CA2289110A1 - Analogues peptidiques et leurs utilisations notamment dans des compositions pharmaceutiques et pour le diagnostic - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation d'analogues peptidiques de peptides parents, caractérisés en ce qu'ils correspondent auxdits peptides parents dans lesquels: au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, ou au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ou au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, et au moins un acide aminé de ladite chaîne peptidique est substitué par un acide non protéinogénique, pour: la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies susmentionnées, ou la préparation d'une composition destinée au diagnostic in vivo des pathologies susmentionnées, ou à l'évaluation in vivo de la réponse immunitaire dans le cadre des pathologies susmentionnées, par mise en oeuvre d'une réaction cutanée d'hypersensibilité par injection intradermique de ladite composition, ou la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro desdites pathologies.

Description

ANALOGUES PEPTIDIQUES ET LEURS UTILISATIONS NOTAMMENT
DANS DES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES ET POUR LE
DIAGNOSTIC
La présente invention a pour objet des analogues peptidiques et leurs utilisations, principalement dans le domaine de la prëparation de compositions pharmaceutiques, notamment de vaccins, et pour le diagnostic in vitro ou in vivo de diverses pathologies.
Le développement des neuropeptides, des hormones peptidiques et des ~c~ antibiotiques à base de peptides, ou des vaccins synthétiques à base de peptides, est fortement perturbé par la grande sensibilité des peptides vis à vis de la protéolyse qui limite, entre autres, l'administration orale et parentérale.
Les pseudopep~tides représentent une classe de molécules particulièrement intéressante dans la conception d'inhibiteurs d'enzymes. L.e clivage par les n a peptidases est impliqué dans une variété de processus biologiques puisqu' il permet de générer à partir de précurseurs inactifs des fragments protéiques ou peptidiques actifs. L'idée qu'un lien isostère pouvait être considéré comme un mime de l'intermédiaire tétraédrique formé lors du passage par l'état de transition, a ouvert la voie des inhibiteurs de type pseudopeptidiques. Au début des années 80, cette 2o approche a été utilisée avec succès dans le développement d' inhibiteurs puissants de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE), de la rénine (Szelke et al., i 982 ; Boger et al. , 1983) et de la protéase aspartique du VIH (Huff, 1991 ). Plus récemment, plusieurs inhibiteurs pseudopeptidiques sélectifs de la Ras farnesyl transférase ont été proposés. Ces molécules présentent un intérêt thérapeutique ?a potentiel dans le traitement des cancers impliquant l'oncogène Ras muté
(Buss &
Marsters, 1995).
Les analogues pseudopeptidiques d'hormones peptidiques ont également fait l'objet de nombreusca études avec pour objectif premier la stabilisation du peptide de départ et une conservation de l'activité. Cette stratégie a effectivement permis la découverte d'agonistes puissants (Chorev et al. , 1979 ; Nagain et al. , 1988 ;
Doulut et al. , 1992), mais aussi d' agonistes partiels et même d' antagonistes de l' hormone étudiée (lvlartinez et al. , 1985 ; Coy et ul. , 1989 ; Leban et al. , 1993 ;
Cai et al., 1994). Des analogues plus sélectifs au niveau d'un récepteur ont aussi été obtenus dans certains cas (Mendre, 1988 ; Nagain et al. , 1988 ; Schiller et al. , 3, 1993). Par ailleurs, la liaison pseudopeptidique permet d'explorer les caractéristiques conformationnelies du ligand au niveau du site modifié et, d'évaluer la contribution de la liaison amide et des liaisons hydrogènes inter-ou intramoléculaires dans l'interaction avec le ou les récepteurs.

Toutefois, les modifications effectuées jusqu'à présent sur les peptides à
usage immunologique se limitent essentiellement à l'adjonction de sucres, à
celle d'acides gras plus ou moins longs pour permettre l'émulsion des lipopeptides résultants, à la cyclisation par formation de ponts Bisulfure ou covalents, ainsi qu'à
a l'adjonction de molécules telles que la biotine, pour augmenter, par exemple, la sensibilité des tests immunochimiques en phase solide.
Plusieurs auteurs ont affirmé que les pseudopeptides possèdent probablement très peu ou pas d' immunogénicité, puisqu' ils ne pouvaient pas être transformés et présentés aux molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) pour être reconnus par les cellules T auxiliaires ou par les lymphocytes T cytotoxiques.
C'est ainsi que Dintzis et al. ont décrit que l'énantiomère L de la rubrexodine induit une forte réponse immunitaire par production d' immunoglobulines d' isotype G (IgG), tandis que la protéine correspondante constituée d'acides aminés taus de configuration D, n' induit pas de réponse immunitaire.
C'est dans ce contexte que les immunorétroïdes décrits ci-après, ainsi que les anticorps dirigés contre ces derniers, ont été décrits dans la demande internationale WO 95/24916, comme étant utilisables dans le domaine de la vaccination contre des pathologies dans lesquelles les peptides dont ils dérivent (peptides parents) étaient impliqués, ainsi que pour le diagnostic de ces pathologies.
2o Les auteurs de cette demande internationale, qui sont également les auteurs de la présente demande, avaient en effet, pour la première fois, mis en évidence que la modification par remplacement d'une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique d'un peptide, par une liaison -NH-CO-, et, le cas échéant par remplacement d'un acide aminé de configuration L par un acide aminé de 25 configuration D, permet d'obtenir des analogues peptidiques (rétro ou rétro-inverso respectivement) susceptibles d'être utilisés dans le cadre du traitement de pathologies impliquant la réponse immunitaire à médiation humorale ou cellulaire.
Les immunorétroïdes susmentionnés sont des composés du type peptidique, à
savoir des composés constitués d'une chaîne d'acides aminés protéinogéniques, 3o dont l'une au moins des liaisons -CO-NH-, et avantageusement toutes les liaisons -CO-NH-, de la chaîne peptidique du peptide parent correspondant, (ne comportant pas de liaison -NH-CO- dans sa chaîne peptidique), est (sont) remplaeée(s) par une (des) liaison(s) -NH-CO-, la chiralité de chaque résidu aminoacyle, qu' il soit impliqué ou non dans une ou plusieurs liaisons -NH-CO-susmentionnées, étant soit conservée (peptide rétro), soit inversée (peptide rétro-inverso) par rapport aux résidus aminoacyles correspondants constituant ledit peptide parent.
Par peptides rétro-inverso, il faut entendre tout peptide et analogue peptidique répondant à la définition donnée ci-dessus des immunarétroïdes, ledit peptide étant plus particulièrement constitué d'une chaîne peptidique dans laquelle l'un au moins des résidus d'une part est lié à au moins un résidu voisin par une liaison -NH-CO-, et d'autre part, est de chiralité opposée à celle de ce même résidu aminoacyle dans la chaîne peptidique du peptide parent.
Par peptide rétro, il faut entendre tout peptide répondant à la définition donnée ci-dessus des immunorétroïdes, ledit pepticje étant plus particulièrement constitué d' une chaîne peptidique dans laquelle l' un au moins des résidus, est lié à
au moins un résidu voisin par une liaison -NH-CO-~, la chiralité de la totalité des résidus aminoacyles ;;mpliqués dans au moins unc liaison -NH-CO- étant conservée i o par rapport au résidu correspondant de la chaîne peptidique du peptide parent.
I1 va de soi que les liaisons -CO-NH- et -NI-I-CO- doivent être prises en compte dans ce qui précède et ce qui suit, dans le sens de la chaïne peptidique parente allant de l'extrémité aminoterminale (N-terminale) vers l'extrémité
carboxyterminale (C-terminale).
Compte tenu du contexte générai d'incertitude sur l'efficacité des analogues peptidiques rappelé ci-dessus, les auteurs de cette demande internationale W095/24916 avaient considéré que cette inversion du sens de la liaison amide entre les acides aminés protéinogéniques, et/ou la modification de la configuration des acides aminés protéinogéniques, représentaient les seules modifications ?o possibles des peptides parents pour obtenir des analogues peptidiques présentant une demi-vie supérieure, et des propriétés biologiques, notamment immunologiques, comparables, voire supérieures, à celles des peptides parents susmentionnés.
Or, la présente invention découle de ia découverte faite par les auteurs de la ?s présente demande que, contrairement à ce qu'ils avaient cru bon de déduire dans le cadre de leur invention précédente en raison du contexte général rappelé ci-dessus, ces modifications du type rétro ou rétro-inverso de la chaîne peptidique des peptides parents, ne représentent pas les seules modifications possibles permettant d'obtenir des analogues peptidiques d'intérêt, du moins dans le cadre du diagnostic 3o et/ou du traitement de pathologies impliquant la réponse immunitaire à
médiation cellulaire.
En effet, les auteurs de la présente demande ont mis en évidence que la modification de peptides naturels impliqués dans des pathologies dans lesquelles intervient l' immunité à médiation cellulaire, et plus particulièrement les >> lymphocytes T cytotoxiques, par remplacement des liaisons peptidiques -CO-NH-de la chaîne peptidique desdits peptides naturels par d'autres liaisons encore que la liaison -NH-CO-, et/ou par remplacement des acides aminés protéinogéniques du peptide naturel par des acides aminés non protéinogéniques, permet d'obtenir des analogues peptidiques desdits peptides naturels pouvant être utilisés avec les avantages susmentionnés dans le cadre du traitement ou du diagnostic desdites pathologies.
Par "acide aminé protéinogénique", on entend, dans ce qui précède et ce qui suit, tout acide aminé entrant dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide s naturel.
Par "acide aminé non protéinogénique", on entend par opposition à la définition précédente, tout acide aminé n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel. On entend plus particulièrement par "acide aminé
non protéinogénique", tout acide aminé dont le carbone portant la chaîne latérale R, à savoir le groupe -CHR-, situé entre -CO- et -NH- dans la chaîne peptidique naturelle, est remplacé par un motif n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel.
L.a présente invention a pour but de fournir des compositions pharmaceutiques, et plus particulièrement des vaccins, comprenant des analogues i ~ peptidiques présentant une demi vie nettement supérieure à celle des peptides naturels ou des protéines naturelles, ou à celle des peptides de synthèse issus ou non de ces protéines naturelles (ces protéines naturelles, ou peptides issus ou non de ces dernières, étant encore désignés dans ce qui suit par l'expression "protéines ou peptides parents"), dont ils sont les analogues, tout en présentant une activité
?o biologique, et plus particulièrement immunologique, comparable, voire même supérieure, à celle des protéines ou peptides parents susmentionnés, ou encore une activité différente ou opposée à celle desdites protéines ou peptides parents.
Un autre but de la présente invention est de fournir des méthodes de diagnostic in vivo ou encore d'évaluation in vivo de la capacité de la réponse immunitaire d'un individu dans le cadre de pathologies dans lesquelles des peptides naturels ou protéines naturelles (exogènes ou endogènes) sont susceptibles d' intervenir en se liant aûx molécules du CMH, les complexes peptides-CMH
ainsi obtenus se aux récepteurs situés sur les cellules T et reconnaissant lesdits peptides naturels ou protéines naturelles sous leur forme complexée avec lesdites molécules du CMH.
L' invention a également pour but de fournir des compositions et des trousses (ou kits) pour la mise en oeuvre des méthodes de diagnostic ou d'évaluation in vivo de la réponse immunitaire susmentionnées.
La présente invention a également pour but de fournir des méthodes de 3, diagnostic in vitro de pathologies associées à la présence dans l'organisme d'un individu de protéines endogènes ou exogènes, ces méthodes étant réalisées à
l'aide des analogues peptidiques tels que définis ci-dessus, ou à l'aide d'anticorps dirigés contre les complexes entre ces anticorps et les molécules de CMH, et présentant l'avantage d'être plus performantes que les méthodes de diagnostic actuelles réalisées à l'aide des peptides ou protéines parents, ou à l'aide d'anticorps dirigés contre ces derniers.
La présente invention a également pour but de fournir de nouveaux kits pour ia mise en oeuvre de telles méthodes de diagnostic in vitro.
a La présente invention a pour objet l'utilisation d'analogues peptidiques de peptides parents, ces peptides parents étant le cas échéant issus de protéines exogènes ou endogènes, lesdits peptides parents interagissant avec des molécules du CMH dans le cadre de pathologies impliquant une réponse inununitaire à
médiation cellulaire, chez l'homme ou l'animal, lesdits analogues étant caractérisés i o en ce qu' ils correspondent auxdits peptides parents dans lesquels - au moins une liaison peptidique -CO-NH- de Ia chaîne peptidique, est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, ou - au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ou i ~ - au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, et au moins un acide aminé de ladite chaîne peptidique est substitué
par un acide aminé non protéinogénique, pour ta préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies susmentionnées.
2o L'invention a plus particuliêrement pour objet l'utilisation susmentionnée d'analogues peptidiques issus de peptides parents interagissant avec des molécules du CMH de classe I, dans le cadre de pathologies impliquant les lymphocytes T
cytotoxiques .
Avantageusement, les analogues peptidiques utilisés dans le cadre de la

2> présente invention, et plus particulièrement ceux issus de peptides parents interagissant avec des molécules du CMH de classe I, correspondent auxdits peptides parents dans lesquels au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso.
3o Comme nous l'avons déjà vu précédemment, il faut entendre par l'expression "peptide parent" susmentionnée, - soit un peptide existant tel quel à l'état naturel, notamment dans un micro organisme ou dans un organisme supérieur (notamment dans l'organisme humain), - soit tout peptide d'intérët immunologique obtenu par synthèse peptidique, à
partir d'acides aminés protéinogéniques, - soit un peptide issu d'une protéine telle qu'elle existe à l'état naturel dans les organismes susmentionnés, notamment par fragmentation de ladite protéine (notamment à l'aide de protéases appropriées, puis purification du peptide en

3 PCT/FR98/00923 G
question), ou par synthèse peptidique (selon les méthodes classiquement utilisées dans ce domaine) - soit un peptide issu d'une protéine telle qu'elle existe à l'état naturel mais dont l'activité immunologique a été modifiée, conservée ou optimisée par a remplacement de certains amino acides de la séquence naturelle par des acides aminés protéinogéniques, par exemple à la suite d'un criblage d'une librairie de peptides analogues obtenue par synthèse peptidique.
L' invention a également pour objet les analogues peptidiques de peptides parents, ces peptides parents étant le cas échéant issus de protéines exogènes ou ~ o endogènes, lesdits peptides parents pouvant interagir avec des molécules du CMI-I
dans le cadre de pathologies chez l'homme ou l'animal, lesdits analogues étant caractérisés en ce qu' ils correspondent auxdits peptides parents dans lesquels - au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, ou - au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ou - au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, et au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué
par un acide non protéinogénique.
2o Avantageusement, ies analogues peptidiques susmentionnés de l' invention sont caractérisés en ce que le nombre de résidus aminoacyles protéinogéniques ou non, et reliés par une liaison modifiée ou non, est compris entre environ 5 et environ 20, de préférence entre 8 et 12 pour les analogues peptidiques se liant aux molécules du CMH de classe I, et de préférence entre 8 et 16 pour les analogues 2> peptidiques se liant aux molécules du CMH de classe II.
L' invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques tels que décrits ci-dessus, caractérisés en ce que l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaîne peptidique du peptide parent est remplacée par une liaison différente de la liaison -CO-NH-, ladite liaison différente étant notamment choisie parmi les suivantes -CH2-NH- (méthylène amino) ;
-CH2-CH2- (carba) ;
-CO-CH2- (cétométhylène) ;
-CH2-O- (méthylène-oxy) ;
aa -CHOH-CH2- (hydroxyéthylène) ;
-CHOH-CHOH- (di-hydroxyéthylène) ;
-CH=CH- (E ou Z oléfine) ;
-CHCN-NH- (cyanométhylène amino) ;
-S-CH2- (thiométhylène) ;

-CH2-S- (mthylne thio) ;

-CS-NH- (thioamide) ;

-Y02-NH- (phosphonamide) ;

-CI-IOH- (hydroxymthylne) ;

a -NH-CO-NH- (ure) ;

-CHCH- (oxirane) ;

\ o/

-CN- (ttrazole) ;

N N

IU ~ N

-CI-I2-CO-NH- (~3-homologation) ;
-CHOH-CH2-1'dH- (hydroxyéthylène amino) ;
-CO-NH-NH- (hydrazino).
I a L' invention a également pour objet les analogues peptidiques tels que décrits ci-dessus, et caractérisés en ce que l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaîne peptidique du peptide parent. est remplacée par une liaison du type rétro ou rétro-inverso telle que définie ci-dessus, dans le cas où
l'un au moins des acides aminés dudit analogue peptidique est un acide aminé non 2o protéinogénique.
Des analogues peptidiques préférés dans le cadre de 1a présente invention sont caractérisés en ce que l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaïne peptidique ou peptide parent est remplacée par une liaison méthylène amino, ou du type ~-homologation, ou carba, ou cétométhylène, ou 2s cyanométhylène ami:no, ou hydroxyéthylène amino.
L' invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques de peptides parents impliqués dans le mélanome, notamment le peptide MARTI 27-35, ledit peptide parent comportant, le cas échéant, une ou plusieurs mutations, tel que le peptide parent muté MARTI 27-35 Leu2g, lesdits analogues peptidiques 3o correspondant auxdits peptides parents dans lesquels l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NHI- est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou retro-mverso.
A ce titre l'invention concerne plus particulièrement ies analogues peptidiques du peptide parent Mart-1 27-35 du mélanome, comportant une liaison méthylène amino et répondant aux formules suivantes WO 98/50423 PCTlFR98/00923 Séquences MART 1 27-35 H- A - A - G G I 1_ - 'I' -- I - - - V -OH

'I'(I-2) H- A9'(CHZNH)A-G G I L - 'f - V
- - - -OH
I
-'I'(2-3) H- A-Av~ccH2NE~~G-G I L - T - V
I - - - -OH

'I'(3-4) H- A - A -Gv~~ca2NH>I-G I L. - T - V
- - -OH

'I'(4-5) I-i-A - A - G - L - 'f - V
- Iv~cc~i2rrmG I -OH
-'I'(5-G) H- A - A - G G~~cH2Ha>I- L - 'f - V
- I - -OH

'I'(G-7) H- A - A - G G IvUCHZrrmL-- I - - 'T
-V
-OH

x(7-8) H- A - A - C' G I L~~cnZN~i>T-V
- I - - - -OH

I u ''(8-9) H- A - A - G G I L - T~rcc~~zNH~V-OH
- I - - -Ces analogues peptidiques yf (1-2), yr (2-3), yr (3-4), yr (4-5), yr (5-6), yr (G-7), y (7-8) et y (8-9), encore désignés peptides réduits analogues de Mart-1 >> 27-35, correspondent à ce dernier peptide dans lequel la liaison -CO-NH-située entre les résidus PI et P2, P2 et P3, P3 et P4, P4 et P5, PS et PG, P6 et P7, P7 et P8, P8 et P9 est remplacée respectivement par une liaison -CH2-NH-.
L'invention a également pour objet les analogues peptidiques du peptide parent Mart-1 27-35 du mélanome, comportant une liaison du type ~-homologation 2o et répondant aux formules suivantes Séquences -~I H-~.n"moA-A-G - I - G L T - V
- I - - -OH

(j2 H- A-p-nomoA-G - 1 - G L T - V
- I - - -OH

H- A - _namoG-I L T - V
A -~ - - -OH
G
-I
-H- A - G -p~ho,r,ol-GL T - V

H- A - G - I -a-~,omoG-IL 'h - V
A - - - -OH

(36 H- A - G - I - G T - V
A - -a-nom~I-L -OH
-H- A - G - I - G -~-f~~m~L-T- V
A - - I -OH

~8 H- A - G - I - G - p.nooT-V
A - - I L -OH
-H- A - G - I - G - T -p-no",aV-OH
A - - I L
-Ces analogues peptidiques X31 à (39 de Mart-1 27-35 correspondent à ce dernier peptide dans lequel la liaison -CO-NH- située entre les résidus P1 et P2, P2 et P3, P3 et P4, P4 et P5, F'S et P6, P6 et P7, P7 et P8, P8 et P9, est remplacée respectivement par une liaison -CH2-CO-NI-1-.
L'invention a également pour objet les analoguevs peptidiques du peptide parent muté Mart-1 27-35 Leu28, correspondant au peptide Mart-1 27-35 dans lequel l'alanine en position 28 est remplacée par la leucine, et comportant une liaison du type y-homologation entre les mêmes résidus que dans le cas décrit ci-dessus des analogues peptidiques (31 à (39.
I o L' invention a également pour objet les analogues peptidiques de MARTI 27-35 dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CH2-CH2-, tels que les analogues 1 à 8 suivants (encore désignés pseudopeptides carba analogues de MART):
O
HZN ~Gly-Ile-Gly-ile-Leu-Thr-Val-OH
2 H-Ala , ~ - - -N ile Gly Ile Leu-Thr-Val-OH
H
O
H-Ala-Ala N Giy-Ile-Leu=Thr-Val-OH
H
O

4 H-Ala-A,la-Gly~
N Gly-Ile-Leu-Thr-Val-OH
H

H-Ala-Ala-Giy-Ile N Leu-Thr-Val-OH
H
i~
I

H-Ala-Ala-Gly-I le-Gly~
P -h r-Va I-O H
F
H-Ala-Ala-Gly-Ile-Gly-IIE
Val-OH
I>
O
g H-Ala-Ala-Gly-Ile-Gly-Ile-Leu N ~' /i~ ~OH
H
L' invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques des peptides parents du virus de la grippe, notamment du peptide parent M58-66, lesdits analogues peptidiques correspondant auxdits peptides parents dans lesquels ?a l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso ; avantageusement, lesdits analogues sont choisis parmi ceux dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CH2-NH-, tels que les analogues suivants Séquences M58-66 H - - L - G F - F 'I' L -OH
G L - - V - --'I'(1-2) H-G4'( CHZNH)L-LG F V h 't L OH
- - - - - - -'l'(2-3) H - L~~cHZNEi~L-G F V F T L -OH
G- - - - - -'l'(3-4) H - - L -L~-ccEa2Na>G- F V F T 1_-OH
G - - - -~I'(4-5) H - - L - GY'(CtiZNH)F- F 'r L -OH
G L - V - --3i 'i'(5-6) H - - L - G FY'(CHZNff)V - T L.-OH
G L - - F --'I'(6-7) H - - L - G F - - I,-OH
G L - - V4'(CIiZNII)F T
-'I'(7-8) H - - L - G F - Fv~ccnZNEaT- -OH
G I_ - - V L
-'l'(8-9) H - - L - G F - F TwccHZNti~L-OH
G L - - V --Ces analogues peptidiques yr (I-2), yr , yr (4-5), y (5-6), (2-3), yr (3-4) y (6-7), y (7-8) et y (8-9), encore dsignsits analogues de peptides rdu M58-66, correspondent ce dernier peptide dans -CO-NH- situe entre lequel la liaison les rsidus Pl et P2, P2 fa P3, P3 et P4, P4 P6 et P7, P7 et et P5, P5 et P6, P8, P8 et s P9 est remplace respectivement par une liaison -CH-~-NH-.

l'ivention a galement pour objet les analoguespeptidiques de peptides parents du virus du SIDA, notamment des peptides NEF 84-92, et GAG 77-85, lesdits analogues peptidiques correspondant auxdits peptides parents dans lesquels l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- est modifie, l'exception des i modifications du type: rtro, ou rtro-inverso, o lesdits analogues tant notamment choisis parmi - ceux dont l'u:ne au moins des liaisons - est remplace -CO-NH par une liaison -CI-i2-NH-, tels que les analogues8 du peptide NEF, NEFRD1~- et GAGRD1-8 du peptile GAG suivants ~ Puret NEF AVDLSHFLK 98 %

NEFRD1 A'I'(CH2-NH)VDLSHFLK 99%

NEFRD2 AVtI'(CH2-NH)DLSHFLK 93 %

NEFRD3 AVD~I'(CH2-NH)LSHFLK 97 %

2o NEFRD4 AVDL'I'(CH2-NH)SHFLK 98%

NEFRDS AVDLS'Y(CH2-NH)HFLK 86%

NEFRD6 AVDLSH~I'(CH2-NH)FLK 98 ~

NEFRD7 AVDLSHFq'(CH2-NH)LK 92%

NEFRD8 AVDLSHFL'I'(CH2-NH)K 91 %

Puret GAG SLYNTVATL 96 %

GAGRD1 S'i'(CH2-NH)LYNTVATL 95%

GAGRD2 SL~I'(CH2-NH)YNTVATL 95 %

3o GAGRD3 SLY~I'(CH2-NH)NTVATL 95 %

GAGRD4 SLYN~I'(CH2-NH)TVATL 95 %

GAGRDS SLYNT~I'(CH2-NH)VATL 95 %

GAGRD6 SLYNTV~I'(CH2-NH)ATL 95 %

GAGRD7 SLYNTVA~I'(CH2-NH)TI, 95 %

~s GAGRD8 SLYNTVAT~(CH2-NH)L 95%

- ceux dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CHOH-NH-, tels que lcs analogues NEFHEA1-8 du peptide NEF
suivants Pureté Masse NEF AVDLSHFLK

NEFHEAI A~l'(CHOH-NH)VDLSHFLK 98% 1046,50 NEFHEA2 AV~1'(CHOH-NH)DLSHFLK 95 % 1046,56 NEFHEA3 AVD'I'(CHOH-NH)LSHFLK 83 lo + 1029,00 15 %

NEFHEA4 AVDL~I'(CHOH-NH)SHFLK 98% 1047,97 NEFHEAS AVDLS'I'(CHOH-NH)HFLK 99% 1047,08 NEFHEA6 AVDLSH'f'(CHOH-NH)FLK

NEFHEA7 AVDLSHF'l'(CHOH-NH)LK 97~ I047,19 io NEFHEA8 AVDLSHFL~I'(CHOH-NH)K 97% 1046,77 Des analogues peptidiques préférés dans le cadre de la présente invention sont caractérisés en ce que l'un au moins des acides aminés de la chaîne peptidique du peptide parent, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, tel que défini ci-dessus.
Avantageusement, les acides aminés non protéinogéniques utilisés sont choisis parmi les acides aminés suivants:
- les acides aminés de configuration D, - les acides a-aminés de formule générale '-o ~ 22 / 12 3 01-~
lo ?a dans laquelle - RI, R2 et R3, représentent indépendamment les uns des autres : un atome d'hydrogène, un hydroxyle, un radical alkyle de 1 à 25 atomes de carbone, un radical contenant un groupe allyle et ayant de 3 à 25 atomes de carbone, un radical contenant un ou plusieurs cycles aromatiques ou non, notamment un groupe aryle, 3o et ayant de 6 à 25 atomes de carbone, et notamment les groupes suivants : -(méthyl), -CH2CH3 (éthyl), -(CH2)4-CI-I3, -CH(CH3)2 (isopropyl), -C(CH3)3 (tertiobutyl), -~ (phényi), -CH2~ (benzyl), -CH24~C1 (para-chlorohenzyl), -CH2-CH24~ (2-phényl-éthyl), -CH2CHCH2 (alkyl), méthylfluorényl, -CI12CONH2 (glycolamide), -CH2CONfi2 (benzhydrylglycolamide), -CHOH~h, ;;
_CH2_/~ , -CH2-~~ ~ , -CH2~---~ ' 1~
étant entendu que l'un des deux groupes R2 et R3 peuvent représenter une chaîne latérale d'acides aminés naturels lorsque soit R1, soit l'autre des deux groupes R2 et R3 ne reprësentent pas un atome d'hydrogène, - le cas échéant, R 1, R2, Ca et N forment un hétérocycle de 4 à 8 atomes de carbone, aromatique ou non, le cas échéant substitué, notamment un hétérocycle de formule ~~
OU
l'f I 0 t~
- les acides ~3-aminés de formule générale U
iZ~, R2 d I ; w ,w W .
o ~3 dans laquelle Rl, R2 et R3, indépendamment les uns des autres représentent une chaîne latérale d'un acide aminé naturel, ou sont tels que définis ci-dessus, ?o notamment . les ~3-homo amino acides de formule t' 2.
N
dans laquelle Rl et R2, sont tels que définis ci-dessus, ou . les a,-hydroxy ~3-homo amino acides de formule U
o»
dans laquelle R1 et R2, sont tels que définis ci-dessus, - les acides y-aminés de formule générale ~1 L p ~ ~' , 6 h1 ', ~~~~ I

dans laquelle Rl, R2, R3 et R4 représentent indépendamment les uns des autres une chaîne latc:rale d'un acide aminé naturel, ou R1, R2 et R3, sont tels que WO 98!50423 PCTlFR98/00923 définis ci-dessus, et Rq. a la même signification que celle donnée ci-dessus pour Rl, RZ et R3, notamment les dérivés de statine de formule dans laquelle Rl, et R2 sont tels que définis ci-dessus.
Avantageusement, les acides aminés non protéinogéniques utilisés dans le lo cadre de la présente invention sont choisis parmi ;
l ~ l ~ i OH
OH

'° NH OH N OH OH

O O O
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(' ~ i w ~ 1-I-~ 1-t ~ ~ u ~-t r~
w ~ H ,~ , ~ uL
N ~I z la ~ ~~ ~ ~ CP ~ ~ J
30 ~i0/-I / ~~N ION ~i r~_N ~! n lu ~I L
p c N3 L' invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques des peptides parents du virus de la grippe, notamment du peptide parent M58-66, 3a lesdits analogues peptidiques correspondant auxdits peptides parents dans lesquels l'un au moins des acides aminés de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, tels que les analogues suivants IS
[Tic6?]M5~~-6h ~ ~ ..,-H-Gly'$-Ilr-Leu-Gly~ J~ Trr-Leu6'-OH
N ~ = H
O
N
[3-Pya62)M58-66 -.
' o H-G!/~-Ile-LEU-Gly~ N~ Thr-Leur-OH
H ~ _ H
p ~ O
[2-Tha62] M58-66 w H-G1~'8-14e-Leu-G~y~N N~r~ T~-1-eu°6-~
H ti p ~ O
[D-P he62] M58-66 o -H-GIy58-11e-Leu-C',h~~N N~ Thr-Leufi'-OH
H'~ ~ 1~
[TicB~l]M58-66 H-G!y'8-Ile-Leu-Giy~ N~ Tt~r-Leu''-OH
H ~ H
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N
[3-Pya64]M58-66 ~ ~

H-G~ysB-i!1e-Leu-Gty~ N~ Thr-LeuE6-OH

o ~ a t2-Tha64]M58-66 H-Gly~-Ile-leu-Gly~ ~~ Thr-LEUR-OH
H
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a H-Gty's-Ite-Leu-Gly~ N~ . Thr-Leur'6-0H
H H II
O ~ Q
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H N
O ~ O
[ht-MePhe62]M58-66 w H-GIy~-l'e-Leu-Giy~ N~ Thr-Leur-OH

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[pCl-Phe62)M58-66 w H-Gly'8-Lie-LEU-GIy ~ Thr-Leur-Cti H
N ~ H
O ~ O
[Phg62)M58-66 i H-Gh,~~-Ile-Leu-Gly~~ ~ Thr-LEUR-OH
H
O ~ O

WO 98150423 I ~ PCT/FR98/00923 [Cha64)M58-66 H-Gly"'-Ile-Leu-Gly~~ N~N Thr-leurOH
1-i i i i O ~ O
CI
~~CP E'he64jM58-66 lo L

H-Gly~'j-l'e-Leu-Gly N
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li (Phgfï4jM58-66 a 1~-Gfy~3-Ile-LeurGy~ N Tt;r-Leur-0H
t~
H ~ Fi o ~ o ?o Avantageusement, les analogues peptidiques susmentionnés de l' invention sont séleco.ionnés parmi ceux susceptibles - d'une part d'être reconnus par les molécules du CMH et de s'associer avec ces dernières, notamment par mise en oeuvre de la méthode suivante . incubation (notamment pendant environ 2 heures à 25°C, puis environ 12 heures à 4°C) de l'analogue peptidique en présence de molécules du CMH, provenant de: la lyse de cellules humaines ou animales, ou purifiées 3o notamment par chromatographie d'affinité à partir de lignées cellulaires humaines ou animales, sur un support solide recouvert d'un premier anticorps, notamment monoclonal, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique, . addition sur le support solide précédent d'un deuxième anticorps 3a marqué, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, ledit anticorps marqué reconnaissant spêcifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-mëme spécifiquement aux molécules du WO 98/50423 ~ g PCT/FR98/00923 CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la y2-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I, . détection, après rinçage du support solide, de l'éventuelle présence du deuxième anticorps marqué resté fixé sur le support solide, témoignant d'un effet de reconnaissance et d'association entre les molécules du CMH et l'analogue peptidique étudié, - et, d'autre part, de former un complexe avec lesdites molécules du CMH, dont la stabilité peut être évaluée par mise en oeuvre d'une méthode de suivi dans le temps de la liaison établie entre l'analogue peptidique et les molécules du CMH, cette méthode étant avantageusement effectuée selon un protocole identique 'à la méthode précédente, mais dans laquelle l'étape d' incubation de l' analogue peptidique en présence des molécules du CMH sur le support solide recouvert dudit premier anticorps, se fait (avantageusement à
une température de 37°C) pendant des temps variables de quelques minutes à
plusieurs i 5 jours.
Les analogues peptidiques de l' invention doivent être reconnus par les molécules de CMH et s'associer à ces dernières, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre du test de reconnaissance décrit ci-dessus. Cette association peut être faible (détectable à des concentrations en analogues peptidiques de l'ordre de 20 10-4 à 10-5 M), intermédiaire (détectable à des concentrations en analogues peptidiques de l'ordre de 10-5 à 10-7 M), ou forte (détectable à des concentrations en analogues peptidiques dc l'ordre de 10-g à lOW M).
Les analogues peptidiques reconnus par les molécules du CMH dans le cadre de la présente invention sont de préférence susceptibles de se lier pendant au 2s moins environ 30 minutes auxdites molécules du CMH.
L' invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques tels que décrits ci-dessus et caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés parmi ceux susceptibles - d'induire in vitro l'apparition et la croissance de lymphocytes T
3o cytotoxiques à partir de cellules humaines ou animales, notamment à partir de cellules mononucléées issues du sang périphérique (PBMC), en présence de facteurs nécessaires à la croissance et la différenciation des cellules T
cytotox~ques, - d' induire in vitro la cytolyse par des lymphocytes T cytotoxiques, de 3> cellules cibles présentant à leur surface l'analogue peptidique associé aux molécules du CMH, lesdits lymphocytes T cytotoxiques étant avantageusement prélevés sur un patient atteint d'une pathologie dans laquelie est impliqué le peptide parent de l'analogue peptidique étudié, WO 98/50423 ~ ~ PCT/FR98/00923 - et d' induire ire vitro la sécrétion de cytokines (ou interleukines) par les lymphocytes T cytotoxiques susmentionnés, notamment IL-2, IL-4 ou l'interféron 'Y , lesdits analogues peptidiques ainsi sélectionnés étant . soit ces agonistes des récepteurs (T'CR) reconnaissant l'antigène (à savoir le peptide parent) des cellules T cytotoxidues, et dérivent de peptides parents se comportant eux-mêmes comme des agonistes ou des antagonistes desdits récepteurs, soit des agonistes partiels desdits récepteurs, et dérivent de ~o peptides parents se comportant eux-mêmes comme des agonistes desdits récepteurs, ces agonüstes partiels induisant notamment. la sécrétion d'une ou plusieurs cytokines différentes de celles dont la sécrétion est induite par les peptides parents.
L'invention a plus particulièrement pour objet les analogues peptidiques tels que décrits ci-dessus et caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés parmi ceux - susceptibles d'induire in vitro l'apparition et la croissance de lymphocytes T cytoto:riques à partir de cellules humaines ou animales, notamment à partir de cellules mononucléées issues du sang përiphérique (PBMC), en présence de facteurs nécessaires à la croissance et la différenciation des cellules T
2o cytotoxiques, - n'induisant pas in vitro la cytolyse par des lymphocytes T cytotoxiques, de cellules cibles présentant à leur surface l'analogue peptidique associé aux molécules du CMH, lesdits lymphocytes T cytotoxiques étant avantageusement prélevés sur un patient atteint d'une pathologie dans laquelle est impliqué le 2s peptide parent de l'analogue peptidique étudié, - n' induisant pas in vitro la sécrétion de cytokines (ou interleukines) par les lymphocytes T cytotoxiques susmentionnés, notamment IL-2, IL-4 ou l' interféron y, .
lesdits analogues peptidiques ainsi sélectionnés étant des antagonistes des 3o récepteurs des cellules T cytotoxiques.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'analogues peptidiques tels que définis ci-dessus pour la préparation de médicaments, notamment de vaccins, destinés à la prévention ou au traitement des pathologies dans lesquelles les peptides parents sont des agonistes ou antagonistes des récepteurs reconnaissant _,s l'antigène des cellules T cytotoxiques, et plus particulièrement des pathologies neurodégénératives infectieuses (d'origine virale ou bactérienne), tumorales, auto-immunes et allergiques.

WO 98/50423 Zo PCT/FR98/00923 Parmi les pathologies tumorales susceptibles d'être traitées dans le cadre de la présente invention, on peut citer le mélanome, notamment à l'aide des analogues peptidiques du peptide MART1 27-3S décrits ci-dessus.
Parmi les maladies d'origine virale susceptibles d'être prévenues ou traitées a dans le cadre de la présente invention, on peut citer:
- le SIDA provoqué par le virus de l' immuno-déficience humaine HIV 1 et HIV2, notamment à l'aide des analogues peptidiques des peptides NEF et GAG
décrits ci-dessus, - la paraplégie associée à HTVL-1, ou la leucémie à cellules T de l'adulte, i o provoquée par le virus de la leucémie humaine à cellules T (virus HTLV), - infections provoquées par le virus respiratoire syncitial, infections provoquées par le virus coxsakie, par exemple méningites aiguës lymphocytaires, - infections provoquées par le virus d'Epstein-Barr, par exemple la i ~ mononucléose infectieuse, - infections provoquées par le cytomégalovirus, par exemple maladie des inclusions cytomégaliques, - herpès provoqué par le virus de l' herpès humain, - herpès provoqué par le virus 6 de l'herpès simplex, 20 - infections provoquées par le parvovirus B 19 humain, par exemple gastro-entérites infectieuses, - l'hépatite B provoquée par le virus de l'hépatite B, - l'hépatite C provoquée par le virus de l'hépatite C, - la grippe provoquée par le virus influenza, notamment à l'aide des analogues peptidiques du peptide MS8-66 décrits ci-dessus, - la rubéole provoquée par le virus de la rubéole, - infections provoquées par le virus de la Dengue, par exemple arboviroses, - rhumes, rhinites, coryza provoqués par les rhinovirus - la fièvre aphteuse provoquée par ie virus de la fièvre aphteuse, 30 - le cancer du col de l'utérus provoqué par le papillomavirus (HPV).
Parmi les principales maladies auto-immunes susceptibles d'être traitées dans le cadre de la présente invention, on peut citer celles rassemblées dans le Tableau A qui suit.
3>

WO 98/50423 2 ~ PCT/FR98/00923 Tableau A
Principales maladies auto-immunes (en allant de haut en bas, des maladies auto-immunes spécifiques d'organes aux maladies auto-immunes non spécifiques d' organes).
Maladies Autoantigènes impliqués 'Thyrodite de Hashimoto Thyroglobuline, microsomes Maladie de Basedow Rcepteur TSH

io Maladie d'Addison Corticosurrnale Insuffisance hypophysaire Hypophyse Gastrite de Biermer Cellule paritale de l' estomac Facteur intrinsque a Certaines strilitea Spermatozodes, ovaires Diabte juvnile de type 1 Ilots L,angerhans, insuline Syndrome de Goodpasture Membrane basale glomrulaire Myasthnie Muscle stri, rcepteur ?o actyl-choline Rhumatisme articulaire aigu Myocarde (streptocoques) Pemphigus Ponts intercellaires piderme Pemphigode bulleuse Membrane basale cutane Dermatite herptiforme Gliadine, rticuline ~> Vitiligo Mlanocytes Pelade Follicule pileux Psoriasis Ophtalmie sympathique Uve Uvite Chambre antrieure de l'oeil 3o Syndrome de Guillain-Bar Sclrose en plaques Myline Anmie hmolytique Hmaties Purpura thrombopnique idiopathique Plaquettes Leucopnie idiopathique Granulocytes Cirrhose biliaire primitive Mitochondries Hpatite chronique active Muscle lisse, noyaux Rectocolite hmorragique Ilite d Crohn Clon (E. coli) Syndrome de Gougerot-Sjgren Noyaux: SS-A, SS-B

Polyarthrite rhumatode IgG, noyaux Dermatopolymyosite Noyaux: Jo 1, muscles Sclrodermie Noyaux: Scl-70 Connectivite mixte Noyaux: RNP

Lupus rythmateux discode Noyaux:

Lupus rythmateux dissmin Noyaux: ADN, antigne Sm Facteurs de coagulation Cardiolipine, etc...

L' invention a également pour objet toute composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, au moins un analogue peptidique (agoniste, le cas échéant partiel, ou antagoniste) tel que défini ci-i ~ dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Avantageusement, les compositions pharmaceutiques selon l'invention se présentent sous une forme administrable par voie orale, ou parentérale, notamment à raison d'environ 500 ~.g à 5 mg par prise, notamment à raison de 3 prises par Jour.
2o L'invention a plus particulièrement pour objet les compositions pharmaceutiques telles que décrites ci-dessus, contenant à titre de principe actif au moins un antagôniste selon l'invention, et leur utilisation dans le cadre du traitement des maladies auto-immunes.
L' invention a plus particulièrement pour objet encore, les compositions pharmaceutiques telles que décrites ci-dessus, contenant à titre de principe actif au moins un agoniste partiel selon l'invention, et leur utilisation dans le cadre du traitement des maladies allergiques.
L' invention a également pour objet tout vaccin, caractérisé en ce qu' il comprend à titre de principe actif, au moins un analogue peptidique, de préférence 3o agoniste, le cas échéant partiel, tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Avantageusement, les vaccins selon l' invention se présentent sous une forme administrable par voie orale, ou parentérale, notamment à raison d'environ 500 ~g à 5 mg par prise, notamment à raison de 3 prises par jour.
L'invention a égaiement pour objet toute composition destinée au diagnostic in vivo de pathologies susmentionnées impliquant la réponse immunitaire à
médiation cellulaire, notamment les lymphocytes T cytotoxiques, ou à
l'évaluation in vivo de la réponse immunitaire dans ie cadre desdites pathologies, par mise en oeuvre d'une réaction cutanée d'hypersensibilité par injection intradermique de ladite composition de diagnostic, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un analogue peptidique, de préférence agoniste, le cas échéant partiel, tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule biologiquement acceptable.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'analogues peptidiques tels que décrits ci-dessus pour la préparation desdites compositions destinées au diagnostic in vivo des pathologies susmentionnées.
L' invention concerne également les complexes entre un analogue peptidique tel que défini ci-dessus, et une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité
(encore désigné complexes binaires CMH-analogue peptidique).
ici En effet, la réponse immunitaire met en jeu la reconnaissance d'un antigène endogène ou exogèn~ par des cellules spécialisées. Pour être reconnu, l'antigène doit être initialemero présenté de façon adéquate par des cellules présentatrices d'antigène (CPA). P,lors que les lymphocytes B reconnaissent des épitopes portés par les antigènes intacts non modifiés, la présentation de l'antigène aux U lymphocytes T est plus complexe dans la mesure où l'antigène est d'abord internalisé par la cellule présentatrice, protéolysé, puis éventuellement réexprimé à
sa surface sous forme de fragments peptidiques en association avec les protéines du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). I_e lymphocyte T qui ne reconnaît pas l'anti;gène natif, reconnaît un fragment peptidique associé à
une ?o molécule CMH.
Ces molécules CMH appartiennent essentiellement à deux classes: I et II.
I_es molécules de classe I sont des glycoprotéines transmembranaires constituées d'une chaîne lourde a polymorphe associée de façon non covalente à
une chaine légère non glycosylée (32m. Leur structure cristallographique a été
résolue (Bjorkman ~et al. (1987), Nature, 329: 506-512), et montre la présence d'un sillon formant le site de présentation c3u peptide dont le fond est composé de huit feuillets (3 et les bords de deux hélices a. Ces molécules sont présentées à la surface de la quasi totalité des cellules.
Les molécules de ciasse II sont également des glycoprotéines membranaires ;o constituées de deux chaînes polymorphes a et ~3 liées de façon non covalentes pour former, comme le montre la structure cristallographique récemment élucidée (Brown et al. (1993), Nature, 364: 33-39), une plateforme ~3 plissée supportant deux hélices a. Le sillon formé est le site de présentation du peptide. Ces molécules ne sont exprimées qu'à la surface de certaines cellules parmi lesquelles les macrophages et les cellules B.
Les lymphocytes T cytotoxiques (cellules possédant des marqueurs CD8) reconnaissent des fragments protéolytiques de protéines virales associées aux molécules CMH de classe I et provoquent la lyse des cellules présentant l' antigène.

WO 98/50423 ~4 PCT/FR98/00923 Les lymphocytes T auxiliaires (cellules portant des marqueurs CD4) reconnaissent des fragments de protéines exogènes capturées par endocytose présentés en association avec les molécules CMH de classe II et induisent la stimulation cellulaire de la réponse immunitaire.
L' invention a également pour objet les complexes entre un analogue peptidique selon l' invention, et un récepteur de cellules T (encore désignés complexes récepteur T-analogue peptidique).
L'invention vise également les complexes entre une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité, un analogue peptidique tel que défini ci-dessus, et un m récepteur de cellules T (encore désigné complexe ternaire CMH-analogue peptidique-récepteur T).
L'invention a également pour objet l'utilisation d'analogues peptidiques tels due définis ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic üz vitro des pathologies mentionnées ci-dessus.
i ~ L' invention a plus particulièrement pour objet, toute méthode de diagnostic in vitro de pathologies impliquant la réponse immunitaire à médiation cellulaire, notamment les lymphocytes T cytotoxiques, à savoir de pathologies associées à
la présence dans l'organisme d'un patient, de peptides exogènes ou endogènes pouvant interagir avec des molécules du CMH, et susceptibles d'être directement ?o ou indirectement impliqués dans le processus de développement de ces pathologies chez l'homme ou ('animal, caractérisée en ce qu'elle comprend:
- la mise en contact d'un ëchantillon biologique provenant d'un patient, notamment du sang ou tout échantillon biologique susceptible de contenir des lymphocytes, avec un analogue peptidique tel que défini ci-dessus, dans des conditions permettant la réaction entre les récepteurs des cellules T
susceptibles d'être présentes dans l'échantillon biologique, et ie susdit complexe binaire formé
entre ledit analogue peptidique et les molécules de CMH présentes dans ledit échantillon;
- la détection in vitro du complexe ternaire CMH-analogue peptidique-récepteur T, susceptible d'être formé à l'étape précédente.
Les méthodes de diagnostic susmentionnées de l' invention sont avantageusement réalisées de la façon suivante:
- incubation dudit échantillon biologique avec des analogues peptidiques selon l' invention, lesdits analogues peptidiques étant fixés sur un support solide, ;a notamment à l'intérieur de puits de plaques de microtitration de type de celles habituellement utilisées pour la mise en oeuvre de techniques de détection ou dosa~~e bien connues sous le nom d'ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), - rinçage du support solide, - incubation dc~s éléments restés fixés sur le support solide après l'étape de rinçage précédente avec un milieu contenant des anticorps, notamment des anticorps anti-complexe ternaire selon l' invention, marqués (notamment de manière radioactive, enzymatique ou fluorescente), ou susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, - rinçage du support solide, - détection des anticorps marqués restés respectivement liés aux complexes ternaires lors de l'étape d'incubation précédente.
L' invention a également pour objet les nécessaires ou kits pour la mise en i o oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro telles due décrites ci-dessus, comprenant:
- un analogue peptidique tel défini ci-dessus ;
- des réactifs pour rendre un milieu apte ;~ la formation d'une réaction immunologique ;
oa - des réactifs permettant de détecter le complexe ternaire selon l'invention, qui a été produit à l'issue de la réaction immunologique, lesdits réactifs contenant éventuellement un marqueur ou étant susceptibles d'ëtre reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où l'analogue peptidique n'est pas marqué.
zo L' invention a c:galement pour objet les anticorps dirigés contre les complexes hinaires CMH-analogue peptidique tels que définis ci-dessus, lesdits anticorps étant tels qu'obtenus par immunisation d'un animal avec au moins un des complexes susmentionnés, lesdits anticorps étant susceptibles de former un complexe avec ces complexes binaires.
Les anticorps selon l' invention sont des anticorps polyclonaux ou monoclonaux .
Les anticorps polyclonaux susmentionnés sont obtenus par immunisation d'un animal avec au moins un complexe CMH-analogue peptidique selon l' invention, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, 3o par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixée un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps, notamment un complexe CMH-analogue peptidique selon l' invention.
Les anticorps monoclonaux selon l' invention peuvent être obtenus par la 3, technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après.
Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris, (ou des cellules en culture dans le cadre d' immunisations in vitro) avec un complexe CMH-analogue peptidique selon l' invention, dont les lymphocytes B
sont alors capables de produire des anticorps contre ledit complexe. Ces WO 98/50423 ~~ PCT/FR98/00923 lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (notamment murines) pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de s se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis du complexe CMI-I-analogue peptidique de l'invention pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert en une ou deux dimensions, en immunof7uorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps io monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatôgraphie d'affinité décrite ci-dessus.
Les anticorps selon l'invention, sont plus particulièrement caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles de former un complexe avec des complexes CMI-I-analogues peptidiques, etlou avec les complexes CMH-peptides ou protéines i ~ parents correspondant auxdits analogues peptidiques.
Avantageusement, les anticorps anti-complexes CMH-analogues peptidiques de l' invention reconnaissent ies complexes CMI-I-peptides ou protéines parents susmentionnés avec une affinité au moins égale à celle présentée par les anticorps anti-complexes CMI-I-peptides ou protéines parents vis à vis des complexes 2o CMH-peptides ou protéines parents .
L' affinité dont il est question ci-dessus peut se mesurer par la constante d'affinité à l'équilibre Ka des complexes impliquant l'un des susdits anticorps avec l'un des susdits complexes.
L' invention a également pour objet toute composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps tels que définis ci-dessus, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable, ainsi que leur utilisation dans le cadre du traitement des pathologies susmentionnées.
L' invention concerne également le procédé de criblage d' analogues peptidiques tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu' il comprend les étapes ~o suivantes . incubation (notamment à une température de 37°C) pendant des temps variables de quelques minutes à plusieurs jours, de l'analogue peptidiquc en présence de molécules du CMH, provenant de la lyse de cellules humaines ou animales, ou purifiées notamment par chromatographie d'affinité à partir de 3s lignées cellulaires humaines ou animales, sur un support solide recouvert d'un premier anticorps, notamment monoclonal, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique, WO 98/50423 ~~ PCT/FR98/00923 ~ addition sur le support solide précédent d'un deuxième anticorps marqué, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, ledit anticorps marqué reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue a peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la (32-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I, . détection, après rinçage du support solide, de l'éventuelle présence du deuxième anticorps marqué resté fixé sur le support solide, io . évaluation de la durée de l'association entre ledit analogue peptidique et les molécules du (,MH.
L' invention a également pour objet toute trousse ou kit pour la mise en oeuvre d'un procéde~ de criblage d'analogues peptidiques tel que défini ci-dessus, comprenant i > - des molécules du CMH, et/ou - des anticorps, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique, avantageusement fixés sur un support solide, ou fournis avec les réactifs nécessaires à leur fixation sur le support solide, et/ou ?o - des anticorps marqués, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule sf; liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la (32-microglobuline reconnaissant ?, spécifiquement les molécules du CMH de classe I, et/ou - un protocole pour la mise en oeuvre dudit procédé, et/ou - un peptide dc: contrôle.
L'invention sera davantage illustrée à l'aïde des exemples qui suivent d'obtention et d'étude des propriétés d'analogues peptidiques tels que décrits ci-dessus.
I- Synthèse dns analogues peptidiques de l'invention A) Généralités ;>
A titre d'illustration, la méthode de synthèse en phase liquide consiste à
condenser successivement deux à deux les aminoacyles dans l'ordre requis ou à
condenser des amiooacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments WO 98/50423 ~g PCT/FR98/00923 préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments, à l'exception des fonctions amines de l'un et carboxyles de l'autre ou vice-versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides.
On pourra par exemple utiliser des groupements protecteurs de type uréthane (Boc, Fmoc benzyloxycarbonyl ou allyloxycarbonyl) pour protéger les extrémités N-terminales des acides aminés et des groupements de type ester (méthylique, io éthylique, benzylique, tertio-butylique, allylique ou encore henzhydrilglycolamidique) pour protéger les extrémités C-terminales des acides aminés.
Une telle synthèse peut être effectuée en condensant tout d'abord le résidu aminoacyle AAl dont la fonction COOH est protégée avec le résidu aminoacyle i s AA2 dont la fonction NH~ est protégée. La fonction amine du résidu AA2 dans le fragment AA2-AAl ainsi obtenu, est alors déprotégée, pour condenser par la suite ledit fragment avec le résidu aminoacyle AA3 dont la fonction amine est protégée.
Les étapes précédentes sont répétées autant de fois qu' il y a de résidus aminoacyles à introduire dans la chaîne des rétro analogues à synthétiser.
?o Selon une autre technique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite par R.D. Merrifield dans l'article intitulé "Solid phase peptide synthesis"
(J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149-2154).
Pour fabriquer une chaîne peptidique selon le procédé de Merrifield, on a recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier acide ?a aminé C-terminal (en l'occurrence AA1-OH) de la chaïne. Cet acide aminé est fixé
sur la résine par l' intermédiaire de son groupe carboxylique et sa fonction amine est protégée, par exemple par le groupe t-butyloxycarbonyle.
Lorsque le premier acide aminé C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction amine en lavant la résine avec un acide.
~o On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés qui vont constituer ia chaîne peptidique sur le groupe amine chaque fois déprotégé au préalable de la portion de la chaïne peptidique déjà formée, et qui est rattachée à la résine.
Lorsque la totalité de la chaîne peptidique désirée est formée, on élimine les ~~roupes protecteurs des différents acides aminés constituant la chaîne peptidique et on détache le peptide de la résine par exemple à l'aide d'acide fluorhydrique.
B) Cas particulier des analogues peptidiques de l'invention Une ou plusieurs des étapes de synthèse décrites ci-dessus peuvent être interrompues afin d' insérer une liaison différente de la liaison -CO-NH-entre WO 98/50423 ~~ PCT/FR98/00923 certains résidus aminoacyles, et/ou un ou plusieurs acides aminés non protéinogéniques.
B.1.) Synthèse d'analogues peptidiques comportant des liaisons peptidiques modifiées La notation 'Y (Spatola & Darlak, 1988) est généralement d'usage pour désigner le lien pseud;opeptidique remplaçant la liaison amide (CONH). Parmi les modifications les plus fréquemment rencontrées, on peut citer par exemple les io suivantes dont les synthèses sont détaillées dans les réFérences bibliographiques indiquées : la liaison méthylèneamino (réduite) 'f'[CI-12NH] (Szelke et al. , 1982 ;
Martinet et al. , 1985 ; Sasaki & Coy, 1987) ; rétro-inverso ~l'[NHCO]
{Shemyakin et al., 1969 ; Goodnlan & Chorev, 1979 ; Chorev & Goodman, 1993); oléfine ~i'[CH ~=CH] (Hann et al. , 1982 ; Kempf et al. , 1991 ;
Bohnstedt et al. , 1993) ; carba 'l'[CH2CH2] (Rodriguez et al. , 1990a, 1990b) ;
méthylèneoxy (éther) 'i'[CH20] (TenBrink, 1986 ; Breton et al. , 1990) ; cétométhylène ~I'[COCH2] (Harbeson & Rich, 1989 ; Gonzalcz-Munit et al. , 1995), hydroxy éthylène ~l'[CH(OH)C'.H2] {Evans et al., 1985 ; Wuts et al., 1992).
?0 1) Synthèse des pseudopeptides réduits correspondant aux séquences de MART et du peptide matrice M58-G6 La contribution de la fonction amine de chaque liaison peptidique de l'antigène Mart-1 27-~35 (AAGIGIL,TV) de la protéine Mart-1 du mélanome et de l'antigène M58-66 (C~LLGFVFTL) de la protéine matrice du virus de la grippe a été évaluée au niveau des interactions de ces antigènes avec leurs récepteurs:
la molécule de classe I du MHC HLA-A2 et le TCR.
libre rotation Structure ~ Structure rigide ~ ~ flexible plane 120°
H H
Liaison peptidique Liaison réduite ~S
Schéma 1: Représentation schématique des liaisons peptidique et réduite.

WO 98/50423 ~o PCT/FR98/00923 La liaison réduite ou méthylène amino a la particularité d'être plus flexible que la liaison peptidique en raison d'une libre rotation de la liaison carbone-carbone (schéma 1). L'introduction d'une liaison réduite peut modifier localement l'orientation des chaînes latérales des acides aminés. La liaison réduite peut exister sous sa forme protonée à pH physiologique. Les modifications entraînées par la présence d'une liaison réduite, à savoir la modification de la structure et la modification du caractère hydrophile du peptide parent, peuvent avoir des implications dans les phénomènes de fixation et de reconnaissance de l'antigène.
La synthèse de chaque peptide réduit a été réalisée en phase solide et en 1o chimie Fmoc classique. La liaison réduite est obtenue par condensation d'un a-amino aldéhyde N-protégé avec l'acide a-aminé immobilisé sur la résine.
L' imine formée est réduite in situ par le cyanoborohydrure de sodium pour conduire à la liaison réduite selon la méthode décrite par Sasaki et Coy en (schéma 2).
n O
H II
~N
PG ~ H R
_ a R' H
H2N~ Peptide résine PG ~ N.~ Peptide résine 2o NaBH3CN N
H
DMF, 1 % AcOH
Schéma 2: Incorporation en phase solide de la liaison réduite. PG:
groupement protecteur Fmoc.
2~ L'a-amino aldéhyde est synthétisé par la méthode de Fehrentz et Castro, 1983. Cette méthode permet l'obtention rapide, sans racémisation, de l'oc-amino aldéhyde N-protégé à partir du N,O-diméthylhydroxamate de l'acide aminé N-protégé correspondant (schéma 3).
O HCI,NH(CH3)OCH3 O O
BOP, DIEA, DMF H
N
PG ~ - OH PG ~ N ~ LiAlH4 N(CH3)OCH3 ~ PG
H
R~ -R, THF R, >>
Schéma 3: Synthèse des a-amino aldéhydes N-protégés par la méthode de Fehrentz et Castro. PG: groupement protecteur Fmoc.

WO 98/50423 ~ ~ PCT/FR98/00923 Les acides aminés suivants de la séquence du peptide réduit sont couplés d'une manière classique. Après synthèse, le peptide réduit est déprotégé et décroché de la résine: par l'acide trifluoroacétique {'rFA). Chaque peptide réduit est purifié par chromatographie liquide haute pression à polarité de phases inversée (RP-I-IPLC). La masse de chaque peptide est contrôlée par désorption laser assistée d'une matrice; (MALDI) à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF.
Les temps de rc~tention (Tr) sur colonne RP-HPLC' C18 dans un gradient de S à 65 % de B en 30 mn (avec A= eau à 0,1% de TFA et B= acétonitrile (ACN) à 0,08% de TFA) ainsi que les masses des différents peptides sont reportés dans i o les tables 1 et 2.
Table 1: Séquences et caractéristiques des peptides réduits analogues de Mart-1 27-35 na Squences P1 '.f2 P3 P4 PS P6 I'7 P8F'9 Tr masse MARTI 27-35 H- A - A - G - I - G L 'h- -OH 12.74 814.4 - I - - V

~I'(1-2) H-A'I'(CH2NH)A-G - I - G I_ ~h- -OH 12.53 802.7 - I - - V

?o ~f'(2-3) H- A- L T - -OH 12.58 802.9 A~I'(CH2NH)G- - V
I -G -~'(s-4) H- A -G'I'(CEI2NH)I- I. 'r- -OH 11.85 801.Ci ~l'(4-5) I-I- - G - I''(CH2NH)G-L 'I'- -OH 12.03 801.5 A - I - - V
A

~l'(5-6) H- A - G - I - G~I'(CH2NH)I- T - -OH 11.29 801.4 - A L V
-'I'(G-7) H- A - G - I - G - I~I'(GH2NH)I, - - -OI-I 12.00 800.4 - A 'fV

?s ~I'(7-8) H- A - G - I - G - I (CH~NH )T-V-OH 12.77 801.5 - A - L'' ''(8-9) II- - G - I - G - I T~I'(CII2NI-I)V-OH 12.46 801.

A

Table 2: Séquences et caractéristiques des peptides réduits analogues de 30 Squences PI P2 P3 P4 PS P6 P7 P8 l'9 Tr masse M58-66 H- G - L - L - G - F - V - F - 'T' -OI-I 12.35* 968.0 - L

~'(1-2) H-G'Y(CH2l~lH)L-L - G - F - V - F - -OH 10.67* 956.2 T - L

~~ ~'(2-3)H- G- L'I'(CH2NH)L- G - F - V - F - -OI-I 1 1.18* 957.1 T - L

~I'(3-4) H- G - L -L~I'(CH2NH)G- F - V - F - -OH 16.01 957.6 T - L

''(4-5) H- G - L - L - G''(CH2NH)F- V - F - -OH 15.61 954.3 T - L

~I'(5-6) H- G - L - L - <1 - F''(CH2NH)V- F -O-1 10.80* 955.8 - 'h - L

4'(6-7) H- G - L - L - CJ - F - V'H'(CH2NH)F- -OH 11.85* 953.2 T' - L

40 'l'{7-8)H- G - L - L - G - F - V - F~I'(CII2NH)T-OI 13.05* 954.7 - L

y'(8-9) H- G - L - L - G - F - V - F - T~'(CH2NH)L-OH 1 1.21 *
957.3 Temps de rtention dans le gradient n 30 (avec A=
20 80%~ de B e mn eau 0, 1 % de TFA et B= ACN 0,08 % de TFA).

WO 98/50423 ~2 PCT/FR98/00923 2) Synthèse des analogues (3 du peptide MART parent et du peptide MART muté (Leu2g) Les analogues (3 sont obtenus par couplage de ~3-homo acides aminés à la place des acides aminés naturels.
O

OH
R O
Acide aminé (3-homo acide aminé
Is Schéma 4: Représentation schématique d'un acide aminé et d'un ~-homo acide aminé
Le ~3-homo acide aminé est un acide aminé dans lequel un groupe méthylène a été inséré entre le carbone a et le carboxyle. La configuration du Ca, est 2o inchangée (schéma 4). L'incorporation d'un ~3-homo acide aminé à la place d'un acide aminé dans une séquence peptidique a pour conséquence d'allonger la chaîne peptidique des analogues peptidiques résultants. Ces analogues peptidiques plus longs peuvent ëtre amenés à se tordre, à s'arc-bouter pour pénétrer dans la poche de liaison de la molécule de classe I du CMH. Dans ce cas, certaines chaînes 2s latérales peuvent être déplacées latéralement ou leur orientation modifiée, ce qui peut entraïner des interactions préférentielles avec la molécule de classe I
du CMH
et/ou le TCR.
Les ~3-homo acides aminés sont obtenus par synthèse chimique en plusieurs étapes à partir des acides aminés N-protégés correspondants d'après le schéma 3o suivant (Schéma S).
L' acide aminé protégé sur sa fonction amine par le groupement Boc est dans un premier temps activé par la méthode aux anhydrides mixtes. L'acide aminé
activé réagit avec le diazométhane pour conduire à 1a diazométhylcétone 2. Le réarrangement de Wolff de cette diazométhylcétone dans le méthanol, en présence 3> du benzoate d'argent et de triéthylamine donne le (3-homo méthylester de l'acide aminé protégé par le groupement Boc. Une saponification conduit au composé 3.
La déprotection du Boc, suivie de la reprotection de la fonction amine par le groupement Fmoc sont les dernières étapes pour l'obtention du (3-homo acide aminé, protégé par le Fmoc.

Le composé 4 est introduit par les méthodes conventionnelles de couplage des acides aminés au cours de la synthèse en phase solide en stratégie Fmoc.
En pratique, S équivalent<.; du mélange (4/BOP/HOBtI sont couplés pendant 20 mn dans le DMF. Le grou;,pement Fmoc est déprotégé par la pipéridine à
50°~° dans le DMF et la synthèse esi: poursuivie d'une manière classique. Pour le décrochage et la déprotection du peptide ainsi que la purification et la caractérisation des peptides, voir paragraphe précédent.
O I) N-ntéthylmorpholine O
BocHN ~ chloroCormiate OH d'isobutyle BocHN~~

2) Cl-i2N2 R R

I ) C6HSCOOAg Et3N
MeOH
2) NaOH
IS
FmocHN I ) TFA
/OH 2) FmocOSu BocHN ~ OH
O
R O

2o Schéma 5: Schérrla de synthèse des Fmoc-(3-homo acides aminés Dans les tables 3 et 4 sont reportés les temps de rétention en RP-HPLC des peptides (3 sur uné colonne C 18 (gradient de S à 6S % de B en 30 mn avec A =
eau à 0,1% de TFA et B= ACN à 0,08% de TFA) ainsi que l'analyse de leur masse par MALDI.
?S

Table 3: Séquences et caractéristiques des peptides (3, analogues de Mart-1 Séquences P I P2 P3 P4 PS P6 P7 P8 P9 R't masse MART1 27-3S H- - A - G - I - G - I - V -OH 12.74 814.4 A - L - T

(31 H-(3-homoA-A- T -- V -OH 12.62 868.9*
G
-I
-G
-I
-L
-(32 H- (3-hornoA- G - 1 - T - V -O1-1 12.50 829.9 A- G - I - L -(33 H- - A -(3-homoG-I - G 'T -- V --OH12.48 828.9 A - I - L -3, (34 H- - A - G -(3-homol-G T - V --OH 12.50 829.5 A - I - L -(3S H- - A - G - I -(3-homoG-IT ~- V ~-OH 12.50 828.9 A - L -(36 H- - A - G - I - G -(3-homol-LT - V -OH I 2.64 829.0 A -(37 H- - A - G - I - G - I -T - V -OH 12.10 828.9 A -(3-homoL

(38 I-1- - A - G - I - G - I 1 l .92 829.1 A - L -(3-homo'-V ~-OFI

(39 H- - A -- G - I - G - (3-homoV-OH 12.68 829.2 A I - L - T -* correspond à M+K+

WO 98/50423 ~4 PCT/FR98/00923 Table 4: Séquences et caractéristiques des peptides (3, analogues de Mart-1 27-35 muté Leu2S
Séquences P I f2 P3 P4 PS P6 P7 P8 P9 Rt masse Mart-1 27- 35 Leu28A - L - G - I - G - I V -Of ( 14.20 857.0 fd- - L - T -h f-I-b-h omoA-L- C~ - 1 - G - I V -OI-I I 4.47 871.2 I - L - T -h2 H- A-b-homoL- V -OH 14.1 870.9 - I - L -'h -I H- A - L -b-bomoG-I - G - 1 V -Of I 14.07 871.0 O - L - T -b h4 H- A - L - G -h-homol-G - 1 V -OH 14.20 871.4 - 1. - T -h5 I--I- A - L - G - I -b-homoG-I V -OH 14.14 871.3 - L - T -h(> H- A - L - G - I - G -b-homol-LV -OH 14.05 871.7 - T -h7 1-I- A - L - G - I - G - 1 -h-homoL--I'V -Ol-1 I 3.78 871.--I H- A - L - G - 1 - G - I - 13.56 871.5 > L -b-homoT-V -Of i b8 b9 H- A - L - G - I - G - I - 14.14 871.4 L - T -h-homoV-OH

3) Synthèse du peptide [IIe3Q~I'(CH2CH2)G1y31] Mart-1 27-35 Cet analogue correspond à l'introduction d'une liaison carba à la place de la 20 liaison peptidique entre les résidus I1e30 et G1y31 de l'antigène Mart-1 27-35.
O
/ Ca+y ~Jl N/ Ca 12a°
H
Liaison peptidique Liaison carba ;0 Schéma 6: Représentation schématique des liaisons peptidique et carba La liaison carba confère une certaine flexibilité au pseudopeptide et ceci en raison de libres rotations autour des liaisons carbone-carbone. Ces libres rotations peuvent entraîner des changements dans l'orientation des chaînes latérales (portées par les carbones Ca et Ca+ 1, voir schéma 6) des deux acides aminés situés de part et d'autre de la liaison carba. Ces modifications dans l'orientation des chaînes ~to latérales peuvent avoir de nombreuses implications dans les phénomènes de fixation, de reconnaissance et d' induction de signaux différents par rapport à ceux engendrés avec le peptide parent.

Le synthon Fmoc-Ile'l'(CH2CH2)Gly-OH (4 de: la Figure 7) est nécessaire à
la synthèse de l'analo,gue [I(e30~I'(CH2CH2)GIy31] Mart-1 27-35. Ce synthon est obtenu par synthèse chimique en plusieurs étapes (schéma 7).
Le diméthylhydroxamate du Boc-[i-homoIle-OH (1) (pour la synthèse des (3-homo acides aminés, voir paragraphe précédent) est réduit par l'hydrure d'aluminium lithium à basse température (-25°C) dans le tétrahydrofurane afin d'obtenir l'aldéhyde correspondant (2). La réaction de Horner-Emmons en présence de triéthyl phosphonoacétate conduit au dipeptide éthylénique 3.
L'hydrogénation de la double liaison, la saponification de l'ester, la déprotection et la reprotcction de la fonction amine par le groupe Fmc>c permettent d'obtenir le Fmoc-Ile'l'(CH2CI-I2)Gly-OH (4).
gocHN OH 1 )HCI,NH(OMe)Me gocHN
n BOP, DIEA, DMF - H
2) LiAIH4 p THF

~o O O
I I
(OEt)2P~
OEt NaH
1) H2, Pd/C
?' FmocHN OH 2) NaOH
3) TFA gocHN ~ OEt 4) FmocOSu O
O

Schéma 7: Schéma de synthèse de Fmoc-I1e30~1'(CH2CH2)G1y31-OH (4) Ce synthon (4) est incorporé en phase solide en chimie Fmoc. Le couplage de 5 équivalents du mélange (synthon/BOP/HOBt) est réalisé 2 fois de suite (20 mn chaque) dans le DMF. Le groupement Fmoc est déprotégé par la pipéridine à 50%o d;~ns le DMF. Les acides aminés suivants sont couplés de WO 98/50423 3~ PCT/FR98/00923 manière classique. Le peptide est déprotégé et décroché de la résine dans 1e TFA, précipité dans l'éther et purifié par RP-HPLC.
Le pseudopeptide [I1e30~1'(CH2CH2)Gly3I] Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 100%. Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65% de B
{avec A=eau à 0,1% de TFA et B=ACN à 0,08°~° de TFA) est de 13,49 mn.
L'analyse de la masse du pseudopeptide par MALDI à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF donne la masse attendue M+H+ 800Ø
4) Synthèse des pseudopeptides carba analogues 1 à 8 de MART1 27-35 La synthèse de ces peptides est effectuée selon la procédure décrite dans Rodriguez et al., Tetrahedron letters, 1990, 31, 7319-7322.
Le pseudopeptide 1 carba Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 90%.
Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65 °~° de B
(avec comme éluant i> A=eau à 0,1% de TFA et B=Acétonitrile (ACN) à 0,08% de TFA) est de 12,98/13,10 mn. L'analyse de la masse du pseudopeptide par MALDI à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF donne la masse attendue M +I~ + 799,1.
Le pseudopeptide 2 carba Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 98 % .
Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65 % de B (avec comme éluant 2o A=eau à 0,1°~° de TFA et B=Acétonitrile (ACN) à 0,08% de TFA) est de 12,90 mn. L'analyse de la masse du pseudopeptide par MALDI à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF donne la masse attendue M +I I + 799,16.
Le pseudopeptide 3 carba Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 96%
(3a), 95 % (3b). Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65 % de B
(avec 2 > comme éluant : A =eau à 0,1 % de TFA et B =Acétonitrile (ACN) à 0,08 % de TFA) est de 13,07 (3a), 13,54 (3b} mn. L'analyse de la masse du pseudopeptide par MALDI à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF donne la masse attendue M+H+ 799,13.
Le pseudopeptide 4 carba Mart-I 27-35 est obtenu avec une pureté de 100 % .
30 Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65 % de B (avec comme éluant A=eau à 0,1% de TFA et B=Acétonitrile (ACN) à 0,08% de TFA) est de 13,49 mn. L'analyse de la masse du pseudopeptide par MALDI à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF donne la masse attendue M+H+ 800,03.
Le pseudopeptide 5 carba Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 99,7%
3a (5a), 96% (Sb). Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65% de B
(avec comme éluant : A=eau à 0,1% de TFA et B=Acétonitrile (ACN) à 0,08% de TFA) esi de 12,72 (5a), 14,16 (5b) mn. L'analyse de la masse du pseudopeptide par MALDI à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF donne la masse attendue M+H+ 799,1.

Le pseudopeptide 6 carba Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 86%
(6a), 90% (6b). Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65% de B (avec comme éluant : A=f:au à 0,1% de TFA et B=Acétonitrile (ACN) à 0,08% de TFA) est de 13,25 (tia), 13,72 (6b) mn. L'analyse de la masse du pseudopeptidc a par MALDI à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF donne la masse attendue M+H+ 799,16.
Le pseudopeptide 7 carba Mart-1 27 a un temps de rétention dans le gradient de 5 à 65 %o de B (avec comme éluant : A=eau à 0,1 % de TFA et B=Acétonitrile (ACN) à 0,08% de TFA) est de 10.20 (7a), 13,61 {7b) mn.
m Le pseudopeptide 8 carba Mart-1 27-35 est obtenu avec une pureté de 99%.
Son temps de rétention dans le gradient de 5 à 65 % de B (avec comme éluant A=eau à 0,1 % de TFA et B=Acétonitrile (ACN) à 0,08% de TFA) est de 15,24/15,29 mn. L'analyse de la masse du pseudopeptide par MALDI à l'aide du spectromètre Bruker I'rotein TOF donne la masse attendue M+H+ 798.
i;
B.2.) Synthèse d'analogues peptidiques comportant des acides aminés non protéinogéniquf~s Synthèse du peptide analogue (Tic62] M58-66 Le tétrahydroisoquinolène-3-carboxylique acide est un analogue contraint de ?o la phénylalanine. Il a été introduit en position 62 dans la séquence du peptide matrice de la grippe à la place de la phénylalanine naturelle afin d'étudier l'importance de l'orientation du groupe phényl dan: l'interaction avec la molécule CMH et le TCR.
La synthèse du peptide analogue a été réalisée en chimie Fmoc classique. Le dérivé Fmoc-L-Tic-OH (commercialisé par la société Néosystem) a été introduit dans la chaîne en croissance en utilisant un procédé classique de couplage (BOP/HOBt/Fmoc-L,-Tic-OH) en excès de 5 durant 20 mn dans du DMF. La déprotection du groupement Fmoc a été réalisée en plusieurs étapes. en 50%
pipéridine dans du D~MF (4 traitements de 30 mn chacun séparés de 3 lavages de la résine en DMF). D'assemblage des acides aminés suivants n'a pas posé de problèmes particuliers. Après déprotection classique en TFA et purification HPLC, le peptide a été obtenu à 90% de pureté. La masse mesurée à l'aide du spectromètre Bruker Protein TOF était la masse attendue M+H+ 978.9.
La synthèse du peptide analogue [Tic64]M58-66 est effectuée de la même façon que précédemment en introduisant le tétrahydroisoquinolène-3-carboxylique acide en lieu et place: de la phénylalanine en position 64.
Toujours selon le même protocole les analogues 3-Pya62 et 3-Pya64 de M58-66 ont été obtenus en introduisant l'acide aminé de formule WO 98/50423 3g PCT/FR98/00923 i~
_/
tJ .~~/ °'-t ~z h en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement ;
les analogues 2-Tha62 et 2-Tha64 de M58-66 ont été obtenus en introduisantl' acide aminé de formule _ ~ ~ I~
~o /\~
~ ~ I~
D
en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement ;
~ s . les analogues D-Phe62 et D-Phe64 de M58-66 ont été obtenus en introduisant la D-phénylalanine en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement ;
. les analogues Cha62 et Cha64 de M58-66 ont été obtenus en introduisant l'acide aminé de formule ?o ; I
/~oN
i~ZN r I
d 25 en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement ;
. l'analogue N-MePhe62 de M58-66 a été obtenu en introduisant l'acide aminé de formule i C
en lieu et place de la phénylalanine en position 62 ;
. les analogues pCl-Phe62 et pCl-Phe64 de M58-66 ont été obtenus en .. 35 introduisant l'acide aminé de formule ~~ N ~~/
z u WO 98!50423 ~~ PCT/FR98/00923 en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement ;
. les analogues Phg62 eE Phg64 de M58-66 ont été obtenus en introduisant l'acide aminé de formule ~\
~Jn f i-~~N o en lieu et place de la phénylalanine en positions 62 et 64 respectivement.
II- Etude des. propriétés biologiques des analogues peptidiques synthétisés:
i a A) Méthodologie 1 ) Détection de ll' association entre les peptides et les molécules d' histocompatibilité
1.1. Matériel Sources de molëcules d'histocompatibilité
'?o Elles sont actuellement de deux types principaux: les cellules mutantes et les molécules d'histocompatibilité purifiées.
- La cellule mutante utilisée est la cellule humaine 'T2 (DeMars et al. , 1985;
Ljunggren & Kàrre, L985 ; Salter & Cresswell, 1986) qui est un variant de la lignée T1 produite par fusion du lymphome T CEM et du lymphome B 721.174.
?a Cette cellule qui est èlépourvue de transporteurs de peptides contient des chaînes lourdes de molécules de classe I libres de peptides qui vont pouvoir accepter des peptides exogènes.
- Des molécules d'histocompatibilité de classe I purifiées par chromatographie d'affinité â partir de lignées de cellules B humaines transformées 3o par l'EBV peuvent être également utilisées. Dans ce cas les peptides endogènes doivent être éliminés par un traitement avec de l'urée 1,5 M et de la soude 12,5 mM (pH 11.7) pendant 1 h à 4°C, suivi de leur élimination par une colonne de désalage (PD1(>., Pharmacia). Les molécules d'histocompatibilité sont immédiatement remise, en présence des peptides à tester dans un tampon PBS
avec 0,05 %p Tween 20, 2 mM EDTA, 0,1 %a NP40 et 6 mM CHAPS, en présence de 2 ~.g/ml B2m pour faciliter la réassociation (Gnjatic et ,1. ,1995).

WO 98/50423 4o PCT/FR98/00923 Peptides Les peptides testés sont utilisés à des concentrations variant de 100 ~cM à
0,1 nM.
1.2. Protocole de l'assemblage Des aiiquots de 8 x 105 cellules T2 dans un volume de 64 /el, répartis dans des tubes microfuge Eppendorf, sont mis en présence d'un tampon de lyse contenant 10 mM PBS, pH 7.5, 1 °~° NP40, des inhibiteurs de protéases (1 mM
PMSF, 100 p,M iodoacétamide, 2 ~g/ml aprotinine, 10 ~.M leupeptine, 10 ~cM
pepstatine et 10 ~eg/ml inhibiteur de trypsine). La lyse se fait en présence des peptides à tester pendant 30 mn ou 1 h à 37°C. Après élimination du matériel non solubilisé par une centrifugation à IS 000 rpm à 4°C, le surnageant est additionné
de 140 ~,l de PBS contenant 0,05°~° de Tween 20, 3 mM d'azide de sodium, 1 mM
PMSF et 10 mg/ml d'albumine bovine. Chaque échantillon est incubé pendant i > 20 h à 4°C dans 2 puits d'une plaque à microtitration de type Nunc, Maxisorb, préalablement recouverts d'un anticorps monoclonal (Parham & Brodsky, 1981) (10 ug/ml en PBS) qui reconnaît les molécules d'histocompatibilité ayant une(des) conformations) conformes) pour la présentation des peptides et semblables) à
celles) présentes) à la surface des cellules. La plaque recouverte d'anticorps est 2o préalablement saturée par de l'albumine bovine à 10 mg/ml dans du PBS-Tween avant la mise de l'échantillon. Le second anticorps qui permet la détection de !'assemblage des molécules d'histocompatibilité est dirigé contre la béta2m.
II est couplé soit à la biotine (NHS-LC biotin, Pierce) soit à la phosphatase alcaline (P-5521, Sigma) et est incubé à 2 ~eg/ml pendant 1 h à 37°C. Dans le cas de ?s l'emploi de la biotine, une incubation de 45 mn à 20-25°C avec de l'extravidine couplée à la phosphatase alcaline (E-2636, Sigma) est réalisée. L'activité de la phosphatase alcaline est mesurée en utilisant comme substrat du 4-méthyl-umbelliferyl phosphate(M-8883, Sigma) à 100 ~cM dans de la diéthanolamine 50 mM, pH 9.5 avec du MgCl2 1 mM. La lecture est faite à
30 340/460 nm à l'aide d'un cytofluorimètre 2300, Millipore.
1.3. Contrôle de la stabilité des complexes HLA~e tilde Le matériel utilisé est soit du HLA purifié, soit le lysat de la cellule T2.
Avec le HLA purifié il faut éliminer les peptides endogènes comme décrit dans le ~a paragraphe I-1 et le mettre en présence du peptide à tester en tube Eppendorf à
37°C pendant des temps variables de quelques mn à plusieurs jours. La phase suivante d'incubation sur plaque 96 puits (voir paragraphe I-2) avec l'anticorps anti-HLA (Parham & Brodsky, 1981) se fait pendant 1 h à 37°C. La révélation est classique (Teillaud et al. , 1982). Avec le lysat de la cellule T2, toutes les WO 98/50423 4 ~ PCT/FR98/00923 incubations se font ég;rlement à 37°C après avoir ajouté tous les inhibiteurs de protéases.
1.4. Analyse de; la conformation des complexes HLA/peptide par la résonance plasmonique de surface oar le BIAcore Cet appareil mc;sure à l'aide d'un faisceau de lumière réfléchie les interactions moléculaires se produisant en temps réel dans un flux de tampon continu. Les anticorps nanti-HLA sont dilués à 25 ~g/rrrl dans du tampon acétate de Na pi-I 7.4 et fixés de façon covalente par leurs amines libres sur la matrice de ~ o dextran carboxyméthylée du "Sensor Chip CMS" activée avec 50 mM NHS et 200 mM EDC. L' injecaion se fait à 5 ul/mn pendant 6 mn puis les groupements réactifs résiduels sont bloqués avec 30 ~.l de chlorure d'éthanolamine pH 8.5.
Les complexes i-ILA/peptide formés comme indiqué dans Le paragraphe I-I sont injectés (30 ~.l) à 2 ~1/mn et vont pouvoir se lier à l'anticorps immobilisé.
Les na résultats sont exprimés en unités de résonance (RU) qui correspondent à
l'angle de déviation du faisceau lumineux, déviation proportionnelle à la concentration de protéines au contact de la matrice. Le système peut être réutilisë après régénération en injectant 1 M éthanolamine pendant 2 mn. Des mesures cinétiques et d'affinité peuvent être réalisées.
2 t) 2) Induction de lymphocytes T cytolytiques ira vitro Les cellules mononucléées issues du sang périphérique (PBMC), non purifiées, sont cultivées en RPMI 1640 et 10% SAB avec des antibiotiques, à la concentration de 2x 10'5 /ml à raison de 2 ml par puits (plaque Costar 24 puits). A
?, ces cellules sont ajoutés la toxine tétanique (TT) à 1 ~g/ml qui stimule les cellules T CD4+ et ie peptide à tester en tant qu'inducteur de CTL à 1 ~.g/ml. Au jour 3 ou 4, de l'IL-7 est .ajoutée à 50 U/m1. Pour chaque culture, 10 réplicats sont traités de manière indépendante. Les cellules effectrices générées sont rest~mulées par des PBMC préincubées avec le peptide (SO ~,g/ml pendant 4 h pour o lOx 106 cellules) puis irradiées à 6000 rads. Les cellules stimulatrices sont diluées à 106/ml et 1 ml est ajouté par puits de culture après avoir enlevé 1 ml de surnageant. Le lendemain et 4 jours plus tard, de I'IL-2 (10 U/ml) et de l'IL-(50 U/ml) sont ajoutées. Les effecteurs sont restimulés tous les 7 à 10 jours de la même façon. Quand l'activité cytolytique est apparue l'IL-2 est ajoutée à 50 U/ml.
a La cytotoxicité peut être testée après 2 stimulations puis chaque semaine.

WO 98/50423 4~ PCT/FR98/00923 3) Analyse des fonctions effectrices 3.1. 'test de c,~yse direct.
Les lignées T induites sont testées sur leur capacité à reconnaître le peptide inducteur présenté sur le HLA à la surface de cellules cibles, qui sont le plus a f~~-équemment des cellules lymphoblastoïdes EBV. La cytolyse qui en résulte est déterminée par le test standard de 4 h de relargage de SICr. Au Jour -3 ou -4 avant le test, l'ajout d'interleukines n'est pas fait car les cellules doivent être sevrées pour être en condition d'activation optimale. Pour les inductions primaires, la lyse ne peut être détectée avant 3 semaines. Les cellules cibles i o marquées pendant 1 h avec 10 ~,Ci de 51 Cr sont préincubées avec le peptide (5 ~,g/ml classiquement ou concentration variable). Après 2 lavages ces cellules sont réparties dans les puits d'une plaque de microtitration 96 puits à raison de 5000 par puits et les cellules effectrices sont ajoutées à des rapports variant de 1 à
100. Le relargage de SICr (R) obtenu pendant l'incubation de 4 h à 37°C
est i a mesuré. Le pourcentage de lyse est déterminé par la formule suivante:
(K. expérimental - R. spontané / R. total - R. spontané) x 100 3.2. Analyse des interleukines L'analyse de l'expression des gènes codant pour les interleukines est faite ?o avec une technique de RT-PCR semi-quantitative. Des PBMC ou des cellules purifiées CD8+ (1 à 2 x 106 ) sont mises en culture dans des plaques 24 puits et stimulées avec soit des anticorps monoclonaux anti-CD3 + en présence de 100 nM
de Phorbol Myristate Acetate (PMA) avec des PBMC autologues irradiés et sensibilisés ou non pendant 1 h 30 avec un peptide dont la reconnaissance est restreinte par les molécules du CMH. Pour les différentes interleukines, au bout de 12 à 14 h de stimulation (ou de 3, 10 et 24 h pour l'analyse cinëtique de l'apparition des ARNm), les cellules sont récupérées et l'ARN total extrait par la technique au RNAzoI (Bioprobe, Montreuil, France). L'ARN (1 à 2 mg) est rétrotranscrit avec la superscript II (Gibco BRL). Les cDNA synthétisés sont 3o dilués au i/5 avec de l'eau et leur concentration quantifiée par PCR
compétitive avec un plasmide (pQB.2) contenant la séquence de la B actine (produit de 237 pb gracieusement fourni par D. Shire). La réaction de PCR est faite en présence de mM de Tris-HCI, 50 mM de KCI, I.5 mM de MgCl2, 0.2 mM de chaque dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.4 mM d'amorce sense et antisense, 2 U de Taq polymérase (Promega). L'amplification est réalisée en commençant par une dénaturation à 94°C, 5 mn, puis par 30 cycles à 94°C, 30 s, 55°C, 30 s, 72°C, 30 s, et une dernière élongation à 72°C, 10 mn, dans un thermostat régulé (Perkin Elmers 9600). L'analyse de l'IL-2, de l'IL-4 et de l'IFN-g est faite dans les WO 98/50423 4~ PCT/FR98/00923 mêmes conditions que pour la B-actine, excepté le nombre de cycles qui varie entre 30 et 40. La quantification relative est réalisée par PCR compétitive.
B) Résultats 1) Analogues peptidiques du peptide MS$-6G comportant des acides aminés non protéinogéniques I .1. Liaison sur lia molécule A2 des ~entides de la série M58-66 Les résultats sont représentés sur la figure 1 (figures 1 A à I C).
i o Lcs peptides om: été incubés à différentes concentrations à 4 °C 18 h en présence de molécules HLA-A2 dénaturées et de (~2 microglobuüne. Les complexes stables HL,A-A2lpeptide formés à 4°C .sont capturés à l'Ac BB7.2 adsorbé sur plaque et révélés par un second Ac anti [12 microglobuline couplé
à la phosphatase alcaline. La quantité de complexes formés HLA--A2/peptide est i ~ proportionnelle à l' intensité de fluorescence détectée au cytofluor. NP
383-391 est un peptide contrôle négatif. 0, peptide correspond au bruit de fond en absence de peptide. U.F. : unité arbitraire de fluorescence.
Seules deux modifications affectent la liaison de ces peptides modifiés sur la molécule HLA-A2 : modification par la D-Phényl en position 62 ~o ([D-Phe62]M58-66) et en position 64 ([D-Phe64]M58-66).
1.2. Canaéité dede ces peptides à induire la ose des cellules cibles T2 par une lunée de çellules T çvtotQxiQUes (GTLI snécifiaue dc M58-66 et restreinte nar la molécule HLA-A2.1.
Les résultats sont représentés sur la figure 2 (figures 2A à 2D).
Les cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51 ), puis incubées pendant 2 h avec 1 ~g/ml de peptide. Après lavage, les cibles (5000 par puits) ont été
incubées pendant 4 h avec la lignée CTL à un rapport 10 cellules effectrices (E)/1 cellule cible (C). La lyse spécifique est exprimée en % de lyse en fonction de la 3u concentration en peptide incubée avec les cibles.
Les modifications Phg-62 et 64, DPhe-62 et 64, Cha62 et 64, Tic 62 et 64 affectent la reconnaissance des lymphocytes T cytolytiques spécifiques du peptide M58-66.
3~ 1.3. Dose ré o~nse.
Les résultats sont représentés sur 1a figure 3 (figures 3A et 3B).
Les cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant 1 h avec différentes concentrations de peptide. Après lavage, les cibles (5000 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec la lignée CTL à un rapport IOE/1C. La lyse spécifique est exprimée en % de lyse en fonction de la concentration en peptide incubée avec les cibles.
Les lymphocytes T cytolytiques spécifiques du peptide M58-66 ont une affinité plus faible pour les peptides modifiés.
2) Analogues peptidiques de Mart-1 comportant une liaison du type (3-homologation 2.1. Liaison sur la molécule A2.
I o Les résultats sont représentés sur la figure 4 (figures 4A et 4B).
Les différents peptides sont comparés pour leur capacité à se lier à la molécule HLA-A2. I purifiée.
Les peptides ont été incubés à différentes concentrations à 4°C 18 h en présence de molécules HLA-A2 dénaturées et de X32 microglobuline. Les i a complexes stables HLA-A2/peptide formés à 4°C sont capturés à l'Ac BB7.2 adsorbé sur plaque et révélés par un second Ac anti X32 microglobuline couplé
à la phosphatase alcaline. La quantité de complexes formés HLA-A2/peptide est proportionnelle à l'intensité de fluorescence détectée au cytofïuor. (U.F. :
unité
arbitraire de fluorescence).
?o NP est un peptide de la nucléoprotéine du virus de l' influenza qui ne se lie pas à la molécule HLA-A2 (contrôle négatif).
A part le peptide ~4 homo qui se lie mieux que le peptide parent, les autres peptides ~3 homo ont une affinité intermédiaire à faible par rapport au peptide Mart-1.
2.2. Capacité de ces nentides à induire 1a Ivse des cellules cibles T2 par 3 clones T spécifiques de Mart-1 restreints par la molécule HLA-A2 1.
Les résultats sont représentés sur la figure 5.
Les cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr5 I ), puis incubées pendant 30 2 h avec I ~,g/ml de peptide. Après lavage, les cibles {1500 par puits) ont été
incubées pendant 4 h avec les différents clones T (LTB, LTI l, LT12) à un rapport 3 cellules effectrices/l cellule cible (E/T). La lyse spécifique est exprimée en % de lyse.
Les cellules cibles T2 incubées avec le peptide parent Mart-1 sont iysées à
90%a par les trois clones cytolytiques (LT8, LT11 et LT12) spécifiques de ce peptide. En absence de peptide (0), aucune lyse n'est détectée. Seul le peptide (34 homo est capable d'induire une activité de lyse similaire au peptide parent pour un seul clone (LT12).

WO 98150423 q5 PCT/FR98/00923 2.3. Dose réponse.
Les résultats sont représentés sur la figure 6.
Les cellules cible, T2 A2 ont été chromées (Cr51 ), puis incubées pendant 2 h avec différentes concentrations de peptide. Après lavage, les cibles (1500 par a puits) ont été incubées pendant 4 h avec le clone T L'T12 à un rapport 3E/1C. La lyse spécifique est exprimée en °l° de lyse en fonction de la concentration en peptide incubée avec les cibles.
Le clone T LT12 a une affinité plus faible pour le peptide ('i4 que vis-à-vis du peptide Mart-1.
m 3) Analogues peptidiques du peptide Mart-1 comportant une liaison -CH2-NH-.
3.1. Liaison sur la molécule A2 des peptides de la série Mart-I réduit.
a Les résultats sont représentés sur la figure 7 (figures 7A et 7B).
Complexes formés peptides/I-ILA-A2 en fonction de la concentration en peptide Les peptides ont été incubés â deux concentrations différentes ( 10-4 M et 10-6 M) à 4°C 18 h en présence de molécules HLA-A2 dénaturées et de (32 3o microglobuline. Les complexes stables HLA-A2/peptide formés à 4°C
sont capturés à l'Ac BB7.2 (spécifique de cette molécule de classe I et adsorbé au fond des puits) et révélés par un second Ac anti (32 microglobuline couplé à la phosphatase alcaline. La quantité de complexes formés 1-ILA-A2/peptide est proportionnelle à l'intensité de fluorescence détectée au cytofluor. (U.F. :
unité
?s arbitraire de fluorescence).
Les peptides yr 1-2 à 4-5 ont une affinité intermédiaire à faible par rapport au peptide Mart-1. Les peptides y 4-5 à 8-9 se fient très faiblement à la molécule A2.1 purifiée.
30 3.2. Capacité dEa peptides de la série Mart réduit à induire la lyse des cellules cibles T2 par 3 clones T spécifiaues de Mart restreints par la molécule HLA-A2.1.
Les résultats sont représentés sur la figure 8.
Test de lyse 3, Des cellules cibl'.es T2 A2 ont été chromées {Cr51), puis incubées pendant 2 h avec I wg/ml de peptide. Après lavage, les cibles (1500 par puits) ont été
incubées pendant 4 h avec les différents clones T (LT'8, L,T11, LT12) à un rapport 3 cellules effectrices/ 1 cellule cible (E/T). La lyse spf:cifidue est exprimée en °~° de lyse en fonction des différents clones testés.

WO 98/50423 4~ PCT/FR98/00923 Les cellules cibles T2 incubées avec le peptide parent Mart-1 sont lycées à
90% par les trois clones cytolytiques (LTB, LT11 et LT12) spécifiques de ce peptide. En absence de peptide (0), aucune lyse n'est détectée. Seuls fes peptides y 2-3, yJ 5-6 sont capables d'induire une activité de lyse similaire au peptide parent pour un seul clone (LT8 et LT12 respectivement). yr 7-8 induit une activité
de lyse plus faible détectée uniquement avec le clone LT12.
3.3. Dose réponse dey différents peptides dui induisent une lyse avec les clones LT8 et LT12.
i o Les résultats sont représentés sur la figure 9 (figures 9A et 9B).
Test de lyse Des cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant 2 h avec différentes concentrations de peptide. Après lavage, les cibles {1500 par puits) ont été incubées pendant 4 h avec les différents clones T (LTB, LT12) à
un n rapport 3E/1C. La lyse spécifique est exprimée en % de lyse en fonction de la concentration en peptide incubée avec les cibles.
Les peptides y 2-3 et yr 5-6 ont une dose réponse comparable à celle du peptide parent alors que le peptide ~~ 7-8 n' induit la lyse que faiblement même à
concentration forte en peptide. Ce résultat suggère que la modification introduite 2o diminue l'affinité du TCR (récepteur T) du clone LT8 pour ce peptide.
4) Analogues peptidiques du peptide M58-G6 comportant une liaison -C H2-NH-.
2s 4.I. Liaison sur la molécule A2 des~eptides de la série M58-G6 réduit.
Les résultats sont représentés sur la figure 10 (figures l0A et lOB).
Les peptides ont été incubés à différentes concentrations à 4°C 18 h en présence de molécules HLA-A2 dénaturées et de X32 microglobuline. Les complexes stables HLA-A2/peptide formés à 4°C sont capturés à l'Ac BB7.2 3o adsorbé sur plaque et révélés par un second Ac anti (32 microglobuline couplé à la phosphatase alcaline. La quantité de complexes formés HLA-A2/peptide est proportionnelle à l'intensité de fluorescence détectée au cytofluor. U.F. :
unité
arbitraire de fluorescence.
Les peptides Mart-1 modifiés par réduction ont une affinité intermédiaire 3> pour la molécule HLA-A2. La réduction en position 2-3 et 8-9 rend la liaison indétectable pour le clone étudié.

WO 98/50423 4~ PCT/FR98/00923 4.2. Capacité des peptides de la série réduit M58-66 à induire la lyse des cellules cibles T2 nar une lignée CTL, induite nar M58-66 et restreinte~ar la molécule HLA-A2.1.
Les résultats sont représentés sur la figure 11.
Les cellules cibles T2 A2 ont été chromées (Cr51), puis incubées pendant 1 h avec 1 ~eg/ml df; peptide. Après lavage, les cibles (5000 par puits) ont été
incubées pendant 4 h avec la lignée CTL à un rapport 10E/1C. La lyse spécifique est exprimée en % de lyse.
La réduction en position 2-3 et 5-6 n'affecte pas la reconnaissance du peptide i o par les lymphocytes T cytolytiques spécifiques du peptide M58-66.
LEGENDE DE;S FIGURES
- Figure 1 : étude de la liaison aux molécules du CMH (I-ILA-A2) des analogues peptidiques du peptide M58-66 comportant des acides aminés non n protéinogéniques : les concentrations des analogues peptidiques (10-4 à 10-10 M) sont indiquées en abscisse, les unités de fluorescence sont indiquées en ordonnée . Figure lA : étude de la liaison des analogues peptidiques [Tic62]M58-66 (encore désigné M58-66 Tic62 ou Tic62), [3-I'ya62]M58-66 (3-Pya62), [2-Tha62)M58-66 (2-Tha62}, [D-Phe62]M58-66 (D-Phe62), [Tic64]M58-66 ?u (Tic64), . Figure 1B : êtude de la liaison des analogues peptidiques [3-Pya64]M58-66 (3-Pya64), [2-Tha64]M58-66 (2-Tha64), [D-Phe64]M58-66 (D-Phe64), [Cha62]M58-66 (Cha62), [N-MePhe62]M58-66 (N-MePhe62), Figure 1C : liaison des analogues peptidiques [pCl-Ph62]M58-66 (pCl-Phe62), [Phg62]M58-66 (Phg62), [Cha64]M58-66 (Cha64), [pCl-Phe64]M58-66 (pCl-Phe64), [Phg64]M58-66 {Phg64), en comparaison avec: le peptide M58-66, le peptide de contrôle négatif NP383-391, et une solution ne contenant aucun peptide (0 peptide).
- Figure 2 : étude de l'effet d'analogues peptidiques de M58-66 comportant ~o des acides aminés non protéinogéniques sur la lyse d'une lignée de cellules cibles T2 par une lignée de cellules T cytotoxiques spécifiques de M58-66 : le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée et le rapport Elrh (cellules effectrices/cellules cibles) est représenté en abscisse . Figure 2A : effet des analogues Tic62 et Tic64 sur la lyse des cellules T2, 3a . Figure 2B : f:ffet des analogues D-Phe62, D-Phe64, Cha62, Cha64 sur la lyse des cellules T2, Figure 2C : effet des analogues 3-Pya62, 3-Pya64, 2-Tha62, 2-Tha64 sur la lyse des celluies T2, Figure 2D : effet des analogues pCl-Phe64, Phg64, pCl-Phe62, Phg62 sur la lyse des cellules T2, en comparaison avec les effets du peptide M58-66, et d'une solution ne contenant pas de peptide (0 peptide).
- Figure 3 : étude de la réponse des cellules T cytotoxiques en fonction de la concentration d'analogues peptidiques du peptide M58-66 comportant des acides aminés non protéinogéniques : le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et la concentration des peptides en abscisse . Figure 3A : étude en fonction de la concentration de pCl-Phe62 et pCl-l o Phe64, . Figure 3B : étude en fonction de la concentration de 2-Tha62 et de 2-Tha64, en comparaison avec la concentration de M58-66.
- Figure 4 : étude de la liaison aux molécules du CMH (HLA-A2) des I a analogues peptididiques du peptide Mart-1 comportant une liaison du type ~3-homologation ; les concentrations des analogues peptidiques (10-5 à 10-~ M) sont indiquées en abscisse, les unités de fluorescence sont indiquées en ordonnée . Figure 4A : étude de la liaison des analogues (il homo (B1), X32 homo (B2), X33 homo (B3), (34 homo (B4), 20 . Figure 4B : étude de la liaison des analogues X35 homo (BS), X36 homo (B6), X37 homo (B7), X38 homo (B8), X39 homo (B9), en comparaison avec le peptide Mart-1 (Mart), et un peptide de contrôle négatif (NP).
- Figure 5 : étude de l'effet d'analogues peptidiques du peptide Mart-1 2a comportant une liaison du type (3-homologation sur la lyse des cellules cibles T2 par 3 clones de cellules T cytotoxiques (LTB, T11 et LT12) spécifiques de Mart-l:
le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et les analogues peptidiques B
1 à
B9 sont indiqués en abscisse, en comparaison avec Mart-1 et une solution sans peptide (0).
30 - Figure 6 : étude de la réponse des cellules T cytotoxiques en fonction de la concentration de l'analogue (34 homo de Mart-l, en comparaison avec Mart-1 :
le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et la concentration en peptide (~.g/ml) en abscisse.
- Figure 7 : étude de la liaison aux molécules du CMH (HLA-A2) des 3~ analogues peptidiques du peptide Mart-1 comportant une liaison -CH2-NH
(analogues réduits) : les peptides aux concentrations de 10-6 M ou de 10-4 M
sont indiqués en abscisse, et les unités de fluorescence sont indiquées en ordonnée . Figure 7A : étude de la liaison des peptides tl'(1-2)Mart-1 (représenté par 1-2), 'I'(2-3)Mart-1 (2-3), ~I'(3-4)Mart-1 (3-4), y'(4-5)Mart-1 (4-5), WO 98/50423 4~ PCT/FR98/00923 . Figure 7B : étude de la liaison des peptides 'l'(5-6)Mart-1 (5-6), 'l'(6-7)Mart-1 ((ï-7), 'I'(7-8)Mart-1 {7-8), 'I'(8-9)Mart-1 (8-9), en comparaison avec :hart-1.
- Figure 8 : étude de l'effet des analogues réduits I-2 à 8-9 de Mart-1 sur la lyse de cellules T2 par 3 clones de cellules T {LTB, LT11 et LTI2) spécifiques de Mart-1 : le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et les analogues peptidiques I-2 à 8-S~ sont indiqués en abscisse, en comparaison avec Mart-1 et une solution sans peptide (0).
- Figure 9 : étude de la réponse des cellules T cytotoxiques en fonction de la i o concentration d'analo;gues réduits de Mart-1 : le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnée, et la concentration des peptides en abscisse (~,g/ml) . Figure 9A : étude en fonction de la concentration des analogues 2-3 et 7-8, . Figure 9B : étude en fonction de la concentration de l'analogue 5-6, en comparaison avec la concentration de Mart-1.
i ~ - Figure 10 : Gaude de la liaison aux molécules du CMH (HLA-A2) des analogues peptidiques du peptide M58-66 comportant une liaison -CH2-NH-(analogues réduits) : les concentrations des peptides (10-IO à 10-4 M) sont indiquées en abscisse., et les unités de fluorescence sont indiquées en ordonnée . Figure l0A : étude de la liaison des peptides 'I'(I--2)M58-66 (1-2), ~o 'l'(2-3)M58-66 (2-3), 'l'(3-4)M58-66 (3-4), ~'(4-5)M58-66 (4-5), . Figure IOB : étude de la liaison des peptides 'I'(5~-6)M58-66 (5-6), 'I'(6-7)M58-66 (6-7), 'l'(7-8)M58-66 (7-8), 'l'(8-9)M58-66 (8-9), en comparaison avec M58-66, et un peptide muté (GIL) de M58-66 portant la mutation G_LL -~ GII~ [M58-66 (GIL)], ?> - Figure 11 : étude de l'effet des analogues réduits 1-2 à 8-9 de M58-66 sur la lyse de cellules 'C2 par un clone de cellules T spécifique de M58-66 : le pourcentage de lyse est indiqué en ordonnëe, et le rapport cellules effectrices/cellules cibles (E/T) est indiqué en abscisse, en comparaison avec MS8-66, M58-66 muté (GLL) et une solution sans peptide (0).
âo

5~ PCT/FR98/00923 RIIFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims (20)

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'analogues peptidiques de peptides parents, ces peptides parents étant le cas échéant issus de protéines exogènes ou endogènes, lesdits peptides parents interagissant avec des molécules du CMH dans le cadre de pathologies impliquant une réponse immunitaire à médiation cellulaire, chez l'homme ou l'animal, lesdits analogues étant caractérisés en ce qu'ils correspondent auxdits peptides parents dans lesquels:
- au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, à l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, ou - au moins un acide aminé de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ou - au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, est modifiée, et au moins un acide aminé de ladite chaîne peptidique est substitué
par un acide aminé non protéinogénique, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies susmentionnées.

2. Utilisation selon la revendication 1, d'analogues peptidiques issus de peptides parents interagissant avec des molécules du CMH de classe I, dans le cadre de pathologies impliquant les lymphocytes T cytotoxiques.

3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, d'analogues peptidiques caractérisés en ce que l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaîne peptidique du peptide parent est remplacée par une liaison différente de la liaison -CO-NH-, ladite liaison différente étant notamment choisie parmi les suivantes:

-CH2-NH- (méthylène amino);
-CH2-CH2- (carba);
-CO-CH2- (cétométhylène);
-CH2-O- (méthylène-oxy);
-CHOH-CH2-(hydroxyéthylène);
-CHOH-CHOH- (di-hydroxyéthylène);
-CH=CH- (E ou Z oléfine);
-CHCN-NH- (cyanométhylène amino);
-S-CH2- (thiométhylène);
-CH2-S- (méthylène thio);
-CS-NH- (thioamide);
-PO2-NH- (phosphonamide);

-CHOH- (hydroxyméthylène);
-NH-CO-NH- (urée);

-CH2-CO-NH- (.beta.-homologation) ;
-CHOH-CH2-NH- (hydroxyéthylène amino);
-CO-NH-NH- (hydrazino).

4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, d'analogues peptidiques caractérisés en ce que l'un au moins des acides aminés de la chaîne peptidique du peptide parent, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, ledit acide aminé non protéinogénique étant choisi notamment parmi les acides aminés suivants:
- les acides aminés de configuration D, - les acides .alpha.-aminés de formule générale:

dans laquelle:
. R1, R2 et R3, représentent indépendamment les uns des autres : un atome d'hydrogène, un hydroxyle, un radical alkyle de 1 à 25 atomes de carbone, un radical contenant un groupe allyle et ayant de 3 à 25 atomes de carbone, un radical contenant un ou plusieurs cycles aromatiques ou non, notamment un groupe aryle, et ayant de 6 à 25 atomes de carbone, et notamment les groupes suivants : -CH3(méthyl), -CH2CH3(éthyl), -(CH2)4-CH3, -CH(CH3)2 (isopropyl), -C(CH3)3 (tertiobutyl), -.PHI.(phényl), -CH2.PHI.(benzyl), -CH2.PHI.Cl (para-chlorobenzyl), -CH2-CH2.PHI. (2-phényl-éthyl), -CH2CHCH2 (alkyl), méthylfluorényl, -CH2CONH2 (glycolamide), -CH2CON.PHI.2 (benzhydrylglycolamide), -CHOH.PHI., étant entendu que l'un des deux groupes R2 et R3 peuvent représenter une chaîne latérale d'acides aminés naturels lorsque soit R1, soit l'autre des deux groupes R2 et R3 ne représentent pas un atome d'hydrogène, . le cas échéant, R1, R2, C.alpha., et N forment un hétérocycle de 4 à 8 atomes de carbone, aromatique ou non, le cas échéant substitué, notamment un hétérocycle de formule:
- les acides .beta.-aminés de formule générale:
dans laquelle R1, R2 et R3, indépendamment les uns des autres représentent une chaîne latérale d'un acide aminé naturel, ou sont tels que définis ci-dessus, notamment:
les .beta.-homo amino acides de formule:
dans laquelle R1 et R2, sont tels que définis ci-dessus, ou . les .alpha.-hydroxy .beta.-homo amino acides de formule:
dans laquelle R1 et R2, sont tels que définis ci-dessus, - les acides .gamma.-aminés de formule générale:
dans laquelle R1, R2, R3 et R4 représentent indépendamment les uns des autres une chaîne latérale d'un acide aminé naturel, ou R1, R2 et R3, sont tels que définis ci-dessus, et R4 a la même signification que celle donnée ci-dessus pour R1, R2 et R3, notamment les dérivés de statine de formule:

5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, d'analogues peptidiques caractérisés en ce qu' ils sont sélectionnés parmi ceux susceptibles:
-~d'une part d'être reconnus par les molécules du CMH et de s'associer avec ces dernières, notamment par mise en oeuvre de la méthode suivante:
~ incubation, de l'analogue peptidique en présence de molécules du CMH, provenant de la lyse de cellules humaines ou animales, ou purifiées notamment par chromatographie d'affinité à partir de lignées cellulaires humaines ou animales, sur un support solide recouvert d'un premier anticorps, notamment monoclonal, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique, ~ addition sur le support solide précédent d'un deuxième anticorps marqué, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, ledit anticorps marqué reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la .beta.2-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I, ~ détection, après rinçage du support soude, de l'éventuelle présence du deuxième anticorps marqué resté fixé sur le support solide, témoignant d'un effet de reconnaissance et d'association entre les molécules du CMH et l'analogue peptidique étudié, - et, d'autre part, de former un complexe avec lesdites molécules du CMH, dont la stabilité peut être évaluée par mise en oeuvre d'une méthode de suivi dans le temps de la liaison établie entre l'analogue peptidique et les molécules du CMH, cette méthode étant avantageusement effectuée selon un protocole identique à la méthode précédente, mais dans laquelle l'étape d'incubation de l'analogue peptidique en présence des molécules du CMH sur le support solide recouvert dudit premier anticorps, se fait pendant des temps variables de quelques minutes à plusieurs jours.

6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, d'analogues peptidiques caractérisés en ce qu' ils sont sélectionnés:
* parmi ceux susceptibles:
- d'induire in vitro l'apparition et la croissance de lymphocytes T
cytotoxiques à partir de cellules humaines ou animales, notamment à partir de cellules mononucléées issues du sang périphérique (PBMC), en présence de facteurs nécessaires à la croissance et la différenciation des cellules T
cytotoxiques, - d'induire in vitro la cytolyse par des lymphocytes T cytotoxiques, de cellules cibles présentant à leur surface l'analogue peptidique associé aux molécules du CMH, lesdits lymphocytes T cytotoxiques étant avantageusement prélevés sur un patient atteint d'une pathologie dans laquelle est impliqué le peptide parent de l'analogue peptidique étudié, - et d'induire in vitro la sécrétion de cytokines (ou interleukines) par les lymphocytes T cytotoxiques susmentionnés, notamment IL-2, IL-4 ou l'interféron .gamma.,~
lesdits analogues peptidiques ainsi sélectionnés étant:
. soit des agonistes des récepteurs (TCR) reconnaissant l'antigène (à savoir le peptide parent) des cellules T cytotoxiques, et dérivent de peptides parents se comportant eux-mêmes comme des agonistes ou des antagonistes desdits récepteurs, . soit des agonistes partiels desdits récepteurs, et dérivent de peptides parents se comportant eux-mêmes comme des agonistes desdits récepteurs, ces agonistes partiels induisant notamment la sécrétion d'une ou plusieurs cytokines différentes de celles dont la sécrétion est induite par les peptides parents, * ou, parmi ceux - susceptibles d'induire in vitro l'apparition et la croissance de lymphocytes T cytotoxiques à partir de cellules humaines ou animales, notamment à partir de cellules mononucléées issues du sang périphérique (PBMC), en présence de facteurs nécessaires à la croissance et la différenciation des cellules T
cytotoxiques, - n'induisant pas in vitro la cytolyse par des lymphocytes T cytotoxiques, de cellules cibles présentant à leur surface l'analogue peptidique associé aux molécules du CMH, lesdits lymphocytes T cytotoxiques étant avantageusement prélevés sur un patient atteint d'une pathologie dans laquelle est impliqué le peptide parent de l'analogue peptidique étudié, - n'induisant pas in vitro la sécrétion de cytokines (ou interleukines) par les lymphocytes T cytotoxiques susmentionnés, notamment IL-2, IL-4 ou l'interféron .gamma., lesdits analogues peptidiques ainsi sélectionnés étant des antagonistes des récepteurs des cellules T cytotoxiques.

7. Analogues peptidiques de peptides parents impliqués dans le mélanome, notamment le peptide MART1 27-35, ledit peptide parent comportant, le cas échéant, une ou plusieurs mutations, tel que le peptide parent muté MART1 27-Leu28, lesdits analogues peptidiques correspondant auxdits peptides parents dans lesquels l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- est modifiée, à
l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, lesdits analogues étant notamment choisis parmi les suivants:

- les analogues peptidiques de MART1 27-35 dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CH2-NH-, tels que les analogues ~(1-2) à ~(8-9) suivants:
Séquences ~(1-2) H-A~(CH2NH)A-G -I - G - I - L - T - V -OH
~(2-3) H -A- A~(CH2NH)G- I - G - I -L - T - V -OH
~(3-4) H- A -A -G~(CH2NH)I- G - I - L - T - V -OH

~(4-5) H- A -A
- les analogues peptidiques de MARTI 27-35 dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CI-I2-CO-NH-, encore désignée ci-après ~-homo, tels que les analogues ~I à ~9 suivants Séquences .beta.1 H-p-n~rt,~A-A-G - I - I - L - T - V -OIi - G

Ii- A-p.~,omoA-G - I - I - L - T - V -OH
- G

I-i- A - n~moG-I - I - I_ - T - V -OH
A -p- - G

I-I- A - G -p-,,omoI-G- I - L - T - V -OH
A -I~I- A - G - I
A - -p-v,<>m~G-I
- I_ - T -V -OH

H- A - A G - I -p-~,~moI-L - '1' - - CJ - V -OH

H- A - A G - I - I -~~.~,omoL-T -- - G V -OH

H- A - A G - I - I - I_ -p_n~moT-V
- - G -OH

H- A - A G - I - I - L - T -p_no~V-OH
- - G

- les analogues Leu2g dont l'une au peptidiques moins des de MARTI 27-35 liaisons -CO-NH-remplace une liaison-CH2-CO-NH-, tels est par que les analogues ~ I lesquels X39 susmentionns l'alanine dans en P2 est remplace par une leucine, - les analogues peptidiques de MARTI 27-35 dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CH2-CH2-, tels que les analogues suivants : -

8. Analogues peptidiques des peptides parents du virus de la grippe, notamment du peptide parent M58-66, lesdits analogues peptidiques correspondant auxdits peptides parents dans lesquels:
- l'une au mains des liaisons peptidiques -CO-NH- est modifiée, à
l'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, lesdits analogues étant notamment choisis parmi ceux dont l'une au moins des liaisons -CO-NH-est remplacée par une liaison -CH2-NH-, tels que les analogues suivants:

Séquences M58-66 ~ H- G - L - L - G - F - V - F - T - L -OH
~(1-2)~~H-G~(CH2NH)L-L - G - F - V - F - T - L -OH
~(2-3)~~H-G- L~(CH2NH)L- G - F - V - F - T - L -OH~~
~(3-4)~~H- G - L -L~(CH2NH)G - F - V - F - T - L -OH
~(4-5)~~H- G - L - L - G~(CH2NH)F - V - F - T - L -OH
~(5-6)~~H- G - L - L - G - F~(CH2NH)V- F - T - L -OH
~(6-7)~~H- G - L - L - G - F - V~(CH2NH)F- T - L -OH
~(7-8)~~H- G - L - L- G- F - V - F~(CH2NH) T - L -OH
~(8-9)~~H- G - L - L - G - F - V - F - T~(CH2NH)L-OH

- l'un au moins des acides aminés de la chaîne peptidique, est substitué par un acide aminé non protéinogénique, tels que les analogues suivants:

9. Analogues peptidiques de peptides parents du virus du SIDA, notamment des peptides NEF 84-92, et GAG 77-85, lesdits analogues peptidiques correspondant auxdits peptides parents dans lesquels l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- est modifiée, à L'exception des modifications du type rétro, ou rétro-inverso, lesdits analogues étant notamment choisis parmi - ceux dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CH2-NH-, tels que les analogues NEFRD1-8 du peptide NEF, et GAGRD1-8 du peptide GAG suivants NEF ~~~~AVDLSHFLK
NEFRD1 ~~~~A~(CH2-NH)VDLSHFLK
NEFRD2 ~~~~AV~(CH2-NH)DLSHFLK
NEFRD3 ~~~~AVD~(CH2-NH)LSHFLK
NEFRD4 ~~~~AVDL~(CH2-NH)SHFLK
NEFRDS ~~~~AVDLS~(CH2-NH)HFLK
NEFRD6 ~~~~AVDLSH~(CH2-NH)FLK
NEFRD7 ~~~~AVDLSHF~(CH2-NH)LK
NEFRD8 ~~~~AVDLSHFL~(CH2-NH)K

GAG SLYNTVATL
GAGRD1 S~(CH2-NH)LYNTVATL
GAGRD2 SL~I(CH2-NH)YNTVATL
GAGRD3 SLY~(CH2-NH)NTVATL
GAGRD4 SLYN~(CH2-NH)TVATL
GAGRDS SLYNT~(CH2-NH)VATL
GAGRD6 SLYNTV~(CH2-NH)ATL
GAGRD7 SLYNTVA~(CH2-NH)TL
GAGRD8 SLYNTVAT~(CH2-NH)L
- ceux dont l'une au moins des liaisons -CO-NH- est remplacée par une liaison -CHOH-NH-, tels que les analogues NEFHEA1-8 du peptide NEF
suivants:
NEF AVDLSHFLK
NEFHEA1 A~(CHOH-NH)VDLSHFLK
NEFHEA2 AV~(CHOH-NH)DLSHFLK
NEFHEA3 AVD~(CHOH-NH)LSHFLK
NEFHEA4 AVDL~(CHOH-NH)SHFLK
NEFHEA5 AVDLS~(CHOH-NH)HFLK
NEFHEA6 AVDLSH~(CHOH-NH)FLK
NEFHEA7 AVDLSHF~(CHOH-NH)LK
NEFHEA8 AVDLSHFL~(CHOH-NH)K

10. Utilisation d'analogues peptidiques définis dans l'une des revendications 1 à 9, pour la préparation de médicaments, notamment de vaccins, destinés à la prévention ou au traitement des pathologies dans lesquelles les peptides parents sont des agonistes ou antagonistes des récepteurs reconnaissant l'antigène des cellules T cytotoxiques, et plus particulièrement des pathologies neurodégénératives infectieuses (d'origine virale ou bactérienne), tumorales (notamment le mélanome), auto-immunes et allergiques.

11. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif au moins un analogue peptidique défini dans l'une des revendications 1 à 9, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

12. Vaccin caractérisé en ce qu'il comprend un analogue peptidique agoniste, le cas échéant partiel, défini dans l'une des revendications 1 à 9, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

13. Composition de diagnostic pour le diagnostic in vivo de pathologies impliquant la réponse immunitaire à médiation cellulaire, notamment les lymphocytes T cytotoxiques, ou pour l'évaluation in vivo de la réponse immunitaire dans le cadre des pathologies susmentionnées, par mise en oeuvre d'une réaction cutanée d'hypersensibilité par injection intradermique de ladite composition de diagnostic, caractérisée en ce qu'elle comprend un analogue peptidique défini dans l'une des revendications 1 à 9, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable.

14. Complexe entre un analogue peptidique défini dans l'une des revendications 1 à 9, et un élément du complexe d'histocompatibilité majeur (encore désigné complexe binaire MHC-analogue peptidique), et éventuellement un récepteur de cellules T (encore désigné complexe ternaire MHC-analogue peptidique-récepteur T).

15. Méthode de diagnostic in vitro de pathologies impliquant la réponse immunitaire à médiation cellulaire, notamment les lymphocytes T cytotoxiques, à
savoir de pathologies associées à la présence dans l'organisme d'un patient, de peptides exogènes ou endogènes interagissant avec des molécules du CMH, et susceptibles d'être directement ou indirectement impliqués dans le processus de développement de ces pathologies chez l'homme ou l'animal, caractérisée en ce qu'elle comprend:
- la mise en contact d'un échantillon biologique provenant d'un patient, avec un analogue peptidique défini dans l'une des revendications 1 à 9, dans des conditions permettant la réaction entre les récepteurs des cellules T
susceptibles d'être présentes dans l'échantillon biologique, et le complexe binaire susceptible d'être formé entre ledit analogue peptidique et les molécules du CMH présentes dans ledit échantillon;
- la détection in vitro du complexe ternaire CMH-analogue peptidique peptidique-récepteur T, susceptible d'être formé à l'étape précédente.

16. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro selon la revendication 15, comprenant:
- un analogue peptidique défini dans l'une des revendications 1 à 9;

- des réactifs pour rendre un milieu apte à la formation d'une réaction immunologique;
- des réactifs permettant de détecter le complexe ternaire selon la revendication 14, qui a été produit à l'issue de la réaction immunologique, lesdits réactifs contenant éventuellement un marqueur ou étant susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où
ledit analogue peptidique n'est pas marqué.

17. Anticorps dirigés contre les complexes binaires tels que définis dans la revendication 14, lesdits anticorps étant tels qu'obtenus par immunisation d'un animal avec au moins un complexe binaire susmentionné, lesdits anticorps étant susceptibles de former un complexe avec ces complexes binaires.

18. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps selon la revendication 17, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable.

19. Procédé de criblage d'analogues peptidiques définis dans l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
~ incubation pendant des temps variables de quelques minutes à
plusieurs jours, de l'analogue peptidique en présence de molécules du CMH, provenant de la lyse de cellules humaines ou animales, ou purifiées notamment par chromatographie d'affinité à partir de lignées cellulaires humaines ou animales, sur un support solide recouvert d'un premier anticorps, notamment monoclonal, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique, ~ addition sur le support solide précédent d'un deuxième anticorps marqué, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, ledit anticorps marqué reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la .beta.2-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I, ~ détection, après rinçage du support solide, de l'éventuelle présence du deuxième anticorps marqué resté fixé sur le support solide, ~ évaluation de la durée de l'association entre ledit analogue peptidique et les molécules du CMH.

20. Trousse ou kit pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage selon la revendication 19, comprenant - des molécules du CMH, et/ou - des anticorps, reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison audit analogue peptidique, avantageusement fixés sur un support solide, ou fournis avec les réactifs nécessaires à leur fixation sur le support solide, et/ou - des anticorps marqués, notamment par couplage à un marqueur radioactif, enzymatique ou fluorescent, reconnaissant spécifiquement soit les molécules du CMH dans leur conformation dépendante de leur liaison à l'analogue peptidique, soit une molécule se liant elle-même spécifiquement aux molécules du CMH dans leur conformation susmentionnée, notamment la .beta.2-microglobuline reconnaissant spécifiquement les molécules du CMH de classe I, et/ou un protocole pour la mise en oeuvre dudit procédé, et/ou - un peptide de contrôle.