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WO2004081230A1 - 生理的な活性型構造機能を反映する機能因子の活性評価方法およびその使用 - Google Patents

生理的な活性型構造機能を反映する機能因子の活性評価方法およびその使用 Download PDF

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WO2004081230A1
WO2004081230A1 PCT/JP2004/003410 JP2004003410W WO2004081230A1 WO 2004081230 A1 WO2004081230 A1 WO 2004081230A1 JP 2004003410 W JP2004003410 W JP 2004003410W WO 2004081230 A1 WO2004081230 A1 WO 2004081230A1
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WO
WIPO (PCT)
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activity
physiologically active
cells
evaluating
test
Prior art date
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Ceased
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PCT/JP2004/003410
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English (en)
French (fr)
Inventor
Masae Takagi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nippon Soda Co Ltd
Original Assignee
Nippon Soda Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nippon Soda Co Ltd filed Critical Nippon Soda Co Ltd
Publication of WO2004081230A1 publication Critical patent/WO2004081230A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G01N2333/918—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)

Definitions

  • the present invention relates to an activity evaluation method reflecting physiologically active structural functions, an inhibitor of an activity indicator in a test using the method, use of the method for creating an activator, and activity in a test using the method.
  • Inhibitors to be evaluated and activators, evaluation methods using the difference in sensitivity in each activity evaluation method reflecting physiological / artificial pseudo-active structure function as an index, physiologically active form of the index Use of structure-function selective inhibitors and activators for the creation of physiologically active structure-function selective inhibitors and activators evaluated by their indicators, and use of those inhibitors and activators More specifically, the present invention relates to the above-mentioned method or the like in which the functional factor is VA—cytoplasmic phospholipase A (2) (hereinafter abbreviated as cPLA (2)).
  • PLA (2) Phospholipase A (2) preferentially hydrolyzes fatty acids bound to the sn-2 position of the glycerol skeleton of daricerophospholipid, a major constituent of biological membranes
  • PLA (2) Phospholipase A (2)
  • c PLA (2) is abundantly expressed in the cytoplasm, and its hydrolysis activity is much weaker than that of the physiologically active enzyme due to the interaction with the phospholipid membrane substrate depending on the increase in Ca 2+ concentration. Fortunately, purification and isolation were successful. Thereafter previously c PL A (2) is to understand the complex activity control mechanism two prism, non-dependent on the C a 2+ concentration increased by utilizing a biochemical technique and information, including genetic handling techniques Cell lines and cell test systems have been constructed, and screening for inhibitors has been energetically carried out.However, artificial false activities with low similarity to the functional structure of such physiologically active enzymes are Activity against enzymes in an evaluation system using an evaluation system that reflects sex type enzyme activity and in WO pharmacology The association with activity was low.
  • the present inventors using U933 cells, a fluorescently labeled phospholipid 1,2-bis- (4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-5 -indecene-3-undecanoyl)-A glycero-3- phosphocholine (hereinafter abbreviated as bis-BODIPY-PC, Molecular Probes) as an index for screening a PLA (2) inhibitor using a cell-based assay.
  • An evaluation method to be performed has been found (WO 01/072723, WO 03/000668, Japanese Patent Application No. 2001-307301). However, although this method is an evaluation method superior to the conventional test method, there is a difference in sensitivity of the compound, and the evaluation method is not sufficiently correlated with the in′ ⁇ anti-inflammatory activity and includes noise. Disclosure of the invention
  • the present inventor has proposed an IV A—cytoplasmic phospholipase A (2) inhibitory activity and an artificial indicator that reflects this physiologically active structural function and an indicator of VA—cytoplasmic phospholipase A (2) inhibitory activity.
  • the present inventors have found that a method for evaluating VA-cytoplasmic phospholipase A (2) inhibitory activity has a good correlation with i'fl n'TO pharmacological activity, thereby completing the present invention.
  • VA a step of obtaining an inhibitory activity index in the method for evaluating the activity of cytoplasmic phospholipase A (2)
  • VA Inhibition activity index in the method for evaluating the activity of cytoplasmic phospholipase A
  • VA reflecting the physiologically active structural function
  • step (a) the production of PGE 2 and / or LTC 4 and / or PAF is enhanced 10 times or more, and the production of Z or active oxygen is enhanced 10 times or more, and / or the activity 3.
  • the evaluation method according to claim 1 or 2 wherein a human leukemia cell line U937 differentiated cultured cell exhibiting a morphological reaction similar to that of pharmacokinetics is used.
  • the term "functional factor” as used herein means a substance which is involved in any physiological reaction by forming a complex with a biological component alone or with the same or different species. Includes proteins, nucleic acids, enzymes, receptors, transposers, rafts, etc.
  • structural function means a physiological reaction involving a functional factor, and includes a catalytic reaction, interaction such as binding, movement, and the like.
  • physiological activation refers to enhancement of the function of a functional factor caused by various stimuli in a physiological phenomenon of an organism, and necessarily involves a change in the functional structure.
  • the term “functional molecular probe” refers to a molecule that is used as a probe to recognize a specific functional factor and / or its function.
  • artificial activation refers to the enhancement of the function of a functional factor caused by a specific physiologically active reagent in an i / zW test system or the like, and is referred to as “artificial false activation”.
  • artificial activation means "artificial activation" that has low homology to functional structural changes associated with physiological activation and low relevance to various stimuli in biological physiological phenomena.
  • inhibitortion activity index means an index of the inhibitory activity strength of a compound in an iTi70 test system or the like, and specifically, a value such as a 50% inhibitory concentration (IC 50 ) is used.
  • the activity of PLA (2) has long been measured using radioisotopes, chromophore or iluorophore-labeled lipids as substrates, or using a Thio-based test method, etc. (Dennis, EA ed., 'Methods in E Hana logy', 197 (1991).
  • the hydrolysis activity of PLA (2) can also be determined by separating the substrate and the hydrolyzate by an appropriate method after the reaction, if necessary, and measuring the radioactivity, absorbance or fluorescence intensity based on the label on the substrate. You.
  • the substrate phospholipid or arachidonic acid ester is often labeled with a radioisotope such as [ 3 H] or [ 14 C], which has high measurement sensitivity, or 4, 4_dif luoro-5, 7-dimet. Labeled with fluorophore such as yl-4-bora-3a, 4a-diaza-s ⁇ indecene-3-undecanoyl (hereinafter abbreviated as BODIPY 9 ) or 7-hydroxy-coumariii (Huang, Z Et al., Analytical Biochemistry, 222: 110-05 (1994).
  • fluorophore such as yl-4-bora-3a, 4a-diaza-s ⁇ indecene-3-undecanoyl (hereinafter abbreviated as BODIPY 9 ) or 7-hydroxy-coumariii (Huang, Z Et al., Analytical Biochemistry, 222: 110-05 (1994).
  • the arachidonic acid releasing activity by the non-phosphorylating enzyme is considered as a typical example of an artificial pseudo-active enzyme activity evaluation method having low similarity to the physiologically active functional structure.
  • a cPLA (2) inhibitor in order for a cPLA (2) inhibitor to exhibit i / z Fira anti-inflammatory activity, it is important that the inhibitory activity against an enzyme having a physiologically active structure is important. Based on the finding that it is more advantageous that the selectivity of the inhibitory activity in the evaluation system that reflects the physiologically active enzyme activity is higher than the inhibitory activity in the evaluation system that reflects the enzymatic activity Active C
  • a method for measuring a cell function accompanied by a physiological increase in the activity of the enzyme there is a method for measuring an increase in the production of an inflammatory lipid mediator.
  • the reported measurement of the physiological response in a known cell line was used to determine the characteristics of the cell used in the physiological / artificial pseudo-active cPLA (2) activity evaluation of the present invention. used.
  • In vivo pharmacological test methods with physiologically enhanced activity include: An inflammatory disease state model induced by an appropriate inflammatory stimulus is exemplified. However, models induced by arachidonic acid, a hydrolysis product of the enzyme, are not suitable as examples.
  • the test method is used for the purpose of verifying the in-activity evaluation method, which is the subject of the present invention, with the in-n'ra activity expression.
  • the method also includes evaluating the pharmacological activity of the PL A (2) inhibitor and Z or the anti-inflammatory compound by the test method.
  • Examples of the cell-free system for evaluating the activity based on an artificial pseudo-active functional structure having low similarity to the physiologically active functional structure of the present invention include a non-phosphorylated form in an expression system such as Escherichia coli. There is a method of evaluating the hydrolysis activity of phospholipid substrates and the like in the micelle state of Triton X-100 using the prepared recombinant enzyme.
  • the hydrolysis activity of cPLA (2) in a cell line is quantitatively analyzed by several measurement methods as described above, but for the purpose of measuring the physiologically active enzyme activity defined in the present invention.
  • the cell line used in the test is preferably a cell line that is appropriately controlled so as to simulate the physiological phenomenon reported to be involved in the activation of cPLA (2). Measurement of status is also an indicator of the pharmacological activity associated with activation of cPLA (2) in the cell line.
  • c PLA (2) is an enzyme at the rate-limiting step of arachidonic acid cascade. It is considered a physiologically activated state. That is, in cells in which the enzyme has not been physiologically activated, LT is not involved in the activation of the downstream arachidonic acid cascade, and the production of LTs is enhanced by COX-2 depending on the production of PGs. I can't. In contrast, in cells in which the enzyme has been physiologically activated, at least the downstream enzyme is properly coupled and the production of lipid mediators is enhanced, and the state is the production of appropriate PGs and LTs It can be evaluated by measuring the amount and the enhancement of the activity of an enzyme such as COX-2.
  • a test method using cells in which the enzyme is not subjected to phosphorylation evaluates the activity based on an artificial pseudo-active functional structure having low similarity to the physiologically active functional structure of the present invention. This is considered a typical example.
  • the activity of the physiologically active enzyme is not reflected in principle, but it is evaluated by the method of the present invention.
  • the activity of the physiologically active cPLA (2) selective inhibitor can be selectively evaluated with high sensitivity, the activity based on the physiologically active functional structure of the present invention is estimated. It is similar to the evaluation method suitable for
  • Enzyme activity evaluated by a method of measuring the release of radioactivity in response to stimulation from cells in which arachidonic acid previously labeled with [ 3 H] or [ 14 C] has been incorporated into the cells is determined by the physiological activity of the cells used. In order to reflect the sum of the hydrolytic activities of the various activated enzymes present in the cell, the enzyme activities in both the non-phosphorylated state and the phosphorylated state were evaluated. It is also possible to compare the sensitivity of the compounds to the inhibitory activity between the two. That is, the test method using cells in which the enzyme does not undergo phosphorylation evaluates the activity based on an artificial pseudo-active functional structure having low similarity to the physiologically active functional structure of the present invention. This is an example.
  • an evaluation method that reflects physiologically active enzyme activity using cells under appropriately controlled physiological conditions is based on the physiologically active function of the present invention. This is an example of evaluating the activity based on the structure.
  • some enzymes are subject to physiological activity, and the enzyme activity in this test method reflects the sum of the hydrolysis activities of various activated states present in the cells. Therefore, caution is required in interpreting the inhibitory activity of a compound.
  • the measuring method using a functional molecular probe substrate in which the compatibility as a substrate differs depending on the activity of the enzyme, particularly such that it is selectively hydrolyzed to a physiologically active enzyme, is described in the present invention. It is also desirable in principle as an activity evaluation system that reflects the physiologically active structure and function of E. coli.
  • Human monoblast-like lymphoma cell line U933 is a cell line that was originally reported to be used for the isolation of this enzyme, and it is Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (hereinafter abbreviated as TPA).
  • Activated vitamin D 3 pyruvamine A derivative, dimethyl sulfoxide (hereinafter abbreviated as DMSO), 2 -0- Dibutyry 1 adenosine-3 ', 5'- (eye 1 ic)-
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • dBc AMP mono-phosphate
  • Chemical analysis or immunoassay can be used for quantitative analysis of lipid mediators.
  • extraction, concentration, purification, and induction from biological samples, cells, or culture supernatants to be analyzed If necessary, the sample containing the target lipid mediator is prepared in a state suitable for separation and analysis.
  • a chemical analysis method in which quantification is performed by an appropriate detection method after separation by thin-layer chromatography, HP LC or GC, multiple lipid mediators can be separated and quantified from the same preparation sample.
  • an immunoassay such as radioimmunoassenzym immunoassay has high detection sensitivity and is suitable for high-speed measurement of multiple sample samples.
  • an anti-inflammatory pharmacological test is described as a method for evaluating the pharmacological activity of cPLA (2) inhibitors.
  • the anti-inflammatory activity was evaluated by applying a 0.13 ⁇ 4 Tween 80 / acetone solution of the test compound to the front and back of the right auricle 30 minutes after the application of TPA.
  • As a positive control 0.1% Tween 80 / acetone solution of Dexamethasone-2-acetate (hereinafter abbreviated as DEX-Ac) or Indomethacin was administered in the same manner as the test compound. Table 5 shows the results.
  • the anti-inflammatory activity was evaluated by applying to the front and back of the sample.
  • a 0.1 l Tween 80 / aceton solution of Indometliaciii was administered in the same manner as the test compound.
  • the physiologically active c PLA (2) inhibitor of the present invention showed anti-inflammatory activity by local administration. Did not. Table 5 shows the results.
  • HBSS Hanks' Balanced Salt Solution
  • BSA bovine serum albumin
  • TPA was added to the reaction solution to a final concentration of 10 nM, and then cultured at 37 for 1 hour to activate.
  • Indomethacin was used as a positive control compound as an inhibitor of COX-1 and COX-2, NS-398 as a selective inhibitor of COX-2, and AA-861 as an inhibitor of 5-LOX.
  • Formation reaction of PG £ 2 Oyopishi Ding Ji 4, 50 M Arakidon C a 2 + acid or appropriate concentration - ionophore A23187 was started by adding Stimulator such (hereinafter abbreviated as A23187), 37 The culture was continued at ° C, and terminated by ice cooling.
  • the cells were pelleted by centrifugation at 4 V, and the concentrations of PGE 2 and LTC 4 in the supernatant were determined using the enzyme immunoassay kit (Cayman Chemical), either directly or after appropriate dilution in the reaction buffer. Quantified. Quantitative analysis test example 2
  • PLA (2) activity was measured by quantifying the fluorescent substance generated by carohydrolysis of bis-BODIPY-PC using appropriate cells.
  • the cells were collected by centrifugation, washed with a reaction buffer (Dulbecco's Phosphate buffered saline (hereinafter abbreviated as PBS) -2.2 mM glucose-2.5 nM MBSA) 2-3 times, and suspended. If necessary, TPA was added to the reaction buffer to a final concentration of 10 nM, and then cultured at 37 ° C for an additional hour to activate.
  • PBS Dulbecco's Phosphate buffered saline
  • TPA was added to the reaction buffer to a final concentration of 10 nM, and then cultured at 37 ° C for an additional hour to activate.
  • the substrate ribosome suspension is prepared by mixing bis-BODIPY-PC and phosphatidylserine in a form-form solution so as to have a molecular number ratio of 1: 9, and evaporating the organic solvent under a stream of nitrogen to dryness.
  • the reaction buffer was added to 100 ⁇ g / mL, and the mixture was sonicated for 1 hour under ice-cooling from light.
  • Fluorescence intensity based on the hydrolysis product of the enzyme is measured using S PECTRA FLUOR PLUS (TECAN), and the fluorescence intensity at 535 nm (Relative Fluorescence Unit, hereinafter abbreviated as RFU) with 485 nm excitation light is measured by upward photometry. did.
  • RFU Relative Fluorescence Unit
  • the reaction zone containing no cells was set as the B 1 ank zone, and the average value of the fluorescence intensities was used as the B 1 ank value.
  • the PL A (2) activity of each test zone was calculated for each well. It was determined by subtracting the B 1 ank value from the fluorescence intensity.
  • TPA was added to each reaction solution to a final concentration of 1 OnM, and then cultured at 37 for 1 hour to activate.
  • the [ 3 H] arachidonic acid release reaction was started by adding an appropriate concentration of A23187 and stopped by cooling on ice.
  • For suspended cells centrifuge at 4 to pellet the cells.
  • For adherent cells take 200 from 500 L of the supernatant and pay attention to the liquid scintillation counter ( Hereinafter, abbreviated as LSC).
  • 200 L of the lysate 6 obtained by adding 300 L of a 2% aqueous solution of TrUonX-100 to 300 L of the residual solution containing cells was mixed, and the radioactivity was measured by LSC. From these measured values of radioactivity, the "free radioactivity" and “total radioactivity incorporated" for each treatment were calculated, and the free activity was calculated as "free radioactivity" It was calculated as the ratio of free radioactivity (%).
  • the cells were cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . Each test was performed while confirming that the cells exhibited stable proliferation and differentiation reactivity during the period of 3 to 14 weeks after freeze-thawing.
  • U937 cells are subcultured every 3 to 4 days in RPMI 1640 culture medium supplemented with 10% inactivated fetal bovine serum (hereinafter abbreviated as i FBS) in RPMI 1640 culture medium.
  • i FBS inactivated fetal bovine serum
  • the method of the present invention can be used as a method for measuring physiologically active PLA (2) activity.
  • the cell-based Assay system 6-2 which uses cells that have not been activated by TPA to differentiate cells under differentiating conditions [ ⁇ ], which has been widely used, has low similarity to the physiologically active form of the present invention.
  • WO 01 / Three typical compounds were selected from the compounds listed in 072723 and WO 03/000668.
  • Known PLA (2) inhibitors and anti-inflammatory active compounds were also purchased or synthesized. Table 3 shows these compounds.
  • the possible compounds were evaluated for their anti-inflammatory activity by the test method of Pharmacological Test Example 1. Further, the pharmacological activity was evaluated by the test method of pharmacological test example 2 as necessary, in order to confirm that it was not in Fiw anti-inflammatory activity based on the effect of the downstream arachidonic acid cascade on the enzyme amount.
  • Table 4 shows the results of the In Wra pharmacological test.
  • test compound was dissolved in DMSO and diluted with DMSO or each reaction buffer so that the final concentration of DMSO in the reaction solution in each test was 0.1% or less.
  • the compound solution was added 10 to 15 minutes before the start of the reaction in each test using the cultured cells, and the cells were cultured at 37 ° C.
  • AACOC F 3 Arachidonyl Trif luoromethyl Ketone
  • BEL Bromoenol lactone
  • an inhibitor of V_i PLA (2) was used.
  • the activity of the inhibitor was calculated by the following formula as a comparison with the control group to which no inhibitor was added (hereinafter abbreviated as a control group).
  • Inhibition rate () (control plot data-inhibitor treatment plot data / control plot data) x 100 Perform multiple concentration treatment tests for each inhibitor and use the logarithmic concentration to determine the inhibition rate at each concentration.
  • each of the conjugates was evaluated using the above-described Celt based Assay system 12 for quantitatively measuring the hydrolytic activity of the fluorescent substrate. The inhibitory activity was examined.
  • As an artificial false active cPLA (2) inhibition evaluation system with low similarity to conventional physiologically active forms the above-mentioned [ 3 H] arachidonic acid free radioactivity is quantitatively measured.
  • Cell based Assay system 6-2 was performed. For the purpose of comparison with these, the cell culture conditions were the same as for the Cell-based Assay System 12 and the Cell-based Assay System 12-2, which quantitatively measures the free radioactivity of [ 3 H] arachidonic acid, was also examined. Added debate.
  • each test system calculates the 50% inhibitory concentration IC 5Q a (FIM), in any physiological to inhibitors sensitivity in a test system that reflects the enzyme activity, test system that reflects the artificial fake enzymatic activity The ratio of inhibitor sensitivity was calculated and used as the selectivity index.
  • FIM 50% inhibitory concentration
  • PLA (2) P which has anti-inflammatory activity in pharmacological test example 1 or has been reported for in Wra anti-inflammatory activity, is listed in Table 5
  • the inhibitory activity of the compound in the conventional activity evaluation method reflecting the artificial enzyme activity was not related to its in′TO anti-inflammatory activity.
  • Activity that reflects physiologically active enzyme activity The inhibitory activity in the evaluation method is improved compared to the conventional method, but it also includes noise, and by calculating the selectivity between different evaluation methods, it is more advantageous to calculate in It has been shown that anti-inflammatory active compounds can be screened in vivo.
  • the heterocyclic derivative compound exhibiting anti-inflammatory activity shows a sensitivity difference of 10 times or more in an evaluation method reflecting physiologically artificial pseudo active cPLA (2) activity
  • the evaluation method of the present invention is an excellent evaluation method that reflects cPL A (2) activity.
  • the present invention has examined cPLA (2) activity in relation to anti-inflammation, it can be applied to an evaluation method for various symptoms caused by cPLA (2).

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Abstract

In vivo活性発現と整合性のあるin vitro活性評価方法およびその創薬研究への使用方法であって、生理的な活性型構造機能を反映する活性評価方法、その方法を用いた試験における阻害活性指標の阻害剤創製への使用等、詳細には、ⅣＡ−細胞質型ホスホリパーゼＡ（２）の生理的な活性型構造機能を反映する活性評価方法、その方法を用いた試験における阻害活性指標の阻害剤創製への使用、および生理的な／人為的な偽の活性型構造機能を反映する活性評価方法における感受性差の生理的な活性型ｃＰＬＡ（２）選択的阻害剤創製への使用等。

Description

明細書
生理的な活性型構造機能を反映する機能因子の活性評価方法およびその使用
技術分野
本発明は、 生理的な活性型構造機能を反映する活性評価方法、 その方法を用いた試験におけ る活性指標の阻害剤並びに活性化剤創製への使用、 その方法を用いた試験において活性が評価 される阻害剤並びに活性ィ匕剤、 生理的な/人為的な偽の活性型構造機能を反映する各活性評価 方法における感受性の差を指標とする評価方法、 その指標の生理的な活性型構造機能選択的阻 害剤並びに活性化剤創製への使用、 その指標により評価される生理的な活性型構造機能選択的 阻害剤並びに活性化剤、 およびそれらの阻害剤並びに活性ィ匕剤の使用に関し、 詳細には機能因 子が] V A—細胞質型ホスホリパーゼ A (2) (以下、 cPLA (2) と略記する） である前記 方法等に関するものである。
背景技術
ホスホリパ一ゼ A (2) (以下、 PLA (2) と略記する） は、 生体膜の主要構成分である ダリセロリン脂質のグリセロール骨格の s n— 2位に結合した脂肪酸を優先的に加水分解す る酵素の総称である。 ―
PLA (2) は近年、 次々に新しいアイソザィムが発見されて 19種類を超え、 各々のアイ ソザィムは特性も異なり、 機能分担を行っていることが報告されている （Six, D. A. & Dennis, Ε. Α· Biochimica et Biophysica Acta 1488: 1-19 (2000) . , Balsinde J. , Winstead M. V. , & Dennis E. A. FEBS Letters 531: 2-6. (2002))。 これらの中で c PLA (2) はァラキドン酸 を結合したリン脂質に高い特異性を示し、 炎症性疾患において活性の上昇が認められ、 その遺 伝子欠損マウスの知見 (Uozumi, N.ら, Mure 390: 619-22 (1997)., Bonventre, J. V. ら, Nature 390: 622-25 (1997).) からも炎症病態における脂質メディェ一夕一産生を制御する主 要なアイソザィムであり、 安全性が高い創薬ターゲットとして期待されている。
c PLA (2) は細胞質に多量に発現しており、 C a 2+濃度上昇に依存したリン脂質膜基質 との相互作用により、 生理的な活性型酵素よりは遥かに弱いながらも加水分解活性を示すゆえ に、 幸いなことに精製、 単離に成功した。 その後に c PL A (2) はその複雑な活性制御メカ 二ズムを理解する以前に、 遺伝子取り扱い技術等の生化学的な技術 ·情報を利用して C a 2+濃 度上昇に依存した無細胞系や細胞試験系が構築され、 阻害剤の探索スクリーニングも精力的に 行われてきたが、 この様な生理的な活性型酵素の機能構造との類似性が低い、 人為的な偽の活 性型酵素活性を反映する評価系を用いた評価系における酵素に対する阻害活性と in W O薬理 活性との関連性は低いものであつた。
本発明者らは、 U 9 3 7細胞を用いて蛍光標識リン脂質である 1, 2-bis- (4,4-difluoro- 5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-5-indecene-3-undecanoyl) - glycero- 3- phosphocholine (以下、 bis- BODIPY-PCと略記する、 Molecular Probes社） の加水分解活性を 指標として PL A (2) 阻害剤の Cel卜 based Assayスクリーニングを行う評価方法を見出し ている （WO 01/072723, WO 03/000668, 特願 2001— 307301 号公報)。 しかし、 該方法は、 従来の試験方法に比べ優れた評価方法ではあるが、 化合物の感 受性差があり、 in 'ΤΌ抗炎症活性との相関性は充分ではなくノイズも含む評価方法である。 発明の開示
本発明者は上記課題を解決する目的で鋭意研究を重ねてきた結果、本発明者らが抗炎症活性 を示すヘテロ環 PL A (2) 阻害化合物を見出した Cen- based Assayスクリーニングにおい て U937細胞に加えられた bis-BODIPY- PC基質の加水分解が C a2+濃度上昇には依存せず、 細胞の炎症性脂質メデイエ一タ一類産生等の生理的な状態に関連した c PLA (2) の活性ィ匕 状態に依存することを見出した。 これに対して従来 C a 2 +濃度上昇に依存した評価方法等に多 く使用されている培養条件の細胞においては炎症性脂質メディェ一夕一類産生の高い亢進が 認められず、 bis- BODIPY-PC基質の加水分解活性も低いことが見出された。
本発明者は、この生理的な活性型構造機能を反映する IV A—細胞質型ホスホリパーゼ A ( 2 ) 阻害活性と人為的な] V A—細胞質型ホスホリパ一ゼ A (2) 阻害活性との指標との比により] V A—細胞質型ホスホリパ一ゼ A (2) 阻害活性を評価する方法が i'fl n'TO薬理活性と良い相関 関係があることを見出し本発明を完成するに至つた。
即ち本発明は、 下記 1.乃至 4.に示すものである。
1. (a) 生理的な活性型構造機能を反映する] VA—細胞質型ホスホリパーゼ A (2) の活性 評価方法における阻害活性指標を得る工程、
( b ) 生理的な活性型構造機能との類似性が低い、 人為的な偽の活性型構造機能を反映す る] VA—細胞質型ホスホリパ一ゼ A (2) の活性評価方法における阻害活性指標を得る工程、
(c) (a) と （b) との対比により算出される選択性指標を得る工程、
を含むことを特徴とする、 生理的な活性型] VA—細胞質型ホスホリパーゼ A (2) 活性評価方 法。
2. (a) 生理的な活性型構造機能を反映する] VA—細胞質型ホスホリパーゼ A (2) の活性 評価方法における阻害活性指標を得る工程、 (b) 生理的な活性型構造機能との類似性が低い、 人為的な偽の活性型構造機能を反映す る] VA—細胞質型ホスホリパーゼ A (2) の活性評価方法における阻害活性指標を得る工程、
(c) (a) と （b) との対比により算出される選択性指標を得る工程、
を含むことを特徴とする評価方法における選択性指標の比が 10倍以上である請求項 1記載 の評価方法。
3. (a) の工程において PGE2および または LTC4および/または PAFの産生が 10 倍以上亢進している、 および Zまたは活性酸素産生が 10倍以上充進している、 および/また は活性化マク口ファ一ジ様の形態反応を呈するヒト白血病細胞株 U 937分化培養細胞を用 いる請求項 1または 2記載の評価方法。
4. (b) の工程において脂質メディエーターの産生の亢進が 10倍未満である細胞を使用す る請求項 1〜 3記載の活性評価方法。
ここで、 本明細書に用いる 「機能因子」 なる用語は、 生体構成成分として単独で、 或いは同 種若しくは異種のものと複合体を形成して何れかの生理反応に関与する物質を意味し、 蛋白質、 核酸、 酵素、 受容体、 トランスポ一夕一、 ラフト等を含む。
「構造機能」 なる用語は、 機能因子の関わる生理反応を意味し、 触媒反応、 結合等の相互作 用、 移動等を含む。
「生理的な活性化」なる用語は、生物の生理現象において種々の刺激に応じて引き起こされ ている機能因子の機能の亢進を意味し 必然的に機能構造の変化を伴うものである。
「機能性分子プローブ」なる用語は、特定の機能因子および/またはその機能を認識する探 索子として使用される分子を意味する。
「人為的な活性化」なる用語は、 i/zW り試験系等において特徵ある生理活性試薬等により 引き起こされている機能因子の機能の亢進を意味し、 「人為的な偽の活性化」 なる用語は、 生 理的な活性化に伴う機能構造変化との相同性が低く、 生物の生理現象における種々の刺激との 関連性も低い 「人為的な活性化」 を意味する。
「阻害活性指標」なる用語は、 iTi 7 0試験系等における化合物の阻害活性強度の指標を意 味し、 具体的には 50%阻害濃度 (I C50) 等の値が使用される。
「選択性指標」なる用語は、対比される各活性評価方法における化合物の阻害活性の感受性 差を意味し、 具体的には各/' 72 W 0試験系における 「阻害活性指標」 の比として算出される。
cPLA (2)活性の評価方法としては下記のような従来使用されているいずれの測定技術 も使用されるが、 本明細書に用いる 「生理的な活性化」 を反映する試験系としては、 生理反応 を模擬した Cel卜 based Assay系にて、 例えば、 ァラキドン酸カスケードの亢進や P G sや L Tsの産生亢進等、 「生理的な活性化」 状態が同定される条件下での測定を意味する。 更に c PLA (2) は種々の生理学的な研究より多種の生理反応において活性ィ匕されて Triggerとし て働いている知見が集積されているため、 かかる生理反応と科学的に関連する試験系は 「生理 的な活性化」 を反映する試験系と考えられる。
PLA (2) の活性評価には、古くから適切なアイソザィムを用いて、放射能、 chromophore 或いは iluorophore標識脂質を基質として、 または Thio-based試験法等により測定されてい る （Dennis, E.A. ed. , 'Methods in E華 o logy' ， 197 (1991). 等）。 c PLA (2) によ る加水分解活性も、 反応後に必要に応じて基質と加水分解産物を適切な方法にて分離し、 基質 の標識に基いて放射能、 吸光度或いは蛍光強度等が測定される。 基質のリン脂質或いはァラキ ドン酸エステルは多くの場合に、 測定感度が高い [3H] や [14C] 等の放射性同位元素で標 識、或レは 4, 4_dif luoro- 5, 7-dimet yl-4-bora-3a, 4a-diaza-s^indecene-3-undecanoyl (以下、 BODIPY9と略記する） や 7-hydroxy-coumariii等の fluorophoreで標識されたものが使用される (Huang, Z.ら， Analytical Biochemistry, 222: 110-05 (1994). 等）。
非リン酸化酵素によるァラキドン酸遊離活性は、 生理的な活性型機能構造との類似性が低い、 人為的な偽の活性型酵素活性評価方法の典型例として考えられる。
発明を実施するための最良の形態
次に， 本発明について更に詳細に説明する。
本明細書においては、 cPLA (2) 阻害剤が i/z Fira抗炎症活性を示すためには、 生理的 な活性型構造の酵素に対する阻害活性が重要であること、 更に人為的な偽の活性型酵素活性を 反映する評価系における阻害活性に対して生理的な活性型酵素活性を反映する評価系におけ る阻害活性の選択性が高いことがより有利であることに関する発見に基き、 生理的な活性型 C
PL A (2) を阻害する新規な化合物をスクリーニングし、 検出および/または特徴付けるた めの方法または手法を記載し、 かかる方法により新規に発見された化合物または薬剤は細胞レ ベル以上で抗炎症活性を示し得ることを説明する。
本酵素活性の生理的な亢進を伴う細胞機能を測定する方法としては、 先ずは炎症性脂質メデ ィェ一ターの産生亢進の測定方法が挙げられるが、 広く本酵素活性の亢進を伴うことが報告さ れている公知の細胞系における生理反応の測定が使用され、 本発明の生理的な/人為的な偽の 活性型 cPLA (2) 活性評価に使用する細胞としての特性を把握する目的で使用される。 生理的な活性型 c PLA (2) 活性の生理的な亢進を伴う in vivo薬理試験方法としては、 適切な起炎刺激により惹起される炎症病態モデル等が挙げられる。 但し、 酵素の加水分解産物 であるァラキドン酸による惹起されるモデルは例として適切でない。 当該試験方法は、 本発明 の課題である in 活性評価方法を in n'ra活性発現との整合性について検証する目的で 使用される。 また、 当該試験方法により、 PL A (2) 阻害剤および Zまたは抗炎症化合物の 薬理活性を評価することを含む。
本発明の生理的な活性型機能構造に類似性の低い、人為的な偽の活性型機能構造に基く活性 を評価する無細胞系の例としては、 大腸菌等の発現系において非リン酸化体として調製した recombinant酵素を用いて Tri ton X- 100混合ミセル状態のリン脂質基質等の加水分解活性を評 価する方法等がある。
細胞系における c P L A (2) による加水分解活性は、 前記のようにいくつかの測定方法に より定量分析されるが、 本発明に定義される生理的な活性型酵素活性を測定する目的において は、 先ずは酵素が生理的な活性化を受けた状態の細胞を使用することが必要である。 試験に用 いる細胞系としては、 特に c PLA (2) の活性化の関与が報告されている生理現象を模擬す るように適切に制御した細胞系が好ましく、 そのような細胞の生理的な状態の測定は、 細胞系 における c PL A (2) の活性化が関わる薬理活性の指標ともなる。
先ずは、 c PLA (2) はァラキドン酸カスケ一ドの律速段階の酵素であり、 用途である抗 炎症活性の指標でもある脂質メデイエ一タ一の産生と couple したリン脂質加水分解の宂進が 生理的な活性化状態と考えられる。 即ち 酵素が生理的な活性ィ匕を受けていない細胞において は、 下流のァラキドン酸カスケードの活性化が伴わないため LT類の産生おょぴ COX— 2 に依存した P G類の産生の亢進が認められない。 これに対して酵素が生理的な活性化を受けて いる細胞においては、 少なくとも下流の酵素と適切に coupling し脂質メディエーター産生が 亢進しており、 その状態は適切な P G類や L T類等の産生量、 並びに COX-2等の酵素活性 の亢進等を測定することにより評価され得る。 これらの産生の亢進が著しい状態の細胞を使用 することにより生理的な活性化型酵素の活性が強く反映する細胞試験系が構築することが可 能であり、 逆に、 これらの脂質メディエーター産生の 進が認められない状態の細胞を使用す ることにより生理的な活性型構造機能との類似性が低い、 人為的な偽の活性化型酵素の活性を 反映する細胞試験系を構築することが可能である。
適切な細胞を懸濁させた試験液中に C a2+— ionophore等の非生理的な刺激に惹起されて遊 離 （Leak) される脂肪酸量 （または濃度） を直接に或いは適切な誘導体として HP LCまたは GCにて分離定量分析することにより、 人為的に活性ィ匕された酵素によるリン脂質加水分解活 性が測定される。 特に酵素がリン酸ィ匕を受けない状態の細胞を用いた試験法は、 本発明の生理 的な活性型機能構造に類似性の低い、 人為的な偽の活性型機能構造に基く活性を評価する典型 的な例と考えられる。 これに対してリン酸化された酵素による加水分解活性が反映される細胞 を用いる場合には、 原理的には生理的な活性型の酵素活性を反映していないが、 本発明の方法 にて評価される生理的な活性型 c P L A ( 2 ) 選択的阻害剤の活性を選択的に高い感受性にて 評価しうる場合には、 本発明の生理的な活性型機能構造に基く活性を推定するのに適した評価 方法に類する。
予め [3H] または [ 1 4 C] で標識したァラキドン酸を細胞に取り込ませた細胞からの刺激 に応じた放射能遊離を測定する方法により評価される酵素活性は使用する細胞の生理的な状 態に依存し、 細胞内に存在する種々の活性化状態の酵素による加水分解活性の総和を反映する ため、 非リン酸化状態並びにリン酸ィ匕状態のいずれの酵素活性も評価され、 それらの間での化 合物による阻害活性の感受性について比較することも可能である。 即ち、 酵素がリン酸化を受 けない状態の細胞を用いた試験法は、 本発明の生理的な活性型機能構造に類似性の低い、 人為 的な偽の活性型機能構造に基く活性を評価する例である。 これに対して例えば脂質メディエー ター産生亢進に coupleするような、 適切に生理条件を制御した細胞を用いて生理的な活性型 酵素活性を反映する評価方法は、 本発明の生理的な活性型機能構造に基く活性を評価する例で ある。 但し、 生理的な活性ィ匕を受ける酵素は一部であり、 この試験方法における酵素活性は細 胞内に存在する種々の活性化状態の醇素による加水分解活性の総和を反映するものであるた め、 化合物による阻害活性の解釈には注意を要する。
酵素の活性ィ匕状態に依存して基質としての適合性が異なるような、 特に生理的な活性型酵素 に選択的に加水分解されるような機能性分子プローブ基質を用いる測定方法は、 本発明の生理 的な活性型構造機能を反映する活性評価系として原理的にも望ましいものである。 ヒ卜単芽球 様リンパ腫株細胞 U 9 3 7は当初に本酵素の単離に用いられたことが報告された細胞株であ り、 Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (以下、 T P Aと略記する）、 活性型ビタミン D 3、 ピ 夕ミン A誘導体、 ジメチルスルホキシド （以下、 D M S Oと略記する）、 2 -0- D i bu tyry 1 adenos i ne-3', 5 '- (eye 1 ic) -mono-phospha t e (以下、 d B c AMPと略記する)等、 各 種の分化誘導物質処理により、 単球系、 マクロファージ系、 或いは顆粒球系への細胞分化が観 察され、 炎症'免疫分野の研究や動脈硬化の研究等に多く使用されている。
脂質メディエータ一の定量分析には化学分析法または免疫測定法が使用され得る。 何れの測 定法においても、 分析対象の生体試料、 細胞、 或いは培養上清等より抽出、 濃縮、 精製、 誘導 体化等を必要に応じて行い、 目的とする脂質メディエーターを含む試料を分離分析に適した状 態に調製する。 薄層クロマトグラフィー、 HP LC或いは GCにて分離後に適切な検出法にて 定量を行う化学分析法においては複数の脂質メディエーターを同一の調製試料から分離定量 可能である。 特定の脂質メディエーターを測定する場合にはラジオィムノアッセィゃェンザィ ムィムノアッセィのような免疫測定法が検出感度も高く、 多検体試料の高速測定に適している。 実施例
以下に実施例を挙げて、 本発明を説明する。 これらの実施例は、 開示の範囲の限定として意 図するものでも、 構成されるものでもない。
先ず、 cPLA (2) 阻害剤の 'ra薬理活性評価方法として抗炎症薬理試験について記 載する。
薬理試験例 1
TP Aにより惹起されたマウス耳介浮腫
Carlson, R. P.らの方法 (Agents and Actions, 17 (2)： 197-204 (1985). ) および Chang, J らの方法 (European Journal of Pharmacologic 142: 197-205 (1987).) を参考にして行った。 即ち、 I CR系雄性マウス ( 6〜 7週齢) の右耳介の表裏にエタノールに溶解した TP A 5 fi g/20 Lを塗布し、 7時間後に両耳介一定部位の厚さをデジマチックマイクロメータ一 を用いて 3回測定して各々の平均値を算出した。 T P Aを塗布した右耳介の厚さより無処置の 左耳介の厚さを減じて耳介浮腫とした。 被験化合物の 0. 1 ¾Tw e e n 80 /ァセトン溶液 を T P A塗布の 30分後に同じく右耳介の表裏に塗布することにより抗炎症活性を評価した。 陽性対照としては Dexamethasone- 2卜 acetate (以下、 DEX-Acと略記する) または Indomethacinの 0. l%Twe e n 80/アセトン溶液を被験ィヒ合物と同様に投与した。結果 を第 5表に示す。
薬理試験例 2
ァラキドン酸により惹起されたマウス耳介浮腫
Chang, J らの方法 (European Journal of Phanmcology, 142: 197-205 (1987).) を参考 にして行った。 即ち、 I CR系雄性マウス （6〜7週齢） の右耳介の表裏にアセトンに溶解し たァラキドン酸 5 m g 20 Lを塗布し、 1時間後に両耳介一定部位の厚さを、 デジマチ ックマイクロメーターを用いて 3回測定して各々の平均値を算出した。 ァラキドン酸を塗布し た右耳介の厚さより無処置の左耳介の厚さを減じて耳介浮腫とした。 被験化合物の 0. 1 % T we e n 80 /アセトン溶液をァラキドン酸塗布の 30分前おょぴ 15分後に同じく右耳介 の表裏に塗布することにより抗炎症活性を評価した。 陽性対照としては Indometliaciiiの 0. l Twe en 80 /ァセトン溶液を被験化合物と同様に投与した。 P L A (2) 加水分解反 応産物であるァラキドン酸により惹起される本薬理試験においては、 本発明に関わる生理的な 活性型 c PL A (2) 阻害剤は局所投与により抗炎症活性が認められなかった。 結果を第 5表 に示す。
次に、 in i ひ活性評価方法に用いる定量分析測定方法について記載する。
定量分析試験例 1
細胞培養液中の P G E 9および L T C±の定量
各種の分ィヒ培養を行っている細胞の入つた培養液を、 フラスコ内の浮遊細胞については遠 心分離をすることにより、 96穴プレートにて培養された接着性の細胞については剥がれない ように注意しつつ除去し、 反応 Bufferとして用いる Hanks' Balanced Salt Solution (以下、 HBSSと略記する） 一 0. 1%牛血清アルブミン （以下、 BS Aと略記する） を用いて 3回 洗浄した。 洗浄された細胞を、 浮遊細胞の場合は 2x 106c e 1 1 s/mLとなるように反 応 Bu f f e rに懸濁して最終反応溶液量が 0. 2 m L 穴となるように 96穴プレートに分注し 接着性細胞は 0. 2mL反応 Buffer/穴となるように調製した。必要に応じて最終濃度が 10 nMとなるように T P Aをその反応液に添加後 37 にて 1時間培養して活性化した。 陽性対 照化合物としては、 COX— 1と COX—2の阻害剤として Indomethacin、 COX— 2選択的 阻害剤として NS— 398、 および 5—LOXの阻害剤として AA— 861を使用した。 PG £2ぉょぴし丁じ4の生成反応は、 50 Mァラキドン酸または適切な濃度の C a2 +— ionophore A23187 (以下、 A23187と略記する) 等の Stimulatorを添加することにより 開始させ、 37°Cにて培養を継続し、 氷冷により終了させた。 4 Vにおいて遠心分離すること により細胞を沈殿させ、上清の P G E 2および L T C 4の濃度は、各々直接に、或いは反応 Buffer にて適宜希釈した後に enzyme immunoassay kit (Cayman Chemical社) を使用して定量した。 定量分析試験例 2
蛍光法による細胞系における PL A (2) 活性
PLA (2)活性は適切な細胞を用い bis-BODIPY- PCのカロ水分解により生成される蛍光性物 質を定量することにより測定した。 遠心分離により細胞を集め、 反応 Buffer (Dulbecco' s Phosphate buffered saline (以下、 PBSと略記する） —2. 2mMグルコース一 2. 5 n MBS A) にて 2〜 3回洗浄後に懸濁した。 必要に応じて最終濃度が 10 nMとなるように T P Aをその反応 Buffer に添加後 37 °Cにて更に 1時間培養して活性化した。 （Rzigalinski, B. A. & Rosenthal, M.D. , Biochimica et BiophysicaActa 1223: 219-225 (1994) .および Goncliar, M. V. , Biochemical and Biophysical Research Co匿 imkat ion, 249: 829-832 (1998).)。 基質リボソーム懸濁液は、 bis-BODIPY- PCとホスファチジルセリンを分子数比 1： 9となるよ うにクロ口ホルム溶液として混和後、 窒素気流下で有機溶媒を留去乾固し、 この混合物に対し て 100 μ g/mLとなるように反応 Buffer を添加して遮光氷冷下で 1時間超音波処理する ことにより調製した。
試験は 96穴マイクロプレート （Corning 3603) に前記の細胞 6x106 c e l l s/mL 懸濁液を 25 穴に対して基質リボソーム懸濁液を添加して計 75 iLZ穴の反応液に 混和調製した後、 遮光して 37でにて 30分間培養を行った。 必要に応じて 1. 5 M A2 3 1 8 7を上記反応液に添加した。 反応は 0. 0 1 ^Ethylene Glycol Bis( j8 - aminoethyl ether) -N, N, N, eir&&cei\c Acid (以下、 EGTAと略記する) メタノール溶液 を 100 L/穴ずつ分注して混和することにより停止させた。 酵素による加水分解生成物に 基づく蛍光を S PECTRA FLUOR PLUS (TECAN社） を使用し、 485nmの 励起光による 535 nmの蛍光強度 (Relative Fluorescence Unit, 以下、 RFUと略記する) を上方測光にて測定した。 各試験においては細胞を含まない反応区を B 1 ank区として設定 し、 それらの蛍光強度の平均値をもって B 1 ank値とし、 各々の試験区の PL A (2) 活性 は、 各々の穴の蛍光強度より B 1 ank値を減じて求めた。
定量分析試細 3
[3H3 ァラキドン酸の培養細胞系からの遊離
各種の分化培養を行っている細胞の入ったフラスコ或いは 24穴プレー卜の各穴に Arachidonic acid, [5, 6， 8, 9, 11, 12, 14, 15 -3翻- (PerkinElmei\ 7844 GBa/mmoL 3.7斷 M) を 106細胞あたり 3. 7kBqとなるように、 培養最終日の前日夕方に添加して一晩培養を 継続し、 放射性脂肪酸を平衡状態に取り込ませた。 但し、 TP A等の活性化'分化処理を行つ ている細胞については、 予め活性化 ·分化処理後に活性化物質を含まない培養液に置換して放 射性脂肪酸を添加し、 一晩培養を継続した。 一晩 [3H] ァラキドン酸を取り込んだ細胞の培 養液を、 フラスコ内の浮遊細胞については遠心分離をすることにより、 24穴プレートにて培 養された接着性の細胞については剥がれないように注意しつつ除去し、 反応 Buffer として用 いる HBSS— 0. 1%BSAを用いて 3回洗浄した。 洗浄された細胞を、 浮遊細胞の場合は 5X105c e 1 1 sZt ube、 最終反応溶液量が 0. 5mL/ tubeとなるように分注 し、 接着性細胞の場合は最終反応溶液量が 0. 5mLZ穴となるように反応 Buffer を分注し た。 必要に応じて最終濃度が 1 OnMとなるように TP Aを各反応液に添加後 37 にて 1時 間培養して活性化した。 [3H]ァラキドン酸の遊離反応は適切な濃度の A 23187を添加す ることにより開始させ、 氷冷することによりその反応を停止させた。 浮遊細胞の場合は 4 に おいて遠心分離して細胞を沈殿させ、 接着性細胞の場合は細胞が剥がれないように注意しつつ、 上清 500 Lより 200 を採取して液体シンチレーシヨンカウンタ一 （以下、 LSCと 略記する） にて放射能を測定した。 細胞を含む残液 300 Lに 2%TrUonX- 100水溶液 30 0 Lを加え混合して得た溶解液 6 より 200^Lを採取して L S Cにて放射能を 測定した。 これらの測定された放射能の値から、 各処理の 「遊離放射能」 および 「取込まれて いた総放射能」 を算出し、 遊離活性としては 「取込まれていた総放射能」 に対する 「遊離放射 能」 の割合 （％) として算出した。
次に、 生理的な活性ィ匕状況を制御する U 937細胞の分ィ匕活性ィヒ培養の試験例を説明する。 細胞培養試験例 1 ：
U937細胞培養および分化誘導
細胞は 37°C、 5%C02条件下にて培養した。 各試験は、 凍結融解後 3〜14週目の期間 に細胞が安定した増殖並びに分化反応性を示すことを確認しつつ行つた。
[I] 継代培養、 非分化細胞
U 937細胞は 10 %非働化牛胎仔血清 （以下、 i F B Sと略記する、 Sigma社 F4135) を添加した RPM I 1640培養液中 Non- tissue Culture Treatedフラスコを用いて 3〜 4日毎に継代培養を行った。 この非分化細胞は TP A処理に対しては緩やかに反応して分化 が進行したが L T C 4産生および C OX— 2による PGE2の産生も極めて低かつた。
[Π] DM SO分化細胞一 1
[ I ]の非分化細胞を [ I ]と同様の培養条件において培養液中最終濃度 0. 16M DMS O条件下で 48時間培養を継続すると、明確な形態変化は認められず顕著な接着性も示さな いが増殖速度は低下し、 A23187刺激に応じてリン脂質よりァラキドン酸を加水分解す る活性が亢進する細胞に分ィ匕した。 この分ィヒ細胞は T P A活性化処理に対する反応性の亢進 は低く、 L T C4産生の亢進および C OX— 2による P GE 2の産生も極めて低かった。
[m] DM SO分化細胞— 2
[ I ]の非分化細胞を 10 %牛胎仔血清（以下、 FBSと略記する、 Sigma社 F2442) を添 加した RPMI 1640±咅養液中 Tissue Culture Treatedフラスコを用いて 1日以上前培 養後に、培養液中最終濃度 0. 16M DMS〇条件下で細胞密度が 2〜8xl05c e 1 1 s /mLとなるように制御しつつ 96〜 144時間培養を継続すると増殖速度が低下し、接 着性を示すマク口ファージ系細胞に分化した。 この分化細胞は T P A処理に対して速やかに 反応して接着性の極めて強い細胞に形態変化を引き起こし、 LTC4産生および COX— 2 による PGE2産生の亢進が極めて高い等、 炎症細胞モデルとして好ましい特性を示した。
[IV] TP A分ィ匕細胞
[I]の非分化細胞を 10% 83を添加した ？ 1 1640培養液中 Tissue Culture Treatedフラスコを用いて 1日以上前培養後に、培養液中最終濃度 10 nM TP A条件下で 細胞密度が 2. 5 X 105 c e 1 1 sZmLとなるように調製したものを 0. 2mL/穴ず つ 96穴マイクロプレートに、 または 1. OmLZ穴ずつ 24穴マイクロプレートに分注し 48〜72時間培養を継続すると強い接着性を示すマクロファージ系細胞に分ィ匕したが、 P GE2産生の亢進は [ΠΙ]より劣り、 LTC4産生の亢進は見られなかった。 この分化細胞にリ ポ多糖や炎症性サイトカインを加えて更に培養を継続すると顕著な活性ィ匕が見られた。
[V] dBcAMP分化細胞
[ I ]の非分化細胞を 10%FBSを添加した RPMI 1640培養液中 Tissue Culture Treatedフラスコを用いて 1日以上前培養後に、培養液中最終濃度 ImM dBcAMP条件 下で細胞密度が 2. 5 X 105c e 1 1 s ZmLとなるように調製したものを 0 · 2mL/ 穴ずつ 96穴マイクロプレートに、 または 1. OmLノ穴ずつ 24穴マイクロプレートに分 注し 48〜 72時間培養を継続すると やや強い接着性を示す顆粒球系細胞に分化した。 次に本発明に関わる c PLA (2) 活性評価方法を特徴付ける試験例を説明する。
細胞系における蛍光性基質加水分解を指標とした P L A (2) 活性
上記の細胞培養試験例 1 [ I ]〜[！ Q]の非分化および分ィ匕細胞を各々遠心分離により集め、定 量分析試験例 2の方法に従って PL A (2) 活性を測定した。 活性化は必要に応じて測定前に 10 nM TP Aを添加し 1時間培養を継続した。 C a 2+濃度上昇による影響を見る目的では 反応溶液中に最終濃度 1 Mとなるように A 23187の添加区と非添加区を設定した。 例え ば、 各種分化活性ィヒ条件の細胞は第 1表に示すような加水分解活性を示した。 活性化マク口フ ァ一ジ様の形態特性を呈し、 PGE2および LTC4産生が極めて亢進している分ィ匕条件 [ΠΙ]の 分化細胞を T P A処理にて活性化した細胞を用い、 定量分析試験例 2の方法により c P L A (2) 活性を測定した Cell- based Assay系 11および系 12は本発明の生理的な活性型 c P LA (2) 活性の測定方法として適していることが示された。 また、 定量分析試験例 2の方法 による c PL A (2) 活性は、 A23187処理 （Ca2+濃度上昇） には影響されず、 細胞の 分化、 活性化状態に依存することが示された。
第 1表
Figure imgf000013_0001
*TPA¾ttft : + (1 O nMTPA活性化処理 1時間)、 - (T P A活性ィ匕処理なし） " A 23187反応液中添加： + ( 1！丄 M A 23 187添加）、 一 (A 23 187添加なし) ***PGE2/LTC4産生：— «10 n mole/穴）、 土 ( 10 15 nmole/穴）、 + (15 30 n mole/穴）、 ++ (30 100 nnioleZ穴）、 + + + (〉100 nmoleZ穴)
[3H] ァラキドン酸の培養細胞系からの遊離を指檫とした PL. A (2) 活性
上記の細胞培養試験例 1 [ I ] [！ V]の非分ィ匕および分化細胞を、各々遠心分離により集め、 定量分析試験例 3の方法に従って最終濃度 3 Μ Α23187添加後 15分間に遊離される [3Η] ァラキドン酸の放射能を指標として PL A (2) 活性を測定した。 活性化は必要に応 じて測定前に 10 nM TP Aを添加し 1 時間培養を加えることにより行った。 例えば、 各種 分化活性ィヒ条件の細胞は第 2表に示すような加水分解活性を示した。 定量分析試験例 3による 活性測定は、 上記の測定方法と同様の分化条件 [m]の分化細胞を TP A処理にて活性ィヒした細 胞を用いる Cell- based Assay系 12— 2には本発明の生理的な活性型 P LA (2) 活性の寄 与する測定方法として使用できることが示された。 また、 従来多く使用されている分化条件 [Π]の分化細胞を TP Aによる活性化処理をしない細胞を用いる Cell- based Assay系 6— 2 は本発明の生理的な活性型と類似性の低い、 人為的な偽の活性型 PL A (2) 活性を反映する 測定方法として適していることが示された。 第 2表
Figure imgf000014_0001
*TP A活性化： + (10 nMTPA活性化処理 1時間)、 - (TP A活性化処理なし） "PGE2ZLTC4産生：一 «10 nmole/穴）、 士 ( 10〜 15 nmole/穴）、 + (15' 30nmole/穴)、 ++ (30〜 100 nmole/穴）、 + + + (> 100 nmole/穴） 試験化合物と in F'TO抗炎症活性
本発明にかかわる in νο抗炎症活性との整合性がある、生理的な活性型ノ人為的な偽の活 性型 c PL A (2) 阻害活性の選択性について検討する目的で、 WO 01/072723お よび WO 03/000668に収載の化合物より典型的な例となる 3化合物を選び、 また、 公知の PLA (2) 阻害剤並びに抗炎症活性化合物についても購入或いは合成することにより 入手した。 これらの化合物を第 3表に示す。 また、 可能な化合物については薬理試験例 1の試 験方法により ίΰ 抗炎症活性を評価した。 更に 下流のァラキドン酸カスケードの酵素額 への作用に基づく in Fiw抗炎症活性でないことを確認する目的で、 必要に応じて薬理試験例 2の試験方法により薬理活性を評価した。 In Wra薬理試験の結果を第 4表に示す。
第 3表—
Figure imgf000015_0001
第 ΰ 2¾— 2
Figure imgf000016_0001
第 4表
Figure imgf000017_0001
*N.D. ：未試験 化合物による培養細胞系における PL A (2) 阻害活性
被験化合物は DM S 0にて溶解し各試験における反応液中の DM S Oの最終濃度が 0. 1% 以下となるように DMSO或いは各反応 Buffer にて希釈した。 培養細胞を用いた各試験の反 応を開始する 10〜15分前に化合物溶液を添加し、 37 °Cにて培養した。 陽性対照としては Arachidonyl Trif luoromethyl Ketone (以下、 AACOC F 3と略記する） を用いた。 また， 比較の目的で V_ i PLA (2) の阻害剤である Bromoenol lactone (以下、 BELと略記す る） を用いた。 阻害剤の活性は阻害剤が加えられていない対照区 （以下、 対照区と略記する） のデ一夕との対比として、 以下の計算式により算出した。
阻害率 ( ) = (対照区データ 一 阻害剤処理区データ /対照区データ） X 100 各阻害剤について複数の濃度処理の試験を行い、対数濃度を使用して各濃度における阻害率
(%) をグラフ上にプロットし、 50%阻害濃度 (I C50) 値を求めた。
本発明に関わる生理的な活性型 c PL A (2) 阻害の評価系としては、 上記の蛍光基質の加 水分解活性を定量測定する Cel卜 based Assay系 12を用いて各ィ匕合物の阻害活性を検討した。 従来の生理的な活性型とは類似性が低い、 人為的な偽の活性型 cPLA (2) 阻害の評価系と しては、 上記の [3H] ァラキドン酸の遊離放射能を定量測定する Cel卜 based Assay系 6— 2 を行った。 これらとの比較の目的で、 細胞培養条件を Cell-based Assay系 12と同一として [3H] ァラキドン酸の遊離放射能を定量測定する Cel卜 based Assay系 12— 2についても検 討を加えた。 各々の試験系において 50%阻害濃度 I C5Q (fiM) を算出し、 いずれかの生理 的な酵素活性を反映する試験系における阻害剤感受性に対する、 人為的な偽の酵素活性を反映 する試験系における阻害剤感受性の比を算出し、 選択性指標とした。
例えば、 薬理試験例 1により抗炎症活性が認められる、 或いは、 in Wra抗炎症活性につい て報告されている PL A (2) P且害剤および/または抗炎症活性化合物は、 第 5表に示すよう に、 使用する細胞の状態および試験法により PLA (2) 阻害活性が異なることが示された。 即ち、 従来の人為的な酵素活性を反映する活性評価方法における化合物による阻害活性は、 そ の in 'TO抗炎症活性との関連は認められなかった。 生理的な活性型酵素活性を反映する活性 評価方法における阻害活性は従来の方法よりは改善されているがノイズも含まれ、 異なる評価 方法の間の選択性を算出することにより、 より有利に in vivo抗炎症活性化合物をスクリ一二 ングできることが示された。
第 5表
Figure imgf000018_0001
ΦΝ. D. ：未試験 産業上の利用可能性
以上の試験結果等により、抗炎症活性を示すヘテロ環誘導体化合物は生理的なノ人為的な偽 の活性型 c PL A (2) 活性を反映する評価方法において 10倍以上の感受性差を示し、 本発 明の評価方法は c PL A (2) 活性を反映する優れた評価方法である。 本発明は坑炎症との相 関により c PLA (2) 活性をみたが、 cPLA (2) に起因する種々の症状に関する評価方 法に適用できる。

Claims

請求の範囲
1. (a) 生理的な活性型構造機能を反映する] VA—細胞質型ホスホリパーゼ A (2) の活性 評価方法における阻害活性指標を得る工程、
(b) 生理的な活性型構造機能との類似性が低い、 人為的な偽の活性型構造機能を反映す る IVA—細胞質型ホスホリパーゼ A (2) の活性評価方法における阻害活性指標を得る工程、
(c) (a) と （b) との対比により算出される選択性指標を得る工程、
を含むことを特徴とする、 生理的な活性型] VA—細胞質型ホスホリパーゼ A (2) 活性評価方 法。
2. (a) 生理的な活性型構造機能を反映する] V A—細胞質型ホスホリパーゼ A (2) の活性 評価方法における阻害活性指標を得る工程、
(b) 生理的な活性型構造機能との類似性が低い、 人為的な偽の活性型構造機能を反映す る 1VA—細胞質型ホスホリパーゼ A (2) の活性評価方法における阻害活性指標を得る工程、
(c) (a) と （b) との対比により算出される選択性指標を得る工程、
を含むことを特徴とする評価方法における選択性指標の比が 10倍以上である請求項 1記載 の評価方法。
3. (a) の工程において PGE2および/または LTC4および/または PAFの産生が 10 倍以上充進している、 および/または活性酸素産生が 10倍以上亢進している、 および zまた は活性ィヒマクロファージ様の形態反応を呈するヒト白血病細胞株 U 937分化培養細胞を用 いる請求項 1または 2記載の評価方法。
4. (b) の工程において脂質メディエーターの産生の亢進が 10倍未満である細胞を使用す る請求項 1〜 3記載の活性評価方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115166172A (zh) * 2022-07-04 2022-10-11 中南民族大学 中药鲜用评价方法、装置、设备及存储介质

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0591874A (ja) * 1990-08-24 1993-04-16 Eli Lilly & Co ヒトサイトゾルホスホリパーゼａ２
WO2001072723A1 (en) * 2000-03-28 2001-10-04 Nippon Soda Co.,Ltd. Oxa(thia)zolidine derivative and anti-inflammatory drug
WO2003000668A1 (fr) * 2001-06-25 2003-01-03 Nippon Soda Co., Ltd. Composes oxa(thia)zolidine, processus de preparation de ceux-ci et agents anti-inflammatoires.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0591874A (ja) * 1990-08-24 1993-04-16 Eli Lilly & Co ヒトサイトゾルホスホリパーゼａ２
WO2001072723A1 (en) * 2000-03-28 2001-10-04 Nippon Soda Co.,Ltd. Oxa(thia)zolidine derivative and anti-inflammatory drug
WO2003000668A1 (fr) * 2001-06-25 2003-01-03 Nippon Soda Co., Ltd. Composes oxa(thia)zolidine, processus de preparation de ceux-ci et agents anti-inflammatoires.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WANG H. Q. ET AL: "Protein Kinase C-alpha Coordinately Regulates Cytosolic Phospholipase A2 Activity and the Expression of Cyclooxygenase-2 through Different Mechanisms in Mouse Keratinocytes", MOLECULAR PHARMACOLOGY, vol. 59, no. 4, 2001, pages 860 - 866, XP002979902 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115166172A (zh) * 2022-07-04 2022-10-11 中南民族大学 中药鲜用评价方法、装置、设备及存储介质
CN115166172B (zh) * 2022-07-04 2024-11-05 中南民族大学 中药鲜用评价方法、装置、设备及存储介质

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