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CN113564203A - HSV1-tk/GCV诱导型血液系统缺陷小鼠模型的制备方法及应用 - Google Patents

HSV1-tk/GCV诱导型血液系统缺陷小鼠模型的制备方法及应用 Download PDF

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CN113564203A CN202110753676.8A CN202110753676A CN113564203A CN 113564203 A CN113564203 A CN 113564203A CN 202110753676 A CN202110753676 A CN 202110753676A CN 113564203 A CN113564203 A CN 113564203A
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Abstract

本发明提供了一种转导HSV1‑tk自杀基因在血液系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途，本发明转基因小鼠HS21/45vav1‑HSV1‑tkB6/C57模型在同种和异种器官移植中清除受体免疫系统，避免排斥反应中应用价值巨大，已经实现了同种血液系统嵌合体的构建，最终实现异种血液系统的嵌合，为同种或异种造血干细胞向受体B6/C57小鼠移植创造条件，该发明还可以应用在难以进行辐照处理的大动物模型如猪，非人灵长类中，同时本发明在异种器官再造中的免疫耐受方面也具有深远的研究意义。

Description

HSV1-tk/GCV诱导型血液系统缺陷小鼠模型的制备方法及 应用
技术领域
本发明涉及小鼠模型的制备方法及其应用，具体涉及由造血系统特异基因Vav1启动子引导的自杀基因-单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-tk)转基因B6/C57小鼠在血液系统特异性高表达HSV1-tk，通过药物GCV诱导血液系统缺陷的动物模型及其制备方法和应用。
背景技术
血液系统嵌合体是研究同种或异种移植的供体免疫原性与免疫耐受强而可靠的方法。研究证明，通过共移植人胚胎胸腺、肝脏和CD34+干细胞到重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)鼠，可以在NOD/SCID鼠重建有功能的人免疫系统，获得免疫系统人源化小鼠，说明在小鼠体内重建人类免疫系统是切实可行的，当下，人源化小鼠模型已成为人类造血功能、先天性和适应性免疫、自身免疫、传染病、癌症生物学和再生医学等领域的重要模型工具。但是，现阶段的人源化小鼠是基于重症联合免疫缺陷小鼠制备出来的，在研究应用中存在一定的局限性，而且在后期应用过程中存在着饲养条件要求高，生存期短等缺点。目前为止，在正常的B6/C57小鼠体内并未实现人类免疫系统的重建。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种转导HSV1-tk自杀基因在血液系统特异性高表达的小鼠模型及其制备方法和用途，构建转基因的载体是插入由Vav1启动子驱动的HSV1-tk的表达质粒，线性化转基因载体，纯化后通过显微注射技术将带有目的基因的核酸注射入B6/C57小鼠受精卵中，使外源基因整合入小鼠基因组中，检测其对血液系统杀伤、清除的作用效率，以及对后期异种造血干细胞嵌合体形成等功能的影响。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种重组载体表达单元，其特征在于，所述重组载体表达单元包括Vav1启动子，HS2/1、HS4和HS5三个结构域以及自杀基因HSV1-tk。
进一步地，所述重组载体表达单元由依次连接的Vav1启动子-HS2/1、自杀基因HSV1-tk、Vav1启动子-HS4以及Vav1启动子-HS5组成。
更进一步地，所述重组载体表达单元按照如下方法构建：扩增Vav1基因的HS2/1、HS4、HS5结构域以及自杀基因HSV1-tk，按照Vav1启动子-HS2/1、Vav1启动子-HS4以及Vav1启动子-HS5的顺序依次连接，将自杀基因HSV1-tk插入到Vav1启动子-HS2/1和Vav1启动子-HS4之间。
更优选地，所述Vav1启动子-HS2/1、自杀基因HSV1-tk、Vav1启动子-HS4以及Vav1启动子-HS5的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-4所示。
本发明还要求保护包含上述任其一所述重组载体表达单元的载体。
作为本发明的另一技术方案，
本发明还涉及一种转基因动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将权利要求5所述的载体整合到动物基因组。
具体地指，所述构建方法具体包括：提取和纯化上述的载体，行线性化处理，利用受精卵原核注射使目的基因整合到动物基因组，输卵管胚胎移植入代孕鼠中，21天可获得首建鼠，待仔鼠生长到两周龄时，剪去2毫米鼠尾，碱性裂解法提取鼠尾基因组，设计HSV1-tk特异性引物，进行基因型鉴定，出现HSV1-tk目的条带的为阳性首建鼠。
作为本发明的另一技术方案，
本发明还涉及一种制备嵌合动物模型的方法，其特征在于，所述方法包括将所得阳性首建鼠全骨髓移植给经过辐照处理的野生型正常小鼠的步骤。
作为本发明的另一技术方案，
本发明还涉及动物模型在异种器官移植或异种血液系统融合或受体骨髓清除或异种器官再造或免疫耐受机制研究的应用。
本发明还涉及动物模型作为造血和免疫系统细胞功能以及表型研究的模式动物的应用。
作为本发明的另一技术方案，
一种转导HSV1-tk自杀基因在血液系统特异性高表达的小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：
1)载体构建：自pORF-HSV1-tk中，PCR扩增HSV1-tk，引入所需的NotI和SfiI酶切位点：上游引物为5’-GCAGGCCCGATCGGCCATGGCCTCGTACCCCGGC-3’下划线为引入的SfiI酶切位点；下游引物为5’-GCATCAGCGCGGCCGCTCAGTTAGCCTCCCCCAT-3’下划线为引入的NotI酶切位点；反应条件为94℃，5min预变性；以下循环30次：98℃10s，62℃30s，68℃1min；然后72℃5min终延伸；最后4℃保存，扩增片段1130bps，PCR扩增结束后，1％琼脂糖凝胶电泳分离，条件为：电压120V，时间为25分钟；紫外灯下确认条带大小后，用干净刀片切下目的条带，胶回收纯化目的片段DNA，Nanodrop 2000检测回收后的DNA浓度，连接Blunt载体，TrasnT1感受态转化连接产物，涂布在氨苄抗性的平板上，置于37℃恒温培养箱进行培养12-14小时，超净台内挑取单克隆，质粒小提后经SfiI和NotI双酶切验证后，测序正确的克隆进行扩大培养，质粒提取，经SfiI和NotI双酶切后获得HSV1-tk基因片段，胶回收纯化，浓度测定，HS21/45vav1经SfiI和NotI双酶切纯化，浓度测定后与纯化的HSV1-tk进行T4连接，25℃连接1小时后，转化TransT1感受态细胞，培养后挑取单克隆，经SfiI和NotI双酶切验证后得到阳性克隆，即可得到转基因质粒：HS21/45vav1-HSV1-tk；
2)转基因载体的线性化与纯化：将构建的HS21/45vav1-HSV1-tk质粒经HindIII单酶切后，去除载体中原核表达部分，完成线性化，80V电压分离酶切后的质粒，切胶，QIAGENEDNA纯化Kit回收目的片段，得到纯化的转基因载体HS21/45vav1-HSV1-tk；
3)小鼠模型的制备：把转基因载体HS21/45vav1-HSV1-tk注射入C57小鼠受精卵的雄原核内，植入假孕小鼠子宫内，手术后19-21天分娩，待仔鼠3周后，剪脚趾、编号、剪尾巴，提取各个小鼠基因组DNA，使用PCR技术检测目的基因HSV1-tk的整合情况，进而得到转导HS21/45vav1-HSV1-tk的首建鼠；
4)建立HS21/45vav1-HSV1-tk转基因鼠系：将整合外源目的基因的首建鼠与6-8周龄的野生型正常C57雄性小鼠交配、传代，提取子代鼠尾基因组DNA，PCR鉴定携带HS21/45vav1-HSV1-tk的阳性仔鼠。
5)GCV最大安全给药剂量探索：将野生型正常B6/C57，周龄为6-8周的雌雄各50只小鼠随机分成PBS组、GCV处理组：20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg五个组，处理时长为2周，期间每隔三天测量一次体重，观察小鼠状态，记录死亡小鼠情况，2周后处死小鼠，检测各组小鼠外周血及骨髓细胞存活情况，称量各组小鼠重要脏器重量变化，并对各组小鼠的各个组织进行组织学观察；综合各个指标，可知，在GCV处理浓度为160mg/kg时，小鼠出现了较为明显的毒性反应，因此后期体内实验GCV处理浓度将设计在80mg/kg-100mg/kg之间。
6)同种异体血液系统嵌合体的获得：将阳性F1代HS21/45vav1-HSV1-tk-C57(CD45.2)小鼠全骨髓移植给经过清髓辐照的野生型正常B6/C57(CD45.1/2)体内，4周以后，流式分析外周血中血液各个谱系细胞分布情况可知HS21/45vav1-HSV1-tk阳性细胞(CD45.2)已经成功替代原有细胞(CD45.1/2),GCV处理小鼠2周以后，用野生型正常B6/C57(CD45.1)小鼠骨髓细胞进行嵌合替换，期间持续GCV处理4周，与此同时，串行移植一次，时间间隔为一周，GCV处理4周以后，停止处理4周后，处死小鼠，流式检测各组小鼠外周血，以及骨髓中嵌合替换细胞所占比例，其中，PBS处理组为对照组，GCV为实验组，每周进行一次流式检测外周血，综合长期观察结果，可知嵌合替换移植前后GCV以80mg/kg剂量处理小鼠各4周能够很好的达到清除受体骨髓细胞，实现同种异体造血嵌合。
本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下：
本发明转基因小鼠HS21/45vav1-HSV1-tkB6/C57模型在同种和异种器官移植中清除受体免疫系统，避免排斥反应中应用价值巨大。在本发明中，我们利用HSV1-tk/GCV诱导型杀伤系统结合血液系统特异性表达基因启动子，得到一种转导自杀基因-单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-tk)在血液系统特异性高表达的小鼠模型，利用非辐射的，安全且特异性的药物诱导杀伤受体B6/C57小鼠血液系统，杀伤并阻断其产生新的T细胞，同时达到受体造血干细胞清除的作用，实现供体造血干细胞进入受体骨髓的生理条件，从而去除免疫屏障及生理屏障，为同种或异种造血干细胞向受体B6/C57小鼠移植创造条件，且已经实现了同种血液系统嵌合体的构建，最终实现异种血液系统的嵌合。并且该发明在难以进行辐照处理的大动物模型中的应用以及异种器官再造中的免疫耐受的研究意义深远，例如猪，非人灵长类，等。
附图说明
图1为HS21/45vav1-HSV1-tk构建设计图。
图2为Vav1各个功能域PCR结果以及骨架载体酶切电泳分析结果(核酸分子量标准：DL15000Marker)。
图3为HSV1-tk片段PCR获得后电泳图(核酸分子量标准：DL15000Marker)。
图4为HS21/45vav1-HSV1-tk转基因载体HindIII单酶切线性化后电泳图(核酸分子量标准：DL15000Marker)。
图5为PCR鉴定得到了一只阳性首建鼠，基因型鉴定电泳图(核酸分子量标准：DL15000Marker，1、2、3、4、5、6为仔鼠编号，Positive为稀释后的转基因质粒)。
图6为体外培养HS21/45vav1-HSV1-tk阳性仔鼠PBMC，GCV处理后，CCK8显色法验证杀伤系统体外有效性。
图7为体外培养HS21/45vav1-HSV1-tk阳性仔鼠PBMC，GCV处理后，流式分析CD3+细胞存活率(NO.16、NO.W为HS21/45vav1-HSV1-tk阳性仔鼠PBMC，WT为野生型正常C57小鼠PBMC。)。
图8为体外培养HS21/45vav1-HSV1-tk阳性仔鼠PBMC，GCV处理后，凋亡相关蛋白cleaved-caspas3蛋白表达水平检测及其灰度分析结果(WT-0、WT-20为野生型正常C57小鼠PBMC，W-0、W-20、W-40、W-80为HS21/45vav1-HSV1-tk阳性仔鼠PBMC。)。
图9为体内验证HS21/45vav1-HSV1-tk阳性仔鼠中杀伤系统的有效性实验设计图。
图10为体内验证HS21/45vav1-HSV1-tk阳性仔鼠中杀伤系统的有效性实验中GCV80mg/kg处理组和溶剂处理对照组DNA的PCR验证HS21/45vav1-HSV1-tk是否存在，电泳图(核酸分子量标准：DL15000Marker，PC为稀释后的转基因质粒。)。
图11为GCV最大安全给药剂量探索实验中各组小鼠体重监测结果，横坐标为时间点，纵坐标为体重，各个颜色指示不同组别小鼠体重变化情况。
图12为GCV最大安全给药剂量探索实验中处理两周后各组小鼠各个脏器重量统计结果，横坐标为组织类别，纵坐标为重量，在每个组织类别中的柱状图，从左至右依次指示的是小鼠给药剂量为：PBS，20mg/kg，40mg/kg，80mg/kg，160mg/kg。
图13为GCV最大安全给药剂量探索实验中流式分析外周血和骨髓中白细胞存活率相关的代表性流式分析图，从上到下依次为：第一列为CD45单染样本，第二列为CD45抗体的同型对照染色组，第三列为H2O2处理后的阳性对照染色组，最后一列为具有代表性的样品组。
图14为GCV最大安全给药剂量探索实验中流式分析外周血和骨髓中白细胞存活率相关的流式分析结果统计图，横坐标为时间点，纵坐标为相对于对照组的实验组的小鼠白细胞存活率，在每个时间点下的柱状图，从左至右依次指示的是小鼠给药剂量为：PBS，20mg/kg，40mg/kg，80mg/kg，160mg/kg。
图15为同种异体血液系统嵌合体的获得实验中嵌合替换移植后流式分析策略图，流式分析中主要分析CD45.1和CD45.2阳性细胞所占比例，以及T细胞，B细胞和髓系细胞占CD45.1和CD45.2中的比例。
图16为同种异体血液系统嵌合体的获得实验中嵌合替换移植后流式分析监测7次后的CD45.1，CD45.2中各个谱系的绝对数目的变化统计图，80-M-110，80-M-111，40-M-113是有代表性的三只实验组小鼠，纵坐标为各个谱系细胞种类，横坐标代表绝对细胞数值。
图17为同种异体血液系统嵌合体的获得实验中嵌合替换移植后停止GCV处理4周后，处死小鼠，检测骨髓细胞中造血干细胞中CD45.1阳性细胞的比例代表性流式分析图。
图18为同种异体血液系统嵌合体的获得实验中嵌合替换移植后停止GCV处理4周后，处死小鼠，检测骨髓细胞中造血干细胞中CD45.1阳性细胞的比例结果统计图。
具体实施方式
本研究中，我们采用了CRISPR/Cas9基因编辑技术结合HSV1-tk/GCV系统构建血液系统特异性表达载体，进而构建更昔洛韦(GCV)诱导的血液系统缺失的小鼠模型，即Vav1启动子引导的HSV1-tk表达载体(vav1 promoter-HSV1-tk)，首先以B6/C57小鼠为受体获得HS21/45vav1-HSV1-tk转基因小鼠模型，利用自杀系统清除受体原有血液系统，避免了后期异种器官移植中的宿主抗移植物反应。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
通过对Vav1基因结构分析可知其功能域HS2/1、HS4、HS5决定了该基因的血液系统特异性表达，于是进行载体结构设计如图1：将自杀基因HSV1-tk插入到HS2/1和功能域HS4，HS5之间，最终达到血液系统特异性表达自杀基因HSV1-tk的目的。
实施例1根据Vav1基因在造血系统中特异性相关的结构域找出来发现为HS2/1，HS4，HS5，将目的基因HSV1-tk与造血系统特异性表达的Vav1基因启动子区域进行结构设计，如图1。
实施例2骨架载体HS2/1、4、5以及vav1各片段PCR以及SfiI和NotI双酶切线性化产物电泳结果如图2，具体实施方式为：应用高保真KOD-Plus-Neo DNA多聚酶，以小鼠基因组为模板进行PCR扩增得到各功能域，T4连接，TransT1感受态转化，鉴定阳性克隆后对其进行质粒提取，SfiI和NotI 37℃双酶切线性化后1％琼脂糖凝胶在120V电压条件下电泳分离25分钟，然后进行DNA凝胶回收，测定核酸浓度后-20℃保存备用。
实施例3自杀基因HSV1-tk的扩增选择高保真KOD-Plus-Neo DNA多聚酶，自pORF-HSV1tk中PCR扩增HSV1-tk基因，引入所需的NotI和SfiI限制性酶切位点，上游引物和下游引物分别为5’-GCAGGCCCGATCGGCCATGGCCTCGTACCCCGGC-3’(下划线为引入的SfiI酶切位点)和5’-GCATCAGCGCGGCCGCTCAGTTAGCCTCCCCCAT-3’(下划线为引入的NotI酶切位点)，反应条件为94℃，5min预变性；以下循环30次：98℃10s，62℃30s，68℃1min；然后72℃5min终延伸；最后4℃保存，扩增片段1130bps，PCR扩增结束后，1％琼脂糖凝胶电泳分离，条件为：电压120V，时间为25分钟；紫外灯下确认条带大小如图3，用干净刀片切下目的条带，胶回收纯化目的片段DNA，Nanodrop 2000检测回收后的DNA浓度，连接Blunt载体，TrasnT1感受态转化连接产物，涂布在氨苄抗性的平板上，置于37℃恒温培养箱进行培养12-14小时，超净台内挑取单克隆，质粒小提后经SfiI和NotI双酶切验证后，测序正确的克隆进行扩大培养，质粒提取，经SfiI和NotI双酶切后获得HSV1-tk基因片段，胶回收纯化，浓度测定，HS21/45vav1经SfiI和NotI双酶切纯化(图2)，浓度测定后与纯化的HSV1-tk进行T4连接，25℃连接1小时后，转化TransT1感受态细胞，培养后挑取单克隆，经SfiI和NotI双酶切验证后得到阳性克隆，测序结果正确无误，即可得到转基因质粒：HS21/45vav1-HSV1-tk。
实施例4将以上获得的转基因质粒：HS21/45vav1-HSV1-tk纯化后进行线性化，将此质粒经HindIII酶切后移除载体中原核表达载体部分，80V电压分离酶切后的质粒，切胶，QIAGENE DNA纯化Kit回收目的片段，得到纯化的可供显微注射的线性化转基因载体HS21/45vav1-HSV1-tk。
实施例5转基因HS21/45vav1-HSV1-tk小鼠模型的建立以及表型鉴定：纯化的可供显微注射的线性化转基因载体HS21/45vav1-HSV1-tk得到以后，可以利用显微注射法使其整合进入B6/C57小鼠细胞基因组，精心饲养代孕母鼠，19-21天产仔，待仔鼠3周后，剪脚趾、编号，组织裂解液500ul，蛋白酶K 8ul，55℃过夜酶切，涡旋混匀后加入200ul 5M Nacl，混匀后添加三氯甲烷200ul，混匀后12000rpm离心5分钟，小心吸取上清到干净1.5EP管中，然后在上清管加入2倍体积95％的乙醇，混匀可看见白色絮状物即为基因组DNA，12000rpm离心5分钟，小心弃去上清，75％酒精1ml洗涤沉淀两次，12000rpm离心5分钟，弃上清，室温风干10-20分钟，50ul的ddH2O溶解沉淀，完成小鼠基因组DNA提取，用提取的各个小鼠基因组DNA，设计HSV1-tk特异性引物：HS2,1-TK-F:GAAGCCGTGAGGGCGTAACT，TK-HS2,1-R：TGTTCGCGATTGTCTCGGAA使用PCR技术检测目的基因HSV1-tk的整合情况，如图5可知目的条带为750bps，得到了转导HS21/45vav1-HSV1-tk的首建鼠。
实施例6体外杀伤系统有效性验证：GCV梯度处理后增殖情况CCK8显色；取雌性野生型B6/C57和Vav1-HSV1-tk-TG各一只，无菌条件下取其脾脏，研磨使成单细胞，过滤后添加适量红细胞裂解液室温裂解10分钟，1640培养基添加anti-CD3：4ug/ml，IL-2:20ng/ml，anti-CD28:2ug/ml，重悬，20000个细胞/孔，接种到96孔板中，37℃，5％CO2条件下进行培养，第3天进行GCV浓度梯度处理，结果表明：如图6，将模型小鼠脾脏细胞体外培养，GCV处理后的CCK8显色可见随着GCV处理浓度增加，颜色逐渐变弱，说明随着GCV处理浓度增加，活细胞数目逐渐减少，与OD630nm-OD450nm统计结果相一致。
实施例7浓度梯度处理GCV后检测CD3+细胞存活情况，将不同浓度GCV处理后的细胞收集到15ml离心管中，400g离心5分钟，PBS洗涤一次，转移到干净的1.5EP管中，50ul的staining buffer重悬细胞，1ul的Fc进行封闭，室温放置10分钟，避光添加抗体CD45，体积1ul，CD3抗体，体积5ul，混匀后4℃避光染色30分钟，同时设置分别单色染色CD45、CD34细胞管，每15分钟晃动一次，染色结束后，1mlPBS进行洗涤，400g离心5分钟，期间配制死活染色液，本方案中采用Annexin V-PI双染方法检测细胞存活率，将4Xbuffer用ddH2O稀释成1X，以每个反应300ul体积配制染色液，添加PI染料10ul/反应，Annexin V染料5ul/反应，室温避光染色15分钟，同时设置分别单色染色PI、Annexin V细胞管和不染色的空白细胞管，1小时内流式上机检测，由检测结果统计图7可知：随着GCV处理浓度的增大，CD3+细胞存活率逐渐下降，说明HSV1-tk/GCV系统杀伤作用有效，但是80uM同时导致WT小鼠CD3+细胞存活率明显下降，说明80uM浓度有较强的细胞毒作用。
实施例8GCV浓度梯度处理后流式检测，凋亡相关蛋白检测统计结果，收取不同浓度GCV处理的单个核细胞，冰上放置，RIPA添加蛋白酶抑制剂PMSF后100ul对收取细胞进行裂解，冰上裂解30分钟，12000rpm，4℃离心15分钟，小心收取上清到干净的1.5EP管中，做好标记，BCA法进行蛋白定量，计算样品浓度，以20ug进行制样，5XLoding稀释添加后，补加RIPA，最后加入20ug蛋白样品，离心使于管底，100℃煮样10分钟，将煮好的样品至于-20℃放置备用；12％SDS-PAGE胶制备，小心点入蛋白样，并记好加样顺序，80V电泳浓缩胶30分钟，120V电泳分离胶1-1.5小时，湿转法转膜，230mA转膜70分钟，5％脱脂牛奶溶解在TBST中，室温封闭1小时，然后TBST冲洗一次，一抗4℃孵育过夜，第二天TBST洗膜3次，每次10分钟，二抗室温孵育1小时，然后TBST洗膜3次，每次10分钟，ECL发光显色。由Western blot以及灰度分析结果图8可知：Vav1-HSV1-tk小鼠单个核细胞体外经过GCV梯度处理后，活化型caspas3蛋白水平升高，且呈GCV浓度依赖性，进一步说明该杀伤系统的有效性，与4.2.中流式分析结果相一致的是，80uM处理组并没有呈现线性增加，说明该浓度GCV下，对细胞毒性过大。
实施例9阳性转基因小鼠F1体内杀伤系统有效性验证，以F1代小鼠为实验小鼠，分成两组，每组3只小鼠，实验组腹腔注射GCV80mg/kg，对照组给予200ul/只/天ddH2O，为期一周，流式分析外周血各谱系比例变化，实验设计见图9。
实施例10小鼠F1体内杀伤系统有效性验证，GCV给药一周后，外周血基因组PCR鉴定HSV1-tk基因有无。PCR检测HSV1-tk有无的琼脂糖凝胶结果图10可知：与对照组相比，GCV处理组，未检测到HSV1-tk基因的存在，该转基因小鼠在给予GCV处理后能够有效清除自身血液系统。
实施例11GCV最大安全给药剂量探索实验，将正常野生型B6/C57雌雄小鼠各50只，以每组10只随机分为雄性5组，雌性5组，给药剂量分别为：PBS，20mg/kg，40mg/kg，80mg/kg，160mg/kg，每天进行腹腔注射，每三天测量一次各组小鼠体重，其中各组小鼠体重监测结果图11统计可知：随着GCV给药剂量的加大，在GCV处理剂量为160mg/kg时小鼠体重出现了明显下降，说明该剂量下，对小鼠产生了明显的毒副作用。
实施例12为GCV最大安全给药剂量探索实验中处理两周后，处死小鼠，小心取出小鼠各个脏器，称重，固定，重量统计结果图12可知：与体重统计结果相一致的是，大剂量的GCV-160mg/kg时，小鼠各个脏器重量明显减轻，说明该剂量GCV处理条件下，小鼠出现了明显的毒性反应。
实施例13图13为GCV最大安全给药剂量探索实验中流式分析外周血和骨髓中白细胞存活率相关的代表性流式分析图，从上到下依次为：第一列为CD45单染样本，第二列为CD45抗体的同型对照染色组，第三列为H2O2处理后的凋亡染色阳性对照组，最后一列为具有代表性的全染样品组。
实施例14为GCV最大安全给药剂量探索实验中每隔三天流式分析外周血和骨髓中白细胞存活率相关的流式分析结果统计图，流式分析策略如图13，横坐标为时间点，纵坐标为相对于对照组的实验组的小鼠白细胞存活率，由图14的血液细胞存活率统计可知在0-160mg/kg的GCV的浓度范围内，小鼠的血液系统细胞存活率没有明显差异。
实施例15图15为同种异体血液系统嵌合体的获得实验中嵌合替换移植后流式分析策略图，将阳性F1代HS21/45vav1-HSV1-tk-C57(CD45.2)小鼠全骨髓移植给经过清髓辐照的野生型正常B6/C57(CD45.1/2)体内，4周以后，流式分析外周血中血液各个谱系细胞分布情况可知HS21/45vav1-HSV1-tk阳性细胞(CD45.2)已经成功替代原有细胞(CD45.1/2)，GCV处理小鼠2周以后，用野生型正常B6/C57(CD45.1)小鼠骨髓细胞进行嵌合替换，期间持续GCV处理4周，与此同时，串行移植一次，时间间隔为一周，GCV处理4周以后，停止处理4周后，处死小鼠，流式检测各组小鼠外周血，以及骨髓中嵌合替换细胞所占比例，其中，PBS处理组为对照组，GCV为实验组，每周进行一次流式检测外周血，综合长期观察结果，可知嵌合替换移植前后GCV以80mg/kg剂量处理小鼠各4周能够很好的达到清除受体骨髓细胞，实现同种异体造血嵌合。流式分析中主要分析CD45.1和CD45.2阳性细胞所占比例，以及T细胞，B细胞和髓系细胞占CD45.1和CD45.2中的比例。
实施例16为同种异体血液系统嵌合体的获得实验中嵌合替换移植后流式分析监测7次后的CD45.1，CD45.2中各个谱系的绝对数目的变化统计图，80-M-110，80-M-111，40-M-113是有代表性的三只实验组小鼠，纵坐标为各个谱系细胞种类，横坐标代表绝对细胞数值。由统计结果图16可知：连续7天统计结果可知随着GCV处理时间的延长，外周血中各个谱系细胞中CD45.1阳性比例整体上呈现出逐渐上升的趋势。
实施例17为同种异体血液系统嵌合体的获得实验中嵌合替换移植后停止GCV处理4周后，处死小鼠，检测骨髓细胞中造血干细胞中CD45.1阳性细胞的比例代表性流式分析图。此分析中主要分析活细胞中Lin-sca1+c-kit+细胞群体中CD45.1阳性细胞的比例变化。
实施例18为同种异体血液系统嵌合体的获得实验中嵌合替换移植后停止GCV处理4周后，处死小鼠，取小鼠股骨，PBS冲洗出全骨髓，FC室温封闭10分钟，抗体染色，避光25分钟，PBS洗一次，上机流式检测，检测骨髓细胞中Lin-sca1+c-kit+(LSK)细胞群中CD45.1阳性细胞的比例。由统计结果可知：代表性的三只嵌合小鼠的LSK+CD45.1+比例占到绝大部分，整体水平上看CD45.1+细胞的比例也达到了将近80％的比例。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，或在实施案例之外的树种实施本方法，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改，改进或范围的扩大，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国科学院动物研究所
<120> HSV1-tk/GCV诱导型血液系统缺陷小鼠模型的制备方法及应用
<130> 1
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2466
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaattcgaa tctagaaacc tagtgggcgc tctccagctt gcctctcgtt tttgttttgt 60
tttcactgcc tggccttcct accctaactg cgtgcaaaga aaacaaattg ttacccggtt 120
tagagaagag ggagaggacg cgtaggaagt cacagacgcc aaaaataggg gatagaaatt 180
gtcctcgcct gtaaggttgc aaaacgggag ggttttcagg ttgtgcccac ccctacccat 240
atcctcagtg cgtaaatgag actcaagctg gtccagcgaa gccgtttagc gccgcctaga 300
ggccataagg ataaaaggtg gggtgctaag gaagcggctt ggaatctggt gggttagtca 360
gggagaggct tgcttgccaa ggtaatttta gttcctgaga agctatggtc aggaaagcag 420
tacatatttg ttagacaaat caactaataa atgacaggga agggcactgg tgaccttgac 480
tcggacgaga actcacagca gggaaggtgg gcttatagta tgataattaa gggtggagga 540
gggctgtggc ttaaaattta ggaagactta agggaaaaaa aatgacattt gggggctggg 600
gagatggttc agtcaaatgc ttgctactca aatgagagga caagagttca aatccctagg 660
gcacaattaa agcaggagga ggtagtctgt gctctttaat ctcagtgctc ctaagacgag 720
atgggggcag agacaattct ggaagttcag ctagccagga gcagctagcc caggagtaag 780
agagactcta tgttaagtta agtgtgtgga agagagggtc tacactgagg ctgtcctgcc 840
acctcaacac acactccata gtgttctctc tctctctctc tctctctctc cttctttctc 900
tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctttctcac acacacacat 960
acaagtttta aagaaaaaag gaaaagtggg tggtgagggt gagagggctc tgtgggcaaa 1020
ggtgattgct accaagccta atgatctgag ctcaatcgtt ggggcttgca tggtggaaag 1080
aggacctact cccttgggct ggtgagatgg ctcagtgggt tagagcacct gactgctctt 1140
ccgaaggtcc agagttcaaa tcccagcaac cacatggtgg ctcacaacca tccgtaacaa 1200
gatctgaccc cctcttctga agtgtctgaa gacagctaca atgtacttac atataataaa 1260
taaataaata aataaatctt taaaaaaaaa aaaaagagga cctactcccc catgttaacc 1320
tttgacctcc acacatgtac tgtgccccac atgtaccttc acacatacac acatacatat 1380
gtatatatat acacacacac acatatatat atgtaataaa agtgaaatgg ctttcaaagt 1440
agaatatatt ttctaatgtt tattatagtt ctatttgttg gcagtttcct acatgttaac 1500
aacctatctt cgtcctaccc accctcaact cccctctgac tccgaatgag agtggactct 1560
ctttacctta tccccacttt cttgctcttt tgtaaccctt tgcatccatt actgctgcct 1620
gtgggcatgt tggctccctc ctggcttcgt cttgtgctgt caccataact gcacggagtt 1680
catgagcgta gtggccatgg gtatgccctg gagatagcat ttcacatccc ccgcccccga 1740
ctcttaccga ctttctgttc cttctccctt gagcctcggg ccggtggtgg tatagatgtc 1800
ccatctatgg ctgagcactc agtaatcaaa aagtaacatg taagaagtga tggagtgaat 1860
tagtgtcttc tgtcaggtgg tgggcacaag tgcaaaggcc ctggggcagg atggaggtca 1920
gggagtgaag aacagagaga ggagaagagg ctggcagggg ttggggcagg gtgaacaggg 1980
ccttgtgggg tgcaggaaag acatgagttt tggccccaaa gcaaggttga accaggaggg 2040
ttatgggtgg tggaagaatg gttgagactt gactcagtgt tcagtggtcc cttttggctg 2100
ctgcaggggc aaaaggctgt gagagatcag ggccgtagac tggggaccag gaggagacag 2160
gaggtgacag cctaggtgcc tacggctgga tgagatagtg gcaccttagt tcagcaggtg 2220
cccaggtctg ctcagtgtag gtggagaaag acgaggtcac accagtgagt ggaagccgtg 2280
agggcgtaac tgcagatgct gctccccctc cgccccacag ctcctcccca cccccacccc 2340
ggggcgacag ttacagtcac agaagaggaa gtggtgttgt agttgtcccc actggggcag 2400
gcggcggcgg tggtgaagga acgagggtgc acggggcctc cccgaggggc caagtgagag 2460
gccggc 2466
<210> 2
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcctcgt accccggcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60
ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120
cgcccggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc ccacgggatg 180
gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240
gtacccgagc cgatgactta ctggcgggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300
tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360
atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420
cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480
ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcggta ccttatgggc 540
agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600
accaacatcg tgcttggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660
cagcgccccg gcgagcggct ggacctggct atgctggctg cgattcgccg cgtttacggg 720
ctacttgcca atacggtgcg gtatctgcag tgcggcgggt cgtggcggga ggactgggga 780
cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840
cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900
aacggcgacc tgtataacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960
tccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020
ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca cccccggctc cataccgacg 1080
atatgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaactg a 1131
<210> 3
<211> 796
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttaacttgc ggccccagat gtcccaggtg agtctgctgg gtgatgctag ggcccgactg 60
gataaaggct ggtaggcccg gctctggcta tggagaggtg tcgagcagaa cggagctctg 120
ggtgggtttg tacactcttg gttggcttgc agctgtccca gcaaatttag ggggaaatct 180
ccctatcccg ccccgccccc agctgactct gttgagatcc atttaaaggg gtcctaagag 240
gtatcttgtt gcctcgtagt tagccaagag ggtgcatgag gttggagaac cagattcaag 300
agagagaggc cttcagtttc tcccccaccg gtggctcctc ctctaccacc tcttctgccc 360
ccctcctcct cacatcttcc ttcacctcca tttcctgcca gggctttgtg ctgtgtggcg 420
tggagtgttg ggggctgcaa tgcgagaccc tgtggcatcc caactctacc tatttcggga 480
agggcccatt gaagtgcagg gcccaggcct agggtcctaa caaggccctg ggtgtccctg 540
agtttgacat ctgtgcactc tccgtgtttc aagtggaggc atggtcagac tatgccccgg 600
tgagcctaga aaatgtattc aaatccttat ttgaatgtgg ctggggtggt ggtgaaaggt 660
gactggtggc tttgtactct tttctctgct tccccaggga tgctgggttt cggggggagg 720
gctgatagcc ctagaaatga aaggtatagg ttcaagtcaa agggatcgag atctagatat 780
cgatgaattc gagctc 796
<210> 4
<211> 3859
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtacctgcc gtcatgtatc cacacacagc ccttcactgg tggattctag gcagggctcc 60
acctctgacc tcgtccccag tccctcacta gtgaatctag ggtaggggct ccactcagag 120
tcacatccca gcccttagag atttttatat tttgagtgga gctgattgtc aggagtctag 180
gttgcacagc tttgtgtgtg tcactgtaga tgttcggaga ctcttggttg ttttttgttt 240
tttcaagaca gggtttctct gtgtagccct ggctgtcctg gaactcactc tgtagaccag 300
gctggccttg aacccagaaa tctgcctgcc tctgcctccc aagtgctggg attaaaggcg 360
tgcgccatca cgcccagctt agagactctt ttttttaaag tggaagcacc tgtaccttgg 420
aaggtcaccc cgtccagcct tctcccatac actgtccatt accgctctga cttgctgtgg 480
ctgccagctg agccccactt tcccctgcac taccccacag ctgtccagtt gtctgtcctt 540
gttactgtgt acctcagctg tctgtacttc ctatcacaca ctccagttgc tgttaccaat 600
tgatacccag attgctttgt gctggaagcc cctcctgttt atctacccca cctctccagg 660
ttataagcac tggggcatca gggtcatgtt ttcctcaccc actactgggt ctcagggctg 720
ggtaaacagt aaatgcttaa tatatgcttt tggagtcaac taatgtctgg gtttttggtc 780
aggctttgtg ttagtgctca gttctaaagt ggagaggttg attctccttc tctctgttct 840
tctggctttc gccttctctc cctctctcct tctttccttt tctcctcttt ctctgttctt 900
cttccaaccc ctccacattt gtccctctcc ttcccttcct attccctcat cttttatcgt 960
atgaataaca ttttgtctcc tgggggagat gtgaacacgt gtctactcgt ctcagacagg 1020
gccaacagcc aggaaaagca aggatcccgc caaagtccaa cttgatgaag cactgagtgt 1080
cactgtgtta cagataggaa tgtgggtcag ggctcactta acaggaacag aaatggctca 1140
aatacagctg tatcaccaaa gcctggcatg gatggtgggc gactcaggaa agctgccttc 1200
aggcagctct gaaaggtgga cagttgtctc ttctaggtgc cttgtcctgt ctgaacctct 1260
tctgggcagt tcagcttgtc ttgagagcgg tcaccagtag tccttacagc ttgtgcttgg 1320
ggagggcagt gcctagagaa tctggtctgt ttcaggaact tcctgcatat ctcctgttgt 1380
ttcctgagct tcacgggctt ttctgtaggc tagaatgctt cacctccact tagcacatcc 1440
tatgtcttaa tgagcttcct tccaaggtgg aaggtttcgt cttaagggaa attgctacac 1500
agcaccctct ttccccctcc ctctgccttc tctcccttcc actatcttct cccctcaccc 1560
ctgtttccca cccctgtttt tgacacaggg tctcactgtg gttccctgga caacctggaa 1620
ctcactctgt agtccatgct taccccagag tttagccatc ctttgctctg cctcctcttc 1680
ctgagcgcgg agattacagg tatattccac cacactggga tttcatttct gatttttggt 1740
tggagaaccc aaggcaggat gacctgtcca aggtccccct gcttaccagt ttcagctggg 1800
agtcaccaga cacctagttg tggaaggcgt actggggtgt gaggtgacag ggaaagaaga 1860
ggaagtctga ttcccagaat gctttagact catgctgaag agttgggtca tcagctcctc 1920
aattcaaagc tctggacagg gtgagcagcg tgaccacccg ctctgggaag cctcagggag 1980
ctagctggag tctgaaagat tacagggctg aaggaaggca gagagccatg cctctacccc 2040
ttgtctatct tccccagcca ggcctggtaa caggcatttc ctgtttccgg ccatctcctg 2100
ggtttgggtt gtgggtgtgg aaagcgcaga aggcagaatt tgtgttgagt ctgggccgct 2160
ttctcccagc ccccaagaga ggccactgtc cttactgcta cttccttgaa cagaattctc 2220
tctattttgg gcagaggcac caaaagccaa cttccggctt gatcacagtg cctggctcct 2280
gatttgccta aagccttctt gcttgtctag cgccatggtc ttctttcgtc ccggaggata 2340
agggaagcag aggggttgtc cctataaaac aaggaagaat tctccttcca cgtgcctcct 2400
acagtgagtg gcttcctgtc cttcatcatc ttttcacatg ccttacggtg ccaggaagtt 2460
cttctggtgg tctaaccaca gtcaccgtgc tttctgaagg agcccagctc tctaactagc 2520
tactctgaag cggtggaagg ggttatgaat catactcctt ttggaagagt catgtgactt 2580
gagggaaggc agtctcaaag ctcagctgat tctctgaggt taggaggggg atttccttcc 2640
ttaggccaca cagacctaag gccagacatc acctctggtg ttggtctgcc agccctgtct 2700
gcctgtctat ggcccacagg acttctgagt gctgtatata atggtgtata taatttctgt 2760
gatatgctgg tccctgttat gtccccgtga ggcctgggcg agggggctgt ggtggctcaa 2820
tgtggttcag gagctagggt agagcaggag tggggctggg ttctgtgtgt ttctccacac 2880
tcctgctttt acatgtgtga ctctggcagg tgacagccct gtgacaagcc tcagttttcc 2940
cacctgtcag atagaagtcc tttgtttagc catttcgtct ttcacttgtg cgtgtgtgta 3000
tttgtatgca tttgtgcatg tttattatta ctattatatt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 3060
gtgtatgggt gcagatgcct gaggaggcca gaagagggca ttggatcctc ctgagttgga 3120
ctcacaagtg tgtgtgatat gggatggaaa ccaaacttga ctcctctgtg agatggacag 3180
tgccagcacc cctgaacatt ctcgtgggtt taagcattga acccagggcc ttgctttagc 3240
aattgagttg cctctcagac ctccttcaat aacttagaaa ttagagcata tttttttttt 3300
ggcagtttgg tctgtgtaca tatgtatttt gatcatggcc gctctactcc cttgtctttt 3360
ttgtgttgtt gttgttgttg tttttttttt tttgtgtgac ccagtgagtt gaattagagt 3420
ttgtgacagg agtcagggtg aggggtcatg taccagtggc tgcaacactg aagaaaatgc 3480
ctctcccttc cctggaagct gttagctgcc tacaaatccc cagggaggag tgggtcctca 3540
tttgactccc cactccttca acacaacaac ttctcttgag ctccacccca gccccaggtc 3600
tttaaatagt tgtccacatg gaagagcgag cccttgagtg acctgtggcc ttaggtaatg 3660
gtggagtgtc atgtagggtt gatgactgtc acaagtggac cagttgtctg tggggagttg 3720
atggtgctga ggctgtatac atggagacag agctccattt ggctgacaat ccaagatagc 3780
tgaaaaaaaa tagtttaaat ctggggctgt gcctcaatgg gaagaacatg tgtccagtgt 3840
gcacagagtc ctgggtacc 3859

Claims (10)

1.一种重组载体表达单元，其特征在于，所述重组载体表达单元包括Vav1启动子，HS2/1、HS4和HS5三个结构域以及自杀基因HSV1-tk。
2.根据权利要求1所述的重组载体表达单元体，其特征在于，所述重组载体表达单元由依次连接的Vav1启动子-HS2/1、自杀基因HSV1-tk、Vav1启动子-HS4以及Vav1启动子-HS5组成。
3.根据权利要求1或2所述的重组载体表达单元体，其特征在于，所述重组载体表达单元按照如下方法构建：扩增Vav1基因的HS2/1、HS4、HS5结构域以及自杀基因HSV1-tk，按照Vav1启动子-HS2/1、Vav1启动子-HS4以及Vav1启动子-HS5的顺序依次连接，将自杀基因HSV1-tk插入到Vav1启动子-HS2/1和Vav1启动子-HS4之间。
4.根据权利要求1-3任其一所述的重组载体表达单元，其特征在于，所述Vav1启动子-HS2/1、自杀基因HSV1-tk、Vav1启动子-HS4以及Vav1启动子-HS5的核苷酸序列分别如SEQID NO.1-4所示。
5.包含权利要求1-4任其一所述重组载体表达单元的载体。
6.一种转基因动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将权利要求5所述的载体整合到动物基因组。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括：提取和纯化权利要求5所述的载体，线性化处理，利用受精卵原核注射使目的基因整合到动物基因组，输卵管胚胎移植入代孕鼠中，21天可获得首建鼠，待仔鼠生长到两周龄时，剪去2毫米鼠尾，碱性裂解法提取鼠尾基因组，设计HSV1-tk特异性引物，进行基因型鉴定，出现HSV1-tk目的条带的为阳性首建鼠。
8.一种制备嵌合动物模型的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求7所得阳性首建鼠全骨髓移植给经过辐照处理的野生型正常小鼠的步骤。
9.根据权利要求6-8任其一制备的动物模型在异种器官移植或异种血液系统融合或受体骨髓清除或异种器官再造或免疫耐受机制研究的应用。
10.根据权利要求6-8任其一制备的动物模型作为造血和免疫系统细胞功能以及表型研究的模式动物的应用。
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