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WO2004061513A1 - Konfokales 4-pi-mikroskop und verfahren zur konfokalen 4-pi-mikroskopie - Google Patents

Konfokales 4-pi-mikroskop und verfahren zur konfokalen 4-pi-mikroskopie Download PDF

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Publication number
WO2004061513A1
WO2004061513A1 PCT/EP2004/000029 EP2004000029W WO2004061513A1 WO 2004061513 A1 WO2004061513 A1 WO 2004061513A1 EP 2004000029 W EP2004000029 W EP 2004000029W WO 2004061513 A1 WO2004061513 A1 WO 2004061513A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
detection
illumination
confocal
sample
excitation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2004/000029
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jörg Bewersdorf
Hilmar Gugel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leica Microsystems CMS GmbH
Original Assignee
Leica Microsystems Heidelberg GmbH
Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Leica Microsystems CMS GmbH filed Critical Leica Microsystems Heidelberg GmbH
Priority to US10/541,700 priority Critical patent/US7333207B2/en
Publication of WO2004061513A1 publication Critical patent/WO2004061513A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0056—Optical details of the image generation based on optical coherence, e.g. phase-contrast arrangements, interference arrangements
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    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence

Definitions

  • the invention relates to methods for confocal 4-pi microscopy.
  • the invention also relates to a confocal 4-pi microscope with a light source, the illuminating light, the at least one
  • Has illumination wavelength generated and which can be directed from two sides through a lens to a sample, whereby a standing illumination wave with an illumination main maximum and with illumination secondary maxima is generated by interference of the illumination light in the sample and with a detector for detecting detection light proceeding from the sample and passing through the two objectives and having at least one detection wavelength.
  • a sample is illuminated with a light beam in order to observe the reflection or fluorescent light emitted by the sample.
  • the focus of an illuminating light beam is moved in a plane of the object with the aid of a controllable beam deflection device, generally by tilting two mirrors, the deflection axes usually being perpendicular to one another, so that one mirror deflects in the x direction and the other in the y direction.
  • the mirrors are tilted, for example, with the help of galvanometer control elements.
  • the power of the light coming from the object depends on the position of the scanning beam
  • control elements are usually equipped with sensors for determining the current mirror position.
  • a confocal scanning microscope generally comprises a light source, focusing optics with which the light from the source is focused on a pinhole - the so-called excitation diaphragm - a beam splitter, a beam deflection device for beam control, microscope optics, a detection diaphragm and the detectors for detecting the detection - or fluorescent light.
  • the illuminating light is coupled in via a beam splitter.
  • the detection light coming from the object passes back to the beam splitter via the beam deflection device, passes it, and is then focused on the detection diaphragm behind which the detectors are located.
  • Detection light that does not come directly from the focus region takes a different light path and does not pass through the detection diaphragm, so that point information is obtained which leads to a three-dimensional image by sequential scanning of the object.
  • a three-dimensional image is usually achieved by recording image data in layers, the path of the scanning light beam ideally describing a meander on or in the object.
  • the sample table or the lens is moved after scanning a layer and thus the next layer to be scanned is brought into the focal plane of the lens.
  • the lighting system incoming light is split into two partial beams, which simultaneously illuminate the sample in opposite directions by means of two mirror-symmetrically arranged lenses.
  • the two lenses are arranged on different sides of the object plane common to them.
  • This interferometric illumination forms an interference pattern in the object point which, in the case of constructive interference, has one main maximum and several secondary maxima.
  • the secondary maxima are generally arranged along the optical axis.
  • the secondary maxima produce disturbing double images during image acquisition, which must be eliminated using mathematical image reconstruction methods. These processes work the better, the lower the secondary maxima are. It has been shown in practice that an artifact-free reconstruction can only be carried out if the amplitude of the secondary maxima is a maximum of 50% of the amplitude of the main maximum. However, the 1-photon excitation preferred in confocal microscopy generates secondary maxima of approx. 65% in a standard 4-pi microscope and is therefore not usable for structure-resolving images.
  • a method and a device for illuminating a transparent object, in particular for use in double-confocal scanning microscopy, is known from German Offenlegungsschrift DE 100 10 154 A1, for illuminating one point of the object two from opposite directions (light waves focused on the point from a coherent light source) interfere with an illumination pattern, and in order to avoid the problems of the reconstruction methods, is characterized in that at least two additional, coherent light waves that run towards one another are superimposed in order to minimize the secondary maxima of the illumination pattern.
  • the double confocal scanning microscope is characterized in that at least one optical component acting on the illumination and / or detection beam path is provided and configured in such a way that it has the amplitude and / or the phase and / or the polarization of the light influenced and thereby the characteristics of the double confocal lighting and / or detection can be changed.
  • the invention is therefore based on the object of proposing a method for confocal 4-pi microscopy which simply and efficiently avoids the image artifacts caused by secondary maxima.
  • the task is solved by a method which is characterized by the following steps: • Coherent illumination of a sample from two sides by one
  • illuminating light which has at least one illuminating wavelength, whereby a standing illuminating wave with a main illuminating maximum and with secondary illuminating maxima is generated by interference of the illuminating light in the sample and
  • This object is achieved by a confocal 4-pi microscope, which is characterized in that the detection light interferes and a detection pattern with a main detection maximum and with secondary detection maxima can be generated in the sample, the illumination secondary maxima and the detection Secondary maxima are located in different places.
  • the invention has the advantage that improved image quality can be achieved in confocal 4-pi microscopy. Because the detection light interferes and generates a detection pattern in the sample with a main detection maximum, with secondary detection maxima and with detection minima, the secondary lighting maxima and the detection minimums overlap at least partially - otherwise the secondary lighting maxima and the Detection secondary maxima not at different locations - the areas of the sample excited by the secondary illumination maxima are not detected or at least with reduced sensitivity.
  • the coherent illumination of two opposing lenses generates a standing wave in the common focus of the lenses.
  • This standing wave axially modulates the point spread function (PSF) of the conventional confocal microscope and thereby generates several maxima with a 4 to 7 times reduced half-value width.
  • PSF point spread function
  • the axial resolution is correspondingly increased by this factor compared to a conventional confocal scanning microscope when using a lens with the highest numerical aperture. If both the excitation light and the detected light interfere with each other via both lenses, new options are available to intervene in the PSF design. According to the invention, it was recognized that the distance between the secondary maxima and the main maximum is proportional to the respective wavelength.
  • the secondary maxima of the illumination and that of the detection PSF overlap only slightly.
  • the effective PSF that results from the product of the two PSFs thus has reduced secondary maxima.
  • Detection wavelength for example approx. 50% above that of the illumination wavelength
  • the secondary maximum of the detection falls into the second minimum of the illumination PSF and is thereby suppressed massively.
  • the secondary maxima can be reduced to approx. 30% of the main maximum height.
  • the optical transfer function (OTF) of the 4Pi confocal microscope with 1-photon excitation has more pronounced minima at the critical spatial frequency k c , which lies between the main maximum and the first secondary maxima, than the OTFs of the 4-pi confocal 2 photons techniques.
  • the signal in particular must be amplified at these spatial frequencies. If the signal-to-noise ratio is poor, these areas of the spatial frequency spectrum are particularly susceptible to generating disruptive artifacts during the reconstruction, which make the image interpretation difficult or impossible.
  • the spatial position of the illumination secondary maxima and / or the detection secondary maxima is determined and / or changed by inserting pupil filters in at least one pupil plane of the objectives or in at least one plane optically corresponding to the pupil plane.
  • the 4-Pi-PSF can be changed by using pupil filters.
  • secondary maxima can be shifted somewhat in this way.
  • Pupil filters are particularly advantageous with 2-photon excitation. Also in the case of the 1-photon excitation, especially in combination with the measure of selecting a ratio of illumination wavelength to detection wavelength in the range from 0.5 to 0.9, in particular in the range from 0.7 to 0.8, in particular at 0.75 particularly good suppression of the interference effects by the secondary lighting maxima.
  • the OTF of a microscope can be optimized by changing the pupil function.
  • the OTF tends to be smoothed.
  • the question is, which are the optimal values of the pupil function are, and whether other, possibly not so obvious functions do not deliver even better results.
  • a point at a distance p from the center of the PSF can be made to be part of the nth diffraction maximum of one ring, but also to belong to the n + (2m + 1) th diffraction maximum of the other ring ,
  • the amplitudes of the two diffraction maxima are opposed to one another and, by suitable choice of ring width or amplitude, the electromagnetic field emitted from this point can be completely extinguished.
  • Toraldo filters theoretically very sharp field distributions can be created around the origin, the ring-shaped environment of which can be reduced to almost any value in a freely selectable area.
  • the signal from the center also drops drastically. Areas outside of the optimized area, on the other hand, are sometimes strongly diffracted into the interior and can easily exceed the signal in the center if the sample is appropriately distributed. This quickly reaches an experimentally realizable limit.
  • phase-delaying elements such as phase plates, in particular ⁇ / 2 plates, are used for this.
  • the principle can easily be extended to the third dimension at the expense of the two lateral dimensions. 11th In confocal microscopy, an application is appropriate in that, for example, the bright outer areas of the excitation PSF can be suppressed with Toraldo filters using the confocal detection PSF.
  • Toraldo filters using the confocal detection PSF.
  • the Toraldo filter should not primarily be used to increase the resolution. Instead, the aim is to reduce the secondary maxima that occur in the PSF in order to raise the weak areas of the OTF by the critical frequency k c .
  • the procedure is analogous. However, it can be operated on a relatively restricted axial area, which means that the negative side effects are not so drastic.
  • the sample is preferably marked with at least one luminescent dye, in particular with a fluorescent dye.
  • the fluorescent dye is selected such that a ratio of the illumination wavelength to the detection wavelength can be set in the range from 0.5 to 0.9, in particular in the range from 0.6 to 0.8, in particular at 0.75.
  • at least one detection wavelength can be selected with reference to the confocal 4-pi microscope and the detector can be set to the selected detection wavelength.
  • the detector is designed as a multiband detector, since it can be used in a particularly flexible and advantageous manner with respect to the method and microscope according to the invention. It is also provided that the at least one preferably free illumination wavelength can be selected and the light source can be adjusted to the selected illumination wavelength.
  • the fluorescent dye preferably has an excitation and an emission range, the illumination wavelength being in the short-wave portion of the excitation range and / or the detection wavelength being in the long-wave portion of the emission range.
  • the Stokes shift range accessible in practice is for some dyes very limited.
  • Some green-emitting dyes have a difference between the excitation and emission maximum of approx. 20 - 30 nm.
  • the spectral bandwidth for excitation and in the fluorescence spectrum is approx. 50 nm each. If the majority of the short-wave fluorescent light is dispensed with and the dye is also used in the excitation spectrum that is difficult to excite, the shifted blue shift enables a Stokes shift of approx to reach.
  • Red dyes typically have a larger Stokes shift. It is also possible to use the largest possible anti-Stokes shift, which unfortunately sometimes fails due to the small overlap area of the excitation and emission spectra.
  • Some dyes are available that have an acceptable Stokes shift or a very broad-band emission spectrum even when excited in the blue-green range.
  • the loss of efficiency when using a small section of the fluorescence spectrum can usually be tolerated, in particular if it is compared with the two-photon excitation which is also possible according to the invention and which has a lower yield than photocaleaching than confocal microscopy with 1-photon excitation.
  • the light source is preferably designed as a pulse laser.
  • the illuminating light has a further illuminating wavelength, the excitation taking place via a virtual or a real intermediate level.
  • the excitation takes place via a higher excitation level, in particular via an S 0 -S 2 transition.
  • This is an alternative that is not based on a restriction of the fluorescence spectrum. There is usually a radiation-free relaxation transition from S 2 to Sr state before fluorescence. This creates a very large Stokes shift. The applicability of this method depends on the extent to which bleaching is increased by this relatively high-energy stimulation.
  • the anti-Stokes area of a dye can possibly be caused by an artificial lifting of the molecules from the vibrational ground state of the electronic ground state S 0 can be used more easily in a higher vibration state.
  • the dyes are brought into the S ⁇ state from this excited state and if, according to the invention, only the short-wave fluorescent light from the decay is as low as possible, the wavelength of the fluorescent light is significantly shorter than that of the excitation light.
  • These vibrational states can be excited by IR radiation.
  • the excitation of the sample includes a Förster resonant energy transfer (FRET) within the sample.
  • FRET Förster resonant energy transfer
  • Coupled dyes are used for this purpose, in which a high-energy excitable dye (the donor) releases the excitation energy via resonant energy transfer to a lower-energy dye (the acceptor), which then fluoresces in the strongly red-shifted region.
  • the use of a dye chain using multiple coupling is also possible.
  • Forester energy transfer (FRET) between two dye molecules is used to determine the distance between these molecules in meanwhile widespread FRET experiments. Transfer efficiencies of almost 100% are achieved in practice. In contrast to these experiments, a permanent coupling is necessary in the 4-Pi case. In principle, this is possible using an antibody that specifically binds these two dye molecules.
  • the confocal 4-pi microscope preferably has a detection pinhole with an opening diameter smaller than 1 Airy disc, in particular an opening diameter of 0.7 to 0.8 Airy discs.
  • the secondary maxima can be reduced according to the invention and, in turn, the requirements for the Stokes shift of the fluorescent dye can be reduced.
  • the secondary maximum height in the confocal 4 ⁇ microscope depends relatively strongly on this size.
  • the inventive method is also l 5 M and wave field Microscopy applicable.
  • 1 shows a confocal 4-pi microscope 1 with a light source 3 that emits illuminating light 5.
  • the illuminating light 5 is focused with the lens 7 onto the illumination pinhole 9, passes through it and then passes through the first optics 11, the second optics 13 and a pupil filter 15 which is arranged between the first optics 11 and the second optics 13.
  • a beam splitter 17 which is designed as a dichroic beam splitter, the illuminating light 5 is reflected through the optics 19 to a beam deflection device 21, which contains a gimbal-mounted scanning mirror 23.
  • the scanning mirror 23 of the beam deflection device 21 is pivotally mounted about two axes, so that the illuminating light can be deflected or scanned by suitable pivoting of the scanning mirror 23.
  • the illuminating light 5 passes through the scanning optics 25 and through the tube optics 27 to a further beam splitter 29 which divides the illuminating light into a first illuminating light partial beam 31 and a second illuminating light partial beam 33.
  • the first illuminating light partial beam 31 passes through the first Deflecting mirror 35 to the first objective 37, which has a first pupil 39 and which focuses the first illuminating light partial beam 31 onto the sample 41.
  • the second illuminating light beam 33 passes via the second deflecting mirror 43 to the second objective 45, which has a second pupil 47 and which likewise focuses the second illuminating light beam 31 onto the sample 41, which interferes with the first illuminating light beam 31.
  • the pupil filter 15 is located in a plane that visually corresponds to the pupil planes in which the pupils 39, 47 are located.
  • Detection light emanating from the sample 41 passes in the form of a first partial detection light beam 49 through the first objective 37 and over and the first deflecting mirror 35 to the further beam splitter 29 and there interferes with a second partial detection light beam 51 which passes through the second objective 45 and over and the second Deflecting mirror 43 arrives at the further beam splitter 29.
  • the interfering detection light 53 is guided via the tube optics 27, the scanning optics 25 and the beam deflection device 21 to the beam splitter 17, passes it and, after passing through the detection optics 55, passes through the detection pinhole 57, which has an opening diameter of 0.7 Airy discs, to which Detector 59 which includes a photomultiplier.
  • the pupil filter 15 is designed as a zone filter with 3 separate phase rings.
  • the wavelength of the illuminating light is 488 nm. That of the detection light is 688 nm.
  • a further pupil filter 71 is provided in the beam path of the detection light 53.
  • the 2 shows z responses of the 4Pi confocal microscope with single-photon excitation and with a pupil filter 15.
  • the pupil filter 15 is located in a plane that corresponds optically to the pupil planes in which the pupils 39, 47 are located.
  • the z-responses for pupil filters with different zone numbers are plotted.
  • the filter shown at the bottom left is preferably used because it also has low z-responses in the edge regions. However, the edge areas play no role in very thin samples, since these lie outside the sample.
  • the profiles for phase ring filters are shown in the Excitation beam path with 1, 2 and 3 separate phase rings and the reference case without a pupil filter. The area highlighted in gray lies outside the optimized zone.
  • FIG. 3 shows theoretical OTFs and PSFs of the 4Pi confocal microscope as a function of the Stokes shift.
  • the z-responses and the profiles along the kz axis of the OTF are plotted against the detection wavelength.
  • the two cases of a detection pinhole of 0 (punctiform) and 1 Airy disk diameter are shown in each case.
  • the specified values for the relative Stokes shift also relate to this wavelength.
  • the contour lines are 50% (white), 40%, 30%, 20%, 10% (dashed) and 5% (dotted; OTFs only) of the maximum values.
  • Fig. 4 shows spectra of the typical fluorescent dye fluorescein and the dye FM4-64 with an exceptionally large Stokes shift. The emission spectra are shown in black, the excitation and absorption spectra in gray.
  • FIG. 5 schematically shows the overlap of the detection minima 61 and the illumination secondary maxima 63 according to the invention.
  • the main illumination maximum 65 and the detection main maximum 67 are also shown.
  • the z response results from the product of the first graph 69 for the Illumination PSF and the second graph 73 for the detection PSF.
  • Types A and C in 1 and 2 photon excitation The values are relative to Height of the respective main maximum specified.
  • the reference curve for 4-PI microscopy without a pupil filter is shown, the curve when the filter is used only in the excitation and the behavior with filters in the excitation and detection beam paths.
  • Typical Stokes shifts are marked by the dashed verticals. Lenses with a half lens opening angle of 1.1 rad and an infinitesimally small detection pinhole were used for the calculation.
  • Main detection maximum first graph further pupil filter second graph

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Abstract

Ein Verfahren zur konfokalen 4-7c-Mikroskopie ist gekennzeichnet durch das kohärente Beleuchten einer Probe von zwei Seiten durch je ein Objektiv mit Beleuchtungslicht, das zumindest eine Beleuchtungswellenlänge aufweist, wobei durch Interferenz des Beleuchtungslichts in der Probe eine stehende Beleuchtungswelle mit einem Beleuchtungs-Hauptmaximum und mit Beleuchtungs-Nebenmaxima erzeugt wird und durch das Detektieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes, das zumindest eine Detektionswellenlänge aufweist, durch die beiden Objektive hindurch, wobei das Detektionslicht zur Interferenz gebracht wird und dadurch in der Probe ein Detektionsmuster mit einem Detektions-Hauptmaximum, mit Detektions-Nebenmaxima und mit Detektions-Minima derart erzeugt wird, dass die Beleuchtungs-Nebenmaxima und die Detektions-Minima zumindest teilweise überlappen.

Description

Konfokales 4-Pi-Mikroskop und Verfahren zur konfokalen 4-Pi-
Mikroskopie
Die Erfindung betrifft Verfahren zur konfokalen 4-Pi-Mikroskopie.
Die Erfindung betrifft außerdem ein konfokales 4-Pi-Mikroskop mit einer Lichtquelle, die Beleuchtungslicht, das zumindest eine
Beleuchtungswellenlänge aufweist, erzeugt, und das von zwei Seiten durch je ein Objektiv auf eine Probe richtbar ist, wobei durch Interferenz des Beleuchtungslichts in der Probe eine stehende Beleuchtungswelle mit einem Beleuchtungs-Hauptmaximum und mit Beleuchtungs-Nebenmaxima erzeugt wird und mit einem Detektor zum Detektieren von von der Probe ausgehendem durch die beiden Objektive hindurch gehendem Detektionslicht, das zumindest eine Detektionswellenlänge aufweist.
In der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles
BESTATIGUNGSKOPIE gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet. Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Detektionslicht, wie Fluoreszenzoder Reflexionslicht oder auch CARS-Licht, gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatenaufnahme erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt idealer Weise einen Mäander beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y- Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position, diese Zeile in negative x-Richtung abtasten usw.). Um eine schichtweise Bilddatenaufnahme zu ermöglichen, wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht verschoben und so die nächste abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
Eine Auflösungssteigerung in Richtung der optischen Achse lässt sich, wie in der Europäischen Patentschrift EP 0 491 289 mit dem Titel: „Doppelkonfokales Rastermikroskop" beschrieben ist, durch eine
Doppelobjektivanordnung erreichen. Das vom Beleuchtungssystem kommende Licht wird in zwei Teilstrahlen aufgespalten, die die Probe einander entgegenlaufend durch zwei spiegelsymmetrisch angeordnete Objektive gleichzeitig beleuchten. Die beiden Objektive sind auf verschiedenen Seiten der ihnen gemeinsamen Objektebene angeordnet. Im Objektpunkt bildet sich durch diese interferometrische Beleuchtung ein Interferenzmuster aus, dass bei konstruktiver Interferenz ein Hauptmaximum und mehrere Nebenmaxima aufweist. Die Nebenmaxima sind hierbei im Allgemeinen entlang der optischen Achse angeordnet. Mit einem doppelkonfokalen Rastermikroskop kann im Vergleich zum konventionellen Rastermikroskop durch die interferometrische Beleuchtung eine erhöhte axiale Auflösung erzielt werden.
Die Nebenmaxima erzeugen bei der Bildaufnahme störende Doppelbilder, die über mathematische Bildrekonstruktionsverfahren beseitigt werden müssen. Diese Verfahren funktionieren umso besser, umso niedriger die Nebenmaxima sind. In der Praxis hat sich gezeigt, dass nur dann eine artefaktfreie Rekonstruktion vorgenommen werden kann, wenn die Amplitude der Nebenmaxima maximal 50% der Amplitude des Hauptmaximums beträgt. Die in der Konfokalmikroskopie bevorzugte 1 -Photonenanregung erzeugt aber in einem Standard-4-Pi-Mikroskop Nebenmaxima von ca. 65% Höhe und ist daher nicht für strukturauflösende Aufnahmen nutzbar.
Aus der Deutschen Offenlegungsschrift DE 100 10 154 A1 ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Beleuchtung eines transparenten Objekts, insbesondere zur Anwendung in der doppelkonfokalen Rastermikroskopie bekannt, wobei zur Beleuchtung eines Punkts des Objekts zwei aus entgegengesetzten Richtungen (auf den Punkt fokussierte Lichtwellen einer kohärenten Lichtquelle zu einem Beleuchtungsmuster interferieren, und ist zur ursächlich Vermeidung der Probleme der Rekonstruktionsverfahren dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei zusätzliche, aufeinander zu laufende, kohärente Lichtwellen überlagert werden, um die Nebenmaxima des Beleuchtungsmusters zu minimieren.
Aus der Deutschen Offenlegungsschrift DE 101 07 095 A1 ist ein doppelkonfokales Rastermikroskop mit einem Beleuchtungsstrahlengang einer Lichtquelle und einem Detektionsstrahlengang eines Detektors bekannt. Das doppelkonfokale Rastermikroskop ist zur ursächlichen Vermeidung der Probleme der Rekonstruktionsmethoden dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein auf den Beleuchtungs- und/oder Detektionsstrahlengang wirkendes optisches Bauteil vorgesehen und derart ausgestaltet ist, dass es die Amplitude und/oder die Phase und/oder die Polarisation des Lichts beeinflusst und hierdurch die Charakteristik der doppelkonfokalen Beleuchtung und/oder Detektion veränderbar ist.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur konfokalen 4-Pi-Mikroskopie vorzuschlagen, das einfach und effizient die durch Nebenmaxima hervorgerufene Bildartefakte vermeidet.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, dass durch folgende Schritte gekennzeichnet ist: • Kohärentes Beleuchten einer Probe von zwei Seiten durch je ein
Objektiv mit Beleuchtungslicht, das zumindest eine Beleuchtungswellenlänge aufweist, wobei durch Interferenz des Beleuchtungslichts in der Probe eine stehende Beleuchtungswelle mit einem Beleuchtungs-Hauptmaximum und mit Beleuchtungs- Nebenmaxima erzeugt wird und
• Detektieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes, das zumindest eine Detektionswellenlänge aufweist, durch die beiden Objektive hindurch, wobei das Detektionslicht zur Interferenz gebracht wird und dadurch in der Probe ein Detektionsmuster mit einem Detektions-Hauptmaximum und mit Detektions-Nebenmaxima derart erzeugt wird, dass die Beleuchtungs-Nebenmaxima und die Detektions-Nebenmaxima sich an unterschiedlichen Orten befinden.
Es ist außerdem eine Aufgabe der Erfindung ein konfokales 4-Pi-Mikroskop anzugeben, bei dem effizient die durch Nebenmaxima hervorgerufenen Bildartefakte vermieden sind. Diese Aufgabe wird durch ein konfokales 4-Pi-Mikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Detektionslicht interferiert und in der Probe ein Detektionsmuster mit einem Detektions-Hauptmaximum und mit Detektions- Nebenmaxima erzeugbar ist, wobei sich die Beleuchtungs-Nebenmaxima und die Detektions-Nebenmaxima sich an unterschiedlichen Orten befinden.
Die Erfindung hat den Vorteil, dass eine verbesserte Bildqualität in der konfokalen 4-Pi-Mikroskopie erzielbar ist. Dadurch dass das Detektionslicht interferiert und in der Probe ein Detektionsmuster mit einem Detektions- Hauptmaximum, mit Detektions-Nebenmaxima und mit Detektions-Minima erzeugt, wobei die Beleuchtungs-Nebenmaxima und die Detektions-Minima zumindest teilweise überlappen - sonst lägen die Beleuchtungs- Nebenmaxima und die Detektions-Nebenmaxima nicht an unterschiedlichen Orten -, werden die durch die Beleuchtungsnebenmaxima angeregten Bereiche der Probe nicht oder zumindest mit reduzierter Empfindlichkeit detektiert.
In der 4-Pi-Mikroskopie wird durch die kohärente Beleuchtung zweier einander gegenüberstehender Objektive eine stehende Welle im gemeinsamen Fokus der Objektive erzeugt. Diese stehende Welle moduliert die Punktbildfunktion (PSF) des gewöhnlichen konfokalen Mikroskops axial und erzeugt dadurch mehrere Maxima mit einer 4- bis 7-fach verringerten Halbwertsbreite. Dadurch ist die axiale Auflösung um diesen Faktor entsprechend erhöht verglichen mit einem gewöhnlichen konfokalen Laserrastermikroskop bei Verwendung eines Objektivs höchster numerischer Apertur. Wenn nun sowohl das Anregungslicht als auch das detektierte Licht über beide Objektive jeweils miteinander interferiert, erhält man neue Möglichkeiten, in die PSF-Gestaltung einzugreifen. Erfindungsgemäß wurde erkannt, dass der Abstand der Nebenmaxima zum Hauptmaximum zur jeweiligen Wellenlänge proportional ist. Beispielsweise durch die Verwendung von möglichst unterschiedlichen Wellenlängen in Detektion und Beleuchtung kann erfindungsgemäß erreicht werden, dass die Nebenmaxima der Beleuchtungs- und die der Detektions- PSF nur geringfügig überlappen. Die effektive PSF, die sich aus dem Produkt der beiden PSFs ergibt, besitzt dadurch gesenkte Nebenmaxima. Liegt die Detektionswellenlänge z.B. ca. 50% über der der Beleuchtungswellenlänge, fällt das Nebenmaximum der Detektion in das zweiten Minimum der Beleuchtungs-PSF und wird dadurch massiv unterdrückt. Die Nebenmaxima lassen sich dadurch in der praktischen Anwendung auf ca. 30% der Hauptmaximumshöhe senken.
Die Optische-Tranfer-Funktion (OTF) des 4Pi-konfokalen Mikroskops bei 1- Photonen-Anregung besitzt ausgeprägtere Minima bei der kritischen Raumfrequenz kc, die zwischen dem Hauptmaximum und den ersten Nebenmaxima liegt, als die OTFs der 4-Pi-konfokalen 2-Photonen-Techniken. Bei der meist erforderlichen Bildrestaurierung muss insbesondere das Signal bei diesen Raumfrequenzen verstärkt werden. Bei schlechtem Signal-zuRausch-Verhältnis sind daher diese Bereiche des Raumfrequenzspektrums bei der Rekonstruktion besonders anfällig, störende Artefakte zu erzeugen, die die Bildinterpretation schwierig bis unmöglich machen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird durch Einfügen von Pupillenfiltern in zumindest eine Pupillenebene der Objektive oder in zumindest eine optisch zu der Pupillenebene korrespondierenden Ebene die räumliche Lage der Beleuchtungs-Nebenmaxima und/oder der Detektions-Nebenmaxima festgelegt und/oder verändert. Durch den Einsatz von Pupillenfiltern kann die 4-Pi-PSF verändert werden. Insbesondere können auf diese Weise Nebenmaxima etwas verschoben werden. Pupillenfilter sind insbesondere bei 2-Photonenanregung von Vorteil. Auch bei der 1 -Photonenanregung führen insbesondere in Kombination mit der Maßnahme des Auswählens eines Verhältnis von Beleuchtungswellenlänge zu Detektionswellenlänge im Bereich von 0,5 bis 0,9, insbesondere im Bereich von 0,7 bis 0,8, insbesondere bei 0,75 zu besonders guter Unterdrückung der Störeffekte durch die Beleuchtungs-Nebenmaxima.
Die OTF eines Mikroskops kann durch eine Veränderung der Pupillenfunktion optimiert werden. Durch Betonung der Bereiche mit extremen kz-Werten, das sind der äußerste Ring sowie die Mitte der Pupille, wird tendenziell die OTF geglättet. Die Frage ist, welches die optimalen Werte der Pupillenfunktion sind, und ob andere, evtl. nicht so offensichtliche Funktionen nicht noch bessere Ergebnisse liefern.
Das Prinzip strukturierter Pupillenfunktionen zur Auflösungserhöhung wurde schon Anfang der 50-er Jahre von G. Toraldo di Francia in der Hellfeld- Mikroskopie verfolgt. Den Filter-Optimierungsprozess kann man sich im Ortsraum so vorstellen, dass man die Apertur des Objektivs in konzentrische Ringe aufteilt. Jeder der Ringe erzeugt entsprechend seines Radius unterschiedliche laterale Raumfrequenzen in der Fokusebene. Durch geeignete Kombination zweier Ringe kann daher für einen Punkt im Abstand p vom Zentrum der PSF erreicht werden, dass er einerseits Teil des n-ten Beugungsmaximums des einen Ringes ist, andererseits aber zum n+(2m+1)- ten Beugungsmaximum des anderen Ringes gehört. Die Amplituden der beiden Beugungsmaxima sind in diesem Fall einander entgegengerichtet und durch geeignete Ringbreiten- oder Amplitudenwahl kann es daher zu einer völligen Auslöschung des aus diesem Punkt emittierten elektromagnetischen Feldes kommen.
Auf diese Weise können sukzessive benachbarte Radien minimiert werden. Mit diesen sogenannten Toraldo-Filtern können theoretisch sehr scharfe Feldverteilungen um den Ursprung geschaffen werden, deren ringförmiges Umfeld in einem frei wählbaren Bereich beliebig stark gegen Null gesenkt werden kann. Allerdings nimmt das Signal aus dem Zentrum dabei ebenfalls drastisch ab. Bereiche außerhalb des optimierten Bereichs werden dagegen teilweise stark in den Innenbereich hineingebeugt und können bei entsprechender Helligkeitsverteilung der Probe das Signal im Zentrum leicht übertreffen. Dadurch wird schnell eine experimentell verwirklichbare Grenze erreicht.
Prinzipiell kann nicht nur die Amplitude sondern auch die Phase des elektromagnetischen Feldes durch die Pupillenfunktion verändert werden. In einer praktischen Realisierung benutzt man hierzu phasenverzögernde Elemente wie z.B. Phasenplatten, insbesondere λ/2-Platten. Zusätzlich lässt sich das Prinzip auch ohne weiteres auf Kosten der beiden lateralen Dimensionen auf die dritte Dimension ausweiten. 11. In der konfokalen Mikroskopie bietet sich eine Anwendung insofern an, da z.B. die hellen Außenbereiche der Anregungs-PSF mit Toraldo-Filtern durch die konfokale Detektions-PSF unterdrückt werden können. Die dort erreichbaren Effekte bewegen sich allerdings nur im Prozentbereich, so dass in den meisten Fällen die Nachteile des Toraldo-Konzepts überwiegen.
In der 4-Pi-konfokalen Mikroskopie soll mit Hilfe der Toraldo-Filter nicht primär die Auflösung gesteigert werden. Ziel ist stattdessen, die auftretenden Nebenmaxima in der PSF zu reduzieren, um auf diesem Weg die schwachen Bereiche der OTF um die kritische Frequenz kc zu heben. Die Vorgehensweise ist dabei analog. Es kann jedoch auf einem relativ eingeschränkten axialen Bereich agiert werden, wodurch die negativen Nebeneffekte nicht so drastisch ausfallen.
Vorzugsweise ist die Probe mit zumindest einem Lumineszenzfarbstoff, insbesondere mit einem Fluoreszenzfarbstoff, markiert. In einer bevorzugen Ausgestaltung ist der Fluoreszenzfarbstoff derart ausgewählt, dass ein Verhältnis von Beleuchtungswellenlänge zu Detektionswellenlänge im Bereich von 0,5 bis 0,9, insbesondere im Bereich von 0,6 bis 0,8, insbesondere bei 0,75 einstellbar ist. Hierzu ist Bezug auf das konfokale 4-Pi-Mikroskop zumindest eine Detektionswellenlänge auswählbar und der Detektor auf die ausgewählte Detektionswellenlänge einstellbar. In einer Variante ist der Detektor als Multibanddetektor ausgeführt, da dieser in Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Mikroskop besonders flexibel und vorteilhaft einsetzbar ist. Ebenso ist vorgesehen, dass die zumindest eine vorzugsweise freie Beleuchtungswellenlänge auswählbar und die Lichtquelle auf die ausgewählte Beleuchtungswellenlänge einstellbar ist.
Vorzugsweise weist der Fluoreszenzfarbstoff einen Anregungs- und einen Emissionsbereich auf, wobei die Beleuchtungswellenlänge im kurzwelligen Anteil des Anregungsbereichs und/oder die Detektionswellenlänge im langwelligen Anteil des Emissionsbereichs liegt.
Der in der Praxis zugängliche Stokes-Shift-Bereich ist bei einigen Farbstoffen sehr eingeschränkt. Einige grün emittierende Farbstoffe weisen einen Unterschied zwischen Anregungs- und Emissionsmaximum von ca. 20 - 30 nm auf. Die spektrale Bandbreite beträgt bei der Anregung und im Fluoreszenzspektrum jeweils ca. 50 nm. Verzichtet man auf den Großteil des kurzwelligen Fluoreszenzlichts und nutzt den Farbstoff zusätzlich im schwer anregbaren blauverschobenen Anregungsspektrum, so kann man auf diesem Weg einen Stokes-Shift von ca. 120 nm erreichen. Rote Farbstoffe weisen typischerweise einen größeren Stokes-Shift auf. Es ist auch möglich, einen möglichst großen Anti-Stokes-Shift zu verwenden, wobei dies leider manchmal am kleinen Überlappungsbereich der Anregungs- und Emissionsspektren scheitert. Einige Farbstoffe sind verfügbar, die auch bei Anregung im blau-grünen Bereich einen akzeptablen Stokes-Shift, bzw. ein sehr breitbandiges Emissionsspektrum aufweisen.
Die Effizienzeinbuße bei der Nutzung eines kleinen Ausschnitts des Fluoreszenzspektrums ist meist tolerierbar, insbesondere wenn man sie mit der erfindungsgemäß ebenfalls möglichen Zweiphotonenanregung vergleicht, die eine aufgrund von Photobleichen geringere Ausbeute hat als die konfokale Mikroskopie mit 1 -Photonen-Anregung. Für die Mehrphotonenanregung ist die Lichtquelle vorzugsweise als Pulslaser ausgeführt. In einer bevorzugen Ausgestaltung weist das Beleuchtungslicht eine weitere Beleuchtungswellenlänge auf, wobei die Anregung über einen virtuelles oder über ein reales Zwischenniveau erfolgt.
In einer bevorzugten Variante erfolgt die Anregung über ein höheres Anregungsniveau , insbesondere über einen S0-S2-Übergang. Dies ist eine Alternative, die nicht auf einer Einschränkung des Fluoreszenzspektrums beruht. Meist erfolgt ein strahlungsloser Relaxations-Übergang vom S2- in den SrZustand vor der Fluoreszenz. Dadurch wird ein sehr großer Stokes-Shift erzeugt. Die Anwendbarkeit dieser Methode ist davon abhängig, inwieweit das Bleichen durch diese relativ hochenergetische Anregung verstärkt wird. Der Anti-Stokes-Bereich eines Farbstoffs kann möglicherweise durch eine künstliche Anhebung der Moleküle aus dem Vibrationsgrundzustand des elektronischen Grundzustands S0 in einen höheren Vibrationszustand leichter ausgenutzt werden. Werden die Farbstoffe aus diesem angeregten Zustand in den S^Zustand gebracht und detektiert man erfindungsgemäß nur das kurzwellige Fluoreszenzlicht aus dem Zerfall in einen möglichst niedrigen Zustand, so ist die Wellenlänge des Fluoreszenzlichts deutlich kürzer als die des Anregungslichts. Durch IR-Strahlung ist eine Anregung dieser Vibrationszustände möglich.
In einer anderen Variante beinhaltet die Anregung der Probe einen Förster- resonanten Energietransfer (FRET) innerhalb der Probe. Hierzu werden gekoppelte Farbstoffe verwendet, bei denen ein hochenergetisch anregbarer Farbstoff (der Donor) über resonanten Energietransfer die Anregungsenergie auf einen niederenergetischeren Farbstoff (den Akzeptor) abgibt, der dann im stark rot-verschobenen Bereich fluoresziert. Auch die Nutzung einer Farbstoffkette unter Ausnutzung mehrfacher Kopplung ist möglich. Förster- Energietransfer (FRET) zwischen zwei Farbstoffmolekülen wird zur Abstandsbestimmung zwischen diesen Molekülen in mittlerweile weitverbreiteten FRET-Experimenten genutzt. Transfereffizienzen von fast 100% werden in der Praxis erreicht. Im Unterschied zu diesen Experimenten ist im 4-Pi-Fall eine permanente Kopplung nötig. Über einen Antikörper, der spezifisch diese beiden Farbstoffmoleküle bindet, ist dies aber prinzipiell möglich.
Das konfokale 4-Pi-Mikroskop weist vorzugsweise eine Detektionslochblende mit einem kleineren Öffnungsdurchmesser als 1 Airyscheibe, insbesondere einen Öffnungsdurchmesser von 0,7 bis 0,8 Airyscheiben, auf. Durch eine besondere Beachtung der Größe der Detektionslochblende können die Nebenmaxima erfindungsgemäß reduziert werden und wiederum die Anforderungen an den Stokes-Shift des Fluoreszenzfarbstoffs verringert werden. Im Gegensatz zum klassischen konfokalen Mikroskop, bei dem der Öffnungsdurchmesser der Detektionslochblende kaum Einfluss auf die Auflösung hat, hängt die Nebenmaximahöhe im konfokalen 4π-Mikroskop relativ stark von dieser Größe ab.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch in der l5M- und Wellenfeld- Mikroskopie anwendbar.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen: Fig. 1 ein erfindungsgemäßes konfokales 4-Pi-Mikroskop,
Fig. 2 z-Profile des 4-Pi-konfokalen Mikroskops bei Einphotonenanregung und mit einem Pupillenfilter,
Fig. 3 theoretische OTFs und PSFs des 4Pi-konfokalen Mikroskops,
Fig. 4 Fig. 4 zeigt Spektren des typischen Fluoreszenzfarbstoffs Fluorescein und des Farbstoffs FM4-64,
Fig. 5 schematisch die erfindungsgemäße Überlappung der Detektions- Minima und der Beleuchtungs-Nebenmaxima und
Fig. 6 die Abhängigkeit der relativen Höhe der Nebenmaxima vom Stokes- Shift. Fig. 1 zeigt ein konfokales 4-Pi-Mikroskop 1 mit einer Lichtquelle 3, die Beleuchtungslicht 5 emittiert. Das Beleuchtungslicht 5 wird mit der Linse 7 auf das Beleuchtungslochblende 9 fokussiert, passiert diese und durchläuft anschließend die erste Optik 11 , die zweite Optik 13 und einen Pupillenfilter 15, der zwischen der ersten Optik 11 und der zweiten Optik 13 angeordnet ist. Von einem Strahlteiler 17, der als dichroitischen Strahlteiler ausgeführt ist, wird das Beleuchtungslicht 5 durch die Optik 19 hindurch zu einer Strahlablenkeinrichtung 21 reflektiert, die einen kardanisch gelagerten Scanspiegel 23 beinhaltet. Der Scanspiegel 23 der Strahlablenkeinrichtung 21 ist um zwei Achsen schwenkbar gelagert, so dass durch geeignetes Schwenken des Scanspiegel 23 das Beleuchtungslicht abgelenkt bzw. gescannt werden kann. Von der Strahlablenkeinrichtung gelangt das Beleuchtungslicht 5 durch die Scanoptik 25 und durch die Tubusoptik 27 zu einem weiteren Strahlteiler 29 der das Beleuchtungslicht in einen ersten Beleuchtungslichtteilstrahl 31 und einen zweiten Beleuchtungslichtteilstrahl 33 aufteilt. Der erste Beleuchtungslichtteilstrahl 31 gelangt über den ersten Umlenkspiegel 35 zu dem ersten Objektiv 37, das eine erste Pupille 39 aufweist und das den ersten Beleuchtungslichtteilstrahl 31 auf die Probe 41 fokussiert. Der zweite Beleuchtungslichtteilstrahl 33 gelangt über den zweiten Umlenkspiegel 43 zu dem zweiten Objektiv 45, das eine zweite Pupille 47 aufweist und das den zweiten Beleuchtungslichtteilstrahl 31 ebenfalls auf die Probe 41 fokussiert, wobei dieser mit dem ersten Beleuchtungslichtteilstrahl 31 interferiert. Der Pupillenfilter 15 befindet sich in einer optisch zu den Pupillenebenen in denen sich die Pupillen 39, 47 befinden korrespondierenden Ebene. Von der Probe 41 ausgehendes Detektionslicht gelangt in Form eines ersten Detektionslichtteilstrahles 49 durch das erste Objektiv 37 und über und den ersten Umlenkspiegel 35 zu dem weiteren Strahlteiler 29 und interferiert dort mit einem zweiten Detektionslichtteilstrahl 51 , der durch das zweite Objektiv 45 und über und den zweiten Umlenkspiegel 43 zu dem weiteren Strahlteiler 29 gelangt. Das interferierende Detektionslicht 53 wird über die Tubusoptik 27, die Scanoptik 25 und über die Strahlablenkeinrichtung 21 zu dem Strahlteiler 17 geführt, passiert diesen und gelangt nach Passieren der Detektionsoptik 55 durch die Detektionslochblende 57, die einen Öffnungsdurchmesser von 0,7 Airyscheiben aufweist, zu dem Detektor 59, der einen Photomultiplier beinhaltet. Der Pupillenfilter 15 ist als Zonenfilter mit 3 getrennten Phasenringen ausgeführt. Die Wellenlänge des Beleuchtungslichtes beträgt 488 nm. Die des Detektionslichtes beträgt 688nm. Im Strahlengang des Detektionslicht 53 ist ein weiterer Pupillenfilter 71 vorgesehen.
Fig. 2 zeigt z-Antworten des 4Pi-konfokalen Mikroskops bei Einphotonenanregung und mit einem Pupillenfilter 15. Der Pupillenfilter 15 befindet sich in einer optisch zu den Pupillenebenen in denen sich die Pupillen 39, 47 befinden korrespondierenden Ebene. Aufgetragen sind die z- Antworten für Pupillenfilter mit unterschiedlichen Zonenanzahlen. Bevorzugt wird der links unten gezeigte Filter verwendet, weil dieser auch in den Randbereichen niedrige z-Antworten aufweist. Allerdings spielen die Randbereiche bei sehr dünnen Proben keine Rolle, da diese außerhalb der Probe liegen. Dargestellt sind die Profile für Phasenring-Filter im Anregungsstrahlengang mit 1 , 2 und 3 getrennten Phasenringen sowie der Referenzfall ohne Pupillenfilter. Der grau unterlegte Bereich liegt außerhalb der optimierten Zone. Je nach Optimierung werden stark verschiedene Verläufe der z-Antworten außerhalb des optimalen Bereichs erreicht. (Die z- Antwort täuscht etwas darüber hinweg, da hier einzelne Punkte linear ins Gewicht fallen und nicht quadratisch wie bei der Berechnung von Delta.) Dafür steigen die Außenbereiche relativ zum zentralen Maximum unverhältnismäßig stark an. (Anregungswellenlänge 488 nm, Stokes-Shift 10%, infinitesimal kleine Detektionslochblende, Wasser-Immersionsobjektiv mit halbem Öffnungswinkel von 1 ,1 rad.)
Fig. 3 zeigt theoretische OTFs und PSFs des 4Pi-konfokalen Mikroskops in Abhängigkeit vom Stokes-Shift. Die z-Antworten und die Profile entlang der kz-Achse der OTF sind gegen die Detektionswellenlänge aufgetragen. Die beiden Fälle einer Detektionslochblende von 0 (punktförmig) und 1 Airy- Scheibe Durchmesser sind jeweils dargestellt. Es wurde von alpha=63° (1 ,1 rad), n = 1 ,33 und einer Anregungswellenlänge von 488nm ausgegangen. Auf diese Wellenlänge beziehen sich auch die angegebenen Werte für den relativen Stokes-Shift. Die Konturlinien liegen bei 50% (weiß), 40%, 30%, 20%, 10% (gestrichelt) und 5% (gepunktet; nur OTFs) der Maximalwerte. Fig. 4 zeigt Spektren des typischen Fluoreszenzfarbstoffs Fluorescein und des Farbstoffs FM4-64 mit einem außergewöhnlich großen Stokes-Shift. Die Emissionsspektren sind schwarz eingezeichnet, die Anregungs- bzw. Absorptionsspektren grau.
Fig. 5 zeigt schematisch die erfindungsgemäße Überlappung der Detektions- Minima 61 und der Beleuchtungs-Nebenmaxima 63. Dargestellt ist auch das Beleuchtungs-Hauptmaximum 65 und das Detektions-Hauptmaximum 67. Die z-Antwort ergibt sich aus dem Produkt des ersten Graphen 69 für die Beleuchtungs-PSF und des zweiten Graphen 73 für die Detektions-PSF.
Fig. 6 zeigt die Abhängigkeit der relativen Höhe der Nebenmaxima vom Stokes-Shift bei Benutzung von Absorptions-Filtern (3 Zonen) für die 4-PI-
Typen A und C in 1- und 2-Photonen-Anregung. Die Werte sind relativ zur Höhe des jeweiligen Hauptmaximums angegeben. ES ist jeweils die Referenzkurve für die 4-PI-Mikroskopie ohne Pupillenfilter, die Kurve bei Verwendung der Filter nur in der Anregung und das Verhalten bei Filtern im Anregungs- und im Detektionsstrahlengang aufgeführt. Typische Stokes-Shifts sind durch die gestrichelten Senkrechten markiert. Für die Berechnung wurde von Objektiven mit einem halben Objektivöffnungswinkel von 1 ,1 rad und einer infinitesimal kleinen Detektionslochblende ausgegangen.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
Bezugszeichenliste:
1 konfokales 4-Pi-Mikroskop
3 Lichtquelle
5 Beleuchtungslicht
7 Linse
9 Beleuchtungslochblende
11 erste Optik
13 zweite Optik
15 Pupillenfilter
17 Strahlteiler
19 Optik
21 Strahlablenkeinrichtung
23 Scanspiegel
25 Scanoptik
27 Tubusoptik
29 weiterer Strahlteiler
31 erster Beleuchtungslichtteilstrahl
33 zweiter Beleuchtungslichtteilstrahl
35 erster Umlenkspiegel
37 erstes Objektiv
39 erste Pupille
41 Probe
43 zweiter Umlenkspiegel
45 zweites Objektiv zweite Pupille erster Detektionslichtteilstrahl zweiter Detektionslichtteilstrahl interferierendes Detektionslicht
Detektionsoptik
Detektionslochblende
Detektor
Detektions-Minima
Beleuchtungs-Nebenmaxima
Beleuchtungs-Hauptmaximum
Detektions-Hauptmaximum erster Graph weiterer Pupillenfilter zweiter Graph

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur konfokalen 4-Pi-Mikroskopie, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
• Kohärentes Beleuchten einer Probe von zwei Seiten durch je ein Objektiv mit Beleuchtungslicht, das zumindest eine
Beleuchtungswellenlänge aufweist, wobei durch Interferenz des Beleuchtungslichts in der Probe eine stehende Beleuchtungswelle mit einem Beleuchtungs-Hauptmaximum und mit Beleuchtungs- Nebenmaxima erzeugt wird und • Detektieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes, das zumindest eine Detektionswellenlänge aufweist, durch die beiden Objektive hindurch, wobei das Detektionslicht zur Interferenz gebracht wird und dadurch in der Probe ein Detektionsmuster mit einem Detektions-Hauptmaximum und mit Detektions-Nebenmaxima derart erzeugt wird, dass die Beleuchtungs-Nebenmaxima und die
Detektions-Nebenmaxima sich an unterschiedlichen Orten befinden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Objektive je eine Pupille aufweisen und dass durch Einfügen von Pupillenfiltern in zumindest eine Pupillenebene oder in zumindest eine optisch zu der Pupillenebene korrespondierenden Ebene die räumliche Lage der Beleuchtungs-Nebenmaxima und/oder der Detektions-Nebenmaxima festgelegt und/oder verändert werden.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit zumindest einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregung der Probe durch Mehrphotonenanregung, insbesondere Zweiphotonenanregung, bewirkt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregung der Probe einen Förster-resonanten Energietransfer (FRET) innerhalb der Probe beinhaltet.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungslicht eine weitere Beleuchtungswellenlänge aufweist und die
Anregung über einen virtuelles oder über ein reales Zwischenniveau erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregung über ein höheres Anregungsniveau, insbesondere über einen S0-S2- Übergang, erfolgt. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Beleuchtungswellenlänge zu Detektionswellenlänge im Bereich von 0,5 bis 0,9, insbesondere im Bereich von 0,6 bis 0,
8, insbesondere bei 0,75 liegt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff einen Anregungs- und einen Emissionsbereich aufweist, wobei die Beleuchtungswellenlänge aus dem kurzwelligen Anteil des Anregungsbereichs und/oder die Detektionswellenlänge aus dem langwelligen Anteil des Emissionsbereichs gewählt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Detektionslochblende vorgesehen ist, deren Öffnungsdurchmesser kleiner als 1 Airyscheibe, insbesondere von 0,7 bis 0,8 Airyscheiben, insbesondere von 0,7 Airyscheiben, eingestellt wird.
11. Konfokales 4-Pi-Mikroskop mit einer Lichtquelle, die Beleuchtungslicht, das zumindest eine Beleuchtungswellenlänge aufweist, erzeugt, und das von zwei Seiten durch je ein Objektiv auf eine Probe richtbar ist, wobei durch Interferenz des Beleuchtungslichts in der Probe eine stehende Beleuchtungswelle mit einem Beleuchtungs-Hauptmaximum und mit Beleuchtungs-Nebenmaxima erzeugt wird und mit einem Detektor zum Detektieren von von der Probe ausgehendem durch die beiden Objektive hindurch gehendem Detektionslicht, das zumindest eine Detektionswellenlänge aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionslicht interferiert und in der Probe ein Detektionsmuster mit einem Detektions-Hauptmaximum und mit Detektions-Nebenmaxima erzeugbar ist, wobei sich die Beleuchtungs-Nebenmaxima und die Detektions-Nebenmaxima sich an unterschiedlichen Orten befinden.
12. Konfokales 4-Pi-Mikroskop nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Objektive je eine Pupille aufweisen und dass Pupillenfiltern in zumindest eine Pupillenebene oder in zumindest eine optisch zu der Pupillenebene korrespondierenden Ebene einfügbar sind, die die räumliche Lage der Beleuchtungs-Nebenmaxima und/oder der Detektions- Nebenmaxima festlegen.
13. Konfokales 4-Pi-Mikroskop nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der zumindest eine Pupillenfilter eine Phasenplatte, die insbesondere Bereiche unterschiedlicher Phasenverzögerung aufweist, insbesondere eine λ/2-Platte beinhaltet.
14. Konfokales 4-Pi-Mikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Detektionswellenlänge auswählbar und der Detektor auf die ausgewählte Detektionswellenlänge einstellbar ist.
15. Konfokales 4-Pi-Mikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Beleuchtungswellenlänge auswählbar und die Lichtquelle auf die ausgewählte Beleuchtungswellenlänge einstellbar ist.
16. Konfokales 4-Pi-Mikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit zumindest einem
Fluoreszenzfarbstoff markiert ist.
17. Konfokales 4-Pi-Mikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle ein Laser, insbesondere ein Pulslaser, ist und dass die Anregung der Probe durch Mehrphotonenanregung, insbesondere Zweiphotonenanregung, bewirkbar ist.
18. Konfokales 4-Pi-Mikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregung der Probe einen Förster-resonanten Energietransfer (FRET) innerhalb der Probe beinhaltet.
19. Konfokales 4-Pi-Mikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungslicht eine weitere
Beleuchtungswellenlänge aufweist und die Anregung der Probe über ein virtuelles oder über ein reales Zwischenniveau erfolgt.
20. Konfokales 4-Pi-Mikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregung über ein höheres Anregungsniveau , insbesondere über einen S0-S2-Übergang, erfolgt.
21. Konfokales 4-Pi-Mikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Beleuchtungswellenlänge zu Detektionswellenlänge im Bereich von 0,5 bis 0,9, insbesondere im Bereich von 0,6 bis 0,8, insbesondere bei 0,75 liegt.
22. Konfokales 4-Pi-Mikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff einen Anregungs- und einen Emissionsbereich aufweist, wobei die Beleuchtungswellenlänge im kurzwelligen Anteil des Anregungsbereichs und/oder die Detektionswellenlänge im langwelligen Anteil des Emissionsbereichs liegt.
23. Konfokales 4-Pi-Mikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das konfokale 4-Pi-Mikroskop eine Detektionslochblende mit einem kleineren Öffnungsdurchmesser als 1 Airyscheibe, insbesondere von 0,7 bis 0,8 Airyscheiben, insbesondere von 0,7 Airyscheiben, aufweist.
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