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WO2004111250A1 - アルツハイマー病の治療のための組換えアデノ随伴ウィルスベクター - Google Patents

アルツハイマー病の治療のための組換えアデノ随伴ウィルスベクター Download PDF

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WO2004111250A1
WO2004111250A1 PCT/JP2004/008224 JP2004008224W WO2004111250A1 WO 2004111250 A1 WO2004111250 A1 WO 2004111250A1 JP 2004008224 W JP2004008224 W JP 2004008224W WO 2004111250 A1 WO2004111250 A1 WO 2004111250A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
adeno
associated virus
virus vector
vector according
peptide
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2004/008224
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takeshi Tabira
Hideo Hara
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan As Represented By President Of National Center For Geriatrics And Gerontology
National Institutes of Biomedical Innovation Health and Nutrition
Original Assignee
Japan As Represented By President Of National Center For Geriatrics And Gerontology
National Institutes of Biomedical Innovation Health and Nutrition
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan As Represented By President Of National Center For Geriatrics And Gerontology, National Institutes of Biomedical Innovation Health and Nutrition filed Critical Japan As Represented By President Of National Center For Geriatrics And Gerontology
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Priority to AU2004248014A priority patent/AU2004248014B2/en
Priority to BRPI0411321-7A priority patent/BRPI0411321A/pt
Priority to DE602004026867T priority patent/DE602004026867D1/de
Priority to EP04745818A priority patent/EP1634956B1/en
Priority to AT04745818T priority patent/ATE466093T1/de
Priority to US10/560,280 priority patent/US8318687B2/en
Priority to CA2529179A priority patent/CA2529179C/en
Publication of WO2004111250A1 publication Critical patent/WO2004111250A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/025—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a parvovirus

Definitions

  • Recombinant adeno-associated virus vector for the treatment of Alzheimer's disease Recombinant adeno-associated virus vector for the treatment of Alzheimer's disease
  • the present invention relates to an adeno-associated virus vector that expresses an A / 3 peptide that can be used for Alzheimer's disease and its use as a pharmaceutical.
  • Alzheimer's disease is characterized by senile plaques, neurofibrillary tangles, and neuronal changes and loss in the brain.
  • ⁇ -amyloid deposited in senile plaques is thought to play a central role in the pathogenesis of Alheimer's disease.
  • the ⁇ amyloid peptide ( ⁇ ⁇ ) is produced by partial degradation of ⁇ -amyloid precursor protein ([3 APP) in neurons by ⁇ , -secretory enzymes. Generated.
  • Non-Patent Document l Schenk D, Barbour R, Dunn W et al .: Nature 400: 173-177, 1999).
  • the first theory is that A peptide is administered to produce antibodies against A iS in the body, the antibody binds to aggregated A in senile plaques, and microglia phagocytoses it, thereby removing senile plaques, The theory is that the antibody also binds to the secreted A j3 and the microglia is phagocytosed to suppress the toxicity of A / 3 to nerve cells, leading to treatment such as improvement of dementia.
  • the second theory is that by administering A / 3 peptide, the antibody produced against ⁇ will recognize and bind to the amino acid at the ⁇ terminal of Aj3, and will aggregate and insolubilize A / 3 It is the theory that amyloid deposition is reduced by suppressing solubilization and secretion of secreted A.
  • the third theory is that the antibody against A does not cross the blood-brain barrier and reduces A / 3 in peripheral blood / peripheral tissue, thereby eliciting central nervous system force, et al. Aj3 to the periphery. It is. [0005] Based on the above hypothesis, attempts have also been made to develop a method for preventing and treating Alzheimer's disease using a viral vector.
  • Non-patent Document 2 Takeshi Tahira, Hideo Hara, 2001 Welfare Chemistry Research “21 Research report on the results of research on the development of century-based medicine (in the field of dementia) ", Longevity Science Foundation, March 2002, p. 49-54). However, in this report, no in vivo experiments have been conducted and therapeutic effects in animals have been confirmed.
  • TGF- ⁇ 1 Transforming growth factor ⁇ 1
  • IL-1 ⁇ Interleukin-1 ⁇
  • TNF-Hi Tumor
  • a therapeutic agent for Alzheimer's disease is required to suppress the formation of senile plaques and amyloid deposition in the central nervous system, and at the same time, it does not spread to multiple organs and causes side effects such as encephalitis. There is also a need for safety. However, no therapeutic agent using A ⁇ antigen that satisfies these conditions has been reported so far.
  • the present inventors now use recombinant adeno-associated virus (rAAV) to express A antigen that induces humoral immunity in intestinal cells and induce antibody production against this A antigen. Found that amyloid deposition and senile plaque formation were reduced in the brain.
  • the present inventors have used the recombinant adeno-associated virus such as brain and kidney. We found that no inflammation was observed in any other organs. The present invention is based on these findings.
  • an object of the present invention is to provide an adeno-associated virus vector expressing the A antigen and a pharmaceutical composition containing the same, which can be used for the treatment of Alzheimer's disease.
  • the adeno-associated virus vector according to the present invention is an adeno-associated virus vector capable of expressing a peptide fragment containing a humoral immunity-inducing site of / 3 amyloid peptide, and a DNA encoding this peptide fragment is obtained. It consists of things that can function.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is a pharmaceutical composition for treating Alzheimer's disease comprising the adeno-associated virus vector according to the present invention.
  • antibody production can be induced without causing cellular immunity using a recombinant adeno-associated virus vector, and senile plaque formation and amyloid in the central nervous system can be induced. Can be suppressed. Furthermore, when this recombinant adeno-associated virus is used, the blood TGF-J31 concentration can be decreased, and the progression of cerebral vascular amyloid deposition and brain microvessel degeneration can be suppressed. Furthermore, the recombinant adeno-associated virus vector according to the present invention enables highly safe treatment of Alzheimer's disease without causing side effects such as encephalitis and liver damage.
  • FIG. 1 shows the amount of anti-A ⁇ antibody produced in serum from mice orally administered with an adeno-associated virus vector expressing A / 3-43.
  • FIG. 2 shows the in vitro A / 3 aggregation-inhibiting effect of anti-antigen / 3 antibody in mouse serum.
  • Figure 3 shows cell proliferation reactivity of treated mouse spleen cells to A j342 peptide.
  • FIG. 4 shows the average A accumulation area ratio in the area of the frontal cortex 'parietal' hippocampus in mice orally administered with an adeno-associated virus vector expressing A / 31-43.
  • FIG. 5 shows the average A accumulation area ratio in the frontal cortex 'parietal' hippocampus region in mice orally administered with an adeno-associated virus vector expressing A iS 1-21.
  • FIG. 6 shows adeno-associated virus vector expressing A iS 1-43 or A j3 1-21 orally It shows the TGF-1 concentration in the serum from the administered mice.
  • the adeno-associated virus vector according to the present invention comprises a DNA encoding a peptide fragment containing a humoral immunity-inducing site of j3 amyloid peptide (A j3 peptide) in a functional form, whereby the peptide fragment Can be expressed.
  • “comprising in a functional form” means that the transgene (DNA) can be expressed under the control of appropriate regulatory elements (eg, promoter, enhancer, transcription terminator, etc.). Means that the transgene is inserted into the vector.
  • the humoral immunity induction site of A ⁇ peptide can be easily identified by those skilled in the art.
  • the humoral immunity induction site is present in the region of the 4th to 10th amino acids (A iS 4-10) of the ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ peptide.
  • the antigen peptide fragment expressed by the adeno-associated virus vector according to the present invention preferably comprises A4-10.
  • the amino acid sequence of A 4-10 includes the 4th to 10th amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Accordingly, the antigen peptide fragment preferably comprises the 4th to 10th amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence of DNA encoding this amino acid sequence is not particularly limited, and examples thereof include the 1030th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. Therefore, the DNA encoding the antigen peptide fragment preferably comprises the 1030th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the antigenic peptide fragment comprises the first 43 amino acids (A / 3-43) of the A / 3 peptide.
  • ⁇ Amino acid sequence of ⁇ 1-43 J includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; therefore, the antigen peptide fragment comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It is preferable.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding this amino acid sequence is not particularly limited.For example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be mentioned. Therefore, the DNA encoding the antigen peptide fragment is It preferably comprises the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the antigen peptide fragment comprises A peptide. 1st to 21st amino acids (A; 3 1-21).
  • Examples of the amino acid sequence AJ_21 of A 1_21 include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and therefore, the antigen peptide fragment preferably comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding this amino acid sequence is not particularly limited, but includes, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, and therefore encodes the antigen peptide fragment.
  • the DNA comprises a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequences of A ⁇ 1-143 and ⁇ 1-21 include not only the humoral immunity induction site but also the ⁇ cell receptor recognition probe IJ. When these antigen peptide fragments are expressed in the intestinal mucosal immune system, antibody production is mainly induced, and cellular immunity is hardly induced.
  • the antigen peptide fragment expressed by the adeno-associated virus vector according to the present invention is secreted outside the cell after expression in the infected cell. It is preferable. Accordingly, the adeno-associated virus vector according to the present invention preferably comprises a DNA encoding a signal peptide capable of secreting the expressed antigen peptide fragment outside the cell in a functional form. .
  • “comprising in a functional form” means that the signal peptide is expressed together with the antigen peptide fragment, and the expressed antigen peptide fragment is secreted outside the cell by the signal peptide. To do.
  • the DNA encoding the signal peptide into the adeno-associated virus vector according to the present invention in a functional form
  • those known to those skilled in the art can be used.
  • the antigen peptide fragment A fusion gene in which each DNA is fused can be used so that the signal peptide is expressed in a form bound to the heel end.
  • the signal peptide As the signal peptide, those known to those skilled in the art can be used.
  • the signal peptide present at the heel end of the amyloid precursor protein ( ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ) is preferably used. ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • the amino acid sequence of the signal peptide includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and therefore the signal peptide expressed by the adeno-associated virus vector according to the present invention has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6. Is comprised of I prefer to be there.
  • the nucleotide sequence of DNA encoding this amino acid sequence is not particularly limited.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 can be mentioned. Therefore, the DNA encoding the signal peptide can be Preferably, comprising the nucleotide sequence represented by number 5.
  • an adeno-associated virus vector comprises a DNA encoding a fusion protein in which an APP signal peptide is linked to the N-terminus of A j31-43. Is done.
  • the amino acid sequence of this fusion protein includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and the nucleotide sequence of the DNA that encodes this includes the 9th to 191st nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7. Can be mentioned.
  • an adeno-associated virus vector comprises DNA encoding a fusion protein in which an APP signal peptide is linked to the N-terminus of A / 3-21-21. It is supposed to be The amino acid sequence of this fusion protein includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and the nucleotide arrangement IJ of the DNA encoding the fusion protein includes the 17th-- in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9. 133 nucleotides.
  • the adeno-associated virus vector according to the present invention may contain a regulatory element for efficiently expressing the target DNA, for example, a promoter, an enhancer, a transcription terminator, etc.
  • a translation start codon, a translation stop codon, etc. may be inserted.
  • the adeno-associated virus vector according to the present invention can be prepared by standard methods well known in the art.
  • US Pat. No. 5,858,351 and references cited therein describe various recombinant adeno-associated viruses suitable for use in gene therapy, and methods for making and propagating those vectors.
  • wild type A plasmid is prepared by inserting the gene of interest between the ITRs at both ends of the adeno-associated virus (AAV vector plasmid).
  • AAV vector plasmids that express the Rep gene (a gene that encodes a replicative protein) and Cap gene (a gene that encodes the cranial protein of the virus), and the genes of the adenovirus genes E2A, E4, and VA
  • plasmids that express the Rep gene (a gene that encodes a replicative protein) and Cap gene (a gene that encodes the cranial protein of the virus), and the genes of the adenovirus genes E2A, E4, and VA
  • These three plasmids are then co-transfected into a packaging cell that expresses the E1 gene, such as HEK293 cells, and the cells are cultured.
  • adeno-associated virus vector particles having high infectivity for mammalian cells can be produced.
  • Such a method can be easily performed using a commercially
  • the adeno-associated virus vector according to the present invention can be used for treatment of Alzheimer's disease in mammals. Therefore, according to the present invention, the present invention provides a method for treating Alzheimer's disease, and a method for producing a therapeutic agent for Alzheimer's disease, comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of an adeno-associated virus vector according to the present invention.
  • the use of adeno-associated virus vectors by is provided.
  • “treatment” includes not only treating an established pathology but also preventing a pathological condition that may be established in the future.
  • the subject is a mammal, for example, a rodent, Inu, cat, ushi, primate, etc., and preferably a human.
  • the administration method of the adeno-associated virus vector according to the present invention is a method that can be used in the field of gene therapy, such as intraperitoneal injection, intratracheal injection, intrabronchial injection and direct intrabronchial instillation, Subcutaneous injection, transdermal delivery, intraarterial injection, intravenous injection, etc. (see Flotte and Carter, Gene Therapy 2: 357-362 (1995)).
  • adeno-associated WINORES has the advantage that it can be administered orally because it is not easily degraded by gastric juice. Oral administration is particularly preferred in that the subject can administer himself.
  • the amount of adeno-associated virus vector to be administered should be a therapeutically effective amount, and such an amount can be easily determined by those skilled in the art of gene therapy.
  • the dose is preferably adjusted according to the severity of the disease state, sex, age, weight, habits, etc. of the subject, but such adjustment of the dose is appropriately performed by a doctor or veterinarian.
  • the amount of adeno-associated virus vector administered orally is usually 0.5 X 10 "2.0 X 10 viral genome / kg body weight, preferably 1. OX 10 — 1. OX 10 viral genome / kg body weight, more preferably 1 ⁇ OX 10 11 — 5.0 X 10 viral genome / kg body weight.
  • the adeno-associated virus vector according to the present invention is pharmaceutically safe within the above dose range.
  • the “viral genome” and the unit represent the number of adeno-associated virus genomes (number of virus particles), and are well known to those skilled in the art as indicating the amount of adeno-associated virus vector. It is. The numerical value can be determined by diluting the purified adeno-associated virus solution and carrying out dot blot hybridization, and comparing the signal intensity with plasmid DNA of a predetermined number of molecules.
  • the adeno-associated virus vector according to the present invention is administered to a subject, the therapeutic action for Alzheimer's disease continues for a relatively long period of time.
  • the antigen is presented in the intestinal epithelial cells for at least 6 months, and antibody production against this is induced.
  • a person skilled in the art can prepare an appropriate dosing schedule.
  • the adeno-associated virus vector according to the present invention can be administered to a subject as a pharmaceutical composition containing the same. Therefore, according to the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for treating Alzheimer's disease comprising the adeno-associated virus vector according to the present invention. According to a preferred embodiment of the invention, the pharmaceutical composition is for oral administration.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be prepared by a method known in the art depending on the administration route and dosage form.
  • dosage forms such as capsules and solutions can be used as pharmaceutical compositions for oral administration. Therefore, the pharmaceutical composition according to the present invention can contain a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, preservative and the like according to each dosage form.
  • mice used in the following test examples are Alzheimer's disease. Taconic, Mayo Clinic). [0034] Example 1
  • Amyloid / 3/43 (A J3 1-43) cDNA was amplified by PCR using the following primers with the human amyloid precursor protein (APP) gene as a saddle.
  • the composition of the PCR reaction solution is TAPS buffer (25 mM, pH 9.3), KCl (50 mM), MgCI (2 mM), 2-mercaps.
  • Toethanol (lmM), dNTPs (100 x M), vertical DNA (50-100 ng), and primers (0.2 ⁇ M each) were used.
  • the temperature condition of the cycle reaction was 94 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 3 minutes, which was 30 cycles.
  • the adapter of the first N-terminal signal distribution lj (SEQ ID NO: 10), which is the APP secretion signal, is obtained by treating the following two oligonucleotides at 90 ° C for 3 minutes and then annealing at room temperature. Produced.
  • APP secretion signal adapter having a T residue protruding 3 'to the sense strand
  • a j3 1-43 cDNA A residue protruding 3' to the antisense strand
  • 4 cDNA SEQ ID NO: 7: nucleotides 3-8 in this sequence are Xbal recognition sites
  • composition of the PCR reaction solution is TAPS buffer (25 mM, pH 9.3), KCl (50 mM), MgCl (2 mM), 2-mercaptoethanol (lmM), dNTPs (100 ⁇ M), vertical DN
  • a (50—lOOng) and primer each 0.2 ⁇ M.
  • the temperature conditions for the cycle reaction were 94 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 3 minutes, which was 30 cycles.
  • the above recombinant pXXUFl, the standard Rep / Cap plasmid, and the E2A / E4 / VA plasmid were transferred to HEK293 cells using the calcium phosphate method, and HEK293 cells were cultured in large quantities. From the cell lysate, virus particles were purified by ultracentrifugation of CsCl to obtain an adeno-associated virus vector having APP signal sequence + A j31-43 cDNA.
  • APP signal sequence + A / 3 l-43 cDNA (XbaI-AflIl / blunt) was incorporated into pBluescript plasmid (Xba to Smal). Using this as a saddle type, PCR was performed using the following primers.
  • Ply _ Mar Forward 5'-TGGCGGCCGCTCTAGAATG-3 '(SEQ ID NO: 16: has a NotI site on the 5'side);
  • P of APP signal sequence + A / 3 l_21 cDNA (SEQ ID NO: 9: the third 10 nucleotide in this sequence is a Notl recognition site, and the 11th and 16th nucleotides are Xbal recognition sites)
  • the CR product was Notl—Aflll / blunt treated and incorporated into pXXUF 1 (Notl-S all) with the above “stuffer” pBR322 PvuII—Sall fragment.
  • GFPrAAV adeno-associated virus
  • APP signal sequence + A i3 l_43 cDNA was incorporated into expression vector pXXUFl, and after 48 hours of introduction into HEK293 cells using lipofectamine 2000 (In vitrogen), the culture supernatant and cell lysate were extracted and anti-A j3 antibody ( After immunoprecipitation with 4G8)
  • Electrophoresis on SDS-PAGE gel After transferring the protein to the nitrocellulose membrane, we tried to detect ⁇ protein with anti-A ⁇ antibody. As a result, it was confirmed that A ⁇ was secreted to the outside of the cell while forming an oligomer, and that a large amount of 4 kDa ⁇ peptide monomer protein was generated in the cell.
  • the adeno-associated virus vector 5X10 ⁇ viral genome of Example 1 was orally administered to a 15-week-old mouse only once. Serum from this mouse was collected after 1 month, 4 months, and 6 months, respectively.
  • Each ⁇ -42 peptide (5mgZmL) was added to each well of a 96 well plate (Nunc, MaxiSonjp). After adhering to a paste and blocking with 5% non-fat milk / TBS-T buffer, the collected mouse serum was added (diluted 500 times) and detected with a peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody. The antibody titer was evaluated by measuring the absorbance with an ELISA reader. Figure 1 shows the results.
  • the antibody titer in serum peaked mainly at 1 month after oral administration, and sustained antibody production was observed until 6 months later.
  • ⁇ ⁇ 1_40 peptide was adjusted to a concentration of 120 mM and incubated at 37 ° C. 2 Aggregation of A j3 was observed after 4 hours. Mouse serum was added to the A / 3 aggregates at concentrations of 1:10 and 1:20 (vol: vol) and incubated at 37 ° C. for 1 week. ⁇ Binding of ⁇ 1-40. Whether the mouse serum inhibits aggregation was measured using a spectrofluorimeter (excitation at 445 nm; emission at 490 nm) with addition of 2 mM thioflavine. Figure 2 shows the results.
  • mice serum 6 months after administration of the adeno-associated virus vector shown in Test Example 1 significantly inhibited A1_40 aggregation 'binding in vitro as compared to the control mouse serum.
  • the heart, lung, spleen, liver, upper gastrointestinal tract and kidney were removed from 28-week mice, and the tissue was homogenized in Tris solution, followed by proteinase K. Protein was digested, treated with phenol / chloroform, and DNA was purified.
  • the following primers were prepared from the 5′-base sequence IJ of the promoter region of the adeno-associated virus vector (pXXUFl) and the 3′-base sequence of the vector, and PCR was performed.
  • the composition of the PCR reaction solution is TAPS buffer (25 mM, pH 9.3), KCl (50 mM), MgCl (2 mM)
  • a 500 bp band indicating the target PCR product was found only in the upper gastrointestinal tissue.
  • Spleen cells were isolated from 28-week-old mice after oral administration of adeno-associated virus of Example 1, 5 ⁇ 10 4 cells were added per tool in a 96-well plate, and A / 3-42 peptide was added at each concentration. The cells were cultured in the culture broth for 48 hours. After cell culture was completed, tetrazolium salt (WST-1) was added. Since tetrazolium salt is converted to formazan dye by mitochondrial tetrazolium succinate reductase, which is active only in living cells, the cell proliferation ability reaction was determined by measuring the absorbance of the dye solution with an ELISA reader. Figure 3 shows the results.
  • mice orally administered with the adeno-associated virus of Example 1 had a low response to cell proliferation regardless of the concentration of A 1 -42 peptide.
  • treatment group a mouse orally administered with the adeno-associated virus of Example 1 (hereinafter referred to as “treatment group”) or an untreated age-matched mouse (hereinafter referred to as “control group”) at the time of 6 months (10 months old) after administration.
  • control group an untreated age-matched mouse
  • Oxidase activity was inactivated. After reacting with anti-A ⁇ antibody (4G8: diluted 1000 times) or rabbit anti-A / 340 antibody (diluted 1000 times), a peroxidase-labeled secondary antibody was added, and DAB staining was performed.
  • Table 1 Comparison of brain amyloid deposits between the mouse control group and the treatment group
  • tissues were obtained from the treatment group and the control group at 6 months (10 months old) after administration, and the following experiments were performed using frozen sections of the tissues. Stain frozen sections with the ABC method using antibodies such as anti-CD4 antibody, anti-CD86 antibody, anti-CDllb antibody, anti-GFAP antibody (astrocyte), anti-Iba-1 antibody (microglia), and The presence or absence of lymphocyte infiltration in the nervous system was confirmed. The results are shown in Table 2.
  • CD4 which is a T cell marker
  • CD86 which is a T cell activation molecule
  • a peripheral macrophage marker, CD1 lb was also negative.
  • GFAP an astrocyte marker
  • Tissues were obtained from mice orally administered with the adeno-associated virus of Example 2 (hereinafter referred to as “treatment group 2”) or control group when 6 months (10 months of age) after administration, and the tissues were frozen. DAB staining was performed using the sections in the same manner as in Test Example 6.
  • Group A 15 weeks of age
  • Group B 30 weeks of age
  • Group A 45 weeks of age
  • the adeno-associated virus of Example 1 (5.0 ⁇ 10 n viral genome / animal) was orally administered once to “Group C”.
  • a control group consisting of 6 mice was prepared, and PBS (0.1 mL / mouse) was orally administered at the age of 15 weeks. Thereafter, each group was dissected at 12-13 months of age (52-56 weeks of age), and brain tissue sections were obtained in the frontal cortex / parietal lobe region. These tissue sections are then tested.
  • the sample was stained in the same manner as in Example 6 and observed using a 3CCD camera connected to a microscope, and the area of the A accumulation portion in each region was measured. The area ratio of the A accumulation portion in each measurement site was calculated. The results are shown in Fig. 4.
  • control group had an average area ratio f or 2. 64 ⁇ 1. 46 0/0 of the three brain measurement region of the A beta accumulation portion.
  • f is 0.5 55 ⁇ 0.50 ⁇ / ⁇ in group A administered by 15-week-old Nichiji, and 0.48 ⁇ 0.35% in group ⁇ administered at 30-week-old. It was 0.46 ⁇ 0.27% in the C-group administered at age, and both values were significantly lower than those in the control group (one-way variance analysis (ANOVA)). And Student's t test, p (0.001).
  • Group D Prepare 3 groups of 4 mice, each at 15 weeks of age (hereinafter referred to as “Group D”), 30 weeks of age (hereinafter referred to as “Group E”), or 45 weeks of age (hereinafter referred to as “Group D”).
  • the adeno-associated virus of Example 2 (5.0 ⁇ 10 n viral genome / animal) was orally administered once to “Group F”. Thereafter, each group was treated in the same manner as in Test Example 9, and the area ratio of the A accumulation portion in each measurement site was calculated. The results are shown in Fig. 5.
  • the area ratio of the A accumulation part was 0.39 ⁇ 0.27% in the D group administered at 15 weeks of age, and 0.45 ⁇ 0.30% in the E group administered at 30 weeks of age. Yes, in the F group administered at 45 weeks of age, it was 0.37 ⁇ 0.20%, which was significantly lower than the control group shown in Test Example 9 (one-way variance) Analysis method (one-way variance analysis, ANOVA) and Student t-test, p ⁇ 0.001).
  • TGF- / 3 1 concentration in mouse serum was measured by ELISA using Quantikine Mouse / Rat / Porcine TGF- ⁇ 1 Immunoassay (manufactured by R & D systems). The result is shown in Fig. 6.
  • TGF_j3 1 The concentration of TGF_j3 1 in mouse serum was 111.6 ⁇ 40.0 pg / mL in the control group. there were. On the other hand, in Group A in Test Example 9, it was 80.5 ⁇ 12.9 pg / mL, Group B was 76.0 ⁇ 6 ⁇ 3 pg / mL, and Group C was 74.3 ⁇ 21. Opg / mL. Both groups showed significantly lower values than the control group (one-way variance analysis (ANOVA) and student t-test, p ⁇ 0.001).
  • ANOVA one-way variance analysis

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Abstract

　本発明は、βアミロイドペプチドの液性免疫惹起部位を含むペプチド断片を発現しうるアデノ随伴ウィルスベクターであって、このペプチド断片をコードするＤＮＡを機能しうる形で含んでなる、アデノ随伴ウィルスベクターを開示している。

Description

明 細 書
アルツハイマー病の治療のための組換えアデノ随伴ウィルスベクター 発明の背景
[0001] 枝術分野
本発明は、アルツハイマー病に対して用いることが可能な A /3ペプチドを発現する アデノ随伴ウィルスベクターおよびその医薬品としての使用に関する。
[0002] 昔景按術
アルツハイマー病は、脳における老人斑、神経原繊維変化、ならびに神経細胞の 変化および脱落により特徴づけられる。特に老人斑に沈着する βアミロイドは、アル ッハイマー病の病態形成の中心的役割を果たしていると考えられている。この βアミ ロイド体の主成分である βアミロイドペプチド（Α β )は、神経細胞内の β—アミロイド前 駆体タンパク質（ [3 APP)が β , -分泌酵素によって部分的に分解されることにより 生成される。
[0003] 近年、家族型アルツハイマー病変異を有するヒトアミロイド前駆体タンパク質を強発 現するトランスジエニックマウスに対し、アジュバントと共に Α ペプチドを免疫投与す ることによって、老人斑の形成が抑制され、既に形成されている老人斑も減少するこ とが報告されている（非特許文献 l : Schenk D, Barbour R， Dunn W et al. : Nature 400: 173-177, 1999)。
[0004] 上記作用の機序としては、現在 3つの説がある。第一の説は、 A ペプチドを投与 し A iSに対する抗体を体内で産生させ、老人斑の中の凝集した A に抗体が結合し 、それをミクログリアが貪食することにより、老人斑が除去され、分泌された A j3にも抗 体が結合してミクログリアが貪食し、 A /3の神経細胞への毒性を抑え、痴呆の改善な どの治療に結びつくという説である。第二の説は、 A /3ペプチドを投与することによつ ΧΑ βに対して産生された抗体は、 A j3の Ν末端のアミノ酸を認識して結合し、凝集' 不溶化した A /3を可溶化し、さらに分泌された A の凝集 ·沈着を抑制することにより 、アミロイド沈着を減少させるという説である。第三の説は、 A に対する抗体は、血 液脳関門を越えず、末梢血 ·末梢組織において A /3を減少させることにより、中枢神 経系力、ら A j3を末梢に引き出すという sink説である。 [0005] 上記の仮説に基づき、ウィルスベクターを用いたアルツハイマー病の予防法および 治療法の開発も試みられている。例えば、アデノウイルスベクターに A iS cDNAを組 み込み、 C57BL/6マウスに経口投与することによって、マウス上部消化管組織に A βを発現させることが可能であり、さらに、このマウスの血清中の抗 A j3抗体は、 in vitroにおレ、て A βペプチドの凝集を阻害することが報告されてレ、る（非特許文献 2： 田平 武、原 英夫著、平成 13年度 厚生化学研究「21世紀型医療開拓推進研究（ 痴呆分野)研究成果発表報告書」、財団法人 長寿科学振興財団出版、平成 14年 3 月、 p. 49— 54)。し力し、この報告では、 in vivo実験は行われておらず、動物におけ る治療効果は確認されてレ、なレ、。
[0006] また、サイト力インである TGF— β 1 (Transforming growth factor β 1)は、血管内皮 細胞での炎症性サイト力イン（IL—1 β (Interleukin-1 β ), TNF—ひ (Tumor necrosis factor—ひ）など）の産生を促進することが知られている。そして、近年、 TGF—/3 1は、 脳血管へのアミロイド沈着や、極小血管の変性など、アルツハイマー病と関連する病 理変化を促進することが報告されている（非特許文献 3 ;Wyss-Coray， T. et al. : Amyloidogenic role or cytoKine T F- β 1 transgenic mice and Alzheimer s disease: Nature 389: 603-606, 1997、および非特許文献 4 ;Wyss_Coray， T. et al.： Chronic overproduction of transforming growth factor- j3 1 by astrocytes promotes Alzheimer's disease-like microvascular degeneration in transgenic mice : Am. J. Pathol. 156 : 139-150， 2000)。
[0007] アルツハイマー病の治療剤には、中枢神経系での老人斑の形成およびアミロイドの 沈着を抑制することが必要とされ、同時に、多臓器への拡散がないこと、脳炎などの 副作用を起こさないことなど、安全性も求められる。しかし、これらの条件を満たす、 A β抗原を利用した治療剤は、これまで報告されていない。
発明の概要
[0008] 本発明者らは、今般、組換えアデノ随伴ウィルス (rAAV)を用いて、液性免疫を惹 起させる A 抗原を腸管細胞に発現させ、この A 抗原に対する抗体産生を誘導す ることにより、脳においてアミロイド沈着および老人斑形成が減少することを見出した 。さらに、本発明者らは、この組換えアデノ随伴ウィルスを用いると、脳および腎臓な どの他臓器に炎症所見が認められないことを見出した。本発明はこれらの知見に基 づくものである。
[0009] 従って、本発明は、アルツハイマー病の治療に用いることのできる、 A 抗原を発 現するアデノ随伴ウィルスベクターおよびこれを含む医薬組成物の提供を目的とする
[0010] そして、本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは、 /3アミロイドペプチドの液性免 疫惹起部位を含むペプチド断片を発現しうるアデノ随伴ウィルスベクターであって、こ のペプチド断片をコードする DNAを機能しうる形で含んでなる、ものである。
[0011] さらに、本発明による医薬組成物は、本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターを含 んでなる、アルツハイマー病を治療するための医薬組成物である。
[0012] 本発明によれば、組換えアデノ随伴ウィルスベクターを利用して、細胞性免疫を惹 起せずに抗体産生を誘導することができ、中枢神経系での老人斑の形成およびアミ ロイドの沈着を抑制できる。さらに、この組換えアデノ随伴ウィルスを用いると、血中の TGF- J3 1濃度を減少させ、脳血管へのアミロイド沈着および脳の極小血管の変性 の進行を抑制できる。さらに、本発明による組換えアデノ随伴ウィルスベクターによれ ば、脳炎、肝障害等の副作用を起こさない安全性の高いアルツハイマー病の治療が 可能となる。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]は、 A /3 1— 43を発現するアデノ随伴ウィルスベクターを経口投与したマウスか らの血清中の抗 A β抗体産生量を示す。
[図 2]は、マウス血清中の抗 Α /3抗体による in vitroでの A /3凝集抑制効果を示す。
[図 3]は、治療したマウスの脾細胞の A j3 42ペプチドに対する細胞増殖反応性を示 す。
[図 4]は、 A /3 1— 43を発現するアデノ随伴ウィルスベクターを経口投与したマウスに おける、前頭葉皮質'頭頂葉'海馬の領域の平均 A 蓄積面積率を示す。
[図 5]は、 A iS 1—21を発現するアデノ随伴ウィルスベクターを経口投与したマウスに おける、前頭葉皮質'頭頂葉'海馬の領域の平均 A 蓄積面積率を示す。
[図 6]は、 A iS 1— 43、または A j3 1—21を発現するアデノ随伴ウィルスベクターを経口 投与したマウスからの血清中の TGF— 1濃度を示す。
発明の具体的説明
[0014] 本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは、 j3アミロイドペプチド (A j3ペプチド） の液性免疫惹起部位を含むペプチド断片をコードする DNAを、機能しうる形で含ん でなり、これにより該ペプチド断片を発現することができる。ここで「機能しうる形で含 んでなる」とは、適切な調節エレメント（例えば、プロモーター、ェンハンサー、転写タ 一ミネ一ターなど）の制御下に、導入遺伝子（DNA)の発現を可能にする様式で、そ のベクター中に該導入遺伝子が挿入されてレ、ることを意味する。
[0015] A βペプチドの液性免疫惹起部位は、当業者であれば容易に特定することができ る。例えば、前記液性免疫惹起部位は Α ペプチドの第 4一 10アミノ酸 (A iS 4-10) の領域中に存在する。よって、本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターによって発 現される前記抗原ペプチド断片は、 A 4一 10を含んでなることが好ましい。
[0016] また、 A 4-10のアミノ酸配列としては、配列番号 2で表されるアミノ酸配列中の第 4一 10アミノ酸が挙げられる。従って、前記抗原ペプチド断片は、配列番号 2で表さ れるアミノ酸配列中の第 4一 10アミノ酸を含んでなることが好ましい。このアミノ酸配列 をコードする DNAのヌクレオチド配列は特に制限されるものではなレ、が、例えば、配 列番号 1で表されるヌクレオチド配列中の第 10 30ヌクレオチドが挙げられる。従つ て、前記抗原ペプチド断片をコードする DNAは、配列番号 1で表されるヌクレオチド 配列中の第 10 30ヌクレオチドを含んでなることが好ましい。
[0017] 本発明の好ましい実施態様によれば、前記抗原ペプチド断片は、 A /3ペプチドの 第 1一 43アミノ酸 (A /3 1—43)を含んでなるものとされる。 Α β 1—43のアミノ酸配歹 [Jと しては、配列番号 2で表されるアミノ酸配列が挙げられ、従って、前記抗原ペプチド 断片は、配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含んでなることが好ましい。このアミノ酸 配列をコードする DNAのヌクレオチド配列は特に制限されるものではなレ、が、例え ば、配列番号 1で表されるヌクレオチド配列が挙げられ、従って、前記抗原ペプチド 断片をコードする DNAは、配列番号 1で表されるヌクレオチド配列を含んでなること が好ましい。
[0018] 本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記抗原ペプチド断片は、 A ぺプチ ドの第 1一 21アミノ酸 (A ;3 1—21)を含んでなるものとされる。 A 1_21のアミノ酸酉己 歹 IJとしては、配列番号 4で表されるアミノ酸配列が挙げられ、従って、前記抗原ぺプ チド断片は、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含んでなることが好ましい。このアミ ノ酸配列をコードする DNAのヌクレオチド配列は特に制限されるものではなレ、が、例 えば、配列番号 3で表されるヌクレオチド配列が挙げられ、従って、前記抗原べプチ ド断片をコードする DNAは、配列番号 3で表されるヌクレオチド配列を含んでなること が好ましい。
[0019] 前記 A β 1一 43および Α β 1—21のアミノ酸配列には、液性免疫惹起部位のみなら ず、 Τ細胞受容体認識配歹 IJも含まれるが、本発明によるアデノ随伴ウィルスベクター によって腸管粘膜免疫系にこれら抗原ペプチド断片を発現させた場合、主に抗体産 生を誘導し、細胞性免疫はほとんど惹起しない。
[0020] 本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターによって発現された前記抗原ペプチド断 片を抗原として効率よく提示するためには、感染細胞内での発現の後に、該抗原べ プチド断片が細胞外に分泌されることが好ましい。従って、本発明によるアデノ随伴 ウィルスベクターは、好ましくは、発現された前記抗原ペプチド断片を細胞外に分泌 させることができるシグナルペプチドをコードする DNAを、機能しうる形で含んでなる ものとされる。ここで「機能しうる形で含んでなる」とは、前記シグナルペプチドが前記 抗原ペプチド断片とともに発現され、かつ、発現された前記抗原ペプチド断片が前記 シグナルペプチドによって細胞外に分泌されることを意味する。前記シグナルぺプチ ドをコードする DNAを機能しうる形で本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターに組 み込む方法としては、当業者に公知のものを用いることができる力 例えば、前記抗 原ペプチド断片の Ν末端に結合した形で前記シグナルペプチドが発現するように、 それぞれの DNAを融合させた融合遺伝子を用いることができる。
[0021] 前記シグナルペプチドとしては、当業者に公知のものを用いることができる力 好ま しくはアミロイド前駆体タンパク質 (ΑΡΡ)の Ν末端に存在するシグナルペプチドが用 レ、られる。 ΑΡΡシグナルペプチドのアミノ酸配列としては配列番号 6で表されるァミノ 酸配列が挙げられ、よって、本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターにより発現され る前記シグナルペプチドは、配列番号 6で表されるアミノ酸配列を含んでなるもので あることが好ましレ、。このアミノ酸配列をコードする DNAのヌクレオチド配列は特に制 限されるものではなレ、が、例えば、配列番号 5で表されるヌクレオチド配列が挙げられ 、従って、前記シグナルペプチドをコードする DNAは、配列番号 5で表されるヌクレ ォチド配列を含んでなることが好ましレ、。
[0022] 本発明の好ましい実施態様によれば、本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは 、 APPシグナルペプチドが A j3 1—43の N末端に連結した融合タンパク質をコードす る DNAを含んでなるものとされる。この融合タンパク質のアミノ酸配列としては、配列 番号 8で表されるアミノ酸配列が挙げられ、これをコードする DNAのヌクレオチド配列 としては、配列番号 7で表されるヌクレオチド配列中の第 9一 191ヌクレオチドが挙げ られる。
[0023] 本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明によるアデノ随伴ウィルスベクタ 一は、 APPシグナルペプチドが A /3 1—21の N末端に連結した融合タンパク質をコー ドする DNAを含んでなるものとされる。この融合タンパク質のアミノ酸配列としては、 配列番号 10で表されるアミノ酸配列が挙げられ、これをコードする DNAのヌクレオチ ド配歹 IJとしては、配列番号 9で表されるヌクレオチド配列中の第 17— 133ヌクレオチド が挙げられる。
[0024] さらに、本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは、 目的の DNAを効率よく発現さ せるための調節エレメント、例えば、プロモーター、ェンハンサー、転写ターミネータ 一などを含んでいてもよぐ必要に応じて、翻訳開始コドン、翻訳終止コドンなどを揷 入してもよい。
[0025] 本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは、当技術分野で周知となっている標準 的方法により調製することができる。例えば、米国特許第 5, 858， 351号およびそこ に引用される参考文献には、遺伝子治療における使用に適切な種々の組換えアデ ノ随伴ウィルス、ならびにそれらのベクターの作製方法および増殖方法が記載されて いる（例えば、 Kotin(1994)Human Gene Therapy 5:793 801、または Bems「
Parvovindae and their ReplicationJ Fundamental Virology Λ 2片 j¾、 ields&Kmpe編 など)。
[0026] アデノ随伴ウィルスベクターを作製するための好ましい方法によれば、まず、野生型 アデノ随伴ウィルスの両端の ITRを残し、その間に目的の遺伝子を挿入することによ りプラスミドを作製する (AAVベクタープラスミド)。一方、 Rep遺伝子 (複製蛋白をコ ードする遺伝子）および Cap遺伝子（ウィルスの頭殻蛋白をコードする遺伝子）を発 現するプラスミド、ならびにアデノウイルス遺伝子である E2A、 E4、および VAの各遺 伝子を発現するプラスミドを用意する。次いで、これら 3種のプラスミドを、 E1遺伝子 を発現するパッケージング細胞、例えば HEK293細胞に同時トランスフエクシヨンし、 この細胞を培養する。これにより、哺乳動物細胞対して高い感染能力を持つアデノ随 伴ウィルスベクター粒子を産生することができる。このような方法は、 AAV— Helper^ Free System (Stratagene)などの市販のキットを用いて容易に行なうことができる。
[0027] 本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは、哺乳動物のアルツハイマー病の治療 に用いることができる。従って、本発明によれば、治療上有効量の本発明によるアデ ノ随伴ウィルスベクターを被験者に投与することを含んでなる、アルツハイマー病の 治療方法、ならびにアルツハイマー病の治療剤の製造における、本発明によるアデ ノ随伴ウィルスベクターの使用が提供される。ここで、「治療」には、確立された病態を 治療することだけでなぐ将来確立される可能性のある病態を予防することをも含む。 前記被験者は哺乳動物、例えば、げっ歯類、ィヌ、ネコ、ゥシ、霊長類などとされ、好 ましくはヒトとされる。
[0028] 本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターの投与方法は、遺伝子治療の分野にお いて使用可能な方法、例えば、腹腔内注入、気管内注入、気管支内注入および直 接的な気管支内滴注、皮下注入、経皮輸送、動脈内注入、静脈内注入等 (Flotteお よび Carter,Gene Therapy 2:357-362(1995)参照）とされる。さらに、アデノ随伴ウイノレ スは、胃液によって分解されにくいため、経口投与できるという利点を有する。また、 経口投与は、被験者が自ら投与することができるという点で、特に好ましい。
[0029] 投与されるアデノ随伴ウィルスベクターの量は治療上有効量であればよぐこのよう な量は遺伝子治療分野の当業者であれば容易に決定することができる。また、投与 量は、被験者の病態の重篤度、性別、年齢、体重、習慣等によって調整することが好 ましいが、このような投与量の調整は、医師または獣医によって適宜行なわれる。例 えば、経口投与されるアデノ随伴ウィルスベクターの量は、通常 0. 5 X 10" 2. 0 X 10 viral genome/体重 kgであり、好ましくは 1. O X 10 — 1. O X 10 viral genome /体重 kg、より好ましくは 1 · O X 1011— 5. 0 X 10 viral genome/体重 kgとされる。 本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは上記の投与量の範囲内において、医薬 上安全である。ここで、 「viral genome」とレ、う単位は、アデノ随伴ウィルスのゲノムの分 子数（ウィルス粒子数）を表すものであり、アデノ随伴ウィルスベクターの量を示すも のとして当業者には周知である。その数値は、精製したアデノ随伴ウィルス溶液を希 釈してドットブロットハイブリダィゼーシヨンを行なレ、、そのシグナル強度を所定の分子 数のプラスミド DNAと比較することにより決定することができる。
[0030] 本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは、一旦被験者に投与すると、比較的長 期間にわたってアルツハイマー病の治療作用が持続する。特に、上記の量で経口投 与した場合には、腸管上皮細胞において抗原が少なくとも 6ヶ月以上提示され、これ に対する抗体産生が誘導されることが確認されている。この点に鑑み、当業者であれ ば適切な投薬計画を作成することができる。
[0031] 本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは、これを含む医薬組成物として被験者 に投与することができる。従って、本発明によれば、本発明によるアデノ随伴ウィルス ベクターを含んでなる、アルツハイマー病を治療するための医薬組成物が提供され る。本発明の好ましい実施形態によれば、この医薬組成物は経口投与のためのもの とされる。
[0032] 本発明による医薬組成物は、その投与経路および剤型に応じて、当技術分野にお いて公知の方法により調製することができる。例えば、経口投与のための医薬組成物 としては、カプセル剤、溶液剤等の剤型が使用可能である。従って、本発明による医 薬組成物は、それぞれの剤型に応じて、医薬上許容される担体、希釈剤、保存剤等 を含むことができる。
実施例
以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に 限定されるものではなレ、。なお、以下の試験例で用いるマウスは、アルツハイマー病
Figure imgf000010_0001
Taconic社、 Mayo Clinic) である。 [0034] 実施例 1
APPシグナル配列 + Α β 1-43 cDNAを発現するアデノ随伴ウィルスベクターの 鐘
アミロイド— /3 1-43(A J3 1-43) cDNAは、ヒトアミロイド前駆タンパク質（APP)遺 伝子を錡型として以下のプライマーを用いる PCRにて増幅した。 PCR反応液の組成 は、 TAPS緩衝液（25mM、 pH9. 3)、 KCl (50mM)、 MgCI (2mM)、 2—メルカプ
2
トエタノール（lmM)、 dNTPs (100 x M)、錡型 DNA (50— 100ng)、およびプライ マー（各 0. 2 μ Μ)とした。サイクル反応の温度条件は、 94°Cで 30秒間、 68°Cで 1分 間、および 72°Cで 3分間を 1サイクルとし、これを 30サイクルとした。
[0035] プライマー
フォワード： 5，-GATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGA-3，（配列番号 11)；およ び
リバース： 5'-〇丁じ丁下八八01^：〇じ丁八丁0八じ^じ八じじ0じじじ-3' (配列番号12 : 3，に Aflll部位を有する）。
[0036] APPの分泌シグナルである N末の最初のシグナル配歹 lj(配列番号 10)のアダプター は、以下の 2つのオリゴヌクレオチドを 90°Cで 3分間処理後、室温でアニーリングさせ ることにより作製した。
[0037] オリゴヌクレオチド
センス
CGGCTCGGGCGCTT-3' (配列番号 13)；
アンチセンス
AGCATTCTAGACC-3' (配列番号 14)。
[0038] APPの分泌シグナルアダプター (センス鎖の 3 '側に突出した T残基を持つ)と PCR で増幅した A j3 1-43 cDNA (アンチセンス鎖の 3 '側に突出した A残基を持つ)を結 合し、 これを錡型として以下のプライマーを用いて PCRを行レ、、 APPシグナル配列 を Α β l_43cDNAの 5 '側に結合させた融合遺伝子： APPシグナル配列 +A j3 1-4 3cDNA (配列番号 7：この配列中の第 3— 8ヌクレオチドは Xbal認識部位である）を 作製した。 PCR反応液の組成は、 TAPS緩衝液（25mM、 pH9. 3)、 KCl (50mM) 、 MgCl (2mM)、 2—メルカプトエタノール（lmM)、 dNTPs (100 μ M)、铸型 DN
2
A (50— lOOng)、およびプライマー（各 0. 2 μ M)とした。サイクル反応の温度条件 は、 94°Cで 30秒間、 68°Cで 1分間、および 72°Cで 3分間を 1サイクルとし、これを 30 サイクルとした。
[0039] プライマー
フォワード：5，_GGTCTAGAATGCTGCCCGGTTTGGCAC-3，（配列番号 15 : 5，側に Xbal部位を有する）；
リバース：5，_GTCTTAAGTCGCTATGACAACACCGCCC- 3，（配列番号 12 : 5，側に Aflll部位を有する）。
[0040] 効率よくアデノ随伴ウィルスの DNAパッケージングを得るには、適度な長さ (4一 4.
5kbp)の DNAが必要であるので、 APPシグナル配列 +A l_43cDNA (Xbal— A fill/blunt)に、非機能的な" stuffer" DNAとして pBR322プラスミド DNAの PvuII— Sail断片を結合させ、標準的なアデノ随伴ウィルスベクター (pXXUFl)の Xbal— Sal I部位に組み込んだ。
[0041] さらに、上記の組換え pXXUFl、 ならびに標準的な Rep/Capプラスミド、および E2A/E4/VAプラスミドの 3種類のベクターを HEK293細胞にリン酸カルシウム法 にて遺伝子導入し、 HEK293細胞を大量培養後、細胞溶解物からウィルス粒子を C sClの超遠心により精製して、 APPシグナル配列 +A j3 1— 43cDNAを有するアデノ 随伴ウィルスベクターを得た。
[0042] 実施例 2
APPシグナル配列 +A β 1—2 lcDNAを発現するアデノ随伴ウィルスベクターの構
APPシグナル配列 + A /3 l-43cDNA(XbaI-AflIl/blunt)を pBluescriptプラ スミド (Xbaト Smal)に組み込んだ。これを铸型として、以下のプライマーを用いて P CRを行った。
[0043] プライ _マー フォワード： 5'- TGGCGGCCGCTCTAGAATG- 3' (配列番号 16 : 5'側にNotI部位を 有する）；
リバース： 5'- CACATCTTAAGCAAAGAACACC- 3' (配列番号 17)。
[0044] APPシグナル配列 +A /3 l_21cDNA (配列番号 9：この配列中の第 3 10ヌクレ ォチドは Notl認識部位であり、第 11一 16ヌクレオチドは Xbal認識部位である）の P
CR産物を、 Notl—Aflll/blunt処理し、上記の" stuffer" pBR322 PvuII—Sall断 片とともに pXXUF 1 (Notl-S all)に組み込んだ。
[0045] さらに、実施例 1と同様にして、 APPシグナル配列 + A j3 l_21cDNAを有するァ デノ随伴ウィルスベクターを得た。
[0046] 比較例 1
コントロールとして、 GFPグリーン蛍光タンパク質)を発現するアデノ随伴ウィルス ( GFPrAAV)を作製した。
[0047] 試験例 1
ウェスタンブロット角军析
APPシグナル配列 +A i3 l_43cDNAを発現ベクター pXXUFlに組み込み、 lipo fectamine 2000(In vitrogen)を用いて HEK293細胞へ導入した 48時間後に培 養上清と細胞溶解物を抽出し、それぞれ抗 A j3抗体 (4G8)で免疫沈降後、
SDS-PAGEゲルに電気泳動した。そして、ニトロセルロース膜に蛋白を転写した後、 抗 A β抗体によって Α 蛋白の検出を試みた。その結果、 A βはオリゴマーを形成し ながら細胞外に分泌されること、および細胞内では多量の 4kDaの Α ペプチドモノ マー蛋白が生成してレ、ることが確認された。
[0048] 試験例 2
マウス血清の樑放
15週齢のマウスに、実施例 1のアデノ随伴ウィルスベクター 5 X lO^viral genomeを 1回のみ経口投与した。このマウスの血清を 1ヶ月後、 4ヶ月後、および 6ヶ月後にそ れぞれ採取した。
[0049] マウス血清中の杭 A β杭体の検出
Α β 1—42ペプチド (5mgZmL)を 96ゥエルプレート（Nunc, MaxiSonjp製)の各ゥェ ノレに付着させ、 5% non-fat milk/TBS-T bufferでブロックした後、上記の採取したマ ウス血清を加え（500倍希釈）、ペルォキシダーゼ標識抗マウス IgG抗体で検出した 。抗体価の評価は、 ELISAリーダーでの吸光度測定により行った。その結果を図 1 に示す。
[0050] 血清中の抗体価は、主として経口投与後 1ヶ月でピークを示し、 6ヶ月後まで抗体の 持続的産生を認めた。
[0051] 試験例 3
マウス .清による A 隼 の阳 訧験
Α β 1_40ペプチドを 120mMの濃度に調整し、 37°Cでインキュベーションした。 2 4時間後に A j3の凝集が開始するのが見られた。この A /3の凝集物にマウスの血清 を 1： 10および 1： 20(vol: vol)の濃度で加え、 37°Cで 1週間インキュベーションした。 Α β 1—40の結合.凝集をマウスの血清が阻害するかどうか、 2mMチオフラビン一 Τを 加え、分光蛍光計 (445nmでの励起； 490nmでの発光)を用いて測定した。その結 果を図 2に示す。
[0052] 試験例 1で示したアデノ随伴ウィルスベクター投与後 6ヶ月のマウス血清は、コント口 ールのマウス血清と比べ、有意に in vitroで A 1_40の凝集'結合を阻害した。
[0053] 試験例 4
組織からの DNA柚出及び PCR
実施例 1のアデノ随伴ウィルスを経口投与した後、 28週間のマウスより、心、肺、脾 臓、肝臓、上部消化管および腎臓を摘出し、 Tris溶液中で組織をホモジネートした後 、プロティナーゼ Kで蛋白を分解し、フエノール/クロ口ホルム処理し、 DNAを精製し た。次に、アデノ随伴ウィルスベクター (pXXUFl)のプロモーター領域の 5 '側塩基配 歹 IJとベクターの 3'側塩基配列から以下のプライマーを作製し、 PCRを行った。 PCR 反応液の組成は、 TAPS緩衝液（25mM、 pH9. 3)、 KCl (50mM)、 MgCl (2mM
2
)、 2_メルカプトエタノール（lmM)、 dNTPs dOO z M)、铸型 DNA(50 lOOng) 、およびプライマー（各 0. 2 μ Μ)とした。サイクル反応の温度条件は、 94°Cで 1分間 、 68°Cで 20秒間、および 72°Cで 1分間を 1サイクルとし、これを 30サイクルとした。 P CR産物を 2。/0ァガロースゲルにて電気泳動し、ェチジゥムブ口ミドで染色した。 [0054] プライマー
フォワード： 5'- AGTGAACCGTCAGATCGC- 3' (配列番号 18)；
リバース： 5'-CGGTATCAGCTCACTCAA-3' (配列番号 19)。
[0055] 目的とする PCR産物を示す 500bpのバンドは、上部消化管組織のみに認められた
[0056] 試験例 5
マウス 細胞の A R 1一 42ペプチド'に対する細胞増殖 )^
実施例 1のアデノ随伴ウィルスを経口投与した後 28週間のマウスより脾細胞を分離 し、 96ゥヱルプレートの 1ゥヱルあたり 5 X 104細胞を加え、 A /3 1—42ペプチドを各濃 度で加えた培養液中で 48時間培養した。細胞培養終了後、テトラゾリゥム塩 (WST— 1)をカ卩えた。テトラゾリゥム塩は、生細胞にのみ活性のあるミトコンドリアのコハク酸テ トラゾリゥム還元酵素によりホルマザン色素に変換されるので、 ELISAリーダーで色 素溶液の吸光度を測定することにより、細胞増殖能反応を判定した。その結果を図 3 に示す。
[0057] 実施例 1のアデノ随伴ウィルスを経口投与したマウスの脾細胞は、 A 1一 42ぺプ チドの濃度に関係なぐ細胞増殖反応は低応答であった。
[0058] 試験例 6
雄 麵 1
実施例 1のアデノ随伴ウィルスを経口投与したマウス（以下「治療群」という）、または 未処置の同齢マウス（以下「コントロール群」という）から、投与後 6ヶ月（10ヶ月齢)経 過時に組織を得て、その組織の凍結切片を用いて以下の実験を行った。組織中の A /3蛋白や老人斑を検出するために、 70%ギ酸で処理し、 5% H Oで内因性のペル
2 2
ォキシダーゼ活性を失活させた。抗 A β抗体 (4G8： 1000倍希釈）またはラビット抗 A /3 40抗体 (1000倍希釈)と反応させた後、ペルォキシダーゼ標識 2次抗体を加え、 D AB染色を行った。
[0059] コントロール群では、加齢と共にアミロイド沈着が進み、 6ヶ月齢では脳に軽度の沈 着をが認められ、 10ヶ月齢になるとアミロイド沈着は著明になり、老人斑の形成も認 められ、神経細胞内のアミロイド沈着も散見された。 [0060] 一方、治療群では、投与後 6ヶ月（10ヶ月齢）に解剖したところ、上部消化管上皮細 胞に A 蛋白の発現が認められた。また、投与後 6ヶ月の脳を解析すると、コントロー ル群に比べ明らかにアミロイド沈着が減少し、老人斑も激減していた。投与後 6ヶ月 の脳の矢状断面におけるアミロイド斑の数を計測した結果を表 1に示す。
[0061] [表 1] 表 1 ：マウスのコント口ール群と治療群の脳のァミロイド沈着の比較
Figure imgf000016_0001
マウス ： 1 0ヶ月齢
[0062] コントロール群では、アミロイド斑数は平均 76個であるのに対し、投与群では 8個と 約 90%減少していた。コントロール群に散見された神経細胞内のアミロイド沈着は、 治療群では殆ど認められなかった。
[0063] 試験例 7
組織' 色試験 2
試験例 6と同様に、治療群およびコントロール群から、投与後 6ヶ月（10ヶ月齢)経 過時に組織を得て、その組織の凍結切片を用いて以下の実験を行った。抗 CD4抗 体、抗 CD86抗体、抗 CDl lb抗体、抗 GFAP抗体 (ァストロサイト)、抗 Iba - 1抗体（ミ クログリア）などの抗体を用いて凍結切片を ABC法にて染色して、中枢神経系にお けるリンパ球の浸潤の有無を確認した。その結果を表 2に示す。
[0064] [表 2] 表 2 ： 免疫組織染色
Figure imgf000017_0001
[0065] 脳組織を T細胞マーカーである CD4および T細胞活性化分子である CD86でそれ ぞれ染色したところ、コントロール群および治療群とも陰性であった。末梢のマクロフ ァージマーカーである CD1 lbについても陰性であった。ァストロサイトマーカーであ る GFAPについては、両群で差が認められた。治療群の前頭葉および側頭葉にお いて、活性化したミクログリア (Iba-1陽性)の増加が認められた。
[0066] 試験例 8
組織染色試験 3
実施例 2のアデノ随伴ウィルスを経口投与したマウス（以下「治療群 2」とレ、う）または コントロール群から、投与後 6ヶ月（10ヶ月齢)経過時に組織を得て、その組織の凍 結切片を用いて試験例 6と同様に DAB染色を行った。
[0067] 治療群 2において、投与後 6ヶ月（10ヶ月齢）の脳を解析すると、コントロール群に 比べ明らかにアミロイド沈着が減少し、老人斑も激減してレ、た。
[0068] 試験例 9
の比 1
4匹のマウスからなる 3群を用意し、それぞれ、 15週齢時（以下「A群」という）、 30週 齢時（以下「B群」とレ、う）、または 45週齢時（以下「C群」とレ、う）に実施例 1のアデノ随 伴ウィルス（5· 0 X 10nviral genome/匹）を 1回経口投与した。また、 6匹のマウスか らなるコントロール群を用意し、 15週齢時に PBS (0. lmL/匹）を経口投与した。そ の後、 12— 13ヶ月齢（52— 56週齢）の時点で各群を解剖し、前頭葉皮質 ·頭頂葉' 海馬の領域において、それぞれ脳組織切片を得た。そして、これらの組織切片を試 験例 6と同様に染色し、顕微鏡に連結させた 3CCDカメラ用いて観測し、各領域にお ける A 蓄積部分の面積を測定した。そして、各測定部位に占める A 蓄積部分の 面積率を計算した。その結果を図 4に示す。
[0069] コントロール群では、上記 A β蓄積部分の 3つの脳測定領域における平均面積率 fま 2. 64 ± 1. 460/0であった。一方、 15週齢日寺投与の A群で fま 0. 55 ± 0. 50ο/οであ り、 30週齢時投与の Β群では 0. 48 ± 0. 35%であり、 45週齢時投与の C群では 0. 46 ± 0. 27%であり、いずれもコントロール群と比較して、有意に低い値を示した（一 元配置分散分析法 (one- way variance analysis, ANOVA)およびスチューデント t検定 , pく 0. 001)。
[0070] 試験例 10
A fl 禾眚 禾蕾率の比 2
4匹のマウスからなる 3群を用意し、それぞれ、 15週齢時 (以下「D群」という）、 30週 齢時 (以下「E群」とレ、う）、または 45週齢時（以下「F群」とレ、う）に実施例 2のアデノ随 伴ウィルス（5· 0 X 10nviral genome/匹）を 1回経口投与した。その後、各群を試験 例 9と同様に処理し、各測定部位に占める A 蓄積部分の面積率を計算した。その 結果を図 5に示す。
[0071] 上記 A 蓄積部分の面積率は、 15週齢時投与の D群では 0. 39 ± 0. 27%であり 、 30週齢時投与の E群では 0. 45 ± 0. 30%であり、 45週齢時投与の F群では 0. 3 7 ± 0. 20%であり、いずれも試験例 9に示したコントロール群と比較して、有意に低 い値を示した（一元配置分散分析法 (one-way variance analysis, ANOVA)およびスチ ユーデント t検定， p < 0. 001)。
[0072] 試験例 11
TGF— 1の沏 I定
試験例 9および 10において、解剖時に各群のマウスから採血し、それらの血清を得 た。そして、マウス血清中の TGF— /3 1濃度を、 Quantikine Mouse/Rat/Porcine TGF- β 1 Immunoassay (R & D systems社製）を用いて、 ELISA法により測定した。 その結果を図 6に示す。
[0073] マウス血清中の TGF_ j3 1濃度は、コントロール群では 111. 6 ±40. 0pg/mLで あった。一方、試験例 9における A群では 80. 5±12. 9pg/mLであり、 B群では 76 .0±6· 3pg/mLであり、 C群では 74· 3±21. Opg/mLであり、いずれの群もコン トロール群と比較して有意に低レ、値を示した（一元配置分散分析法 (one-way variance analysis, ANOVA)およびスチューデント t検定， p<0.001)。
さらに、試験例 10における C群では 99.4±21. 2pg/mLであり、 D群では 80. 2 ±17. 2pg/mLであり、 E群では 72. 9±15.8pgZmLであり、レ、ずれの群もコント ロール群と比較して有意に低レ、値を示した（一元配置分散分析法 (one-way variance analysis, ANOVA)およびスチューデント t検定， p<0.001)。

Claims

請求の範囲
[I] βアミロイドペプチドの液性免疫惹起部位を含むペプチド断片を発現しうるアデノ 随伴ウィルスベクターであって、該ペプチド断片をコードする DNAを機能しうる形で 含んでなる、アデノ随伴ウィルスベクター。
[2] 前記ペプチド断片が、 j3アミロイドペプチドの第 4一 10アミノ酸を含んでなるもので ある、請求項 1に記載のアデノ随伴ウィルスベクター。
[3] 前記ペプチド断片が、配列番号 2で表されるアミノ酸配列中の第 4一 10アミノ酸を 含んでなるものである、請求項 1に記載のアデノ随伴ウィルスベクター。
[4] 前記ペプチド断片をコードする DNA力 配列番号 1で表されるヌクレオチド配列中 の第 10— 30ヌクレオチドを含んでなるものである、請求項 1に記載のアデノ随伴ウイ ノレスベクター。
[5] 前記ペプチド断片が、 アミロイドペプチドの第 1一 43アミノ酸を含んでなるもので ある、請求項 1に記載のアデノ随伴ウィルスベクター。
[6] 前記ペプチド断片が、配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含んでなるものである、 請求項 1に記載のアデノ随伴ウィルスベクター。
[7] 前記ペプチド断片をコードする DNA力 S、配列番号 1で表されるヌクレオチド配列を 含んでなるものである、請求項 1に記載のアデノ随伴ウィルスベクター。
[8] 前記ペプチド断片が、 j3アミロイドペプチドの第 1一 21アミノ酸を含んでなるもので ある、請求項 1に記載のアデノ随伴ウィルスベクター。
[9] 前記ペプチド断片が、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含んでなるものである、 請求項 1に記載のアデノ随伴ウィルスベクター。
[10] 前記ペプチド断片をコードする DNA力 S、配列番号 3で表されるヌクレオチド配列を 含んでなるものである、請求項 1に記載のアデノ随伴ウィルスベクター。
[II] 前記ペプチド断片を細胞外に分泌させることができるシグナルペプチドをコードす る DNAを、機能しうる形でさらに含んでなる、請求項 1に記載のアデノ随伴ウィルス ベクター。
[12] 前記シグナルペプチドが、アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドである、 請求項 11に記載のアデノ随伴ウィルスベクター。
[13] 前記シグナルペプチドが、配列番号 6で表されるアミノ酸配列を含んでなるものであ る、請求項 11に記載のアデノ随伴ウィルスベクター。
[14] 前記シグナルペプチドをコードする DNA力 配列番号 5で表されるヌクレオチド配 列を含んでなるものである、請求項 11に記載のアデノ随伴ウィルスベクター。
[15] 請求項 1一 14のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウィルスベクターを含んでなる、 アルツハイマー病を治療するための医薬組成物。
[16] 経口投与のための、請求項 15に記載の医薬組成物。
[17] 治療上有効量の請求項 1一 14のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウィルスベクタ 一を被験者に投与することを含んでなる、アルツハイマー病の治療方法。
[18] アルツハイマー病の治療剤の製造における、請求項 1一 14のいずれか一項に記載 のアデノ随伴ウィルスベクターの使用。
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