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WO2003106663A1 - 遺伝子治療用初代培養脂肪細胞 - Google Patents

遺伝子治療用初代培養脂肪細胞 Download PDF

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WO2003106663A1
WO2003106663A1 PCT/JP2003/007721 JP0307721W WO03106663A1 WO 2003106663 A1 WO2003106663 A1 WO 2003106663A1 JP 0307721 W JP0307721 W JP 0307721W WO 03106663 A1 WO03106663 A1 WO 03106663A1
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WO
WIPO (PCT)
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cells
gene
adipocytes
protein
cell
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2003/007721
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English (en)
French (fr)
Inventor
伊藤　昌史
齋藤　康
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eisai Co Ltd
Original Assignee
Eisai Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to MXPA04012859A priority patent/MXPA04012859A/es
Priority to JP2004513476A priority patent/JPWO2003106663A1/ja
Priority to CA2488414A priority patent/CA2488414C/en
Priority to AU2003242459A priority patent/AU2003242459B2/en
Priority to DK03736235.7T priority patent/DK1541674T3/da
Priority to AT03736235T priority patent/ATE492630T1/de
Priority to BRPI0312441A priority patent/BRPI0312441B8/pt
Priority to EP03736235A priority patent/EP1541674B9/en
Priority to US10/518,472 priority patent/US7820438B2/en
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to adipocytes for gene therapy in primary culture into which a foreign gene has been introduced.
  • gene therapy is based on (1) gene transfer by directly administering to a patient a viral vector or a naked plasmid encoding a therapeutic gene. (In vivo), and (2) a method in which cells are removed from a patient and a gene is introduced into the cells and returned to the patient (etas vivo).
  • the in vivo method has major problems in terms of transfection efficiency, sustained expression, and selective gene transfer into target cells.
  • the Etasbipo method has the potential to solve these issues.
  • collection and transplantation are relatively easy and the burden on the patient is small, and the majority of cases use blood cells (peripheral blood lymphocytes, bone marrow cells) (Tani et al., Medicine, 56: 258-267, 2001), and in cells other than the blood system, a method of transferring genes back to liver cells (Raper SE et al., Cell Transplant 2 (5): 381-400, 1993) has been implemented. Most of them focus on recovery, maintenance, and enhancement of the function of the transfected cells themselves. Disclosure of the invention
  • adipocytes In the process of searching for cells suitable for ex vivo gene therapy, the inventors considered using primary cultured adipocytes.
  • the advantages of using adipocytes include the following. (1) Several humoral factors secreted from adipocytes have been reported, and adipocytes have the function of producing hormones and secreting organs (Bradley RD, et al., Recent Prog Horm
  • the isolated primary cultured adipocytes proliferate vigorously in vitro and are suitable for operations such as gene transfer.
  • the present inventors devised a method for efficiently introducing a gene into a primary cultured adipocyte, and confirmed that the introduced gene still functions after transplantation, and confirmed that the adipocyte is effective for gene therapy. I found that I could use it. Moreover, according to the method of the present invention, It is possible to obtain adipocytes that stably express the inserted foreign gene in the body for a long period of time. Transplanted mature adipocytes can sustain foreign gene expression for over a year. In addition, if the expression of the foreign gene is not necessary after transplanting the fat cells, the expression of the foreign gene can be stopped by removing the transplant.
  • the present invention relates to a primary culture adipocyte for gene therapy, which stably retains a foreign gene encoding a protein secreted extracellularly, a method for producing the cell, a transplant composition containing the cell, and the cell. More specifically, regarding the use of
  • a primary culture adipocyte for gene therapy which stably holds a foreign gene encoding a protein secreted outside the cell
  • a method for producing an adipocyte for gene therapy comprising:
  • a transplant composition for gene therapy comprising a cultured fat cell, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a gene therapy method comprising the step of administering to the body a primary cultured adipocyte that stably retains a foreign gene encoding a desired therapeutic protein secreted extracellularly; [13] a protein in the blood A method comprising administering to the body a primary cultured adipocyte that stably retains a foreign gene encoding a protein secreted extracellularly,
  • a method for lowering blood glucose comprising a step of administering to the body a primary cultured adipocyte that stably retains a gene encoding insulin or GLP-1 (Glucagon-Like Peptide 1),
  • the present invention first provides a primary-cultured adipocyte for gene therapy, which stably holds a foreign gene encoding a protein secreted extracellularly.
  • the foreign gene refers to a gene introduced from the outside into the primary cultured adipocyte, and includes a gene encoding a protein not produced by the primary cultured adipocyte.
  • Primary culture cells are cells cultured from tissues removed from a living body and are not yet established.
  • Adipocytes are cells having the ability to differentiate into fat, such as mature adipocytes and preadipocytes. That is, unless specifically referred to as “mature” fat cells, Also include preadipocytes.
  • Mature adipocytes are spherical cells that store fat and contain oil droplets. Fat stored in mature adipocytes can be confirmed by oil red 0 staining. Mature adipocytes generally secrete leptin in response to insulin.
  • Preadipocytes naturally exist as stromal cells before differentiation into mature adipocytes.
  • Preadipocytes can be isolated by treating adipose tissue with collagenase, but it is also possible to isolate preadipocytes resulting from the division of mature adipocytes by the ceiling culture method described below. Yes (Sugihara et al., Japan Clinical 1995, 53; 115-120, Sugihara H, et al. J Lipid Res. 1987, 28; 1038-1045, Zhang HH, et al. J Endcriniol. 2000, 164: 119— 128).
  • adipocyte-specific surface antigens has not been confirmed, but CD36 and the like are strongly expressed in mature adipocytes (Aburarad NA, et al. J Biol Chem. 1993 Aug 25; 268 (268) 24): 17665-8. Therefore, it is conceivable to recover adipocytes with higher purity using such a molecule as a marker.
  • Preadipocytes can be differentiated into mature adipocytes within a few days to weeks by the differentiation induction described below (Hauner H, et al., J. Clin. Invest. 84, 1663-1670, 1989; Marko , et al. Endocrinology 136, 4582-4588, 1994).
  • Primary adipocytes may be isolated from the desired a tissue and can be obtained, for example, from visceral adipose tissue such as subcutaneous adipose tissue, epididymal circumference or mesentery.
  • the term “for gene therapy” refers to the use of a protein encoded by a foreign gene for the purpose of expressing it in the body with the expectation of its effect.
  • the term “gene therapy cell” refers to a cell that is used for administering a foreign gene into the body by ex vivo administration and that has the ability to express the protein in the body administered ex vivo and that retains the foreign gene.
  • Ex vivo administration refers to removing adipose tissue or adipocytes from an individual, performing gene transfer in vitro, and then transplanting the same into another individual.
  • the cell for gene therapy more preferably refers to a cell used for treating a disease by transferring a cell that produces a specific protein.
  • a specific protein is a protein that is active in the bloodstream, or is supplied from the bloodstream to a target tissue and acts on the cell surface of the tissue, and for a certain period of time (for example, several days to several weeks, (Or more) those that require a sustainable supply are desirable. All factors and diseases for which protein replacement therapy has been administered or are predicted to be effective can be targeted.
  • Insulin / diabetes glucagon-like peptide-1 (GLP-1) / diabetes, obesity, eating disorders, GLP-2 / inflammatory bowel disease, gastrointestinal disorders associated with cancer therapy, leptin / obesity ⁇ Lipotrophic diabetes mellitus, adiponectin / diabetes ⁇ Vascular disorders, blood coagulation factor VIII ⁇ Factor IX / hemophilia, lipoprotein lipase (LPL) / LPL deficiency 'hypertriglyceridemia, lecithin cholesterol acyltransfection Esterase (LCAT) / LCAT deficiency, erythropoietin / erythrocytopenia, apo AI / hypoHDLemia, albumin / hypoproteinemia, atrial sodium peptide (ANP) I hypertension, heart failure, luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) / breast cancer ⁇ prostate cancer, angiostatin ⁇ endostatin / angiogenesis ⁇ metastasis inhibition,
  • Neuronetis' allergic interferon- / 31 / multiple sclerosis
  • interleukin-1 ⁇ '-1] 3 / malignant tumor interleukin-4 / psoriasis
  • interleukin-10 / Autoimmune diseases interleukin-12 / malignant tumors
  • knee secretory trypsin inhibitor / kneeitis superoxide dismutase / ischemic heart disease
  • vascular disorders etc.
  • Tumor necrosis factor-a soluble soluble receptor / rheumatoid arthritis
  • solubilized IgE receptor / allergy solubilized IgA receptor / food allergy
  • solubilized cytotoxic T lymphocyte antigen-4 CTLA4
  • solubilized CD40 ligand / immune disease solubilized CD40 ligand / immune disease
  • dominant-negative blood coagulation factor Vila / thrombosis fibroblast growth factor (FGF) solubilized receptor / intimal thickening, etc.
  • the adipocytes of the present invention are not limited to those used for so-called "therapy", and include cells used for expressing a desired protein in the body.
  • a specific protein can be obtained and expressed as a model animal.
  • a disease model animal that expresses a pathogenesis factor or a malignant transformation factor acquiredly, and it is also possible to screen a drug using the animal.
  • expression of a disease condition improving factor can be used to prove the working hypothesis of searching for a new drug that the factor improves the disease condition.
  • a desired non-human animal preferably a non-human mammal (including rodents, primates, etc.) is used.
  • the adipocyte for gene therapy of the primary culture of the present invention stably holds a foreign gene encoding a protein secreted outside the cell.
  • “Stably maintain” means that a foreign gene is passed on to daughter cells with cell division, and more specifically, a foreign gene. A child is integrated into a cell's chromosome.
  • a foreign gene is preferably stably introduced by a chromosome-integrated virus vector. More preferably, the foreign gene has been introduced by a retroviral vector.
  • Retroviral vectors have the ability to stably integrate into the chromosome of cells and express the transgene over a long period of time, but the transfection efficiency and the persistence of transgene expression depend on the cell type. .
  • the expression of a gene introduced by a retroviral vector may be maintained while the cells are growing, but may be stopped when the cells stop growing (Lund AH, et al., J Biomed Sci. 1996; 3: 365-378; Niwa, 0. et al., 1983, Cell, 32: 1105-1113). Suppression of exogenous gene expression is often observed, particularly after transfection of the gene into the body by in vivo or ex vivo.
  • the expression of the transgene persisted extremely stably both in vitro and in vivo. It turned out to be.
  • the expression of the transgene is stable in both pre-differentiated and mature adipocytes, and during in vitro culture, over the entire 80 days of the experiment, and when implanted in vivo, It was confirmed that the expression persisted for a period of 360 days or more. Therefore, it was found that the adipocytes of the primary culture into which the foreign gene was stably introduced can be used as a plant that stably expresses the gene for a long time.
  • the adipocytes for gene therapy of the present invention have the ability to significantly express a protein encoded by a foreign gene in vitro, more preferably in vivo, for at least 20 days or more.
  • Significant expression means that expression is detected statistically significantly (for example, with a significance level of 5% or higher) as compared to, for example, a case where a foreign gene is not introduced.
  • the fat cells of the present invention when implanted in the body, have at least 30 days or more, more preferably 40 days or more, more preferably 50 days or more, more preferably 60 days or more, more preferably Is more than 80 days, more preferably more than 100 days, more preferably more than 150 days, more preferably more than 200 days, more preferably more than 250 days, more preferably more than 300 days, more preferably more than 350 days. It has the ability to significantly express the protein encoded by the gene.
  • the adipocyte for gene therapy of the present invention is particularly useful as a cell for releasing a protein encoded by a foreign gene held by the cell into the blood.
  • the protein released into the blood includes a desired secreted protein that is active in the bloodstream or on the cell surface of a target tissue, and includes, for example, desired humoral factors such as hormones and cytokines, and antibodies.
  • desired humoral factors such as hormones and cytokines, and antibodies.
  • hypoglycemic hormones such as insulin and / or Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1), and the treatment of hemophilia and the like are used.
  • cleavage site sitel and site2
  • a cleavage sequence of a protease expressed in adipocytes so that mature insulin can be efficiently produced (for example, Groskreutz DJ, et al. JBC). , 1994, 269 (8), 6241).
  • GLP-1 includes GLP-1 receptor (NP-002053, Thorens, B. et al., Diabe tes 42, 1678-1682 (1993); Dillon, JS et al., Endocrinology 133, 1907-1910 (1993); Graziano, MP et al., Biochera. Biophys. Res. Commun. 196, 141-146 ( 1993); Stoffel, M. et al., Diabetes 42, 1215-1218 (1993)), but any desired peptide can be used, such as GLP-1 (7-37).
  • a method for producing a gene therapy adipocyte comprising: and a gene therapy adipocyte produced by this method.
  • To stably maintain a gene means to introduce the gene so that the foreign gene is passed on to the daughter cell with cell division, and more specifically, to integrate the foreign gene into the chromosome of the cell. Southern blotting or PCR using genomic DNA can be used to molecularly prove that the foreign gene has integrated into the chromosome and has achieved stable expression.
  • a method such as a Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) that allows the cells to recognize GFP expressed together with the target gene and enrich the cells can be used.
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorter
  • Adipocytes in primary culture can be collected by the method described in Sugihara H. et al., Differentiation, 31: 42-49, 1986. Specifically, adipose tissue is aseptically removed from adipose tissue, preferably subcutaneous adipose tissue of the transplant recipient, or visceral adipose tissue such as around the epididymis or the mesentery. Hasa Using a knife or a surgical knife, cut into small pieces.
  • This minced tissue is shake-digested in a medium containing an appropriate amount of collagenase, preferably 1 to 3 mg / ml, at 37 ° C for an appropriate time, preferably 20 to 60 minutes, and then separated into a sediment and a floating layer by centrifugation. I do.
  • the suspension is washed, preferably by one or two further centrifugations, and then added to a culture flask filled with medium. Except for the foam, conventional culture surface is cultured and allowed to stand in the way C0 2 incubator in the beta become heavenly (ceiling culture). After culturing for an appropriate period, preferably 10 to 14 days, the cells adhered to the ceiling surface are collected by trypsin treatment, and then subcultured in a usual culture system.
  • Primary cultured adipocytes may be cryopreserved before or after gene transfer. This makes it possible to collect fat cells once and use them frequently.
  • Gene transfer can be performed using gene transfer reagents (Fugene 6: manufactured by Roche, Lipofectamin: manufactured by Invitrogen, Cellphect transfection kit (phosphate-calcium method): manufactured by Amersham, etc.), electroporation (electroporation, Chen H. et al., J Biol. Chem. 1997: 272 (12), 8026-31), and viral vectors (Kay ⁇ , et al., Nat Med 2001, 7, 33-40).
  • the introduction is by a viral vector, more preferably, by a retroviral vector (such as Arai T. et al., J. Viro 1., 1998: 72, pplll5-21).
  • an adipocyte capable of stably retaining the introduced foreign gene can be selected.
  • the drug-resistant gene is retained in a plasmid encoding the foreign gene, or transfection is performed together with the plasmid having the drug-resistant gene, and the transfected cells are selected with the drug.
  • it can be obtained by cloning the transfected cells by limiting dilution.
  • phage-derived integrators are used to increase the efficiency of chromosome insertion.
  • a method of transiently expressing zeolites may be used (Mol Cell Biol. 2001 Jun; 21 (12): 3926-34).
  • MV is a virus belonging to the genus Dependovirus of the family Parvoviridae (Parvoviridae), and has the property that the transgene is integrated into the chromosome.
  • a foreign gene is inserted between two inverted terminal repeats (ITRs), and the foreign gene is incorporated by expressing the MV packaging protein (the r-mark and cap gene products) in the presence of the adenovirus El, E2A, and E4 proteins.
  • ITRs inverted terminal repeats
  • Retrovirus refers to a virus belonging to the retroviridae family, Retrovirida), and includes oncovirus, Foamy virus (Russell DW, and Mi Her AD, J Virol 1996; 70: 217-222; Wu M et al., J Virol 1999; 73: 4498-450 1), lentivirus (for example, HIV-1 (Naldini L et al., Science 1996; 272: 263-267; Poeschla E et al., Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 11395-11399) ; Sri nivasakuraar N et al., J Virol 1997; 71: 5841-5848; Zufferey R, et al.
  • retroviral vector refers to a virus belonging to the retroviridae family, Retrovirida), and includes oncovirus, Foamy virus (Russell DW, and Mi Her AD, J Virol 1996; 70: 217-222; Wu M et al.
  • the retrovirus vector used in the present invention is preferably a Moloney murine leukemia virus (MoMLV) vector (TM Shinnick, RA Lerner and J).
  • MoMLV Moloney murine leukemia virus
  • the retrovirus may be a self inactivating (SIN) vector.
  • the SIN vector can be prepared by deleting part of the LTR during packaging of virus (Yu SF et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83 Natl. Acad. Sci. USA 84: 5197-5201; Zufferey, R. et al., 1998, J. Virology, 72, 9873-9880): 3194; Yee, JK et al., 1987, Proc.
  • the foreign gene in the retrovirus can be transcribed by the LTR or expressed from another promoter within the vector.
  • a constitutive expression promoter such as a CMV promoter, an EF-1 ⁇ promoter, a CAG promoter, or a desired inducible promoter can be used.
  • a chimeric promoter in which a part of the LTR is replaced with another promoter may be used.
  • a plasmid in which the gene to be introduced is inserted for example, pBabe CL-SEAP-IRES-GFP, is inserted into a packaged cell, for example, 293- ⁇ cell (manufactured by Invitrogen).
  • a transfection reagent or the like is inserted into a packaged cell, for example, 293- ⁇ cell (manufactured by Invitrogen).
  • the recombinant virus produced in the supernatant is collected and infected to adipocytes to be transfected.
  • the retroviral vector has an envelope protein with broad tropism so that it can widely infect mammalian and human adipocytes.
  • Amphotopic pick envelope protein eg, 4070A
  • the retrovirus is preferably a vesicular stomatitis virus G protein (VSV-G) (Rose, JK and Gallione, CJ, J. Virol. 39 (2), 519-528). 1981))) (Emi, T. Friedmann and JK Yee, J.
  • VSV-G By eutyping, a gene can be introduced into fat cells at a high rate.
  • the VSV-G pseudotyped vector can be prepared by expressing VSV-G in a packaging cell.
  • a packaging cell capable of inducing and expressing VSV-G Arai Ding et al., J. Virol., 1998: 72, pplll5-21, etc. can be suitably used.
  • the titer measurement of the prepared virus can be determined by infecting serially diluted virus solution and counting the number of colonies of infected cells. See Ausubel et al. (Ausubel, FM et al. Eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology. (John Wiley & Sons, NY)). Or, Byun et al. (Byun, J. et al. (1996) Gene Ther. 33333: 1018-1020), Tafuro et al. (Tafuro, S. et al. (1996) Gene Ther. 33333: 679-684), Miyao et al. (Miyao, Y. et al. (1995) Cell Struct. Funct.
  • the vector may be contacted with the cells.
  • primary cultured adipocytes are incubated in a culture containing a viral vector.
  • the adipocytes are preferably infected in the form of preadipocytes.
  • the infection efficiency can be increased by adding 0.5 to 8 ⁇ g / ml of polybrene.
  • the multiplicity of infection (M0I) is not particularly limited. It can be adjusted appropriately between ⁇ 100.
  • the transfected cells may be selected using, for example, a marker gene.However, if M0I is infected with about 2 or more, preferably about 3, 4, or 5 or more, selection is not necessary. Gene transfer to most cells is possible.
  • the transfected adipocytes can be used for transplantation as they are, or in some cases, cultured in a medium containing 3-isobutyl_l-methylxanthine (IBMX), Dexamethasone, and insulin to become mature adipocytes.
  • IBMX and Dexamethasone are mainly adipocytes Since it is used to activate the sisome proliferator-activated receptor- ⁇ (PPAR-7), a drug that directly activates the receptor (for example, pioglitazone which is a thiazolidine derivative / Takeda Pharmaceutical Co., Ltd. and rosiglitazone / (Daraxo Smith Klein, etc.) is also allowed.
  • the primary adipocytes to be transplanted are preferably cells of the same host as the recipient.
  • the method of the present invention for gene therapy by transplantation of adipocytes in primary culture can be applied to express a desired secreted protein in the body in anticipation of its effect.
  • the disease can be treated or prevented by transplanting an adipocyte of the present invention that carries a foreign gene encoding a protein having a therapeutic or preventive effect on the disease.
  • the present invention also relates to a method for releasing a protein into the blood, which comprises a step of administering the primary cultured adipocyte of the present invention to the body.
  • a method for releasing a protein into the blood comprises a step of administering the primary cultured adipocyte of the present invention to the body.
  • the foreign protein expressed in the body can be detected and / or quantified by an immunoassay such as ⁇ .
  • the present invention also provides a transplant composition for gene therapy, comprising a primary cultured adipocyte stably retaining a foreign gene encoding a protein secreted extracellularly, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier include physiological saline, phosphate buffer, culture solution, serum, and body fluid. Further, it may be combined with a solid or gel support serving as a cell scaffold.
  • the transplant composition of the present invention preferably contains an extracellular matrix (ECM) component.
  • Extracellular matrix components refer to components such as proteins or mucopolysaccharides contained in insoluble 1 "raw reticulated or fibrous structures that accumulate between cells, and are isolated from organisms and artificially reconstituted.
  • the ECM component used in the present invention is collagen, fibronectin, vitronectin, laminin, heparan sulfate, proteodalican, glycosaminodalican, chondroitin sulfate, hyaluron, dermatan sulfate, keratin sulfate.
  • ECM gel used in the present invention is at least one of the above components There is no particular limitation as long as the above is included, but preferably at least a type IV collagen
  • Such ECM includes a substrate (Matrigel®) (Becton Dickinson Labware3 ⁇ 4) extracted from Engelbreth- Holm- Swarm mouse tumors (US Patent No. No. 4,829,000)
  • the structure of the composition containing the ECM component and the fat cells used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a gel-like or paste-like network structure, a fibrous structure, and a flat plate (disk).
  • the ECM component can be gelled according to a conventional method, for example, a 0.3 to 0.5% aqueous collagen solution is incubated at 37 at 37 to 10 to 30 minutes.
  • the ECM component can be gelled by using a gelling agent.
  • the transplant composition of the present invention preferably contains an angiogenic factor.
  • the transplant composition of the present invention containing an angiogenesis factor forms a blood vessel around it after transplantation, and Exogenous proteins can be secreted into the blood with high efficiency.
  • the angiogenic factor is not particularly limited as long as it can induce angiogenesis in a living body. Examples thereof include vascular endothelial cell growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and acidic fibroblast. Examples include growth factor (aFGF), platelet-derived growth factor, transforming growth factor-J3 (TGF-J3), osteonectin (Osteonectin), angiopoietin, hepatocyte growth factor (HGF) and the like.
  • bFGF is used.
  • bFGF is also called FGF2 and has an activity to promote not only the growth factor of fibroblasts, but also the proliferation of various cells such as vascular endothelial cells, cartilage, osteoblasts, and epidermal cells (Abraham et al., ⁇ J. , 5, 2523-2528, 1986; Prats et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1836-1840, 1989).
  • the bFGF used in the present invention may be not only a natural protein, but also one produced by genetic engineering using recombinant DNA technology, and a modified form thereof.
  • bFGF for example, W087 / 01728, W089 / 04832, W08 6/07595, W087 / 03885, European Patent Application Publication No. 237966, European Patent Application Publication No. 281822, European Patent Application Publication No. 326907, European Patent Application Publication No. 394951, European Patent Application Publication No. 493737 and the like can be exemplified.
  • another expression vector that transiently expresses an angiogenic factor may be introduced into adipocytes (see W097 / 49827).
  • the angiogenic factor used in this manner has a main purpose of forming blood vessels around transplanted cells in order to efficiently secrete a foreign protein into the blood from the adipocytes of the present invention.
  • a vascular inducing factor from adipocytes using a vector encoding an inducing factor
  • it is preferable to use a vector that transiently expresses ie, a vector that is not incorporated into chromosomes.
  • Long-term expression of vascular inducing factors from fat cells may cause excessive blood vessels to form around the transplanted fat cells and adverse effects on the whole body. It is preferable that a foreign gene encoding an angiogenic factor has not been stably introduced.
  • the transfected adipocytes should have an appropriate cell concentration, preferably from 0.2 ⁇ 10 7 to 2 ⁇ 10 7 / lo
  • ml when introduced in a retroviral vector was adjusted to 0. 2 X 10 6 ⁇ 5 x lOVml , it remains alone or effective medium, preferably mixed such with a solution comprising an extracellular matrix such as collagen, It is injected into subcutaneous tissue or adipose tissue, preferably into subcutaneous tissue.
  • the injection into adipose tissue may be performed by excision to expose the adipose tissue.
  • Cells that have been terminally differentiated into mature fat cells express the foreign gene at a constant level for a long time without proliferating after transplantation.
  • the expression level of a foreign gene in a transplanted body is proportional to the number of cells to be transplanted, the amount of adipocytes to be transplanted can be adjusted in accordance with the expression level of the foreign gene measured in vitro before transplantation. Thus, the desired expression level can be maintained for a long time.
  • FIG. 1 is a micrograph of primary cultured adipocytes isolated from subcutaneous fat of 3-week-old ICR mice.
  • A Adipocytes adhering to the culture surface on the ceiling side after 14 days of ceiling culture
  • B Primary cultured adipocytes grown in a normal culture system
  • C Mature adipocytes containing lipid droplets by differentiation induction
  • C D) shows Oil red 0 staining images of the differentiation-inducing cells, respectively.
  • Fig. 2 shows the plasma AP obtained by transplanting primary cultured adipocytes (derived from ICR subcutaneous fat) transiently transfected with plasmid pcDNA3.1-SEAPmh expressing the plasmid for the expression of allelic phosphatase (AP) into ICR nude mice. It is a figure which shows activity.
  • Fig. 3 shows a comparison of gene transfer efficiency when retroviral vector MLV (VSV) / pBabeCL (PLAP) IP was introduced into primary cultured adipocytes derived from each adipose tissue.
  • 4 is a micrograph showing an image of induction of differentiation of primary cultured adipocytes into which MLV (VSV) / pBabeCL (GFP) IP has been introduced.
  • A shows an optical micrograph
  • B shows a GFP fluorescence photograph in the same field as A.
  • FIG. 5 is a graph showing the persistence of AP expression in subculture of primary cultured adipocytes into which an AP-expressing virus vector has been introduced.
  • A C57BL / 6 mouse subcutaneous fat-derived cells As a result of introducing EAP gene (MLV (VSV) I pBabeCL (SEAPrah) I2G) or PLAP gene (MLV (VSV) / pBabeCL (PLAP) IP),
  • B PLA gene (MLV ( The results obtained by introducing VSV) / pBabeCL (PLAP) IP or GFP gene (MLV (VSV) / pBabeCL (GFP) IP) are shown.
  • FIG. 6 is a photograph and a diagram showing a change in expression in a transduced adipocyte induced to differentiate.
  • A Primary culture of ICR subcutaneous fat into which MLV (VSV) / pBabeCL (GFP) IP was introduced GFP light micrograph under induction of non-differentiation of adipocytes
  • B GFP micrograph under induction of Minich
  • C shows AP production of primary cultured adipocytes (derived from ICR subcutaneous fat) into which MLV (VSV) / pBabeCL (PLAP) IP was introduced under undifferentiation induction (undifferentiation) and under differentiation induction (differentiation), respectively.
  • FIG. 7 is a diagram showing (pro) insulin production by introducing a plasmid into primary cultured adipocytes.
  • FIG. 8 is a diagram showing stable expression of AP in primary cultured adipocytes (derived from subcutaneous fat of C57BL / 6 mouse) into which AP-expressed MV was introduced.
  • FIG. 9 is a graph showing insulin expression in primary cultured adipocytes into which the sls2B10 insulin-expressing retrovirus vector has been introduced, upon differentiation induction.
  • A Results by Morinaga EIA
  • B Results by IBL EIA.
  • FIG. 10 is a diagram showing the expression of GLP-1 (7-37) in primary cultured adipocytes transfected with a GLP-1 (7-37) expression retroviral vector. Three measurements were made for each, and the results were shown as the average and standard deviation.
  • FIG. 11 is a graph showing the effect of pre-transplant differentiation induction stimulus on in vivo AP expression in transplantation of primary cultured adipocytes expressing AP.
  • FIG. 12 shows (A) changes in plasma AP activity when transplanted using AP-expressing primary cultured adipocytes using Matrigel with differentiation stimulus and basic FGF, and (B) plasma extracted by transplanted Matrigel.
  • FIG. 4 shows a diagram and a photograph, respectively, showing the disappearance of medium AP activity (individual A), and a GFP light microscopic image of Matrigel extracted from a GFP-transfected cell transplant group as a control (0).
  • the group mean and standard deviation of the measured values for each individual were shown, and the others were shown as the mean.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of a longer-term study of the blood AP activity of mice transplanted with FIG. 12 (A) and various other methods.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of performing the same excision test as illustrated in FIG. 12 (B) in the late stage of transplantation.
  • FIG. 15 is a graph showing the number of transplanted cells and the blood AP activity in the transplantation of AP-expressing adipocytes. The results were shown as the group mean and standard deviation of the measured values for each individual.
  • FIG. 16 shows the effect of transplanting sls2B10 insulin-expressing adipocytes to STZ-induced diabetic mice.
  • A shows the effect on fasting blood glucose
  • B shows the effect on body weight. The results were shown as the group mean and standard deviation of the measured values for each individual.
  • the suspended layer was further diluted with collagenase by centrifugation twice and added to a T-25 flask (IWAKI) filled with the medium. Except foam, conventional culture surface and cultured 37 ° C with C0 2 incubator to be heaven, in 53 ⁇ 4 C0 2 (ceiling culture). After culturing for 10 to 14 days, cells adhered to the ceiling surface by trypsin treatment were collected and transferred to a usual culture system. Thereafter, subculture was performed at a ratio of 1: 3 to 1:10.
  • induction of differentiation cells cultured confluently in a 6-well plate were replaced with an induction medium (normal medium supplemented with 0.5 mM IBMX, 0.25 / iM dexamethasone, 10 Aig / ml Insulin) and stimulated for 48 hours. . Then, cultivation was performed in a maturation medium (normal medium supplemented with 10 ⁇ g / ml insulin) to induce shiroi. The maturation medium was changed every three days.
  • induction medium normal medium supplemented with 0.5 mM IBMX, 0.25 / iM dexamethasone, 10 Aig / ml Insulin
  • maturation medium normal medium supplemented with 10 ⁇ g / ml insulin
  • the Oil red 0 staining solution was prepared by mixing 0.3 g of Oil red 0 with 100 ml of isopropanol (99%) in a stock solution and distilled water at a ratio of 3: 2 when used.
  • the cells were washed with PBS and fixed with 10% neutral formalin solution (WAK0). After washing again with PBS, the cells were stained with Oil red 0 staining solution at room temperature for 10 minutes. After washing again with PBS, the microscope was examined.
  • FIG. 1 A micrograph of primary cultured adipocytes isolated from 3-week-old ICR mouse subcutaneous fat is shown in FIG.
  • Adhesion of fat cells having lipid droplets was observed on the ceiling culture surface 14 days after ceiling culture (A). When this was transferred to a normal culture system, it proliferated like a fibroblast as shown in (B), but when differentiation was induced with IBMX, dexamethasone, and insulin, it differentiated again into mature adipocytes with lipid droplets (C). The stored fat was stained red by Oilred 0 staining (D). The cells isolated by this means were shown to be primary cultured adipocytes having the potential for differentiation.
  • thermostable secretory al-lipophosphatase (AP) gene into primary cultured adipocytes and transfer of transfected adipocytes to mice
  • the AP gene that is, the SEAP gene (Clontech) or the PLAP gene (Goto M. et al. Mol. Pharmacol, vol. 49 860-873 (1996)) was first introduced. The change in AP activity was examined by transfection into subcultured adipocytes. (Both AP gene products are heat-resistant and can be easily distinguished from endogenous alkaline phosphatase by heat treatment.)
  • the plasmid expressing AP (pcDNA3.1-SEAPmh) is a mammalian cell expression vector pcDNA3.-SEAPmh, which is obtained by double-digesting the pSEAP2-basic vector (Clontech) with the restriction enzyme Hind II-Xba I. It was constructed by inserting into the '2III-II site of lMyc-HisA (Invitrogen).
  • the transfected cells were collected by trypsin treatment, washed twice by centrifugation with PBS, and suspended in PBS at 1 ⁇ 10 7 cells / ml.
  • Animals ICR nude mice, 5 weeks old at the time of surgery
  • pentobarbital sodium Naembutal 'Dainippon Pharmaceutical
  • 0.55 ml (5.5 ⁇ 10 6 cells / head) of the prepared cell suspension was prepared with a 1 ml syringe, and injected into subcutaneous fat using a 22G injection needle.
  • control was injected with PBS at the same site.
  • purified AP (Roche) g was aseptically dissolved in PBS and injected similarly.
  • the incised skin was sutured, and the surgical site was disinfected with surgical isodine (Meiji Seika).
  • Heparin-coated capillaries before (day 0) and daily after transplantation (Dramond ) was used to collect blood from the fundus venous plexus.
  • Plasma was obtained from whole blood by centrifugation at 2000 g for IS minutes.
  • the AP activity in the plasma was measured using a measurement kit (SEAP reporter gene assay kit, manufactured by Roche) according to the attached manual.
  • Fig. 2 shows the plasma AP activity obtained by transplanting primary cultured cells into which mice were transiently transfected with plasmid pDNA3.1-SEAPmh that expresses allelic phosphatase (AP).
  • AP allelic phosphatase
  • Infusion of lxg of purified AP protein (Roche) administered as a control reduced blood AP activity to control levels 7 days after administration.
  • the blood AP activity peaked on the 4th day after the transplantation, and the expression period was 14 days.
  • In vivo expression by transiently transfected cell transplantation is slightly more sustained than protein injection, but for a shorter period of time, and variability in blood concentration is clear
  • Example 3 Production of adipocytes stably expressing AP using virus vector
  • the PLAP gene was cut out from pTK-PLAP described in the literature (Goto M. et al. Mol. Pharmacol, vol. 49 860-873 (1996)) using III and II.
  • the SEAP gene was obtained by double digestion of pcDNA3.1-SEAPmh with 111 / PmeI.
  • the GFP gene was excised from pEGFP-N2 using ⁇ ⁇ l-NcoI.
  • the plasmid pBabeCLXI2G used for the production of the virus vector is based on pBabePuro (Morgens tern, JP et al. Nucleic Acids Res.vol. 18 3587-3596 (1990)), and from there, the SV40 promoter and the neomycin resistance gene>& l After excising with -Cla I, smoothing with Klenow fragment, and IRES (internal ribosome re-rentry site) of encephalomyocarditis virus (EMCV) excised from pIRES2-EGFP with Hinc II-Hinc II ) And GFP (green fluorescent protein) And the part from the LTR (long terminal repeat) to the foreign gene insertion site (multicloning site) (53 ⁇ 4D I-a »HI) is replaced with the corresponding sequence G3 ⁇ 4p l-Bam HI of pCLXSN (IMGENEX). It is created by replacement.
  • the procedure was as follows for gene transfer into a 10 cm dish. 500 ⁇ l of FCS-free DMEM medium was mixed with 30 ⁇ l of plasmid introduction reagent TransIT (Mirus) and left at room temperature for 5 minutes
  • plasmid solution After mixing well added to plasmid solution DMEM / TransIT mixture was left for 1 5 minutes at room temperature further, the day before the 2xl0 6 cells / 10cm prepared were over ⁇ cultured dish 293- EBNA cells (Invitrogen) I cooked it.
  • Some virus solutions were concentrated by ultracentrifugation (19,500 rpm, 100 minutes) before use.
  • the adipocytes used for gene transfer (derived from subcutaneous fat from ICR mice, from peri-epithelial fat, from mesenteric fat, from subcutaneous fat from C57BL / 6 mice) should be 50-80% confluent the day before transfection. Or prepared in a 96-well plate. The medium was removed, and a virus vector was introduced by adding equal amounts of a 4 / g / ml Polybrene (SIGMA) solution and a virus solution to the cells. Eight hours after the introduction, the medium was replaced with a normal medium, followed by further culturing and subculturing. For some cells, the culture supernatant for 24 hours was collected on the fourth day after the introduction, and the AP activity was measured (FIG. 3).
  • SIGMA 4 / g / ml Polybrene
  • Subculture is performed on a 10-cm dish scale according to the method described in Example 1.After culturing for 4 to 7 days to reach confluence, change the medium and measure the AP activity in the culture supernatant after 17 hours. did. The cells were continuously subcultured and the same procedure was repeated as appropriate to examine the duration of expression (Figs. 5 and 6). AP activity was not measured on every passage. Differentiation was induced in a 6-well plate according to the method described in Example 1. However, the cells were treated with the induction medium for 3 days, and thereafter the maturation medium was replaced every 3 days. The AP activity in the culture supernatant was measured using the culture supernatant every three days, and the horizontal axis in the figure is the day on which the supernatant was collected. Microphotographs of GFP-transduced cells were taken under GFP light as appropriate ( Figures 4 and 6).
  • the non-differentiation induction condition means a condition in which the culture is continued in a normal medium instead of the induction medium and the mature medium.
  • FIG. 3 is a diagram showing a comparison of gene transfer efficiency for each tissue-derived cell when a retrovirus vector is used.
  • FIG. 4 is a microscopic image showing a differentiation induction image of cells into which the GFP-expressing retrovirus vector has been introduced. Induction of differentiation started 3 days after gene transfer, and photos were taken 3 weeks later. Taken. GFP fluorescence was observed in cells containing lipid droplets, indicating that the virus vector was capable of gene transfer into preadipocytes having differentiation ability, and that gene transfer by the vector had an effect on sorting ability. Revealed that there is no.
  • FIG. 5 is a diagram showing the persistence of expression in subculture of primary cultured adipocytes into which an AP-expressing viral vector has been introduced.
  • the AP activity in the culture supernatant 17 hours after the cells reached confluence in a 10 cm dish was measured. Sustained AP production was observed for 87 days in primary cultured adipocytes derived from C57BL / 6 mouse subcutaneous fat (A) and 63 days in primary cultured adipocytes derived from ICR mouse subcutaneous fat (B).
  • A primary cultured adipocytes derived from C57BL / 6 mouse subcutaneous fat
  • B ICR mouse subcutaneous fat
  • FIG. 6 is a photograph and a diagram showing a change in expression in a transduced adipocyte induced to differentiate.
  • GFP-expressing adipocytes derived from ICR subcutaneous fat strong GFP expression was observed both under normal culture (A) and under differentiation induction (B).
  • continuous expression of AP was detected in both APs-derived adipocytes derived from ICR subcutaneous fat under undifferentiation induction (undifferentiation) and under differentiation induction (differentiation) (C).
  • the primary cultured adipocytes transfected with the viral vector stably express the gene not only under the proliferation shown in FIG. 5 but also under any phase of non-differentiation induction, ie, non-proliferative state or maturation. Clarified.
  • Example 4 Production of Adipocytes Stably Expressing Insulin Using a Plasmid Vector
  • a method using a plasmid vector is also acceptable.
  • a human insulin gene fragment was subjected to a PCR reaction with a human kidney-derived cDNA library (Stratagene) using the primers (Insulin Fw and Rv) shown in Table 1.
  • the nucleotide sequence of the obtained 354 bp fragment was identified and subcloned into pCR2.1T0P0 vector (Invitrogen) as native insulin.
  • Table 1 Primer sequence used for PCR reaction Primer-base sequence (5'-)
  • Insulin Fw CATAAGCTTACCATGGCCCTGTGGATGCGC SEQ ID NO: 1
  • GLP-5 'TTCCACCATGCTGCTGCTGC (SEQ ID NO: 8)
  • GLP-3 'AATTATCCTCGGCCTTTCACCAG (SEQ ID NO: 9)
  • the EIA kit detects both proinsulin before processing and mature insulin.
  • FIG. 7 is a diagram showing (pro) insulin production by introducing a plasmid into primary cultured adipocytes.
  • Human (pro) insulin was detected in the culture supernatant of the resistant cells obtained by G418 selection. It has been shown that stable gene transfer into primary cultured adipocytes is also possible with a plasmid vector.
  • Example 5 Preparation of adipocytes stably expressing AP using adeno-associated virus As a method for introducing a gene, a method using adeno-associated virus (AAV) is also acceptable.
  • AAV adeno-associated virus
  • the preparation of the AAV vector was performed as follows. OPTI-MEM (Invitrogen) 1. Mix 75 ml of plasmid introduction reagent Fugene 220 ⁇ and then pAAV-PLAP, pMV-RC and pHelper. , O r. PCT / JP03 / 07721
  • adipocytes derived from C57BL / 6 mouse subcutaneous fat
  • 40 mM Hydroxyurea and ImM Butylic acid both SIGMA
  • the cells were treated with the containing medium for 6 hours.
  • a virus solution diluted 1/100 with FMEM-free DMEM was added at 0.5 ml / well.
  • a medium containing FCS was added to a final concentration of 10%, and the cells were cultured overnight. Thereafter, normal medium exchange was performed, and the cells were passaged on the 24th day.
  • the medium was changed on days 1, 7, and 25 after the introduction, and the culture supernatant two days after each was used for AP measurement. 20 minutes heating at 65 ° C, the diluted if necessary culture supernatant 10 ⁇ ⁇ , and 50 mu 1 of ⁇ Tsu Si buffer (16mM NaHC0 3, 12mM Na 2 C0 3, 0. 8mM MgS0 4), 50 ⁇ 1 Lumistin reagent (CDP-Star Ready to Use with Sapphierll, TROPIX) was mixed and reacted for 30 minutes under light shielding, and measured with a luminometer.
  • FIG. 8 is a diagram showing stable expression of AP in primary cultured adipocytes (derived from subcutaneous fat of C57BL / 6 mouse) into which AP-expressed MV was introduced. AP activity in the culture supernatant was detected continuously throughout the entire test period. It has been shown that stable gene transfer to primary cultured adipocytes can also be obtained with MV vectors.
  • the modified human insulin gene (sls2B10Ins) constructed in Example 4 was inserted into the pBabeCLXI2G vector according to the method of Example 3 (pBabeCL (sls2B10Ins) I2G).
  • a modified insulin-expressing retrovirus vector MLV (VSV) / pBabeCL (sls2B10Ins) I2G).
  • the transfected cells were replated on a 6-well plate, and differentiation was induced according to the method of Example 1.
  • the culture supernatants were collected from 3 days before induction to 3 days before induction (before induction) and from 14 days after induction to 17 days after induction (after induction).
  • the amount of insulin was measured.
  • the measurement of an insulin EIA kit (IBL) that recognizes only mature insulin was performed.
  • IBL insulin EIA kit
  • FIG. 9 is a graph showing insulin expression in primary cultured adipocytes into which the sls2B10 insulin-expressing retrovirus vector has been introduced, upon differentiation induction.
  • A Results by Morinaga EIA
  • B Results by IBL EIA. It has been shown that insulin is secreted stably before or after induction of differentiation and that mature insulin can be produced from adipocytes by introducing a mutant insulin gene. 0 ⁇
  • Example 7 Construction of a retrovirus vector expressing human glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and introduction into adipocytes.
  • GLP-1 human glucagon-like peptide-1
  • GLP-1 is a peptide produced from small intestinal L cells during feeding and acting on ⁇ j8 cells to stimulate insulin secretion. In addition, it has been shown to have a variety of anti-diabetic and anti-obesity effects, such as ⁇ cell regeneration, appetite suppression, and gastric emptying (Meier JJ et al. Eur J Pharmacol. 2002 , 12; 440 (2-3): 269-79, Drucker DJ. Gastroenterology. 2002; 122 (2): 531-544).
  • This peptide is a GLP-1 amino acid sequence of peptides 7 to 37 (or the amide form of No. 36) produced by tissue-specific processing from a polypeptide produced from the prebud dalgon gene.
  • a sequence containing the signal peptide (17-amino acid) of the PLAP gene used in Example 3 and a sequence in which human GLP-1 (7-37) and a stop codon are linked (the coding sequence is shown in SEQ ID NO: 10).
  • the nucleotide sequence of the 156 base pair was designed, and nucleotides were synthesized so as to have a 22-mer overlap at the center (sPL-GLP-lFw and sPb "GLP-IRv” in Table 1). This was annealed and Pfu polymerase (Stratagene) After that, the target fragment was amplified by PCR using primers at the 5'-end, 3'-end (GLP-5 'and GLP-3' in Table 1).
  • adipocytes derived from subcutaneous fat of C57BL / 6 seeded on a 6-well plate the day before.
  • the introduced adipocytes were replated on a 12-well plate, and the differentiation was induced according to the method of Example 1.
  • Non-induced refers to conditions in which the culture was continued in a normal medium instead of the induction medium / maturation medium.
  • the medium was replaced with a FCS-free DMEM medium containing ImM Valine-pyrrolidine (GLP-1 degrading enzyme inhibitor, synthesized by Eisai Co., Ltd.). After 18 hours, collect the culture supernatant and measure the amount of active GLP-1 (7-37) by ELISA (LINC0)
  • FIG. 10 is a diagram showing expression in primary cultured adipocytes transfected with a GLP-1 (7-37) expression retrovirus vector. Expression of the active form of GLP-1 (7-37) was observed in the culture supernatant of adipocytes after undifferentiation induction and differentiation induction. The present method revealed that, even if the factor is produced in the preprotype and excised by processing, only that factor can be produced from adipocytes.
  • AP-expressing adipocytes (MLV (VSV) / pBabeCL (PLAP) IP introduced, derived from C57BL / 6 subcutaneous fat) produced by the method of Example 3 were cultured in a confluent, collected by trypsin treatment, and washed with PBS. later, suspended in Matrigel (Beet on Dickinson) under ice cold so as to 5xl0 7 cells / ml. This was transplanted by injecting 0.2 ml / mouse (1 ⁇ 10 s cells / head) per mouse into the back subcutaneous (Sc) of C57BL / 6 mice (8 weeks old at surgery, Charles River). No guidance).
  • the cells were cultured in the induction medium described in Example 1 for 3 days, and the same treatment was performed. (With differentiation induction). Blood was collected daily using the method described in Example 2, and the AP activity in plasma was measured.
  • FIG. 11 is a graph showing changes in plasma AP activity in mice transplanted with AP-expressed primary cultured adipocytes.
  • expression persisted for the entire test period of about 50 days, but the transplanted individuals (with differentiation induction) were given a 3-day differentiation-inducing stimulus before transplantation, and were more likely to induce induction. It lasted with a smaller fluctuation range than the individual transplanted without. It was shown that the survival rate after transplantation could be improved by giving a differentiation-inducing stimulus.
  • ICR subcutaneous fat-derived produced in Example 3 was cultured in Konfuruento, after washing with recovered PBS by trypsinization, 5xl0 7 cells The suspension was suspended in Matrigel (Becton Dickinson) at an ice temperature to which bFGF (Genzyme Techne) at / zg / ml was added. 0.2ml per mouse in the subcutaneous back (Sc), subcutaneous fat (fat) and intraperitoneal (ip) sites of ICR nude mice (6 weeks old at surgery, Charles River) (LxlO 6 cells / head). As a control, GFP-expressing lupus cells were treated similarly and implanted subcutaneously.
  • MMV subcutaneous back
  • ip intraperitoneal
  • AP-expressing cells were cultured and cultured in the induction medium described in Example 1 for 3 days and then transplanted (Dif). In addition, a part of the medium was further cultured for 4 days in a maturation medium after the induction medium, and similarly collected and transplanted (Mat).
  • AP-expressing cells were solidified by seeding them in the same well (1x1070.2 ml Matrigel-bFGF added) in an 8 well-Labteck chamber (Nunc) and heating at 37 ° C. did.
  • the solidified gel was implanted by subcutaneously injecting it into mice. At this time, those cultured in a normal medium after solidification were defined as pre-fixed (pf) / gr, and those cultured in a differentiation-inducing medium were defined as pf / d, and transplanted after culture for ⁇ days.
  • AP activity in plasma was measured according to the method of Example 2 before (day 0) and daily after transplantation.
  • the transplanted cell mass together with Matrigel was excised for individual A at 5 weeks after transplantation and for individual B at 43 weeks after transplantation.
  • One case in the control group was also removed at 5 weeks after transplantation.
  • After anesthesia by intraperitoneal administration of 50 mg / kg of Nembutal the skin was incised, and the graft matrigel pieces that were visually confirmed were excised.
  • the surgical site was sutured and disinfected with Isodine (Meiji). Thereafter, the animals were bred in the same manner and blood was collected daily.
  • FIG. 12 shows the change in plasma AP activity when primary cultured adipocytes expressing AP were transplanted using Matrigel with differentiation stimulation and basic FGF (Dif / Sc group). This is the result of examining for 50 days. The blood AP activity remained stable for about 490 in the range of about 5 times. It was shown that by adding bFGF at the time of transplantation, the survival rate after transplantation can be further improved.
  • (B) shows the disappearance of plasma AP activity (individual A) due to the removal of transplanted Matrigel during the same period.
  • FIG. 13 shows the transplanted mice in Fig. 12 (A)
  • FIG. 3 shows the results of a longer-term study of blood AP activity in transplanted mice.
  • the transplantation group of PLAP-introduced cells a clear increase in blood AP activity was observed at all transplantation sites and transplantation methods.
  • the blood AP activity persisted for a long time, and in particular, the Mf / Sc group (the group exemplified in Fig. 12 (A)) showed stable AP expression for one year during the test period. All other transplantation methods were within the test period (316 days for the ip group, 54 days for the fat group, 225 days for the Sc group, 317 days for the Mat / Sc group, and 314 days for the prefix group).
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of performing the same excision test as illustrated in FIG. 12 (B) in the late stage of transplantation. Not only in the individual isolated in the early stage of transplantation (individual A), but also in the individual extirpated in the late stage of transplantation (individual B), the disappearance of blood AP activity immediately after extirpation was observed. It was clarified that adipocytes transplanted by this method were localized at the transplant site for a long period after transplantation, and that gene expression could be eliminated by excision as needed regardless of the timing.
  • AP-expressing adipocytes prepared in Example 3 (MLV (VSV) / pBabeCL (PLAP) IP transfection, ICR subcutaneous 1 ob
  • Example 2 (Derived from fat) was cultured in a confluent medium, followed by culturing in the induction medium described in Example 1 for 3 days, and then recovered by trypsinization. After washing with PBS, and suspended in Matrigel so that 5xl0 7 cells / ml. Perform dilutions of five-fold by matrigel for AP cell suspension, respectively lxlO 7 cells / ml, the 2xl0 6 cells / ml solution was prepared.
  • FIG. 15 is a graph showing the number of transplanted cells and the blood AP activity in the transplantation of AP-expressing adipocytes.
  • Diabetic mice were produced by intravenously administering 170 mg / kg streptozotocin (STZ, SIGMA) at 10 ml / kg to 8-week-old male C57BL / 6 mice.
  • FBG Fasting blood glucose
  • STZ Steptozotocin
  • SIGMA streptozotocin
  • the blood glucose level was measured using a glucose test- ⁇ (WAK0) after treatment of perchloric acid immediately after collection of whole blood.
  • the cells were suspended in Matrigel supplemented with 1 ⁇ g / ml bFGF at a concentration of 5 ⁇ 10 7 / ml.
  • the suspension by 0. 2 ml per one place, diabetic mice of the dorsal skin in a total of four positions (4xl0 6 / head) was pieces implanted.
  • non-transgenic adipocytes were transplanted in the same manner. Transplantation was performed 19 days after STZ treatment, and thereafter FBG was measured over time.
  • Statistical analysis was performed by comparison with the control group (unpaired t test)
  • FIG. 16 shows the effect of transplantation of adipocytes expressing sls2B10 insulin on STZ-induced diabetic mice.
  • Non-transfected cells were transplanted as controls.
  • the blood glucose level of the insulin-expressing cell transplant group showed a decreasing tendency from day 7 of transplantation, and showed a significant blood glucose lowering effect on days 13 and 21 of transplantation (A).
  • the body weight 20 days after transplantation was significantly higher in the insulin-expressing cell transplant group than in the control group, and the weight loss due to diabetes was recovered (B).
  • the results of studies using AP suggest that this hypoglycemic effect is long-lasting.
  • the exogenous gene product produced from the transplanted primary cultured adipocytes can contribute to the modification of the recipient's condition, and at the same time show the possibility of treating diabetes with this method.
  • a method for introducing a foreign gene into a primary cultured adipocyte suitable for ex vivo gene therapy has been established, and a primary cultured adipocyte stably retaining a foreign gene has been established.

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Abstract

本発明は、細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する、初代培養の遺伝子治療用脂肪細胞に関する。本発明は、従来エクスビボの遺伝子治療に用いられてきた骨髄細胞や肝臓細胞に代わる、遺伝子治療に適した細胞を提供する。本発明により、採取及び移植が容易で移植後に取り除くことも可能な、エクスビボでの遺伝子治療に適した初代培養脂肪細胞に、外来遺伝子を導入する方法、特にレトロウイルスベクターを用いる方法が確立され、細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する、初代培養遺伝子治療用脂肪細胞が確立された。

Description

明細 遺伝子治療用初代培養脂肪細胞 技術分野
本 明は、 外来遺伝子を導入した初代培養の遺伝子治療用脂肪細胞に関する。 背景技術
現在行われている遺伝子治療 （豊岡ら、 Folia Pharmacol. Jpn. 116: 158-162， 2000) は、 （1)治療用遺伝子をコードするウィルスベクターまたは naked plasmid 等を直接患者に投与して遺伝子導入する方法 （インビポ） 、 （2)患者から細胞を一 且取り出し、 その細胞に遺伝子を導入して患者に戻す方法 （ェタスビボ） 、 の 2 種類に大別することができる。
このうち、 インビボの方法は、 導入効率や発現の持続、 標的細胞への選択的な 遺伝子導入という点に大きな課題を残している。 一方、 エタスビポの方法はこれ らの課題をクリアしうる可能性がある。 エタスビボにおいては、 採取と移植が比 較的に容易で患者への負担が少ないことから血液系の細胞 （抹消血リンパ球、 骨 髄細胞） を使った例が大多数を占め （谷ら、 最新医学， 56: 258-267， 2001) 、 ま た、 血液系以外の細胞では肝臓細胞に遺伝子導入し戻す方法 （Raper SE et al. , Cell Transplant 2 (5) : 381-400, 1993) が行われているが、 そのほとんどが導入 細胞自体の機能回復 ·維持 ·増強に主眼が置かれている。 発明の開示
ェクスビボの遺伝子治療に適した細胞を探し出す過程で、 本発明者らは、 初代 培養の脂肪細胞を用いることを考えた。 脂肪細胞を用いる利点として、 以下の点 が挙げられる。 (1) 脂肪細胞から分泌される液性因子が複数報告され、 脂肪細胞がホルモン産生 •分泌臓器としての機能を有している （Bradley RD， et al. , Recent Prog Horm
Res, 2001； 56, 329-358)。
(2) 皮下にも存在するために採取が容易であり、 更に形成外科 '美容整形分野等 で摘出に関する技術が発達しつつある。 また、 容易に移植可能である皮下に移植 した場合でも、 本来そこに存在する細胞であるため異所にならなレ、。
(3) 単離した初代培養脂肪細胞はインビトロでも活発に増殖するため、 遺伝子導 入などの操作に適している。
(4) 移植後に局所に生着すると予想されるため、 移植後に移植細胞を取り出した い場合 （すなわち、 遺伝子発現を消去したい場合） でも対応可能である。
(5) 脂肪細胞自身が血管新生因子を産生する (Mick GJ, et al. , Endocrinology 2002；143 (3) :948-53) ので、 移植後の高い生着が期待できる。
(6) 成体において大きく重量を変動させる臓器であり、 摘出 Z移植による人体へ の影響が少ない。
(7) 脂肪細胞は余分なもの ·邪魔なものという認識が強く、 採取の同意を得やす いと予想される。
現在、 同様の試みとしてケラチノサイトを用いた検討が行われている （J Gene Med 2001 Jan- Feb ; 3 (1) : 21- 31、 Histochem Cell Biol 2001 Jan ; 115 (1) : 73 - 82) 、 初代培養を単離する過程で生体パリァである皮膚を除去することは、 感染リ スクの点などから問題がある。 除去 ·移植に伴う患者の苦痛も強いと予想され、 発現を消すための再摘出 （上記 4 ) なども容易ではない。 また、 2次元でしか移植 できないケラチノサイト /皮膚は、 移植量の増加を移植平面の面積増加でしか達成 できず、 立体的に移植可能な脂肪細胞がより有用であると考えられる。
本発明者らは、 初代培養した脂肪細胞に効率よく遺伝子を導入する方法を考案 し、 更に導入した遺伝子が移植後も機能していることを確認して、 脂肪細胞が遺 伝子治療に有効に活用できることを見出した。 しかも本発明の方法によれば、 導 入した外来遺伝子を体内で長期間安定して発現する脂肪細胞を得ることが可能で ある。 移植した成熟脂肪細胞は 1年以上にわたって外来遺伝子の発現を持続する ことができる。 また、 脂肪細胞を移植後に、 外来遺伝子の発現が不要となれば、 移植片を取り出すことで外来遺伝子の発現を停止させることも可能である。
すなわち本発明は、 細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に 保持する、 初代培養の遺伝子治療用脂肪細胞、 該細胞の製造方法、 該細胞を含む 移植組成物、 およぴ該細胞の利用等に関し、 より具体的には
〔1〕 細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する、 初代 培養の遺伝子治療用脂肪細胞、
〔2〕 該遺伝子がレトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウィルスベクターに より該細胞に導入された、 〔1〕 に記載の脂肪細胞、
〔3〕 体内で少なくとも 2 0日以上にわたって該蛋白質を有意に発現する能力を 有する、 〔1〕 に記載の脂肪細胞、
〔4〕 該蛋白質を血中に放出させるために用いる、 〔1〕 に記載の脂肪細胞、
〔 5〕 該蛋白質がィンスリンまたは G L P - 1 (Glucagon-Like Peptide 1) であ る、 〔1〕 に記載の方法、
〔6〕 以下の工程、
(i) 脂肪細胞を初代培養する工程、
(ii) 細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を導入し、 安定に保持さ せる工程、
を含んでなる遺伝子治療用脂肪細胞を製造する方法、
〔7〕 該外来遺伝子をレトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウィルスベクタ 一により導入する、 〔6〕 に記載の方法、
〔8〕 〔6〕 または 〔7〕 に記載の方法により製造された遺伝子治療用脂肪細胞
〔9〕 細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する初代培 養の脂肪細胞、 および薬学的に許容される担体を含む、 遺伝子治療用の移植組成 物、 .
〔1 0〕 さらに細胞外基質成分を含む、 〔9〕 に記載の移植用組成物、
〔1 1〕 さらに血管新生因子を含む、 〔9〕 に記載の移植用組成物、
〔1 2〕 細胞外に分泌される所望の治療蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に 保持する初代培養の脂肪細胞を体内に投与する工程を含む、 遺伝子治療方法、 〔1 3〕 蛋白質を血中に放出させる方法であって、 細胞外に分泌される蛋白質を コードする外来遺伝子を安定に保持する初代培養の脂肪細胞を体内に投与するェ 程を含む方法、
〔1 4〕 該蛋白質を血中 2 0日以上にわたって血中に放出させる方法である、 〔 1 3〕 に記載の方法、
〔1 5〕 血糖を低下させる方法であって、 インスリンまたは G L P— 1 (Glucago n-Like Peptide 1) をコードする遺伝子を安定に保持する初代培養の脂肪細胞を 体内に投与する工程を含む方法、
[ 1 6〕 細胞外に分泌される蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する初 代培養の脂肪細胞が体内に移植された動物、 に関する。 以下に本発明の実施の形態について説明する。
本発明は、 まず、 細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保 持する、 初代培養の遺伝子治療用脂肪細胞を提供する。
ここで外来遺伝子とは、 初代培養脂肪細胞に外から導入された遺伝子を言レ、、 初代培養脂肪細胞が産生していない蛋白質をコードする遺伝子などが含まれる。 また初代培養の細胞とは、 生体から取り出された組織から培養された細胞で、 株 化していない細胞を言う。 また脂肪細胞 （adipocytes) とは成熟脂肪細胞 (mature adipocytes) ならびに前脂肪細胞 （preadipocytes) などの脂肪に分化する能力 を有する細胞をいう。 すなわち、 特に成熟"脂肪細胞と断らない限り、 脂肪細胞 には前脂肪細胞も含まれる。 成熟脂肪細胞は球形で脂肪を蓄えた細胞であり油滴 を含んでいる。 成熟脂肪細胞に蓄えられた脂肪は oil red 0染色によって確認する ことができる。 成熟脂肪細胞は、 一般的にィンスリンに応答してレブチン（leptin ) を分泌する。 前脂肪細胞は、 本来、 成熟脂肪細胞に分化する前の間質 （stromal ) 細胞として存在する。 前脂肪細胞は、 脂肪組織 （adipose tissue) をコラゲナ ーゼ処理して単離することができるが、 後述する天井培養法によって成熟脂肪細 胞が分裂した結果生じる前脂肪細胞を単離することもできる （杉原ら、 日本臨床 1 995、 53； 115-120、 Sugihara H, et al. J Lipid Res. 1987, 28 ; 1038-1045、 Zha ng HH, et al. J Endcriniol. 2000, 164: 119—128) 。 また、 脂肪細胞特異的な表 面抗原の存在は確認されてはいないが、 CD36などは成熟脂肪細胞に強く発現が認 められる （Aburarad NA, et al. J Biol Chem. 1993 Aug 25 ;268 (24)： 17665-8. ) 。 よってこのような分子をマーカーにしてより高い純度で脂肪細胞を回収するこ とも考えられる。 前脂肪細胞は、 後述する分化誘導によって数日から数週間の間 に成熟脂肪細胞に分化することができる （Hauner H， et al. , J. Clin. Invest. 84, 1663-1670, 1989 ; Marko, et al. Endocrinology 136, 4582 - 4588， 1994)。 初代脂肪細胞は所望の a織から単離してもよく、 例えば皮下脂肪組織、 副睾丸周 囲または腸間膜などの内臓脂肪組織から得ることができる。
遺伝子治療用とは、 外来遺伝子がコードする蛋白質を、 その効果を期待して体 内において発現させる用途に用いることを言う。 また遺伝子治療用細胞とは、 ェ クスビポ投与により外来遺伝子を体内に投与する用途に用いる、 さらにェクスビ ボで投与された体内で該蛋白質を発現する能力を有する、 該外来遺伝子を保持す る細胞のことを言う。 ェクスビボ投与とは、 脂肪組織または脂肪細胞を個体より 取り出し、 インビトロで遺伝子導入を行つた後、 同一または別の個体に移植する ことを言う。
遺伝子治療用細胞は、 より好ましくは、 ある特定の蛋白質を産生する細胞を移 入して疾患を治療するために用いる細胞を言う。 好ましくは、 ある特定の蛋白質 による治療は、 その物理的もしくは機能的な不足あるいは欠如により疾患が引き 起こされる蛋白質による補充療法、 ないしはある病態の発症 '悪性ィ匕をきたす因 子を中和しうる作用を有する蛋白による中和療法が挙げられる。 ある特定の蛋白 質とは、 血流中で活性を示す、 もしくは血流中から対象組織に供給され、 該組織 の細胞表面で作用する蛋白質であり、 一定の期間 （例えば数日から数週間、 また はそれ以上にわたって） 持続的な供給を必要とするものが望ましい。 すでに蛋白 補充療法が施行されている、 もしくは有効性が予測されている因子および疾患は すべて対象となり得る。
以下に、 代表的な対象を分類別に記載するが、 用途はこれに限定されるもので はなく、 類似の目的により類似の因子を使用することは本発明の範疇に含まれる 補充療法には、 ホルモンまたはサイトカインの不足 ·機能低下により発症 ·増 悪する疾患に対する補充、 先天性の遺伝子欠損による疾患に対する補充、 病態改 善因子の補充、 などが含まれる。
インスリン /糖尿病、 グルカゴン様ぺプチド- 1 (GLP-1) /糖尿病 ·肥満 ·摂 食障害、 GLP- 2/炎症性腸疾患'癌ィ匕学療法などに伴う消化管障害、 レプチ ン /肥満症 ·脂肪萎縮性糖尿病、 アディポネクチン/糖尿病 ·血管障害、 血 液凝固第 VIII ·第 IX因子/血友病、 リポプロテインリパーゼ （LPL) /LPL欠 損症 '高トリグリセリ ド血症、 レシチンコレステロールァシルトランスフ ェラーゼ（LCAT) /LCAT欠損症、 エリス口ポェチン /赤血球減少症、 ァポ A-I/ 低 HDL血症、 アルブミン/低蛋白血症、 心房性ナトリウムペプチド （ANP) I 高血圧 ·心不全、 黄体形成ホルモン放出ホルモン (LHRH)/乳がん ·前立腺ガ ン、 アンギオスタチン ·ェンドスタチン/血管新生 ·転移阻害、 モルヒネ受 容体作動ペプチド （内因性ォピオイドペプチド （エンケフアリン等） ゃダ ィノルフィン （dynolphin) 等） /疼痛緩和、 カルシトニン '骨形成因子 （ BMP) /骨粗しょう症、 インターフェロン—α ·— ]3 /悪性腫瘍、 インターフエ JP03/07721
ロン- γ /悪性腫瘍 '肝炎 ' ァレルギ一、 インターフェロン - /3 1 /多発性硬 化症、 インターロイキン -1 α ' -1 ]3 /悪性腫瘍、 インターロイキン- 4/乾癬 、 インターロイキン - 10/自己免疫疾患、 インターロイキン- 12/悪性腫瘍、 膝分泌性トリプシンィンヒビター/膝炎、 スーパーォキサイドデイスムター ゼ /虚血性心疾患'血管障害、 など 病態形成因子もしくは悪性ィヒ因子の中和療法には、 可溶化受容体や中和抗体の 部分べプチド、 ドミナントネガティブ型蛋白の産生がこれに含まれる。
腫瘍壊死因子 - a (TNF-ひ） 可溶ィ匕受容体/慢性関節リュウマチ、 可溶化 IgE 受容体/アレルギー、 可溶化 IgA受容体/食物アレルギー、 可溶化細胞障害性 Tリンパ球抗原- 4 (CTLA4) /自己免疫疾患、 可溶化 CD40リガンド /免疫疾患 、 ドミナントネガティプ型血液凝固第 Vila因子/血栓症、 繊維芽細胞増殖因 子 （FGF) 可溶化受容体/血管内膜肥厚、 など また、 本発明の脂肪細胞は、 いわゆる 「治療」 に用いるものに限定されず、 所 望の分 蛋白質を体内において発現させるために用いられる細胞が含まれる。 例 えば、 本発明の方法により、 ある特定の蛋白質を後天的に発現させてモデル動物 とすることが可能である。 該方法を用いれば、 病態発症因子もしくは悪性化因子 を後天性に発現する病体モデル動物の作製が可能であり、 該動物を用いて薬物を スクリーニングすることも可能となる。 また、 病態改善因子を発現させれば、 当 該因子が病態を改善するという新薬探索の作業仮説の証明にも利用できる。 動物 としては、 所望の非ヒト動物、 好ましくは非ヒト哺乳動物 （げっ歯類、 霊長類な どを含む） 力 S用いられる。
本発明の初代培養の遺伝子治療用脂肪細胞は、 細胞外に分泌する蛋白質をコー ドする外来遺伝子を安定に保持している。 「安定に保持する」 とは、 細胞分裂に 伴い、 外来遺伝子が娘細胞に受け継がれることを言い、 より具体的には外来遺伝 子が細胞の染色体に組み込まれていることを言う。 本発明の遺伝子治療用脂肪細 胞は、 好ましくは外来遺伝子が染色体組み込み型のウィルスべクターにより安定 に導入されている。 より好ましくは、 外来遺伝子がレトロウイルスベクターによ り導入されている。
レトロウイルスベクターは、 細胞の染色体に安定にインテグレートされ導入遺 伝子を長期間にわたって発現する能力を有しているが、 導入効率および導入遺伝 子の発現の持続性は細胞種に依存している。 例えば、 レトロウイルスベクターに より導入した遺伝子は、 細胞が増殖している間は発現が持続するが、 細胞の増殖 が止まると発現が停止することがある （Lund AH, et al. , J Biomed Sci 1996； 3 : 365-378； Niwa, 0. et al. , 1983， Cell, 32 : 1105-1113)。 外来遺伝子の発現の 抑制は、 特にィンビポまたはェクスビボにより体内に遺伝子を導入した後にしば しば観察される。 このような発現抑制には、 導入遺伝子のプロモーターまたはコ ード配列の de novoのメチル化が関与しているといわれている （Jahner D and Jae nisch R， Nature 315 : 594-597, 1985 ; Challita P- M and Kohn DB， Proc Natl Acad Sci USA 91 : 2567-2571， 1994； Hoeben RC et al. , J Virol 65： 904—912, 1991)。 また導入遺伝子のサイレンシングにはヒストンの脱ァセチルイ匕も関与して レヽる （Chen, W. Y. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 : 377-382, 2000； Chen , W. Y. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94： 5798—5803， 1997) 。 し力 しな がら、 本発明者らがレトロウイルスベクターを介して初代培養の脂肪細胞に外来 遺伝子を導入したところ、 驚くべきことに導入遺伝子の発現はィンビトロおよび インビボの両方において、 極めて安定に持続することが判明した。 導入遺伝子の 発現は、 分化前の脂肪細胞でも、 成熟脂肪細胞でも安定しており、 インビトロ培 養においては実験の全期間である 80日以上にわたって、 また体内に移植された場 合は実験の全期間である 360日以上にわたって発現が持続することが確認された。 従って、 外来遺伝子が安定に導入された初代培養の脂肪細胞は、 長期間安定して 該遺伝子を発現するィンプラントとして利用できることが判明した。 本発明の遺伝子治療用脂肪細胞は、 インビトロで、 さらに好ましくはインビボ において、 少なくとも 20日以上にわたって外来遺伝子がコードする蛋白質を有意 に発現する能力を有する。 有意に発現するとは、 例えば外来遺伝子を導入しない 場合に比べ、 統計学上有意に （例えば有意水準 5%またはそれより高い有意性をも つて） 発現が検出されることである。 より好ましくは、 本発明の脂肪細胞は、 体 内に移植された場合、 体内において少なくとも 30日以上、 より好ましくは 40日以 上、 より好ましくは 50日以上、 より好ましくは 60日以上、 より好ましくは 80日以 上、 より好ましくは 100日以上、 より好ましくは 150日以上、 より好ましくは 200日 以上、 より好ましくは 250日以上、 より好ましくは 300日以上、 より好ましくは 350 日以上にわたって、 外来遺伝子がコードする蛋白質を有意に発現する能力を有す る。
また本発明の遺伝子治療用脂肪細胞は、 該細胞が保持する外来遺伝子がコード する蛋白質を、 血中に放出させるための細胞として特に有用である。 血中に放出 させる蛋白質としては、 血流中または対象組織の細胞表面で活性を示す所望の分 泌蛋白質が含まれ、 例えばホルモンおよびサイトカインなどの所望の液性因子お よび抗体などが例示できる。 具体的には、 上記のように糖尿病などの治療におい てはィンスリンおよび/またはグルカゴン様ぺプチド- 1 (Glucagon-Like Peptide 1； GLP-1) 等の血糖降下ホルモン、 血友病などの治療においては血液凝固因子、 T NF- αが亢進する慢性関節リュゥマチなどの治療においては TNF- a受容体の可溶ィ匕 断片または抗 TNF- a抗体 （Fabおよび scFv等の抗体可変領域を含む抗体断片を含む ) 人工可溶化などが挙げられる。 例えばインスリンであれば、 効率よく成熟型ィ ンスリンを産生できるように開裂部位 （sitelおよび site2) を脂肪細胞内で発現 するプロテアーゼの開裂配列に置換することができる （例えば Groskreutz DJ, et al. JBC, 1994, 269 (8) , 6241) 。 また、 単鎖型に改変したインスリンアナログ を使用することもできる （Lee HC , et al.， Nature. 2000 Nov 23 ; 408 (6811)： 483-8. ) 。 GLP- 1としては、 GLP-1受容体 （NP—002053, Thorens, B. et al. , Diabe tes 42, 1678-1682 (1993)； Dillon, J. S. et al. , Endocrinology 133， 1907-191 0 (1993)； Graziano, M. P. et al. , Biochera. Biophys. Res. Commun. 196， 141-1 46 (1993) ; Stoff el, M. et al. , Diabetes 42, 1215-1218 (1993) ) のリガントと して作用する所望のぺプチドを用いることができるが、 例えば GLP- 1 (7- 37)などが 挙げられる （Diabetes, 1998， 47： 159-69； Endocrinology, 2001, 142： 521 - 7， Curr Pharm Des. , 2001, 7 : 1399 - 412, Gastroenterology, 2002, 122 : 531—44)。 また本発明は、 以下の工程、
(1) 脂肪細胞を初代培養する工程、
(2) 細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を導入、 好ましくはレトロ ウィルスベクターまたはアデノ随伴ウィルスベクターにより導入し、 安定に保持 させる工程、
を含んでなる遺伝子治療用脂肪細胞を作製する方法、 および、 この方法により作 製された遺伝子治療用脂肪細胞、 に関する。 安定に保持させるとは、 外来遺伝子 が細胞分裂に伴って娘細胞に受け継がれるように遺伝子を導入することを言い、 より具体的には外来遺伝子を細胞の染色体に組み込むことである。 外来遺伝子が 染色体に組み込まれ安定発現を獲得したことを分子生物学的に証明するためには 、 サザンブロット法やゲノム DNAを用いた PCR法などを行うことが出来る。 また、 安定導入細胞をより濃縮するためには、 例えば細胞に目的遺伝子と共に発現させ た GFPなどを認識させて濃縮する Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) な どの方法を用いることが出来る。
1 . 初代培養の脂肪細胞を採取する方法
初代培養の脂肪細胞は杉原らの報告 （Sugihara H. et al. , Differentiation, 31：42-49, 1986) に記載の方法により採取できる。 具体的には脂肪組織、 好まし くは移植レシピエント自身の皮下脂肪組織、 あるいは副睾丸周囲または腸間膜な どの内臓脂肪組織より脂肪組織を無菌的に摘出し、 例えば PBSで洗浄した後、 ハサ ミあるいは手術用ナイフを用いて細切する。 この細切組織を適量の、 好ましくは 1 〜3 mg/mlのコラゲナーゼを含む培地で 37°C、 適当な時間、 好ましくは 20〜60分間 震盪消化した後、 遠心により沈查と浮遊層に分離する。
浮遊層を、 好ましくは更に 1〜2回の遠心により洗浄した後、 培地を充満した 培養フラスコに加える。 泡を除き、 通常の培養面が天上になるように C02インキュ ベータ内に静置して培養する （天井培養） 。 適当な期間、 好ましくは 10〜； 14日間 培養後、 トリプシン処理によって天井面に接着した細胞を回収し、 以降、 通常通 りの培養系で継代培養する。
初代培養脂肪細胞は遺伝子導入前または後に凍結保存してもよい。 これにより 、 脂肪細胞を一回採取するだけで頻回使用が可能である。
2 . 脂肪細胞への遺伝子導入
遺伝子導入は、 遺伝子導入試薬 （Fugene 6： Roche社製、 Lipofectamin： Invitr ogen社製、 Cellphect transfection kit (リン酸-カルシウム法） ： Amersham社製 など） 、 電気的穿孔法 （エレクトロポレーシヨン法、 Chen H. et al.， J Biol. Chem. 1997 : 272 (12)， 8026-31) 、 ウィルスベクター （Kay ΜΑ· , et al. , Nat Med 2001, 7, 33-40) により行うことが出来る。 好ましくはウィルスベクターによる 導入であり、 更に好ましくはレトロウイルスベクター （Arai T. et al. , J. Viro 1.， 1998: 72, pplll5 - 21など） による導入である。
プラスミ ドにより導入する場合は、 プラスミ ドを脂肪細胞にトランスフヱクシ ヨンした後、 導入した外来遺伝子を安定に保持する脂肪細胞を選択することがで きる。 このような選択は、 例えば外来遺伝子をコードするプラスミドに薬剤耐性 遺伝子を保持させておくか、 あるいは薬剤耐性遺伝子を持つプラスミドと共にト ランスフエクシヨンを行い、 トランスフエクトした細胞を薬剤で選択することに より実施することができる。 あるいは、 トランスフエタトした細胞を限界希釈に よりクローン化することによって得ることができる。 またプラスミドにより導入 する場合は、 染色体への挿入効率を高めるために、 ファージ由来のインテグラー ゼを一過性に発現させる方法を用いてもよい (Mol Cell Biol. 2001 Jun;21 (12) : 3926-34) 。
ウィルスベクターを用いた脂肪細胞への遺伝子導入としては、 アデノ随伴ウイ ルス （adeno- associated virus ; AAV) を用いる方法が挙げられる。 MVとは、 パ ルポウィルス科 （Parvoviridae) の Dependovirus属に属するウィルスであり、 導 入遺伝子が染色体に組み込まれる性質を持つ。 2つの inverted terminal repeats (ITRs) の間に外来遺伝子を組み込み、 アデノウイルス El、 E2A、 E4蛋白質の存在 下、 MVのパッケージング蛋白質 （r印および cap遺伝子産物） を発現させることで 外来遺伝子が取り込まれた組み換え AVVベタターを作製することができる （Muzycz ka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97 - 29 ; Kaplitt, M. G. et al. (1994) Nat. Genet. 8， 148—54; Xiao, X. et al. (1996) J. Virol. 70, 8098-108； Kessler, P. D. et al. (1996) Pro Natl. Acad. Sci. USA 93, 14 082-4087； Xiao, W. et al. (1998) J. Virol. 72, 10222 - 0226)。
本発明においては、 より好ましくはレトロウィルスベクターにより外来遺伝子 を脂肪細胞に導入する。 レトロウイルスとはレトロウィルス科 、Retrovirida ) に属するウィルスを言い、 オンコウィルス、 Foamyウィルス （Russell DW， and Mi Her AD, J Virol 1996； 70 :217-222; Wu M et al. , J Virol 1999； 73 : 4498-450 1)、 レンチウィルス (例えば HIV - 1 (Naldini L et al. , Science 1996； 272 : 26 3-267； Poeschla E et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1996;93 : 11395- 11399; Sri nivasakuraar N et al.， J Virol 1997 ;71 : 5841-5848 ; Zufferey R， et al. Nat Biotechnol 1997; 15: 871- 875 ; Kim VN, e al. , J Virol 1998 ; 72 :811- 816) およ ぴネコ免疫不全ウィルス （Johnston JC et al. , J Virol 1999； 73:4991-5000 ; Johnston J and Power C. , J Virol 1999； 73 : 2491 - 2498 ; Poeschla EM et al. , Nat Med 1998;4: 354 - 357) 等） などが含まれる。 本発明において用いるレトロゥ イノレスベクターは、 好ましくは Moloneyマウス白血病ウイノレス （Moloney murine leukemia virus； MoMLV) ベクターである (T. M. Shinnick, R. A. Lerner and J 丄 ό
. G. Sutcliffe, Nature 293, 543-548, 1981)。
レトロウイルスは、 自己不活性化型 （self inactivating; SIN) ベクターであ つてもよい。 SINベクターは、 ウイ ^/スのパッケージングの際に、 3， LTRの一部を 欠失させておくことにより作製することができる （Yu SF et al. (1986) Proc Na tl Acad Sci USA 83 : 3194; Yee, J. K. et al. , 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 5197 - 5201 ; Zufferey, R. et al. , 1998, J. Virology, 72, 9873-9880) 。 レトロウイルス中の外来遺伝子は LTRにより転写させることもできるし、 ベクタ 一内部の別のプロモーターから発現させてもよい。 例えば CMVプロモーター、 EF - 1 αプロモーター、 CAGプロモーターなどの構成的発現プロモーター、 または所望の 誘導性プロモーターを利用することができる。 また、 LTRの一部を他のプロモータ 一に置換したキメラプロモーターを利用してもよい。
レトロウィルスにより遺伝子を導入するには、 具体的には、 パッケージ細胞、 例えば 293 - ΕΒΝΑ細胞 （Invitrogen社製） に、 導入したい遺伝子を挿入したプラス ミ ド、 例えば pBabe CL- SEAP-IRES- GFPを、 遺伝子導入試薬等を使って遺伝子導入 し、 適当な期間、 好ましくは 1〜 3日間培養後、 上清中に産生された組換えウイ ルスを集めて、 導入したい脂肪細胞に感染させる。
ヒトを含む哺乳動物の脂肪細胞に広く感染するように、 レトロウイルスベクタ 一は広いトロピズムを持つエンベロープ蛋白質を有することが好ましい。 例えば 、 アンフォト口ピックエンベロープ蛋白質 （例えば 4070Aなど） （Accession K027 29 ; Sorge, J. et al. , Mol. Cell. Biol. (9) , 1730 - 1737 (1984) ) を用いる ことができる。 本発明においてレトロウイルスは、 好ましくは水疱性口内炎ウイ ルス （vesicular stomatitis virus) の G蛋白質 （VSV- G) (Rose, J. K. and Galli one, C. J. , J. Virol. 39 (2)， 519-528 (1981) ) によりシユードタイプ化されて いる （Emi， T. Friedmann and J. K. Yee, J. Virol. , 65 (3)， 1202-1207 (1991 )； Yee, J. -K. et al. (1994) Methods Cell Biol. 43 43 :99 - 112 ; Burns, J. C. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 90 :8033-8037)。 VSV - Gによりシ ユードタイプ化することにより、 脂肪細胞に高率に遺伝子を導入することができ る。 VSV-Gシユードタイプ化ベクターは、 パッケージング細胞に VSV-Gを発現させ ることにより作製することができる。 具体的には、 例えば VSV - Gを誘導発現できる パッケージング細胞 (Arai 丁 et al. , J. Virol. , 1998： 72, pplll5 - 21など） を好適に利用することができる。
作製したウィルスのタイター測定については、 段階希釈したウィルス溶液を感 染させ、 感染細胞のコロニー数を計数することによって決定することができ、 詳 細には Ausubelら (Ausubel, F. M. et al. Eds. (1995) Current Protocols in Mo lecular Biology. (John Wiley & Sons, NY) ) を参照することができる。 あるい は、 Byunら （Byun, J. et al. (1996) Gene Ther. 33333 : 1018 - 1020)、 Tafuroら (Tafuro, S. et al. (1996) Gene Ther. 33333 : 679-684)、 Miyaoら （Miyao, Y. et al. (1995) Cell Struct. Funct. 20 20 : 177-183)、 Claudioら （Claudio, P. P. et al. (2001) Anal. Biochem. 291 : 96 - 101)、 または Cashionら （Cashion, L . M. et al. (1999) Biotechniques 26 26： 924-930) の方法によって決定するこ ともできる。
ウィルスベクターを初代培養脂肪細胞へ導入するには、 該べクターを該細胞に 接触させればよレ、。 例えば、 ウィルスベクターを含む培養液中で初代培養脂肪細 胞をインキュベートする。 脂肪細胞は、 好ましくは前脂肪細胞の状態で感染させ る。 0. 5〜8 μ g/ml程度の polybreneを添加することで感染効率を上げることができ る。 多重感染度 （M0I) は特に制限はないが、 0.：！〜 100の間で適宜調節できる。 遺 伝子導入細胞は、 例えばマーカー遺伝子を利用して選択してもよレ、が、 M0Iを約 2 以上、 好ましくは約 3、 4、 または 5以上で感染させれば、 選択しなくても大半の細 胞に遺伝子を導入することが可能である。 遺伝子導入した脂肪細胞は、 そのまま 移植に用いることもできるし、 場合によっては 3- isobutyl_l - methylxanthine ( IBMX) 、 Dexamethasone, およびインスリンを含む培地で培養し成熟脂肪細胞とす ることも許される。 この場合、 IBMXや Dexamethasoneは、 主に脂肪細胞のペルォキ シソーム増殖剤応答性受容体 - γ (PPAR- 7 ) を活性ィヒするために用いられるので 、 同受容体を直接活性ィ匕する薬剤 （例えばチアゾリジン誘導体であるピオグリタ ゾン /武田薬品やロジグリタゾン /ダラクソ ·スミスクラインなど） を同時に添カロ することも許される。
所望の治療遺伝子を持つ本発明の初代培養の脂肪細胞を、 免疫学的に適合する レシピエントの体内に移植することにより、 該治療遺伝子がコードする分泌蛋白 質を体内で発現させることによる遺伝子治療が可能となる。 移植する初代培養の 脂肪細胞は、 好ましくはレシピエントと同一宿主の細胞である。 本発明の初代培 養の脂肪細胞の移植による遺伝子治療方法は、 所望の分泌蛋白質を、 その効果を 期待して体内にぉレ、て発現させるために適用することができる。 例えば疾患に対 する治療または予防効果を有する蛋白質をコードする外来遺伝子を保持する本発 明の脂肪細胞を移植することにより、 該疾患の治療または予防を実施することが できる。 また本発明は、 蛋白質を血中に放出させる方法であって、 本発明の初代 培養の脂肪細胞を体内に投与する工程を含む方法に関する。 本方法によって、 少 なくとも 20日以上にわたって、 好ましくは 30日以上、 より好ましくは 40日以上、 より好ましくは 50日以上、 より好ましくは 60日以上、 より好ましくは 80日以上、 より好ましくは 100日以上、 より好ましくは 150日以上、 より好ましくは 200日以上 、 より好ましくは 250日以上、 より好ましくは 300日以上、 より好ましくは 350日以 上にわたって、 外来遺伝子がコードする蛋白質を血中に有意に分泌させることが できる。 体内で発現した外来蛋白質は、 ΕΙΑなどのィムノアッセィ等により検出お よび/または定量することができる。 なお、 移植した細胞を取り出すことによつ て、 所望の時期に投与した外来遺伝子の発現を停止させることが可能である。 ま た場合によっては、 誘導型自殺遺伝子 （HSV- tkなど） を移植細胞に導入しておく ことにより、 例えばガンシク口ビルを投与することによって移植細胞を消去する ことも可能である。 また本発明は、 細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持 する初代培養の脂肪細胞、 および薬学的に許容される担体を含む、 遺伝子治療用 の移植組成物を提供する。 用いられる担体としては、 例えば生理食塩水、 リン酸 緩衝液、 培養液、 血清、 および体液などが挙げられる。 また、 細胞の足場となる 固体またはゲル状の支持体などと組み合わせてもよい。
本発明の移植組成物は、 好ましくは細胞外基質 （extracellular matrix; ECM) 成分を含んでいる。 細胞外基質成分とは、 細胞間に蓄積する不溶 1"生の網状または 繊維状構造物に含まれる蛋白質またはムコ多糖などの成分を言い、 生物から分離 されたもの、 および人工的に再構成したものであってよい。 好ましくは本発明で 用いられる ECM成分としてはコラーゲン、 フイブロネクチン、 ビトロネクチン、 ラ ミニン、 へパラン硫酸、 プロテオダリカン、 グリコサミノダリカン、 コンドロイ チン硫酸、 ヒアルロン、 デルマタン硫酸、 ケラチン硫酸、 エラスチン、 またはそ の 2種以上の組み合わせを挙げることができる。 これらの ECM成分はゲル化させて 脂肪細胞と混合させることが好ましい。 本発明に用いられる ECMゲルは、 上記成分 の少なくとも 1種以上が含まれていれば特に限定されないが、 好ましくは、 少な くとも IV型コラーゲン、 ラミニン、 およびへパラン硫酸を含んでいる。 このよう な ECMとしては、 Engelbreth- Holm- Swarmマウス腫瘍から抽出した基質 （Matrigel (登録商標)） (Becton Dickinson Labware¾) が挙げられる （米国特許第 4， 829， 00 0号） 。 本発明に用いられる ECM成分および脂肪細胞を含む組成物の構造は特に限 定されず、 例えばゲル状またはペースト状の網構造、 繊維状構造、 平板 （デイス ク） 状構造、 ハニカム状、 スポンジ様構造としてよい。 ECM成分のゲル化は、 常法 に従って行うことができる。 例えば 0. 3〜0. 5%程度のコラーゲン水溶液を37でで 10〜30分間インキュベーションすることによりゲルイ匕させることができる。 ある いは、 ゲル化剤を用いて ECM成分をゲル化させることもできる。
また、 本発明の移植組成物は、 好ましくは血管新生因子を含んでいる。 血管新 生因子を含む本発明の移植組成物は、 移植後に周囲に血管が形成され、 より高い 効率で外来蛋白質を血中に分泌することができる。 血管新生因子としては、 生体 内で血管新生を誘導し得る因子であれば特に限定されないが、 例えば血管内皮細 胞増殖因子 （VEGF) 、 塩基性線維芽細胞増殖因子 （bFGF) 、 酸性線維芽細胞増殖 因子 （aFGF) 、 血小板由来増殖因子、 トランスフォーミング増殖因子- J3 (TGF- J3 )、 ォステオネクチン（Osteonectin)、 アンジォポイエチン （angiopoietin) 、 肝 細胞増殖因子 （HGF) などが例示できる。 最も好ましくは、 bFGFが挙げられる。 bF GFは FGF2とも呼ばれ、 線維芽細胞の増殖因のみならず、 血管内皮細胞、 軟骨、 骨 芽細胞、 表皮細胞など様々な細胞の増殖を促進する活性有する （Abraham et al. , ΕΜΒΟ J. , 5, 2523-2528, 1986； Prats et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1836-1840, 1989) 。 本発明において用いられる bFGFとしては、 天然の蛋白質 のみならず、 組み換え DNA技術により遺伝子工学的に製造されたもの、 およびそれ らの修飾体であってもよい。 bFGFとしては、 例えば W087/01728、 W089/04832, W08 6/07595、 W087/03885, 欧州特許出願公開第 237966号、 欧州特許出願公開第 281822 号、 欧州特許出願公開第 326907号、 欧州特許出願公開第 394951号、 欧州特許出願 公開第 493737号などに記載のものを例示することができる。 あるいは、 血管新生 因子を一過的に発現する別の発現ベクターを脂肪細胞に導入してもよい （W097/49 827参照） 。 このように用いられる血管新生因子は、 本発明の脂肪細胞から外来蛋 白質を効率的に血中に分泌させるために、 移植細胞周辺に血管を形成されること が主要な目的であるので、 血管誘導因子をコードするベクターを用いて脂肪細胞 から血管誘導因子を発現させる際には、 一過的に発現するベクター （すなわち染 色体に組み込まれないベクター） を用いることが好ましい。 脂肪細胞から血管誘 導因子を長期間発現させると、 移植した脂肪細胞周囲に過剰な血管が形成された り、 全身に副作用を及ぼす懸念があるため、 本発明の初代培養の脂肪細胞には血 管新生因子をコードする外来遺伝子が安定に導入されていないことが好ましい。 3 . 脂肪細胞の移植
遺伝子導入した脂肪細胞は、 適当な細胞濃度、 好ましくは 0. 2 X 107〜2 X 107/ lo
ml, レトロウイルスベクターで導入した場合は 0. 2 X 106〜5 x lOVmlに調整し、 単体のまま、 ないしは効果的な媒体、 好ましくはコラーゲンなどの細胞外基質を 含む溶液などと混合し、 皮下組織や脂肪組織、 好ましくは皮下組織内に注入する 。 脂肪組織への注入は切開して脂肪組織を露出させて行っても良い。 成熟脂肪細 胞に最終分化させた細胞は、 移植後に増殖することなく外来遺伝子を長期間一定 のレベルで発現する。 移植した体内における外来遺伝子の発現レベルは、 移植細 胞数に比例することから、 移植にあたっては、 あらかじめインビトロで測定した 外来遺伝子の発現レベルに従って移植する脂肪細胞量を調節すれば、 移植した体 内で望みの発現量を長期間維持することが可能である。 図面の簡単な説明
図 1は、 3週齢の ICRマウス皮下脂肪より単離した初代培養脂肪細胞の顕微鏡写 真である。 （A) 天井培養 14日後の天井側培養面に接着した脂肪細胞、 （B) 通常 培養系で増殖させた初代培養脂肪細胞、 （C) 分化誘導により脂肪滴を貯留した成 熟脂肪細胞、 （D) 分化誘導細胞の Oil red 0染色像、 をそれぞれ示す。
図 2は、 アル力リホスファターゼ （AP) 発現プラスミド pcDNA3. 1- SEAPmhを一過 性に導入した初代培養脂肪細胞 （ICR皮下脂肪由来） を ICR系ヌードマウスに移植 して得られた血漿中 AP活性を示す図である。
図 3は、 レトロウイルスべクタ一 MLV (VSV) /pBabeCL (PLAP) IPを、 各脂肪組織由 来の初代培養脂肪細胞に導入したときの、 遺伝子導入効率の比較を示す図である 図 4は、 MLV (VSV) /pBabeCL (GFP) IPを導入した初代培養脂肪細胞の分化誘導像を 示す顕微鏡写真である。 （A) 光学顕微鏡写真、 （B ) Aと同一視野の GFP蛍光写 真、 をそれぞれ示す。
図 5は、 AP発現ゥィルスべクターを導入した初代培養脂肪細胞の継代培養にお ける AP発現の持続性を示す図である。 （A) C57BL/6マウス皮下脂肪由来の細胞に S EAP遺伝子 (MLV (VSV) I pBabeCL (SEAPrah) I2G)または PLAP遺伝子 (MLV (VSV) /pBabeCL ( PLAP) IP)を導入した結果、 （B) ICRマウス由来脂肪細胞の細胞に PLAP遺伝子 （MLV (VSV) /pBabeCL (PLAP) IP) または GFP遺伝子 (MLV (VSV) /pBabeCL (GFP) IP) を導入し た結果、 をそれぞれ示す。
図 6は、 分化誘導した遺伝子導入脂肪細胞における発現の変化を示す写真およ ぴ図である。 （A) MLV (VSV) /pBabeCL(GFP) IPを導入した ICR皮下脂肪由来初代培養 脂肪細胞の非分化誘導下における GFP光顕微鏡像、 (B)同、 分ィヒ誘導下における GF P顕微鏡像、 (C) 非分化誘導下 （非分化） および分化誘導下 （分化） における MLV (VSV) /pBabeCL (PLAP) IP導入初代培養脂肪細胞 （ICR皮下脂肪由来） の AP産生、 を それぞれ示す。
図 7は、 初代培養脂肪細胞へのプラスミド導入による （プロ） インスリン産生 を示す図である。
図 8は、 AP発現 MVを導入した初代培養脂肪細胞 （C57BL/6マウス皮下脂肪由来 ) における、 APの安定発現を示す図である。
図 9は、 sls2B10インスリン発現レトロウイルスベクターを導入した初代培養脂 肪細胞における、 分化誘導時のインスリン発現を示す図である。 （A) 森永製 EIA による結果、 （B) IBL製 EIAによる結果、 をそれぞれ示す。
図 1 0は、 GLP-1 (7-37)発現レト口ウィルスベクターを導入した初代培養脂肪細 胞における、 GLP-1 (7- 37)の発現を示す図である。 各々 3点の測定を行い、 平均値 と標準偏差で示した。
図 1 1は、 AP発現初代培養脂肪細胞の移植におけるインビポ AP発現に及ぼす、 移植前分化誘導刺激の有無による効果を示した図である。
図 1 2は、 （A) AP発現初代培養脂肪細胞の、 分化刺激有り 'かつ basic FGF添 加マトリゲルを用いて移植した際の、 血漿中 AP活性の推移、 (B) 移植マトリゲル の摘出による血漿中 AP活性の消失 (個体 A)、 (0 対照である GFP導入細胞移植群か ら摘出したマトリゲルの GFP光顕微鏡像、 をそれぞれ示す図および写真である。 （A ) の PLAP移植群 32日目までは、 個体別測定値の群平均と標準偏差で、 他は平均値 で示した。
図 1 3は、 図 1 2 (A) 、 およびその他さまざまな方法で移植したマウスの血中 AP活性をより長期にわたって検討した結果を示す図である。
図 1 4は、 図 1 2 (B) に例示したのと同様の摘出試験を、 移植後期に行った結 果を示す図である。
図 1 5は、 AP発現脂肪細胞の移植における、 移植細胞数依存的な血中 AP活性を 示す図である。 個体別測定値の群平均と標準偏差で示した。
図 1 6は、 STZ誘発糖尿病マウスに対する、 sls2B10ィンスリン発現脂肪細胞の 移植による効果を示した図である。 （A) 空腹時血糖値に及ぼす効果、 （B) 体重 に及ぼす効果をそれぞれ示す。 個体別測定値の群平均と標準偏差で示した。 発明を実施するための最良の形態
以下に、 具体的な例をもって本発明を示すが、 本発明はこれに限られるもので はない。 なお、 本明細書中に引用された文献は、 本明細書の一部として組み込ま れる。
[実施例 1 ] マウス脂肪細胞の初代培養
[方法]
3週齢の ICR系雄性マウスあるいは 4-5週齢の C57BL/6雄性マウス （ 、ずれもチヤ ールズリパー） をジェチルエーテルで麻酔し、 心臓からの全採血により脱血死さ せた。 ついで、 鼠蹊部皮下脂肪、 あるいは副睾丸周囲脂肪、 腸管膜脂肪組織をそ れぞれ無菌的に摘出した。 摘出した組織を PBSで洗浄した後、 ハサミあるいは手術 用ナイフを用いて細切し、 この細切組織を lmg/mlのコラゲナーゼ （SI f ruction/ 新田ゼラチン） を含む通常培地 （DMEM- high glucose/SIGMA, 10% FCS) で 37°C、 20 - 60分間震盪消化した後、 遠心 （300g， 5min. ) により沈查と浮遊層に分離した ム丄
浮遊層はさらに:!〜 2回の遠心によりコラゲナーゼを希釈除去後、 培地を充満し た T- 25フラスコ (IWAKI) に加えた。 泡を除き、 通常の培養面が天上になるように C02インキュベータで 37°C、 5¾ C02で培養した （天井培養） 。 10〜14日間培養後、 トリプシン処理により天井面に接着した細胞を回収し、 通常通りの培養系に移し た。 以後、 1 : 3〜1： 10の ratioで継代培養をおこなった。
分化誘導は、 6wellプレートでコンフルェントに培養した細胞を誘導培地 （0. 5 mM IBMX, 0. 25 /i M dexamethasone, 10 Ai g/ml Insulinを添加した通常培地） に交 換し 48時間刺激した。 ついで、 成熟培地 （10 x g/ml Insulinを添加した通常培地 ) で培養することにより分ィ匕を誘導した。 成熟培地は 3日置きに交換した。
Oil red 0染色液は、 0. 3 gの Oil red 0を 100 mlのイソプロパノール （99%) に 混和した保存溶液と蒸留水を 3 ： 2の割合で使用時に混和した。 細胞は PBSで洗浄 した後に 1 0 %中性ホルマリン液 （WAK0) で固定した。 PBSで再度洗浄後、 Oil re d 0染色液により室温で 10分間染色した。 PBSにて再度洗浄後に検鏡した。
[結果]
3週齢の ICRマウス皮下脂肪より単離した初代培養脂肪細胞の顕微鏡写真を図 1 に示す。 天井培養 14日後の天井側培養面に脂肪滴を有する脂肪細胞の接着を認め た （A) 。 これを通常培養系に移すと （B) のように繊維芽細胞様に増殖するが、 I BMX、 デキサメサゾン、 インスリンにより分化を誘導すると再び脂肪滴を有する成 熟脂肪細胞に分化した （C) 。 貯留された脂肪は Oilred 0染色によって赤色に染色 された （D) 。 本手段により単離される細胞が、 分化能を有する初代培養脂肪細胞 であることを示した。
[実施例 2 ] 初代培養脂肪細胞への耐熱性分泌型アル力リフォスファターゼ （AP ) 遺伝子の一過性導入と、 導入脂肪細胞のマウスへの移入
遺伝子発現のモデル系として、 AP遺伝子、 すなわち SEAP遺伝子 (Clontech) ま たは PLAP遺伝子 (Goto M. et al. Mol. Pharmacol, vol. 49 860- 873 (1996) ) を初 代培養脂肪細胞に導入し AP活性の推移を検討した。 （両 AP遺伝子産物は耐熱型で 、 熱処理後することにより、 内在性アルカリフォスファターゼと容易に区別する ことができる。 ）
[方法]
(1) SEAP遺伝子を一過性に導入した初代培養脂肪細胞の作製
APを発現する plasmid (pcDNA3. 1 - SEAPmh) は、 pSEAP2-basic vector (Clontech ) を制限酵素 Hind ΙΙΙ-Xba Iで二重消化して得られる SEAP配列を、 哺乳類細胞発 現用ベクターである pcDNA3. lMyc- HisA (Invitrogen) の ' 2 III- ¾ I部位に揷 入して構築した。
10cm dishへの遺伝子導入あたり 500 / 1の FCS- free DMEM培地と 15 1の Fugene 6 試薬 （Roche社製） を混合し、 ついで 5 /z gの pcDNA3. 1- SEAPmhを加え、 室温にて 15 分間静置した。 この混合液を、 10cm dishで 70〜80% confluentに培養した初代培 養細胞 （ICR皮下脂肪由来） に加え、 C02インキュベーター内で 24時間培養した。
(2) アル力リフォスファターゼ遺伝子を導入した初代培養脂肪細胞のマウスへの 移入
遺伝子導入した細胞をトリプシン処理により回収し、 PBSで 2回遠心洗浄後 1 X 107 cells/mlになるように PBSに懸濁した。 動物 （ICR系ヌードマウス、 術時 5週齢 ) は、 ペントバルビタールナトリウム （ネンブタール'大日本製薬） 50 mg/kgの 腹腔内投与により麻酔した。 術部付近を希釈ヒビテン液 （住友製薬） にて消毒後 、 右後肢付け根付近の皮膚を 3〜5 腿程度切開し、 鼠蹊部皮下脂肪を露出させた。 調製した細胞懸濁液 0. 55 ml (5. 5 x 106 cells/head) を 1 mlシリンジにて準備し 、 22G注射針を用いて皮下脂肪内に注入した。 対照として、 コントロールには PBS を同部位に注入した。 また、 蛋白補充法と比較するため、 精製 AP (Roche) gを PBSに無菌的に溶解し、 同様に注入した。 切開した皮膚を縫合し、 術部を手術用ィ ソジン （明治製菓） で消毒した。
移植前 （0日） 、 及び移植後経日的にへパリンコートのキヤビラリ一 （Dramond ) を用いて眼底静脈叢より採血した。 全血から 2000 g、 IS分間の遠心により plas maを得た。 この plasma 中の AP活性を、 測定キット （SEAP reporter gene assay kit, Roche社製） を用い、 添付のマニュアルに従って測定した。
[結果]
アル力リホスファターゼ （AP) 発現プラスミ ド pcDNA3. 1- SEAPmhを一過性に導入 した初代培養細胞をマウスに移植して得られた血漿中 AP活性を図 2に示す。 比較 対照として投与した l x gの精製 AP蛋白 （Roche) の注入では、 血中 AP活性は投与後 7日の時点で対照レベルまで低下した。 一方、 一過性遺伝子導入細胞移植マウス では、 移植後 4日目をピークとした血中 AP活性が確認され、 発現期間は 14日間であ つた。 一過性に遺伝子導入された細胞移植によるインビボでの発現は、 蛋白の注 入よりもやや持続するものの期間が短く、 血中濃度の変動も大きいことを明らか
V した。
[実施例 3 ] ウィルスベクターを用いた、 APを安定に発現する脂肪細胞の作製
[方法] .
( 1 ) AP、 および対照である GFP発現ベクターの構築
PLAP遺伝子は文献 （Goto M. et al. Mol. Pharmacol, vol. 49 860 - 873 (1996) ) に記載の pTK- PLAPから III， IIを用いて切り出した。 SEAP遺伝子は pcDNA 3. 1 - SEAPmhを 111/ Pme Iで二重消化して得た。 GFP遺伝子は pEGFP - N2から^ ί l-Nco Iにより切り出した。
ウィルスベクター作製に用いるプラスミド pBabeCLXI2Gは、 pBabePuro (Morgens tern, J. P. et al. Nucleic Acids Res. vol. 18 3587-3596 (1990)) を基として 、 そこから SV40プロモーターとネオマイシン耐十生遺伝子を > & l-Cla Iにより切り 出した後 Klenow fragment により平滑ィ匕し、 そこへ pIRES2 - EGFP より Hinc II - Hinc IIにより切り出した脳心筋炎ウィルス（encephalomyocarditis virus (EMCV) )の IRES (internal ribosome re-rentry site)と GFP (green fluorescent protein) に置換するとともに、 さらにその LTR(long terminal repeat)から外来遺伝子挿入 部分 (マルチクローニングサイト）までの部分（5¾D I- a » HI)を pCLXSN (IMGENEX) の相当する配列 G¾p l-Bam HI)と置換することにより作成したものである。 また pBabeCLXI2Gの IRES-GFP の部分を IRES-ピューロマイシン耐性遺伝子に置換した pBabeCLXIPも用いた。
上述した PLAP、 SEAP、 GFPそれぞれの DNA断片を Klenow gragmentによる平滑処理 後、 Z^a Iにより切断した pBabeCLXIPベクターないしは pBabeCLXI2Gに挿入し、 そ れぞれ pBabeCL (PLAP) IP、 pBabeCL (SEAPrah) I2G、 pBabeCL (GFP) IPを得た。
( 2 ) ウィルスベクターの作製
10cm dishへの遺伝子導入あたり以下のように行つた。 500 1の FCS - freeの DMEM 培地に plasmid導入試薬 TransIT (Mirus) 30 μ 1を混合し室温にて 5分間放置した
(DMEM/TransIT混合液） 。 また別の tubeに VSV-Gをコードするベクター （pCALG、 Arai T. et al. , J. Virol. , 1998： 72, pplll5 - 21より改変） 3· 3 ^ β、 Gag · Pol をコードするベクター （pCLAmpho/ RetroMax system (IMGENEX) ) 3. 3 g、 及び パッケージシグナルと導入遺伝子を含むベクター （pBabeCL (PLAP) IP、 あるいは pB abeCL (SEAPmh) I2G、 あるいは pBabeCL (GFP) IP) 3. 3 /z gの合計 9. 9 μ gを混合した
(plasmid液） 。 DMEM/TransIT混合液に plasmid液を加えよく混合した後に、 さら に室温にて 1 5分放置した後、 前日に 2xl06cells / 10cm dishで用意しー晚培養 した 293- EBNA細胞 （Invitrogen) に添カ卩した。
添加 8時間後に培地を交換し、 さらに 2日間培養後に培養上清を回収した。 回収 した培養上清は、 夾雑物を除去するため遠心（300 g、 5 min)ないしは 0, 45 μ ηιシリ ンジフィルター （ミリポアネ： h ) により濾過し、 この上清をウィルス液として使 用した （それぞれ、 MLV (VSV) /pBabeCL (PLAP) IP、 MLV (VSV) I pBabeCL (SEAPrah) I2G 、 MLV (VSV) /pBabeCL (GFP) IP) 。 一部のウィルス液は超遠心 （19， 500rpm、 100分） により濃縮して使用した。
( 3 ) 初代培養脂肪細胞への遺伝子導入と培養 遺伝子導入に用いる脂肪細胞 （ICRマウス皮下脂肪由来、 同副睾丸周囲脂肪由来 、 同腸間膜脂肪由来、 C57BL/6マウス皮下脂肪由来） は、 導入前日に 50- 80%コンフ ルェントになるよう 6wellまたは 96wellのプレートに準備した。 培地をすて、 4 / g/ml Polybrene (SIGMA) 液とウイルス液を等量ずつ細胞に添加することによりゥ ィルスベクターを導入した。 導入 8時間後に通常培地に交換しさらに培養および継 代培養を行った。 一部の細胞については、 導入 4日目の時点で 24時間の培養上清を 回収し AP活性を測定した （図 3 ) 。
継代培養は 10cm dishスケールで実施例 1に記載した方法に準じて行い、 4〜7日 間培養してコンフルェントに達したら培地を替え、 17時間後の培養上清中の AP活 性を測定した。 この細胞を継代し続け、 適宜同様の操作を行って発現の持続を検 討した （図 5、 6 ) 。 なおすベての継代日に AP活性を測定したわけではない。 分化誘導は 6wellプレートで実施例 1に記載した方法に準じて行った。 ただし、 誘導培地で 3日間処理し、 以後成熟培地を 3日ごとに交換した。 培養上清中の AP活 性は各 3日間ごとの培養上清を用いて測定し、 図の横軸は上清を回収した日で表し た。 GFP導入細胞については適宜 GFP光下での顕微鏡写真を撮影した （図 4、 6 ) 。 なお、 非分化誘導条件とは、 誘導培地'成熟培地のかわりに通常培地で培養し つづけた条件を意味する。
[結果]
図 3は、 レトロウイルスベクターを用いた場合の、 組織由来細胞ごとの遺伝子 導入効率の比較を示す図である。 ICRマウスの鼠溪部皮下、 副睾丸周囲、 腸間膜に 存在する各脂肪組織からそれぞれ単離した初代培養脂肪細胞に遺伝子導入を行つ たところ、 いずれの細胞においても培養上清中に AP活性を認めた。 該レトロウイ ルスベクターによる遺伝子導入は、 由来部位に依存せず可能であることを明らか にした。
図 4は、 GFP発現レトロウイルスベクターを導入した細胞の分化誘導像を示す顕 微鏡像である。 遺伝子導入 1 3日後に分化誘導を開始し、 3週間経過後に写真を 撮影した。 脂肪滴を含む細胞に GFPの蛍光が観察され、 該ウィルスベクターが分化 能を有する前脂肪細胞に遺伝子導入可能であること、 かつ該ベクターによる遺伝 子導入が分ィ匕能に影響をおよぼさないことを明らかにした。
図 5は、 AP発現ウィルスベクターを導入した初代培養脂肪細胞の継代培養にお ける発現の持続性を示す図である。 10 cm dishでコンフルェントに達した細胞の 、 17時間後の培養上清中の AP活性を測定した。 C57BL/6マウス皮下脂肪由来の初代 培養脂肪細胞 （A) では検討した 87日間にわたって、 ICRマウス皮下脂肪由来の初 代培養脂肪細胞 （B) では検討した 63日間にわたって、 持続的な AP産生を認めた。 これらの結果から、 該ウィルスベクターの初代培養脂肪細胞への導入により、 分 裂後の娘細胞にも外来遺伝子が保持される安定発現細胞の作製が可能であること を明らかにした。
図 6は、 分化誘導した遺伝子導入脂肪細胞における発現の変ィヒを示す写真およ び図である。 ICR皮下脂肪由来の GFP発現脂肪細胞は、 通常培養下 （A) および分化 誘導下 (B)のどちらでも強い GFP発現が観察された。 また、 ICR皮下脂肪由来の AP S 現脂肪細胞は、 非分化誘導下 （非分化） および分化誘導下 （分化） のいずれにお いても、 持続的な APの発現が検出された （C) 。 該ウィルスベクターにより遺伝 子導入された初代培養脂肪細胞は、 図 5に明示した増殖下のみならず、 非分化誘 導下すなわち非増殖状態や成熟下といったいずれのフェーズにおいても安定に遺 伝子発現を示すことを明らカにした。
[実施例 4 ] プラスミドベクターを用いたインスリン安定発現脂肪細胞の作製 遺伝子の導入法は、 プラスミドベクターを用いた方法も許容される。
[方法]
( 1 ) ヒ トインスリン遺伝子の単離と修飾
ヒト腾臓由来 cDNAライブラリー （Stratagene) に対し、 表 1に示したプライマ 一 (Insulin Fwおよび Rv) を用いて PCR反応を行い、 ヒトインスリン遺伝子断片 を得た。 得られた 354 bpの断片について塩基配列を同定し、 nativeインスリンと して、 pCR2. 1T0P0ベクター （Invitrogen) にサブクローニングした。 表 1 PCR反応に用いたプライマ一配列 プライマ- 塩基配列 (5'-)
Insulin Fw CATAAGCTTACCATGGCCCTGTGGATGCGC (配列番号： 1)
Insulin Rv CATTCTAGACTAG GCAGTAGTTCTCCAG (配列番号： 2)
sitel CTTCTACACACCCAGGACCAAGCGGGAGGCAGAGGAC (配列番号: 3) site2 CCCTGGAGGGATCCCGGCAGAAGCGTGG (配列番号： 4)
BIO CACCTGTGCGGATCCGACCTGGTGGAAGC (配列番号： 5) sPL-GLP-1 Fw nCCACCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCCTGAGGCTACAGCTCT- -CCCTGGGCCATGCTGMGGGACCTTTACCAGTG (配列番号： 6) sPL-GLP-1 Rv AATTATCCTCGGCCTTTCACCAGCCAAGCAATGAACTCCnGGCAGCTTG-
-GCCTTCCAAATAAGAACnACATCACTGGTAAAGGTCCCnCAGC (配列番号: 7)
GLP-5' TTCCACCATGCTGCTGCTGC (配列番号： 8)
GLP-3' AATTATCCTCGGCCTTTCACCAG (配列番号： 9)
(太字は Γ½では開始コドンを、 Rvでは終止コドンのアンチセンスをそれぞれ示す 。 下線は、 導入した変異部分を示す。 ) ついで、 脂肪細胞で成熟インスリンを発現させるために、 文献 （JBC， 1994, 26 9 (8) , 6241-) に基づいて遺伝子改変を行った。 具体的には、 ヒ トインスリン B鎖 と Cペプチドの結合部 （sitel) およぴ同 Cペプチドと A鎖の結合部 （site2) 、 およ び B鎖 10番目のヒスチヂン残基 (B10) それぞれの変異をふくむ両方向のプライマ 一 ¾Τそれそれ合成し (¾ 1； 、 Quikchange mutagenesis kit (Stratagene)により 変異体を得た。 この反応を sitelおよび site2に対して行ったものを sls2変異体、 s itel、 site2および B10に対して行ったものを sls2B10変異型インスリンとした。 得 られた改変型ヒトインスリン遺伝子について塩基配列を確認し、 pcDNA3. 1ベタタ 一に組み込んで遺伝子導入に用いた。
( 2 ) 初代培養脂肪細胞への遺伝子導入 500 μ 1の FCS-free DMEM培地と 15 /i lの Fugene 6試薬 (Roche) を混合し、 ついで 導入プラスミド 5 μ §を力 []え、 室温にて 15分間静置した。 この混合液を、 10 cm dis hで 70〜80% confluentに培養した初代培養細胞 （C57BL/6マウス副睾丸周囲脂肪 組織由来） に加え、 C02インキュベーター内で 24時間培養した。 遺伝子導入 4日後 に細胞を T225フラスコに継代し、 ー晚培養した後に 0, 2 mgU/mlの G418 (SIGMA) を 含む培地に交換し 3週間培養して遺伝子導入細胞を選択した。 得られた G418耐性細 胞を 10 cm dishにまき、 培養上清中のィンスリンを超高感度ィンスリン EIAキット
(森永） により測定した。 なお、 本 EIAキットは、 プロセシングされる前のプロイ ンスリンと成熟インスリンをともに検出する。
[結果]
図 7は、 初代培養脂肪細胞へのプラスミド導入による （プロ） インスリン産生 を示す図である。 C57BL/6マウス副睾丸周囲脂肪組織由来の脂肪細胞に、 nativeヒ トインスリン遺伝子 （native：)、 あるいは sitel/site2/B10改変型 （sls2B10) をそ れぞれ組み込んだ pcDNA3. lMyc- Hisべクタ一または空べクタ一 (mock) をトランス フエクシヨンした。 G418選択して得られた耐性細胞の培養上清中にヒト （プロ） インスリンが検出された。 初代培養脂肪細胞に対する安定遺伝子導入は、 プラス ミドベクターによっても可能であることを示した。
[実施例 5 ] アデノ随伴ウィルスを用いた、 AP安定発現脂肪細胞の作製 遺伝子の導入法は、 アデノ随伴ウィルス （AAV) を用いた方法も許容される。
[方法]
AAV Helper-Free System (Stratagene)を用いて検討した。 実施例 2に記載した PLAP断片 を用いて切り出した断片） を pMV- MCSベクターの同制 限酵素サイトに揷入し pMV-PLAPを得た。
AAVベクターの作製は以下のように行った。 OPTI-MEM (Invitrogen) 1. 75ml と plasmid導入試薬 Fugene 220 μ ΐを混合し、 ついで pAAV- PLAP、 pMV - RC、 pHelperを , or. PCT/JP03/07721
それぞれ 25 /z gずつ混合して、 室温にて 1 5分放置した （Fugene/plasmid液)。 一 方 293-EBNA細胞を、 15cm dishで 60- 70%コンフルェント状態になるよう用意した。 培養液を FCS- freeの DMEMに置換し、 そこに Fugene/plasmid液を均等に滴下して2 -3 時間培養した。 ついで終濃度 10°/。となるよう FCSを添加し、 さらに 2日間培養した。 細胞をトリプシン処理にて回収し遠沈させた後、 最終用量が 3 mlになるよう 50 mM
Tris-HCL, 150 mM NaCl溶液に懸濁した。 この懸濁液に対しドライアイス -ェタノ ール /37°Cの凍結/融解を 3サイクル行うことで細胞を破枠した。 さらに Benzonase
(SIGMA) により宿主ゲノム DNAを分解した後に 9, 000 rpm、 30分の遠心を行い、 上 清をフィルターろ過してウィルス液とした。
初代培養脂肪細胞 （C57BL/6マウス皮下脂肪由来） は、 遺伝子導入前日に lxlO4 cells ellで 12 well plateにまき、 ー晚培養後、 40mMの Hydroxyureaおよび ImMの Butyl ic acid (いずれも SIGMA) を含む培地で 6時間処理した。 この培地を除いた 後、 FCS- freeの DMEMで 1/100に希釈したウィルス液を 0· 5 ml/wellで添加した。 1時 間培養後、 終濃度 10%となるよう FCS含有培地を添加し、 一晩培養した。 以後、 通 常の培地交換を行い、 2 4日目に継代した。
導入 1、 7、 2 5日目に培地を交換し、 それぞれ 2日後の培養上清を AP測定に用 いた。 65°Cで 20分間加温し、 必要に応じて希釈した培養上清 10 μ ΐに、 50 μ 1のァ ッセィバッファー （16mM NaHC03, 12mM Na2C03, 0. 8mM MgS04) と、 50 ^ 1のルミス ティン試薬 （CDP - Star Ready to Use with Sapphierll, TROPIX) を混和し遮光下 で 30分間反応させ、 ルミノメータ一で測定した。 図 8は、 AP発現 MVを導入した初代培養脂肪細胞 （C57BL/6マウス皮下脂肪由来 ) における、 APの安定発現を示す図である。 培養上清中の AP活性は、 全試験期間 を通して持続的に検出された。 初代培養脂肪細胞に対する安定遺伝子導入は、 MV ベクターによっても得られることを示した。 [実施例 6 ] ヒ トインスリンを発現するレトロウイルスベクターの構築と脂肪細 胞への導入
[方法]
実施例 4で構築したヒ ト改変型インスリン遺伝子 （sl s2B10Ins) を、 実 施例 3の方法に準じて pBabeCLXI2Gベクターに揷入した （pBabeCL (sls2B10Ins) I2G) 。 このプラスミドを、 VSV- Gをコードするベクター （pVPack-VSV_G/Stratage ne) 、 Gag . Polをコードするベクター （pVPack-gp/Stratageneより改変） ととも に、 293- EBNA細胞に実施例 3の方法に準じて導入し、 改変型ィンスリン発現レト ロウィルスベクターを作製した (MLV (VSV) /pBabeCL (sls2B10Ins) I2G) 。 10 cm di sh 22枚の 293- EBNA細胞の培養上清 （約 200 ml) を回収し、 遠心/フィルター処理 により不溶物を除いた後に超遠心 （19, 500 rpm、 100分） により濃縮ウィルス液を 得た。 これを、 前日に 6wellプレートにまいた初代培養脂肪細胞 （C57BL/6皮下脂 肪由来） に導入した。
遺伝子導入細胞を 6wellプレートにまきなおし、 実施例 1の方法に準じて分化を 誘導した。 誘導前 3日から誘導開始日の 3日間 （誘導前） 、 および誘導 14日目力 ら 1 7日目の 3日間 （誘導後） の培養上清をそれぞれ回収して、 実施例 4と同じ方法で インスリン量を測定した。 また、 目的の部位でプロセシングが起こり成熟ィンス リンが生成されていることを確認するために、 成熟インスリンのみを認識するィ ンスリン EIAキット （IBL) の測定も行った。 対照は、 同時に分化誘導した非遺伝 子導入細胞の培養上清を用いた。
[結果]
図 9は、 sls2B10インスリン発現レトロウイルスベクターを導入した初代培養脂 肪細胞における、 分化誘導時のインスリン発現を示す図である。 （A) 森永製 EIA による結果、 （B) IBL製 EIAによる結果、 をそれぞれ示す。 インスリンは、 分化誘 導前または分化誘導後のいずれにおいても安定に分泌されること、 変異型インス リン遺伝子導入によつて脂肪細胞から成熟ィンスリンを産生し得ること、 を明ら 0丄
かにした。
[実施例 7 ] ヒ ト glucagon - like peptide- 1 (GLP - 1)を発現するレトロウイルスべ クタ一の構築と脂肪細胞への導入 .
GLP- 1は摂食時に小腸 L細胞から産生され、 瞵 j8細胞に作用してィンスリン分泌 を刺激する作用を有するペプチドである。 その他にも、 腌 細胞の再生作用や食 欲抑制作用、 胃排泄抑制作用など、 抗糖尿病 '抗肥満の多様な作用を有すること が明らかにされている (Meier JJ et al. Eur J Pharmacol. 2002, 12 ;440 (2-3)： 269-79、 Drucker DJ. Gastroenterology. 2002 ; 122 (2) : 531- 544) 。 このペプチド はプレブ口ダル力ゴン遺伝子から産生されるポリぺプチドから組織特異的プロセ シングにより生じる、 GLP - 1のアミノ酸配列として 7番から 37番 （ないし 36番のァ ミ ド体） のぺプチドが主な薬理活性を有することが知られている（Drucker DJ et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 May ;84 (10) : 3434-3438, Kreymann B et al . Lancet. 1987, 5 ;2 (8571) : 1300— 1304、 Mojsov S et al. J Clin Invest. 1987 Feb ; 79 (2) : 616-619)。 この因子を脂肪細胞から産生させるベく以下のような検討 を行った。
[方法]
実施例 3で用いた PLAP遺伝子のシグナルぺプチド （17ァミノ酸） にヒ ト GLP - 1 ( 7-37)とストップコドンをつないだ配列 （コード配列を配列番号： 10に示す） を含 む計 156base pairの塩基の配列を設計し、 中央に 22merのオーバーラップを持つよ うにヌクレオチドを合成した （表 1中 sPL- GLP- lFwおよび sPb"GLP- IRv) 。 これ をァニーリングさせ Pfu polymerase (Stratagene)により二重鎖にさせた後、 5'端 、 3，端のプライマー （表 1の GLP- 5 'および GLP-3' ) を用いた PCRにより目的断片を 増幅した。 この断片を PCR2. 1ベクターにサブクロ一エングした後に制限酵素で切 り出し、 実施例 3と同様に pBabeCLXI2Gベクターに揷入した （pBabeCL (sPL-GLPl ) I2G) 。 これを実施例 6と同様の方法で 293- EBNA細胞に導入して、 GLP- 1発現レ トロウィルスベクターを作製した （MLV (VSV) /pBabeCL(sPL- GLP_1) I2G) 10cm di sh 9枚の 293-EBNA細胞の培養上清 （約 90ml) を回収し、 遠心/フィルター処理によ り不溶物を除いた後に超遠心 （19 500rpm 100分） により濃縮ウィルス液を得た 。 これを、 前日に 6wellプレートにまいた初代培養脂肪細胞 （C57BL/6皮下脂肪由 来） に導入した。 導入した脂肪細胞を 12wellプレートにまきなおし、 実施例 1の 方法に準じて分化誘導した。 非誘導とは、 誘導培地 ·成熟培地のかわりに通常培 地で培養しつづけた条件を意味する。 7日後に、 ImMの Valine- pyrrolidine (GLP-1 分解酵素阻害剤、 エーザィ㈱にて合成） を含む FCS- free DMEM培地に交換した。 18 時間後に培養上清を回収し、 活性型 GLP- 1 (7- 37)量を ELISA法 (LINC0) により測定
[結果]
図 1 0は、 GLP- 1 (7-37)発現レト口ウィルスベクターを導入した初代培養脂肪細 胞における発現を示す図である。 非分化誘導および分化誘導後の脂肪細胞の培養 上清に、 active formである GLP- 1 (7- 37)の発現が認められた。 プレプロタイプで 産生されプロセシングによって切り出されるような因子であっても、 本法によつ て、 その因子のみを脂肪細胞から産生させ得ることを明らかにした。
[実施例 8 ] AP安定発現細胞のマウスへの移植 （試験 1 )
[方法]
実施例 3の方法で作製した AP発現脂肪細胞 （MLV (VSV) /pBabeCL (PLAP) IP導入、 C 57BL/6皮下脂肪由来） をコンフルェントに培養した後、 トリプシン処理により回 収し PBSで洗浄した後に、 5xl07 cells/mlになるように氷温下のマトリゲル （Beet on Dickinson) に懸濁した。 これを C57BL/6マウス （術時 8週齢、 チャールズリバ 一） の背部皮下 （Sc) にマウス一匹あたり 0. 2 mlの用量 （1x10s cells/head) を 注入することにより移植した （分化誘導なし） 。 一方、 同細胞をコンフルェント に培養した後、 実施例 1に示す誘導培地で 3日間培養後、 同様の処理を行レ、移植し た （分化誘導あり） 。 実施例 2に示す方法で経日的に採血を行い、 血漿中の AP活 性を測定した。
[結果]
図 1 1は、 AP発現初代培養脂肪細胞を移植したマウスにおける、 血漿中 AP活性 の推移を示す図である。 いずれの移植法によっても約 50日間の全試験期間にわた つて発現の持続を認めたが、 移植前に 3日間の分化誘導刺激を与えてから移植した 個体 （分化誘導あり） の方が、 誘導なしで移植した個体に比べ、 少ない変動幅で 持続した。 分化誘導刺激を与えることによって、 移植後の生存率を改善し得る可 能性を示した。
[実施例 9 ] AP安定発現細胞のマウスへの移植 （試験 2 )
[方法]
( 1 ) 移植
実施例 3で作製した AP発現脂肪細胞 （MLV (VSV) /pBabeCL (PLAP) IP導入、 ICR皮下 脂肪由来） をコンフルェントに培養した後、 トリプシン処理により回収し PBSで洗 浄した後に、 5xl07 cells/mlになるように Ι /z g/mlの bFGF (Genzyme Techne) を添 加した氷温下のマトリゲル （Becton Dickinson) に懸濁した。 これを ICR系ヌード マウス （術時 6週齢、 チャールズリバ一） の背部皮下 （Sc)、 鼠溪部皮下脂肪内 （ fat) , 腹腔内 (ip)の各部位にマウス一匹あたり 0. 2mlの用量 (lxlO6 cells/head ) を注入することにより移植した。 対照として、 GFP発現月旨肪細胞を同様に処理し 皮下に移植した。
また AP発現細胞の一部は、 実施例 1に示す誘導培地で 3日間培養した後に、 同様 に回収し移植した （Dif) 。 また一部は誘導培地の後さらに成熟培地で 4日間培養 し、 同様に回収して移植した （Mat) 。
また AP発現細胞の一部は、 移植と同条件 (1x1070. 2 mlマトリゲル - bFGF添加） で 8well- Labteckチャンバ一 （Nunc) にまき、 37°Cで加温することによって固形化 した。 この固形化ゲルをマウスの皮下に揷入することで移植した。 このとき、 固 形化後に通常培地で培養したものを pre- fixed (pf) /gr、 分化誘導培地で培養した ものを pf/d とし、 Ί日間培養後に移植を行った。
移植前 （0日） 、 及ぴ移植後経日的に実施例 2の方法に準じて plasma中の AP活性 を測定した。
( 2 ) 摘出
分化誘導後に移植した群 （Dif/Sc) のうち、 個体 Aについては移植5週後に、 個 体 Bについては移植 43週目に、 それぞれ移植細胞塊をマトリゲルごと摘出した。 対 照群の一例についても、 移植 5週目に摘出した。 それぞれ、 50 mg/kgのネンブター ルを腹腔内投与して麻酔した後に皮膚を切開して、 肉眼的に確認しえた移植マト リゲル片を切除した。 手術部位は縫合しイソジン （明治） にて消毒し、 以後同様 に飼育し経日的に採血を行つた。
C結果 3 · 図 1 2 (A) は、 AP発現初代培養脂肪細胞を、 分化刺激有り 'かつ basic FGF添 加マトリゲルを用いて移植した際 （Dif/Sc群） の、 血漿中 AP活性の推移を 50日間 検討した結果である。 血中 AP活性は約 5倍の範囲で 49 0間にわたって安定に推移し た。 移植時の bFGF添加により、 移植後の生着率をより改善し得ることを示した。 また （B) は、 同期間内において、 移植マトリゲルの摘出による血漿中 AP活性の消 失 (個体 A)を示す図である。 PLAP導入群の平均値に比べ、 摘出個体では著明な AP活 性の低下が認められ、 血中 APは移植細胞由来であること、 また移植片の摘出によ り遺伝子発現は速やかに消去可能であること、 を明らかにした。 このとき、 対照 である GFP導入細胞移植群からも一部摘出を行ったところ、 摘出マトリゲル中に GF P陽性細胞を認め、 力つその多くは図 6 (B) のように空胞像を呈した （C) 。 該方 法により移植した初代培養脂肪細胞が、 成熟脂肪としてィンビポで生着する可能 性を示した。
図 1 3は、 図 1 2 (A) における移植マウス、 およびその他さまざまな方法で移 植したマウスの血中 AP活性をより長期にわたって検討した結果である。 PLAP導入 細胞の移植群では、 いずれの移植部位 ·移植法によっても明確な血中 AP活性の上 昇を認めた。 血中 AP活性は長期にわたって持続し、 特にに Mf/Sc群 （図 1 2 (A) に例示した群） は試験期間の 1年にわたって安定な AP発現が認められた。 その他の 移植法においても、 いずれも試験期間内 （ip群では 316日、 fat群では 54日、 Sc群 では 225日、 Mat/Sc群では 317日、 pre- fixの 2群では 314日） において持続的に AP 産生が認められた。 移植後 1週以内に認められる活性のピークは ip群が最も高く 、 以下、 Sc>fat> Dif/Sc=pf-dif >pf-gr Mat/Scの順で高値であった。 また、 移 植後の変動幅については全群比較可能な 13週経過時とピークとの比で見ると、 pr e - fixの 2群で約 3倍ともつとも変動が少なく、 ip群や Dif/Sc、 Mat/Sc群で約 5倍、 Sc群や fat群では約 10倍であった。 各移植法では移植直後のピーク値や移植後の変 動幅が異なっており、 これらは用いる遺伝子産物や病態の特徴、 手技の簡便性な どに応じて使い分けることが可能である。 体外で遺伝子を安定導入した初代培養 脂肪細胞の移植は、 多様な方法で移植可能であること、 また移植後は長期に安定 なィンビボ遺伝子発現が可能であることを明らかにした。
図 1 4は、 図 1 2 (B) に例示したのと同様の摘出試験を、 移植後期に行った結 果を示す図である。 移植初期に摘出した個体 （個体 A) のみならず、 移植後期に摘 出した個体 （個体 B) においても、 摘出後速やかな血中 AP活性の消失を認めた。 本 法により移植された脂肪細胞は移植後長期間にわたって移植部位に局在し、 時期 によらず必要に応じて摘出することにより遺伝子発現を消去できることを明ら力 にした。
[実施例 1 0 ] AP安定発現細胞のマゥスへの移植 （試験 3 )
移植細胞数の用量依存性を確認するために、 次の検討を行つた。
[方法]
実施例 3で作製した AP発現脂肪細胞 （MLV (VSV) /pBabeCL (PLAP) IP導入、 ICR皮下 1 ob
脂肪由来） をコンフルェントに培養した後、 実施例 1に示す誘導培地で 3日間培養 した後に、 トリプシン処理により回収した。 PBSで洗浄した後に、 5xl07 cells/ml になるようにマトリゲルに懸濁した。 AP細胞懸濁液についてはマトリゲルにより 5 倍ずつの段階希釈を行い、 それぞれ lxlO7 cells/ml, 2xl06 cells/ml溶液を調製 した。 これらに終濃度 1 g/mlになるよう bFGFを添加し、 ICR系ヌードマウスの背 部皮下にマウス一匹あたり 0. 2 mlの用量で移植した （それぞれ高用量： lxlO6 cell s/head、 中用量: 2 x 105 cells/headヽ 低用量： xl04 cells/head) 。 コントロー ルとして、 GFP発現脂肪細胞を同様に処理し高用量と同条件 （lxlO6 cells/head) で皮下に移植した。
[結果]
図 1 5は、 AP発現脂肪細胞の移植における、 移植細胞数依存的な血中 AP活性を 示す図である。 移植細胞数を変えることにより、 持続期間に影響せずに用量依存 的な血中 AP活性が認められた。 特に、 中 ·低用量群では高用量群に見られていた 移植早期のピークを示さず、 より少ない変動幅で推移した。 インビポの発現量が
、 移植細胞数によって容易に調整し得ること、 至適細胞数を整えることで移植後 の血中濃度 （発現量） をより安定させ得ることを明らかにした。
[実施例 1 1 ] インスリン発現脂肪細胞の移植による、 糖尿病モデルマウスの 血糖低下作用
[方法]
糖尿病マウスは、 8週齢の雄性 C57BL/6マウスに対し 170mg/kgのストレプトゾト シン （STZ、 SIGMA) を 10 ml/kgで静脈内投与することにより作製した。 STZ投与 1 、 2週後にそれぞれ空腹時血糖値 (FBG) を測定し、 ともに 300 mg/dl以上の FBGを 呈した個体を糖尿病とした。 なお血糖値は全血を採取直後に過塩素酸処理してグ ルコーステスト- π (WAK0) を用いて測定した。
実施例 6で作製した MLV (VSV) /pBabeCL (sls2B10Ins) I2G導入脂肪細胞を、 実施例 f
1 0と同様の方法で分化誘導刺激後、 5xl07/mlになるように 1 μ g/mlの bFGFを添カロ したマトリゲルに懸濁した。 この懸濁液を、 一箇所あたり 0. 2 mlずつ、 糖尿病マ ウスの背部皮下に計 4箇所 （4xl06/head) 個移植した。 対照群には、 非遺伝子導入 の脂肪細胞を同様の方法により移植した。 移植は STZ処置 19日後に行い、 以後経時 的に FBGを測定した。 統計解析は対照群との比較 (unpaired t test)により行った
[結果]
図 1 6は STZ誘発糖尿病マウスに対する、 sls2B10ィンスリン発現脂肪細胞の移 植による効果を示した図である。 対照には非遺伝子導入細胞を移植した。 インス リン発現細胞移植群の血糖値は移植 7日目から低下傾向を示し、 移植 1 3、 2 1日 目には有意な血糖低下作用を示した （A) 。 また、 移植 20日後の体重はインスリン 発現細胞移植群が対照群に比べて有意に高く、 糖尿病による体重減少を回復させ た （B) 。 APを用いた検討結果より、 この血糖低下作用は長期に持続することが推 測される。 このように、 移植した初代培養脂肪細胞から産生された外来遺伝子産 物が、 レシピエントの病態修飾に寄与しうることを明らかにしたと同時に、 本法 による糖尿病治療の可能性が示された。 産業上の利用の可能性
本発明により、 ェクスビボでの遺伝子治療に適した初代培養脂肪細胞に外来遺 伝子を導入する方法が確立され、 外来遺伝子を安定に保持する初代培養脂肪細胞 が確立された。

Claims

OO 請求の範囲
1 . 細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する、 初代培 養の遺伝子治療用脂肪細胞。
2 . 該遺伝子がレトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウィルスベクターによ り該細胞に導入された、 請求項 1に記載の脂肪細胞。
3 . 体内で少なくとも 2 0日以上にわたって該蛋白質を有意に発現する能力を有 する、 請求項 1に記載の脂肪細胞。
4 . 該蛋白質を血中に放出させるために用いる、 請求項 1に記載の脂肪細胞。
5 . 該蛋白質がインスリンまたは G L P— 1 (Glucagon- Like Peptide 1) である 、 請求項 1に記載の方法。
6 . 以下の工程、
( 1 ) 脂肪細胞を初代培養する工程、
( 2 ) 細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を導入し、 安定に保持さ せる工程、
を含んでなる遺伝子治療用脂肪細胞を製造する方法。
7 . 該外来遺伝子をレトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウィルスベクター により導入する、 請求項 6に記載の方法。
8 . 請求項 6または 7に記載の方法により製造された遺伝子治療用脂肪細胞。
9 . 細胞外に分泌する蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する初代培養 の脂肪細胞、 および薬学的に許容される担体を含む、 遺伝子治療用の移植組成物
1 0 . さらに細胞外基質成分を含む、 請求項 9に記載の移植用組成物。
1 1 . さらに血管新生因子を含む、 請求項 9に記載の移植用組成物。
1 2 . 細胞外に分泌される所望の治療蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保 持する初代培養の脂肪細胞を体内に投与する工程を含む、 遺伝子治療方法。
13. 蛋白質を血中に放出させる方法であって、 細胞外に分泌される蛋白質をコ ードする外来遺伝子を安定に保持する初代培養の脂肪細胞を体内に投与する工程 を含む方法。
14. 該蛋白質を血中 20日以上にわたって血中に放出させる方法である、 請求 項 1 3に記載の方法。
15. 血糖を低下させる方法であって、 インスリンまたは GLP—l (Glucagon- Like Peptide 1) をコードする遺伝子を安定に保持する初代培養の脂肪細胞を体 内に投与する工程を含む方法。
16. 細胞外に分泌される蛋白質をコードする外来遺伝子を安定に保持する初代 培養の脂肪細胞が体内に移植された動物。
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