CN121311586A - 耳蜗內毛细胞特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

提供涉及导致基因在耳蜗內毛细胞中特异性地表达的核酸序列、及其在基因治疗中的应用，尤其是在治疗与耳蜗內毛细胞缺陷相关的遗传性听力损失中的应用。

Description

耳蜗内毛细胞特异性启动子及其应用 技术领域

本发明涉及导致基因在耳蜗内毛细胞中特异性地表达的核酸序列、及其在基因治疗中的应用，尤其是在治疗与耳蜗内毛细胞缺陷相关的遗传性听力损失中的应用。

背景技术

听力损失是一个主要的公共卫生问题，据估计，近15％的学龄儿童和65岁时每三人中就有一人受其影响。最常见的听力损失类型是感音神经性听力损失，这是一种由内耳细胞(如耳蜗毛细胞)缺陷或从内耳到大脑的神经通路缺陷引起的听力损失。除后天原因(包括听觉创伤、疾病或感染、头部创伤、耳毒性药物和衰老)外，感音神经性听力损失也有遗传原因，如与内耳发育和功能有关的基因突变。目前，超过90个这样的基因突变已经被确认，包括常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传和x连锁模式的突变。

耳蜗毛细胞是听觉系统的感觉细胞，由两种主要细胞类型组成:负责感知声音的内毛细胞和被认为能放大低分贝声音的外毛细胞。近年来，治疗听力损失的努力越来越集中在基因治疗上。然而，针对与听损通常相关的内毛细胞的特异性治疗方法仍然很少。因此，有必要寻找新的针对内毛细胞的治疗手段，来治疗遗传性感音神经性听力丧失。

发明概述

为满足上述需求，本发明人致力于寻找适用于在哺乳动物耳蜗内毛细胞中以高表达水平和细胞类型特异性方式表达转基因的新启动子序列，并由此提供了含有这样的启动子序列的多核苷酸、以及含有该多核苷酸的基因治疗载体。使用本发明的多核苷酸和载体，可促进转基因在内毛细胞中的特异性表达，从而为临床靶向治疗遗传性听力损失提供了有利工具。

本发明的内毛细胞特异性启动子可以在基因治疗过程中，特异性地将目的基因递送到耳蜗内毛细胞中，降低脱靶风险的同时提高效率，减少基因治疗药物的使用剂量，极大地增加了安全性和可靠性。

因此，在第一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其中所述核酸包含或由以下序列组成：

(a)SEQ ID NO.2的长度不超过1980bp的截短序列，其中所述截短序列包含选自以下的多核苷酸：

(i)SEQ ID NO:2的大约851bp位置至大约1834bp位置的多核苷酸，

(ii)SEQ ID NO:2的大约851bp位置至大约1976bp位置的多核苷酸，

(iii)SEQ ID NO:2的大约651bp位置至大约1834bp位置的多核苷酸，或

(iv)SEQ ID NO:2的大约651bp位置至大约1976bp位置的多核苷酸，

优选地，其中，所述截短序列的长度不超过1850bp、1800bp、1750bp、1700bp、1650bp、1600bp、1550bp、1500bp、1450bp、1400bp、1350bp或1300bp，更优选地，所述截短序列的长度为900bp至1400bp；

(b)SEQ ID NO.2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多核苷酸，

(c)SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的多核苷酸，或

(d)与(a)至(c)任一项的多核苷酸具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％)同一性的多核苷酸，

其中，在将编码转基因的核酸序列可操作连接至所述分离的核酸时，所述分离的核酸驱动所述转基因在耳蜗内毛细胞中表达，即发挥启动子的功能。

在一些实施方案中，所述截短序列的5’相应于选自SEQ ID NO:2的核苷酸位置620bp至680bp、或核苷酸位置640bp至660bp的位置，更优选相应于SEQ ID NO:2的核苷酸位置651bp。在一些实施方案中，所述截短序列的3’相应于选自SEQ ID NO:2的核苷酸位置1980bp至1830bp的位置，更优选相应于SEQ ID NO:2的核苷酸位置1976bp。

在一些实施方案中，所述截短序列包含SEQ ID NO:2的大约651bp位置至大约1834bp位置的多核苷酸，且长度不超过1400bp或1350bp。

在一些实施方案中，所述截短序列包含SEQ ID NO:2的大约651bp位置至大约1976bp位置的多核苷酸，且长度不超过1400bp或1350bp。

在一些实施方案中，所述分离的核酸包含或由SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.4,SEQ ID NO.5,和SEQ ID NO.6的核酸序列，或与其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％)同一性的核酸序列组成。在一些实施方案中，所述分离的核酸包含或由SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.8,SEQ ID NO.9的核酸序列，或与其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％)同一性的核酸序列组成。

在一些优选的实施方案中，所述分离的核酸由SEQ ID NO.4的核酸序列组成，或基本上由其组成。在另一些优选的实施方案中，所述分离的核酸由SEQ ID NO.7的核酸序列组成，或基本上由其组成。在本文中，就核酸而言，“基本上由述及的核酸序列组成”是指，由所述核酸序列以及位于其5’和/或3’末端的不超过50bp或20bp的短核苷酸序列组成。

在一些实施方案中，所述分离的核酸包含或由所述SEQ ID NO:2的截短序列或SEQ ID NOs:7-9任一的序列及与其侧翼连接的异源序列组成。在本文中，应理解，该异源序列是指，在天然情况下不与SEQ ID NO:2的所述截短序列或SEQ ID NOs:7-9任一的序列连接的序列，即非所述截短序列的天然侧翼序列或非 所述SEQ ID NOs:7-9任一的序列的天然侧翼序列。在一些方面，根据所述分离核酸的应用目的，所述异源序列可以为进一步调节(例如促进)所述分离核酸的启动子强度和/或特异性的异源多核苷酸。

在一些实施方案中，采用诸如实施例所述的AAV病毒载体转染和免疫荧光染色方法，当将所述转基因与所述分离的核酸可操作连接时，相较于耳蜗其余区域(例如耳蜗外毛细胞)，所述转基因在耳蜗内毛细胞中特异性表达。在一些实施方案中，所述分离的核酸导致所述转基因在耳蜗內毛细胞中的表达水平，相对于其在耳蜗其他细胞(例如耳蜗外毛细胞)中的表达水平，高至少50％、75％、100％、150％、200％或更高。在下文中，本发明的该分离的核酸也称作本发明启动子多核苷酸。

在第二方面，本发明提供了表达盒，所述表达盒包含本发明启动子多核苷酸以及与其可操作连接的待在耳蜗内毛细胞中表达的转基因。

在第三方面，本发明提供了包含本发明启动子多核苷酸或本发明表达盒的载体。在一个实施方案中，所述载体是病毒载体，优选慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体(AAV)。优选地，所述载体是AAV载体，更优选地所述AAV载体包含选自以下血清型的衣壳：AAV1，AAV2,AAV2quad(Y-F),AAV3,AVV4,AVV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV-ie,Anc80L65,DJ/9,7m8和PHP.B，更优选地，所述AAV载体包含AAV-ie或Anc80L65血清型衣壳。

在第四方面，本发明提供了一种分离的细胞，其包含本发明的启动子多核苷酸、表达盒或载体。在一个实施方案中，所述细胞是耳蜗内毛细胞，例如，体外、离体或体内的细胞、细胞系或细胞群体。在一个实施方案中，所述表达盒或载体稳定整合在所述耳蜗内毛细胞中。在一个实施方案中，与本发明启动子多核苷酸可操作连接的转基因在所述耳蜗内毛细胞中特异性表达。

在第五方面，本发明提供了一种在耳蜗内毛细胞中表达转基因的方法，包括：将本发明的表达盒或载体引入耳蜗内毛细胞。所述的方法可以是体外方法、离体方法或体内方法。所述耳蜗内毛细胞可以是体外、离体或体内的细胞、细胞系或细胞群体。所述耳蜗内毛细胞可以是来自人、啮齿类动物、或非人灵长类动物的耳蜗内毛细胞。在一个实施方案中，所述载体是病毒载体，优选慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体(AAV)。在一个实施方案中，所述方法包括用本发明的表达盒或载体转染所述耳蜗内毛细胞。

在根据本发明的上述各方面的一些实施方案中，与本文描述的启动子多核苷酸可操作地连接的转基因是待在耳蜗內毛细胞中表达的转基因，例如编码治疗性蛋白或RNA的转基因。在一些实施方案中，所述转基因在耳蜗內毛细胞中表达时将有益于遗传性听力损失的治疗或预防。在一些实施方案中，所述转基因编码用于基因置换、基因阻抑(例如，反义RNA技术、RNA干扰)或基因编辑(例如，CRISPR/Cas编辑)听力损失相关基因的多核苷酸。在一些实施方案中，所述听力损失相关基因是耳聋基因(DFN)，例如，DFNA基因(常染色体遗传)、DFNB基因(隐性遗传)、DFNX基因(X染色体连锁遗传)、和DFNM基因(线粒体遗 传)。适用于本发明的耳聋基因的实例包括，但不限于：TMC1和TMC2，CABP2、OTOF、SLC17A8、TBC1D24、ACTG1、CDH23、CIB2、ESPN、MYO3A、MYO7A、MYO15A、PCDH15、PDZD7、RDX、TPRN、TRIOBP、USH1C、USH2A、WHRN、SIX1、POU4F3、EDN3、EDNRB、EPS8、GPSM2、MARVELD2、TJP2、CLDN14、WFS1、MYH9，Myo6、REST、TBC1D24、OSBPL2、HOMER2、MCM2、DMXL2、PDE1C、TMIE、TMPRSS3、GRXCR1、ILDR1、DCDC2、LOXHD1、ELMOD3、SERPINB6、TMEM132、GRXCR2、CLIC5等。在一个优选的实施方案中，所述转基因编码OTOF蛋白(Otoferlin)。

在第六方面，本发明也提供了用于治疗或预防遗传性听力损失的药物组合物和方法。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含至少一个本发明表达盒或载体以及可药用载体。在一些优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物包含AAV病毒载体。在一些实施方案中，根据本发明的方法包括向有需要的个体施用本发明的药物组合物，以在个体的耳蜗內毛细胞中特异性表达至少一个转基因。在一些实施方案中，所述个体患有听力损失或具有听力损失易感性。在一些实施方案中，所述个体是幼年个体。在另一些实施方案中，所述个体是成年个体。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物通过园窗注射施用。在一些实施方案中，所述遗传性听力损失是感音神经性遗传损失(SNHL)。在一些实施方案中，所述遗传性听力损失与听损基因(例如OTOF基因)突变导致的耳蜗內毛细胞缺陷相关。在一些实施方案中，通过本发明的方法或药物组合物，可以实现转基因在耳蜗内毛细胞中的特异性表达，从而弥补内毛细胞中相关蛋白的缺失，从而治疗或预防所述遗传性听力损失。在一些实施方案中，转基因可以通过基因置换、基因阻抑(例如，反义RNA技术、RNA干扰)和基因编辑(例如，CRISPR/Cas编辑)等方式，用于所述遗传性听力损失治疗。在一些实施方案中，所述转基因编码用于基因置换、基因阻抑或基因编辑听力损失相关基因的多核苷酸。在一些实施方案中，所述转基因在个体耳蜗內毛细胞中表达并产生治疗性蛋白质，优选地其中所述治疗性蛋白质包含由选自以下的耳聋基因编码的蛋白质的氨基酸序列：TMC1，TMC2，CABP2、OTOF、SLC17A8、TBC1D24、ACTG1、CDH23、CIB2、ESPN、MYO3A、MYO7A、MYO15A、PCDH15、PDZD7、RDX、TPRN、TRIOBP、USH1C、USH2A、WHRN、SIX1、POU4F3、EDN3、EDNRB、EPS8、GPSM2、MARVELD2、TJP2、CLDN14、WFS1、MYH9，Myo6、REST、TBC1D24、OSBPL2、HOMER2、MCM2、DMXL2、PDE1C、TMIE、TMPRSS3、GRXCR1、ILDR1、DCDC2、LOXHD1、ELMOD3、SERPINB6、TMEM132、GRXCR2、和CLIC5。在一个优选的实施方案中，所述遗传性听力损失由OTOF缺陷引起，且其中所述至少一个转基因编码OTOF蛋白。在一些实施方案中，通过ABR(听性脑干反应)测听，在施用本发明的药物组合物后，所述个体的听力改善、部分恢复或恢复。

在第七方面，本发明也提供了本发明的启动子多核苷酸、表达盒或载体在制备用于治疗或预防遗传性听力损失的药物中的用途。

附图说明

图1显示，作为包含本发明启动子的病毒载体的对照，在新生小鼠耳蜗中注射病毒AAV-ie-CAG-mNeonGreen并在第14天取耳蜗进行免疫荧光染色。绿色为AAV感染耳蜗后表达的mNeonGreen(为一种绿色荧光蛋白)，红色为Myosin7a(简称为Myo7a)标记的耳蜗毛细胞(内毛细胞和外毛细胞)。图1的左小图表示染色Myosin7a的结果；中间小图表示mNeonGreen的表达结果；右小图是染色Myosin7a和mNeonGreen的叠图，表示Myosin7a和mNeonGreen共表达的结果。如图所示，采用该对照病毒载体，mNeonGreen在内毛区域(IHC)，外毛区域(OHC)以及支持细胞中均表达，说明CAG不能驱动mNeoGreen在内毛细胞中特异性表达，是一种广谱启动子。

图2显示，作为包含本发明启动子的病毒载体的另一对照，在新生小鼠耳蜗中注射病毒AAV-ie-IHC-S-mNeonGreen并在第14天取耳蜗进行免疫荧光染色。绿色为AAV感染耳蜗后表达的mNeonGreen，紫色为Myosin7a标记的耳蜗毛细胞(内毛细胞和外毛细胞)。图2的左小图表示mNeonGreen的表达结果；中间小图表示染色Myosin7a的结果；右小图是染色Myosin7a和mNeonGreen的叠图，表示Myosin7a和mNeonGreen共表达的结果。如图所示，采用该对照病毒载体，mNeonGreen几乎没有在内毛细胞中表达，说明IHC-S不能驱动mNeoGreen在内毛细胞中特异性表达。

图3显示，在新生小鼠耳蜗中注射病毒AAV-ie-IHC-L-mNeonGreen后在第14天取耳蜗进行免疫荧光染色。绿色为AAV感染耳蜗后表达的mNeonGreen，紫色为Myosin7a标记的耳蜗毛细胞。图3A的上方小图表示mNeonGreen的表达结果；下方小图表示染色Myosin7a和mNeonGreen的叠图，表示Myosin7a和mNeonGreen共表达的结果。图3B是对图3A(整体)的局部放大，明显观察到mNeonGreen在顶转(APEX)、中转(MID)和底转(BASE)的内毛细胞中均特异性表达。图3C是对图3A的免疫荧光结果进行的量化统计，显示mNeonGreen对内毛细胞的转导率达到了100％，说明IHC-L可以驱动mNeoGreen在内毛细胞中特异性表达。

图4显示，在新生小鼠耳蜗中注射病毒AAV-ie-IHC-L-N860-mNeonGreen，AAV-ie-IHC-L-N660-mNeonGreen，AAV-ie-IHC-L-N460-mNeonGreen，AAV-ie-IHC-L-C140-mNeonGreen后，在第14天取耳蜗进行免疫荧光染色。绿色为AAV感染耳蜗后表达的mNeonGreen。结果显示，mNeonGreen在内毛细胞中均有特异性表达，说明这些截短的IHC-L都对内毛细胞具有特异性。

图5显示，在新生小鼠耳蜗中注射病毒AAV-ie-Mouse IHC promoter-mNeoGreen后，在第14天取耳蜗进行免疫荧光染色。绿色为AAV感染耳蜗后表达的mNeonGreen，红色为Myosin 7a标记的耳蜗毛细胞(内毛细胞IHC和外毛细胞OHC)；紫色为Sox2+标记的支持细胞(SC)。图5的上方左小图表示染色Myosin 7a的结果；上方中间小图表示mNeonGreen的表达结果；上方右小图表示染色Myosin 7a和mNeonGreen的叠图，表示Myosin 7a和mNeonGreen共表达的结果。图5的下方左小图是染色Sox2的结果；下方中间 小图表示mNeonGreen的表达结果；下方右小图是染色Sox2和mNeonGreen的叠图，表示Sox2和mNeonGreen共表达的结果。

图6显示，对图5的免疫荧光结果进行量化统计，表明病毒AAV-ie-Mouse IHC promoter-mNeoGreen注射后，mNeonGreen约在100％的内毛细胞(IHC)中高效特异性表达。外毛细胞(OHC)和支持细胞(SC)则完全不表达mNeonGreen。

图7显示，在敲除OTOF基因功能的OTOF点突变小鼠(OTOF^-/-)中注射病毒AAV-ie-IHC-L-N660-mNeonGreen(作为对照)和AAV-ie-IHC-L-N660-mOTOF后，在第14天取耳蜗进行免疫荧光染色。红色指示耳蜗表达的OTOF，蓝色为Myosin 7a标记的耳蜗毛细胞(内毛细胞和外毛细胞)。在对照病毒注射组中，未观察到在内毛区域存在OTOF表达。相反地，在施用AAV-ie-IHC-L-660-mOTOF的实验组中，观察到内毛区域重新表达了mOTOF，说明通过AAV载体和启动子IHC-L-660能够靶向驱动mOTOF在内毛区域中重新表达。

图8显示，对出生30天(P30)的OTOF点突变成年鼠(OTOF^-/-)，通过圆窗注射病毒AAV-ie-IHC-L-N660-mNeoGreen(对照组)和AAV-ie-IHC-L-N660-mOTOF(实验组)。在注射10天(P40天)后，对小鼠进行ABR(听性脑干反应)测听，观察到实验组小鼠听力部分恢复，说明IHC-L-N660驱动的OTOF在OTOF点突变小鼠耳蜗内毛区域中的重新表达可以恢复小鼠的部分听力。

图9显示，OTOF敲除小鼠(OTOF^-/-)在出生第3天(P3)注射病毒AAV-ie-Mouse IHC promoter-mOTOF后，在P30天取耳蜗进行免疫荧光染色。使用不注射病毒AAV-ie-Mouse IHC promoter-mOTOF的OTOF敲除小鼠("KO”)作为对照。红色为小鼠的耳蜗OTOF染色，蓝色为Myosin 7a标记的耳蜗毛细胞。在对照KO小鼠中，未观察到在内毛区域存在OTOF表达。相反地，在施用AAV-ie-Mouse IHC promoter-mOTOF的实验组中，观察到内毛区域重新表达了mOTOF，说明通过AAV载体和启动子Mouse IHC promoter能够靶向驱动mOTOF在内毛区域中重新表达。

图10显示，在注射病毒AAV-ie-Mouse IHC promoter-mOTOF的OTOF敲除小鼠中，在P30天进行ABR(听性脑干反应)测听。使用不注射该病毒的OTOF敲除小鼠("KO”)作为对照。观察到实验组小鼠听力部分恢复，说明Mouse IHC promoter驱动的OTOF在OTOF敲除小鼠耳蜗内毛区域中的重新表达可以恢复小鼠的部分听力。

发明详述

除非下文中另外定义，否则本说明书中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特 征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。

定义

在本文中，术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。该术语也旨在涵盖在指定数字±1％,±0.5％，或±0.1％范围内的数值。

在本文中，术语“约”在与核苷酸位置联合使用时意为涵盖在指定核苷酸位置±10bp范围内的任意位置。例如，提及SEQ ID NO:2的“大约651bp位置”应理解涵盖了该序列的核苷酸641bp至661bp之间的任意位置。

在本文中，与核苷酸序列例如SEQ ID NO:2相关的核苷酸位置是指，按照所述核苷酸序列的5’至3’方向编号的核苷酸位置。

在本文中，术语“包含”或“包括”意指包括所述及的要素、整数或步骤、或要素组、整数组或步骤组，但是不排除任何其他的要素、整数或步骤、或其他要素组、整数组或步骤组。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的多核苷酸时，也旨在涵盖由该具体序列组成的多核苷酸。

在本文中，表述“和/或”在与两个或两个以上项目联合使用时，意在表示所列相关项目中的任何一个、或所列相关项目中的任何多个或所有的可能组合。

在本文中，表述“转基因”是指，待通过重组技术引入宿主细胞中的多核苷酸，所述的多核苷酸编码RNA或蛋白质，并能够在可操作连接到适宜启动子的情况下在宿主细胞中表达所述RNA或蛋白质。转基因在引入目的宿主细胞中后，可以特异性地靶向确定的遗传基因座，或随机整合到染色体内，或者可以以染色体外形式存在。这通常取决于用于引入所述转基因的技术和目的。适用于本发明的转基因包括但不限于，从基因组来源分离的DNA、由分离的mRNA模板制备的cDNA、直接合成的DNA，或其组合。

术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是耳蜗內毛细胞。

在本文中，“听力损失”是指，通过听力测量确定的低于正常听力阈值水平的听力，包括轻度、中度、重度和极重度听力损失、以及耳聋。听力损失可以通过听力损失百分比描述，例如，30％、60％、80％或甚至100％听力损失，或通过听力损失分级描述。

在本文中，“听力损失相关基因”是指，所述基因上的变异可通过改变内耳正常发挥功能的能力而引起听力损失或造成听力损失易感性。在本文中，这样的基因也称作“听损基因”。目前已经鉴定了100多个基因与听力损失相关(参见，Hereditary Hearing Loss Homepage，https://hereditaryhearingloss.org/，其中列出了 目前已知的单基因无症状听力损失的基因位置和鉴定数据)。在引起听力损失易感性的情况下，相对于健康个体，携带所述听损基因变异的个体可表现出更容易因环境因素，例如衰老、噪音、药物或感染而引发听力损失。

在本文中，“遗传性听力损失”是指，由基因缺陷引起或与之相关的听力损失，例如由遗传因素引起的先天性耳聋和学语前聋，或与遗传因素相关的、由环境因素诱发的(例如，衰老、噪音、药物或感染诱导的)听力损失。遗传性听力损失可以是无症状的(即，不存在相关的可见外耳或其他器官异常)或有症状的。在本文中，遗传性听力损失优选是感音神经性听力损失。

在本文中，“耳蜗內毛细胞”是指，来自哺乳动物的离体或体外的耳蜗內毛细胞或细胞系或细胞群体，或在哺乳动物耳蜗中的內毛细胞。

在本文中，“分离的”核酸是指，人工合成的、或自包含其的天然环境的至少一些组分中分离出来的核酸分子。例如，分离的核酸可以是一个更大的核酸的一部分、或是载体或物质组合物的一部分，或者可以包含在细胞内，并且仍然是“分离的”，条件是该更大的核酸、载体、物质组合物或特定细胞不是所述核酸的天然环境。然而，出于本发明的目的，作为某文库(例如，基因组或cDNA文库)的成员但尚未与该文库的其他成员分离的克隆(例如，存在于含有该克隆和该文库的其他成员的均一溶液中的克隆)中所含的核酸，或从细胞或细胞裂解物中移出的染色体，或随机剪切的基因组DNA的制备物，或经一种或多种限制酶切割的基因组DNA的制备物，不是“分离的”。在一些实施方案中，“分离的”核酸相对于起始材料被富集了至少大约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多。

在本文中，术语“可操作连接”也称作“有效连接”或“功能性连接”，意指两个或更多个多核苷酸(例如DNA)区段处于一种允许它们以预期的方式起作用的关系中。举例而言，若启动子或增强子序列在合适的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则该启动子或增强子序列有效连接到该编码序列。一般而言，有效连接到可转录序列的启动子，与该可转录序列是连续的，即它们是顺式作用(cis-acting)。然而，一些转录调控序列(如增强子)无须物理邻接于或紧密接近于其增强转录的编码序列。

在本文中，术语序列“同一性”用于描述两个氨基酸序列或多核苷酸序列之间的序列结构相似性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，可以将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是所述参考序列的长度的至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％，和甚至更优选地至少70％、80％、90％、或100％。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。

可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。

还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。

在本文中，术语“病毒载体”是指，能够作为目的核酸的运载工具的非野生型重组病毒颗粒(例如AAV病毒颗粒)。通常，病毒载体包含衣壳和包装在其中的病毒基因组(例如，病毒DNA)，待递送的目的核酸插在病毒基因组中。

在本文中，“个体”是指哺乳动物。哺乳动物的实例包括，但不限于，人、非人灵长类动物(例如，食蟹猴、恒河猴)、啮齿类动物，以及其他哺乳动物，例如，牛、猪、马、狗。在本文中，哺乳动物包括处于所有发育期(包括胚胎和胎儿期)的个体。

在本文中，术语“治疗”指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。术语“治疗”也涵盖改良或改善至少一项身体参数，包括患者可能无法辨别的身体参数。

在本文中，术语“预防”是指预防或延缓疾病或病症的发作或发展或进程。在本文中，“预防”通常是指在疾病的至少一个症状发生前实施的医学干预。

以下对本发明的各个方面进行描述。

本发明的IHC特异性启动子

启动子是通常位于需要转录的基因上游(朝向5'区域)的DNA区域。启动子容许正确激活或抑制其控制的基因的表达。在本发明的上下文中，本发明的启动子导致与它们可操作地连接的基因在耳蜗内毛细胞中的特异性表达。

在本文中，“特异性表达”意指，在用可操作连接了启动子的基因转染后，在耳蜗中，相对于其他耳蜗细胞，所述基因主要在耳蜗內毛细胞中表达，或者至少超过75％的表达所述基因的细胞为耳蜗內毛细胞。可以按照例如实施例中所示的AAV病毒载体转染和免疫荧光染色方法，检测根据本发明的启动子在动物耳蜗中诱导的转基因特异性表达。或者，可以使用标准技术(例如，定量RT-PCR、免疫荧光染色)，比较转基因在各种耳蜗细胞中的表达，例如，比较耳蜗內毛细胞与耳蜗外毛细胞中自转基因产生的RNA或蛋白质表达量，以确定转基因的IHC特异性表达。在一些方面，IHC特异性启动子在耳蜗內毛细胞中诱导的转基因表达水平，相对于其在耳蜗其他细胞(例如耳蜗外毛细胞)中诱导的转基因表达水平，高至少50％(例如，75％、100％、150％、200％或更高)。在一些实施方案中，根据本发明的IHC特异性启动子可以包含在哺乳动物基因组中天然存在的驱动效应基因表达的启动子中的部分序列、或其片段、变体或衍生物，只要包含该部分序列、片段、变体或衍生物的本发明启动子可以驱动可操作连接的转基因在耳蜗内毛细胞中表达即可。在进一步的一些实施方案中，根据本发明的IHC特异性启动子中的至少部分序列，与本公开的具体IHC特异性启动子(例如SEQ ID NOs:2-6)之任一的至少部分序列，来源于在哺乳动物基因组中与相同的效应基因连接的启动子序列、或是其片段、变体或衍生物。在再一些实施方案中，根据本发明的IHC特异性启动子包含在哺乳动物基因组中天然驱动OTOF基因表达的部分启动子序列、或其片段、变体或衍生物。在一些实施方案中，哺乳动物基因组是人基因组、啮齿类动物基因组或灵长类动物基因组。

在本文中，术语“同源启动子”是指这样的两个或两个以上启动子，这些启动子的至少部分(例如80％、90％、或96％以上)启动子序列来源于在哺乳动物基因组中与相同的效应基因连接的启动子区域。在一些实施方案中，本发明提供了本公开的具体IHC特异性启动子(例如SEQ ID NOs:2-6)之任一的同源启动子。

以下显示了示例性的本发明启动子(在本文中也称作“IHC特异性启动子”)的核苷酸序列，包括在人基因组上获得的一个长启动子IHC-L(SEQ ID NO.2)、以及一系列在IHC-L(SEQ ID NO.2)基础上截短的启动子IHC-L-N860(SEQ ID NO.3),IHC-L-N660(SEQ ID NO.4),IHC-L-N460(SEQ ID NO.5),和IHC-L-C140(SEQ ID NO.6)；以及分别在小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)以及豚尾猴(Macaca nemestrina)基因组上获得的与IHC-L-N660相应的同源启动子(分别为SEQ ID NOs:10-12)。以下也显示了用于本发明实施例中的对照启动子IHC-S和CAG的序列和mNeonGreen的氨基酸序列和核苷酸序列。

启动子IHC-S(SEQ ID NO.1)，长度2003bp

启动子IHC-L(SEQ ID NO.2)，长度2008bp

启动子IHC-L-N860(SEQ ID NO.3)，即SEQ ID NO:2的851bp-1976bp核苷酸序列，长度1126bp

启动子IHC-L-N660(SEQ ID NO.4)，即SEQ ID NO:2的651bp-1976bp核苷酸序列，长度1326bp

启动子IHC-L-N460(SEQ ID NO.5)，即SEQ ID NO:2的450bp-1976bp核苷酸序列，长度1527bp

启动子IHC-L-C140(SEQ ID NO.6)，即SEQ ID NO:2的1bp-1834bp核苷酸序列，长度1834bp

小鼠来源(Mus musculus)的IHC启动子(SEQ ID NO:7)，长度1326bp

大鼠(Rattus norvegicus)来源的IHC启动子(SEQ ID NO.8)，长度1326bp：

豚尾猴(Macaca nemestrina)来源的IHC启动子(SEQ ID NO.9)，长度1326bp：

mNeonGreen DNA序列(SEQ ID NO.10)，长度708bp

mNeonGreen氨基酸序列(SEQ ID NO.11)，长度236aa

启动子CAG(SEQ IDNO.12)，长度906bp

表达盒

本发明提供包含与本发明启动子多核苷酸可操作连接的转基因的表达盒。在所述表达盒中，与本发明启动子多核苷酸可操作地连接的转基因可以是任何有待在耳蜗內毛细胞中表达的异源多核苷酸。在一些实施方案中，所述转基因在耳蜗內毛细胞中表达时将有益于遗传性听力损失的治疗或预防，例如，促进内毛细胞发育、改善內毛细胞功能、促进內毛细胞再生、存活或维持。在另一些实施方案中，所述转基因包含编码标记或报告蛋白的多核苷酸。

在一些实施方案中，所述转基因编码用于基因置换、基因阻抑(例如，反义RNA技术、RNA干扰)或基因编辑(例如，CRISPR/Cas编辑)听力损失相关基因的多核苷酸。在一些实施方案中，所述听力损失相关 基因是耳聋基因(DFN)，例如，DFNA基因(常染色体遗传)、DFNB基因(隐性遗传)、DFNX基因(X染色体连锁遗传)、和DFNM基因(线粒体遗传)。适用于本发明的耳聋基因的实例包括，但不限于：TMC1和TMC2，CABP2、OTOF、SLC17A8、TBC1D24、ACTG1、CDH23、CIB2、ESPN、MYO3A、MYO7A、MYO15A、PCDH15、PDZD7、RDX、TPRN、TRIOBP、USH1C、USH2A、WHRN、SIX1、POU4F3、EDN3、EDNRB、EPS8、GPSM2、MARVELD2、TJP2、CLDN14、WFS1、MYH9，Myo6、REST、TBC1D24、OSBPL2、HOMER2、MCM2、DMXL2、PDE1C、TMIE、TMPRSS3、GRXCR1、ILDR1、DCDC2、LOXHD1、ELMOD3、SERPINB6、TMEM132、GRXCR2、CLIC5等。

基因置换(gene replacement)是一种最为“直接的基因治疗方式，其通常涉及将编码功能性蛋白质的核酸引入宿主细胞并使其在宿主细胞中表达，以弥补宿主细胞中由缺陷型基因(例如，在本文中，突变的听力损失相关基因)造成的该功能性蛋白质缺失。如本领域技术人员理解，根据该功能性蛋白的大小和性质，可以通过将编码该蛋白质的一个核酸分子引入宿主细胞中、或通过将多个分别编码该蛋白质的一部分的核酸，引入同一宿主细胞中，来表达产生全长的功能性蛋白质。在一些实施方案中，本发明提供表达盒，其中所述表达盒包含至少一个与本发明的启动子多核苷酸可操作连接的用于基因置换的转基因。在一些实施方案中，所述至少一个转基因编码治疗性蛋白质，其中所述治疗性蛋白质包含由正常拷贝的听损基因或耳聋基因编码的蛋白质的氨基酸序列。

基因抑制可以通过诸如反义核酸、siRNA或microRNA等RNA干扰(RNAi)手段，抑制宿主细胞中缺陷基因的表达或翻译，从而治疗或预防由该缺陷基因导致的功能性障碍。在一些实施方案中，因此，本发明提供表达盒，其中所述表达盒包含至少一个与本发明的启动子多核苷酸可操作连接的用于基因抑制的转基因。在一些实施方案中，所述至少一个转基因在引入宿主细胞表达中后，将导致siRNA或microRNA产生，以抑制宿主细胞中缺陷型听损基因或耳聋基因的表达或翻译。

基因编辑是另一种靶向修复基因缺陷的基因治疗手段，包括但不限于，ZFN、TALEN和CRISP/Cas编辑。在一些实施方案中，本发明也提供了表达盒，其中所述表达盒包含至少一个与本发明的启动子多核苷酸可操作连接的用于基因编辑(尤其是CRISP/Cas9编辑)的转基因。在一些实施方案中，该转基因在耳蜗內毛细胞中的表达将靶向修复所述內毛细胞的听损基因缺陷。

除了启动子和转基因，表达盒中还可以根据需要包含其他调控序列。术语“调控序列”和“表达控制序列”在本文中可以互换使用，是指这样的核酸序列，其诱导、抑制或以其它方式控制与之有效连接的编码核酸序列的蛋白质转录。调控序列可以是例如起始序列、增强子序列、内含子序列和转录终止子序列等。在一些实施方案中，本发明的表达盒以转录方向包含彼此功能性连接的如下元件：

-根据本发明的启动子多核苷酸，

-编码转基因的多核苷酸，

-一个或多个转录终止子，和

-polyA信号序列。在一些实施方案中，所述表达盒还包含位于编码转基因的多核苷酸上游(即，5’)的Kozak序列。

为了实现目的基因在哺乳动物细胞中的表达，可以通过多种方式，将包含与本发明启动子可操作连接的转基因的表达盒或包含所述表达盒的载体，引入所述细胞中。所述方法包括，但不限于，转化、转染、转导、直接摄取、包封在脂质体中。用于转染或转化细胞的适宜方法是本领域已知的，包括磷酸钙沉淀、电穿孔、显微注射、病毒感染和脂转染。

载体

本发明提供引导转基因在耳蜗內毛细胞中表达的载体，尤其是重组病毒载体，其包含与本发明启动子可操作连接的转基因或根据本发明的表达盒。本领域内已知的多种病毒载体可由本领域技术人员调整而用于本发明中，例如重组腺相关病毒、重组腺病毒、重组反转录病毒、重组痘病毒、重组慢病毒载体等。在一些方面，适用于本发明的重组病毒载体可以选自慢病毒载体、AAV病毒载体和腺病毒载体。在一些方面，本发明特别考虑重组腺相关(AAV)病毒载体。

在AAV病毒载体的情况下，为了产生可以将目的核酸递送至组织或细胞的重组病毒颗粒，通常仅需要在基因组中保留反向末端重复(ITR)顺式元件，而病毒包装所需的其余序列可以反式提供。因此，在一些实施方案中，本发明的AAV病毒载体包含衣壳和包装在其中的重组病毒基因组，其中所述重组病毒基因组包含或由位于两个AAV ITR序列之间的一个或多个外源核苷酸序列组成。位于重组病毒基因组5’和3’末端的两个ITR序列(即，5’ITR和3’ITR)可以相同或不同。

在本文中，术语AAV“反向末端重复”(inverted terminal repeat,ITR)或“ITR”可互换使用，用于指来自AAV病毒基因组的ITR顺式作用元件，所述元件在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用。天然AAV病毒的ITR序列中包含Rep蛋白结合位点(Rep binding site，RBS)和末端解链位点trs(terminal resolution site)，能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口。该ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用。最早分离到的AAV病毒，AAV2，具有位于基因组两端、长度145bp的呈回文-发卡结构的“反向末端重复序列”(ITR)。之后，在各种血清型的AAV病毒中发现不尽相同的ITR序列，但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。基于这些野生型ITR序列的传统重组AAV病毒载体一般为单链AAV载体(ssAAV)，病毒基因组以单链形式包装在AAV衣壳中。与此类ssAAV不同，已经发现，通过改造ITR，删除AAV病毒的一侧ITR序列中的trs序列和任选地D序列， 能够使包装得到的重组AAV病毒载体所携带的基因组自我互补，形成双链(Wang Z等人，Gene Ther.2003；10(26):2105-2111；McCarty DM等人，Gene Ther.2003；10(26):2112-2118)。由此包装得到的病毒为双链AAV病毒，即，scAAV(self-complementary AAV)病毒。

通常，ssAAV病毒载体的包装容量为大约4.6kb，而scAAV病毒载体的包装容量更小，仅为ssAAV病毒载体包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。为了适应AAV病毒载体的小容量，用于AAV病毒基因组中的顺式作用元件常常需要在保持一定功能活性的基础上具有尽可能小的尺寸。因此，在涉及AAV病毒载体的根据本发明的一些实施方案中，根据本发明的截短启动子或其同源启动子，由于强度和/或特异性的保持，将是优选的。在根据本发明的一些实施方案中，本发明提供包含本发明截短启动子(例如SEQ ID NOs:3-6之任一)或其同源启动子(例如SEQ ID NOs:7-9之任一)的AAV病毒载体。在一些实施方案中，所述AAV病毒载体可以是ssAAV或scAAV病毒载体。在一些实施方案中，所述AAV病毒载体具有天然的ITR序列或修饰的ITR序列，例如来自AAV2的ITR序列。

AAV蛋白VP1,VP2和VP3是衣壳蛋白，其相互作用以形成AAV衣壳。不同血清型的AAV病毒具有不同的组织感染嗜性，可以通过选择AAV病毒载体衣壳的来源血清型，将外源基因转运至特定的器官和组织(Wu Z等人，Mol Ther.2006；14(3):316-327)。在根据本发明的AAV病毒载体的实施方案中，病毒载体衣壳可由本领域内已知的任何AAV血清型提供，包括目前所鉴定的人和非人AAV血清型及有待鉴定的AAV血清型。此外，病毒载体衣壳也可以是镶嵌型衣壳(例如：由来自不同血清型的衣壳蛋白质的混合物构成的衣壳)或甚至是嵌合衣壳(例如：含有用于产生标志物和/或改变组织向性的外来或不相关蛋白质序列的衣壳蛋白质)。如本领域技术人员理解的，病毒载体的衣壳和ITR可来自相同或不同的AAV血清型。

适用于本发明的AAV病毒载体衣壳包括，但不限于，来自以下AAV血清型的病毒衣壳：AAV1-12、rh10,rh39,rh43,rh74,Anc80,Anc80L65,DJ/8,DJ/9,7m8,PHP.B,PHP.eb,AAV-ie,AAV2quad(Y-F)；并且优选以下病毒衣壳,用于耳蜗內毛细胞靶向：AAV1,AAV2,AAV2quad(Y-F),AAV6,AAV8,AAV9,Anc80,Anc80L65,DJ/9,7m8,PHP.B,和AAV-ie。在一个优选的实施方案中，本发明的AAV病毒载体包含AAV-ie血清型衣壳。具有AAV-ie血清型病毒载体描述在NATURE COMMUNICATIONS，(2019)10:3733，https://doi.org/10.1038/s41467-019-11687-8中，其中一个CPP样短肽DGTLAVPFK被插入到AAV-DJ病毒的VP1衣壳蛋白的氨基酸589和590之间。在此为了本发明的所有目的，将该文献并入作为参考。

本领域中对AAV载体具有相对成熟的包装系统，这便于规模化生产AAV载体。目前常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒作为辅助病毒的系统、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1，HSV1)作为辅助病毒的包装系统、以及基于杆状病毒的包装系统。每种包装系统都各具特点，本领 域技术人员可以根据需要做出合适的选择。三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。本发明的重组AAV病毒载体可以使用本领域已知的任何合适的方法来生产。在一个实施方案中，本发明重组AAV病毒采用三质粒包装系统进行生产。在另一实施方案中，本发明重组AAV病毒采用杆状病毒包装系统进行生产。

药物组合物

在一些方面，本发明提供药物组合物，其包含与可药用的载体一起配制的本发明载体。此外，所述的组合物还可含有一种或多种适用于治疗或预防例如遗传性听力损失的其他治疗剂。可药用的载体包括可增强或稳定组合物的可药用物质，或可用于促进组合物制备的可药用物质。例如，可药用的载体可包括生理学上相容的溶剂、表面活性剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂及吸收延迟剂等等。

本发明的药物组合物可通过本领域内已知的多种方法进行给药。给药的途径和/或模式视所需结果而变化。优选，园窗注射给药。可药用的载体应适于给药方式，例如耳蜗、静脉内、皮下或局部给药。

组合物应无菌且为流体。可以例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散剂情况下通过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等张剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)和氯化钠。

本发明的药物组合物可根据领域内所熟知且常规实施的方法进行制备。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.,第20版,2000；和Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。药物组合物优选在GMP条件下制造。本发明的药物组合物中通常采用治疗有效剂量或预防有效剂量的本发明病毒载体。病毒载体可通过本领域技术人员已知的常规方法配制成可药用的剂型。此外，可以调整给药方案，以提供最佳的期望反应(例如治疗反应)。举例而言，可单次给药，可随时间推移施用若干分次剂量，或可以按治疗情况的紧急性所指示按比例减少或增加剂量。特别有利的是，将药物组合物配制成单位剂型，以便于给药和剂量均匀性。如本文中所用的单位剂型是指适合作为单位剂量用于所治疗对象的物理离散单位；各单位含有预定量的计算为产生期望治疗作用的活性化合物与所需药物载体联合。

可改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以便在对患者无毒的情况下获得对于特定患者、组合物和给药模式有效实现期望的治疗反应的活性成分的量。所选剂量水平视多种药物动力学因素而定，包括所采用的本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，所用特定化合物的排泄速率，治疗持续时间，与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，待治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康情况及前病史以及类似因素。

医师或兽医可以以低于实现期望治疗效果所需水平的药物组合物中所用的本发明病毒载体的剂量开始、并逐渐增加剂量，直至实现期望效果。一般而言，用于治疗如本文所述的遗传性听力损失的本发明组合物的有效剂量视许多不同因素而变化，包括给药方式、靶部位、患者生理状态、患者为人或是动物、所施用的其他药物以及治疗为预防性或是治疗性。需要滴定治疗剂量以优化安全性和功效。

本文所述的病毒载体可以以每只耳给药一次来使用，也可以根据情况进行重复给药。给药的剂量可视治疗为预防性或是治疗性而变化。

如果需要，本发明的药物组合物可以呈现于包装或分配装置中，该包装或分配装置可以含有一个或多个包含活性成分的单位剂型。该包装例如可以包含金属箔或塑料箔，例如泡罩包装。该分配装置可以是注射装置，例如注射笔。该包装或分配装置可以附有施用说明。

因此，在一些方面，本发明还提供了用于实施本发明的治疗方法的药盒。此类药盒在一个或多个容器中包含治疗或预防有效量的根据本发明的药物组合物。药盒的小瓶中的组合物可以呈药学上可接受的溶液的形式，例如与无菌盐水、葡萄糖溶液或缓冲溶液或其他药学上可接受的无菌流体组合。替代性地，所述药物组合物可以为冻干或脱水的形式；在这种情况下，药盒任选地进一步在容器中包含优选地为无菌的药学上可接受的溶液(例如，盐水、葡萄糖溶液等)，以将组合物复原以形成用于注射目的的溶液。在一些情况下，药盒还可以进一步包含优选以无菌形式包装以用于注射组合物的针或注射器，以及任选地包括供临床医生或患者施用组合物的说明书。

治疗方法

在一个方面，本发明提供了在个体中治疗或预防听力损失的方法，包括向所述个体施用本发明的药物组合物。适用于本发明方法的个体可以是患有或有风险患有听力损失的个体。在一些实施方案中，所述听力损失是感音神经性听力损失。在一些实施方案中，所述听力损失是遗传性听力损失。在一些实施方案中，所述遗传性听力损失是常染色体显性听力损失、常染色体隐性听力损失、或X连锁的听力损失。在一些实施方案中，所述听力损失是获得性听力损失。在一些实施方案中，所述获得性听力损失是噪音诱导的听力损失、年龄诱导的听力损失、疾病或感染诱导的听力损失。在一些实施方案中，所述听力损失与耳蜗內毛细胞的损失或功能性障碍有关。

在一些实施方案中，所述药物组合物以治疗或预防有效量施用，以预防或减少听力损失、延迟听力损失的出现、延缓听力损失的进程、改善听力、改善内毛细胞功能、防止或减少内毛细胞死亡、增加內毛细胞存活、或增加內毛细胞的数量。

在一些实施方案中，所述个体是人。在另一些实施方案中，所述个体是非人哺乳动物个体，例如啮齿 类动物。

描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成限制本发明的保护范围。

实施例

实施例1 IHC-S(SEQ ID NO.1)和IHC-L(SEQ ID NO.2)启动子促进内毛细胞转基因表达情况

1.1 CAG-mNeonGreen、IHC-S-mNeonGreen和IHC-L-mNeonGreen质粒构建和病毒包装

将广谱启动子CAG(SEQ ID NO.12)、对照启动子IHC-S(SEQ ID NO.1)和特异性启动子IHC-L(SEQ ID NO.2)插入pAAV-mNeonGreen质粒中(南京金斯瑞公司合成；表达盒：三种启动子+mNeonGreen绿色荧光报告基因)。mNeonGreen(DNA序列：SEQ ID NO.10,氨基酸序列：SEQ ID NO.11)是一个绿色荧光蛋白，作为报告基因，用于指示被病毒感染并表达转基因的细胞。构建的pAAV-CAG-mNeonGreen、pAAV-IHC-S-mNeonGreen和pAAV-IHC-L-mNeonGreen病毒包装质粒，分别与AAV-ie质粒(DOI:10.1038/s41467-019-11687-8)和pHelper质粒(南京金斯瑞公司合成)以合适的量共转于HEK-293T细胞中，以产生分别包装了CAG-mNeonGreen、IHC-S-mNeonGreen和IHC-L-mNeonGreen的AAV-ie病毒。基本按照文献(DOI:10.1038/s41467-019-11687-8)中描述，采用碘克沙醇梯度离心纯化产生的AAV病毒，测量病毒滴度在1E12～1E13 GC/mL。

采用碘克沙醇梯度超高速离心纯化AAV病毒，按如下进行：使用反复冻融裂解细胞和上清后，用10％PEG 8000和1.0M NaCl对细胞裂解物和上清混合液沉淀浓缩。离心后，用全能核酸酶重悬沉淀于PBS缓冲液中。分别使用15％、25％、40％、60％的碘克沙醇仔细分层覆盖病毒悬液。10℃条件下以350,000g/min进行超速离心共计90min。最后交换缓冲液以除去碘克沙醇并浓缩纯化的病毒。

1.2IHC-S(SEQ ID NO.1)和IHC-L(SEQ ID NO.2)启动子对mNeonGreen表达的内毛靶向驱动作用

对出生第3天的FVB新生鼠(南京青龙山购买)通过圆窗注射病毒AAV-ie-CAG-mNeonGreen、AAV-ie-IHC-S-mNeonGreen和AAV-ie-IHC-L-mNeonGreen。首先将小鼠冰麻，然后固定到手术板上，在显微镜下用手术剪刀在小鼠颈部剪开一个小的手术创口，用镊子将小鼠圆窗暴露后，通过毛细针管将适量病毒缓缓注射进小鼠圆窗内。注射病毒后第14天取耳蜗，用毛细胞标记物myosin7a对小鼠耳蜗进行免疫荧光染色。首先将小鼠耳蜗切成顶转、中转和底转，贴在圆形玻片上用封闭液孵育1小时以去除非特异性染色，然后孵育一抗即myosin7a(Rabbit源)过夜后，用对应的二抗(Rabbit 555；红色荧光)孵育以结合一抗myosin7a(Rabbit源)，使毛细胞染色。图中观察到与对照组(图1：CAG和图2：IHC-S)相比，实验组(IHC-L)的mNeonGreen在内毛区域特异性表达(图3)。

实施例2 IHC-L截短的启动子促进内毛细胞转基因表达情况

2.1IHC-L截短体质粒构建和病毒包装

采用以实施例1中相同的方式，将特异性启动子IHC-L-N860(SEQ ID NO.3),IHC-L-N660(SEQ ID NO.4),IHC-L-N460(SEQ ID NO.5),IHC-L-C140(SEQ ID NO.6)构建入pAAV-mNeonGreen质粒中。构建产生的pAAV-IHC-L-N860-mNeonGreen，pAAV-IHC-L-N660-mNeonGreen，pAAV-IHC-L-N460-mNeonGreen，pAAV-IHC-L-C140-mNeonGreen病毒包装质粒，与AAV-ie质粒和pHelper质粒以合适的量共转于HEK-293T细胞中。采用碘克沙醇梯度离心纯化AAV病毒，测量病毒滴度在1E12～1E13 GC/mL。

2.2IHC-L截短体启动子对绿色荧光蛋白mNeonGreen表达的内毛靶向驱动作用

采用以实施例1中相同的方式，对出生第3天的FVB新生鼠，通过圆窗注射病毒AAV-ie-IHC-L-N860-mNeonGreen，AAV-ie-IHC-L-N660-mNeonGreen，AAV-ie-IHC-L-N460-mNeonGreen，AAV-ie-IHC-L-C140-mNeonGreen。在注射后第14天取耳蜗，并进行免疫荧光染色。用相同荧光强度对mNeonGreen拍照,即用激光共聚焦显微镜拍摄时，设置相同的拍摄参数，对不同的样品进行拍摄，以保证拍摄条件相同由此能够对不同样品的mNeonGreen的荧光强度进行比较，其中荧光强度越强，表明启动子效果越好，从而可以确定哪种启动子作用强度最优。

根据内外毛细胞的排列方式，判断内毛区域；并根据不同区域的绿色荧光强度，比较不同启动子的作用强度和特异性。结果发现：(1).IHC-L-N460较其他几个启动子获得较弱的绿色荧光，说明该启动子作用强度较弱，而且由IHC-L-N460启动的mNeonGreen表达不止限于内毛区域，说明该启动子的特异性也相对较弱；(2).IHC-L-N860较其他几个启动子具有相对较弱的特异性，在外毛细胞处有感染；(3).IHC-L-N660和IHC-L-N140都只在内毛区域驱动mNeonGreen荧光表达，说明其特异性均很好，且启动子作用强度高(图4)。

2.3小鼠同源IHC启动子驱动小鼠耳蜗内毛细胞特异性表达mNeonGreen

采用实施例1中相同的方式，制备包含小鼠同源IHC启动子(SEQ ID NO:7)驱动的mNeonGreen报告基因的AAV病毒AAV-ie-Mouse IHC promoter-mNeoGreen。

按实施例1中相同方式，对出生第3天的野生型小鼠，通过圆窗注射病毒AAV-ie-Mouse IHC promoter-mNeoGreen。在注射后第14天取耳蜗，并进行免疫荧光染色。将小鼠耳蜗，贴在圆形玻片上用封闭液孵育1小时以去除非特异性染色，然后孵育一抗即Myosin7a(Rabbit源)和Sox2(goat源)过夜后，用对应的二抗(Rabbit 647；goat 555)孵育以结合一抗。免疫荧光染色结果如图5所示。通过对图5中Myosin7a和mNeonGreen双阳性细胞进行数量统计。结果显示，注射病毒AAV-ie-Mouse IHC promoter-mNeoGreen的小鼠中，mNeonGreen报告基因在耳蜗内毛细胞(IHC)中高效表达，表达效率高达100％(图6)，表明小鼠同源IHC启动子在内毛细胞中具有高特异性。

实施例3 IHC-L-N660驱动在OTOF敲除小鼠的内毛区域中OTOF的重新表达情况

3.1 IHC-L-N660-mNeonGreen和IHC-L-N660-mOTOF质粒构建和病毒包装

采用实施例1中相同的方式，将特异性启动子IHC-L-N660(SEQ ID NO.4)构建入pAAV-mNeoGreen和pAAV-mOTOF质粒中；将构建产生的pAAV-IHC-L-N660-mNeoGreen和pAAV-IHC-L-N660-mOTOF病毒包装质粒，与AAV-ie质粒和pHelper质粒以合适的量共转于HEK-293T细胞中；采用碘克沙醇梯度离心纯化AAV病毒，测量病毒滴度在1E12～1E13 GC/mL。

3.2 IHC-L-N660启动子驱动在OTOF敲除小鼠的耳蜗内毛细胞中重新表达OTOF

采用实施例1中相同的方式，对出生第3天的敲除OTOF功能的OTOF点突变小鼠(OTOF^-/-)，通过圆窗注射病毒AAV-ie-IHC-L-N660-mNeoGreen和AAV-ie-IHC-L-N660-mOTOF。在注射后第14天取耳蜗，并进行免疫荧光染色。将小鼠耳蜗，贴在圆形玻片上用封闭液孵育1小时以去除非特异性染色，然后孵育一抗即myosin7a(Rabbit源)和OTOF(mouse源)过夜后，用对应的二抗(Rabbit 647，蓝色荧光；mouse 555，红色荧光)孵育以结合一抗，使毛细胞染成蓝色，OTOF的表达被标记成红色。观察到，在OTOF-/-小鼠中，与对照组Ctrl(IHC-L-N660-mNeoGreen)相比，实验组(IHC-L-N660-mOTOF)的OTOF在内毛区域重新表达(图7)。

实施例4 IHC-L-N660驱动OTOF在OTOF缺陷小鼠内毛区域中重新表达后对听力的影响

4.1 IHC-L-N660-mNeonGreen和IHC-L-N660-mOTOF质粒构建和病毒包装

同实施例3.1

4.2 IHC-L-N660启动子驱动OTOF在OTOF点突变的小鼠耳蜗内毛细胞中重新表达后小鼠听力有所恢复

对出生30天(P30)的敲除OTOF功能的OTOF点突变成年鼠(OTOF^-/-)，通过圆窗注射病毒AAV-ie-IHC-L-N660-mNeoGreen(对照组)和AAV-ie-IHC-L-N660-mOTOF(实验组)，每组各3只动物，注射剂量为1E13GC。在注射10天(P40)后，对小鼠进行ABR(听性脑干反应)测听，观察到实验组小鼠听力部分恢复(图8)。这说明，IHC-L-N660驱动的OTOF在OTOF点突变小鼠耳蜗内毛区域中的重新表达，可以恢复小鼠的部分听力。

4.3小鼠同源IHC启动子在OTOF点突变的小鼠耳蜗内毛细胞中重新表达OTOF后小鼠听力有所恢复

对出生3天的敲除OTOF功能的OTOF点突变小鼠(OTOF^-/-)，通过圆窗注射病毒AAV-ie-Mouse IHC promoter-mOTOF，注射剂量为1E13GC。在出生后第30天(P30)，对小鼠进行ABR(听性脑干反应)测听。测听之后取耳蜗进行免疫荧光染色。使用不注射病毒AAV-ie-Mouse IHC promoter-mOTOF的OTOF敲除(KO)小鼠(在图9和图10中简写为“KO”)作为阴性对照。结果如图9和10所示。

如图9所示，小鼠同源IHC启动子(SEQ ID NO:7)驱动的OTOF基因，在OTOF点突变小鼠的耳蜗内毛区域中实现了OTOF的重新表达；而且如图10所示，该实验组小鼠的听力有所恢复。这说明，该小鼠同源启动子可以用于OTOF点突变小鼠的听力治疗。

Claims (20)

1. 一种分离的核酸，其中所述核酸包含或由以下序列组成：

   (a)SEQ ID NO.2的截短序列，其中所述截短序列包含选自以下的多核苷酸：

   (i)SEQ ID NO:2的大约851bp位置至大约1834bp位置的多核苷酸，

   (ii)SEQ ID NO:2的大约851bp位置至大约1976bp位置的多核苷酸，

   (iii)SEQ ID NO:2的大约651bp位置至大约1834bp位置的多核苷酸，或

   (iv)SEQ ID NO:2的大约651bp位置至大约1976bp位置的多核苷酸，

   其中，所述截短序列的长度不超过1980bp，优选地不超过1850bp、1800bp、1750bp、1700bp、1650bp、1600bp、1550bp、1500bp、1450bp、1400bp、1350bp或1300bp，更优选地，所述截短序列的长度为900bp至1400bp；

   (b)SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多核苷酸，

   (c)SEQ ID NO.7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的多核苷酸；或

   (d)与(a)至(c)任一项的多核苷酸具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％)同一性的多核苷酸，

   其中，在将编码转基因的核酸序列可操作连接至所述分离的核酸时，所述分离的核酸驱动所述转基因在耳蜗內毛细胞中表达。
2. 根据权利要求1的分离的核酸，其中所述核酸包含或由选自SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.4,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6,SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9的核酸序列，或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的核酸序列组成。
3. 一种表达盒，所述表达盒包含根据权利要求1-2任一项的分离的核酸和与其可操作连接的待在耳蜗内毛细胞中表达的转基因。
4. 根据权利要求3的表达盒，其中所述转基因编码在耳蜗內毛细胞中表达时将有益于遗传性听力损失的治疗或预防的治疗性蛋白质或RNA。
5. 根据权利要求3或4的表达盒，其中所述转基因编码用于基因置换、基因阻抑或基因编辑听力损失相关基因的多核苷酸，优选地所述听力损失相关基因为耳聋基因(DFN)，更优选地选自以下的耳聋基因：TMC1，TMC2，CABP2、OTOF、SLC17A8、TBC1D24、ACTG1、CDH23、CIB2、ESPN、MYO3A、MYO7A、MYO15A、PCDH15、PDZD7、RDX、TPRN、TRIOBP、USH1C、USH2A、WHRN、SIX1、POU4F3、EDN3、EDNRB、EPS8、GPSM2、MARVELD2、TJP2、CLDN14、WFS1、MYH9，Myo6、REST、TBC1D24、 OSBPL2、HOMER2、MCM2、DMXL2、PDE1C、TMIE、TMPRSS3、GRXCR1、ILDR1、DCDC2、LOXHD1、ELMOD3、SERPINB6、TMEM132、GRXCR2、和CLIC5，更优选地，所述转基因编码OTOF蛋白。
6. 一种载体，其包含根据权利要求3-5任一项的表达盒。
7. 根据权利要求6的载体，其中所述载体是病毒载体，优选慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体(AAV)。
8. 根据权利要求5的载体，其中所述载体是AAV载体，优选地所述AAV载体包含选自以下血清型的衣壳：AAV1，AAV2,AAV2quad(Y-F),AAV3,AVV4,AVV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV-ie,Anc80L65,DJ/9,7m8和PHP.B，更优选地，所述AAV载体包含AAV-ie或Anc80L65血清型衣壳。
9. 一种分离的细胞，其包含根据权利要求1-2的分离的核酸、根据权利要求3-5任一项的表达盒或根据权利要求6-8任一项的载体，优选地，所述细胞是耳蜗内毛细胞。
10. 一种在耳蜗内毛细胞中表达转基因的方法，包括：将根据权利要求3-5任一项的表达盒或根据权利要求6-8任一项的载体引入耳蜗内毛细胞。
11. 根据权利要求10的方法，其中所述耳蜗内毛细胞是人耳蜗内毛细胞、啮齿类动物耳蜗内毛细胞、或非人灵长类动物耳蜗内毛细胞。
12. 一种药物组合物，其包含至少一个根据权利要求6-8任一项的载体以及可药用载体。
13. 一种用于治疗或预防遗传性听力损失的方法，其包括向有需要的个体施用治疗或预防有效量的根据权利要求12的药物组合物，以在个体的耳蜗內毛细胞中特异性表达至少一个转基因。
14. 根据权利要求13的方法，其中所述遗传性听力损失是感音神经性遗传损失(SNHL)。
15. 根据权利要求13-14任一项的方法，其中，所述药物组合物包含根据权利要求8的AAV病毒载体，并优选地通过园窗注射施用。
16. 根据权利要求13-15任一项的方法，其中，所述至少一个转基因编码用于基因置换、基因阻抑或基因编辑听力损失相关基因的多核苷酸。
17. 根据权利要求16的方法，其中，所述至少一个转基因在个体耳蜗内毛细胞中表达并产生治疗性蛋白质，优选地其中所述治疗性蛋白质包含由选自以下的耳聋基因编码的蛋白质的氨基酸序列：TMC1，TMC2，CABP2、OTOF、SLC17A8、TBC1D24、ACTG1、CDH23、CIB2、ESPN、MYO3A、MYO7A、MYO15A、PCDH15、PDZD7、RDX、TPRN、TRIOBP、USH1C、USH2A、WHRN、SIX1、POU4F3、EDN3、EDNRB、EPS8、GPSM2、MARVELD2、TJP2、CLDN14、WFS1、MYH9，Myo6、REST、TBC1D24、OSBPL2、HOMER2、MCM2、DMXL2、PDE1C、TMIE、TMPRSS3、GRXCR1、ILDR1、DCDC2、LOXHD1、ELMOD3、SERPINB6、TMEM132、GRXCR2、和CLIC5。
18. 根据权利要求13-17的方法，其中，所述个体患有听力损失或具有听力损失易感性。
19. 根据权利要求13-18的方法，其中所述遗传性听力损失由OTOF缺陷引起，且其中所述至少一个转基因编码OTOF蛋白。
20. 根据权利要求3-5任一项的表达盒或根据权利要求6-8任一项的载体或根据权利要求13的药物组合物在制备用于治疗或预防遗传性听力损失的药物中的用途。