WO2004039968A1

WO2004039968A1 - 骨髄由来の不死化樹状細胞株

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Publication number: WO2004039968A1
Application number: PCT/JP2003/013951
Authority: WO
Inventors: Toshiyuki Takai; Masuo Oginata; Yumi Ito; Kozue Ito; Shin Ebihara
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-10-30
Filing date: 2003-10-30
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2005-04-30

Abstract

　樹状細胞が本来有する機能・特性を保持する不死化樹状細胞株やその樹立方法、かかる不死化樹状細胞株を用いた有用物質のスクリーニング方法及びかかる不死化樹状細胞株を主成分とする細胞ワクチンを提供するものである。ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの骨髄細胞を溶血処理した後、リンパ球及びＩａ陽性細胞を除去し、得られた細胞をＧＭ−ＣＳＦの存在下培養することにより樹状細胞を誘導することにより、継代培養を１０回以上繰り返し、細胞表面にミエロイド分子及びロイコサイト分子を発現し、抗原の取込み能、抗原の提示能、及びＣＴＬ活性の誘導能を有する不死化樹状細胞株を樹立する。

Description

骨髄由来の不死化樹状細胞株技術分野

本発明は、骨髄に由来する不死化樹状細胞株に関し、詳しくは S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子を導入したトランスジエニックマウス（ t明s S V 4 0 L T T gマウス）の骨髄に由来する樹状細胞（Dendr i t i c c e l l ； D C ) を継代培養することにより田

樹立することができる不死化樹状細胞株及びその製法や、その利用に関する。本発明の不死化樹状細胞株は、樹状細胞のインビトロにおける解析ゃ樹状細胞を用いたワクチン療法の開発並びに免疫応答の修飾、増強の研究に応用できる。背景技術

従来、医薬品の安全性や有効性に関する試験研究には主として動物が用いられていたが、動物愛護の観点から動物を使用する代わりに、培養細胞等を用いてィンビトロで医薬品の有効性や安全性を試験研究する技術の実用化レベルでの研究が行われている。例えば、生体組織から採取した初代培養細胞や無限増殖する不死化細胞（樹立細胞）系を用いる方法で予め試験した後に動物試験が行われている。しかし、初代細胞は初期段階ではよく増殖するが、継代培養とともに次第に増殖が停止し、やがては死滅す,る（この現象を細胞老化という）。さらに、初代細胞は、その特性が生体組織から採取する度に異なるという危惧に加え、継代とともに変化することが指摘されている。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合には、試験に供するに足る初代細胞を得ることは非常に困難であるとされている。

一方、初代培養の継代を重ねるなかで、細胞老化を免れて無限増殖する能力を獲得した不死化細胞では、安定して均一の特性を有することになるが、このような不死化細胞の多くは、その細胞が生体において本来有していた形態や機能の一部又はその全てを喪失する。そのため、このような不死化細胞株を用いた試験では、その細胞株の由来する組織での本来の特性を正確に反映することは難しいとされていた。そこで、初代細胞に r a s遺伝子や c 一 m y c遺伝子などの発癌遺伝子、アデノウィルスの E l A遺伝子、 S V 4 0ウィルスのラ一ジ T抗原遺伝子、ヒトパピロ一マウィルスの H P V 1 6遺伝子等を導入して細胞を形質転換し、初代細胞の有する活発な増殖能を継続的に保持し、さらに継代することによってその細胞固有の特性を喪失しない不死化細胞を樹立する試みがなされている。ところが、このような不死化細胞においても、対象とする臓器によっては、その初代細胞を調製し、これらの癌遺伝子やラージ T抗原遺伝子を導入する時点で、すでに幾つかの機能を喪失するため、本来の機能を保持する厳密な意味での不死化細胞の取得は困難であった。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合の初代細胞を調製して株化することは極めて困難であった。

これに対し、近年確立された動物個体への遺伝子導入技術を用いて、個々の細胞に癌遺伝子やラージ T抗原遺伝子を導入するかわりに、これらの遺伝子を安定的に染色体に組み込んだ遺伝子導入動物を作出し、個体の発生時点において既に癌遺伝子やラージ T抗原遺伝子を細胞の中に保有する動物の臓器から初代細胞を調製して、これを継代することによつて不死化細胞を樹立する方法が報告されている。特に t s S V 4 0 L T T gマウスの臓器から得られる不死化細胞は、その増殖や分化形質の発現を温度を変えることによって操作することができるため、非常に有効であるとされている（Transgenic Research 4, 215-225, 1995、 Genes to Cells, 2, 235-244, 1997、 Exp. Cell Res. , 197, 50-56, 1991、 Exp. Cell Res. , 209, 382-387, 1993、 Exp. Cell Res.， 218, 424-429, 1995、 Blood, 86, 2590-2597, 1995、 J. Cell. Physiol. , 164, 55-64, 1995、 Exp. Hematol. , 27, 1087-1096, 1999)。

他方、樹状細胞（D C) は造血幹細胞由来の樹枝状形態をとる細胞集団で、生体内に広く分布している。未成熟樹状細胞は、それぞれの組織に侵入したウィルスや細菌をはじめとする異物を認識して取り込み、リンパ系器官 T細胞領域への移動の過程でぺプチドを消化分解によって生成し、 MHC分子に結合させて細胞表面に提示することにより、抗原特異的な T細胞を活性化して免疫応答を誘導する抗原提示細胞としての役割を担っている（Ann. Rev. Immunol. 9, 271-296, 1991、 J. Exp. Med. , 185, 2133-2141, 1997) ₀ このように、 D Cは T細胞依存性の初期免疫応答を惹起できるという T細胞応答の始動にとって非常に重要な役割を果たしている（Nature, 392, 245-252, 1998、 Annu. Rev. Immunol. , 18, 767-811, 2000)。骨髄で生まれた D Cは未熟な状態で、生体内の様々な組織に飲食作用をもって分布する。その未熟 D Cは抗原を取り込み成熟し、 2次リンパ性器官へと移動する。そしてその T細胞領域に蓄積して、体内を循環している T細胞のうち抗原特異的なものを選択的に活性化して免疫応答を駆動する。しかし、 D Cのインビポにおけるこれらの詳しいメカニズムは未だ分かっておらず、インビトロにて解析する必要がある。マウスのインビト口のシステムにおいて顆粒球マク口ファージコロニー剌激因子（GM— C S F) を用いることにより、機能的な D Cの誘導が初期培養で可能であるが、その寿命は長くても 2ヶ月である（J. Exp. Med. , 175, 1157-1167, 1992)。近年、マウスの 2次リンパ性器官である脾臓から、 D Cが GM— C S F依存的に長期培養（ 1 2ヶ月以上）できることが報告されたが（D 1細胞： J . Exp. Med.， 185, 317-328, 1997)、未熟で抗原を取り込んでいない、骨髄などの 1次リンパ組織からは D C 細胞株が樹立されていない。

樹状細胞（D C )は免疫応答の駆動を行う重要な細胞である。しかし、 D Cの生体内での動態の解析や、癌免疫賦活への応用は始まったばかりであり、未解明な点が多く残されている。 D Cは生体から調製することで培養可能であるが、その寿命は限られており、 G M— C S F等のサイトカイン存在下で培養しても、長くて 1ヶ月程度しか存続できず、その後死滅する。これまでは、安定的に増殖し続ける樹状細胞の作製は非常に困難であって、樹状細胞の簡便な株化方法もなく、免疫の誘導や修飾、樹状細胞を用いた治療などに目処が立っていなかった。すなわち本発明の課題は、樹状細胞が本来有する機能 ·特性を保持する不死化樹状細胞株やその樹立方法、かかる不死化榭状細胞株を用いた有用物質のスクリ一二ング方法及びかかる不死化樹状細胞株を主成分とする細胞ワクチンを提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、 t s S V 4 0 L T T gマウスの骨髄細胞を溶血処理した後、リンパ球及び I a陽性細胞を除去し、得られた細胞を G M— C S Fの存在下培養することにより樹状細胞を誘導し、継代培養を 1 0回以上繰り返し、樹立した不死化樹状細胞株が、細胞表面にミエロイド分子及びロイコサイト分子を発現し、抗原の取込み能、抗原の提示能、及び C T L活性の誘導能を有するなど、 D Cが本来有している性質を備えていることを確認し、本発明を完成するに至った。発明の開示

すなわち本発明は、骨髄に由来することを特徴とする不死化樹状細胞株（請求項 1 ) や、細胞表面にミエロイド分子及びロイコサイト分子を発現し、抗原の取込み能、抗原の提示能、及び CTL活性の誘導能を有することを特徴とする請求項 1記載の不死化榭状細胞株（請求項 2 )や、 3 3 °Cで増殖することができるが、 3 7 °Cでは増殖が抑制されることを特徴とする請求項 1又は 2記載の不死化樹状細胞株（請求項 3) や、 L P S刺激に応答能を有することを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載の不死化樹状細胞株（請求項 4) や、齧歯類起源であることを特徴とする請求項 1〜4のいずれか記載の不死化樹状細胞株（請求項 5) や、齧歯類がマウスであることを特徴とする請求項 5記載の不死化榭状細胞株（請求項 6 ) や、不死化樹状細胞株 TD C (F E RM B P - 0 8 5 2 7 ) (請求項 7 ) に関する。

また本発明は、 S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子を導入したトランスジエニックマウスの骨髄細胞を溶血処理した後、リンパ球及び I a陽性細胞を除去し、得られた細胞を GM— C S Fの存在下培養することにより樹状細胞を誘導し、継代培養を 1 0 回以上繰り返し、細胞表面にミエロイド分子及びロイコサイト分子を発現し、抗原の取込み能、抗原の提示能、及び C T L活性の誘導能を有する細胞株を樹立することを特徴とする不死化樹状細胞株の製造方法（請求項 8 ) や、 3 3 °Cで増殖することができるが、 3 7 °Cでは増殖が抑制され、 L P S刺激に応答能を有する細胞株を樹立することを特徵とする請求項 8記載の不死化樹状細胞株の製造方法（請求項 9) や、被検物質の存在下、 .請求項 1〜 7のいずれか記載の不死化樹状細胞株を培養し、該細胞株における成熟マーカータンパク質の発現の程度を測定 ·評価することを特徴とする樹状細胞における成熟促進又は抑制物質のスクリ一ニング方法（請求項 1 0)や、マーカ一タンパク質が、ミエロイド分子、ロイコサイト分子、 I 一 A^b、 C D 8 6及ぴ Z又は C D 4 0であることを特徴とする請求項 1 0記載の樹状細胞における成熟促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項 1 1 ) や、被検物質の存在下、請求項 1 〜 7のいずれか記載の不死化樹状細胞株を培養し、該細胞の増殖の程度を測定 ·評価することを特徴とする樹状細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項 1 2 ) や、被検物質の存在下、請求項 1〜 7のいずれか記載の不死化樹状細胞株を L P S刺激し、該細胞の I L一 1 2産生量を測定、評価することを特徴とする樹状細胞の活性化促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項 1 3 ) に関する。

さらに本発明は、請求項 1 0又は 1 1記載のスクリーニング方法により得られる榭状細胞における成熟促進物質（請求項 1 4 ) や、請求項 1 2記載のスクリ一二ング方法により得られる樹状細胞における細胞増殖促進物質（請求項 1 5 ) や、請求項 1 3記載のスクリーニング方法により得られる樹状細胞の活性化促進物質（請求項 1 6 ) や、請求項 1〜 7 のいずれか記載の不死化樹状細胞株を主成分とすることを特徴とする細胞ワクチン（請求項 1 7 ) や、不死化樹状細胞株が、 3 3 °Cで増殖することができるが、 3 7ででは増殖が抑制される不死化樹状細胞株であることを特徴とする請求項 1 7記載の細胞ワクチン（請求項 1 8 ) や、不死化樹状細胞株が、抗原又は抗原一 I g G免疫複合体を取り込ませた不死化樹状細胞株であることを特徴とする請求項 1 7又は 1 8記載の細胞ワクチン（請求項 1 9 ) や、抗原が腫瘍抗原であることを特徴とする請求項 1 9記載の細胞ワクチン（請求項 2 0 ) に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の不死化した榭状細胞株の榭状細胞と B 6マウスの樹状細胞をライトギムザ染色した結果を示す写真である。

第 2図は、本発明の不死化した樹状細胞株について、 M T Tアツセィにより温度条件を変えて増殖能を測定した結果を示す図である。

第 3図は、本発明の不死化した樹状細胞株の増殖において、 GM— C S Fの要求性を MTTアツセィにより測定した結果を示す図である。第 4図は、本発明の不死化した樹状細胞株と B 6マウスの樹状細胞上の代表的なミエロイド分子の発現量を F AC Sで解析した結果を示す図である。

第 5図は、本発明の不死化した樹状細胞株と B 6マウスの樹状細胞表面上の代表的なロイコサイト分子の発現量を F AC Sで解析した結果を示す図である。

第 6図は、本発明の不死化した樹状細胞株と B 6マウスの樹状細胞の抗原取り込み能を F AC Sで解析した結果を示す図である。

第 7図は、本発明の不死化した樹状細胞株と B 6マウスの榭状細胞の L P S刺激に対する、樹状細胞の成熟度を F AC Sで解析した結果を示す図である。

第 8図は、本発明の不死化した樹状細胞株と B 6マウスの樹状細胞の L P S剌激に対する、樹状細胞の I L一 1 2 p 7 0産生量を E L I S A 法にて測定した結果を示す図である。

第 9図は、本発明の不死化した樹状細胞株と B 6マウスの樹状細胞に OVAを取り込ませ、 2 日後の成熟度を F AC Sで解析した結果を示す図である。

第 1 0図は、本発明の不死化した樹状細胞株と B 6マウスの樹状細胞の OVA— T細胞への抗原提示能の結果を示す図である。

第 1 1図は、本発明の不死化した樹状細胞株と B 6マウスの榭状細胞に OVAを移入し、経時的抗 OVA抗体価を示す図である。

第 1 2図は、本発明の樹状細胞株の樹状細胞を移入した後、約 3週間後の、脾臓胚中心の免疫組織化学染色（抗 GL— 7抗体）した結果を示す写真である。

第 1 3図は、本発明の樹状細胞株の樹状細胞を移入したことによる、生体内の C T L活性を比較検討した結果を示す図である。

第 1 4図は、本発明の不死化した樹状細胞株と B 6マウスの樹状細胞における MHCクラス I /OVAぺプチド複合体の発現量を比較した結果を示す図である。

第 1 5図は、本発明の不死化した樹状細胞株を移入したことによる、生体内での増強された抗腫瘍活性の結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明の不死化樹状細胞株としては、骨髄に由来する不死化樹状細胞株であればどのようなものでもよく、 3 3 °Cで増殖することができ、 3 7 °Cでは増殖が抑制される細胞株が好ましく、この温度感受性の点を除いては、 D Cが本来備えている性質を有するものがより好ましい。例えば、細胞表面にミエロイド分子及びロイコサイト分子を発現し、抗原の取込み能、抗原の提示能、及び C TL活性の誘導能を有する細胞株や、 L P Sによる刺激により樹状細胞が成熟化、活性化され、 I L一 1 2を産生するなど L P S刺激に応答能を有する細胞株や、これらの性質を合わせ有する細胞株を好適に例示することができる。また、かかる不死化樹状細胞株の具体例として、不死化樹状細胞株 TD Cを挙げることができ、この TD C株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号 F E RM B P— 0 8 5 2 7 (平成 1 4年 9月 2 6 日に寄託された F E RM P— 1 9 0 44号より移管）として、ブダペスト条約に基づく寄託がなされている。また、本発明の不死化樹状細胞株の由来は特に限定されないが、マウス等の齧歯類などの動物から得られた不死化樹状細胞株は、マウスが豊富な病態モデルを有し、薬理作用の評価に広く用いられていることから好ましい。以下、本発明の不死化樹状細胞株の製造方法を、マウスを用いた方法を例にとって説明する。

マウス由来の本発明の不死化樹状細胞株は、例えば、 t s S V 4 0 L T T gマウスの骨髄細胞を塩化アンモニゥムを用いて溶血処理した後、例えば抗 C D 4抗体、抗 C D 8抗体、抗 I 一 A^b抗体、抗ラット I g抗体とゥサギ補体を用いて、リンパ球と I a陽性細胞を除去した細胞を 2 0 n g/mLのマウスリコンビナント GM— C S Fを含む完全 R PM I 培地 ( 5 % F C S) を用いて培養し、榭状細胞（D C) を誘導し、継代培養を 1 0回以上繰り返し、細胞表面にミエロイド分子及びロイコサイト分子を発現し、抗原の取込み能、抗原の提示能、及び CTL活性の誘導能を有する細胞株を樹立することにより得ることができる。

また、 t s S V 4 0 L T T gマウスは、次のようにして作製することができる。 S V 4 0の複製起点（ o r i ) を欠失させた t s A 5 8 o r i (一）一 2の全 D N Aを制限酸素 B amH Iで開環して p B R 3 2 2に導入したプラスミド p S V t s A 5 8 (―) — 2 (O noT. et al. , Cytotec nology 7, 165-172, 1991) を常法に従い大腸菌内で大量に増幅させ、この増幅したプラスミドを制限酵素 B amH Iで切断してベクタ一部位を除去し、 t s A 5 8のラージ T钪原遺伝子を有する DN A断片を調製する。このラージ T抗原遺伝子のプロモーターが内在する D N A 断片を常法に従いマウスの全能性細胞に遺伝子導入することにより、 S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子を全ての細胞内に有する遺伝子導入マウス、すなわちトランスジエニックマウスを作出することができる。かかるトランスジエニックマウスは、その全ての体細胞において t s A 5 8のラ一ジ T抗原遺伝子が発現することになる。そして、上記全能性細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有する E S細胞などを具体的に挙げることができる。' また、全能性細胞への D N Aの導入方法としては、マイクロインジェクション法、電気パルス法、リボソーム法、リン酸カルシウム法等の公知の遺伝子導入法を用いることができる。

上記マウスの全能性細胞（培養細胞）の核を、除核未受精卵に移植して初期化すること（核移植）で卵子に S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子を導入することができる。また、前核期受精卵の雄性前核に S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラ —ジ T抗原遺伝子をマイクロインジヱクションして得られる卵子を仮親の卵管に移植して産仔を得た後、注入した遺伝子を持つ産仔を選出し、安定的にかかる遺伝子が組み込まれた個体を得ることで、個体発生時にすでに t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子が各組織の細胞の染色体に組み込まれた遺伝子導入マウス、すなわちトランスジエニックマウスを効率よく作出することができる。

本発明の不死化樹状細胞株は、 3 3 °Cにおいて永久的増殖能を保持し、 3 7 °Cにおいては増殖が抑制され、 3 9 °Cにおいては増殖を停止するため、細胞固有の分化形質の発現を制御することができるという特色を有している。また、この不死化樹状細胞株は、 7ヶ月以上継代培養行っても 3 3 °Cで良好な増殖性を示し、樹状細胞としての機能を保持している。本発明の不死化樹状細胞株は、安定的に増殖し続けることができ、また、該榭状細胞の有する抗原取り込み能及び抗原提示能により、 T細胞を活性化させることができるので細胞ワクチンとして有用である上に、免疫の誘導や修飾、樹状細胞を用いた治療の研究に用いることができる。また、以下に示すように、樹状細胞に対する有用物質のスクリーニングに用いることができる。

本発明におけるスクリーニング方法としては、被検物質の存在下、上記本発明の不死化樹状細胞株を培養し、該細胞株におけるミエロイド分

0 子、ロイコサイト分子、 I 一 A ^b、 C D 8 6、 C D 4 0等の成熟マーカ一夕ンパク質の発現の程度を測定 ·評価する樹状細胞における成熟促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、該細胞株の増殖の程度を測定 - 評価する樹状細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリ一二ング方法や、該細胞株を L P S刺激し、該細胞の I L一 1 2産生量を測定、評価する樹状細胞の活性化促進又は抑制物質のスクリ一二ング方法等を挙げることができる。そして、上記スクリーニング方法により得られる樹状細胞における成熟促進物質や、樹状細胞における細胞増殖促進物質や、樹状細胞の活性化促進物質も本発明に含まれる。

上記樹状細胞における成熟促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化樹状細胞株を種々の濃度の被検物質の存在下でそれぞれ培養し、一定時間培養後に発現したマーカ一タンパク質の量を検出 ·測定し、被検物質の非存在下で培養した対照のものと比較 ·評価することにより行われる。例えば、樹状細胞の表面に発現する成熟度マーカータンパク質であるミエロイド分子やロイコサイト分子は、それぞれ特異抗体を用いて常法により免疫化学的に検出することにより測定することができる。また、これらに相当する m R N Aの発現量を常法により検出することにより測定することもできる。上記樹状細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化樹状細胞株を種々の濃度の被検物質の存在下でそれぞれ培養し、一定時間培養後に細胞数や細胞の形態を測定 ·解析し、被検物質の非存在下に培養した対照のものと比較 ·評価することにより行われる。また、上記榭状細胞の活性化促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化樹状細胞株を種々の濃度の被検物質の存在下でそれぞれ培養し、一定時間培養後に I L一 1 2の産生量を測定し、被検物質の非存在下に培養した対照のものと比較 ·評価することにより行われる。本発明の細胞ワクチンとしては、上記本発明の不死化樹状細胞株を主成分とするものであれば特に制限されるものではないが、上記不死化樹状細胞株としてはヒト由来の不死化樹状細胞株が好ましく、かかるヒト由来の不死化樹状細胞株は、ヒト末梢血又は骨髄より樹状細胞株を単離し、 S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子を導入し、継代培養を繰り返すことにより、あるいはヒトの胚性幹細胞 ( E S細胞）に S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラージ T 抗原遺伝子を導入し、これをインビトロで樹状細胞株に分化させ、継代培養を繰り返すことにより樹立することができる。また、不死化樹状細胞株としては、 3 3 °Cで増殖することができるが、 3 7 °Cでは増殖が抑制されるものや、不死化樹状細胞株が腫瘍抗原等の抗原や抗原一 I g G 免疫複合体を取り込ませたものが好ましい。本発明の細胞ワクチンは、インビボ又はインビトロで抗原を取り込ませ、修飾後細胞表面に抗原性のべプチドを提示する、 T細胞を刺激する抗原提示細胞として用いることができる。例えば、本発明の不死化樹状細胞株の懸濁液からなる本発明の細胞ワクチンは、ヒト体内に治療用のワクチンとして接種されることになるが、 3 7 では増殖が抑制されることから安全性が高い。通常、細胞ワクチンとしての安全性を高めるために、加熱処理、放射線処理、あるいはマイ卜マイシン C処理などが必要とされるが、本発明の不死化樹状細胞株は、かかる細胞不活化処理が不要で、かつ、 3 3 °Cで増殖することができるが、 3 7ででは増殖が抑制されることから極めて安全性が高いワクチンということができる。

本発明の細胞ワクチン、特にヒト由来の不死化樹状細胞株を主成分とする細胞ワクチンは、ヒトに移入可能な細胞ワクチンとして、白血病、肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌などの各種腫瘍、及び各種ウィルス、細菌等による感染症等に対して有利に利用することができる。本発明の細胞ヮクチンの投与量は、患者の年齢、体重、性別、癌の種類及び癌の進行度、症状等により異なり、一概に決定できないが、現在行われている細胞ヮクチン療法で注入されるのと同程度の量が患者に投与することができる。本発明の細胞ワクチンは、患者本人に使用することもできるが、骨髄バンク、臍帯血バンクの発達により、 MHC適合の同種の多数の患者に投与することができる。以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。実施例 1 (トランスジエニックマウスの作出）

S V 40の温度感受性突然変異株 t s A 5 8の DN Aを導入したトランスジエニックマウスは、下記の手順で作出した。

(導入遺伝子の調製）

マイクロインジェクションには S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のゲノム DN Aを遺伝子工学的手法で改変したものを使用した。 t s A 5 8のゲノム DN Aを制限酵素 B amH Iで開環し、 p B R 3 2 2の B amH I部位に導入し、 S ί i I配列を S a c II に変換して S V 4 0の複製起点（ o r i ) を欠失する o r i (—）とした DNAクローン p S V t s A 5 8 o r i (-) - 2 (Ohno T. et al. , Cytotechnol ogy, 165-172, 1991 ) から常法に従い導入用 D N Aを調製した。すなわち、大腸菌内で大量に増幅させることにより得られたプラスミド D N Aの p S V t s A 5 8 0 r i (一） - 2を制限酵素 B a mH I (宝酒造社製）で消化した後、ァガロース電気泳動法（ 1 %ゲル；ベーリンガー社製）により分離し、ゲルを溶解した後、フエノール · クロロホルム処理及びェ夕ノール沈殿処理を行い DN Aを回収した。回収した精製 DN Aを T E ノッファー（ I mMの EDTAを含む 1 0 mMの T r i s _HC l ； p H 7. 6)に溶解して 1 7 0 g/m 1 の精製 D N Aを含む溶液を得た。この DNA溶液を注入用バッファ一（ 0. 1 mMの E D T Aを含む 1 0 mMの T r i s -HC l ； p H 7. 6 ) で 5 g/m 1 となるように希釈して注入用 DNA溶液を調製した。なお、調製した DNA溶液は注入操作まで— 2 0 で保存した。

(トランスジエニックマウスの作出）

マウス前核期受精卵への上記調製した注入用 DN A溶液のマイクロインジェクシヨンは下記の要領で行つた。性成熟した 8週齢のウィスターマウスを明暗サイクル 1 2時間（4 ： 0 0〜 1 6 ： 0 0を明時間）、温度 2 3 ± 2 C、湿度 5 5 ± 5 %で飼育し、膣スメァにより雌の性周期を観察して、ホルモン処理日を選択した。まず、雌マウスにより 1 5 0 I U Zk gの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（日本ゼンャク社製； PMSゴナド卜ロピン (pregnanto mare serum gonadotropin : PMS G)) を腹腔内投与し、その 4 8時間後に 7 5 I U/k gのヒト絨毛性性腺刺激ホルモン (三共臓器社製；プべロ一ケン (human chorionic gonadotropin： h C G)) を投与して過剰排卵処理を行った後、雄との同居により交配を行った。 h C G投与 3 2時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。卵管灌流及び卵の培養には mK R B液（Toyoda Y. and Chang M. ， J. Reprod. Fertil. , 36， 9-22, 1974) を使用した。採取した受精卵を 0. 1 %のヒアルロニダーゼ（シグマ社製； Hyaluronidase Typel-S) を含む mKRB液中で 3 7 °C, 5分間の酵素処理を行い卵丘細胞を除去した後、 mKR B液で 3回洗浄して酵素を除去し、 DNA注入操作まで C 0₂—インキュベーター内（ 5 %の C〇₂— 9 5 %の A i r， 3 7 °C、飽和湿度）に保存した。この様にして準備したマウス受精卵の雄性前核に前記 DN A溶液を注入した。注入した 2 2 8個の卵を 9匹の仮親に移植して出産させ 8 0匹の産仔を得た。注入 D N Aのマウスへの導入は、離乳直後に断尾して得た尾より調製した DN Aを P C R法により検定した [使用プライマー； t s A 5 8 _ l A， 5 ' 一 TC CTAATGTGC AGT CAGGT G— 3，（ 1 3 6 5〜 1 3 8 4部位に相当：配列番号 1 )、 t s A 5 8 - 1 B , 5 ' - ATGAC GAGCTTTGGC ACT TG— 3 ' ( 1 5 7 1〜 1 5 9 0部位に相当：配列番号 2)]。その結果、遺伝子導入の認められた 2 0匹（雄 6匹、雌 8匹、性別不明 6匹）の産仔の中から性成熟期間を経過する 1 2週齢まで生存した 1 1ラインのトランスジエニックマウス（雄ライン： # 0 7— 2 , # 0 7— 5， # 0 9 一 6， # 1 2— 3， # 1 9一 5，雌ライン： # 0 9— 7， # 1 1一 6 , # 1 2— 5 , # 1 2— 7 , # 1 8— 5 , # 1 9— 8) を得た。これらの G。世代のトランスジエニックマウスとウイスターマウスを交配し、雄フアウンダ一の 2ライン（# 0 7— 2， # 0 7— 5 ) と雌フアウンダーの 3ライン（# 0 9— 7， # 1 1一 6， # 1 9一 8 ) において次世代以降への遺伝子の伝達を確認した。実施例 2 (マウス骨髄からの D Cの分離，調整）

マウスは C 5 7 B L/ 6 (B 6マウス）と温度感受性 S V 4 0 T抗原卜ランスジエニックマウス（ t s S V 4 0 L T T gマウス； B 6バックグラウンド）の 2系統を用いた。また、これらマウスは全て 6〜 8週齢の雌を用いた。マウスの骨髄細胞を 0. 1 44 M塩化アンモニゥムにて赤血球 l y s i s処理し、抗 CD 4抗体、抗 CD 8抗体、抗 I 一 A^b 抗体、抗ラット I g抗体（それぞれ T I B 2 0 7、 2 1 1、 1 5 4、 2 1 6 ： Amerikan Type Culture Collection) とゥサギ補体（Cedarlane 社製）を用いて、リンパ球と I a陽性細胞の除去を行った。この細胞 I X 1 0 ⁶ /well を 2 0 n g/mLのマウスリコンビナント GM— C S F

5 (Peprotech 社製）を含む完全 R P M I培地（ 5 % F C S) を用い、 2 4穴プレートで培養し、 6日後に樹状細胞（D C) を誘導した。 t s S V 4 0 L T T gマウスからの D Cは 3 3 ° (：、 5 % C〇 ₂条件下で誘導後、継代を 5 X 1 0⁵/mL/well で 1 0回以上繰り返し（4〜 5 日ごとに培地交換、 3週ごとに継代）、 7ヶ月以上培養したものを用いた。なお、 B 6マウスからの D Cは上記の方法により骨髄細胞を単離し、 D C を誘導した後、 3 7°C、 5 % C〇 ₂条件下で培養し、その時点で解析に用いた。実施例 3 (ライトギムザ染色による形態観察）

実施例 2で得られた D Cのライトギムザ（Wright-Giemsa)染色を行つた。 B 6マウスと t s S V 4 0 L T T gマウスの 2系統を起源とするそれぞれの D Cをサイトスピンでスライドグラスに接着させ、ライトギムザ法（ライト染色液 ·ギムザ染色液、ともにメルク社製）にて染色し、可視化した。結果を図 1に示す。この結果、細胞の大きさは、 t s S V 4 0 L T T gの D C (S V4 0 T B 6 ) の方が B 6マウスの D C (初代培養 B 6 ) より大きかった。実施例 4 (異なる温度での増殖能）

MTT (3- (4, 5-dimethyl t iazol-2-yl)-2, 5-di phenyl tet razo-1 ium bromide)はミトコンドリア内膜の脱水素酵素などにより開裂されて赤紫色の MT T- iormazan を生成する。この呈色反応が細胞の増殖能に比例するこ.とに基づいた MTTアツセィにより、 t s S V 4 0 L T T gの D Cの異なる温度（ 3 3°C、 3 7 °C, 3 9 °C) での増殖能を測定した。 MTTアツセィは、 5mg/mLのMTT (シグマ社製）溶液 1 0 L を前記 2 O n g/mLのマウスリコンビナント GM— C S F (Peprotech

6 社製）を含む細胞懸濁液 1 0 0 2 Lに添加し、 9 6穴プレートに 7. 5 X 1 0³/ 1 0 0 L/ ell で細胞をまき、測定時に MTT溶液を 1 0 /well添加し、経時的に測定を行った。結果を図 2に示す。この結果、 S V4 0 T抗原が発現する 3 3 °Cで最も増殖能が高かった。実施例 5 (GM— C S F要求性）

t s S V 40 L T T gの D Cについて、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM— C S F) 要求性を検討するため、実施例 4と同様な条件で、 MTTアツセィを行った。すなわち、 5mg/mLの MTT (シグマ社製）溶液 1 0 Lをそれぞれ 2 0、 1 0、 2、 O n gZmL 濃度のマウスリコンビナント GM— C S F (Peprotech 社製）を含む細胞懸濁液 1 0 0 t Lに添加し、 9 6穴プレートに 7. 5 X 1 0³/ 1 0 0 n L/wellで細胞をまき、測定時に MT T溶液を 1 0 x L/well添加し、経時的に測定を行った。結果を図 3に示す。この結果、通常の初代培養の D C誘導に用いる濃度の 2 0 n g /m Lで一番増殖が良かった。この不死化細胞は GM— C S F依存的に増殖する細胞であることが分かつた実施例 6 (細胞表面に発現するタンパク質の検討）

t s S V 4 0 L T T gマウス（S V4 0 T B 6) と B 6マウス（初代培養 B 6) の 2系統を起源とするそれぞれの D Cを用いて、細胞表面上に発現する代表的なタンパク質であるミエロイド分子及びロイコサイト分子の発現を F AC Sにて解析した。結果を図 4及び図 5に示す。この結果、上記 2系統を起源とする D Cにおけるミエロイド分子及びロイコサイト分子の発現量は共に変わらなかった。実施例 7 (抗原の取込み能の比較検討）

t s S V 40 LT T gマウス（S V 40 T B 6) と B 6マウス（初代培養 B 6) の 2系統を起源とするそれぞれの D Cを用いて、 1 0 / g /mLの抗原（OVA— F I TC ； Molecule Probes 社製）を添加後 2 日目に取込み能の比較検討を F AC Sにて行った。結果を図 6に示す。この結果、 t s S V 40 LT T gの D Cは B 6マウスの D Cよりも強い取込み能を示した。実施例 8 (L P S刺激に対する樹状細胞の成熟化の比較検討）

t s S V 40 LT T gマウス（S V 40 T B 6) と B 6マウス（初代培養 B 6) の 2系統を起源とするそれぞれの D Cについて、それぞれの D Cの培養ゥエルに L P Sを 2 H gZmL添加して、 24時間後の細胞表面上の成熟度マーカ一である I 一 A^b、 CD 8 6と CD 4 0の発現量を F A C Sにて解析した。結果を図 7に示す。この結果、 t s S V 4 0 LT T gの D Cにおける成熟度マーカーのアップレギュレーション、つまり成熟度は B 6マウス（初代培養 B 6 ) の D Cと変わらず起こることが分かった。実施例 9 (L P S刺激に対する樹状細胞の活性化の比較検討）

t s S V 4 0 L T T gマウス（S V4 0 T B 6 ) と B 6マウス（初代培養 B 6 ) の 2系統を起源とするそれぞれの D Cにおける、 L P S剌激に対する D Cの活性化として I L一 1 2 p 7 0産生量を E L I S Aにて測定した。結果を図 8に示す。この結果、それぞれの D Cの培養ゥェルに L P Sを 2 g/mL添加して、 2 4時間後の上清中の I L一 1 2 p 7 0産生量は 2系統間で変わらなかった。

8 実施例 1 0 (抗原を取り込ませた場合の樹状細胞の成熟化）

t s S V 4 0 LT T gマウス（S V 4 0 T B 6 ) と B 6マウス（初代培養 B 6 ) の 2系統を起源とするそれぞれの D Cに、抗原として 1 0 fi gZmLの〇 VA— F I T Cを取り込ませて、 2日後にそれらの成熟度を F AC Sにて解析した。結果を図 9に示す。この結果、 B 6マウス (初代培養 6 ) の D Cの方が強い成熟度を示した。実施例 1 1 (榭状細胞による OVA— T細胞への抗原提示能の比較検討）本発明者らが以前樹立した OVA特異的 CD 4 T細胞を用いて、 t s S V 4 0 L T T gマウス（S V 4 0 T B 6 ) と B 6マウス（初代培養 B 6 ) の 2系統を起源とするそれぞれの D Cの抗原提示能を測定した。提示能として T細胞の I L一 4産生と増殖を測定した。 X線照射した D C ( 5 X 1 0³/well) を 1 X 1 0⁵の O V A特異的 T細胞と様々な濃度の OVA又は OVA— I g G免疫複合体（ I C) 存在下で 9 6穴プレートにて共培養した。免疫複合体は F c γレセプターを介して抗原を取り込ませると、高効率な抗原提示が起きると言われている（J. Immunol. , 161, 6059-6067, 1998、 J. Exp. Med.， 189, 371-380, 1999、 Eur. J. Immunol. , 30, 848-857, 2000、 J. Exp. Med. , 195, F1-F3,' 2002) ことから、比較検討に用いた。なお、 OVA— I g G免疫複合体（ I C) は、卵白アルブミン（O V A ； Sigma 社製）をゥサギ抗 O V A I g G (BioDesign 社製）を重量比 1 : 1 0で混合し、 3 7でで 1時間ィンキュペートして作製した。 2 4時間後、その培養上清を回収し、 T細胞の I L一 4産生量を E L I S Aにて測定した。 T細胞の増殖は、 4 8時間の共培養後、〔³H] — T d Rの取り込みを測定した。結果を図 1 0に示す。この結果、 2系統を起源とするそれぞれの D Cは、共に同じくらいの T細胞の増殖、 I L一 4産生を起こした。ただ、 I L一 4産生において添加した OVAが 1 a gZmLの場合、 OVA— I g G免疫複合体（ I C) を抗原に用いたときに、 t s S V 40 L T T gの D Cによる I L 一 4産生量は B 6マウス（初代培養 B 6) の D Cに比べて少なかった。実施例 1 2 (経時的抗 OVA抗体価）

t s S V 40 LT T gマウス（S V 4 0 T B 6) と B 6マウス（初代培養 B 6) の 2系統を起源とするそれぞれの D Cに、 OVA又は OV A— I g G免疫複合体を負荷して、移入した後の経時的抗 OVA抗体価を調べた。インビポの実験において、 D Cを培養しているゥエルに O V A又は OVA_ I g G免疫複合体を 1 0 β g/mL含む新鮮培地と交換後 2日目に、抗原を取り込んだ成熟 D Cを回収して P B S (―) で洗浄し、レシピエントとなる B 6マウス 1匹あたり D C 1 X 1 0⁶ cellsを尾静脈に移入した。免疫後、眼底より採血し、経時的な抗 OVA抗体価を E L I S Aにより測定した。結果を図 1 1に示す。この結果、 OVA— I g G免疫複合体（ I C) では、 2系統とも I g G l、 I g G 2 a、 I g G 2 bいずれにおいても効果的な抗体産生が見られた。抗原に OVA を用いたとき、 I g G 2 aにおいて t s S V 4 0 L T T gの D Cによる抗体産生が有意な差をもって高かった（ 2週間後）。実施例 1 3 (抗 GL— 7抗体による脾臓組織の免疫組織化学染色）

マウスに D Cを移入し、約 3週後にそのマウスの脾臓を採取し、活性化した胚中心の指標である GL— 7の発現を免疫組織化学染色法にて検鏡した。結果を図 1 2 (参考写真 2 ) に示す。この結果、 B 6マウス及び t s S V 4 0 L T T gマウス共に免疫複合体（ I C) を抗原に用いたとき、その形成が効果的だった。これら 2系統間に差は無かった。実施例 1 4 (生体内 CTL活性）

マウスへの D C移入による生体内の C T L活性を比較検討した。移入 7 日後のマウスの脾臓細胞を採取し、 3 7 °Cの C〇₂インキュベーターにて 3 0分間インキュベートすることで付着性細胞を取り除き、 T細胞リッチな状態にした。この非付着性細胞 1 X 1 0⁷と、 X線照射し増殖を止めた E. G 7 - OVA 1 X 1 0⁶を 24穴プレートにて共培養した。 E. G 7 -0 V A (CRL2113;ATCC) は B 6由来の thymomaである E L一 4に OVAの c DNAをトランスフエク卜したものであり、その M H Cクラス I上には常に O V Aのペプチドがロードされている。培養 5 日目に、 E . G 7 — O VAを N a ₂ ^{5 1} C r 〇 ₄ ( Amer sham Pharmacia Biotech 社製）で 1時間かけてラベルした。様々な濃度の生脾細胞とその^{5 1} C rラベルした E. G 7 - 0 V A 1 X 1 0⁴とを 9 6穴 Uボトムプレートにて共培養し、 4時間後に上清中の⁵¹ C rの放出をオートゥェルガンマシステム（Aloka 社製）にて測定した。結果を図 1 3に示す。この結果、 t s S V 4 0 L T T gの D Cに OVAを添加したときに、 B 6マウス（Primary) の D Cと比較すると、免疫複合体を取り込ませたときと同程度の、かなり強力な CTL活性を誘導した。実施例 1 5 (樹状細胞における MH Cクラス I Z OVAぺプチド複合体の発現）

上記実施例 1 4において、 t s S V 40 L T T gの D Cに OVAを添加したときに、 B 6マウス（初代培養 B 6) の D Cと比較すると、免疫複合体を取り込ませたときと同程度の、かなり強力な C T L活性を誘導した理由として、 D Cの MHCクラス I分子上により多くの抗原由来ぺプチドが提示されているのではないかと考え、 MHCクラス I /OV Aぺプチド複合体に特異的なモノクローナル抗体を用いてフローサイ卜

2 メトリーにより解析した。 5 0 w g/m 1 の OVA存在下で、 t s S V 4 0 L T T gマウス（S V 4 0 T B 6 ) と B 6マウス（初代培養 B 6 ) の 2系統を起源とするそれぞれの D Cを 4 8時間培養した。次いで、抗 F c r RIIZIII抗体で F cレセプ夕一をブロックした後、抗 C D 1 1 c — P E抗体及び抗 MHC I — F I T C抗体、又は抗 CD 1 1 c — P E抗体及び抗 MHC I Z〇 V Aぺプチド抗体を用いて染色した。なお、抗 M HC I / OVAぺプチド抗体染色の場合、 2次抗体（抗マウス I g G 1 _ F I T C抗体）で染色した。染色後、フローサイトメトリ一（B D L S R) で測定し、データは BD CellQuestで解析した。樹状細胞（CD 1 l c陽性細胞）の MHC I又は MHC I /〇 V Aペプチド細胞表面発現量をヒストグラムで示した結果を図 1 4に示す。この結果、 t s S V 4 0 L T T gの D Cの MH Cクラス Iの発現レベルは野生型の B 6マウス（初代培養 B 6) とほぼ同等であつたが、 MHCクラス I ZOVA ペプチド複合体の発現は t s S V 4 0 L T T gの D Cにおいて劇的に高くなつていた。すなわち、 t s S V 4 0 L T T gの D Cは MHC クラス I に効率良く〇 V Aぺプチドを提示することで C T Lに対する効率良い抗原提示ができる細胞であることがわかった。実施例 1 6 (インビポにおける抗腫瘍活性）

t s S V 4 0 L T T gの D Cの生体内における増強された C T L 応答を具体的に評価するために、抗腫瘍実験を行った。 OVA刺激（ 1 0 g /m 1 , 4 8時間）を与えた t s S V 4 0 L T T gマウス（S V 4 0 T Β 6 ) と Β 6マウス（初代培養 Β 6 ) の 2系統を起源とするそれぞれの D C ( 5 X 1 0⁵/マウス）、又は生理食塩水（ 2 0 0 1 ) を、未感作マウス（ 7〜 8匹）の尾静脈より投与し、 7日後に再度 D C又は生理食塩水を投与し、さらに 7 日後に OVAを発現する腫瘍細胞（E. G 7 ) を左大腿部に 1 X 1 0⁵ノマウスで植え付け、腫瘍形成を日を追つて観察し、腫瘍の直径が 5 mm以上のものを腫瘍が形成されたと判定した。結果を図 1 5に示す。図 1 5における腫瘍抑制率は、腫瘍が形成されていないマウスの割合を％で表示したものである。 t s S V 4 0 L T T gの D Cを移入したマウスは野生型の B 6マウスの D Cを移入したマウスよりも腫瘍形成が遅く、効率良く腫瘍形成を抑制した。すなはち、 t s S V 4 0 L T T gの D Cは生体内において野生型 D Cよりも効率良く抗腫瘍活性を誘導する細胞であることが判つた。 (考察）

t s S V 40 L T T gマウスの骨髄細胞から誘導して、 1 0回以上継代し、 7ヶ月以上 3 3 で長期培養を繰り返した D Cは初期培養のそれに比べ、大きさが少々大きく、取り込み能が高いが、インビト口においての坊原提示能では MHCクラス II を介した場合で変わらない機能を持つことが分かった。このことから、インビトロにおける D Cの解析に用いるのに有用な細胞株であると考えられる。また、インビボにおいてワクチンとして用いると、特に MH Cクラス I を介して強力に CTL を誘導した。これは高効率の MHCクラス I を介した提示能は高い抗原の取り込み量に依存するという報告（Annu. Rev. Immunol. , 19, 47-64, 2001) と一致する。このことから、 t s S V 4 0 L T T gの D Cは癌やウィルスなどに対するワクチン効果を生体内で効率よく起こすことができる。

産業上の利用可能性

本発明によれば、安定的に増殖し続ける不死化榭状細胞株を得ることができ、該樹状細胞株を用いて免疫の誘導や修飾、樹状細胞株を用いた治療法の開発など利用することができる。また、本発明によれば、当該細胞株の由来する組織における本来の機能 ·特性を保持しているので、これを用いた樹状細胞に対する有用物質のスクリーニング方法及び免疫応答を増強する物質を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1. 骨髄に由来することを特徴とする不死化樹状細胞株。

2. 細胞表面にミエロイド分子及びロイコサイト分子を発現し、抗原の取込み能、抗原の提示能、及び CTL活性の誘導能を有することを特徴とする請求項 1記載の不死化樹状細胞株。

3. 3 3 °Cで増殖することができるが、 3 7 °Cでは増殖が抑制されることを特徴とする請求項 1又は 2記載の不死化樹状細胞株。

4. L P S刺激に応答能を有することを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載の不死化樹状細胞株。

5. 齧歯類起源であることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載の不死化樹状細胞株。

6. 齧歯類がマウスであることを特徴とする請求項 5記載の不死化樹状細胞株。

7. 不死化樹状細胞株 T D C (F E RM B P— 0 8 5 2 7)。

8. S V 4 0の温度感受性突然変異株 t s A 5 8のラージ T抗原遺伝子を導入したトランスジエニックマウスの骨髄細胞を溶血処理した後、リンパ球及び I a陽性細胞を除去し、得られた細胞を GM— C S Fの存在下培養することにより樹状細胞を誘導し、継代培養を 1 0回以上繰り返し、細胞表面にミエロイド分子及びロイコサイト分子を発現し、抗原の取込み能、抗原の提示能、及び CTL活性の誘導能を有する細胞株を樹立することを特徴とする不死化樹状細胞株の製造方法。

9. 3 3 °Cで増殖することができるが、 3 7 °Cでは増殖が抑制され、 L P S刺激に応答能を有する細胞株を樹立することを特徴とする請求項 8 記載の不死化榭状細胞株の製造方法。

1 0. 被検物質の存在下、請求項 1〜 7のいずれか記載の不死化樹状細胞株を培養し、該細胞株における成熟マーカータンパク質の発現の程度を測定 ·評価することを特徴とする樹状細胞における成熟促進又は抑制物質のスクリーニング方法。

1 1 . マーカータンパク質が、ミエロイド分子、ロイコサイト分子、 I 一 A ^b、 C D 8 6及び Z又は C D 4 0であることを特徴とする請求項 1 0記載の樹状細胞における成熟促進又は抑制物質のスクリーニング方法。 • 1 2 . 被検物質の存在下、請求項 1〜 7のいずれか記載の不死化樹状細胞株を培養し、該細胞の増殖の程度を測定 ·評価することを特徴とする樹状細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリ一二ング方法。 1 3 . 被検物質の存在下、請求項 1〜 7のいずれか記載の不死化樹状細胞株を L P S刺激し、該細胞の I L一 1 2産生量を測定、評価することを特徴とする樹状細胞の活性化促進又は抑制物質のスクリーニング方法。 1 4 . 請求項 1 0又は 1 1記載のスクリ一二ング方法により得られる樹状細胞における成熟促進物質。

1 5 . 請求項 1 2記載のスクリーニング方法により得られる樹状細胞における細胞増殖促進物質。

1 6 . 請求項 1 3記載のスクリーニング方法により得られる樹状細胞の活性化促進物質。

1 7 . 請求項 1〜 7のいずれか記載の不死化樹状細胞株を主成分とすることを特徴とする細胞ワクチン。

1 8 . 不死化樹状細胞株が、 3 3 :で増殖することができるが、 3 7 °C では増殖が抑制される不死化樹状細胞株であることを特徴とする請求項 1 7記載の細胞ワクチン。

1 9 . 不死化樹状細胞株が、抗原又は抗原一 I g G免疫複合体を取り込ませた不死化樹状細胞株であることを特徴とする請求項 1 7又は 1 8記載の細胞ワクチン。

2 0. 抗原が腫瘍抗原であることを特徴とする請求項 1 9記載の細胞ヮクチン。