders vorteilhaft und entsprechend bevorzugt sind solche Verfahren mit Schritt (d), die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Beschichtung in Schritt (d) mit
0 bis 30 Gew.-% Pigment,
0 bis 30 Gew.-% Weichmacher,
5 bis 97,5 Gew.-% Filmbildner (Fließmittel) und optional weiteren Bestandteilen erfolgt.
Der vorliegenden Erfindung zufolge, und wie auch in Beispiel 1 experimentell belegt ist, weisen die nach (c) erhaltenen Granulate eine hellere Farbe und einen geringeren Geruch als herkömmliche Granulate auf. Deshalb kann auf eine Beschichtung in einzelnen Fällen ganz verzichtet werden; ansonsten reicht in der Regel eine dünnere Beschichtung, insbesondere eine mit weniger Pigment. Das gilt insbesondere für eine Beschichtung mit einem weißen Pigment. Hierdurch werden die Eigenschaften der Partikel wie die Elastizität, insbesondere die Oberflächeneigenschaften wie die Staubrate mehr durch die übrigen Beschichtungskomponenten bestimmt. Vorteilhafterweise bilden Granulate mit weniger Pigment weniger Abrieb und stellen somit eine geringere Staubbelastung dar. Hinzu kommt ein finanzieller Effekt, weil weniger Rohstoff benötigt wird.
Besonders vorteilhaft hat sich dem Beispiel der vorliegenden Anmeldung zufolge eine Beschichtung aus Polyethylenglykol 20.000 und 6 bis 20 Gew.-% Titandioxid herausgestellt. Hierfür können handelsübliche zu diesem Zweck bekannte Geräte eingesetzt werden, im betreffenden Beispiel ist das ein Topspray-Wirbelschicht-Coater.
Als optionale Inhaltsstoffe können auch an dieser Stelle die bereits oben ausgeführten Stabilisatoren zugesetzt werden. Ferner ist es vorteilhaft und somit entsprechend bevorzugt, wenn weitere Stoffe zugesetzt werden, die dem späteren Einsatzzweck der Granulate zugute kommen. Hierzu gehören wie oben erwähnt für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln beispielsweise Tenside oder Builder. Ein weiteres Beispiel hierfür ist etwa gemäß WO 95/17493 A1 die Zugabe von Silber-Korrosionsinhibitoren, Bleichmitteln und/oder Bleichaktivatoren, insbesondere für den späteren Einsatz in maschinellen Geschirrspülmitteln. Weiterhin sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Beschichtung 2,5 bis 27,5 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 25 Gew.-% Pigment enthält. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Diese Bereiche werden insbesondere durch das Beispiel der vorliegenden Anmeldung für ein weißes Pigment belegt.
Weiterhin sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Beschichtung 0,5 bis 15 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 5 Gew.-% Weichmacher enthält. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Dieser Wert hängt insbesondere von der Fließfähigkeit des Filmbildners bei den eingestellten Bedingungen ab. Er ist erfindungsgemäß aber deshalb geringer als im Stand der Technik üblich, weil die Fließfähigkeit bei einem geringeren Anteil an sprödem, trockenen Pigment automatisch zunimmt.
Weiterhin sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Beschichtung 7,5 bis 95 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 90 Gew.-%, besonders bevorzugt 20 bis 80 Gew.-% Filmbildner enthält. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Hierunter sind ferner solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Dicke der Beschichtung 1 bis 150 μm, vorzugsweise 5 bis 50 μm, besonders bevorzugt 10 bis 30 μm beträgt. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Im allgemeinen kann die Schichtdicke somit erfindungsgemäß unter den bislang üblichen Werten liegen, weil auf einen beträchtlichen Anteil an Pigment verzichtet werden kann. So weist die in Beispiel 1 beschriebene Beschichtung aus ca. 80 Gew.-% PEG und ca. 20 Gew.-% Titandioxid eine durchschnittliche Schichtdicke von ca. 20 μm auf. Entsprechend dem oben Gesagten sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in Schritt (a) ein technisch einsetzbares Enzym eingebracht wird, vorzugsweise eine Protease, besonders bevorzugt eine alkalische Protease.
Entsprechend dem oben Gesagten sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß durch Schritt (d) erhaltene Granulat insbesondere über die Steuerung der Granulation in Schritt (c) eine durchschnittliche Partikelgröße von 110 bis 5.000 μm, vorzugsweise von 200 bis 2.000 μm, besonders bevorzugt von 400 bis 1.200 μm erhält. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Diese Werte liegen etwas oberhalb von denen, die nach (c) erhalten worden sind, sollen insgesamt aber nach den Anforderungen an das Granulat eingestellt werden. Hierbei ist zu bedenken, daß auch die Beschichtung einen Beitrag zur Elastizität liefert und einen Schutz der Inhaltsstoffe darstellt.
Entsprechend dem oben Gesagten sind solche Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in Schritt (a) eine Protease eingebracht wird und das durch Schritt (c) oder (d) erhaltene Granulat insbesondere über die Einstellung der Konzentration in Schritt (b) eine durchschnittliche Aktivität von 50.000 bis 500.000 HPE/g, vorzugsweise von 100.000 bis 450.000 HPE/g, besonders bevorzugt von 140.000 bis 380.000 HPE/g erhält. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Denn diese Werte sind beispielsweise für die jeweilige Einstellung der Proteasekonzentration in verschiedenen Waschmittelrezepturen günstig.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt ein Enzymgranulat dar, das durch eines der zuvor beschriebenen Verfahren erhalten worden ist und die dementsprechend günstigen Eigenschaften aufweist.
Einen weiteren eigenen Erfindungsgegenstand stellt ein Mittel dar, enthaltend ein solches Enzymgranulat. Unter einem Mittel ist erfindunsggemäß jede Rezeptur oder Formulierung zu verstehen, die als wirksame Komponente solch ein Granulat enthält. Dessen übrige Zusammensetzung bestimmt sich nach dem Einsatzgebiet des Mittels. Hierbei ist es deshalb besonders vorteilhaft, erfindungsgemäße beschichtete Granulate einzusetzen, weil in solchen Rezepturen weitere Inhaltsstoffe zugegen sind, die die erfindungsgemäßen Granulate oder die enthaltenen Enzym hinsichtlich ihrer Stabilität gefährden könnten.
Hierunter sind alle jeweils zweckmäßigen, dem Stand der Technik entsprechenden Rezepturen oder Formulierungen zu verstehen, beispielsweise flüssige, vorzugsweise wasserfreie Formulierungen, in denen entsprechend beschichtete erfindungsgemäße Granulate stabil sind. Das läßt sich insbesondere über die lonenstärke und die Anwesenheit wasserentziehender Mittel und/oder Gelbildnern steuern.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei jedoch um Mittel in insgesamt fester Form, vorzugsweise in Pulverform oder kompaktiert, hierunter besonders bevorzugt zu Tabletten kompaktiert.
Denn bei diesen ist die Stabilität gegenüber Auflösungsvorgängen weniger kritisch als bei flüssigen Formulierungen. Ihre Herstellung ist im Stand der Technik hinlänglich bekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein Waschmittel oder um ein Reinigungsmittel.
Dazu zählen alle denkbaren Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Hand-Wäsche, beziehungsweise -Reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche oder Naturfasern, für die nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder; für solche wird nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet. Jegliche Wasch- oder Reinigungsmittelart stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, sofern sie um ein erfindungsgemäß hergestelltes Enzymgranulat bereichert ist.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle nach den Stand der Technik etablierten und/oder alle zweckmäßigen Darreichungsformen der erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel. Dazu zählen entsprechend dem oben gesagten insbesondere feste, pulverförmige, Mittel, gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen, komprimiert oder nicht komprimiert; ferner gehören beispielsweise dazu: Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches, sowohl in Großgebinden als auch portionsweise abgepackt. Auch flüssige, pastöse oder gelförmige Ausführungsformen sind eingeschlossen, sofern für diese das erfindungsgemäß aufgearbeitete Enzymgranulat darin stabil erhalten werden kann.
Ferner fallen hierunter sowohl Wasch- und Reinigungsmittel für die kommerzielle Anwendung als auch solche, die insbesondere über die Darreichungsform und die Auswahl der Inhaltsstoffe für den Endverbraucher konzipiert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel aktive Enzyme in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg, ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro Gramm des Mittels. Eingeschlossen werden alle ganzzahligen und nichtganzzahligen jeweils zwischen diesen Zahlen liegenden Werte.
Neben einem erfindungsgemäß hergestellten Enzymgranulat und möglicherweise weiteren Enzymen enthält ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel gegebenenfalls weitere aus dem Stand der Technik bekannte Inhaltsstoffe wie beispielsweise Enzymstabilisatoren, Tenside, zum Beispiel nichtionische, anionische und/oder amphotere Tenside, Bleichmittel, Bleichaktivatoren, Bleichkatalysatoren, Builder, Lösungsmittel, Verdicker und gegebenenfalls als weitere übliche Inhaltsstoffe Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Farbübertragungsinhibitoren, Schauminhibitoren, Färb- und/ oder Duftstoffe, antimikrobielle Wirkstoffe und/oder UV-Absorbenzien, um nur die wichtigsten Stoffklassen aufzuführen. Entsprechende Rezepturen sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Zur Realisierung dieses Erfindungsaspekts sei insbesondere auf folgende, bereits einleitend vorgestellte Dokumente verwiesen, in denen entsprechende Wasch- und Reinigungsmittel ausführlich dargestellt werden: Als Beispiele für den entsprechenden Einsatz von Amylasen: WO 02/44350 A2 (für eine Cyclodextrin-Glucanotransferase mit α-Amylase-Aktivität); WO 02/10356 A2, WO 03/014358 A2, WO 03/002711 A2, WO 03/054177 A2, DE 10309803.8 A1 (α-Amylasen); DE 102004048590.9 und DE 102004048591.7 (α-Amylase-haltige maschinelle Geschirrspülmittel; beide nicht vorveröffentlicht); als Beispiele für Cellulase-haltige Wasch- und Reinigungsmittel: WO 96/34092 A2 und WO 01/32817 A1 ; als Beispiele für Lipase-haltige Wasch- und Reinigungsmittel: WO97/08281 A1 und WO 95/27029 A1 ; und als Beispiele für Protease- haltige Wasch- und Reinigungsmittel: WO 91/02792 A1 , WO 92/21760 A1 , WO 95/23221 A1 , WO 03/038082 A2, WO 02/088340 A2, WO 03/054185 A1, WO 03/056017 A2, WO 03/055974 A2, WO 03/054184 A1 , DE 102004027091.0, DE 10360805.2 und DE 102004019751.2 (die letzten drei nicht vorveröffentlicht).
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung weiter.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung eines Proteasegranulats
Schritt 0: Herstellung einer einer wäßrigen, gereinigten Enzymlösung
Zunächst wurde durch Aufarbeitung aus einem Fermentationsüberstand von Protease- bildenden und -sekretierenden grampositiven Bakterien eine konzentrierte Proteaselösung hergestellt. Dabei wurde der Reihe nach den in Beispiel 1 der Anmeldung DE 10304066 beschriebenen Punkten „Abtrennung der Biomasse", „Bestimmung des optimalen Arbeitsbereichs", „Schritt (a): Konzentrierung der Enzymlösung bis zum Arbeitsbereich" und „Schritt (b): Separation der entstandenen Ausfällungen (Feststoffe)" gefolgt. Hierdurch wurden 10 I einer Proteaselösung mit einer Aktivität von 750.000 HPE/g und einem Trockensubstanzgehalt von 25 Gew.-% erhalten. Deren Erscheinungsbild wies in der international gebräuchlichen CIE-LAB-Farbskala, definiert in DIN 5033-3 und DIN 6174 einen L- Wert (Helligkeit) von 60, einen a*-Wert (rot-grün) von 3,0 und einen b*-Wert (gelb-blau) von 60 auf.
Schritt (a): lonenaustausch-Chromatographie
Nun folgte eine starkbasische Anionenaustausch-Chromatographie, durchgeführt bei einem pH-Wert von 7,5. Sie erfolgte im Festbett mittels des starkbasischen Anionenaustauschers vom Typ DIAION® Pa 308L, erhältlich von der Firma Mitsubishi, Tokyo, Japan, beziehungsweise Mitsubishi Chemical Europe GmbH, Düsseldorf, Deutschland. Hiervon wurden 2,5 I in einer Glaskolonne mit Siebboden bereitgestellt; die Betthöhe lag bei 300 mm; als treibende Kraft diente die geostatische Höhe. Die Chromatographie erfolgte mit Rücksicht auf das Bettvolumenverhältnis (BV; Volumenverhältnis des Enzymkonzentrats zum Harz) und die Verweilzeit. Konkret wurden ein Verhältnis von 2 bis 5 BV und eine Dosierung von 0,1 I Enzymlösung pro kg Harz und min eingestellt. Hierfür wurde über die Gravitation gesteuert.
Das Trennprinzip beruht darauf, daß das Enzym vom Trägermaterial abgestoßen, und somit im Flüssigkeitsstrom mitgeführt wird, während die Begleitstoffe am immobilen Träger adsorbiert werden. Ein Teil des Nachlaufs wurde zur Erhöhung der Ausbeute erneut über die Säule geführt. Anschließend wurden durch Spülen mit NaCI- und NaOH- Lösungen die an die Säule adsorbierten Verbindungen (vor allem Färb- und Geruchsstoffe) ausgewaschen und auf diese Weise das Festbett regeneriert.
Dadurch wurden 15 I eines schwach gefärbten Protease-Konzentrats erhalten. Dessen Aktivität betrug 490.000 HPE/g (Ausbeute 98 %, bezogen auf die eingesetzte Aktivität). Als CIE-Farbwerte wurden L = 92, a*=1,5 und b*= 20 ermittelt.
Schritt (b): Einstellung einer geeigneten Konzentration
Zur Konzentrationseinsteilung des über Schritt (a) erhaltenen Protease-Konzentrats wurde die Technik der thermischen Aufkonzentrierung gewählt. Dafür wurde die Enzymlösung mit Hilfe eines handelsüblichen Rotationsverdampfers (Rotavapor, Fa. Büchi, Schweiz) bei ca. 35°C und ca. 50 mbar auf eine Endaktivität von ca. 1.000.000 HPE/g einkonzentriert.
Schritt (c): Granulation
Die Granulation erfolgte über die Technik der Extrusion. Hierzu wurde die nach Schritt (b) konzentrierte Proteaselösung in einem Batchmischer (Fa. Lödige) mit folgenden handelsüblichen Zuschlagsstoffen versetzt: Maisstärke, Weizenmehl, PEG 2.000 (Fa. BASF, Deutschland), Cellulose, Saccharose.
Dieses Gemisch wurde sogleich in einem handelsüblichen gegenläufigen Zweiwellenextruder (Fa. Lihotzki, Deutschland) extrudiert und das erhaltene, noch feuchte Extrudat anschließend in einem Wirbelschichttrockner (WSG 5, Fa. Glatt, Deutschland) schonend, das heißt unterhalb von 40°C getrocknet.
Das hierdurch erhaltene Granulat ist sehr hell und weist praktisch nur noch die Eigenfärbung der Festrohstoffe auf. Als CIE-Farbwerte wurden L = 81 , a*=2 und b*= 15 ermittelt, während ein nicht Schritt (a) unterzogenes sondern auf herkömmliche Weise desodoriertes, ansonsten aber gleich behandeltes Vergleichsgranulat Werte von L = 67, a*=4 und b*= 18 aufwies. Schritt (d): Beschichtung (Coating)
Das aus Schritt (c) erhaltene Granulat wurde anschließend mit einer wäßrigen Suspension aus PEG 20.000 (Fa. BASF) und Titandioxid vom Rutil-Typ (Fa. Huntsman, Großbritannien) beschichtet. Hierfür wurde ein handelsüblicher Topspray-Wirbelschicht- Coater (WSG 5, Fa. Glatt) eingesetzt und eine Temperatur von weniger als 40°C eingehalten. Die erhaltene Beschichtung bestand zu ca. 80 Gew.-% aus PEG und zu ca. 20 Gew.-% aus Titandioxid und wies eine durchschnittliche Schichtdicke von ca. 20 μm auf.
Als CIE-Farbwerte wurden für das hierdurch erhaltene beschichtete Granulat L = 82, a*=1 und b*= 8 ermittelt, während das in Schritt (c) bereits zum Vergleich herangezogene und anschließend genauso Schritt (d) unterzogene Vergleichsgranulat Werte von L = 76, a*=2 und b*= 8 aufwies.
In Wiederholungen des Versuchs konnte der Titandioxid-Gehalt der Beschichtung erfindungsgemäßer Granulate auf bis zu ca. 6 Gew.-% gesenkt werden, wobei
Farbwerte erhalten wurden, die immer noch nicht schlechter waren als die des Vergleichgranulats.
Beschreibung der Figuren
Figur 1: Blockfließschema zur erfindungsgemäßen Herstellung eines
Enzymgranulats, einschließlich des optionalen Beschichtungs-Schritts. Dargestellt sind folgende Schritte, die sich an an die Herstellung einer wäßrigen, gereinigten Enzymlösung anschließen:
(a) lonenaustausch-Chromatographie über einen Ionenaustauscher, unter Durchfluß eines Regenerationsmediums zur Abtrennung von Färb- und Geruchsstoffen, optional unter Rückführung eines Teils des Vor- oder Nachlaufs der Chromatographie (Regenerat),
(b) Einstellung einer geeigneten Konzentration über Einkonzentrierung,
(c) Granulation unter Zugabe von Feststoffen zum Endprodukt und
(d) als optionaler Schritt: Beschichtung (Coating) über Zugabe der Schicht in Form einer Coating-Suspension zum Endprodukt.
Das Endprodukt nach Schritt (c) ist ein erfindungsgemäßes Enzymgranulat beziehungsweise nach Schritt (d) ein erfindungsgemäßes, beschichtetes Enzymgranulat.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Enzymgranulats aus einer wäßrigen, gereinigten Enzymlösung, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
(a) lonenaustausch-Chromatographie, während der das interessierende Enzym in Lösung bleibt,
(b) Einstellung einer geeigneten Konzentration und
(c) Granulation.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch folgenden Schritt:
(d) Beschichtung (Coating).
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a) eine Anionenaustausch-Chromatographie durchgeführt wird, vorzugsweise mit einem Material, das im pH-Bereich von 5 bis 11, besonders bevorzugt von 6 bis 8 maximale Austauschkapazität aufweist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Anionenaustauscher für Schritt (a) als funktioneile Gruppen quartäre Ammoniumgruppen aufweist, vorzugsweise substituiert mit mindestens zwei Alkylgruppen, besonders bevorzugt mit mindestens zwei Alkylgruppen mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen, optional zusätzlich mit einer 1 oder 2 Kohlenstoffatomen aufweisenden Hydroxyalkylgruppe.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Anionenaustauscher für Schritt (a) als funktionelle Gruppen Trimethyl-ammonium- oder Dimethylethanol-ammonium-Gruppen aufweist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Anionenaustausch-Chromatographie in einem pH-Bereich von 5 bis 9, vorzugsweise von 6 bis 8,5 besonders bevorzugt von 7 bis 8 durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Ionenaustauscher für Schritt (a) eine Austauschkapazität von 0,7 bis 1,2 meq/ml vorzugsweise von 0,8 bis 1,1 meq/ml, und besonders bevorzugt von 0,9 bis 1,0 meq/ml aufweist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Ionenaustauscher für Schritt (a) effektive Porengrößen von 0,2 bis 0,7 mm, vorzugsweise von 0,3 bis 0,6 mm, besonders bevorzugt von 0,4 bis 0,5 mm aufweist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Material des Ionenaustauschers für Schritt (a) eine Partikelgrößenverteilung von 150 bis 3.000 μm, vorzugsweise von 175 bis 1.500 μm, besonders bevorzugt von 200 bis 800 μm aufweist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Ionenaustauscher für Schritt (a) auf einem porösen Kunststoffpolymer beruht, vorzugsweise einem StyroI-DVB-Copolymer.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Chromatographie in Schritt (a) mit einem Bettvolumenverhältnis von 0,1 bis 100, vorzugsweise 0,5 bis 40, besonders bevorzugt 1 bis 4 durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Chromatographie in Schritt (a) bei einer durchschnittlichen Verweilzeit von 0,01 bis 2 g, vorzugsweise 0,025 bis 0,1 g, besonders bevorzugt 0,04 bis 0,06 g und ganz besonders bevorzugt von 0,05 g Enzym pro g lonenaustauschermaterial und Minute erfolgt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Chromatographie in Schritt (a) über die Leitfähigkeit des Eluats gesteuert wird, hierbei insbesondere die Trennung zwischen Vorlauf und Gutprodukt und/oder Gutprodukt und Nachlauf.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Chromatographie in Schritt (a) unter Rückführung wenigstens eines Teils des Vor- und/oder des Nachlaufs der lonenaustausch-Chromatographie in die Enzymlösung vor der Chromatographie erfolgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Einstellung einer geeigneten Konzentration in Schritt (b) durch Einkonzentrierung der Enzymlösung erfolgt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentrierung in Schritt (b) mit einem Einkonzentrierungsverhältnis von 1,01 bis 10, vorzugsweise von 1,1 bis 8, besonders bevorzugt von 1,2 bis 4 erfolgt, jeweils bezogen auf die zugehörigen Volumina.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Trockensubstanzgehalt beim Start der Einkonzentrierung in Schritt (b) bei 0,1 bis 40 Gew.-%, vorzugsweise bei 0,5 bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt bei 1 bis 15 Gew.-% liegt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Einkonzentrierung thermisch erfolgt.
19. Verfahren nach Ansprüche 18, dadurch gekennzeichnet, daß die thermische Einkonzentrierung der Enzymlösung in Schritt (b) bei 5 bis 70°C, bevorzugt bei 10 bis 60°C, besonders bevorzugt bei 20 bis 40°C, ganz besonders bevorzugt bei 35°C erfolgt, jeweils bezogen auf den zugehörigen Dampfdruck.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Trockensubstanzgehalt am Ende der Einstellung der geeigneten Konzentration in Schritt (b) bei 8 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise bei 9 bis 40 Gew.-%, besonders bevorzugt bei 10 bis 35 Gew.-% liegt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20 dadurch gekennzeichnet, daß das Konzentrat in Schritt (b) auf eine Viskosität von 1 bis 1.000 mPas eingestellt wird, vorzugsweise auf 1 bis 500 mPas, besonders bevorzugt auf 1 bis 200 mPas.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Protease handelt, deren Aktivität in Schritt (b) auf 200.000 bis 2.000.000 HPE pro g Konzentrat eingestellt wird, vorzugsweise auf 500.000 bis 1.500.000 HPE pro g Konzentrat, besonders bevorzugt auf 800.000 bis 1.200.000 HPE pro g Konzentrat.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Granulation in Schritt (c) durch Extrusion erfolgt.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Granulation in Schritt (c) so gesteuert wird, daß eine durchschnittliche Partikelgröße von 100 bis 10.000 μm, vorzugsweise von 200 bis 5.000 μm, besonders bevorzugt von 400 bis 1.000 μm erzielt wird, bei der Extrusion insbesondere über die Größe der Lochplatten oder die Geschwindigkeit des Messers.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Granulation in Schritt (c) unter Vermischung des Enzymkonzentrats aus Schritt (b) mit einem oder mehreren Inhaltsstoffen, ausgewählt aus der Gruppe Getreidemehl, Stärke, Stärkederivate, Cellulose, Cellulosederivate, Gleitmittel (Weichmacher), Zucker und Enzym-Stabilisatoren erfolgt.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die durch Schritt (c) erhaltenen Granulate getrocknet werden.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung in Schritt (d) mit
0 bis 30 Gew.-% Pigment,
0 bis 30 Gew.-% Weichmacher,
5 bis 97,5 Gew.-% Filmbildner (Fließmittel) und optional weiteren Bestandteilen erfolgt.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung 2,5 bis 27,5 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 25 Gew.-% Pigment enthält.
29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung 0,5 bis 15 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 5 Gew.-% Weichmacher enthält.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung 7,5 bis 95 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 90 Gew.-%, besonders bevorzugt 20 bis 80 Gew.-% Filmbildner enthält.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke der Beschichtung 1 bis 150 μm, vorzugsweise 5 bis 50 μm, besonders bevorzugt 10 bis 30 μm beträgt.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a) ein technisch einsetzbares Enzym eingebracht wird, vorzugsweise eine Protease, besonders bevorzugt eine alkalische Protease.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß das durch Schritt (d) erhaltene Granulat insbesondere über die Steuerung der Granulation in Schritt (c) eine durchschnittliche Partikelgröße von 110 bis 5.000 μm, vorzugsweise von 200 bis 2.000 μm, besonders bevorzugt von 400 bis 1.200 μm erhält.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a) eine Protease eingebracht wird und das durch Schritt (c) oder (d) erhaltene Granulat insbesondere über die Einstellung der Konzentration in Schritt (b) eine durchschnittliche Aktivität von 50.000 bis 500.000 HPE/g, vorzugsweise von 100.000 bis 450.000 HPE/g, besonders bevorzugt von 140.000 bis 380.000 HPE/g erhält.
35. Enzymgranulat, erhalten durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 34.
36. Mittel, enthaltend ein Enzymgranulat nach Anspruch 35.
37. Mittel nach Anspruch 36 in insgesamt fester Form, vorzugsweise in Pulverform oder kompaktiert, hierunter besonders bevorzugt zu Tabletten kompaktiert.
38. Mittel nach Anspruch 36 oder 37, wobei es sich um ein Waschmittel oder um ein Reinigungsmittel handelt.
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