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WO2003012410A1 - Procede de detection au niveau d'un support solide d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molecules base sur un signal amplifie au niveau du support - Google Patents

Procede de detection au niveau d'un support solide d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molecules base sur un signal amplifie au niveau du support Download PDF

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Publication number
WO2003012410A1
WO2003012410A1 PCT/FR2002/002781 FR0202781W WO03012410A1 WO 2003012410 A1 WO2003012410 A1 WO 2003012410A1 FR 0202781 W FR0202781 W FR 0202781W WO 03012410 A1 WO03012410 A1 WO 03012410A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
support
chemical
recognition
molecules
signal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2002/002781
Other languages
English (en)
Inventor
Francis Garnier
Bernard Mandrand
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Priority to US10/485,328 priority Critical patent/US20040234991A1/en
Priority to EP02779605A priority patent/EP1412726A1/fr
Priority to JP2003517554A priority patent/JP2004537722A/ja
Publication of WO2003012410A1 publication Critical patent/WO2003012410A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N2035/00099—Characterised by type of test elements
    • G01N2035/00158—Elements containing microarrays, i.e. "biochip"

Definitions

  • the present invention relates to the detection of biological molecules by the use of an amplification method with improved yield.
  • the recognition of a target biological molecule by a recognition molecule specific for this target biological molecule is a property commonly used in the field of diagnostics. Many biological molecules (DNA, RNA, protein, antibody, antigen) are thus currently detectable and quantifiable thanks to these recognition methods. Techniques comparable to those used for the detection of biological molecules are also used in the food industry to detect the presence of microorganisms such as bacteria.
  • the first step in these detection techniques is to fix the recognition molecule on a support.
  • the support which is used to fix the recognition molecules is generally a flat or porous surface composed of materials, such as:
  • the recognition molecule can be respectively constituted by another DNA, an RNA, an oligonucleotide (or ODN), or by an antigen, an antibody.
  • Printing is an adaptation of the process used by inkjet printers. It is based on the propulsion of very small spheres of fluids (volume ⁇ 1 ni) and at a rate of up to 4000 drops / second. Printing does not involve any contact between the system releasing the fluid and the surface on which it is deposited.
  • Micro-deposition consists in fixing probes long from a few hundred to several hundred bases on the surface of a glass slide. These probes are generally extracted from databases and come in the form of amplified and purified products. This technique makes it possible to produce microarrays with approximately ten thousand DNA spots on a surface of just under 4 cm 2 . However, do not forget the use of nylon membranes, say
  • Macroarrays which carry amplified products, generally by PCR, with a diameter of 0.5 to 1 mm and the maximum density of which is 25 spots / cm 2 . This very flexible technique is used by many laboratories. In the present invention, the latter technique is considered to be part of the biochips.
  • the second technique for attaching the probes to the support is called in situ synthesis.
  • This technique results in the development of short probes directly on the surface of the chip. It is based on the synthesis of oligonucleotides in situ invented by Edwin Southern, and is based on the process of synthesizers of oligonucleotides, it consists in moving a reaction chamber, where the elongation reaction of oligonucleotides takes place, along of the glass surface.
  • Photolithography is a process behind the biochips developed by Affymetrix.
  • Photolithography is derived from microprocessor techniques.
  • the surface of the chip is modified by the fixing of photolabile chemical groups which can be activated by light. Once illuminated, these groups are likely to react with the 3 'end of an oligonucleotide.
  • photolabile chemical groups which can be activated by light. Once illuminated, these groups are likely to react with the 3 'end of an oligonucleotide.
  • masks of defined shapes By protecting this surface with masks of defined shapes, one can illuminate and therefore selectively activate areas of the chip where one wishes to fix one or the other of the 4 nucleotides.
  • the successive use of different masks makes it possible to alternate protection / reaction cycles and therefore to produce the probes of oligonucleotides on spots of around a few tens of square micrometers ( ⁇ m 2 ).
  • Photolithography has advantages: massively parallel, it makes it possible to create a chip of N-mothers in only 4 x N cycles.
  • the second step in these detection techniques is to specifically hybridize a target molecule to the recognition molecule. Note that it is also possible to form the hybrid recognition molecule / target molecule before fixing to the support.
  • the third step of these detection techniques is either to use an already labeled target molecule or to hybridize a detection molecule to the target molecule.
  • the target molecule is marked beforehand.
  • labeling techniques have so far been described in the literature.
  • the Applicant has already filed a patent application, WO-A-99/65926 under priority of June 17, 1998, on a labeling of nucleic acids which is coupled to the fragmentation of these.
  • Another conventional labeling technique consists in grafting a fluorescent label onto the target molecule. After excitation of the marker, a light signal is emitted, and can be detected and analyzed by fluorescence microscopy or by luminometry.
  • the detection limit by fluorescence is of the order of 10 "9 to 10 " 10 mole per liter (mol / 1) of labeled additional oligonucleotides, Lu, Hua. Characterization of DNA hybridization on the optical fiber surface Colloids and Surfaces A: Physiochemical and Engineering Aspects - Vol. 175, Issues 1: p. 147-152. 15 Dec. 2000.
  • a comparable technique consists in grafting a radioactive marker onto the detection probe. This technique is commonly used, in particular for the detection of DNA or RNA. Signal quantification is done by autoradiography, by a photographic plate sensitive to X-rays. Chemiluminescence is another more recent marking technique.
  • the labeling is carried out chemically with a chemiluminescent compound.
  • chemiluminescent markers have already been described in the prior art such as luminol, lucigenin, anthracene, rubene.
  • the chemiluminescent compound is brought to an excited state.
  • the excitation is carried out by modification of the pH (luminol, lucigenin) or by the presence of peroxyoxalate (anthracene, rubene). This excited compound then emits radiation in the visible, allowing the detection of the probe / target complex, by luminometry.
  • the detection can also be done by electrochemiluminescence, as is notably developed in patent WO-A-98/12539.
  • the marker is electrically excited, which leads to the emission of a photon, detectable by luminometry.
  • electrochemistry the detection limit is higher than when using fluorescent markers and can reach approximately 10 "12 to 10 " 13 mole of DNA sought in the context of DNA detection.
  • Another technique finally calls for a modification of the electrochemical signature of a conjugated polymer carrying the probe, during the hybridization of the recognition molecule / target molecule complex.
  • an electrically conductive and electroactive conjugated polymer linked to a first biological molecule is used to detect or specifically assay a second biological molecule (target molecule).
  • the latter is then detected electrically, by measuring a potential difference between the conjugated polymer not linked to the target molecule and the conjugated polymer linked to the target molecule.
  • a comparable study is presented in patent application WO-A-00/77523.
  • the target molecule is then labeled indirectly by specific hybridization of a detection molecule.
  • Biochip means a chip or a support having on its surface a plurality of recognition zones, equipped with molecules having recognition properties. In the remainder of the text, and for abuse of language, the term biochip is used regardless of the destination of the chip for chemical or biological analysis.
  • the present invention finally relates to hybrids or complexes which can be used on such biochips.
  • the biochip method is based on the use of probes (DNA sequences representing a portion of a gene or an oligonucleotide), fixed on a solid support on which a sample of nucleic acids labeled directly or indirectly with fluorochromes.
  • the probes are positioned specifically on the chip and each hybridization provides information on each gene represented. This information is cumulative, and makes it possible to detect the presence of a gene or to quantify the level of expression of this gene in the tissue studied.
  • the chip is washed, read by a scanner and the analysis of the fluorescence is processed by computer.
  • Micam chips registered trademark
  • Micam chips have an effective surface of less than 2 mm 2 .
  • the limit of detection by fluorescence ie the number of photons that one is able to distinguish corresponds to approximately 10 "9 to 10 " 10 mole.
  • the detection limit can reach approximately 10 " to 10 " mole.
  • signal processing techniques could reduce these detection limits by a factor of 10 or even 100, the expected values are obviously far below the wishes of researchers and practitioners to characterize in particular a few tens or hundreds of copies in DNA analysis in solution.
  • the invention proposes to respond to all of the drawbacks of the state of the art.
  • the present invention relates to a method of detecting at the level of a solid support a complexation or a hybridization between at least two molecules, one of the molecules being initially fixed on the support, called recognition molecule , and the other being in solution in a liquid sample, called the target molecule, consisting of:
  • the chemical or biological element releases at least one photon during excitation.
  • the amplified signal is produced by a metallic precipitate, preferably by a precipitate of silver halide.
  • the detection is carried out by electrical detection, and / or luminometry, and / or fluorometry, and / or radiometry, and / or photodiode.
  • the invention also relates to a solid support for detecting complexation or hybridization between at least two molecules, one of the molecules being in contact with the support, called the recognition molecule, and the other being in solution in a liquid sample, called the target molecule, consisting of a wall made of a transparent material comprising:
  • the invention also relates to a solid support for detecting complexation or hybridization between at least two molecules, one of the molecules being in contact with the support, called the recognition molecule, and the other being in solution in a liquid sample, called a target molecule, the attachment of complexes or hybrids and the means of chemical amplification of a light signal coming from a chemical or biological element, specifically linked to the complex or to the hybrid formed are on the same face of the support.
  • the face of the support which carries the means for chemical amplification of a light signal, also carries means for detecting the amplified signal.
  • the support is of thin thickness between 0.1 ⁇ m and 100 ⁇ m, preferably between 0.5 ⁇ m and 10 ⁇ m, and even more preferably 1 ⁇ m.
  • the support is in the form of a substantially parallelepiped.
  • the second face of the support is attached to an analysis card, the space between the two elements circumscribing the means for amplifying the light signal and / or the means for detecting the chemical signal.
  • the chemical or biological element constitutes all or part of one of the two recognition or target molecules or consists of an atom or a detection molecule initially carried by one of said two recognition or target molecules.
  • the element consists of an atom or a group of atoms attached to one of the two recognition or target molecules.
  • all the recognition molecules which are structurally or functionally identical, that is to say which hybridize or complex with the same target molecules, are grouped together in a recognition zone; the support being able to contain at least two recognition zones, preferably between one hundred and one million recognition zones and even more preferably from three hundred to one thousand recognition zones.
  • each recognition zone is associated with amplification means which are specific to it, or which are common with all or part of the other recognition zones of the support.
  • the amplification means cover all or part of the face of the support where they are implanted.
  • the means for amplifying the light signal consist of a metallic layer, preferably a layer of silver, which gives a metallic precipitate preferably of silver in the presence of at least one photon. .
  • the means for detecting the amplified signal or signals are constituted by a matrix electrical network.
  • the support and / or the recognition zones is / are made of glass or of polymer or of silica.
  • the invention also relates to a biochip incorporating a support according to the invention described in the preceding paragraph. Preferably, the biochip is used in a diagnostic test.
  • FIG. 1 represents a partial perspective view of an analysis card according to the invention.
  • 2 shows a sectional view along A-A of Figure 1, the upper part of the analysis card being in place.
  • FIG. 3 represents a partial perspective view of an analysis card according to the invention, highlighting the matrix electrical network, seen in transparency.
  • FIG. 4 represents a sectional view of a support according to the invention, after complexation of a recognition molecule on its external surface.
  • FIG. 5 represents a sectional view of a support according to the invention, after hybridization of a target molecule on the recognition molecule already complexed on the external surface of the support.
  • FIG. 6 represents a sectional view of a support according to the invention, after hybridization of a detection molecule on the hybrid between a target molecule and a recognition molecule already complexed on the external surface of the support.
  • the biochip method is based on the use of probes (DNA sequences representing a portion of a gene or an oligonucleotide), fixed on a solid support on which a sample of nucleic acids labeled directly or indirectly with fluorochromes.
  • the probes are positioned specifically on the chip and each hybridization provides information on each gene represented. This information is cumulative, and makes it possible to detect the presence of a gene or to quantify the level of expression of this gene in the tissue studied.
  • the chip is washed, read by a scanner and the analysis of the fluorescence is processed by computer.
  • the support used to fix the probes generally consists of a flat or porous surface composed of materials, such as:
  • Printing is an adaptation of the process used by inkjet printers. It is based on the propulsion of very small spheres of fluids (volume ⁇ 1 ni) and at a rate of up to 4000 drops / second. Printing does not involve any contact between the system releasing the fluid and the surface on which it is deposited.
  • Micro-deposition consists in fixing probes long from a few hundred to several hundred bases on the surface of a glass slide. These probes are generally extracted from databases and come in the form of amplified and purified products. This technique makes it possible to produce microarrays with approximately ten thousand DNA spots on a surface of just under 4 cm 2 . However, do not forget the use of nylon membranes, say
  • Macroarrays which carry amplified products, generally by PCR, with a diameter of 0.5 to 1 mm and the maximum density of which is 25 spots / cm 2 . This very flexible technique is used by many laboratories. In the present invention, the latter technique is considered to be part of the biochips.
  • the second technique for attaching the probes to the support is called in situ synthesis. This technique results in the development of short probes directly on the surface of the chip. It is based on the synthesis of oligonucleotides in situ invented by
  • Edwin Southern is based on the process of oligonucleotide synthesizers, it consists in moving a reaction chamber, where the elongation reaction of oligonucleotides takes place, along the glass surface.
  • Photolithography is a process behind the biochips developed by Affymetrix.
  • Photolithography is derived from microprocessor techniques. The surface of the chip is modified by the fixing of photolabile chemical groups which can be activated by light.
  • Methods using biochips can essentially be of two different natures. On the one hand, they can be processes for:
  • the network of the chip carries very many probes which correspond to all the genes of the species to be studied.
  • a sample for example of mRNA which represents the active genes of the tissue, is hybridized. Fluorescence analysis makes it possible to know the level of expression of each gene.
  • biochips have been tested on well-known biological systems such as yeast (cell cycle, respiratory metabolism, fermentation ).
  • yeast cell cycle, respiratory metabolism, fermentation
  • the recognition molecules can be, for example, ohgonucleotides, polynucleotides, proteins such as antibodies or peptides, lectins or any other system of the ligand-receptor type.
  • the recognition molecules can comprise fragments of DNA or RNA.
  • the recognition molecules are capable of interacting, for example by hybridization in the case where it is nucleic acids or by complexation in the case where it is antibody and antigen, with target molecules present in a liquid biological sample.
  • each recognition zone comprises only one type of recognition molecules which are identical to each other.
  • the support-recognition molecule-target molecule-detection molecule assembly constitutes a sandwich test
  • Sandwich tests are widely used in diagnostics, whether in molecular diagnostics, for example ELOSA test (Enzyme-Linked Oligo-Sorbent Assay), or in immunological diagnostics, for example ELISA test (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay) .
  • they comprise a recognition molecule, such as a nucleic acid probe or an antigen (in the case of an antigen sandwich) or an antibody (in the case of an antibody sandwich), which is used to capture a target, which will be respectively constituted by a nucleic acid probe or an antibody or an antigen.
  • This recognition molecule is fixed on a solid support in a manner known to a person skilled in the art, either by adsorption, or by direct coupling, or by means of an intermediate protein, such as for example avidin or protein A.
  • the combination of recognition molecule and target molecule is then detected by a detection molecule, which will respectively consist of a nucleic acid probe or an antibody or an antigen.
  • This detection molecule carries or may be subsequently associated with a marker, a marker which is necessary to allow detection and / or quantification.
  • the detection molecule whether or not it is still associated with a marker will always be called the detection molecule.
  • the binding of a nucleic acid to another nucleic acid is called hybridization, while the binding of an antibody to an antigen is called complexation.
  • the tests currently available are tests such as those developed by one of the Applicants for immunoassays or DNA chips developed by the company Affymetrix ("Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays", M. Shee and al., Science, 274, 610-614. "Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis", A. Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026) , for molecular diagnostics. In this technology, the capture probes are generally of reduced size, around twenty nucleotides.
  • a capture oligonucleotide is defined in the same way, a nucleic acid target which is either DNA or TARN, and a detection oligonucleotide.
  • the capture and detection ohgonucleotides are complementary to part of the target but at regions of the target which are structurally and physically different respectively, so that the capture and detection ohgonucleotides cannot hybridize to one another. one to another.
  • the detection elements carry a marker which allows the detection and / or quantification of the target.
  • markers In the state of the art, various markers have been developed with the permanent objective of improving sensitivity. They can either be radioactive, either enzymatic, fluorescent or in the form of microparticles or nanoparticles.
  • markers is intended to mean the attachment of a marker capable of directly or indirectly generating a detectable signal. A non-exhaustive list of these markers follows:
  • the enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase,
  • chromophores such as fluorescent, luminescent, dye compounds, “groups with electron density detectable by electron microscopy or by their electrical property such as conductivity, amperometry, voltametry, impedance,
  • detectable groups for example whose molecules are large enough to induce detectable changes in their physical and / or chemical characteristics
  • this detection can be carried out by optical methods such as diffraction, surface plasmon resonance, variation of surface, variation of contact angle or physical methods like atomic force spectroscopy, tunnel effect,
  • the marker is essentially constituted by a group capable of providing a photon.
  • Indirect systems can also be used, such as for example ligands capable of reacting with an anti-ligand.
  • ligands capable of reacting with an anti-ligand.
  • the ligand / anti-ligand pairs are well known to those skilled in the art, which is the case for example of the following couples: • biotin / streptavidin,
  • sugar / lectin • polynucleotide / complementary to the polynucleotide.
  • ligand which carries the binding agent.
  • the anti-ligand can be detectable directly by the markers described in the preceding paragraph or be itself detectable by a ligand / anti-ligand.
  • FIG. 1 it can be seen in FIG. 1 that the invention relates to an analysis card 1, of which only the first so-called basic part 17 is shown.
  • the latter 1 has on one of its flat faces a certain number of recognition zones 14, which together constitute a support 3.
  • the support 3 very largely absorbs ultraviolet but is transparent in the visible. For this, said glass support 3 is previously loaded with lead.
  • the support 3 is itself deposited within the analysis card 1, which can also be made of glass, or of a suitable plastic.
  • This card 1 as shown in Figure 2 consists of two parts, the first part called base 17, already mentioned above, and a second part constituted by a cover 16, which delimit, together with the supports 3, a space 18 where a liquid sample to be tested 2 can be introduced via any means of the state of the art known to those skilled in the art.
  • the nature and operation of this signal amplification means 5 will be described later.
  • FIG. 3 allows a better understanding of the base part from the inside 17. It comprises in this figure a number of supports 3, each associated with a reservoir 4 and with a signal amplification means 5, itself associated to an upstream electrical terminal 6 and a downstream electrical terminal 7. All of the upstream electrical terminals 6 are in the perpendicular position of all of the downstream electrical terminals 7 without contact between these two assemblies, and jointly form a matrix electrical network 13.
  • the cover 16 has not been shown and the recognition molecule 8, as well as the other molecules mentioned below which cooperate with it, were only represented in a single copy and in a stylized and enlarged manner.
  • a recognition molecule 8 is deposited on one of the recognition zones 14 of a support 3 in ve ⁇ e, according to a conventional microdeposition technique, already mentioned previously. Of course, this fixing is carried out prior to the introduction into the space 18 of the sample 2 to be tested.
  • FIG. 5 represents the next step which consists in allowing the hybridization on the recognition molecule 8 of a target molecule 9. This hybridization does not cause any modification at the level of the base part 17 of the map 1, including support 3.
  • FIG. 6 shows the last biological step. It consists in allowing hybridization on the hybrid constituted by the recognition molecule 8 and the target molecule 9, of a third so-called detection molecule 10.
  • this detection molecule 10 is an integral part of the target molecule 9, in which case this step has no reason to be since the detection will be possible as soon as the hybrid 8 and 9 is formed.
  • the detection molecule 10 is a molecular group capable of specifically binding on the target molecule 9 or on the hybrid 8 and 9, and capable of giving at least one photon to give a light signal 11.
  • This hybridization does not cause any modification at the level of the support 3.
  • it causes a modification at the level of the reservoir 4 of the base part 17 of the card 1, and more precisely at the level of the chemical amplification means 5 of the signal luminous 1 1, which is constituted by a silver halide (AgX, such as AgCl, AgBr, etc.).
  • AgX silver halide
  • the light signal 11 will generate a precipitation of silver 15 within said reservoir 4. This precipitation will then close the electrical circuit between the upstream 6 and downstream 7 electrical terminals, which will allow the conduction of an electrical signal 12.
  • the electrical network 13 of FIG. 3 will thus allow, by the matrix grid of micro-circuits in rows 6 and columns 7 to reveal or not appear at each intersection a precipitate, corresponding in coordinates, to the recognition molecules 8 having specifically hybridized target molecules 9 .
  • the target molecule 9 is labeled with a fluorescent chemical element 10, according to a conventional labeling technique known to those skilled in the art.
  • the hybrid 8 and 9 formed, linked to the fluorescent chemical element 10, is subjected to a global excitation by ultraviolet. Local emissions take place in the visible from the hybrid 8 and 9, forming a light signal 11. Unlike the excitation ultraviolet, this light signal 1 1 crosses the support 3, transparent in the visible and is transformed into chemical signal 15 by precipitation of the silver halide 5.
  • the interaction of this light signal 11 and the silver halide 5 leads to the formation in the reservoir 4 of the chemical signal 15 comprising silver microcrystallites with regard to the hybrid 8 and 9 formed.
  • These silver microcrystallites establish a contact between line and column of the matrix grid.
  • the conductivity established between row and column, related to the size of the microcrystallites formed is directly related to the amount of light emitted, and therefore directly related to the amount of recognition molecules 8 and target molecules 9 hybridized.
  • Chemical signal or metallic precipitate preferably silver
  • Base part of the card 1 18. Space circumscribed by a support 3, the cover 16 and the base part 17

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection au niveau d'un support (3) solide d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molécules (8 et 9), l'une des molécules étant initialement fixée sur le support (3), dite molécule de reconnaissance (8), et l'autre étant en solution dans un échantillon liquide (2), dite molécule cible (9). L'invention concerne également un support solide de détection d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molécules différentes, une biopuce incorporant un tel support et une utilisation de cette biopuce dans un test de diagnostic. Le procédé consiste à : .utiliser un élément chimique ou biologique (10), lié spécifiquement au complexe ou à l 'hybride formé, .exciter ledit complexe ou ledit hybride, afin que l' élépment chimique ou biologique (10) libère un signal lumineux (11), .réceptionner le signal lumineux (11) et le transformer en signal chimique (15) au niveau dudit support (3), et détecter un signal électrique (12), dû au signal chimique (15). L'invention trouve une application préférentielle dans le domaine du diagnostic.

Description

DESCRIPTION
La présente invention concerne la détection de molécules biologiques par l'utilisation d'un procédé d'amplification à rendement amélioré.
La reconnaissance d'une molécule biologique cible par une molécule de reconnaissance spécifique de cette molécule biologique cible est une propriété couramment utilisée dans le domaine du diagnostic. De nombreuses molécules biologiques (ADN, ARN, protéine, anticorps, antigène) sont ainsi actuellement détectables et quantifiables grâce à ces méthodes de reconnaissance. Des techniques comparables à celles utilisées pour la détection de molécules biologiques, sont également utilisées dans le domaine agro-alimentaire pour détecter la présence de micro-organismes telles que les bactéries.
La première étape de ces techniques de détection consiste à fixer la molécule de reconnaissance sur un support. Le support qui sert à fixer les molécules de reconnaissance est généralement une surface plane ou poreuse composée de matériaux, tels que :
• le verre, matériau peu onéreux, inerte et mécaniquement stable ; la surface peut être recouverte d'une grille de Teflon qui délimite des zones hydrophiles et hydrophobes,
• les polymères tels que le polypyrrole,
• le silicium,
• les métaux, notamment l'or et le platine.
Suivant la nature de la molécule biologique cible recherchée, ADN ou protéine, la molécule de reconnaissance peut être respectivement constituée par un autre ADN, un ARN, un oligonucléotide (ou ODN), ou par un antigène, un anticorps.
Pour la fixation des molécules de reconnaissance, on distingue trois grands types de fabrication.
Il y a, tout d'abord, une première technique qui consiste en un dépôt de sondes pré-synthétisées. La fixation des sondes se fait par transfert direct, au moyen de micropipettes, de micro-pointes ou par dispositif type jet d'encre. Cette technique permet la fixation de sondes de taille relativement importante : de 60 bases (impression) à quelques centaines de bases (micro-déposition) :
• L'impression est une adaptation du procédé utilisé par les imprimantes à jets d'encre. Elle repose sur la propulsion de très petites sphères de fluides (volume <1 ni) et à un rythme pouvant atteindre 4000 gouttes/secondes. L'impression n'implique aucun contact entre le système libérant le fluide et la surface à laquelle il est déposé.
• La micro-déposition consiste à fixer des sondes longues de quelques centaines à plusieurs centaines de bases à la surface d'une lame de verre. Ces sondes sont généralement extraites de bases de données et se présentent sous forme de produits amplifiés et purifiés. Cette technique permet de réaliser des puces dénommées microarrays portant environ dix mille spots d'ADN sur une surface d'un peu moins de 4 cm2. Il ne faut toutefois, pas oublier l'emploi de membranes de Nylon, dites
« macroarrays », qui portent des produits amplifiés, généralement par PCR, avec un diamètre de 0,5 à 1 mm et dont la densité maximale est de 25 spots/ cm2. Cette technique très flexible est utilisée par de nombreux laboratoires. Dans la présente invention, cette dernière technique est considérée comme faisant partie des biopuces.
La deuxième technique de fixation des sondes sur le support est appelée la synthèse in situ. Cette technique aboutit à l'élaboration de sondes courtes directement à la surface de la puce. Elle repose sur la synthèse d'oligonucléotides in situ inventée par Edwin Southern, et est fondée sur le procédé des synthétiseurs d'oligonucléotides, elle consiste à déplacer une chambre de réactions, où se déroule la réaction d'élongation d'oligonucléotides, le long de la surface de verre.
Enfin, la troisième technique est appelée la photolithographie, qui est un procédé à l'origine des biopuces développées par Affymetrix. La photolithographie est dérivée des techniques des microprocesseurs. La surface de la puce est modifiée par la fixation de groupements chimiques photolabiles pouvant être activés par la lumière. Une fois illuminés, ces groupes sont susceptibles de réagir avec l'extrémité 3' d'un oligonucléotide. En protégeant cette surface par des masques de formes définies, on peut illuminer et donc activer sélectivement des zones de la puce où l'on souhaite fixer l'un ou l'autre des 4 nucléotides. L'utilisation successive de masques différents permet d'alterner des cycles de protection/réaction et donc de réaliser les sondes d'oligonucléotides sur des spots d'environ quelques dizaines de micromètre carré (μm2). Cette résolution permet de créer jusqu'à plusieurs dizaines de milliers de spots sur une surface de quelques centimètres carré (cm ). La photolithographie présente des avantages : massivement parallèle, elle permet de créer une puce de N-mères en seulement 4 x N cycles.
Toutes ces techniques sont bien entendues utilisables avec la présente invention.
La deuxième étape de ces techniques de détection consiste à hybrider spécifiquement une molécule cible sur la molécule de reconnaissance. A noter qu'il est également possible de former l'hybride molécule de reconnaissance / molécule cible avant la fixation sur le support.
La troisième étape de ces techniques de détection consiste soit à utiliser une molécule cible déjà marquée soit à hybrider sur la molécule cible une molécule de détection.
Selon la première variante, afin de pouvoir détecter l'hybridation ou le complexe molécule de reconnaissance et molécule cible après l'hybridation ou la complexation, la molécule cible est préalablement marquée. Plusieurs techniques de marquage ont été décrites jusqu'alors dans la littérature. La Demanderesse a d'ores et déjà déposé une demande de brevet, WO-A-99/65926 sous priorité du 17 juin 1998, sur un marquage d'acides nucléiques qui est couplé à la fragmentation de ceux-ci. Une autre technique classique de marquage consiste à greffer un marqueur fluorescent sur la molécule cible. Après excitation du marqueur, un signal lumineux est émis, et peut être détecté et analysé en microscopie à fluorescence ou par luminométrie. Dans le cadre de la détection d'ADN, la limite de détection par fluorescence est de l'ordre de 10"9 à 10"10 mole par litre (mol/1) d'oligonucléotides complémentaires marqués, Lu, Hua. Characterization of DNA hybridization on the optical fiber surface Colloids and Surfaces A : Physiochemical and Engineering Aspects - Vol. 175, Issues 1 : p. 147-152. 15 Dec. 2000. Une technique comparable consiste à greffer un marqueur radioactif sur la sonde de détection. Cette technique est couramment utilisée, notamment pour la détection d'ADN ou d'ARN. La quantification du signal s'effectue par autoradiographie, par une plaque photographique sensible aux rayons X. La chimiluminescence est une autre technique de marquage plus récente. Le marquage s'effectue chimiquement par un composé chimiluminescent. Différents marqueurs chimiluminescents ont déjà été décrit dans l'art antérieur tels que le luminol, la lucigenine, l'anthracène, le rubène. Après hybridation sonde/cible marquée, le composé chimiluminescent est porté à un état excité. Suivant le marqueur, l'excitation s'effectue par modification du pH (luminol, lucigenine) ou par la présence de peroxyoxalate (anthracène, rubène). Ce composé excité émet alors un rayonnement dans le visible, permettant la détection du complexe sonde/cible, par luminométrie. D'une façon comparable, la détection peut également se faire par électrochemiluminescence, comme cela est notamment développé dans le brevet WO-A-98/12539. Dans ce cas, le marqueur est excité électriquement, ce qui conduit à l'émission d'un photon, détectable par luminométrie. Par électrochimie, la limite de détection est plus élevée que lors de l'utilisation de marqueurs fluorescents et peut atteindre environ 10"12 à 10"13 mole d'ADN recherché dans le cadre de la détection d'ADN. Une autre technique enfin, fait appel à une modification de la signature électrochimique d'un polymère conjugué portant la sonde, lors de l'hybridation du complexe molécule de reconnaissance / molécule cible. Ainsi, dans la demande de brevet FR94/5064, un polymère conjugué, électriquement conducteur et électro-actif lié à une première molécule biologique (molécule de reconnaissance) est utilisé pour détecter ou doser spécifiquement une seconde molécule biologique (molécule cible). La détection de cette dernière s'effectue alors électriquement, par mesure d'une différence de potentiel entre le polymère conjugué non lié à la molécule cible et le polymère conjugué lié à la molécule cible. Une étude comparable est présentée dans la demande de brevet WO-A-00/77523. Selon la seconde variante, afin de pouvoir détecter l'hybride ou le complexe molécule de reconnaissance et molécule cible après l'hybridation ou complexation, la molécule cible est ensuite marquée indirectement par hybridation spécifiques d'une molécule de détection. Plusieurs techniques de marquage ont été décrites jusqu'alors dans la littérature. Des compléments d'information en relation avec cette seconde variante peuvent être trouvés dans les documents suivants : • E. Lopez-Crapez, H. Bazin, E. André, J. Noletti, J. Grenier and G. Mathis - A homogeneous europium cryptate-based assay for the diagnosis of mutations by time- resolved fluorescence résonance energy transfert - Nucleic acids Res. 2001 29 :e70, et • Yuzhi Zhang, Brendan D. Price, Sotirios Tetradis, Subrata Chakrabarti, Gautam
Maulik and Mike Makrigiorgos - Reproductible and inexpensive probe préparation for oligonucleotide arrays - Nucleic acids Res. 2001 29 :e66.
Toutes ces techniques peuvent être appliquées au domaine des biopuces. On entend par biopuce, une puce ou un support présentant à sa surface une pluralité de zones de reconnaissance, équipées de molécules présentant des propriétés de reconnaissance. Dans la suite du texte, et par abus de langage, le terme biopuce est utilisé indépendamment de la destination de la puce à une analyse chimique ou biologique. La présente invention concerne enfin des hybrides ou complexes pouvant être utilisés sur de tels biopuces.
Le concept de biopuce, plus précisément de puce à ADN, date du début des années 90. De nos jours, ce concept s'est élargi puisque des puces à protéine commencent à se développer. Il repose sur une technologie pluridisciplinaire intégrant la micro-électronique, la chimie des acides nucléiques, l'analyse d'images et l'informatique. Le principe de fonctionnement repose sur un fondement de la biologie moléculaire : le phénomène d'hybridation ; c'est à dire l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences d'ADN.
La méthode des biopuces repose sur l'emploi de sondes (séquences d'ADN représentant une portion d'un gène ou un oligonucleotide), fixées sur un support solide sur lesquelles on fait agir un échantillon d'acides nucléiques marqués directement ou indirectement avec des fluorochromes. Les sondes sont positionnées de manière spécifique sur la puce et chaque hybridation donne un renseignement sur chaque gène représenté. Ces informations sont cumulatives, et permettent de détecter la présence d'un gène ou de quantifier le niveau d'expression de ce gène dans le tissu étudié. Après hybridation, la puce est lavée, lue par un scanner et l'analyse de la fluorescence est traitée par informatique. Ainsi, les puces Micam (marque déposée) ont une surface effective inférieure à 2 mm2. Après hybridation avec des ADN cibles marqués (volume réactionnel de l'ordre de quelques μl), la puce est lue en fluorescence (voir à ce propos M. Cuzin - DNA chips : a new tool for genetic analysis and diagnostics - Transfusion Clinique et Biologique, Volume 8. Issue 3, June 2001, pages 291-296). D'autres systèmes de biopuces utilisés dans le diagnostic génétique ont également été décrits d'une façon comparable (Vo-Dinh 1998 ; WO-A-99/2714 ; WO-A-00/43552), et peuvent être d'une manière plus large appliqués à la détection de protéines cibles ou de bactéries (US-A- 5,814,516). Toutefois, bien que des techniques très sensibles (fluorescence, électrochimie) soient utilisées comme mode de détection, ces procédés présentent des limites de détection qui sont intrinsèquement associées à ces techniques. Ainsi, la limite de détection par fluorescence, c'est à dire le nombre de photons que l'on est capable de distinguer correspond à environ 10"9 à 10"10 mole. Par électrochimie, il semble que la limite de détection puisse atteindre environ 10" à 10" mole. Bien que des techniques de traitement de signal pourraient permettre de faire reculer ces limites de détection d'un facteur de 10, voire 100, les valeurs attendues sont évidemment bien en deçà des souhaits des chercheurs et praticiens de caractériser notamment quelques dizaines ou centaines de copies dans l'analyse d'ADN en solution.
L'invention se propose de répondre à l'ensemble des inconvénients de l'état de la technique.
A cet effet, la présente invention concerne un procédé de détection au niveau d'un support solide d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molécules, l'une des molécules étant initialement fixée sur le support, dite molécule de reconnaissance, et l'autre étant en solution dans un échantillon liquide, dite molécule cible, consistant à :
• utiliser un élément chimique ou biologique, lié spécifiquement au complexe ou à l'hybride formé, • exciter ledit complexe ou ledit hybride, afin que l'élément chimique ou biologique libère un signal lumineux, • réceptionner le signal lumineux et le transformer en signal chimique au niveau dudit support, et
• détecter un signal électrique, du au signal chimique.
Selon un mode préféré de l'invention, l'élément chimique ou biologique libère au moins un photon lors de l'excitation.
Selon un autre mode préféré de l'invention, le signal amplifié est réalisé par un précipité métallique, préférentiellement par un précipité d'halogénure d'argent.
Selon un autre mode préféré de l'invention, la détection est réalisée par détection électrique, et/ou luminométrie, et/ou fluorométrie, et/ou radiométrie, et/ou photodiode.
L'invention concerne également un support solide de détection d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molécules, l'une des molécules étant en contact avec le support, dite molécule de reconnaissance, et l'autre étant en solution dans un échantillon liquide, dite molécule cible, constitué par une paroi en un matériau transparent comportant :
• une première face pour l'accrochage des complexes ou des hybrides, et
• une seconde face portant des moyens d'amplification chimique d'un signal lumineux provenant d'un élément chimique ou biologique, lié spécifiquement au complexe ou à l'hybride formé.
L'invention concerne également un support solide de détection d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molécules, l'une des molécules étant en contact avec le support, dite molécule de reconnaissance, et l'autre étant en solution dans un échantillon liquide, dite molécule cible, l'accrochage des complexes ou des hybrides et les moyens d'amplification chimique d'un signal lumineux provenant d'un élément chimique ou biologique, lié spécifiquement au complexe ou à l'hybride formé sont sur la même face du support.
Selon un mode préféré de l'invention décrite dans les deux paragraphes précédents, la face du support, qui porte les moyens d'amplification chimique d'un signal lumineux, porte également des moyens de détection du signal amplifié. Selon un autre mode préféré de l'invention, le support est de faible épaisseur comprise entre 0,1 μm et 100 μm, préférentiellement entre 0,5 μm et 10 μm, et encore plus préférentiellement de 1 μm. Préférentiellement, le support est en forme sensiblement de parallélépipède. Selon un mode préféré de l'invention, la seconde face du support est accolée à une carte d'analyse, l'espace entre les deux éléments circonscrivant les moyens d'amplification du signal lumineux et/ou les moyens de détection du signal chimique.
Selon un autre mode préféré de l'invention, l'élément chimique ou biologique constitue tout ou partie de l'une des deux molécules de reconnaissance ou cible ou est constitué d'un atome ou une molécule de détection initialement portée par l'une desdites deux molécules de reconnaissance ou cible. Préférentiellement, l'élément est constitué par un atome ou un groupement d'atomes rapporté sur l'une des deux molécules de reconnaissance ou cible.
Selon un autre mode préféré de l'invention, toutes les molécules de reconnaissance identiques structurellement ou fonctionnellement, c'est-à-dire qui s'hybrident ou se complexent aux mêmes molécules cibles, sont regroupées en une zone de reconnaissance ; le support pouvant contenir au moins deux zones de reconnaissance, préférentiellement entre cent et un million de zones de reconnaissance et encore plus préférentiellement de trois cents à mille zones de reconnaissance. Préférentiellement, chaque zone de reconnaissance est associée à des moyens d'amplification qui lui sont propres, ou sont communs avec toute ou partie des autres zones de reconnaissance du support. Préférentiellement, les moyens d'amplification couvrent toute ou partie de la face du support où ils sont implantés.
Selon un autre mode préféré de l'invention, les moyens d'amplification du signal lumineux sont constitués d'une couche métallique, préférentiellement une couche d'argent, qui donne un précipité métallique préférentiellement d'argent en présence d'au moins un photon.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les moyens de détection du ou des signaux amplifiés sont constitués par un réseau électrique matriciel. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le support et/ou les zones de reconnaissance est/sont en verre ou en polymère ou en silice. L'invention concerne également une biopuce incorporant un support selon l'invention décrit dans le paragraphe précédent. Préférentiellement, la biopuce est utilisée dans un test de diagnostic.
Les figures ci-joints sont donnés à titre d'exemple explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Elles permettront de mieux comprendre l'invention.
La figure 1 représente une vue en perspective partielle d'une carte d'analyse selon l'invention. La figure 2 représente une vue en coupe selon A-A de la figure 1, la partie supérieure de la carte d'analyse étant en place.
La figure 3 représente une vue en perspective partielle d'une carte d'analyse selon l'invention, mettant en évidence le réseau électrique matriciel, vu en transparence.
La figure 4 représente une vue en coupe d'un support selon l'invention, après complexation d'une molécule de reconnaissance sur sa surface extérieure.
La figure 5 représente une vue en coupe d'un support selon l'invention, après hybridation d'une molécule cible sur la molécule de reconnaissance déjà complexée sur la surface extérieure du support.
Enfin, la figure 6 représente une vue en coupe d'un support selon l'invention, après hybridation d'une molécule de détection sur l'hybride entre une molécule cible et une molécule de reconnaissance déjà complexé sur la surface extérieure du support.
L'exemple qui suit est donné à titre explicatif et n'a aucun caractère limitatif. Il permettra de mieux comprendre l'invention. Ainsi l'exemple donné concerne essentiellement les acides nucléiques, mais il est tout à fait envisageable de l'utiliser par exemple avec des anticorps et des antigènes.
De manière générale, le concept de biopuce, plus précisément de puce à ADN, date du début des années 90. De nos jours, ce concept s'est élargi puisque des puces à protéine commencent à se développer. Il repose sur une technologie pluridisciplinaire intégrant la micro-électronique, la chimie des acides nucléiques, l'analyse d'images et l'informatique. Le principe de fonctionnement repose sur un fondement de la biologie moléculaire : le phénomène d'hybridation ; c'est à dire l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences d'ADN.
La méthode des biopuces repose sur l'emploi de sondes (séquences d'ADN représentant une portion d'un gène ou un oligonucleotide), fixées sur un support solide sur lesquelles on fait agir un échantillon d'acides nucléiques marqués directement ou indirectement avec des fluorochromes. Les sondes sont positionnées de manière spécifique sur la puce et chaque hybridation donne un renseignement sur chaque gène représenté. Ces informations sont cumulatives, et permettent de détecter la présence d'un gène ou de quantifier le niveau d'expression de ce gène dans le tissu étudié. Après hybridation, la puce est lavée, lue par un scanner et l'analyse de la fluorescence est traitée par informatique.
Le support qui sert à fixer les sondes est généralement constitués de surface plane ou poreuse composée de matériaux, tels que :
• le verre, matériau peu onéreux, inerte et mécaniquement stable ; la surface peut être recouverte d'une grille de Téflon qui délimite des zones hydrophiles et hydrophobes,
• les polymères tels que le polypyrrole,
• le silicium, • les métaux, notamment l'or et le platine.
Pour la fixation des sondes également appelées par la suite molécules de reconnaissance, on distingue trois grands types de fabrication.
Il y a, tout d'abord, une première technique qui consiste en un dépôt de sondes pré-synthétisées. La fixation des sondes se fait par transfert direct, au moyen de micropipettes, de micro-pointes ou par dispositif type jet d'encre. Cette technique permet la fixation de sondes de taille relativement importante : de 60 bases
(impression) à quelques centaines de bases (micro-déposition) :
• L'impression est une adaptation du procédé utilisé par les imprimantes à jets d'encre. Elle repose sur la propulsion de très petites sphères de fluides (volume <1 ni) et à un rythme pouvant atteindre 4000 gouttes/secondes. L'impression n'implique aucun contact entre le système libérant le fluide et la surface à laquelle il est déposé.
• La micro-déposition consiste à fixer des sondes longues de quelques centaines à plusieurs centaines de bases à la surface d'une lame de verre. Ces sondes sont généralement extraites de bases de données et se présentent sous forme de produits amplifiés et purifiés. Cette technique permet de réaliser des puces dénommées microarrays portant environ dix mille spots d'ADN sur une surface d'un peu moins de 4 cm2. Il ne faut toutefois, pas oublier l'emploi de membranes de Nylon, dites
« macroarrays », qui portent des produits amplifiés, généralement par PCR, avec un diamètre de 0,5 à 1 mm et dont la densité maximale est de 25 spots/ cm2. Cette technique très flexible est utilisée par de nombreux laboratoires. Dans la présente invention, cette dernière technique est considérée comme faisant partie des biopuces.
La deuxième technique de fixation des sondes sur le support est appelée la synthèse in situ. Cette technique aboutit à l'élaboration de sondes courtes directement à la surface de la puce. Elle repose sur la synthèse d'oligonucléotides in situ inventée par
Edwin Southern, et est fondée sur le procédé des synthétiseurs d'oligonucléotides, elle consiste à déplacer une chambre de réactions, où se déroule la réaction d'élongation d'oligonucléotides, le long de la surface de verre.
Enfin, la troisième technique est appelée la photolithographie, qui est un procédé à l'origine des biopuces développées par Affymetrix. La photolithographie est dérivée des techniques des microprocesseurs. La surface de la puce est modifiée par la fixation de groupements chimiques photolabiles pouvant être activés par la lumière.
Une fois illuminés, ces groupes sont susceptibles de réagir avec l'extrémité 3' d'un oligonuclétide. En protégeant cette surface par des masques de formes définies, on peut illuminer et donc activer sélectivement des zones de la puce où l'on souhaite fixer l'un ou l'autre des quatre nucléotides. L'utilisation successive de masques différents permet d'alterner des cycles de protection/réaction et donc de réaliser les sondes d'oligo sur des spots d'environ quelques dizaines de micromètre carré (μm2). Cette résolution permet de créer jusqu'à plusieurs dizaines de milliers de spots sur une surface de quelques centimètres carré (cm2). La photolithographie présente des avantages : massivement parallèle, elle permet de créer une puce de N-mères en seulement 4 x N cycles. Toutes ces techniques sont bien entendues utilisables avec la présente invention.
Des procédés utilisant des biopuces peuvent essentiellement être de deux natures différentes. D'une part, il peut s'agir de procédés pour :
• la recherche de la présence ou de l'absence d'un agent pathogène, par exemple d'une bactérie dans la viande.
• la recherche de la présence ou de l'absence de mutations, connaissant le gène, on fabrique des ohgonucléotides qui représentent ce gène. En présence de l'échantillon biologique, l'image obtenue par fluorescence permet de savoir s'il y a une mutation et en quelle position elle est située. Dans cette application, l'utilisation des puces à ADN est l'équivalent d'un séquençage pour un diagnostic de mutation, avec un énorme avantage en terme de rapidité.
• la mesure du niveau d'expression de gènes dans un tissu. Le réseau de la puce porte de très nombreuses sondes qui correspondent à l'ensemble des gènes de l'espèce à étudier. On hybride un échantillon, par exemple d'ARNm qui représente les gènes actifs du tissu. L'analyse par fluorescence permet de connaître le niveau d'expression de chaque gène.
L'efficacité des biopuces a été testée sur des systèmes biologiques bien connus tel que la levure (cycle cellulaire, métabolisme respiratoire, fermentation...). La comparaison des résultats obtenus par les puces avec ceux préalablement obtenus par d'autres approches a démontré une concordance pour les gènes dont l'expression était déjà bien connue dans ces systèmes biologiques. Ces travaux ont ainsi permis de valider la technologie des biopuces.
Les puces à ADN ont ouvert la voie à une nouvelle instrumentation en biologie moléculaire qui peut même intégrer différentes étapes d'analyses sous forme miniaturisée, voir à ce propos les demandes de brevet WO-A-00/78452 sous priorité du 22 juin 1999 et FR00/10978 déposée 28 août 2000 de la Demanderesse. De plus, et comme déjà indiqué ci-dessus, le très fort intérêt suscité ces derniers temps par la protéomique, la discipline clef de la post-génomique, s'accompagne de l'émergence du concept de puces à protéines. Celles-ci font également parties des biopuces selon l'invention.
Les molécules de reconnaissance peuvent être, par exemple, des ohgonucléotides, des polynucléotides, des protéines telles que des anticorps ou des peptides, des lectines ou tout autre système du type ligand-récepteur. En particulier, les molécules de reconnaissance peuvent comporter des fragments d'ADN ou d'ARN.
Lorsque la biopuce est mise en contact avec un échantillon à analyser, les molécules de reconnaissance sont susceptibles d'interagir, par exemple par hybridation dans le cas où il s'agit d'acides nucléiques ou par complexation dans le cas où il s'agit d'anticorps et d'antigène, avec des molécules cibles présentes dans un échantillon biologique liquide.
Ainsi, en équipant une biopuce d'une pluralité de zones de reconnaissance avec différentes molécules de reconnaissance différentes, où chaque molécule de reconnaissance est spécifique d'une molécule cible, il est possible de détecter et éventuellement de quantifier une grande variété de molécules contenues dans l'échantillon. Il est bien entendu évident que chaque zone de reconnaissance ne comporte qu'un seul type de molécules de reconnaissance identiques entre elles.
L'ensemble support-molécule de reconnaissance-molécule cible-molécule de détection constitue un test en format sandwich
Les tests en format sandwich sont largement utilisés en diagnostic, que ce soit en diagnostics moléculaires, par exemple test ELOSA (Enzyme-Linked Oligo-Sorbent Assay), ou en diagnostics immunologiques, par exemple test ELISA (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay). De façon générale, ils comprennent une molécule de reconnaissance, telle qu'une sonde d'acide nucléique ou un antigène (cas d'un sandwich antigène) ou un anticorps (cas d'un sandwich anticorps), qui sert à capturer une cible, qui sera respectivement constituée par une sonde d'acide nucléique ou un anticorps ou un antigène. Cette molécule de reconnaissance est fixée sur support solide de manière connu pour l'homme du métier, soit par adsorption, soit par couplage direct, soit par l'intermédiaire d'une protéine intermédiaire, comme par exemple l'avidine ou la protéine A. L'ensemble molécule de reconnaissance et molécule cible est ensuite détecté par une molécule de détection, qui sera respectivement constituée d'une sonde d'acide nucléique ou un anticorps ou un antigène. Cette molécule de détection porte ou pourra être ultérieurement associée à un marqueur, marqueur qui est nécessaire pour permettre la détection et/ou la quantification. La molécule de détection qu'elle soit ou pas encore associée à un marqueur sera toujours appelée molécule de détection.
Par la suite, la fixation d'un acide nucléique sur un autre acide nucléique est appelée hybridation, alors que la fixation d'un anticorps sur un antigène est appelé complexation. Les tests actuellement disponibles sont des tests tels que ceux développés par l'une des Demanderesses pour les dosages immunologiques ou les puces à ADN mises au point par la société Affymetrix ("Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays", M. Shee et al., Science, 274, 610-614. "Light-generated oligonucleotide arrays for rapide DNA séquence analysis", A. Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026), pour les diagnostics moléculaires. Dans cette technologie, les sondes de capture sont généralement de tailles réduites, autour de vingt nucléotides.
Dans le domaine ELOSA, c'est-à-dire de la détection des acides nucléiques, voir à ce propos la demande de brevet déposée par la Demanderesse WO-A-91/19812, on définit de la même façon un oligonucleotide de capture, une cible acide nucléique qui est soit de l'ADN soit de TARN, et un oligonucleotide de détection. Les ohgonucléotides de capture et de détection sont complémentaires d'une partie de la cible mais au niveau de régions de la cible qui sont respectivement différentes structurellement et physiquement, de sorte que les ohgonucléotides de capture et de détection ne peuvent pas s'hybrident l'un à l'autre.
Que ce soit en diagnostics moléculaires ou en dosages immunologiques, les éléments de détection portent un marqueur qui permet la détection et/ou la quantification de la cible. Dans l'état de la technique, différents marqueurs ont été développés avec l'objectif permanent d'améliorer la sensibilité. Ils peuvent être soit radioactifs, soit enzymatiques, soit fluorescents soit sous la forme de microparticules ou de nanoparticules.
Par marquage, on entend la fixation d'un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs suit :
• les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la péroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la β-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase,
• les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants, « les groupements à densité électronique détectable par microscopie électronique ou par leur propriété électrique comme la conductivité, l'ampérométrie, la voltamétrie, l'impédance,
• les groupements détectables, par exemple dont les molécules sont de tailles suffisantes pour induire des modifications détectables de leurs caractéristiques physiques et/ou chimiques, cette détection peut être réalisée par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation de surface, la variation d'angle de contact ou des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel,
• les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le 125I. Dans la présente invention le marqueur est essentiellement constitué par un groupement pouvant fournir un photon.
Des systèmes indirects peuvent aussi être utilisés, comme par exemple des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. Les couples ligand/anti-ligand sont bien connus de l'homme du métier, ce qui est le cas par exemple des couples suivants : • biotine/streptavidine,
• haptène/anticorps,
• antigène/anticorps,
• peptide/anticorps,
• sucre/lectine, • polynucléotide/complémentaire du polynucléotide. Dans ce cas, c'est le ligand qui porte l'agent de liaison. L' anti-ligand peut être détectable directement par les marqueurs décrits au paragraphe précédent ou être lui- même détectable par un ligand/anti-ligand.
Ces systèmes de détection indirects peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'homme du métier, et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures
FR98/10084 ou WO-A-95/08000 de la Demanderesse ou à l'article J. Histochem.
Cytochem. 45 : 481-491, 1997.
Tous ces éléments évoqués ci-dessus sont susceptibles d'être incorporés dans l'invention afin d'améliorer encore les performances de celle-ci.
Si l'on se réfère maintenant aux figures, on remarque en figure 1 que l'invention concerne une carte d'analyse 1, dont seule la première partie dite de base 17 est représentée. Celle-ci 1 comporte sur l'une de ses faces plate un certains nombre de zones de reconnaissance 14, qui ensemble constituent un support 3. Le support 3 absorbe très largement les ultraviolets mais est transparent dans le visible. Pour cela, ledit support 3 en verre est préalablement chargé au plomb.
Comme représenté à la figure 2, le support 3 est lui même déposé au sein de la carte d'analyse 1, qui peut être en verre également, ou en un plastique approprié. Cette carte 1 telle que représentée sur la figure 2 est constituée de deux parties, la première partie dite de base 17, déjà évoquée précédemment, et une seconde partie constituée par un couvercle 16, qui délimitent, conjointement avec les supports 3, un espace 18 où un échantillon liquide à tester 2 peut être introduit via tout moyen de l'état de la technique connu de l'homme du métier.
Cette première partie dite de base 17 et chaque support 3 délimitent ensemble un réservoir 4 où un moyen d'amplification de signal 5 est présent. La nature et le fonctionnement de ce moyen d'amplification de signal 5 sera décrit ultérieurement.
De part et d'autre du réservoir 4, on remarque la présence d'une borne électrique amont 6 et d'une borne électrique aval 7, qui n'ont aucun contact direct entre elles. Par contre, ledit moyen d'amplification de signal 5 est en contact à la fois avec la borne électrique amont 6 et avec la borne électrique aval 7.
La figure 3 permet de mieux comprendre de l'intérieur la partie de base 17. Elle comporte sur cette figure un certain nombre de supports 3, chacun associé à un réservoir 4 et à un moyen d'amplification de signal 5, lui-même associé à une borne électrique amont 6 et une borne électrique aval 7. L'ensemble des bornes électriques amont 6 est en position perpendiculaire de l'ensemble des bornes électriques aval 7 sans contact entre ces deux ensemble, et forment conjointement un réseau électrique 13 matriciel. Sur ces figures 4 à 6, et dans un souci de faciliter la compréhension de l'invention, le couvercle 16 n'a pas été représenté et la molécule de reconnaissance 8, ainsi que les autres molécules évoquées par la suite qui coopèrent avec elle, n'ont été représentées qu'en un seul exemplaire et de manière stylisée et grossie.
Sur la figure 4, une molécule de reconnaissance 8 est déposée sur une des zones de reconnaissance 14 d'un support 3 en veπe, selon une technique classique de microdépôt, déjà évoquée précédemment. Bien entendu cette fixation est réalisée préalablement à l'introduction dans l'espace 18 de l'échantillon 2 à tester.
La figure 5 représente l'étape suivante qui consiste à permettre l'hybridation sur la molécule de reconnaissance 8 d'une molécule cible 9. Cette hybridation n'entraîne aucune modification au niveau de la partie de base 17 de la carte 1, y compris du support 3.
Enfin la figure 6, représente la dernière étape biologique. Elle consiste à permettre l'hybridation sur l'hybride constitué par la molécule de reconnaissance 8 et la molécule cible 9, d'une troisième molécule dite de détection 10. Bien entendu il est également possible que cette molécule de détection 10 soit une partie intégrante de la molécule cible 9, auquel cas cette étape n'a pas de raison d'être puisque la détection sera réalisable dès la formation de l'hybride 8 et 9.
La molécule de détection 10 est un groupement moléculaire apte à se lier spécifiquement sur la molécule cible 9 ou sur l'hybride 8 et 9, et apte à donner au moins un photon pour donner un signal lumineux 11. Cette hybridation n'entraîne aucune modification au niveau du support 3. Par contre, elle entraîne une modification au niveau du réservoir 4 de la partie de base 17 de la carte 1, et plus précisément au niveau du moyen chimique d'amplification 5 du signal lumineux 1 1, qui est constitué par un halogenure d'argent (AgX, tel que AgCl, AgBr, etc.). Ainsi le signal lumineux 11 va engendrer une précipitation d'argent 15 au sein dudit réservoir 4. Cette précipitation va alors fermer le circuit électrique entre les bornes électriques amont 6 et aval 7, ce qui va permettre la conduction d'un signal électrique 12.
Le réseau électrique 13 de la figure 3 va ainsi permettre par le quadrillage matriciel de micro-circuits lignes 6 et colonnes 7 laisser apparaître ou non à chaque intersection un précipité, correspondant en coordonnées, aux molécules de reconnaissance 8 ayant spécifiquement hybridées des molécules cibles 9.
A noter que la molécule cible 9 est marquée par un élément chimique 10 fluorescent, selon une technique classique de marquage connue de l'homme du métier. L'hybride 8 et 9 formé, lié à l'élément chimique 10 fluorescent, est soumis à une excitation globale par ultraviolet. Des émissions locales ont lieu dans le visible à partir de l'hybride 8 et 9, formant- un signal lumineux 11. Contrairement aux ultraviolet d'excitation, ce signal lumineux 1 1 traverse le support 3, transparent dans le visible et est transformé en signal chimique 15 par la précipitation de l'halogénure d'argent 5. L'interaction de ce signal lumineux 11 et de l'halogénure d'argent 5 conduit à la formation dans le réservoir 4 du signal chimique 15 comprenant des microcristallites d'argent au regard de l'hybride 8 et 9 formé. Ces microcristallites d'argent établissent un contact entre ligne et colonne du quadrillage matriciel. Ainsi, la conductivité établie entre ligne et colonne, liée à la taille des microcristallites formées est directement liée à la quantité de lumière émise, et donc directement liée à la quantité de molécules de reconnaissance 8 et de molécules cibles 9 hybridées. REFERENCES
1. Carte d'analyse
2. Echantillon liquide à tester 3. Support solide ou zone de reconnaissance
4. Réservoir
5. Moyen d'amplification d'un signal ou solution métallique ou solution d'argent
6. Borne électrique amont
7. Borne électrique aval 8. Molécule de reconnaissance
9. Molécule cible
10. Elément chimique ou biologique ou molécule de détection
11. Signal lumineux
12. Signal électrique 13. Réseau électrique
14. Zones de reconnaissance du support 3
15. Signal chimique ou précipité métallique préférentiellement d'argent
16. Couvercle de la carte 1
17. Partie de base de la carte 1 18. Espace circonscrit par un support 3, le couvercle 16 et la partie de base 17

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection au niveau d'un support (3) solide d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molécules (8 et 9), l'une des molécules étant initialement fixée sur le support (3), dite molécule de reconnaissance (8), et l'autre étant en solution dans un échantillon liquide (2), dite molécule cible (9), caractérisé en ce qu'il consiste à :
• utiliser un élément chimique ou biologique (10), lié spécifiquement au complexe ou à l'hybride formé,
• exciter ledit complexe ou ledit hybride, afin que l'élément chimique ou biologique (10) libère un signal lumineux (11),
• réceptionner le signal lumineux (11) et le transformer en signal chimique (15) au niveau dudit support (3), et • détecter un signal électrique (12), dû au signal chimique (15).
2. Procédé, selon la revendication 1, caractérisé en ce que, lors de l'excitation, l'élément chimique ou biologique (10) libère au moins un photon.
3. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le signal chimique (15) est réalisé par un précipité métallique, préférentiellement par un précipité d'halogénure d'argent.
4. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la détection est réalisée par détection électrique (12), et/ou luminométrie, et/ou fluorométrie, et/ou radiométrie, et/ou photodiode.
5. Support solide (3) de détection d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molécules (8 et 9), l'une des molécules étant en contact avec le support (3), dite molécule de reconnaissance (8), et l'autre étant en solution dans un échantillon liquide (2), dite molécule cible (9), caractérisé par le fait qu'il est constitué par au moins une paroi en un matériau transparent comportant :
• une première face pour l'accrochage des complexes ou des hybrides, et
• une seconde face délimitant des moyens d'amplification (5) chimique d'un signal lumineux (11) provenant d'un élément chimique ou biologique (10), lié spécifiquement au complexe ou à l'hybride formé.
6. Support solide (3) de détection d'une complexation ou d'une hybridation entre au moins deux molécules (8 et 9), l'une des molécules étant en contact avec le support (3), dite molécule de reconnaissance (8), et l'autre étant en solution dans un échantillon liquide (2), dite molécule cible (9), caractérisé par le fait que l'accrochage des complexes ou des hybrides et les moyens d'amplification (5) chimique d'un signal lumineux (1 1) provenant d'un élément chimique ou biologique (10), lié spécifiquement au complexe ou à l'hybride formé sont sur la même face dudit support (3).
7. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisé par le fait que la face du support (3), qui porte les moyens d'amplification (5) chimique d'un signal lumineux (11), porte également des moyens de détection (6, 7 et 12) du signal chimique (15).
8. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé par le fait que le support (3) est de faible épaisseur comprise entre 0,1 μm et 100 μm, préférentiellement entre 0,5 μm et 10 μm, et encore plus préférentiellement de 1 μm.
9. Support, selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le support (3) est en forme sensiblement de parallélépipède.
10. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé par le fait que la seconde face du support (3) est accolée à une carte d'analyse (1), l'espace entre les deux éléments (3 et 1) circonscrivant les moyens d'amplification (5) du signal lumineux (11) et/ou les moyens de détection (6, 7 et 12) du signal chimique (15).
11. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisé par le fait que l'élément chimique ou biologique (10) constitue tout ou partie de l'une des deux molécules de reconnaissance (8) ou cible (9) ou est constitué d'un atome ou une molécule de détection initialement portée par l'une desdites deux molécules de reconnaissance (8) ou cible (9).
12. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisé par le fait que l'élément chimique ou biologique (10) est constitué par un atome ou un groupement d'atomes rapporté sur l'une des deux molécules de reconnaissance (2) ou cible (5).
13. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 à 12, caractérisé par le fait que toutes les molécules de reconnaissance (8) identiques structurellement ou fonctionnellement, c'est-à-dire qui s'hybrident ou se complexes aux mêmes molécules cibles (9), sont regroupées en une zone de reconnaissance (14) ; le support (3) pouvant contenir au moins deux zones de reconnaissance (14), préférentiellement entre cent et un million de zones de reconnaissance (14) et encore plus préférentiellement de trois cents à mille zones de reconnaissance (14).
14. Support, selon la revendication 13, caractérisé par le fait que chaque zone de reconnaissance (14) est associée à des moyens d'amplification (5) qui :
• lui sont propres, ou
• sont communs avec toute ou partie des autres zones de reconnaissance (14) du support (3).
15. Support, selon la revendication 13, caractérisé par le fait que les moyens d'amplification (5) couvrent toute ou partie de la face du support (3) où ils sont implantés.
16. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 à 15, caractérisé par le fait que les moyens d'amplification (5) du signal lumineux (11) sont constitués d'une couche métallique, préférentiellement une couche d'argent, qui donne un précipité métallique (15) préférentiellement d'argent en présence d'au moins un photon.
17. Support, selon l'une quelconque des revendications 7 à 16, caractérisé par le fait que les moyens de détection (6 et 7) du ou des signaux chimiques (15) sont constitués par un réseau électrique matriciel (13).
18. Support, selon l'une quelconque des revendications 5 à 17, caractérisé par le fait que le support (3) et/ou les zones de reconnaissance (14) est/sont en verre ou en polymère ou en silice.
19. Biopuce incorporant un support (3), selon l'une quelconque des revendications 5 à 18.
20. Utilisation d'une biopuce, selon la revendication 19, dans un test de diagnostic.
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