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WO2004111090A2 - Molecules de ciblage et de liberation de composes therapeutiques et leur utilisation - Google Patents

Molecules de ciblage et de liberation de composes therapeutiques et leur utilisation Download PDF

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WO2004111090A2
WO2004111090A2 PCT/FR2004/001435 FR2004001435W WO2004111090A2 WO 2004111090 A2 WO2004111090 A2 WO 2004111090A2 FR 2004001435 W FR2004001435 W FR 2004001435W WO 2004111090 A2 WO2004111090 A2 WO 2004111090A2
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WO
WIPO (PCT)
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segment
molecule
targeting
molecule according
sequence
Prior art date
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PCT/FR2004/001435
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English (en)
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WO2004111090A3 (fr
Inventor
Françoise RUSSO-MARIE
Alain Samson
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
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Publication date
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Priority to US10/560,025 priority patent/US20060154854A1/en
Priority to CA002528186A priority patent/CA2528186A1/fr
Publication of WO2004111090A2 publication Critical patent/WO2004111090A2/fr
Publication of WO2004111090A3 publication Critical patent/WO2004111090A3/fr
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4721—Lipocortins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to chimeric molecules for targeting and releasing therapeutic compounds in mammals, especially humans.
  • the molecules of the invention mainly comprise three segments or functional domains: a targeting segment, capable of preferentially binding to the surface of the targeted cells, a therapeutic segment, comprising the biologically active compound, and a linking segment between the segment of targeting and the therapeutic segment, the binding segment being cleavable at the target site.
  • the invention also relates to the preparation of these molecules, synthesis intermediates or domains thereof, pharmaceutical compositions containing them, and their uses, in particular in the pharmaceutical field.
  • the molecules and compositions of the invention are very particularly suitable for targeting pathological cells engaged in an apoptotic pathway, and for the treatment of pathologies or associated tissues, in particular cancers and inflammation.
  • Anti-tumor compounds are in principle highly cytotoxic compounds, which are distributed throughout the body when administered systemically. They produce extremely damaging side reactions to the individual. There is therefore a very great interest in distributing these anti-tumor compounds only in tumor tissues, that is to say in targeting these tissues by means of a specific vector. Although this problem of treatment toxicity is particularly acute for cancer, it can be generalized to a large number of treatments in which, in general, a minimum of side effect is sought for maximum therapeutic effect.
  • a system called ADEPT Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy
  • ADEPT Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy
  • an antibody carries an enzyme to the tumor site.
  • a prodrug is administered and converted into an active molecule by this enzyme (US 5,760,072; US 5,433,955).
  • US 5,760,072; US 5,433,955 the enzyme allowing activation of the prodrug is targeted.
  • the pro-drug is therefore distributed throughout the body, which does not entirely exclude side reactions and reduces the dose of pro-drug actually supplied to the tumor site.
  • this approach is complex because it requires the use of several types of molecules.
  • An analogous method based on targeting the enzyme capable of activating the pro-drug has been described in the applications (WO97 / 26918; WO 98/51787).
  • the object of the present invention is to provide molecules capable of targeting tissues presenting a pathology and of specifically liberating therefrom compounds with therapeutic properties for this pathology. Thanks to the molecules of the invention, the therapeutic compounds exert their activity in a localized and more effective manner, and offer risks of side effects much lower.
  • the molecules of the invention can be constructed to target different types of pathological cells or tissues, preferably in humans.
  • the invention is based on the targeting of apoptotic cells, thanks to a targeting element having the property of binding to cell membranes expressing a negatively charged lipid, in particular phosphatidylserine (PS).
  • PS phosphatidylserine
  • Apoptosis or programmed cell death, is a normal physiological phenomenon, characteristic of multicellular organisms and present in particular in humans. Under normal conditions, the rate of apoptosis is however low and the apoptotic cells are very quickly phagocytosed either by neighboring cells, or more often by professional phagocytic cells such as macrophages or dendritic cells. In addition, apoptotic sites are often very dispersed and show no synchronization. As a result, physiological apoptosis is generally undetectable.
  • Apoptosis is signaled to phagocytic cells by the presence of PS on the surface of apoptotic cells, resulting from the loss of asymmetry in their plasma membrane.
  • the presence of detectable apoptosis is a sign of a physiological disorder where the phagocytic functions are overwhelmed and unable to cope with the increase in cells to be eliminated.
  • Well-known examples of such disorders are, for example, apoptosis of the heart muscle after a heart attack or hepatic apoptosis following a strong viral infection or other conditions of an acute nature. Apoptotic cells are also found in other tissues or pathological mechanisms, such as inflammation and cancer.
  • the pathological tissue contains little or not enough target cells capable of massively retaining the therapeutic molecules of the invention
  • these can be used in combination with an agent or a treatment causing or promoting apoptosis in within the pathological tissue in order to increase the therapeutic benefit.
  • an agent promoting apoptosis for example a conventional anti-tumor
  • the advantage of targeting apoptotic cells in the tumor environment lies in the kinetic effect linked to the administration of the compound anti-tumor: in the first case, the action of the therapeutic compound, if administered continuously, produces an increase in the "target” and therefore in the effective concentration of said therapeutic compound in the tumor environment, while, in the second case, the size of the "target” tends to decrease as well as the effective concentration of the therapeutic compound.
  • This cumulative effect resulting from the targeting of apoptotic cells is also very important for controlling the initial stages of metastasis by maintaining an optimal concentration of the therapeutic compound in the final stages of tumor regression.
  • the strong decrease in the effective dose of anti-tumor compound and its strong localization in the tumor region has of course also the effect of considerably reducing the secondary toxic effects on the patient.
  • the molecules of the invention therefore make it possible to target different pathological tissues and to release a therapeutic or biologically active agent therein in situ, thereby reducing their undesirable cytotoxic effects on healthy tissues.
  • a first subject of the invention therefore resides in chimeric molecules comprising a targeting region, an active region and a binding region sensitive to the environment of a pathological tissue or cell.
  • the targeting region is preferably a region targeting apoptotic cells.
  • the active region can be any therapeutic compound, typically anti-cancer or anti-inflammatory.
  • the therapeutic compound is typically less active when it is in the form of a chimeric molecule of the invention, than in a free form.
  • Another subject of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a chimeric molecule as defined above.
  • Another object of the invention relates to the use of targeting molecules as defined above for the preparation of medicaments.
  • these drugs are anti-tumor or anti-inflammatory drugs.
  • the invention can be used in particular for the treatment of solid or liquid or hematopoietic tumors, in particular of breast, lung, intestine, colon, prostate, brain, head and neck, liver cancers. , skin, lymphoma, melanoma, etc.
  • the therapeutic compound is an anti-inflammatory
  • the molecules according to the invention can be used for the preparation of medicaments intended for treatment of acute or chronic inflammatory pathologies such as asthma, ulcerative colitis, Crohn's disease, septic shock, collagen diseases and P arthritis.
  • Another object of the invention relates to the use of targeting molecules as defined above for the local delivery of active principles in the vicinity of pathological tissues in subjects.
  • the present invention also relates to methods of treating a pathology in a subject comprising the administration of a molecule or a composition as defined above.
  • the pathology concerned is cancer or inflammation.
  • the treatment method may further comprise a preliminary step consisting of a treatment making it possible to generate cells engaged in a process of apoptosis in the pathological tissue. It also relates to methods of local delivery of active principles in the vicinity of pathological tissues in subjects, comprising the administration of a molecule or of a composition as defined above.
  • the molecules of the invention typically comprise three parts or functional domains linked to each other, namely a targeting region (C), a biologically active region (A) and a binding region (L) sensitive to the environment of a tissue or pathological cell.
  • a targeting region C
  • A biologically active region
  • L binding region sensitive to the environment of a tissue or pathological cell.
  • the arrangement of the different elements can vary, and in particular according to the order A-L-C or C-L-A.
  • the region (or function) L can be inserted or included within one of the regions A or C.
  • Targeting segment C is a molecule capable of recognizing or preferentially binding cells engaged in a pathological process, preferably apoptosis; 2)
  • the binding segment L is a molecule ensuring the binding between A and C, said binding being cleavable at the target site allowing the release of the therapeutic segment A;
  • Part A is a biologically active molecule with therapeutic properties.
  • Targeting segment C comprises a polypeptide capable of binding to the surface of cells characteristically or specifically present in a tissue presenting a pathology, or generated in this tissue by a prior or combined treatment.
  • This targeting segment C is preferably capable of binding to the membranes of cells engaged in a process of apoptosis, these exposing on their surface negatively charged lipids such as phosphatidylserine.
  • part C comprises a polypeptide capable of preferentially binding to the surface of tumor cells or present in tumor tissue or generated in these tissues by treatment with an agent promoting apoptosis, for example an anti-tumor (chemotherapy, radiotherapy, etc.).
  • an agent promoting apoptosis for example an anti-tumor (chemotherapy, radiotherapy, etc.).
  • the targeting segment C comprises a polypeptide capable of preferentially binding to the surface of the cells present in an inflammatory tissue and in particular the neutrophil cells which accumulate in these tissues and die there by apoptosis 24 48 hours after their arrival.
  • Neutrophils are "baits" for targeting molecules.
  • the term "preferentially bind" indicates that the targeting element has a particular affinity for the cells or tissues considered, even if a non-specific or less important bond with other cells or tissues cannot be completely excluded in vivo.
  • the preferential bond nevertheless ensures targeting of the chimeric molecules of the invention towards the pathological sites, reducing the dissemination and the potential side effects.
  • the targeting segment C is preferably a peptide molecule.
  • peptide molecule is meant any molecule composed or comprising amino acids, natural or not, optionally modified, such as for example any protein or fragment of protein, a polypeptide or peptide, natural or synthetic, modified or not.
  • the common property of these elements is to be able to bind preferentially to cells characteristic of pathological situations and, in a more preferred mode, to cell membranes exhibiting negatively charged lipids, in particular phosphatidylserine.
  • the present invention provides for the use of any protein, fragment or derivative of protein meeting this criterion.
  • proteins capable of binding to membranes exposing negatively charged lipids. Mention may in particular be made of the Annexin family, the families of proteins comprising a Cl or C2 domain, such as factors V and VIII of blood coagulation; families of proteins comprising a PH domain or a FYVE domain; or proteins with an identical domain or homologous to domain 5 of ⁇ 2-Glycoproteins-I ( ⁇ GP-I). These proteins, or domains derived from or derived from their sequences can be used as a targeting element in the chimeric molecules of the invention. For reasons of immunogenicity, the human version of these proteins or protein domains is preferably chosen. In addition, whenever possible, it is necessary to select and use the smallest active domain of these proteins in order to ensure the best diffusion of the molecule through the micro-vascularization towards the targeted tissues and above all a better bio-distribution and elimination by the renal route.
  • the targeting element comprises a peptide sequence derived from the proteins or protein fragments mentioned above.
  • fragment is meant a sequence of at least 10 consecutive amino acids, preferably between 50 and 500 amino acids, even more preferably around 250 to 350 amino acids.
  • These derivatives have at least 50% identity with the initial proteins or the fragments thereof. Preferably, they have 60%, 75%, 90% or 95% identity.
  • Some of the protein domains mentioned, in particular the PH and FYVE domains can moreover be mutated so as to modify their lipid specificity to adapt them to the precise needs of targeting cells in the apoptotic phase.
  • the targeting segment C can contain one or more sites for binding to the segment L.
  • the presence of several sites has the advantage of being able to distribute several molecules therapeutic A in one go and increase in the same proportions the concentration of A in the environment of the tissues affected by the pathology concerned.
  • the structure of the molecule according to the present invention is then:
  • the targeting segment C can comprise a repetition of several polypeptides or motifs for binding to pathological or target cells (designated CO), in order to increase the efficiency of targeting.
  • the general formula of such molecules is as follows:
  • n 1 or 2.
  • the targeting segment C comprises the sequence of an annexin, or of a fragment or a derivative thereof.
  • Targeting segment C preferably comprises the sequence of the “four-domain heart” of a protein of the annexin family.
  • the annexin is of type V, a fragment or a derivative thereof.
  • Annexin of human origin is preferred.
  • the targeting segment C comprises domain 1 of this annexin.
  • the targeting segment C comprises a Cl or C2 type domain, a fragment or a derivative thereof. More particularly, the invention relates to targeting segments C comprising the sequence of a Cl domain of a coagulation factor, a fragment or a derivative thereof. Alternatively, the invention relates to targeting segments C comprising the sequence of a C2 domain of human coagulation factor VIII, a fragment or a derivative thereof.
  • the targeting segment C is a polypeptide constructed on the basis of a Cl-type domain topology.
  • the targeting segment C comprises a polypeptide of sequence chosen from SEQ ID Nos 1-8, preferably SEQ ID Nos 2-4, and 6-8, or a fragment thereof.
  • C1F8-S1 (SEQ ID No 6) KCQTPMGLAS GHIRDFQITA SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WLKIDLLAPM IIHGIKTQGA RQKFSSLYIS QYIIMYSLDG KKWQTYRGNS TGTLMVFFGN VDSSPHRMMYIR
  • C1F8-S2 (SEQ ID No 7) KCQTPMGLAS GHIRDFQITA SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WIKVDLLAPM IIHGVKTQGA RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRYNS TGTLMVFFGN VDSSGIKILRMPLYLRMPLYRMNP
  • C1F8-S3 (SEQ ID No 8) KCQTPLGMAS GHIRDFQITA SGQYGQWWPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WLKIDLLAPM IIHGIKTQGA RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRGNS TGTLMVFFGN VDLPGIRI
  • the targeting segment C is a polypeptide constructed on the basis of a C2 type domain topology.
  • the targeting segment C comprises a polypeptide of sequence chosen from SEQ ID Nos 9-16, preferably SEQ ID Nos 10-12, and 14-16, or a fragment thereof.
  • C2F5-S1 (SEQ ID No 10) CSTPLGMENG KIENKQITAS SFKKSWWGDY WEPFRARLNA QGRVNAWQPK ANNNKQWLEV DLLKIKKITA VITQGCKSLS SEMYVKSFTI HYSEQGVEWK PFRLKSSMVD KINEGNTNTK GHVKNFPNPP RISRFIRVIP KTWNQSITLR LELFGCDIY
  • the targeting segment C is a polypeptide constructed on the basis of a domain 5 topology of ⁇ 2-Glycoproteins-I ( ⁇ 2GP-I) (SEQ ID No 17).
  • the targeting segment C comprises a polypeptide of sequence chosen from SEQ ID Nos 17-22, preferably SEQ ID Nos 18-22, or a fragment thereof.
  • the targeting segment C comprises a polypeptide whose general sequence is as follows: TJ 2 ASCKU 7 PU 9 KJ 11 U 12 TU 14 U 15 U 16 J 17 GERU 21 J 22 U 23 QEKU 27 J 28 NGML
  • the targeting segment C comprises a polypeptide of sequence chosen from SEQ ID Nos 19-22 or a fragment thereof:
  • the targeting segment C comprises a polypeptide whose general sequence is as follows: jl. D 2d3. J 4_ J 5_ J 6. z 7_ u 8_ J 9_ J 10. u ll_ R _ J 13_ J 14_ u l 5 _ ⁇ _ G _ ⁇ 18_ G _ ⁇ _ J 21_ E _j23_ J 24_ u 25_ J 26_ J 27 . J 28_
  • amino acids J are chosen independently of each other from natural amino acids, or derivatives thereof, such that at least 50% of them are polar residues chosen from R, N, D , C, Q, E, G, H, K, Orn, P, S, T and Y,
  • amino acids U are chosen from A, C, G, I, L, M, F, W, Y, and V
  • - amino acid X 18 is chosen independently of the other amino acids of the sequence from A, N , C, Q, G, H, I, L, M, F, S, T, W, Y and V,
  • amino acid B 37 is chosen independently of the other amino acids of the sequence from R, A, C 5 G, I, L, M, F, W, Y, and V,
  • amino acid Z 7 is chosen independently of the other amino acids of the sequence from D and E,
  • the amino acids Z 59 and Z 65 are chosen independently from E, D, K, and R, the exponents indicating the position of the amino acids in the sequence.
  • the amino acids J can be chosen independently of each other from the set of residues A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, Orn, F , P, S, T, W, Y, and V, and in such a way that at least 50% of them are polar residues chosen from R, N, D, C, Q, E, G, H, K, Om, P, S, T.
  • the peptide of formula S1 can advantageously be a peptide sequence chosen from the peptide sequences SEQ ID No 23-32.
  • the sequence S1 represents a type of peptide in its shortest form. It is understood that this sequence can also comprise one or more additional amino acids at one or the other of the ends, for example from 1 to 15 amino acids, in general from 1 to 10 amino acids to obtain additional functionalization. .
  • a small sequence called a functionalization sequence, can be linked to the peptide allowing attachment to the L segment.
  • This functionalization sequence can be located at the N-terminal end of the sequence S1. It can be around 3 amino acids preferably chosen from GSC-, GST-, GSP-, GSS-, GSG-, and GSQ-.
  • These functionalization sequences are advantageous in that they allow in particular easy labeling by radio-tracers such as 99m Tc or 18 F and allow, by injection into humans at a tracer dose, to follow in vivo the fate perfectly. of the drug, its bio-distribution and to control its good localization.
  • sequence S1 can be duplicated within the same peptide to produce a molecule exhibiting an even higher affinity for the apoptotic sites.
  • the segment L is a binding molecule cleavable at the target site, and connecting part A and part C.
  • Segment L can be any molecule or chemical bond, of covalent type, including molecules in part or totally of peptide nature , modified or not, natural or not.
  • the L segment advantageously contains a recognized chemical function which can be cleaved in the environment of the tissue or pathological cells, for example by an enzyme or a set of enzymes specific to the environment of the targeted cells.
  • linker segment L which can be cleaved preferentially in the environment of the targeted cells allows a local and targeted release of the active principle and gives the molecules of the invention a behavior of the targeted pro-drug type. Indeed, the molecule is not very active as long as it does not reside in the environment of the targeted cells possessing the enzymes or other cleavage factors.
  • the linking segment L can be simple or branched.
  • the advantage of a branching is to be able to bring and distribute several therapeutic molecules with a single targeting molecule C.
  • the L (or LO) segment can be of a varied nature, such as a bond or chemical molecule, and in particular of a peptide nature.
  • the L segment is a cleavable peptide link sensitive to proteases (or other enzymes), called in the following text "intervening proteases", more specifically overexpressed either on the surface of cells presenting the pathology, either released into the environment of the target cells, or even released by the cells in the apoptotic phase.
  • proteases or other enzymes
  • Tumor and inflammatory cells are known to excrete a variety of intervening proteases, in particular metallo-proteases of the extracellular matrix (MMP) , urokinases, specific proteases for the cleavage of the extracellular segment of membrane cytokines or their receptors (ADAM), etc.
  • MMP extracellular matrix
  • urokinases metallo-proteases of the extracellular matrix
  • ADAM membrane cytokines or their receptors
  • sequences cleaved by these proteases are given in Table 2.
  • These intervening proteases play an important role in the evolution of the tumor or of the inflammatory tissue and in particular in the invasion of the surrounding tissues and the formation of metastases, or l invasion by specialized inflammatory reaction cells.
  • the level of MMP in the tumor or inflammatory environment is much higher than that present in normal tissue because, in particular, the control of the expression of these MMPs depends on the action of certain cytokines. It is therefore possible to take advantage of this expression differential to amplify the principle of targeting of the anti-tumor or anti-inflammatory compound by only allowing activation of this compound at the targeting sites.
  • Simple pro-drugs have already been designed but they do not solve the problem of uniform distribution of the drug throughout the body because there is no accumulation of the pro-drug within the cancer tissue or inflammatory.
  • the present invention a means is proposed to accumulate the antitumor or anti-inflammatory principle only in tumor or inflammatory tissue already comprising cells in the process of apoptosis, and to make the drug active essentially in this tissue.
  • the CL or LC assembly constitutes a vectorization-activation system of anti-tumor or anti-inflammatory compounds. This together therefore meets the following double imperative: reduce the average effective concentration of the drug in the body, that is to say reduce the secondary toxic effects, and restrict the action of the drug to the only tissue of interest, that is to say increase its efficiency.
  • the cleavable linker segment L is therefore an at least partially peptide link comprising a sequence recognized and cleaved by an intervening protease mainly present in the targeted tissue.
  • the L or LO link can therefore be represented as comprising two parts, L1-L2, designed such that the intervening proteases cleave the peptide bond of the link between L1 and L2 and that the released molecule L2-A or A-L1, depending on the molecules chosen, ie a molecule which is therapeutically active, preferably at least as much as the initial molecule A.
  • the length of the parts L1 and L2 can be optimized as a function of the accessibility necessary to the active site of the intervening proteases, with the constraint limit as much as possible the final size of the final molecule for the reasons mentioned above.
  • L (L1-L2) n -D (F5B) where D, Ll, L2 and n have the definition given above.
  • connection between the different functional elements of the molecules of the invention can be carried out by any chemical, enzymatic or genetic coupling method known per se to those skilled in the art.
  • they can be chemical, peptide, nucleic bonds, etc.
  • the groups can be coupled together by maleimide, succinimide, intein, biotin, amino, amide, carboxylic, phosphate, ester, ether, etc. bonds.
  • the link L is linked to the molecule C (and / or A) by a maleimide group, known for its rapid and total reaction with a thiol group carried by an accessible cysteine residue from the targeting segment C (and / or of molecule A).
  • the link L is linked to the molecule C (and / or A) by reaction of the terminal carboxylic group of the peptide L with an amino group carried by the therapeutic segment A (or targeting C).
  • the linking segment L is coupled to the C-terminal (in the case of an H 2 NLA molecule) or N-terminal (in the case of an AL-COOH molecule) end of the segment C by means of an intein.
  • the segment L (or the cleavage function) is part of the element C or A. It can be for example an N-terminal or C-terminal extension of the segment C or A, especially when the latter is peptide in nature.
  • the molecules of the invention can be assembled in one or more steps, depending on the coupling techniques used.
  • a CL type molecule can be produced first, then coupled with one or more therapeutic molecules A.
  • the connections between the functional segments call for different chemical reactions, simultaneous synthesis or assembly is possible .
  • the purely peptide version of the L link is preferably obtained by direct synthesis, using in particular the common peptide synthesizers and conventional methods of synthesis, especially in solid phase.
  • the advantage of the direct synthesis of the link is that it allows the use of non-natural amino acid residues thus allowing better adaptation of the sequence to the intervening proteases.
  • This recognition sequence can also be modified with respect to the natural recognition sequence by an enzyme or a cleavage factor, for example to give it a better affinity or specificity towards the protease in question.
  • the length of the link segment can be adapted by a person skilled in the art according to the needs and the nature of the segments C and A. In general, a Fairly short and essentially non-immunogenic linker. It is typically a segment of peptide nature comprising from 3 to 20 amino acid residues, preferably from 3 to 15, even more preferably from 4 to 12. In certain cases, as indicated below, it can be interesting to modify the length of the segment L, in particular to distance the peptide part from the segment C or A, or to create molecules with particular function (penetration in the cell, action on neighboring cells, etc.).
  • L or LO can take one of the following two structures:
  • L'1 is a non-peptide spacing group and L "l is the peptide part proper;
  • L'2 is a non-peptide spacing group and L "2 the peptide part proper.
  • the non-peptide spacer group can be chosen from any synthetic chemical molecule, preferably chemically stable and not very immunogenic. It may especially be a polymer, for example of the polyoxyethylene, dextran, polyethyleneimine, etc. type. A preferred example is polyoxyethylene, functionalized or not.
  • L “l-L2 and L1-L” 2 can represent the same peptide. Furthermore, the number of residues of the peptide segments L “l-L2 or Ll-L” 2 can vary from four to more than twenty, the optimal value being of the order of six.
  • the cleavable link segment corresponds to the following formula:
  • n and c can vary from 0 to around 10 and depend on the end chosen for the connection to segment A; for the end linked to A, the value of n or c will be low and preferably equal to 0 (J 3 only present) and for the opposite end the value of n or c is not limited and the corresponding residues will be chosen according to the specificity of the targeted intervening proteases.
  • the sequences J- 1 -J 0 and J 3 -J 4 which frame the cleavage site B 1 -B 2 are involved in the interactions of the link with the targeted protease and therefore on the speed of the enzymatic reaction to cut the link B 1 -B 2 .
  • Jo GIy, AIa, Leu, Ile, Val, Phe and any hydrophobic non-natural amino acid residue.
  • J 3 GIy, AIa, Leu, He, Val, Phe
  • J 4 GIy, AIa, Leu, Ile, Val, Phe or any hydrophobic or absent non-natural residue
  • the other residues, J-2 ⁇ J-n and J5 ⁇ Jc can be any natural or unnatural amino acid residue as required.
  • the length and / or the properties of the linking segment can be adjusted, for example to construct a molecule allowing the therapeutic compound A to interact with or to penetrate into a cell neighboring the target cell on which the segment C leads her.
  • the link segment L: - must be long enough to reach neighboring cells.
  • a chemical oligomer for example of the polyoxyethylene type, is preferably chosen, comprising a sufficient number of monomers so that the length of the link is approximately 80 to 200 angstroms, typically 130 to 150 angstroms; and / or - comprises a domain allowing or facilitating the passage of A through the cell membrane and, where appropriate, a cleavage region sensitive to intracellular enzymes.
  • the link advantageously has one of the following two structures:
  • L or L0 A-L3-LMT-LE (F9B) where LE is an essentially extracellular part of the link, LTM a transmembrane part and L3 a function or element cleavable by proteases or intra-cellular esterases (eg, cytosolic).
  • the LE part is preferably sufficiently hydrophilic to allow suitable solvation in an aqueous medium in order to obtain a sufficiently extensive structure.
  • the LTM part of a length at least equal to about 40 ⁇ , preferably be sufficiently amphiphilic so that, on the one hand, its structure in the extracellular aqueous medium remains weakly compact and that, on the other hand, it can cross the hydrophobic medium of the plasma membrane.
  • LMT - [O- (CH2) q -O] - (Fl 1) where q and p are whole numbers different from 0, q> p so that, for LMT, the lipid environment of the membrane is at more favorable energy plan than the aqueous environment.
  • the values p 2 and 5>q> 3 are preferable.
  • the targeting element can be synthesized by techniques known per se from chemistry or biology.
  • the element C-L also constitutes a particular object of the invention.
  • the invention can be implemented with any type of therapeutic molecule capable of being associated with the C segment. They may be chemical compounds, drugs, small molecules, etc.) of peptide, nucleic, lipid, etc. compounds. .
  • therapeutic segment A is a molecule exhibiting biological activity.
  • this biological activity is reduced (or nonexistent) when the therapeutic segment is linked to the L-binding and targeting C segments. Therefore, the biological activity is expressed mainly in the environment of pathological tissues, after targeting. and cleavage in vivo.
  • Therapeutic compounds can have various properties, in various therapeutic fields. These may be already known drugs, or new or developing molecules. They may be compounds whose mode of action involves penetration into cells or whose action only involves interaction with the surface of the plasma membrane.
  • the preferred compounds A of the invention are anti-tumor or anti-inflammatory.
  • the biologically active molecule has anti-tumor properties.
  • A can be any anti-tumor molecule or an active derivative of these same molecules. The only constraint is that these anti-tumor compounds can be linked chemically to the rest of the vectorization molecule.
  • A can be released into the extracellular medium and passively or actively diffuse inside neighboring cells or else be brought into these cells by a link of the LE-LMT type and then released by the action of endogenous proteases or esterases.
  • An example of an anti-tumor compound is constituted by the molecules of the antracycline family and their derivatives.
  • antacycline molecules contain an amino sugar.
  • the amino group is advantageously used for the link to the L segment (for example to the L2 or LMT part) of the link defined above.
  • an anti-tumor compound is constituted by molecules of the TNF ⁇ family or derivatives thereof. These molecules act on cell surface receptors and induce apoptosis.
  • the factor TRAIL or A ⁇ o2L (P_W19777) is probably the most interesting since normal cells seem to be protected from its action whereas tumor cells are sensitive to it and can be selectively eliminated by it. action of this pro-apoptotic cytokine.
  • This factor can therefore be very useful in so-called “solid” cancers, which implies effective targeting to avoid as much as possible the side effects due to the presence of these molecules in the blood.
  • TRAIL is initially a membrane protein associated in trimer and only the extracellular part is active.
  • TRAIL-Do This extracellular part, TRAIL-Do, or a set containing TRAIL-Do, can therefore be targeted thanks to the C segment and released in the inter-cellular space thanks to the action of proteases intervening on the cleavable link L which connects C and TRAIL-Do.
  • the therapeutic molecule thus constituted has the following structure:
  • trimer assembly of the molecules of the TNF family necessary for binding to their receptors, is hampered by the presence of the targeting and binding segments.
  • the molecule remains weakly active as long as the link is not cleaved by an intervening protease.
  • the cleavable link must have a sufficiently short length while retaining suitable accessibility to the intervening proteases.
  • cytokine Another example of a cytokine, which is very interesting for the treatment of certain cancers and in particular melanoma and intracranial glioma, is Interleukin-4 (IL4, 1310839).
  • IL4, 1310839 Interleukin-4
  • This protein cannot be used without being properly targeted.
  • the binding to a targeting segment C of human IL4 or one of its isoforms or of an assembly containing one of these proteins, via a cleavable segment makes it possible to constitute a therapeutic molecule interesting in oncology:
  • anti-tumor compounds are in particular:
  • Methotrexate is an anti-tumor compound commonly used for the treatment of cancerous tumors. It is an analogue of folic acid which first acts as a false substrate by inhibiting dehydrofolate reductase (DHFR). It also acts by indirect inhibition of thymidilate synthetase (TS).
  • DHFR dehydrofolate reductase
  • TS thymidilate synthetase
  • Methotrexate contains an amino acid, glutamic acid, which can be inserted into the N-terminus of a cleavable link peptide according to the formula (F6B) or (F4B).
  • 2-methoxyestradiol (1,3,5 (10) -oestratriene-2,3,17 ⁇ -triol 2-methyl ether) called 2ME 2 , is a byproduct of the metabolism of estrogens having the property of blocking the growth of cells rapidly dividing endothelial cells and tumor cells.
  • the molecules of this family have the effect of blocking the cell cycle in G2 and M by their action on the microtubular cytoskeleton. This results in an inhibition of the normal reorganization necessary for the progress of the interphase of mitosis.
  • Taxanes and in particular docetaxel, contain functions which can be used for modifications allowing its incorporation at the end of a peptide cleavable by the proteases intervening in the tumor environment.
  • R 1 tBuOCO
  • R 2 H (docetaxel)
  • R, C 6 H 5 CO
  • R 2 Ac (paclitaxel)
  • cytosine arabinoside or cytarabine or Aracytine is the main representative of this family.
  • Other molecules in this family are difluoro-deoxy-cytidine (Gemcitabine).
  • these agents Derived from "nitrogen mustards”, these agents have given rise to various anti-tumor compounds acting on nucleic acids and therefore in the intra-cellular space. These are in particular Melphalan and Chlorambucil, two bifunctional alkylating agents of interest for easy bonding to a cleavable peptide bond.
  • Melphalan is Phenylalanine-Mustard (L-PAM) is an unnatural amino acid which can be introduced easily at the beginning or at the end of the peptide synthesis of a cleavable link by intervening proteases:
  • Chlorambucil only has a carboxylic function and can only be introduced directly into a peptide at the end of synthesis of the peptide link cleavable by the intervening proteases and at the N-terminal end.
  • this compound can also be introduced at the C-terminal end of the cleavable peptide link.
  • the molecule released in the tumor environment is a hydrophobic amino acid derivative such as, for example, Leu-Melphalan or Chlorambucil-Leu.
  • hydrophobic amino acid derivative such as, for example, Leu-Melphalan or Chlorambucil-Leu.
  • the biologically active molecule has anti-inflammatory properties.
  • NTAl N-terminal segment of annexin I
  • the anti-inflammatory properties of this peptide probably result from its action on the receptor of the fMLP thus inhibiting the chemotaxis and the activation of phagocytic cells and in particular their degranulation and their production of toxic oxygen metabolites.
  • the sequence of the N-terminal segment of human annexin I is as follows:
  • the anti-inflammatory peptide derived from the N-terminal segment of annexin I will advantageously be chosen from the following sequences:
  • the underlined sequence represents a so-called consensus sequence having the desired anti-inflammatory properties. Under each variable residue of this sequence is indicated a list of residues which can replace that indicated in the consensus sequence: an acid residue; h hydrophobic residue; p polar residue; o Thr or Ser preferably.
  • protease capable of specifically cleaving the NTAl segment at the level of one of the two residues Lysine 25 or 28 present in its N-terminal part -Thr-Val-Lys-Ser-Ser-Lys -Gly-Gly-, These proteases are normally responsible for the in vivo release of the N-terminal segment of annexin I.
  • the NTA1 peptide or a judiciously mutated version is simply integrated into the N-terminal part of the C segment for the
  • segment C is taken here in its widest sense and defined above.
  • the NTA1 peptide or a judiciously mutated version is linked to the C segment via a simple link cleavable by an intervening proteases according to the formula F6A or F6B or a multiple link comprising an element of branch D as defined above (F5A, F5B).
  • part A can also contain a repetition of one of the sequences chosen for the NTA1 segment in order to increase the local concentration of the anti-inflammatory peptide and therefore its effectiveness.
  • NTAl 1n -C (F2)
  • NTAl segment it may be advantageous to link the NTAl segment to the C-terminal end of the C segment.
  • a bifunctional link will be used so as to connect the C-terminal ends of C and NTAl: CL-NTAl
  • Chronic inflammatory diseases are caused by a large imbalance in the production in the cellular environment of a number of signaling molecules.
  • the amplification and sustainability of the inflammatory phenomenon in these diseases results from a complex balance between a large number of proteins with opposite influences, pro-inflammatory molecules and anti-inflammatory molecules.
  • interleukin 10 (SwissProt, P22301), or on any of its isoforms, is the most interesting by the regulatory effect it produces on the inflammatory reaction .
  • IL10 has multiple functions including functions of stimulation of the immune system. It is therefore very advantageous to target this protein at the inflammatory site proper so as to strictly localize its action.
  • IL10 acts as a homodimer on its hetero tetrameric receptor.
  • the three-dimensional structure of PILlO and the complex with its receptor, PILlOR offers an additional advantage.
  • the structure of the IL10-IL10OR complex shows that the N and C-terminal ends of PIL10 are relatively close in structure.
  • the N-terminal end is buried in the heart of the receptor and the C-terminal end is located in the dimerization region of this cytokine. Therefore, blocking by the C-L or L-C segment of one of the N or C-terminal ends of PIL10, prohibits the formation of the complex and finally blocks its action.
  • PIL10 can therefore only be done by the action of proteases intervening in the inflammatory environment which have the effect of releasing this cytokine exclusively in this environment.
  • P35225 another anti-inflammatory cytokine
  • P35225 another anti-inflammatory cytokine
  • the therapeutic molecule based on PILlO or PILl 3 has one of the following general structures, depending on the choice made for the positioning of PILlO or PIL13: CL '1 -L "1 -L2- (IL10 / IL13) (according to the formula F6A) (ILl 0 / IL13) -Ll -V '2-L'2-C (according to formula F6B)
  • the cleavage site of the intervening proteases is provided between L “l and L” l or between L “2 and L'2.
  • the length of the residual segment L” l-L2 or Ll-L “2 is such that it does not interfere not the formation of the IL10-1L10R or IL13-IL13R ⁇ l / 2 complex It is easy to adjust the effective sequence of PIL10 to satisfy this constraint In either case the L1 or L2 segment may be absent.
  • Therapeutic segment A can be selected from non-activating inhibitors of membrane receptors for pro-inflammatory cytokines.
  • IL1 interleukin 1
  • PILlR soluble inhibitor of the PIL1 receptor
  • sILIRa Small protein
  • the efficacy of sILIRa has been tested in various diseases and in particular in rheumatoid arthritis and has been shown to be relatively active.
  • the doses used in patients under subcutaneous injections are enormous, from 30mg to 150mg.
  • the pharmacokinetics is also unfavorable since the half-life time in the circulation is only 21 min, which is very short for therapeutic use in the case of rheumatoid arthritis.
  • the C-L- (ILlRa) or (ILlRa) -L-C group is completely inactive.
  • the structure of the ILlRa-ILlR complex shows that the N and C-terminal ends of PILlRa are very close in structure and are buried at the heart of the receptor. Therefore, the activation of the inhibitor can only be done by the action of proteases intervening in the inflammatory environment which have the effect of releasing the inhibitor exclusively in this environment.
  • the therapeutic molecule based on PILlRa or on any of its isoforms has one of the following general structures, depending on the choice made for the positioning of PILlRa:
  • the cleavage site of the intervening proteases is provided between L “l and L” l or between L “2 and L'2.
  • the length of the residual segment L" l-L2 or Ll-L “2 is such that it does not interfere not the formation of the IL1-ILlRa complex.
  • PILlO it is easy to adjust the effective sequence of PILlRa to satisfy this constraint.
  • the L1 or L2 segment may be absent.
  • Glucocorticoids There are many non-peptide molecules with important anti-inflammatory properties such as Glucocorticoids, non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), Methotrexate. a) Glucocorticoids:
  • Glucocorticoids are natural hormonal molecules produced by the body and are involved in many physiological processes. Their action is strictly intracellular and intervenes by their binding to nuclear receptors inducing the transcription of a certain number of genes, hence the complex role of these hormones at multiple stages of the inflammatory reaction.
  • the use of Glucocorticoids and their non-natural derivatives as a medicine is therefore always very delicate, while their effectiveness can be very great. Their targeting and strict release into the inflammatory environment is therefore crucial.
  • Glucocorticoids are steroid molecules, therefore quite hydrophobic, and their action takes place at the level of the cell nucleus after passive diffusion through the plasma membrane. For use as a targeted drug, Glucocorticoids can therefore simply be released into the inflammatory environment.
  • All of these molecules have chemical functions, for example hydroxyl groups, allowing their grafting on peptide molecules and in particular on an L segment cleavable by intervening proteases as for anti-tumor compounds.
  • the Glucocorticoids-based therapeutic molecule has one of the following general structures, depending on the choice made for positioning the molecule with respect to the targeting segment: CL '1 -L "1 -L2- (0-Glucocorticoid) (according to formula F6 A) (Glucocorticoid-0) -Ll-L '' 2-L'2-C (according to formula F6B)
  • the action of the intervening proteases releases either the L “l-L2- (O-Glucocorticoid) molecule or the (Glucocorticoid-O) -Ll-L” 2 molecule, that is to say a pro-drug which must passively diffuse in the surrounding cells where they will be treated with endogenous proteases and esterases to finally release the active molecule.
  • the segments L “l-L2 or Ll-L” 2 be hydrophobic and as short as possible, taking into account the cleavage capacities of the intervening proteases. It is advantageous to limit the number of residues to two or even to one the number of residues in L "l or L" 2. It may also be advantageous not to introduce the segments L1 or L2.
  • Nonsteroidal anti-inflammatory drugs are mostly inhibitors of cyclooxygenases (COX-I and COX-2), important enzymes involved in the metabolism of arachidonic acid. These are drugs generally reserved for the treatment of severe inflammatory diseases and used in generally very high doses and therefore generating undesirable side effects.
  • COX-I and COX-2 cyclooxygenases
  • these drugs generally reserved for the treatment of severe inflammatory diseases and used in generally very high doses and therefore generating undesirable side effects.
  • NSAIDs there is a class of compounds having a carboxylic function which can be used for their grafting on peptide molecules and in particular on an L segment cleavable by intervening proteases as for the anti-tumor or anti-inflammatory compounds mentioned above.
  • Methotrexate also has anti-inflammatory properties and can be used in the same way as for its anti-tumor properties described above.
  • PCRDX a peptide, here called PCRDX, comprising at least the CRDl domain of any TNFR X to block the trimerization of the latter in a very specific manner and therefore block its function: by binding to a membrane subunit of TNFR (monomer), the free PCRDX peptide, in the form of monomer or dimer, blocks the trimerization of this membrane subunit without activating the receptor since the latter can no longer acquire its trimeric structure.
  • PCRDX peptide or a mutated version of this domain, linked to the C segment by an L1-L2 link cleavable by one of the intervening proteases generally present in the inflammatory environment so as to release the inhibitor only at the targeted inflammatory site.
  • the general structure of the therapeutic molecule of the present invention is therefore: C-L1-L2-PCRDX or PCRDX-Ll -L2-C Where the cleavage takes place between Ll and L2.
  • the C-L1-L2-PCRDX structure is directly active because it leaves the C-terminal end of CRDl free, allowing it to bind to CRDl of a cellular receptor.
  • the PCRDX-L1-L2-C structure has the additional advantage of only making the CRDl segment active when it is released by cleavage of the L1-L2 segment, thereby limiting the risk of side effects accordingly.
  • the C-terminal end of the PCRDX is congested by the presence of the L1-L2-C segment, unsuitable for any interaction with an extracellular domain of a TNFR, thus making its interaction more difficult.
  • the activity is recovered by the cleavage of the link L1-L2.
  • sequences can be mutated, in particular in the region of interaction with the original TNFR1 and TNFR2 receptors, in order to increase their affinity with these receptors.
  • Analogous sequences from any TNF family cytokine receptor can be used to produce specific inhibitors for these receptors.
  • the cleavable link L1-L2 can be advantageously chosen from the peptide sequences recognized and cleaved by specific proteases whose role is to release the extracellular part of the membrane TNFRs or of the membrane precursors of the TNFs.
  • proteases belong to the family of ADAMs already mentioned.
  • ADAM-17 or TACE protease specific for the release of TNF ⁇ and TNF ⁇ (LT ⁇ ) will be chosen and the sequence of the L1-L2 segment will therefore be chosen so that it contains one of the following sequences:
  • L1 * L2 SPLAQA * VRSSSR (SEQ ID No 38) or fragments thereof, PLAQ A * VRSSS (SEQ ID No 39), LAQA * VRSS (SEQ ID No 40), AQA * VRS (SEQ ID No 41) , QA * VR (SEQ ID No 42), or any combination of the groups of sequences located on either side of the cleavage site marked with an asterisk, for example.
  • the molecules of the invention can be constructed to target different types of pathological cells or tissues, preferably in humans. They can be used for the preparation of medicaments and / or in methods of therapeutic treatment.
  • a particular object of the invention consists of a pharmaceutical composition comprising a chimeric molecule as defined above.
  • Another object of the invention relates to the use of a chimeric molecule as defined above for the preparation of a medicament.
  • these drugs are anti-tumor or anti-inflammatory drugs.
  • the molecules according to the invention can be used for the preparation of medicaments intended for acute pathologies such as asthma, ulcerative colitis, Crohn's disease, septic shock, diseases collagen and arthritis.
  • the invention can be used for the treatment of various tumors, in particular solid or liquid or hematopoietic tumors, in particular breast, lung, intestinal, colon and rectum, brain, meninges, stomach, esophagus, liver, pancreas, bladder, head and neck, male or female reproductive systems, skin, etc.
  • tumors in particular solid or liquid or hematopoietic tumors, in particular breast, lung, intestinal, colon and rectum, brain, meninges, stomach, esophagus, liver, pancreas, bladder, head and neck, male or female reproductive systems, skin, etc.
  • compositions of the invention can comprise any pharmaceutically acceptable excipient or vehicle, such as salt, solutes, etc. It can be saline, buffered, isotonic, water, etc.
  • the compositions may further comprise other active agents, used in combination, simultaneously, separately or spaced over time.
  • Another object of the invention relates to the use of targeting molecules as defined above for the local delivery of active principles in the vicinity of pathological tissues in subjects.
  • the present invention also relates to methods of treating a pathology in a subject comprising the administration of a molecule or a composition as defined above.
  • a pathology concerned and cancer or inflammation Preferably, the pathology concerned and cancer or inflammation.
  • the treatment method may further comprise a preliminary step consisting of a treatment making it possible to generate cells engaged in a process of apoptosis in the pathological tissue. It also relates to methods of local delivery of active principles in the vicinity of pathological tissues in subjects, comprising the administration of a molecule or of a composition as defined above.
  • treatment designates preventive, curative, palliative treatment, as well as the management of patients (reduction of suffering, reduction of the size of a tumor or of the progression of pathology, improved lifespan, slower disease progression, decreased inflammatory site), etc.
  • the treatment can also be carried out in combination with other agents or treatments (chemotherapy, radiotherapy, gene therapy, etc.).
  • the treatments and medicaments of the invention are very particularly intended for humans.
  • the therapeutic compound can be used at different doses and according to different protocols.
  • the administration can be carried out by any method known to those skilled in the art, preferably by injection, typically by intraperitoneal, intra-tumor, intradermal, intra-cerebral, intravenous, intra-arterial or intramuscular route.
  • the doses administered can be adjusted by those skilled in the art. Typically, from about 0.01 mg to 100 mg / kg are injected. It is understood that repeated injections can be carried out.
  • the invention can be used in mammals, in particular in humans.
  • Example 1 Example of the production of cleavable L segments for the release of anti-tumor and anti-inflammatory compounds:
  • L segment is only peptide and contains only natural residues, it will preferably be integrated into the C segment at its N or C-terminal end by the conventional methods of molecular biology. H can however be integrated if necessary into segment A if that is peptide and obtained by molecular biology.
  • the L segment or the LA unit in a reactive form for a later connection to the C segment.
  • An interesting example occurs in the case where a thiol group brought by a Cysteine residue is present in segment C, preferably far from the site of binding of C to negatively charged membranes. This thiol group makes it possible, by a simple, rapid and total chemical reaction, to link the L-A assembly provided with the maleimide functional group.
  • the synthesis protocol is described in FIG. 1.
  • the fragment L consists of a protected peptide linked to an acid-labile resin rink via the FMOC strategy well known to those skilled in the art.
  • the reactive fragment has the property of forming a covalent bond with a nucleophilic group - here the SH group of a Cysteine - of protein C.
  • the reactive group can be a bromoacetamide or, as here and more advantageously, a maleimide group .
  • the spacer group between the maleimide and the peptide L can be an alkyl, alkoxy or poly alkoxy group terminated by a carboxylic function for coupling to L.
  • FIG. 1 The fragment L consists of a protected peptide linked to an acid-labile resin rink via the FMOC strategy well known to those skilled in the art.
  • the reactive fragment has the property of forming a covalent bond with a nucleophilic group - here the SH group of a Cysteine - of protein C.
  • the therapeutic segment is an anti-tumor compound of the antracycline family, doxorubicin.
  • AA represents any amino acid sequence which may constitute a cleavable link. The example described below corresponds to the sequence AA ⁇ Gly-Ser-Gly-Val-Leu.
  • the filtered resin is washed with 40 ml (for 30 s each time) with the following solvents: 3 times methanol, 3 times DCE, 3 times DMA.
  • the unreacted hydroxyl groups of the resin are blocked with acetic anhydride (13.5 mmol) in 3 ml of pyridine and 15 ml of DMA and then the resin is washed as follows (40 ml each time): 2 times isopropanol, 3 times DMA, 2 times isopropanol, 6 times DCE, 2 times isopropanol, 3 times DMA, 3 times isopropanol.
  • the resin is then dried under vacuum and has an Fmoc content of approximately 0.35 mmol / g.
  • DMA 2 times DMA, 1 time isopropanol, 4 times DMA.
  • the resin is dispersed in DCM and treated with 20 ml of AcOH / DCM cleavage mixture (10/90 v / v) for one hour then is filtered, washed 3 times with 20 ml of cleavage mixture then 3 times 20 ml of DMA to extract the peptide from the resin. Hexane (15 times the volume) is added to the filtrate to remove acetic acid in azeotropic form. The resulting protected peptide is dried under vacuum and purified by "flash" chromatography.
  • Example 2 Synthesis of a mixed peptide and non-peptide link for the release of anti-tumor compounds.
  • the non-peptide part of the link is introduced using the compound (12), obtained according to the diagram in FIG. 2, replacing the N-maleoyl- ⁇ -alanine used in the previous synthesis (FIG. 1).
  • the compound (12) is then used as the compound N-maleoyl- ⁇ -alanine for the synthesis of a mixed cleavable link according to the protocol described in Figure 1 for the compounds (5) and (6).
  • Example 2b Synthesis of an arm comprising a spacer group and a cleavable peptide group and coupling on the one hand to a targeting molecule C and on the other hand to doxorubicin.
  • the lyophylisate was taken up in a H2O / DMSO 50/50 mixture (2 ml) and was purified by HPLC (Source column 15RPC 10 ⁇ 250 mm). The fraction corresponding to the final compound C-S- (12) was collected and then lyophilized.
  • the final compound C-S- (12) was subsequently subjected to the action of the various proteases (MMP2, MMP3 and MMP9) according to the following protocol:
  • NTAIl Two constructions are proposed, one corresponding to the long version of NTAl named NTAIl, according to the sequence S7 (Seq ID 33) and the other to the short version, named NTAIc, according to the sequence S8 (Seq ID 35).
  • the pGEX 6Pl plasmids used are commercial (Amersham biosciences) as well as the enzymes (Biolabs) used: BamH I, EcoR I, Ban II, T4 DNA Ligase, CIP, T4 kinase.
  • the expression vector used is the vector pGEX 6Pl (Amersham-Biosciences). This vector allows the expression of the protein of interest fused to the GST at its Nter end. The protein of interest is recovered without fusion protein after digestion by the PreScission.
  • the coding sequence of segment C (from the vector pGEX2T, constructed in the laboratory) will be inserted into this vector between the BamH I and EcoR I sites.
  • the NTAII or NTAIc segment will then be inserted in the form of cassettes in the vector pGEX 6P containing the coding sequence of the C segment between the Ban II and BamH I sites.
  • the vector pGEX 6P has two Ban IL sites.
  • the first step therefore consists in making this site unique in order to use it as a cloning site for the NTA1 segment.
  • the Ban II site located at position 3890 is removed by a silent directed mutagenesis step (Quick Change kit, Stratagene, Ban II + and Ban II - oligos) following the supplier's recommendations.
  • the plasmid "pGEX-6P-mut" is then obtained.
  • the coding sequence of segment C is extracted from the plasmid pGEX2T by enzymatic digestion using the restriction enzymes BamH I and EcoR I (Biolabs). Briefly, 20 ⁇ g of DNA is digested sequentially with 200 U of enzyme, at 37 ° C. overnight. After each digestion, the DNA is purified after migration on agarose gel using the “GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit” (Amersham-Biosciences) kit. 20 ⁇ g of plasmid "pGEX-6P-mut" is also digested under the same conditions with BamH I and EcoR I in order to obtain the vector in which the coding sequences will be inserted.
  • BamH I and EcoR I Biolabs
  • the latter is dephosphorylated by an incubation of 2 h at 37 ° C. in the presence of 2 U of CIP (Biolabs).
  • the vector “pGEX-6P-mut”, opened in BamH I / EcoR I and dephosphorylated, is then purified using the Amersham kit.
  • Ligation of the coding sequence of segment C (10 moles of insert for 1 mole of vector) in the vector “pGEX-6P-mut” is then carried out by incubation for 2 h at room temperature in the presence of 400 U of T4 DNA ligase (Biolabs).
  • the pGEX-6P-mut plasmids containing the C segment coding sequence are then obtained.
  • NTA11 and NAlc cassettes are obtained by hybridization of 100 pmol of the complementary oligos (NTAlc + / NTAlc - and NTAIl + / NTAIl -) at 95 ° C for 5 min in a 20 mM Tris HCl buffer ⁇ H7.5; 300 mM NaCl; 1 mM EDTA.
  • the 5 ′ ends of the cassettes are then phosphorylated by an incubation at 37 ° C. for 2 h in the presence of 50 U of T4 polynucleotide kinase (Biolabs). The enzyme is inactivated by incubation at 65 ° C for 20 min.
  • the last step consists in digesting the plasmids pGEX-6P-mut the coding sequence of segment C by Ban II and BamH I in order to insert the cassettes.
  • 20 ⁇ g of DNA is digested sequentially with 50 U of Ban II and 100 U of BamH I, at 37 ° C. overnight.
  • the DNA is purified after migration on agarose gel using the Amersham kit.
  • the dephosphorylation of the vectors is carried out by incubation at 37 ° C for 1 hour in the presence of 10 U of CIP, in order to avoid their recircularization during the ligation step.
  • the ligation of the cassettes in the vectors is carried out as described above.
  • the NTAIc-C and NTAII-C sequences cloned in the vector pGEX-6P-mut are therefore obtained.
  • DNA sequences are checked with the Big Dye Terminator sequencing kit, Perkin-Elmer Applied Biosystems, on a Perkin-Elmer Abiprism 310 sequencer, according to the supplier's protocol.
  • the expression is carried out in a strain of E. coli BL21 gold (Stratagene) at 30 ° C.
  • the bacteria are cultured in a Luria Berthani medium (Gibco) containing 150 mg / L of ampicillin. When the turbidity of the cultures reaches an optical density at 600 nm
  • binding buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.5; 150 mM NaCl.
  • the proteins are then purified by affinity chromatography on a GSTrap Fast Flow column (Amersham-Biosciences). A 5 mL column is prepared according to the manufacturer's instructions. The protein sample (30 mL) is loaded onto the column and the column is washed with 10 volumes of binding buffer.
  • a HiLoad 26/60 Superdex 75 column (300 mL) (Amersham-Biosciences) is balanced using 2 volumes of buffer A (150 mM ammonium bicarbonate pH 7.9).
  • the protein resulting from the purification by GSTrap is then injected, and its elution is carried out with 2 volumes of buffer A.
  • the protein thus purified is aliquoted, lyophilized and stored at 20 ° C.

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  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

La présente invention se rapporte à des molécules chimères permettant le ciblage et la libération de composés thérapeutiques chez des mammifères, notamment des humains. Les molécules de l'invention comprennent principalement trois segments ou domaines fonctionnels : un segment de ciblage, capable de se lier préférentiellement à la surface des cellules ciblées, un segment thérapeutique, comprenant le composé biologiquement actif, et un segment de liaison entre le segment de ciblage et le segment thérapeutique, le segment de liaison étant clivable sur le site cible. L'invention concerne également la préparation de ces molécules, des intermédiaires de synthèse ou domaines de celles-ci, des compositions pharmaceutiques les contenant, et leurs utilisation, en particulier dans le domaine pharmaceutique. Les molécules et compositions de l'invention sont tout particulièrement adaptées au ciblage de cellules pathologiques engagées dans une voie apoptotique, et au traitement de pathologies ou tissus associés, notamment les cancers et l'inflammation.

Description

Molécules de ciblage et de libération de composés thérapeutiques et leur utilisation.
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention se rapporte à des molécules chimères permettant le ciblage et la libération de composés thérapeutiques chez des mammifères, notamment des humains. Les molécules de l'invention comprennent principalement trois segments ou domaines fonctionnels : un segment de ciblage, capable de se lier préférentiellement à la surface des cellules ciblées, un segment thérapeutique, comprenant le composé biologiquement actif, et un segment de liaison entre le segment de ciblage et le segment thérapeutique, le segment de liaison étant clivable sur le site cible. L'invention concerne également la préparation de ces molécules, des intermédiaires de synthèse ou domaines de celles-ci, des compositions pharmaceutiques les contenant, et leurs utilisations, en particulier dans le domaine pharmaceutique. Les molécules et compositions de l'invention sont tout particulièrement adaptées au ciblage de cellules pathologiques engagées dans une voie apoptotique, et au traitement de pathologies ou tissus associés, notamment les cancers et l' inflammation.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les composés anti-tumoraux sont par principe des composés hautement cytotoxiques, qui sont distribués dans l'ensemble de l'organisme lorsqu'ils sont administrés de façon systémique. Ils produisent des réactions secondaires extrêmement préjudiciables à l'individu. Il y a donc un très grand intérêt à ne distribuer ces composés anti-tumoraux que dans les tissus tumoraux, c'est-à-dire à cibler ces tissus grâce à un vecteur spécifique. Bien que ce problème de toxicité des traitements soit particulièrement aiguë pour le cancer, il est généralisable à un grand nombre de traitements dans lesquels, de façon générale, un minimum d'effet secondaire est recherché pour un effet thérapeutique maximal.
Différents vecteurs ont été proposés et notamment des anticorps monoclonaux dirigés contre des marqueurs spécifiques de la surface des cellules cancéreuses. Ils produisent de fait des effets cytotoxiques sur les cellules tumorales, mais l'amplitude de ces effets peut diminuer au cours du temps.
Un système appelé ADEPT (Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy) consiste en une thérapie dans laquelle un anticorps véhicule une enzyme au site tumoral. Ensuite, une prodrogue est administrée et convertie en molécule active par cette enzyme (US 5,760,072 ; US 5,433,955). Dans cette méthode, seule l'enzyme permettant l'activation de la prodrogue fait l'objet d'un ciblage. La pro-drogue est donc distribuée dans l'ensemble de l'organisme, ce qui n'exclut pas entièrement les réactions secondaires et diminue la dose de pro-drogue effectivement fournie au site tumoral. En outre, cette approche est complexe car requiert l'utilisation de plusieurs types de molécules. Une méthode analogue basée sur le ciblage de l'enzyme capable d'activer la pro-drogue a été décrite dans les demandes (WO97/26918 ; WO 98/51787).
D'autre part, divers systèmes de liaison pour la fabrication de pro-drogues, avec une possibilité de ciblage, ont été décrits : par exemple, on trouve des liaisons sulfonamides (WO98/00173), des liaisons clivables par la cathepsine B (WO98/56425) et des liaisons cinnamates (US20020187992).
Cependant, il existe toujours un fort besoin de molécules ou approches thérapeutiques non- toxiques permettant un ciblage ainsi qu'une activation spécifique d'une pro-drogue à un site pathologique. Ce système permettrait de réduire la dose d'agent actif, d'améliorer l'efficacité, et de diminuer les effets secondaires.
EXPOSE DE L'INVENTION
L'objet de la présente invention est de fournir des molécules capables de cibler des tissus présentant une pathologie et d'y libérer de façon spécifique des composés aux propriétés thérapeutiques pour cette pathologie. Grâce aux molécules de l'invention, les composés thérapeutiques exercent leur activité de manière localisée et plus efficace, et offrent des risques d'effets secondaires bien inférieurs.
Les molécules de l'invention peuvent être construites pour cibler différents types de cellules ou de tissus pathologiques, de préférence chez l'homme. Dans un mode préféré de mise en oeuvre, l'invention est basée sur le ciblage de cellules apoptotiques, grâce à un élément de ciblage ayant la propriété de se lier aux membranes cellulaires exprimant un lipide chargé négativement, en particulier la phosphatidylsérine (PS). L'apoptose, ou mort cellulaire programmée, est un phénomène physiologique normal, caractéristique des organismes multicellulaires et présent en particulier chez l'homme. Dans les conditions normales, le taux d'apoptose est cependant faible et les cellules apoptotiques sont très vite phagocytées soit par les cellules voisines, soit le plus souvent par les cellules phagocytaires professionnelles comme les macrophages ou les cellules dendritiques. En outre, les sites apoptotiques sont souvent très dispersés et ne présentent aucune synchronisation. De ce fait, l'apoptose physiologique est généralement indétectable.
L'apoptose est signalée aux cellules phagocytaires par la présence de PS à la surface des cellules apoptotiques, résultant de la perte de l'asymétrie de leur membrane plasmique. La présence d'apoptose détectable est le signe d'un désordre physiologique où les fonctions phagocytaires sont débordées et incapables de faire face à l'accroissement des cellules à éliminer. Des exemples bien connus de tels désordres sont par exemple l'apoptose du muscle cardiaque après un infarctus ou l'apoptose hépatique à la suite d'une infection virale forte ou d'autres affections à caractère aigu. Des cellules en apoptose sont également présentes dans d'autres tissus ou mécanismes pathologiques, tels que Pinflammation et le cancer.
D'autre part, lorsque le tissu pathologique contient peu ou pas suffisamment de cellules cibles capables de retenir massivement les molécules thérapeutiques de l'invention, celles- ci peuvent être utilisées en combinaison avec un agent ou un traitement causant ou favorisant l'apoptose au sein du tissu pathologique afin d'augmenter le bénéfice thérapeutique. Par exemple, certains tissu cancéreux «jeune » (e.g., de petite taille ou non- métastasés) ne contiennent pas toujours une quantité importante de cellules en apoptose, compte tenu de leur division rapide. Dans ce cas, un agent favorisant l'apoptose (par exemple un anti-tumoral classique) peut être utilisé en combinaison avec les molécules de l'invention, du moins au début du traitement, pour augmenter l'efficacité thérapeutique.
L'avantage de cibler les cellules apoptotiques de l'environnement tumoral, plutôt que de cibler des marqueurs spécifiques de la surface des cellules tumorales (par exemple, grâce à des anticorps monoclonaux), réside dans l'effet cinétique lié à l'administration du composé anti-tumoral : dans le premier cas, l'action du composé thérapeutique, s'il est administré de façon continue, produit une augmentation de la « cible » et donc de la concentration effective dudit composé thérapeutique dans l'environnement tumoral alors que, dans le second cas, la taille de la « cible » a tendance à diminuer ainsi que la concentration effective du composé thérapeutique. Cet effet cumulatif résultant du ciblage des cellules apoptotiques est également très important pour le contrôle des étapes initiales de la métastase en maintenant une concentration optimale du composé thérapeutique dans les phases finales de régression de la tumeur. La diminution forte de la dose effective de composé anti-tumoral et sa forte localisation dans la région tumorale a bien sur aussi pour effet de réduire considérablement les effets toxiques secondaires sur le patient.
Les molécules de l'invention permettent donc de cibler différents tissus pathologiques et d'y libérer un agent thérapeutique ou biologiquement actif in situ, réduisant ainsi leur effets cytotoxiques indésirables sur les tissus sains.
Un premier objet de l'invention réside donc dans des molécules chimères comprenant une région de ciblage, une région active et une région de liaison sensible à l'environnement d'un tissu ou d'une cellule pathologique. La région de ciblage est préférentiellement une région ciblant les cellules en apoptose. La région active peut être tout composé thérapeutique, typiquement anti-cancéreux ou anti-inflammatoire. Le composé thérapeutique est typiquement moins actif lorsqu'il est dans la forme d'une molécule chimère de l'invention, que sous une forme libre.
Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une molécule chimère telle que définie ci-avant.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation des molécules de ciblage telles que définies ci-avant pour la préparation de médicaments. Dans un mode préféré de réalisation, ces médicaments sont des médicaments anti-tumoraux ou anti-inflammatoires. L'invention est utilisable notamment pour le traitement de tumeurs solides ou liquides ou hématopoiétiques, en particulier de cancers du sein, du poumon, de l'intestin, du colon, de la prostate, du cerveau, tête-et-cou, du foie, de la peau, le lymphome, le mélanome, etc. Lorsque le composé thérapeutique est un anti-inflammatoire, les molécules selon l'invention peuvent être utilisées pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies inflammatoires aiguës ou chroniques comme l'asthme, la rectocolite hémorragique, la maladie de Crohn, le choc septique, les maladies du collagène et P arthrite.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation des molécules de ciblage telles que définies ci-avant pour la délivrance locale de principes actifs dans le voisinage de tissus pathologiques chez des sujets.
La présente invention concerne en outre des méthodes de traitement d'une pathologie chez un sujet comprenant l'administration d'une molécule ou d'une composition telles que définies ci-avant. De préférence, la pathologie concernée est un cancer ou une inflammation. La méthode de traitement peut comprendre en outre une étape préalable consistant en un traitement permettant de générer des cellules engagées dans un processus d'apoptose dans le tissu pathologique. Elle concerne également des méthodes de délivrance locale de principes actifs dans le voisinage de tissus pathologiques chez des sujets, comprenant l'administration d'une molécule ou d'une composition telles que définies ci- avant.
Ces différents aspects de l'invention seront décrits plus en détails dans la suite du texte.
MOLECULE DE CIBLAGE ET DE LIBERATION DE COMPOSE THERAPEUTIQUE
Comme indiqué précédemment, les molécule de l'invention comprennent typiquement trois parties ou domaines fonctionnels liés les uns aux autres, à savoir une région de ciblage (C), une région biologiquement active (A) et une région de liaison (L) sensible à l'environnement d'un tissu ou d'une cellule pathologique. L'agencement des différents éléments peut varier, et notamment selon l'ordre A-L-C ou C-L-A. D'autre part, dans certains modes de réalisation, la région (ou la fonction) L peut être insérée ou comprise au sein de l'une des régions A ou C.
De manière plus préférée :
1) Le segment de ciblage C est une molécule capable de reconnaître ou de lier préférentiellement des cellules engagées dans un processus pathologique, de préférence d'apoptose ; 2) Le segment de liaison L est une molécule assurant la liaison entre A et C, ladite liaison étant clivable sur le site cible permettant la libération du segment thérapeutique A ;
3) La partie A est une molécule biologiquement active présentant des propriétés thérapeutiques.
Segment de Ciblage C
Le segment de ciblage C comprend un polypeptide capable de se lier à la surface de cellules présentes de façon caractéristique ou spécifique dans un tissu présentant une pathologie, ou générées dans ce tissu par un traitement préalable ou combiné. Ce segment de ciblage C est de préférence capable de se lier aux membranes des cellules engagées dans un processus d'apoptose, celles-ci exposant à leur surface des lipides chargés négativement comme la phosphatidylsérine.
Dans un premier mode de réalisation préféré, la partie C comprend un polypeptide capable de se lier préférentiellement à la surface des cellules tumorales ou présentes dans un tissu tumoral ou générées dans ces tissus par un traitement au moyen d'un agent favorisant l'apoptose, par exemple un anti-tumoral (chimiothérapie, radiothérapie, etc.).
Dans un autre mode de réalisation préféré, le segment de ciblage C comprend un polypeptide capable de se lier préférentiellement à la surface des cellules présentes dans un tissu inflammatoire et en particulier les cellules neutrophiles qui s'accumulent dans ces tissus et y meurent par apoptose 24 à 48 heures après leur arrivée. Les neutrophiles constituent des « appâts » pour les molécules de ciblage.
Le terme « se lier préférentiellement » indique que l'élément de ciblage possède une affinité particulière pour les cellules ou tissus considérés, même si une liaison non spécifique ou moins importante avec d'autres cellules ou tissus ne peut être totalement exclue in vivo. La liaison préférentielle assure néanmoins un ciblage des molécules chimères de l'invention vers les sites pathologiques, réduisant la dissémination et les effets secondaires potentiels.
Le segment de ciblage C est de préférence une molécule peptidique. On entend par molécule peptidique toute molécule composée ou comprenant des acides aminés, naturels ou non, éventuellement modifiés, comme par exemple toute protéine ou fragment de protéine, un polypeptide ou peptide, naturels ou synthétiques, modifiés ou non. La propriété commune de ces éléments est de pouvoir se lier de manière préférentielle à des cellules caractéristiques de situations pathologiques et, dans un mode plus préféré, aux membranes cellulaires exposant des lipides chargés négativement, notamment la phosphatidylsérine. D'une façon générale, la présente invention prévoit l'utilisation de toute protéine, fragment ou dérivé de protéine répondant à ce critère.
Il existe plusieurs familles de protéines capables de se lier aux membranes exposant des lipides chargés négativement. On peut citer notamment la famille des Annexines, les familles de protéines comportant un domaine Cl ou C2, telles que les facteurs V et VIII de la coagulation sanguine ; les familles de protéines comportant un domaine PH ou un domaine FYVE ; ou encore les protéines comportant un domaine identique ou homologue du domaine 5 des β2-Glycoprotéines-I (βGP-I). Ces protéines, ou des domaines issus ou dérivés de leurs séquences peuvent être utilisés comme élément de ciblage dans les molécules chimères de l'invention. Pour des raisons d'imrnunogénicité, on choisit de préférence la version humaine de ces protéines ou domaines de protéines. De plus, il convient chaque fois que cela est possible, de sélectionner et d'utiliser le plus petit domaine actif de ces protéines afin d'assurer la meilleure diffusion de la molécule au travers de la micro-vascularisation vers les tissus ciblés et surtout une meilleure bio- distribution et élimination par la voie rénale.
Dans un mode de mise en œuvre particulier de la présente invention, l'élément de ciblage comprend une séquence peptidique dérivée des protéines ou fragments de protéines mentionnés plus haut. Par fragment est entendu une séquence d'au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence entre 50 et 500 acides aminés, de manière encore plus préférée environ 250 à 350 acides aminés. Ces dérivés présentent au moins 50 % d'identité avec les protéines initiales ou les fragments de celles-ci. De préférence, ils présentent 60 %, 75 %, 90 % ou 95 % d'identité. Certains des domaines de protéines mentionnés, notamment les domaines PH et FYVE, peuvent par ailleurs être mutés de façon à modifier leur spécificité lipidique pour les adapter aux besoins précis du ciblage de cellules en phase apoptotique.
Le segment de ciblage C peut contenir un ou plusieurs sites de liaison au segment L. La présence de plusieurs sites présente l'avantage de pouvoir distribuer plusieurs molécules thérapeutiques A en une seule fois et d'augmenter dans les mêmes proportions la concentration de A dans l'environnement des tissus touchés par la pathologie concernée.
Dans un mode de réalisation particulier, la structure de la molécule selon la présente invention est alors :
C-(L-A)n Ou (A-L)n-C où n ≥ l (Fl).
Dans un autre mode de réalisation, éventuellement combinable avec le précédent, le segment de ciblage C peut comprendre une répétition de plusieurs polypeptides ou motifs de liaison aux cellules pathologiques ou cibles (désignés CO), afin d'augmenter l'efficacité du ciblage. La formule générale de telles molécules est la suivante :
(CO)1n-(L-A)n ou (A-L)n-(CO)1n (F2) où n et m sont, indépendamment l'un de l'autre, un nombre entier supérieur ou égal à 1.
Pour optimiser le comportement in vivo de la molécule thérapeutique, on choisit de préférence m et/ou n = 1 ou 2.
Selon une première variante spécifique de l'invention, le segment de ciblage C comprend la séquence d'une annexine, ou d'un fragment ou un dérivé de celle-ci. Le segment de ciblage C comprend de préférence la séquence du « coeur à quatre domaines » d'une protéine de la famille des annexines. De préférence, l'annexine est de type V, un fragment ou un dérivé de celle-ci. L'annexine d'origine humaine est privilégiée. De préférence, le segment de ciblage C comprend le domaine 1 de cette annexine.
Selon une première variante spécifique de l'invention, le segment de ciblage C comprend un domaine de type Cl ou C2, un fragment ou un dérivé de celui-ci. Plus particulièrement, l'invention concerne des segments de ciblage C comprenant la séquence d'un domaine Cl d'un facteur de coagulation, un fragment ou un dérivé de celui-ci. De façon alternative, l'invention concerne des segments de ciblage C comprenant la séquence d'un domaine C2 du facteur VIII humain de la coagulation , un fragment ou un dérivé de celui-ci.
Dans un mode préféré de réalisation, le segment de ciblage C est un polypeptide construit sur la base d'une topologie de domaine de type Cl. De préférence, le segment de ciblage C comprend un polypeptide de séquence choisie parmi SEQ ID Nos 1-8, de préférence SEQ ID Nos 2-4, et 6-8, ou un fragment de celui-ci.
Domaine de type Cl du facteur V humain de la coagulation - ClF 5 -SO (F-V) séquence sauvage
(SEQ ID No 1)
DCRMPMGLST GIISDSQIKA SEFLGYWEPR LARLNNGGSY NAWSVEKLAA EFASKPWIQV DMQKEVIITG IQTQGAKHYL KSCYTTEFYV AYSSNQINWQ IFKGNSTRNV MYFNGNSDAS TIKENQFDPP IVARYIRISP TRAYNRPTLR LELQGC
Polypeptides construits sur la base du domaine de type Cl du facteur V humain de la coagulation
C1F5-S1 (SEQ ID No 2) DCRMPLGMST GIISDSQIKA SEFLGYWEPR LARLNNGGSY NAWSVEKLAA
EFASKPWLQI DMQKEVIITG IQTQGAKHYL KSCYTTEFYI AYSSNQINWQ
IFKGNSTRNV MYFNGNSDAS TIKENQLDPP IVARYIRISP TRAYNRPTLR LELQGC
C1F5-S2 (SEQ ID No 3)
DCRMPMGLST GIISDSQIKA SEFLGYWWPR LARLNNGGSY NAWSVEKLAA EFASKPWIQV DLQKEVIITG IQTQGAKHYL KSCYVTEFYV AYSSNQINWQ IFKYNSTRNV MYFNGNSDAS TIKENQFDPP LVARYIRISP TRAYNRITLR LELQGC
C1F5-S3 (SEQ ID No 4)
DCRMPMGLST GIISDSQIKA SEFLGYWEPR LARLNNGGSY NAWSVEKLAA EFASKPWLQI DLQKEVIITG IQTQGAKHYL KSCYTTEFYI AYSSNQINWQ IFKGNSTRNV MYFNGNSDAS TIKENQLDPP IVARYIRISP TRAYNRPTLR LELQGC
Domaine de type Cl dufacteur VIII humain de la coagulation - C1F8-S0 (F-V) séquence sauvage (SEQ ID No 5) KCQTPLGMAS GHIRDFQITA SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WIKVDLLAPM IIHGIKTQGA RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRGNS TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI FNPPIIARYI RLHPTHYSIR STLRMELMGC Polypeptides construits sur la base du domaine de type Cl du facteur VIII humain de la coagulation
C1F8-S1 (SEQ ID No 6) KCQTPMGLAS GHIRDFQITA SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WLKIDLLAPM IIHGIKTQGA RQKFSSLYIS QYIIMYSLDG KKWQTYRGNS TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI FNPPIIARYI RLHPTHYSIR STLRMELMGC
C1F8-S2 (SEQ ID No 7) KCQTPMGLAS GHIRDFQITA SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WIKVDLLAPM IIHGVKTQGA RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRYNS TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI FNPPLIARYI RLHPTHYSIR STLRMELMGC
C1F8-S3 (SEQ ID No 8) KCQTPLGMAS GHIRDFQITA SGQYGQWWPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WLKIDLLAPM IIHGIKTQGA RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRGNS TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI FNPPLLARYI RLHPTHYSIR STLRMEVMGC
Dans un autre mode préféré de réalisation, le segment de ciblage C est un polypeptide construit sur la base d'une topologie de domaine de type C2. De préférence, le segment de ciblage C comprend un polypeptide de séquence choisie parmi SEQ ID Nos 9-16, de préférence SEQ ID Nos 10-12, et 14-16, ou un fragment de celui-ci.
Domaine de type C2 du facteur V humain de la coagulation — C2F5-S0 (F-V) séquence sauvage
(SEQ ID No 9)
CSTPLGMENG KIENKQITAS SFKKSWWGDY WEPFRARLNA QGRVNAWQAK ANNNKQWLEI DLLKIKKITA IITQGCKSLS SEMYVKSYTI HYSEQGVEWK PYRLKSSMVD KIFEGNTNTK GHVKNFFNPP IISRFIRVIP KTWNQSITLR LELFGCDIY
Polypeptides construits sur la base du domaine de type C2 du facteur V humain de la coagulation
C2F5-S1 (SEQ ID No 10) CSTPLGMENG KIENKQITAS SFKKSWWGDY WEPFRARLNA QGRVNAWQPK ANNNKQWLEV DLLKIKKITA VITQGCKSLS SEMYVKSFTI HYSEQGVEWK PFRLKSSMVD KINEGNTNTK GHVKNFPNPP RISRFIRVIP KTWNQSITLR LELFGCDIY
C2F5-S2 (SEQ ID No 11) CSTPLGIENG KIENKQITAS SFKKSWWGDY WEPFRARLNA QGRVNAWQAK ANNNKQWLEM DFLKIKKVTA VITQGCKSLS SEMYVKSFTI HYSEQGVEWK PYRLKSSMVD KIFEGNTNTK GHVKNFFNPP IISRFIRQIP KTWNQSITLR LELYGCDIY
C2F5-S3 (SEQ ID No 12)
CSTPLGIENG KIENKQITAS SFKKSWWGDY WEPFRLRLNA QGRVNAWQAK ANNNKQWAEM DLLKIKKITA I ITQGCKSLS SEMYVKSYTI HYSEQGVEWK PYRLKSSMVD KIFEGNTNTK GHVKNFFNPP I ITRFIRVIP KTWNQSITIR LELFGCDIY
Domaine de type C2 du facteur VIII humain de la coagulation - C2F8-S0 (F-V) séquence sauvage (SEQ ID No 13)
CSMPLGMESK AISDAQITAS SYFTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL
FFQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPPLLT RYLRIHPQSW VHQIALRMEV
LGC
Polypeptides construits sur la base du domaine de type C2 du facteur VIII humain de la coagulation
C2F8-S1 (SEQ ID No 14)
CSMPLGMESK AISDAQITAS SYFTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRAQV NNPKEWLQID LQKTMKITGI TTQGVKSLLT SMYVKEYLIS SSQDGHQWTL FYQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPFLLT RYLRIHPVSW VHQIALRMEV LGC
C2F8-S2 (SEQ ID No 15)
CSMPLGMESK AISDAQITAS SYKTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRAQV NNPKQWLQVD FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF QGFQDSFTPV VNSLDPPLLT IYLRIHPQSW VHQIALRMEV LEC C2F8-S3 (SEQ ID No 16)
CSMPLGMESK AISDAQITAS SYKTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEYLIS SSQDGHQWTL FYQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPFLLT RYLRIHPQSW VHQIALRMEV LEC
Dans un mode préféré de réalisation, le segment de ciblage C est un polypeptide construit sur la base d'une topologie de type domaine 5 des β2-Glycoprotéines-I (β2GP-I) (SEQ ID No 17). De préférence, le segment de ciblage C comprend un polypeptide de séquence choisie parmi SEQ ID Nos 17-22, de préférence SEQ ID Nos 18-22, ou un fragment de celui-ci.
Domaine 5 des β2-Glycoprotéines-I humaines — β2GP-I séquence sauvage (SEQ ID No 17) TKASCKVPVK KATWYQGER VKIQEKFKNG MLHGDKVSFF CKNKEKKCSY TEDAQCIDGT IEVPKCFKEH SSLAFWKTDA SDVKPC
Dans un mode de réalisation préféré, le segment de ciblage C comprend un polypeptide dont la séquence générale est la suivante : TJ2ASCKU7PU9KJ11U12TU14U15U16J17GERU21J22U23QEKU27J28NGML
HGDKU37SFU40CJ42NJ44EJ46J47CJ49YTEDU54QCIDGTU61EVPKCU67
J68 E H S J72 U73 U74 J75 J76 J77 T D A S D V J84 P C (SEQ ID No 18) (S4) où:
J2 = K , D, E ; Jl 1, J22, J28, J42, J44, J46, J47, J68, J77, Jl 7 = Q, E ; J84 = K, R ; J49 = S, T ; J72 = S, T, M ; U7 = L, V, I ; U9 = V, I, T ; U12 = A, M ; U14, U15, U21, U23, U37 =
V, I, T ; U16, U27, U40 ,U67 = F, Y ; U54 = A, V, I ; U61 = I, V, M ; U73,U74,U75,U76
= L, I, F, Y, M, W.
De préférence, le segment de ciblage C comprend un polypeptide de séquence choisie parmi SEQ ID Nos 19-22 ou un fragment de celui-ci :
Polypeptides construits sur la base du domaine 5 des β2-Glycoprotéines-I humaines GPI-Sl (SEQ ID No 19)
TEASCKVPVK RATWYEGER VRIQEKFKNG MLHGDKVSFF CRNRERRCSY TEDAQCIDGT IEVPKCYREH SMLTWWRTDA SDVKPC 6PI-S2 (SEQ ID No 20)
TEASCKLPTK RMTWYEGER VRIQEKFKNG MLHGDKISFF CRNRERRCSY TEDΆQCIDGT IEVPKCYREH SMITWWRTDA SDVKPC
6PI-S3 (SEQ ID No 21)
TKASCKVPTK KMTVVYQGER VKIQEKFKNG MLHGDKISFF CKNKEKKCSY TEDAQCIDGT IEVPKCYKEH SSLAWWKTDA SDVKPC
GPI-S4 (SEQ ID No 22)
TKASCKVPTK KMTVVYQGER VKIQEKFKNG MLHGDKISFF CKNKEKKCSY TEDAQCIDGT IEVPKCYKEH SSLAFWKTDA SDVKPC
Dans un mode de réalisation préféré, le segment de ciblage C comprend un polypeptide dont la séquence générale est la suivante : jl.J2j3.J4_J5_J6.z7_u8_J9_J10.ull_R_J13_J14_ul5_κ_G_χ18_G_τ_J21_E_j23_J24_u25_J26_J27.J28_
U29J30-J31-RJ33J34-J35J36-B^ J5lD-U56-K-S-ZS9-L-J^
(S5) dans laquelle J, Z, U, X, et B représentent des acides aminés tels que :
- les acides aminés J sont choisis indépendamment les uns des autres parmi les acides aminés naturels, ou des dérivés de ceux-ci, de telle manière qu'au moins 50 % d'entre eux sont des résidus polaires choisis parmi R, N, D, C, Q, E, G, H, K, Orn, P, S, T et Y,
- les acides aminés U sont choisis parmi A, C, G, I, L, M, F, W, Y, et V, - l'acide aminé X18 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi A, N, C, Q, G, H, I, L, M, F, S, T, W, Y et V,
- l'acide aminé B37 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi R, A, C5 G, I, L, M, F, W, Y, et V,
- l'acide aminé Z7 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi D et E,
- les acides aminés Z59 et Z65 sont choisis indépendamment parmi E, D, K, et R, les exposants indiquant la position des acides aminés dans la séquence.
De préférence, les acides aminés J peuvent être choisis indépendamment les uns des autres parmi l'ensemble des résidus A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, Orn, F, P, S, T, W, Y, et V, et de telle manière qu'au moins 50 % d'entre eux sont des résidus polaires choisis parmi R, N, D, C, Q, E, G, H, K, Om, P, S, T.
Différentes combinaisons de résidus U et B sont données dans le tableau 1 ci-dessous :
Figure imgf000015_0001
A titre d'exemple, le peptide de formule Sl peut être avantageusement une séquence peptidique choisie parmi les séquences peptidiques SEQ ID No 23-32.
La séquence Sl représente un type de peptides dans sa forme la plus courte. Il est bien entendu que cette séquence peut comprendre en outre un ou plusieurs acides aminés supplémentaire à l'une ou l'autre des extrémités, par exemple de 1 à 15 acides aminés, en général de 1 à 10 acides aminés pour obtenir une fonctionnalisation supplémentaire. Par exemple, une petite séquence, dite de fonctionnalisation, peut être liée au peptide permettant la fixation au segment L. Cette séquence de fonctionnalisation peut être située à l'extrémité N-terminale de la séquence Sl. Elle peut être d'environ 3 acides aminés choisis de préférence parmi G-S-C-, G-S-T-, G-S-P-, G-S-S-, G-S-G-, et G-S-Q-. Elle peut être également d'environ 4 acides aminés, choisis de préférence parmi les séquences G-S-Aa- C-, G-C-Aa-S-, G-S-Aa-S-, G-C-Aa-C-, et G-C-Aa-S- où Aa est un acide aminé quelconque. Ces séquences de fonctionnalisation sont avantageuses en ce qu'elles permettent en particulier le marquage aisé par des radio-traceurs comme le 99mTc ou le 18F et permettent, par injection chez l'homme à dose traceuse, de suivre parfaitement in vivo le devenir du médicament, sa bio-distribution et de contrôler sa bonne localisation.
Par ailleurs la séquence Sl peut être dupliquée au sein d'un même peptide pour produire une molécule présentant une affinité encore plus élevée pour les sites apoptotiques.
Segment de Liaison L
Le segment L est une molécule de liaison clivable sur le site cible, et reliant la partie A et la partie C. Le segment L peut être toute molécule ou liaison chimique, de type covalent, y compris des molécules en partie ou totalement de nature peptidique, modifiée ou non, naturelle ou non. Le segment L contient avantageusement une fonction chimique reconnue et clivable dans l'environnement du tissu ou des cellules pathologiques, par exemple par une enzyme ou un ensemble d'enzymes spécifiques de l'environnement des cellules ciblées.
La présence, entre les parties A et C, du segment de liaison L clivable préférentiellement dans l'environnement des cellules ciblées permet une libération locale et ciblée du principe actif et confère aux molécule de l'invention un comportement de type pro-drogue ciblée. En effet, la molécule est peu active tant qu'elle ne réside pas dans l'environnement des cellules ciblées possédant les enzymes ou autres facteurs de clivage.
Le segment de liaison L peut être simple ou ramifié. L'intérêt d'une ramification est de pouvoir amener et distribuer plusieurs molécules thérapeutiques avec une seule molécule de ciblage C. Dans ce mode de mise en œuvre, la structure générale du segment de liaison est donc L = D(LO)n, où D est un élément de ramification, n est un nombre entier égal ou supérieur à 1 (correspondant au nombre de bras que comporte la ramification), et LO est le lien proprement dit.
Il en découle que le composé faisant l'objet de la présente invention possède l'une des deux formules générales suivantes selon l'ordre dans lequel se succèdent les différentes parties : C-D-(LO-A)n (F4A)
(A-LO)n-D-C (F4B)
Le segment L (ou LO) peut être de nature variée, comme une liaison ou molécule chimique, et en particulier de nature peptidique.
Dans un mode de mise en œuvre préféré, le segment L est un lien peptidique clivable sensible aux protéases (ou autres enzymes), dénommées dans la suite du texte « protéases intervenantes », plus spécifiquement sur-exprimées soit à la surface des cellules présentant la pathologie, soit libérées dans l'environnement des cellules ciblées, soit encore libérées par les cellules en phase apoptotique.
Les cellules tumorales et inflammatoires, ainsi que, par exemple, les cellules stromales recrutées dans l'environnement de celles-ci, sont connues pour excréter une variété de protéases intervenantes, en particulier des métallo-protéases de la matrice extra-cellulaire (MMP), des urokinases, les protéases spécifiques du clivage du segment extracellulaire des cytokines membranaires ou de leurs récepteurs (ADAM), etc. Des exemple de séquences clivées par ces protéases sont données dans le Tableau 2. Ces protéases intervenantes jouent un rôle important dans l'évolution de la tumeur ou du tissu inflammatoire et notamment dans l'envahissement des tissus environnants et la formation de métastases, ou l'envahissement par les cellules spécialisées de réaction inflammatoire. Par exemple, le taux de MMP dans l'environnement tumoral ou inflammatoire est bien supérieur à celui présent dans un tissu normal car, en particulier, le contrôle de l'expression de ces MMP dépend de l'action de certaines cytokines. Il donc possible de mettre à profit ce différentiel d'expression pour amplifier le principe du ciblage du composé anti-tumoral ou anti- inflammatoire en ne permettant l'activation de ce composé qu'aux sites de ciblage. Des pro-drogues simples ont déjà été conçues mais elle ne résolvent pas le problème de la distribution uniforme du médicament dans l'ensemble de l'organisme car il n'y a pas d'accumulation de la pro-drogue au sein du tissu cancéreux ou inflammatoire. Au contraire, dans la présente invention, on propose un moyen d'accumuler le principe antitumoral ou anti-inflammatoire uniquement dans le tissu tumoral ou inflammatoire comportant déjà des cellules en voie d'apoptose, et de rendre actif le médicament essentiellement dans ce tissu. Autrement dit, l'ensemble C-L ou L-C constitue un système de vectorisation-activation de composés anti-tumoraux ou anti-inflammatoires. Cet ensemble répond donc au double impératif suivant : réduire la concentration effective moyenne du médicament dans l'organisme, c'est à dire réduire les effets toxiques secondaires, et restreindre l'action du médicament au seul tissu intéressant, c'est à dire augmenter son efficacité.
Le segment de liaison clivable L (ou LO) est donc un lien au moins partiellement peptidique comportant une séquence reconnue et clivée par une protéase intervenante majoritairement présente dans le tissu ciblé. Le lien L ou LO peut donc être représenté comme comprenant deux parties, L1-L2, conçues de telle sorte que les protéases intervenantes clivent la liaison peptidique du lien entre Ll et L2 et que la molécule libérée L2-A ou A-Ll, selon les molécules choisies, soit une molécule active au plan thérapeutique, de préférence au moins autant que la molécule initiale A. La longueur des parties Ll et L2 peut être optimisée en fonction de l'accessibilité nécessaire au site actif des protéases intervenantes, avec la contrainte de limiter autant qu'il se peut la taille finale de la molécule finale pour les raisons évoquées plus haut. Pour tenir compte de toutes les possibilités associées à la structure finale du composé thérapeutique, A-L-C ou C-L-A, la structure la plus générale proposée pour le lien L est la suivante : L = D-(Ll -L2)n (F5A)
L = (L1-L2)n-D (F5B) où D, Ll , L2 et n ont la définition donnée plus haut.
La liaison entre les différents éléments fonctionnels des molécules de l'invention peut être réalisée par toute méthode de couplage chimique, enzymatique ou génétique connue en soi de l'homme du métier. Ainsi, il peut s'agir de liaisons chimiques, peptidiques, nucléiques, etc. Les groupements peuvent être couplés entre-eux par des liaisons maléimides, succinimide, intéine, biotine, aminé, amide, carboxyliques, phosphate, ester, éther, etc.
Dans une variante de l'invention, le lien L est lié à la molécule C (et/ou A) par un groupe maléimide, connu pour sa réaction rapide et totale avec un groupe thiol porté par un résidu cystéine accessible du segment de ciblage C (et/ou de la molécule A).
Dans une autre variante, le lien L est lié à la molécule C (et/ou A) par réaction du groupe carboxylique terminal du peptide L avec un groupe amino porté par le segment thérapeutique A (ou de ciblage C). Dans une autre variante de réalisation, le segment de liaison L est couplé à l'extrémité C- terminale (dans le cas d'une molécule H2N-L-A) ou N-terminale (dans le cas d'une molécule A-L-COOH) du segment C au moyen d'une intéine. L'intérêt de ce mode de construction de la molécule finale, par rapport au mode précédant utilisant une liaison par groupe maléimide, est qu'il préserve la possibilité de disposer d'une cystéine libre dans la molécule, pour une autre fonctionalisation ou pour un radio-marquage éventuel pour le suivi du médicament. Il y a en effet un grand intérêt thérapeutique à pouvoir suivre et contrôler au moyen de l'imagerie la bio-distribution et la cinétique de cette bio-distribution pour ce type de médicament ciblé.
Dans certains modes de réalisation, le segment L (ou la fonction de clivage) fait partie de l'élément C ou A. Il peut s'agir par exemple d'une extension N-terminale ou C-terminale du segment C ou A, notamment lorsque ce dernier est de nature peptidique.
Les molécules de l'invention peuvent être assemblées en une ou plusieurs étapes, selon les techniques de couplage mises en œuvre. Ainsi, une molécule de type C-L peut être réalisée dans un premier temps, puis couplée avec une ou plusieurs molécules thérapeutiques A. Alternativement, lorsque les liaisons entre les segments fonctionnels font appel à des réactions chimiques différentes, une synthèse ou un assemblage simultanée sont possibles.
Etant donnée la taille du segment de liaison (généralement de environ cinq à environ vingt résidus, pour un segment de nature peptidique), la version purement peptidique du lien L est de préférence obtenue par synthèse directe, en utilisant notamment les synthétiseurs de peptides courants et les méthodes classiques de synthèse, notamment en phase solide. L'avantage de la synthèse directe du lien est qu'elle autorise l'utilisation de résidus aminoacides non naturels permettant ainsi une meilleure adaptation de la séquence aux protéases intervenantes. Cette séquence de reconnaissance peut en outre être modifiée par rapport à la séquence naturelle de reconnaissance par une enzyme ou un facteur de clivage, par exemple pour lui conférer une meilleure affinité ou spécificité envers la protéase en question.
La longueur du segment de liaison peut être adaptée par l'homme du métier en fonction des besoins et de la nature des segments C et A. De manière générale, on utilise un segment de liaison assez court et essentiellement non immunogène. Il s'agit typiquement d'un segment de nature peptidique comprenant de 3 à 20 résidus d'acides aminés, de préférence de 3 à 15, encore plus préférentiellement de 4 à 12. Dans certains cas, comme indiqué ci-après, il peut être intéressant de modifier la longueur du segment L, notamment pour éloigner la partie peptidique du segment C ou A, ou pour créer des molécules à fonction particulière (pénétration dans la cellule, action sur cellules voisines, etc.).
Ainsi, il peut y avoir avantage à ce que le lien L ou LO contienne une partie d'espacement pour éloigner le site de clivage (et la partie peptidique) du segment de ciblage C. Dans ce cas L ou LO peut prendre l'une des deux structures suivantes :
L'l-L"l-L2 (F6A)
Ll-L"2-L'2 (F6B) où, dans l'un et l'autre cas :
- L'1 est un groupe d'espacement non-peptidique et L"l la partie peptidique proprement dite ;
- L'2 est un groupe d'espacement non-peptidique et L"2 la partie peptidique proprement dite.
Le groupe d'espacement non peptidique peut être choisi parmi toute molécule chimique synthétique, de préférence stable chimiquement et peu immunogène. Il peut s'agir notamment d'un polymère, par exemple de type polyoxyéthylène, dextran, polyéthylèneimine, etc. Un exemple préféré est le polyoxyéthylène, fonctionnalisé ou non.
Dans les formules ci-dessus, L"l-L2 et Ll-L"2 peuvent représenter le même peptide. Par ailleurs, le nombre de résidus des segments peptidiques L"l-L2 ou Ll-L"2 peut varier de quatre à plus de vingt, la valeur optimale étant de l'ordre de six.
Dans un exemple particulier de mise en œuvre, le segment de liaison clivable répond à la formule suivante :
L (ou LO) = -(CH2-CH2-0)m-(CH2)n-CO-L"l -L2 (F7A) L (ou LO) = Ll-L"2-NH-(CH2)n -(OCH2-CH2)m- (F7B) où m est un nombre entier supérieur ou égal à 0 et L" 1 et L"2 un peptide dont la séquence comprend au mois un site de clivage par une des protéases généralement présentes dans l'environnement ciblé. On notera que L"l-L2 et Ll-L"2 peuvent représenter le même peptide. Le nombre de résidus des segments peptidiques L"l-L2 ou Ll-L"2 peut varier de quatre à plus de vingt, la valeur optimale étant de l'ordre de six.
On présente dans les exemples suivants un ensemble de séquences peptidiques pour L"l- L2 ou Ll-L"2 répondant aux divers critères donnés dans l'ensemble du texte qui précède :
J-n— J0-B1-B2-J3— Jc (S6) où :
* J-O-J0-B1 représente indifféremment les segments L"l et Ll ;
* B2-J3-Jc représente indifféremment les segments L2 et L" 2 ; * la liaison peptidique B1-B2 est la liaison clivée par les protéases intervenantes.
* n et c peuvent varier de 0 à environ 10 et dépendent de l'extrémité choisie pour la liaison au segment A ; pour l'extrémité liée à A, la valeur de n ou c sera faible et de préférence égale à 0 (J3 seulement présent) et pour l'extrémité opposée la valeur de n ou c n'est pas limitée et les résidus correspondants seront choisis en fonction de la spécificité des protéases intervenantes ciblées.
Le tableau suivant donne un exemple d'ensemble de séquences B1-B2 reconnues et clivées par les différentes protéases intervenantes et utilisables préférablement pour un segment L clivable : Tableau 2
Figure imgf000021_0001
Les séquences J-1-J0 et J3-J4 qui encadrent le site de clivage B1-B2 interviennent dans les interactions du lien avec la protéase visée et donc sur la vitesse de la réaction enzymatique de coupure de la liaison B1-B2. Les résidus J-i, J0, J3 et J4 de S5 seront avantageusement choisis dans les ensembles suivants : J-i = résidu polaire de préférence
Jo = GIy, AIa, Leu, Ile, Val, Phe et tout résidu aminoacide non naturel hydrophobe. J3 = GIy, AIa, Leu, He, Val, Phe
J4 = GIy, AIa, Leu, Ile, Val, Phe ou tout résidu non-naturel hydrophobe ou absent
Les autres résidus, J-2~J-n et J5~Jc peuvent être n'importe quel résidu aminoacide naturel ou non naturel selon les besoins.
D'autre part, la longueur et/ou les propriétés du segment de liaison peuvent être ajustées, par exemple pour construire une molécule permettant au composé thérapeutique A d'interagir avec ou de pénétrer dans une cellule voisine de la cellule cible sur laquelle le segment C la conduit. Dans ce cas, par exemple, le segment de liaison L: - doit être suffisamment long pour atteindre les cellules voisines. Pour ce type de lien on choisit de préférence un oligomère chimique, par exemple de type polyoxyéthylène, comprenant un nombre suffisant de monomères pour que la longueur du lien soit d'environ 80 à 200 angstrôm, typiquement de 130 à 150 angstrôm; et/ou - comprend un domaine permettant ou facilitant le passage de A dans la membrane cellulaire et, le cas échéant, une région de clivage sensible aux enzymes intra-cellulaires.
Dans ce mode de réalisation, le lien possède avantageusement l'une des deux structures suivantes :
L ou LO ≈ LE-LTM-L3-A (F9A)
L ou L0 = A-L3-LMT-LE (F9B) où LE est une partie essentiellement extracellulaire du lien, LTM une partie trans- membranaire et L3 une fonction ou un élément clivable par les protéases ou les estérases intra-cellulaires (e.g., cytosoliques).
La partie LE est préférentiellement suffisamment hydrophile pour permettre une solvatation convenable en milieu aqueux afin d'obtenir une structure suffisamment étendue. La partie LTM, d'une longueur au moins égale à environ 40 Â, être préférentiellement suffisamment amphiphile pour que, d'une part, sa structure dans le milieu aqueux extracellulaire reste faiblement compacte et que, d'autre part, elle puisse traverser le milieu hydrophobe de la membrane plasmique.
La composition chimique de LE et LMT pourra par exemple être la suivante : LE = -[O-(CH2)P-O]- (F 10)
LMT = -[O-(CH2)q-O]- (Fl 1) où q et p sont des nombres entiers différents de 0, q >p de telle sorte que, pour LMT, l'environnement lipidique de la membrane soit au plan énergétique plus favorable que l'environnement aqueux. Les valeurs p = 2 et 5 > q > 3 sont préférables.
Comme indiqué précédemment, l'élément de ciblage peut être synthétisé par des techniques connues en soi de la chimie ou de la biologie. L'élément C-L constitue par ailleurs un objet particulier de l'invention.
Segment Thérapeutique A
L'invention peut être mise en œuvre avec tout type de molécule thérapeutique susceptible d'être associé au segment C. Il peut s'agir de composés chimiques, de médicaments, petites molécules, etc.) de composés peptidiques, nucléiques, lipidiques, etc.
D'une façon générale, le segment thérapeutique A est une molécule présentant une activité biologique. De préférence, cette activité biologique est réduite (ou inexistante) lorsque le segment thérapeutique est lié aux segments de liaison L et de ciblage C. De ce fait, l'activité biologique s'exprime surtout dans l'environnement des tissus pathologiques, après ciblage et clivage in vivo.
Les composés thérapeutiques peuvent avoir des propriétés variées, dans des domaines thérapeutiques variés. Il peut s'agir de médicaments déjà connus, ou de molécules nouvelles ou en développement. Il peut s'agir de composés dont le mode d'action implique une pénétration dans les cellules ou dont l'action implique uniquement une interaction à la surface de la membrane plasmique. Les composés A préférés de l'invention sont des antitumoraux ou anti-inflammatoires.
Composés anti-tumoraux Dans un mode de réalisation particulier, la molécule biologiquement active présente des propriétés anti-tumorales. A peut être n'importe quelle molécule anti-tumorale ou un dérivé actif de ces mêmes molécules. La seule contrainte est que ces composés antitumoraux puissent être liés chimiquement au reste de la molécule de vectorisation.
Comme il a été décrit plus haut, A peut être libérée dans le milieu extra-cellulaire et diffuser de façon passive ou active à l'intérieur des cellules voisines ou bien être amenée dans ces cellules par un lien du type LE-LMT puis libérée par l'action de protéases ou estérases endogènes.
Un exemple de composé anti-tumoral est constitué par les molécules de la famille des antracyclines et de leurs dérivés.
Ces molécules d'antracycline comportent un sucre aminé. Le groupe amino est avantageusement utilisé pour la liaison au segment L (par exemple à la partie L2 ou LMT) du lien défini plus haut .
Un autre exemple de composé anti-tumoral est constitué par les molécules de la famille des TNFα ou dérivés de ceux-ci. Ces molécules agissent sur des récepteurs de surface des cellules et induisent l'apoptose.
Parmi les molécules de la famille des TNFα, le facteur TRAIL ou Aρo2L (P_W19777) est probablement le plus intéressant dans la mesure où les cellules normales semblent protégées de son action alors que les cellules tumorales y sont sensibles et peuvent être sélectivement éliminées par l'action de cette cytokine pro-apoptotique. Ce facteur peu donc être très utile dans les cancers dit « solides » ce qui implique un ciblage efficace pour éviter au maximum les effets secondaires dus à la présence de ces molécules dans le milieu sanguin. Comme toutes les molécules de la famille du TNF, TRAIL est initialement une protéine membranaire associée en trimère et seule la partie extracellulaire est active. Cette partie extracellulaire, TRAIL-Do, ou un ensemble contenant TRAIL-Do, peut donc être ciblé grâce au segment C et libéré dans l'espace inter-cellulaire grâce à l'action des protéases intervenantes sur le lien clivable L qui relie C et TRAIL-Do. La molécule thérapeutique ainsi constituée possède la structure suivante :
C-L' 1 -L" 1 -L2-( TRAIL-Do) (selon la formule F6A) (TRAIL-Do)-Ll -L' '2-U2-C (selon la formule F6B)
Un avantage de l'une ou l'autre de ces dispositions est que l'assemblage en trimère des molécules de la famille des TNF, nécessaire à la liaison à leurs récepteurs, est gêné par la présence des segments de ciblage et de liaison. Ainsi la molécule reste faiblement active tant que le lien n'est pas clivé par une protéase intervenante. Pour bénéficier de cet avantage particulier il faut que le lien clivable ait une longueur suffisamment faible tout en conservant une accessibilité convenable aux protéases intervenantes.
Un autre exemple de cytokine, très intéressante pour le traitement de certains cancers et notamment le mélanome et le gliome intracrânien, est PInterleukine-4 (IL4, 1310839). Malheureusement, étant donnés ses effets secondaires importants, cette protéine ne peut pas être utilisée sans être convenablement ciblée. La liaison à un segment de ciblage C de l'IL4 humaine ou de l'une de ses isoformes ou encore d'un ensemble contenant l'une de ces protéines, par l'intermédiaire d'un segment clivable permet de constituer une molécule thérapeutique intéressante en oncologie :
C-L' 1 -L" 1 -L2-(IL4) (selon la formule F6 A)
(IL4)-L1 -L' '2-L'2-C (selon la formule F6B)
D'autres exemples de composés anti-tumoraux sont notamment :
a) Le méthotrexate :
Figure imgf000026_0001
Le méthotrexate est un composé anti-tumoral couramment utilisé pour le traitement des tumeurs cancéreuses. Il s'agit d'un analogue de l'acide folique qui agit d'abord comme un faux substrat en inhibant la déhydrofolate réductase (DHFR). Il agit aussi par inhibition indirecte de la thymidilate synthétase (TS).
Le méthotrexate contient un aminoacide, l'acide glutamique, qui peut être inséré dans l'extrémité N-terminale d'un peptide de lien clivable selon la formule (F6B) ou (F4B).
b) Le méthoxyestradiol
Le 2-méthoxyestradiol (1,3,5 (10)-oestratriène-2,3,17β-triol 2-méthyl ether) appelé 2ME2, est un sous-produit du métabolisme des œstrogènes ayant la propriété de bloquer la croissance des cellules endothéliales en division rapide et des cellules tumorales.
c) les taxanes :
Les molécules de cette famille ont pour effet le blocage du cycle cellulaire en G2 et M par leur action sur les cytosquelette microtubulaire. Il en résulte une inhibition de la réorganisation normale nécessaire au déroulement de l'interphase de la mitose.
Les taxanes, et particulièrement le docetaxel, comportent des fonctions utilisables pour des modifications permettant son incorporation à l'extrémité d'un peptide clivable par les protéases intervenantes de l'environnement tumoral.
Figure imgf000027_0001
R1 = tBuOCO, R2 = H (docetaxel) R, = C6H5CO, R2 = Ac (paclitaxel)
LES TAXANES
d) les antipyrimidines sucre modifies :
La cytosine arabinoside (Ara-C) ou cytarabine ou Aracytine est le représentant principal de cette famille. D'autres molécules de cette famille sont la difluoro-déoxy-cytidine (Gemcitabine).
e) Les agents alkylants :
Dérivés des « moutardes à l'azote », ces agents ont donné naissance à divers composés anti-tumoraux agissant sur les acides nucléiques et donc dans l'espace intra-cellulaire. Il s'agit en particulier le Melphalan et le Chlorambucil, deux agents alkylants bifonctionnels intéressant pour liaison aisée à un lien peptidique clivable.
Le Melphalan est la Phenylalanine-Moutarde (L-PAM) est aminoacide non naturel qui peut être introduit facilement au début ou à la fin de la synthèse peptidique d'un lien clivable par protéases intervenantes :
Figure imgf000027_0002
Le Chlorambucil ne comporte qu'une fonction carboxylique et ne pourra être introduit directement dans un peptide qu'en fin de synthèse du lien peptidique clivable par les protéases intervenantes et à l'extrémité N-terminale.
Figure imgf000028_0001
Par l'utilisation d'un segment de lien bivalent comme Péthanolamine ou le diamino- éthane, ce composé pourra aussi être introduit à l'extrémité C-terminale du lien peptidique clivable.
Dans les deux cas la molécule libérée dans l'environnement tumoral est un dérivé aminoacide hydrophobe comme par exemple le Leu-Melphalan ou le Chlorambucil-Leu. Ces composés peuvent traverser facilement de façon passive la membrane plasmique des cellules tumorales et agir sur les acides nucléiques soit directement puisque la fonction alkylante n'est pas modifiée soit après clivage de l' aminoacide supplémentaire par les peptidases ou estérases endogènes.
Composés anti-inflammatoires
Dans un autre mode de réalisation particulier, la molécule biologiquement active présente des propriétés anti-inflammatoires.
Libération depeptides dérivés du segment N-terminal de l'annexine I.
Un exemple dé tels composés est un peptide, nommé ici NTAl, aux propriétés anti- inflammatoires identique à ou dérivé du segment N-terminal de l'annexine I. Les propriétés anti-inflammatoires de ce peptide résultent probablement de son action sur le récepteur du fMLP inhibant ainsi que le chimiotactisme et l'activation des cellules phagocytaires et en particulier leur dégranulation et leur production de métabolites toxiques de l'oxygène. La séquence du segment N-terminal de l'annexine I humaine est la suivante :
AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVKSSKGGP ( SEQ ID NO 33 )
Dans un mode plus général de réalisation, le peptide anti-inflammatoire dérivé du segment N-terminal de l'annexine I sera avantageusement choisi parmi les séquences suivantes :
1 5 10 15 20 25 30
I I I I I I I AMVSEFLKQAWFhaNpEQEYhpoVKooKGGP (S7) (SEQ ID No 34) IN YYIE E DCVQTTQSSHVV C LD Q IKSS TYS M L NC CVP EA GG
La séquence soulignée représente une séquence dite consensus possédant les propriétés anti-inflammatoires recherchées. Sous chaque résidu variable de cette séquence est indiquée une liste de résidus pouvant remplacer celui indiqué dans la séquence consensus : a résidu acide ; h résidu hydrophobe ; p résidu polaire ; o Thr ou Ser de préférence.
II est également possible de choisir une séquence plus courte pour NTAl. On peut ainsi supprimer les huit à treize premiers résidus. On pourra utiliser en particulier utiliser la séquence :
ENEEQEYVQTVKSSKGGP (SEQ ID NO 35 ) (S8)
Toutes les mutations correspondant à ce fragment et indiquées pour la séquence (S7) seront utilisables dans la séquence S8.
II existe dans l'environnement inflammatoire au moins une protéase susceptible de cliver spécifiquement le segment NTAl au niveau de l'un des deux résidus Lysine 25 ou 28 présents dans sa partie N-terminale -Thr-Val-Lys-Ser-Ser-Lys-Gly-Gly-, Ces protéases sont normalement responsables de la libération in vivo du segment N-terminal de l'annexine I.
Dans un premier mode simple de réalisation, le peptide NTAl ou une version judicieusement mutée est simplement intégré à la partie N-terminale du segment C pour l'
former la protéine thérapeutique : NTAl-C. Le segment C est pris ici dans son acceptation la plus large et définie plus haut.
Dans un second mode de réalisation, le peptide NTAl ou une version judicieusement mutée est relié au segment C par l'intermédiaire d'un lien simple clivable par une protéases intervenantes selon la formule F6A ou F6B ou d'un lien multiple comportant un élément de ramification D comme défini plus haut (F5A, F5B).
Dans un autre mode de réalisation, la partie A peut aussi contenir une répétition de l'une des séquences choisi pour le segment NTAl afin d'augmenter la concentration locale du peptide anti-inflammatoire et donc son efficacité.
(NTAl)1n-C (F2)
Pour optimiser le comportement in vivo de la molécule thérapeutique, on choisira de préférence m = 2.
Dans un autre mode de réalisation, il peut être avantageux de lier le segment NTAl à l'extrémité C-terminale du segment C. Pour cette réalisation, on utilisera un lien bifonctionnel de façon à relier entre elles les extrémité C-terminales de C et NTAl : C-L-NTAl
Libération de Cytokines anti-inflammatoires.
Les maladies inflammatoires chroniques, et particulièrement la polyarthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn et le Psoriasis, sont provoquées par un déséquilibre important dans la production dans l' environnement cellulaire d'un certain nombre de molécules de signalisation. L'amplification et la pérennisation du phénomène inflammatoire dans ces maladies résultent d'un équilibre complexe entre un nombre important de protéines aux influences opposées, molécules pro-inflammatoires et molécules anti-inflammatoires.
Parmi les cytokines jouant un rôle anti-inflammatoire, l'interleukine 10 (ILlO) (SwissProt, P22301), ou sur l'une quelconque de ses isoformes, est la plus intéressante par l'effet régulateur qu'elle produit sur la réaction inflammatoire. Mais comme beaucoup de molécules de la signalisation de la réaction inflammatoire, ILlO possède de multiples fonctions dont des fonctions de stimulation du système immunitaire. Il est donc très avantageux de cibler cette protéine au site inflammatoire proprement dit de façon à localiser strictement son action.
L' ILlO agit en tant qu'homodimère sur son récepteur hétéro tétramérique. La structure tridimensionnelle de PILlO et du complexe avec son récepteur, PILlOR, offre un avantage supplémentaire. En effet, la structure du complexe ILlO-ILlOR, montre que les extrémités N et C-terminale de PILlO sont relativement proches dans sa structure. De plus l'extrémité N-terminale est enfouie au cœur du récepteur et l'extrémité C-terminale est située dans la région de dimérisation de cette cytokine. De ce fait, le blocage par le segment C-L ou L-C de l'une des extrémités N ou C-terminale de PILlO, interdit la formation du complexe et finalement bloque son action. L'activation de PILlO ne peut donc se faire que par l'action des protéases intervenantes de l'environnement inflammatoire qui ont pour effet de libérer cette cytokine exclusivement dans cet environnement. Le même raisonnement peut être appliqué à une autre cytokine anti-inflammatoire, P IL 13 (P35225) ou à l'une de ses isoformes.
La molécule thérapeutique basée sur PILlO ou PILl 3 possède l'une des structures générales suivantes, selon le choix fait pour le positionnement de PILlO ou de PIL13 : C-L' 1 -L" 1 -L2-(IL10/IL13) (selon la formule F6A) (ILl 0/IL13)-Ll -V '2-L'2-C (selon la formule F6B)
Le site de clivage des protéases intervenantes est prévu entre L"l et L"l ou entre L"2 et L'2. La longueur du segment résiduel L"l-L2 ou Ll-L"2 est telle qu'elle ne gêne pas la formation du complexe IL10-1L10R ou IL13-lL13Rαl/2. Il est aisé d'ajuster la séquence effective de PILlO pour satisfaire cette contrainte. Dans l'un et l'autre cas le segment Ll ou L2 peut être absent.
Libération d'inhibiteurs de Cytokines pro-inflammatoires. Le segment thérapeutique A peut être sélectionné parmi les inhibiteurs non activants des récepteurs membranaires des cytokines pro-inflammatoires.
Il existe des inhibiteurs naturels de certaines cytokines et notamment de Pinterleukine 1 (ILl), une cytokine pro-inflammatoire dont l'incidence dans les maladies inflammatoires vient immédiatement après celle du TNFα qui est la cytokine dont le rôle est central. L'inhibiteur soluble du récepteur de PILl, PILlR, est une petite protéine, le sILIRa (Swiss-Prot P18510), qui agit en se liant au ILlR ans l'activer, bloquant ainsi de PILl. L'efficacité du sILIRa a été testée dans divers maladies et en particulier dans l'arthrite rhumatoïde et se montre relativement actif. Cependant les doses utilisées chez les malades en injections sous cutanées sont énormes, de 30mg à 150mg. La pharmacocinétique est par ailleurs défavorable puisque le temps de demie- vie dans la circulation n'est que de 21 min, ce qui est très faible pour une utilisation thérapeutique dans le cas de l'arthrite rhumatoïde.
Comme précédemment pour PILlO, l'ensemble C-L-(ILlRa) ou (ILlRa)-L-C est totalement inactif. En effet, la structure du complexe ILlRa-ILlR montre que les extrémités N et C-terminale de PILlRa sont très proches dans la structure et sont enfouies au cœur du récepteur. De ce fait, l'activation de l'inhibiteur ne peut se faire que par l'action des protéases intervenantes de l'environnement inflammatoire qui ont pour effet de libérer l'inhibiteur exclusivement dans cet environnement.
La molécule thérapeutique basée sur PILlRa ou sur l'une quelconque de ses isoformes, possède l'une des structures générales suivantes, selon le choix fait pour le positionnement de PILlRa :
C-L' 1 -L" 1 -L2-(ILlRa) (selon la formule F6A) (ILl Ra)-Ll -L' '2-L'2-C (selon la formule F6B)
Le site de clivage des protéases intervenantes est prévu entre L"l et L"l ou entre L" 2 et L'2. La longueur du segment résiduel L"l-L2 ou Ll-L"2 est telle qu'elle ne gêne pas la formation du complexe ILl-ILlRa. Comme pour PILlO, il est aisé d'ajuster la séquence effective de PILlRa pour satisfaire cette contrainte. Dans l'un et l'autre cas le segment Ll ou L2 peut être absent.
Libération de médicaments anti-inflammatoires.
II existe de nombreuses molécules non peptidiques possédant des propriétés antiinflammatoires importantes comme les Glucocorticoïdes, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), le Méthotrexate. a) Les Glucocorticoïdes :
Initialement, les Glucocorticoïdes sont des molécules hormonales naturelles produites par l'organisme et interviennent dans de nombreux processus physiologiques. Leur action est strictement intracellulaire et intervient par leur liaison à des récepteurs nucléaires induisant la transcription d'un certain nombre de gènes, d'où le rôle complexe de ces hormones à de multiples étapes de la réaction inflammatoire. L'utilisation des Glucocorticoïdes et de leurs dérivés non naturels comme médicament est donc toujours très délicate alors que leur efficacité peut être très grande. Leur ciblage et leur libération stricte dans l'environnement inflammatoire sont donc cruciaux.
Les Glucocorticoïdes sont des molécules stéroïdiennes, donc assez hydrophobes, et leurs action s'effectue au niveau du noyau cellulaire après diffusion passive à travers la membrane plasmique. Pour une utilisation comme médicament ciblé, les Glucocorticoïdes peuvent donc être simplement libérés dans l'environnement inflammatoire.
Toutes ces molécules comportent des fonctions chimiques, par exemple des groupes hydroxyles, permettant leur greffage sur des molécules peptidiques et en particulier sur un segment L clivable par des protéases intervenantes comme pour les composés anti- tumoraux.
La molécule thérapeutique basée sur les Glucocorticoïdes possède l'une des structures générales suivantes, selon le choix fait pour le positionnement de la molécule par rapport au segment de ciblage : C-L' 1 -L" 1 -L2-(0-Glucocorticoïde) (selon la formule F6 A) (Glucocorticoïde-0)-Ll-L' '2-L'2-C (selon la formule F6B)
Sous cette forme ces molécules sont totalement inactives.
L'action des protéases intervenantes libère soit la molécule L"l-L2-(O-Glucocorticoïde) soit la molécule (Glucocorticoïde-O)-Ll-L"2, c'est à dire une pro-drogue qui doit diffuser passivement dans les cellules environnantes où elles seront traitées par les protéases et estérases endogènes pour libérer finalement la molécule active. Dans cette application particulière de la présente invention, il est donc important que les segments L"l-L2 ou Ll-L"2 soit hydrophobes et les plus court possibles, compte tenu des capacités de clivage des protéases intervenantes. Il est avantageux de limiter à deux le nombre de résidus voire à un le nombre de résidus dans L"l ou L"2. Il peut être aussi avantageux de ne pas introduire les segment Ll ou L2.
b) Les anti-inflammatoires non stéroïdiens :
Les anti-inflammatoires non stéroïdiens forment une des classes de médicament les plus prescrits. Ce sont pour la plus part des inhibiteurs des cyclo-oxygénases (COX-I et COX- 2), des enzymes importantes intervenant dans le métabolisme de l'acide arachidonique. Ce sont des médicament généralement réservés au traitement des maladies inflammatoires sévères et utilisés à des doses généralement très élevées et donc génératrices d'effets secondaires indésirables. Parmi les AINS, il existe une classe de composés possédant une fonction carboxylique utilisable pour leur greffage sur des molécules peptidiques et en particulier sur un segment L clivable par des protéases intervenantes comme pour les composés anti-tumoraux ou anti-inflammatoires mentionnés plus haut. Parmi ces composés on mentionnera l'Aspirine, l'Olsalazine, le Diclofénac, l'Etodolac, le Sulindac, l'Idométacine, le Ténidap et l'ensemble des dérivés de l'acide propionique comme Plbuprofène, l'acide Tiaprofénique, le Naproxène, le Kétoprofène et d'une façon générale « profénides ». D'autres familles de composés sont aussi utilisables, les acides anthraniniliques et apparentés comprenant le groupe des fénamates comme l'acide méfénamique, le groupe des dérivés de l'acide nicotinique comme l'acide niflumique.
Comme l'ensemble de ces composés anti-inflammatoires sont des acides carboxyliques, ils devront être fixés à l'extrémité N-terminale du lien peptidique clivable selon la formulation suivante :
(AINS)-CONH-L' '2-L'2-C
Cette configuration est avantageuse en ce qu'elle permet l'introduction de la molécule d'AINS directement en fin de synthèse peptidique en phase solide du segment L"2-L'2. Dans ce mode de réalisation, le segment L"2 devra être suffisamment court et hydrophobe pour permettre la diffusion passive du segment actif (AINS)-CONH-L"2 à travers la membrane plasmique des cellules cibles. Si, pour des raisons particulières, il est nécessaire d'utiliser l'extrémité C-terminale selon la formule : C-L'1-L"1-L2-(AINS), le segment L2 devra dans ce cas être bi-fonctionnel et hydrophobe comme par exemple l'aminoéthanol : L2 = H2N-CH2-CH2-OH.
c) Le méthotrexate
Le méthotrexate possède également des propriétés anti-inflammatoires et peut être utilisé de la même façon que pour ses propriétés anti-tumorales décrites plus haut.
Réalisation d'inhibiteurs des récepteurs memhranaires de la famille des TNFR.
L'homotrimérisation stricte des domaines extracellulaires en l'absence du ligand est un élément important du fonctionnement correct des TNFR. Cette trimérisation du récepteur vide est assuré essentiellement par un segment N-terminal comprenant le domaine extracellulaire CRDl. Les interactions protéine-protéine sont très spécifiques et évitent ainsi la formation d'hétérotrimères dus à la présence de récepteurs différents à la surface d'une même cellule. On met à profit cette propriété pour produire de nouveaux inhibiteurs spécifiques de n'importe quelle protéines membranaires de la famille des TNFR.
Ces inhibiteurs utilisent un peptide, nommé ici PCRDX, comprenant au moins le domaine CRDl d'un TNFR quelconque X pour bloquer la trimérisation de celui-ci de façon très spécifique et donc bloquer sa fonction : en se liant à une sous unité membranaire du TNFR (monomère), le peptide PCRDX libre, sous la forme de monomère ou de dimère, bloque la trimérisarion de cette sous unité membranaire sans activer le récepteur puisque celui-ci ne peut plus acquérir sa structure trimérique.
Dans un mode de réalisation simple, on pourra utiliser un peptide PCRDX, ou une version mutée de ce domaine, lié au segment C par un lien L1-L2 clivable par l'une des protéases intervenantes généralement présentes dans l'environnement inflammatoire de façon à ne libérer l'inhibiteur qu'au site inflammatoire ciblé. La structure générale de la molécule thérapeutique de la présente invention est donc : C-L1-L2-PCRDX ou PCRDX-Ll -L2-C Où le clivage s'effectue entre Ll et L2.
La structure C- L1-L2-PCRDX est directement active car elle laisse libre l'extrémité C- terminale du CRDl permettant sa liaison au CRDl d'un récepteur cellulaire.
La structure PCRDX- L1-L2-C possède l'avantage supplémentaire de ne rendre actif le segment CRDl que lorsque celui-ci est libéré par le clivage du segment L1-L2 limitant ainsi d'autant le risque d'effets secondaires. En effet dans cette configuration l'extrémité C-terminale du PCRDX est encombrée par la présence du segment L1-L2-C, inadapté à toute interaction avec un domaine extracellulaire d'un TNFR, rendant ainsi plus difficile sont interaction avec celui-ci. L'activité est recouvrée par le clivage du lien L1-L2.
La liste suivante donne des exemples de séquence minimum que doivent contenir les divers segments PCRDX possibles utilisables comme inhibiteur de la trimérisation du TNFRl et du TNFR2 :
Inhibiteur du TNFRl
DSVCPQGKYI HPQNNSICCT KCHKGTYLYN DCPGPGQDTD CRECESGSFT ASENHLRHCL SS ( SEQ ID No 36 )
Inhibiteur du TNFR2
PGTCRLREYY DQTAQMCCSK CSPGQHAKVF CTKTSDTVCD SCEDSTYTQL WNWVPECLSS
(SEQ ID No 37)
Ces séquences peuvent être mutées, notamment dans la région d'interaction avec les récepteurs TNFRl et du TNFR2 originaux, afin d'augmenter leur affinité avec ces récepteurs.
Des séquences analogues provenant de n'importe quel récepteur de cytokines de la famille des TNF peuvent être utilisées pour produire des inhibiteurs spécifiques de ces récepteurs.
Le lien clivable L1-L2 peut être avantageusement choisi parmi les séquences peptidiques reconnues et clivées par les protéases spécifiques dont le rôle est de libérer la partie extracellulaire des TNFR membranaires ou des précurseurs membranaires des TNF. Ces protéases appartiennent à la famille des ADAM déjà mentionnées. Parmi ces protéases, on choisira en particulier la protéase ADAM- 17 ou TACE spécifique de la libération du TNFα et du TNFβ (LTβ) et on choisira en conséquence la séquence du segment L1-L2 de telle sorte qu'il contienne l'une des séquence suivantes :
L1*L2 = SPLAQA*VRSSSR (SEQ ID No 38) ou fragments de celle-ci, PLAQ A* VRSSS (SEQ ID No 39), LAQA*VRSS (SEQ ID No 40), AQA*VRS (SEQ ID No 41), QA*VR (SEQ ID No 42), ou toute combinaison des groupes de séquences situées de part et d'autre du site de clivage marqué par une astérisque comme par exemple . PLAQA*VRS (SEQ ID No 43) ou AQA*VRSS (SEQ ID No 44), etc.
UTILISATIONS DES MOLECULES DE CIBLAGE ET DE LIBERATION DE COMPOSE THERAPEUTIQUE
Les molécules de l'invention peuvent être construites pour cibler différents types de cellules ou de tissus pathologiques, de préférence chez l'homme. Elles peuvent être utilisées pour la préparation de médicaments et/ou dans des méthodes de traitement thérapeutique.
Ainsi, un objet particulier de l'invention consiste en une composition pharmaceutique comprenant une molécule chimère telle que définie ci-avant.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une molécule chimère telle que définie ci-avant pour la préparation d'un médicament. Dans un mode préféré de réalisation, ces médicaments sont des médicaments anti-tumoraux ou anti-inflammatoires.
Lorsque le composé thérapeutique A est un anti-inflammatoire, les molécules selon l'invention peuvent être utilisée pour la préparation de médicaments destinés à des pathologies aiguës comme l'asthme, la rectocolite hémorragique, la maladie de Crohn, le choc septique, les maladies du collagène et l'arthrite.
Lorsque le composé thérapeutique A est un anti-cancéreux, l'invention est utilisable pour le traitement de différentes tumeurs, notamment de tumeurs solides ou liquides ou hématopoïétiques, en particulier de cancers du sein, du poumon, de l'intestin, du colon et du rectum, du cerveau, des méninges, de l'estomac, de l'oesophage, du foie, du pancréas, de la vessie, tête-et-cou, des appareils reproductifs mâles ou femelles, de la peau, etc.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent comprendre tout excipient ou véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique, tel que sel, solutés, etc. Il peut s'agir de solutions salines, tamponnées, isotoniques, d'eau, etc. Les compositions peuvent comprendre, en outre, d'autres agents actifs, utilisés en combinaison, de manière simultanée, séparée ou espacée dans le temps.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation des molécules de ciblage telles que définies ci-avant pour la délivrance locale de principes actifs dans le voisinage de tissus pathologiques chez des sujets.
La présente invention concerne en outre des méthodes de traitement d'une pathologie chez un sujet comprenant l'administration d'une molécule ou d'une composition telles que définies ci-avant. De préférence, la pathologie concernée et un cancer ou une inflammation. La méthode de traitement peut comprendre en outre une étape préalable consistant en un traitement permettant de générer des cellules engagées dans un processus d'apoptose dans le tissu pathologique. Elle concerne également des méthodes de délivrance locale de principes actifs dans le voisinage de tissus pathologiques chez des sujets, comprenant l'administration d'une molécule ou d'une composition telles que définies ci- avant.
Dans le contexte de l'invention, le terme « traitement » désigne le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, réduction de la taille d'une tumeur ou de la progression de la pathologie, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie, diminution du site inflammatoire), etc. Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents ou traitements (chimiothérapie, radiothérapie, thérapie génique, etc.). Les traitements et médicaments de l'invention sont tout particulièrement destinés aux humains.
Pour la mise en œuvre des méthodes thérapeutiques définies ci-avant, le composé thérapeutique peut être utilisé à différentes doses et selon différents protocoles. L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par injection, typiquement par voie intra-péritonéale, intra-tumorale, intradermique, intra-cérébrale, intra-veineuse, intra-artérielle ou intra-musculaire. Les doses administrées peuvent être adaptées par l'homme de l'art. Typiquement, de 0,01 mg à 100 mg / kg environ sont injectés. Il est entendu que des injections répétées peuvent être réalisées. L'invention est utilisable chez les mammifères, notamment chez l'être humain.
EXEMPLES
Example 1 : Exemple de réalisation de segments L clivables pour la libération de composés anti-tumoraux et anti-inflammatoires :
Si le segment L est uniquement peptidique et ne contient que des résidus naturels, il sera de préférence intégré dans le segment C à son extrémité N ou C-terminale par les méthodes classique de la biologie moléculaire. H pourra cependant être intégré si nécessaire au segment A si celui est peptidique et obtenu par biologie moléculaire.
Dans un mode de réalisation particulier, il y aura avantage à préparer de façon extemporanée le segment L ou l'ensemble L-A sous une forme réactive pour une liaison ultérieure au segment C. Un exemple intéressant se présente dans le cas où un groupe thiol amené par un résidu Cystéine est présent dans le segment C, de préférence loin du site de liaison de C aux membranes chargées négativement. Ce groupe thiol permet, par une réaction chimique simple, rapide et totale, de lier l'ensemble L-A muni du groupe fonctionnel maléimide.
Le protocole de synthèse est décrit dans la figure 1. Le fragment L consiste en un peptide protégé lié à une résine acide-labile rink via la stratégie FMOC bien connue de l'homme de l'art. Le fragment réactif possède la propriété de former une liaison covalente avec un groupe nucléophile - ici le groupe SH d'une Cystéine - de la protéine C. Le groupe réactif peut être un bromoacétamide ou, comme ici et de façon plus avantageuse, un groupe maléimide. Le groupe espaceur entre le maléimide et le peptide L peut être un groupe alkyl, alkoxy ou poly alkoxy terminé par une fonction carboxylique pour le couplage à L. Dans l'exemple de la figure 1, le segment thérapeutique est un composé anti-tumoral de la famille de antracycline, la doxorubicine. Dans la figre 1, AA représente n'importe quelle séquence d'aminoacides pouvant constituer un lien clivable. L'exemple décrit ci-dessous correspond à la séquence AA ≈ Gly-Ser-Gly-Val-Leu.
Synthèse du Fmoc-Leu-Résine rink acide (1) : 5 g de résine rink 100-200 Mesh (approximativement 0,35-0,80 mmole/g), Fmoc-Leu-OH (3,2 mmoles) et la DCCI (3,37 mmoles) sont agités pendant 5 minutes de O0C à 50C dans 50 ml de DCE, puis 60 mg de DMAP (0,5 mmole) sont ajoutés et après 20 minutes supplémentaires à 5°C, 275 μl de N-méthylmorpholine (2,5 mmoles) sont ajoutés. Le mélange est agité pendant 4 heures. La résine filtrée est lavée avec 40 ml (pour 30 s chaque fois) par les solvants suivants : 3 fois méthanol, 3 fois DCE, 3 fois DMA. Les groupes hydroxyle non réagis de la résine sont bloqués avec l'anhydride acétique (13,5 mmoles) dans 3 ml de pyridine et 15 ml de DMA puis la résine est lavée comme suit (40 ml chaque fois) : 2 fois isopropanol, 3 fois DMA, 2 fois isopropanol, 6 fois DCE, 2 fois isopropanol, 3 fois DMA, 3 fois isopropanol. La résine est ensuite séchée sous vide et a un contenu en Fmoc d' environ 0,35 mmole/g.
Synthèse du Fmoc-Gly-Ser(Trt)-Gly-Val-Leu-Résine rink acide (2) :
Lavage et enlèvement du groupe Fmoc à température ambiante :
1 g de Fmoc-Leu-Résine rink acide (0,35 mmole) est traité de la façon suivante chaque fois 3 minutes avec 20 ml de 1 fois isopropanol, 4 fois DMA, 6 fois 20% pipéridine dans le
DMA, 2 fois DMA, 1 fois isopropanol, 4 fois DMA.
Couplage Fmoc-AAn-OH :
DIEA (3,5 mmoles) dans 10 ml de DMA est ajouté à la résine. Après le gonflement de la résine, les aminoacides protégés par le Fmoc (1,75 mmoles) et le HBTU (1,72 mmoles) dans du DMA sont ajoutés. Après 40 minutes la résine est rincée avec 4 fois 40 ml de
DMA.
Synthèse du H-Gly-Ser(Trt)-Gly-Val-Leu-Résine rink acide (3) :
La forme N-terminale libre du peptide protégé et lié à la résine est obtenu par le protocole de clivage et lavage identique au protocole (2)°.
Synthèse du composé réactif (4) : A 1 g de résine (3) (3,5 mmoles dans le DMA) on ajoute 3,5 nimoles de DIEA, 1,75 mmoles de N-maléoyl-β-alanine et 1,72 mmoles de HBTU. Après 2 heures, la résine est lavée avec 4 fois 20 ml de DMA puis séchée sous vide.
Séparation du peptide protégé de la résine pour obtenir (5) :
La résine est dispersée dans le DCM et traitée par 20 ml de mélange de clivage AcOH/DCM (10/90 v/v) pendant une heure puis est filtrée, lavée 3 fois avec 20 ml de mélange de clivage puis 3 fois 20 ml de DMA pour extraire le peptide de la résine. De l'hexane (15 fois le volume) est ajouté au filtrat pour enlever l'acide acétique sous forme azéotrope. Le peptide protégé résultant est séché sous vide et purifié par chromatographie « flash ».
Couplage du peptide protégé au composé anti-tumoral doxorubicine :
A l'abri de la lumière, on ajoute au composé (5) (0,3 mmole dans 2 ml de DMA), 3 mmoles de DIEA, 0,3 mmole de HBTU et 0,3 mmole de Doxorubicine. Après 2 heures, le solvant est évaporé et le produit brut est dilué dans l'acétonitrile, purifié par chromatographie « flash » sur gel de silice.
Synthèse du composé final (7) : A l'abri de la lumière, le composé (6) est dilué dans une solution à 1% de TFA et 5% de triéthylsilane dans le DCM. Après 2 heures, le produit brut est évaporé sous vide puis dissout dans l'acétonitrile, purifié par HPLC et lyophylisé.
Exemple 2 : Synthèse d'un lien mixte peptidique et non-peptidique pour la libération de composés anti-tumoraux.
La partie non peptidique du lien est introduit à l'aide du composé (12), obtenu selon le schéma de la figure 2, en remplacement de la N-maléoyl-β-alanine utilisée dans la synthèse précédente (figure 1). Le schéma de la figure 2 décrit un lien de structure générale et le protocole qui suit décrit le cas particulier m=l , n=2, o=l .
A une solution de 2-(2-aminoethoxy)-éthanol (47,55 mmol) (8) dans 100 ml de dichlorométhane, on ajoute au goutte à goutte à 0°C une solution de t-butylpyrocarbonate (47.55 mmol) dans 50 ml de dichlorométhane. On laisse remonter à température ambiante et après deux heures, on évapore à sec le mélange réactionnel. On obtient le carbamate désiré (9) sous forme d'une huile incolore.
A une solution de PPH3ZDIAD (7.5 mmol) dans 25ml de THF fraîchement distillé est ajouté, à 0°C, l'alcool néopentylique (7.5 mmol), le carbamate précèdent (9) (7.5 mmol) et le maléimide (7.5 mmol). On laisse ensuite la réaction à température ambiante pendant la nuit. Le brute réactionnel est évaporé à sec puis flash chromatographié sur silice pour donner le produit attendu (10).
A une solution du carbamate précédent (10) (6.5 mmol) dans 40 ml de dichlorométhane est ajouté 30 ml d'acide trifluoroacétique. La mixture est laissée aux ultrasons 10 minutes puis agitée à température ambiante 1 heure. Les solvants sont évaporés et le résidu lavé au chloroforme (3x) et à l'éther (4x). Le produit obtenu (11) sous forme de trifluoroacétate est utilisé tel quel à l'étape suivante.
Au sel de trifluoroacétate du produit précèdent (11) (6 mmol) en suspension dans le dichlorométhane (3OmL), est ajouté à température ambiante le DIEA (12 mmol). Après une heure, on ajoute l'anhydride diglycolique (6.5 mmol). Après deux heures, on évapore à sec et on purifie le produit (12) par flash chromatographié sur silice.
Le composé (12) est ensuite utilisé comme le composé N-maléoyl-β-alanine pour la synthèse d'un lien clivable mixte selon le protocole décrit dans la Figure 1 pour les composés (5) et (6).
Exemple 2b : Synthèse d'un bras comportant un groupe d'espacement et un groupe peptidique clivable et couplage d'une part à une molécule de ciblage C et d'autre part à la doxorubicine.
Le composé (12) de la Figure 2 avec n=2, M=I et o=l a été couplé au peptide AAn= GIy- Gly-Ala-Leu selon la méthode décrite précédemment (Exemple 2). La molécule obtenue a été couplée à la doxorubicine selon la méthode décrite dans l'exemple précédent (Figure 1) pour obtenir le composé (12) suivant :
Figure imgf000043_0001
Composé (12)
Le composé 12 a ensuite été couplé à un segment de ciblage C-SH de la famille (S5) grâce au groupe SH que celui-ci comporte et selon le protocole général suivant : A 4,5mg de C-SH lyophilisé (1 équivalent) dans 5,4mL de tampon PBS (pH = 6.7) dégazé à l'azote, on a ajouté une solution de 1 équivalent de (12) (0,54 mg) dans 540μL de DMSO. On a laissé la réaction se poursuivre Ih à température ambiante puis le mélange réactionnel a été lyophilisé.
Le lyophylisat a été repris dans un mélange H2O /DMSO 50/50 (2mL) et a été purifié par HPLC (colonne Source 15RPC 10x250 mm). La fraction correspondant au composé final C-S-(12) a été collectée puis lyophilisée.
Le composé final C-S-(12) a été ultérieurement soumis à l'action des différentes protéases (MMP2, MMP3 et MMP9) selon le protocole suivant :
On a préparé une solution de C-S-(12) (60μM) soit 0,6mg dans ImL dans un tampon Tris- HCl 5OmM pH=7,5. On a séparé ce lot en 3 aliquots de 33OμL chacun. A chaque aliquot, on a ajouté une des MMP après activation (MMP2, MMP3 et MMP9) environ 0,5μg de chaque enzyme. On a laissé incuber 5 heures à température ambiante. Les aliquots ont ensuite été purifiés par HPLC et les différents pics absorbants à 495nm ont été analysés en ESI-TOF. Exemple 3 : Construction et production anti-inflammatoire NTAl-C.
Deux constructions sont proposées qui correspondent l'une à la version longue de NTAl nommé NTAIl, selon la séquence S7 (Seq ID 33) et l'autre à la version courte, nommé NTAIc, selon la séquence S8 (Seq ID 35).
NTAIc + :
5 ' P-CGAAAACGAAGAACΆGGAATACGTTCAGACCGTTAAATCTTCTAAAGGTGGTCCGG-S ' (SEQ ID No 45)
N TAIc - :
5 ' P-GATCCCGGACCACCTTTAGAAGATTTAACGGTCTGAACGTATTCCTGTTCTTCGTTTTCGGGCC- 3 '
(SEQ ID No 46)
N TAIl + :
5 ' P-
CGCTATGGTTTCTGAATTCCTGAAACAGGCTTGGTTCATCGAAAACGAAGAACAGGAATACGTTCAGAC CGTTAAATCTTCTAAAGGTGGTCCGG-3' (SEQ IDNo 47) N TAIl - :
5'P-
GATCCCGGACCACCTTTAGAAGATTTAACGGTCTGAACGTATTCCTGTTCTTCGTTTTCGATGAACCAA GCCTGTTTCAGGAATTCAGAAACCATAGCGGGCC-3'
(SEQ ID No 48) Ban 11 + :
5 ' -GCGCTGTTAGCGGGTCCATTAAGTTCTGTC-3 ' (SEQ ID No 49) Ban II - :
5 ' -GACAGAACTTAATGGACCCGCTAACAGCGC-3 '
(SEQ ID No 50)
Les plasmides pGEX 6Pl utilisés sont commerciaux (Amersham biosciences) ainsi que les enzymes (Biolabs) utilisés : BamH I, EcoR I, Ban II, T4 DNA Ligase, CIP, T4 kinase.
Construction de NTAIc-C et NTAIl-C dans pGEX 6P
Le vecteur d'expression utilisé est le vecteur pGEX 6Pl (Amersham-Biosciences). Ce vecteur permet l'expression de la protéine d'intérêt fusionnée à la GST à son extrémité Nter. La protéine d'intérêt est récupérée sans protéine de fusion après digestion par la PreScission. La séquence codante du segment C (provenant du vecteur pGEX2T, construit au laboratoire) sera insérée dans ce vecteur entre les sites BamH I et EcoR I. Le segment NTAIl ou NTAIc sera ensuite inséré sous forme de cassettes dans le vecteur pGEX 6P contenant la séquence codante du segment C entre les sites Ban II et BamH I.
Le vecteur pGEX 6P possède deux sites Ban IL La première étape consiste donc à rendre ce site unique afin de l'utiliser comme site de clonage du segment NTAl. Le site Ban II situé en position 3890 est enlevé par une étape de mutagenèse dirigée silencieuse (kit Quick Change, Stratagène, oligos Ban II + et Ban II -) en suivant les recommandations du fournisseur. Le plasmide « pGEX-6P-mut » est alors obtenu.
La séquence codante du segment C est extraite du plasmide pGEX2T par digestion enzymatique à l'aide des enzymes de restriction BamH I et EcoR I (Biolabs). Brièvement, 20 μg d'ADN est digéré séquentiellement par 200 U d'enzyme, à 37°C pendant la nuit. Après chaque digestion, l'ADN est purifié après migration sur gel d'agarose à l'aide du kit « GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit » (Amersham-Biosciences). 20 μg de plasmide « pGEX-6P-mut » est également digéré dans les mêmes conditions par BamH I et EcoR I afin d'obtenir le vecteur dans lequel les séquences codantes seront insérées. Afin d'éviter une recircularisation du vecteur, celui-ci est déphosphorylé par une incubation de 2h à 370C en présence de 2 U de CIP (Biolabs). Le vecteur « pGEX-6P-mut », ouvert en BamH I / EcoR I et déphosphorylé, est ensuite purifié à l'aide du kit Amersham. La ligation de la séquence codante du segment C (10 moles d'insert pour 1 mole de vecteur) dans le vecteur « pGEX-6P-mut » est ensuite réalisée par incubation de 2h à température ambiante en présence de 400 U de T4 DNA ligase (Biolabs). Les plasmides pGEX-6P-mut contenant la séquence codante du segment C sont alors obtenus.
Les cassettes «NTA11 » et «NTAlc » sont obtenues par hybridation de 100 pmol des oligos complémentaires (NTAlc + / NTAlc - et NTAIl + / NTAIl -) à 95°C pendant 5 min dans un tampon Tris HCl 20 mM ρH7,5 ; NaCl 300 mM ; EDTA 1 mM. Les extrémités 5' des cassettes sont ensuite phosphorylées par une incubation à 37°C pendant 2h en présence de 50 U de T4 polynucléotide kinase (Biolabs). L'enzyme est inactivée par incubation à 65°C pendant 20 min.
La dernière étape consiste à digérer les plasmides pGEX-6P-mut la séquence codante du segment C par Ban II et BamH I afin d'insérer les cassettes. 20 μg d'ADN est digéré séquentiellement par 50 U de Ban II et 100 U de BamH I, à 37°C pendant la nuit. Après chaque digestion, l'ADN est purifié après migration sur gel d'agarose à l'aide du kit Amersham. La déphosphorylation des vecteurs est réalisée par incubation à 37°C pendant Ih en présence de 10 U de CIP, afin d'éviter leur recircularisation lors de l'étape de ligation. La ligation des cassettes dans les vecteurs est réalisée comme décrite précédemment. On obtient donc les séquences NTAIc-C et NTAIl-C clonées dans le vecteur pGEX-6P-mut.
Après chaque construction les séquences d'ADN sont vérifiées avec le kit de séquençage Big Dye Terminator, Perkin-Elmer Applied Biosystems, sur un séquenceur Perkin-Elmer Abiprism 310, selon le protocole du fournisseur.
Expression de NTAIc-C et NTAIl-C chez E. coli
L'expression est réalisée chez une souche d'E. coli BL21 gold (Stratagène) à 30°C. Les bactéries sont mises en culture dans un milieu Luria Berthani (Gibco) contenant 150 mg/L d'ampicilline. Lorsque la turbidité des cultures atteint une densité optique à 600 nm
(DO6O0) de 0,6, l'expression des protéines est induite par l'ajout de 1 mM IPTG (Sigma) et maintenue pendant 4h. Les bactéries sont alors centrifugées à 5,000 rpm (centrifugeuse
JLAl.8000, Beckman) pour 10 min à 4°C et re-suspendues dans 20 mL de tampon S complet (20 mM Tris-HCl pH 7,6 ; 500 mM NaCl ; 1 mM EDTA ; 2% glycérol (v/v) ; 1% triton XlOO (v/v)) supplémenté avec 0,1 mM de PMSF (Sigma) en éthanol ; 0,5 mM de
DTT (Sigma) et 50 mg de lysozyme (Sigma). Après une incubation d'ih à 4°C, les extraits sont homogénéisés par 10 sonications de 1 min (amplitude 65%, 1 sec sonication, 1 sec repos) avec un repos d'1 min entre chaque sonication. Les protéines présentes dans la fraction soluble (surnageant) sont alors récupérées par centrifugation à 20,000 g, pendant
45 min à 4°C.
Purification de NTAIc-C et NTAH-C sur colonne GSTrap
10 mL de la fraction soluble est prélevée et diluée dans 20 mL de tampon de liaison (50 mM Tris-HCl pH7,5 ; 150 mM NaCl). Les protéines sont alors purifiées par chromatographie d'affinité sur colonne GSTrap Fast Flow (Amersham-Biosciences). Une colonne de 5 mL est préparée suivant les instructions du fabricant. L'échantillon protéique (30 mL) est chargé sur la colonne et cette dernière est lavée avec 10 volumes de tampon de liaison. Après un lavage supplémentaire avec 10 volumes de tampon de coupure (50 mM Tris-HCl pH7,5 ; 150 mM NaCl ; 1 mM EDTA ; 1 mM DTT), la protéine est incubée directement sur la colonne avec 100 U de PreScission (Amersham-Biosciences) à 4°C pendant 2Oh. La protéine d'intérêt sans partenaire de fusion est ensuite récupérée par lavage avec 15 mL de tampon de coupure.
Purification de NTAIc-C et NTAIl-C par gel filtration
Une colonne HiLoad 26/60 Superdex 75 (300 mL) (Amersham-Biosciences) est équilibrée à l'aide de 2 volumes de tampon A (bicarbonate d'ammonium 150 mM pH 7,9). La protéine issue de la purification par GSTrap est alors injectée, et son élution est réalisée avec 2 volumes de tampon A. La protéine ainsi purifiée est aliquotée, lyophilisée et conservée à 20°C.
Figures Figure 1 : Synthèse de la prodrogue avec AAn = Gly-Ser-Gly-Val-Leu comme substrat pour la MMP2, MMP3 et MMP9 et la N-maleoyl-beta-alanine comme segment réactif de liaison.
Figure 2 : Synthèse du lien non-peptidique long en remplacement du lien court de la N- maleoyl-beta-alanine utilisé dans le protocole précédent. Synthèse à partir de la 2-(2- aminoethoxy)-éthanol (8) (m=l, n=2, o=l)
Abbreviations : AcOH : acide acétique ; DCCI : N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide ; DCE : 1,2 Dichloroéthane ; DCM : Dichlorométhane ; DIEA : Diisopropylsilane ; DMA : Diméthylacétamide ; DMAP : 4-Diméthylaminopyridine ; HBTU : 2-(lH-Benzotriazole-l- yl)-l,l,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate ; TFA : acid trifluoroacetique

Claims

REVENDICATIONS
1- Molécule comprenant trois segments :
- un segment de ciblage C capable de se lier aux membranes de cellules engagées dans un processus d'apoptose ;
- un segment thérapeutique A comprenant un composé biologiquement actif ; et un segment de liaison L entre le segment de ciblage et le segment thérapeutique, ladite liaison étant clivable in vivo dans l'environnement d'un tissu ou d'une cellule en apoptose.
2- Molécule selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit segment de liaison L comprend une fonction chimique reconnue et clivée par une enzyme ou un ensemble d'enzymes spécifiques de l'environnement des cellules ciblées.
3- Molécule selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit segment de liaison L comprend une séquence reconnue et clivée par une protéase majoritairement présente dans le tissu ciblé, plus particulièrement choisie parmi une métallo-protéase de la matrice extra- cellulaire, une urokinase, et une protéase spécifique du clivage du segment extracellulaire des cytokines membranaires ou de leurs récepteurs.
4- Molécule selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit segment de liaison L comprend une séquence sélectionnée en ce qu'elle contient au moins un couple de résidus B1-B2 donné dans le tableau suivant :
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
où X est résidu aminoacide quelconque naturel ou non.
5- Molécule selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit segment de ciblage C est capable de se lier aux membranes comportant des lipides dont la charge électrostatique totale est négative, notamment la phosphatidylsérine.
6- Molécule selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit segment de ciblage comprend la séquence peptidique suivante : J^^-J^J^-U8-!^
J28.u29.J30_j31_R_J33_J34_J35_J36_B37.J38_J39_u40_J41_J42_J43_u44_J45.J46_J47_J48_J49_R_j5l_u52^ J53.J54_D_U56_K_S.Z59_L_J61_J62_J63_J64_Z65_J66_J67_U68_J69_J7O_J71_U72_J73_J74_J75_J76
(Sl) dans laquelle J, Z, U, X, et B représentent des acides aminés tels que : - les acides aminés J sont choisis indépendamment les uns des autres parmi les acides aminés naturels, ou des dérivés de ceux-ci, de telle manière qu'au moins 50 % d'entre eux sont des résidus polaires choisis parmi R, N, D, C, Q, E, G, H, K, Orn, P, S, T et Y,
- les acides aminés U sont choisis parmi A, C, G, I, L, M, F, W, Y, et V,
- l'acide aminé X18 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi A, N, C, Q, G, H, I, L5 M, F, S, T, W, Y et V,
- l'acide aminé B37 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi R, A, C, G, I, L, M, F, W, Y, et V,
- l'acide aminé Z7 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi D et E, - les acides aminés Z59 et Z65 sont choisis indépendamment parmi E, D, K, et R, les exposants indiquant la position des acides aminés dans la séquence.
7- Molécule selon la revendication 6, caractérisée en ce que les acides aminés U et B sont choisis suivant un des exemples exposés ci-dessous :
Figure imgf000050_0001
8- Molécule selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit segment de ciblage C comprend une séquence sélectionnée parmi le groupe constitué des séquence SEQ ID Nos 23-32.
9- Molécule selon l'une des revendications 1-5, caractérisée en ce que ledit segment de ciblage C comprend la séquence de tout ou partie d'une annexine, d'un domaine de type Cl ou C2 des facteurs de coagulation sanguine, d'un domaine V d'une protéine de la famille des 2-Glycoprotéines-I, d'un domaine de type FYVE, d'un domaine de type PH, ou un fragment ou un dérivé présentant au moins 50 % d'identité.
10- Molécule selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit segment de ciblage C comprend une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID Nos 1-16 et 17-22, de préférence SEQ ID Nos 2-4, 6-8, 10-12, 14-16 et 19-22 ou un fragment de celle-ci.
11- Molécule selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit segment thérapeutique A présente une activité anti-tumorale.
12- Molécule selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit segment thérapeutique A est sélectionné parmi le groupe constitué d'une molécule de la famille des TNFα ou dérivés de ceux-ci (TRAIL-Do), d'une molécule d'IL4 humaine ou de l'une de ses isoformes, d'une molécule de la famille des anthracyclines ou l'un de ces dérivés actifs, de préférence la doxorubicine, d'une molécule de taxane comme le paclitaxel ou le docetaxel ou l'un de ces dérivés actifs, d'une molécule de méthotrexate ou l'un de ces dérivés actifs, du 2-méthoxyestradiol ou l'un de ces dérivés actifs, de molécules de la famille des 5 antipyrimidines comme la cytosine arabinoside ou la difluoro-déoxy-cytidine ou l'un de ces dérivés actifs, de molécules de la famille des agents alkylants dérivés des moutardes à l'azote comme la phénylalanine-moutarde (Melphalan) ou d'un dérivé comme le Chlorambucyl.
10 13- Molécule selon l'une des revendications 1-10, caractérisée en ce que ledit segment thérapeutique A présente une activité anti-inflammatoire.
14- Molécule selon la revendication 13, caractérisée en ce que ledit segment thérapeutique A est sélectionnée parmi le groupe constitué par un segment N-terminal de l'annexine I
15 humaine, en particulier NTAl, les cytokines anti-inflammatoires, et en particulier HLlO et PILl 3 ou l'un de leurs mutants appropriés, les inhibiteurs non activants des récepteurs membranaires des cytokines pro-inflammatoires comme en particulier l'inhibiteur du récepteur de FILl ou un mutant approprié de cet inhibiteur, les glucocorticoïdes, les antiinflammatoires non stéroïdiens ou de leurs dérivés considérés comme des inhibiteurs des
20 enzymes cylo-oxygénase 1 et 2, et le Méthotrexate, un inhibiteur des récepteurs membranaires de la famille des TNFR, en particulier des peptides contenant ou moins le domaine extracellulaire CRDl correspondant.
15- Composition pharmaceutique comprenant une molécule selon l'une des revendications 25 précédentes.
16- Utilisation d'une molécule selon l'une des revendications 1-14 pour la fabrication d'un médicament.
30 17- Utilisation d'une molécule selon la revendication 11 ou 12 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer.
18- Utilisation d'une molécule selon la revendication 13 ou 14 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une maladie inflammatoire.
35
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