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WO1998029740A1 - Microsysteme pour analyses biologiques et son procede de fabrication - Google Patents

Microsysteme pour analyses biologiques et son procede de fabrication Download PDF

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WO1998029740A1
WO1998029740A1 PCT/FR1997/002440 FR9702440W WO9829740A1 WO 1998029740 A1 WO1998029740 A1 WO 1998029740A1 FR 9702440 W FR9702440 W FR 9702440W WO 9829740 A1 WO9829740 A1 WO 9829740A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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conductor
metal
layer
conductive elements
conductors
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR1997/002440
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Frédéric Clerc
Claude Massit
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority to EP97953963A priority Critical patent/EP0948744A1/fr
Priority to JP52970698A priority patent/JP2001510564A/ja
Publication of WO1998029740A1 publication Critical patent/WO1998029740A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
    • H—ELECTRICITY
    • H05—ELECTRIC TECHNIQUES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H05K—PRINTED CIRCUITS; CASINGS OR CONSTRUCTIONAL DETAILS OF ELECTRIC APPARATUS; MANUFACTURE OF ASSEMBLAGES OF ELECTRICAL COMPONENTS
    • H05K3/00—Apparatus or processes for manufacturing printed circuits
    • H05K3/40—Forming printed elements for providing electric connections to or between printed circuits
    • H05K3/4007—Surface contacts, e.g. bumps

Definitions

  • the present invention relates to a microsystem for biological analyzes, usable in particular in the health sector, the food industry and the environment.
  • microtechnologies lead to new solutions, both technical (miniaturization, integration) and economic (mass production), likely to boost the development of biosensors.
  • FR-A-2 598 227 and 4: EP-A-244 326 also describe a method for detecting and / or identifying a biological substance in a liquid sample using electrical measurements.
  • the sample is brought into contact with a reagent-carrying plate comprising a ligand specific for the biological substance to be detected, this plate possibly being made of a semiconductor material such as silicon, and being coated with a silica insulating layer, then we measure the C and / or R components of the electrical impedance of the system to detect the presence of the biological substance in the sample.
  • the present invention specifically relates to a biological analysis microsystem, based on the same principle, that is to say on the recognition reaction of the biological substance or analyte to be detected with a specific ligand, which makes it possible to perform the measurement with a distance between the measurement electrodes much more. low and thereby improve the sensitivity of the device.
  • the device for detecting an analyte comprises: an insulating support coated with a first conductor forming a first electrode, and a second conductor supporting a plurality of conductive elements extending above the first conductor so as to form a second coplanar electrode arranged at a distance d from the first driver, and
  • At least one of the electrodes are covered with a specific ligand L of the analyte to be detected.
  • the analyte A possibly present in this sample will react with the ligand L to form an LA complex, ie an active layer. on the electrodes.
  • the formation of this layer can be detected by measuring the impedance between the electrodes.
  • the particular coplanar structure of the electrodes makes it possible to arrange the two electrodes at a very short distance d, for example from 20 to 500 nm, which is of the order of 2 to 5 times the thickness of the active layer formed by reaction of the analyte with the specific ligand on the electrodes. So, . the impedance measurement will relate to the layer itself and not to a layer of air or of fluid not representative of the phenomenon of recognition between the analyte and the specific ligand.
  • This particular arrangement of the electrodes on the same support makes it possible to obtain a multiplicity of overlap zones between the first and second electrodes resulting in a large total surface of distributed covering.
  • the distribution of the covering surface and the absence of a second support allows the analyte quick access to the electrodes compared to a device where the electrodes are each on a separate support and where the fluid must enter a space between two thick structures. The smaller this space, the more the fluid is hampered, hence problems of access time and homogeneity.
  • this arrangement makes it possible to increase the developed surface of the electrodes and thus to obtain, when measuring the impedance of the active layer formed, a high signal / noise ratio.
  • the conductive elements produced for example in the form of mushrooms, have good mechanical strength, which makes it possible to preserve the distance between the electrodes.
  • the first conductor has the shape of a comb with wide teeth
  • the second conductor has the shape of a comb with narrower teeth, the teeth of the second conductor being interposed between the teeth of the first conductor and supporting conductive elements extending above the teeth of the first conductor.
  • the device of the invention can be used for the detection of analytes of various types.
  • analytes in particular in the medical field, mention may be made of antigens, haptens, antibodies, peptides, nucleic acid fragments (DNA or RNA), enzymes and enzyme substrates.
  • at least one of the electrodes of the device is covered with a ligand specific for the analyte to be detected, for example by direct or indirect grafting of this ligand on the electrode (s) .
  • an analyte-ligand complex or active layer, is formed on the electrode (s), and the presence of this complex is directly detected by an electrical impedance measurement.
  • the specific ligands covering the electrode (s) are those which have at least one site for recognition of the analyte and which are capable of binding to the latter.
  • the ligand-analyte pair can thus belong to the antigen-antibody, hapten-antibody, hormone receptor, DNA- C DNA, RNA- C RNA, enzyme-substrate, or any other association of biological molecules or not, capable of forming between they are complex.
  • the invention also relates to a method of manufacturing the device described above.
  • This process comprises the following steps: a) forming on an insulating support a first conductor and a second conductor spaced apart from each other, b) coating the insulating support comprising the first and second conductors with an insulating layer, c) etch this insulating layer to expose areas of the second conductor which will serve as electrical contact pads, d) forming on these zones and above the insulating layer conductive elements by galvanic growth of a metal, and e) removing the insulating layer by dissolving in a solvent, dissolving neither the first and second conductors, nor the metal conductive elements.
  • steps d) and e) of the process defined above are replaced by the following steps: d ') depositing on the assembly a metallic layer, then a photolithography resin layer, e') exposing the resin and develop it to expose areas of the metal layer having the dimensions of the conductive elements to be formed, f ') forming on these areas of the metal layer the conductive elements by galvanic growth of a metal, g') removing the resin and the metal layer except on the places which correspond to the conductive elements, and h ') remove the insulating layer by dissolving in a solvent, neither dissolving nor first and second conductors, nor the metal of the elements.
  • an insulating support in glass or an insulating support in silicon.
  • the first and second conductors are preferably formed by depositing metal on the insulating support at the corresponding places. This can be done by metallization followed by etching to define the conductive areas corresponding to the first and second conductors.
  • the first second conductors are preferably formed on this support by implantation of ions, for example boron or phosphorus ions at the desired locations.
  • an insulating layer for example of silica, is then deposited on the support comprising the first and second conductors, which is then etched to define the contact pads of the conducting elements which will form the second on the second conductor. electrode.
  • a metal such as gold.
  • a complementary step of coating the first conductor and the conductive elements, ie the electrodes of the device is generally carried out with a specific ligand for the analyte to be detected.
  • the embodiment of this step depends, on the one hand, on the material constituting the electrodes and, on the other hand, on the specific ligand used.
  • Figure 1 is a perspective view of a detection device according to the invention.
  • FIG. 2 is a view in vertical section of the device of the invention along the line XX ′ in FIG. 1.
  • Figures 3 to 7 illustrate the main stages of manufacturing the device of Figure 1 in the case where the insulating support is a glass.
  • FIGS. 8 to 12 illustrate an alternative embodiment of the manufacturing process illustrated by FIGS. 3 to 7.
  • Figures 13 to 17 illustrate another embodiment of the device of Figure 1 suitable for the use of a silicon support.
  • Figure 1 there is shown in perspective a microsystem for biological analysis according to one invention.
  • This microsystem comprises an insulating support 1 provided on its upper surface with a first conductor 3 and. of a second conductor 5.
  • the first conductor 3 which constitutes one of the electrodes of the microsystem, has the shape of a comb whose teeth 3a are relatively large compared to the space between successive teeth.
  • the second conductor 5 also has the shape of a comb comprising teeth 5a interposed between the teeth 3a of the first conductor 3, these teeth 5a are narrower than the teeth 3a and they support conductive elements 7 having the form of fungi which s 'extend above the first conductor 3 at a distance d therefrom.
  • the conductive elements 7 form the second electrode of the microsystem.
  • the electrodes 3 and 7 can be connected to an external electrical circuit respectively by the conductors 13 and 15 in order to polarize the electrodes and to perform impedance measurements between them.
  • Figure 2 which is a vertical section of the device of Figure 1 along line XX ', we see that the conductive element 7 in the form of a mushroom is disposed at a distance d from the teeth 3a of the first conductor 3, being supported by the teeth 5a of the second conductor.
  • the shape of the fungus makes it possible to have a large electrode surface for the recognition reaction of the analyte to be detected.
  • FIGs 3 to 7 there is shown schematically the embodiment of the microsystem of Figure 1 starting from an insulating glass support.
  • the production is carried out by a "cold” process, the manufacturing steps being carried out at temperatures not exceeding 300K.
  • FIG. 3 illustrates the realization of the first step of the manufacturing process according to which the first and second conductors in the form of combs are deposited on the support 1. This can be done by metallization of the support 1, followed by etching which makes it possible to define the conductive areas which will constitute the first comb-shaped conductor 3 with its teeth 3a and the second comb-shaped conductor 5 with the teeth 5a.
  • These combs can be made of gold, a gold-chrome alloy or a gold-nickel-chrome alloy.
  • the use of gold or of a gold alloy makes it possible, on the one hand, to then obtain good galvanic growth of the fungi and, on the other hand, to graft under good conditions the electrodes of biological molecules which will constitute the specific ligand of the analyte to be detected.
  • step b) an insulating layer 6, for example of silica, is deposited on the coated support obtained in the first step, which is then etched to expose the areas 7a corresponding to the contact pads between the second conductor and the mushroom shaped elements.
  • This can be done by cold depositing layer 6, for example by PECVD (chemical vapor deposition activated by plasma) or by spinning with colloidal silica.
  • PECVD chemical vapor deposition activated by plasma
  • the holes corresponding to the contact pads are then made in layer 6 by photolithography.
  • step d) of the method of the invention there is illustrated step d) of the method of the invention.
  • the conductive elements 7 are formed in the form of mushrooms by galvanic growth of metal, using the contact pads as deposition electrodes.
  • the metal is gold or a gold alloy, it can be carried out at room temperature with a bias voltage of the order of a volt. This galvanic growth directly develops the form of fungus.
  • step e) of the method of the invention in which the silica layer 6 is removed by dissolution using hydrofluoric acid.
  • the device shown in FIG. 1 is thus obtained.
  • this device is subjected to a final step of coating the two electrodes with a specific ligand for the analyte to be detected.
  • the surface of the electrodes is modified, for example with thioalkanes when the electrodes are made of gold.
  • Figures 8 to 12 there is shown an alternative embodiment of the method described above.
  • FIGS. 3 and 4 the first steps of the process are carried out as illustrated in FIGS. 3 and 4, but after etching the layer of silica and obtaining the configuration shown in FIG. 4, a continuous layer of metal is deposited on the support.
  • FIG. 8 illustrates this step which can be carried out by sputtering of a metal. In this figure, we see the metal layer 8.
  • the assembly is covered with a photolithography resin which will then be hardened by irradiation so as to become insoluble in certain areas of the substrate, the uncured resin being eliminated by an appropriate solvent.
  • Figures 9 and 10 show these steps.
  • this resin By exposure to the desired areas identified by arrows, this resin is hardened to make it insoluble.
  • FIG. 11 illustrates the production of the conductive elements 7. This can be carried out by galvanic growth, for example of gold, under the same conditions as those described above. The structure shown in FIG. 11 is obtained where the elements 7 are delimited in the hardened resin layer 9.
  • the step of eliminating the hardened resin layer 9 and the metal layer 8 is shown on the zones which do not correspond not to the conducting elements 7. This can be done by applying an oxygen plasma.
  • FIG. 12 The structure shown in FIG. 12 is obtained, which corresponds substantially to that of FIG. 5.
  • the step of eliminating the silica layer 6 and the step of grafting a ligand are then carried out as in the case of FIGS. 6 and 7.
  • FIGS. 13 to 17 another embodiment of the device in FIG. 1 has been described, using an insulating silicon support.
  • the process used is a process of silicon microelectronics type. The manufacturing steps are compatible with the CMOS circuit manufacturing lines.
  • FIG. 13 illustrates the first step of the method according to which the first and the second conductors are formed on the support.
  • the conductive zones corresponding to the combs 3 and 5 are produced by implanting ions in the silicon support to make it conductive on these zones represented by 3a and 5a in the figure.
  • the ions used for implantation are, for example, boron or phosphorus ions, and implantation is carried out through a mask defining the zones to be implanted using sufficient energy to make the silicon conductive on these - zones, over a thickness from a few 1000 ⁇ to 1 micron.
  • FIG. 14 illustrates step b) of the method, in which an insulating layer 6 is formed on the assembly.
  • This insulating layer is silica which can be formed by thermal oxidation of the silicon on the entire support (implanted zones and not established). After this step, the thickness of the zones implanted is weaker.
  • FIG. 9 also illustrates step c) of the method of the invention in which the insulating layer 6 is etched to expose certain areas 7a of the second conductor which will serve as contact pads. This engraving can be carried out by photolithography in. the same conditions as before.
  • Figure 15 there is shown the intermediate step of metallization of the contact pads 10 which can be performed by a complete metallization followed by localized etching corresponding to the location of the contact pads.
  • FIG. 16 represents the step of forming the conductive elements above the layer 6. This can be carried out by galvanic growth as in the case of FIG. 5.
  • FIG. 17 represents step e) of elimination of the silica layer, for example by means of hydrofluoric acid.
  • the last step of the process can be carried out as previously by grafting on the conductive elements 7 and on the electrode formed by the first conductor 3 a ligand specific for the analyte to be detected.
  • the conductor 3 and the elements 7 are made of gold or of a gold alloy, the surface of the electrodes is modified with thioalkanes, then the ligand is fixed on the gold surfaces thus modified by reaction between the ligand and the terminal chains. of thioalkanes.
  • this fixing can be carried out by conventional techniques, for example by adsorption on the electrode after having oxidized it very superficially, or by forming a covalent bond between the electrode and the ligand using a bifunctional coupling reagent capable of reacting both with the electrode and with the ligand.
  • reagents suitable for coupling ligands constituted by antibodies, proteins and peptides, on silicon mention may be made of silane derivatives comprising an alkoxysilane group and an NH 2 group separated from one 'other by a hydrocarbon chain. Techniques of this type are described in references 1, 3 and 4 cited above.
  • the silicon can be chemically modified by an alkoxy or a chlorosilane comprising a function capable of reacting with the specific ligand, for example a terminal group-CN, -NH2 or -SH.
  • these groups are capable of reacting, after activation by an appropriate functional agent, with the groups of molecules such as antibody fragments and oligonucleotides.
  • R 1 represents CH 3 , C 2 H 5 , OCH 3 or OCH 2 H 5
  • R 2 represents -CN, -NH 2 or -SH
  • n is an integer from 1 to 17.
  • an oligonucleotide fragment can be attached to this group by conventional reactions.
  • R represents SH
  • an antibody fragment can also be attached to this group by conventional coupling reactions.
  • the device of the invention whose conductive elements 7 and possibly the first conductor 3 have been coated with an appropriate specific ligand, can be used for the detection of analyte in the following manner.
  • a drop of the sample to be analyzed is placed on the support plate 1. Given the dimensions of the wafer, the drop covers the elements 7 and the electrode 3. If the sample contains the analyte A, an active layer is formed on the surface of the electrodes 3 a and 7 by formation of the LA complex. which occupies practically the entire thickness d between the electrodes. The presence of this layer is detected by measuring the impedance between these electrodes.

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Abstract

L'invention concerne un microsystème pour analyse biologique, destiné à la détection d'analytes, par exemple d'antigènes, dans un échantillon. Le microsystème comprend: un support isolant (1) revêtu d'un premier conducteur (3) formant une première électrode, et d'un second conducteur (5) supportant une pluralité d'éléments conducteurs (7) s'étendant au-dessus du premier conducteur de façon à former une seconde électrode coplanaire disposée à une distance <u>d</u> du premier conducteur; et des moyens de polarisation (13, 15) du premier et du second conducteur. La ou les électrode(s) sont recouvertes d'un ligand spécifique. Après introduction d'un échantillon sur le support, on peut détecter la présence d'analyte dans l'échantillon par mesure de l'impédance entre les électrodes (3 et 7), qui traduira la formation ou non d'une couche analyte-ligand sur la (les) électrode(s).

Description

MICROSYSTEME POUR ANALYSES BIOLOGIQUES ET SON PROCEDE
DE FABRICATION
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention a pour objet un microsystème pour analyses biologiques, utilisable notamment dans le secteur de la santé, de l'industrie agro-alimentaire et de l'environnement.
Elle s'applique plus particulièrement à la réalisation de microsystèmes d'analyses biologiques destinés au diagnostic in vitro, notamment en analyse des maladies infectieuses (détection du HIV, des ycobactéries etc.).
Dans ces domaines où il s'agit de faire des économies de santé, on recherche actuellement des microsystèmes d'analyse à usage unique, qui soient simples d'emploi, utilisent de très faibles volumes d'échantillon et reposent sur le principe d'une détection directe ne nécessitant ni réactif de détection (marqueur ou autre) , ni amplification du signal de détection.
Etat de la technique antérieure .
Depuis environ quatre ans, de nouveaux formats de tests (multiaffinité, intégration de fonctions telles que l'amplification génique, séparation par électrophorèse) ont fait leur apparition et leurs applications industrielles semblent importantes, bien qu'aujourd'hui elles soient principalement localisées dans le séquençage du génome humain.
Ces nouveaux tests - doivent surtout leur succès à l'introduction des microtechnologies dans le domaine biologique, permettant ainsi, par l'intégration et la parallélisation, d'atteindre des performances, des vitesses et des sensibilités élevées. Par ailleurs, les microtechnologies conduisent à des solutions nouvelles tant techniques (miniaturisation, intégration) qu'économiques (production en masse), de nature à relancer le développement des biocapteurs.
Ainsi, on a réalisé récemment des support de tests pour la détection immunochimique directe, constitués de couches minces de semiconducteur et de silice avec des anticorps liés de façon covalente à ces couches, qui permettent de détecter la présence d'un antigène capable de réagir avec ces anticorps par mesure de la capacité de l'ensemble (voir référence
1 : Battaillard et al, dans Analytical Chemistry, 60, 1988, pages 2374-2379). Un autre microsystème du même type a été décrit par Schyberg et al, dans la référence
2 : Sensors and Actuators, B26-27, 1995, pages 457-460.
Les documents référencés 3 : FR-A-2 598 227 et 4 : EP-A-244 326 décrivent aussi un procédé de détection et/ou d'identification d'une substance biologique dans un échantillon liquide .à l'aide de mesures électriques. Selon ce procédé, on met en contact l'échantillon avec une plaque porte-réactif comportant un ligand spécifique de la substance biologique à détecter, cette plaque pouvant être réalisée en un matériau semi-conducteur tel que le silicium, et étant revêtue d'une couche isolante de silice, puis on mesure les composantes C et/ou R de l'impédance électrique du système pour détecter la présence de la substance biologique dans l'échantillon.
Tous ces systèmes .font appel à la réaction de reconnaissance entre la substance biologique à détecter et un ligand spécifique de cette substance pour réaliser une détection directe de cette dernière sans avoir à utiliser d'autres réactifs ou moyens de détection (marqueurs, réactions d'amplification du signal etc) . En effet, cette réaction de reconnaissance se traduit par la formation d'une couche active de très faible épaisseur, par exemple de 100 Â à 1 000 Â, qui présente des caractéristiques électriques, par exemple une capacité et une impédance, différentes de celles du système en l'absence de ladite couche. Cependant, avec les systèmes connus actuellement la distance entre les électrodes de mesure disposées de part et d' autre de la couche active reste importante par rapport à l'épaisseur de cette couche active ; et ceci nuit à la sensibilité de détection. La présente invention a précisément pour objet un microsystème d'analyse biologique, basé sur le même principe, c'est-à-dire sur la réaction de reconnaissance de la substance biologique ou analyte à détecter avec un ligand spécifique, qui permet, d'effectuer la mesure avec une distance entre les électrodes de mesure beaucoup plus . faible et d'améliorer de ce fait la sensibilité du dispositif.
Exposé de l'invention
Selon l'invention, le dispositif de détection d'un analyte comprend : un support isolant revêtu d'un premier conducteur formant une première électrode, et d'un second conducteur supportant une pluralité d'éléments conducteurs s' étendant au-dessus du premier conducteur de façon à former une seconde électrode coplanaire disposée à une distance d du premier conducteur, et
- des moyens de polarisation du premier et du second conducteurs.
Selon l'invention l'une au moins des électrodes, de préférence les deux, sont recouvertes d'un ligand spécifique L de l' analyte à détecter.
De la sorte, lorsqu'on dépose sur le support isolant muni des électrodes un échantillon à analyser au contact des deux électrodes, l' analyte A éventuellement présent dans cet échantillon va réagir avec le ligand L pour former un complexe LA, soit une couche active sur les électrodes. La formation de cette couche pourra être détectée en mesurant l'impédance entre les électrodes. Avec le dispositif de l'invention, la structure coplanaire particulière des électrodes permet de disposer les deux électrodes à une distance d très faible, par exemple de 20 à 500 nm, qui est de l'ordre de 2 à 5 fois l'épaisseur de la couche active formée par réaction de l' analyte avec le ligand spécifique se trouvant sur les électrodes. Ainsi, . la mesure d' impédance portera sur la couche elle-même et non sur une couche d'air ou de fluide non représentative du phénomène de reconnaissance entre l' analyte et le ligand spécifique.
Cette disposition particulière des électrodes sur le même support permet d'obtenir une multiplicité de zones de recouvrement entre les premières et deuxièmes électrodes entraînant une grande surface totale de recouvrement répartie. La répartition de la surface de recouvrement et l'absence de second support permet à l' analyte un accès rapide aux électrodes par rapport à un dispositif où les électrodes sont chacune sur un support distinct et où le fluide doit pénétrer dans un espace situé entre deux structures épaisses. Plus cet espace est faible, plus le fluide est gêné d'où des problèmes de temps d'accès et d'homogénéité. Par ailleurs, cette disposition permet d'augmenter la surface développée des électrodes et d'obtenir ainsi, lors de la mesure d'impédance de la couche active formée, un rapport signal/bruit élevé.
Enfin, comme on le verra plus loin, les éléments conducteurs, réalisés par exemple sous forme de champignons, présentent une bonne tenue mécanique, ce qui permet de préserver la distance entre les électrodes .
Selon un mode préféré de réalisation du dispositif de l'invention, le premier conducteur a la forme d'un peigne à dents larges, le second conducteur a la forme d'un peigne à dents plus étroites, les dents du second conducteur étant intercalées entre les dents du premier conducteur et supportant des éléments conducteurs s' étendant au-dessus des dents du premier conducteur .
Le dispositif de l'invention est utilisable pour la détection d' analytes de divers types. A titre d'exemple de tels analytes, notamment dans le domaine médical, on peut citer les antigènes, les haptènes, les anticorps, les peptides, les fragments d'acide nucléique (ADN ou ARN) , les enzymes et les substrats d' enzymes . Pour cette détection, conformément à l'invention, l'une au moins des électrodes du dispositif est recouverte- d'un ligand spécifique de l' analyte à détecter, par exemple par greffage direct ou indirect de ce ligand sur la (les) électrodes. Lorsque la (les) électrode (s) ainsi recouverte (s) sont en contact avec un échantillon contenant l' analyte correspondant, il se forme un complexe analyte-ligand, ou couche active, sur la (les) électrode (s) , et on détecte directement la présence de ce complexe par une mesure électrique d'impédance.
Les ligands spécifiques recouvrant la ou les électrodes sont ceux qui présentent au moins un site de reconnaissance de l' analyte et qui sont susceptibles de se lier à ce dernier. Le couple ligand-analyte peut ainsi appartenir aux couples antigène-anticorps, haptène-anticorps, hormone-récepteur, ADN-ADNC, ARN- ARNC, enzyme-substrat, ou tout autre association de molécules biologiques ou non, capables de former entre elles des complexes.
L'invention a également pour objet un procédé de fabrication du dispositif décrit ci-dessus. Ce procédé comprend les étapes suivantes : a) former sur un support isolant un premier conducteur et un second conducteur espacés l'un de l' autre, b) revêtir le support isolant comportant les premier et second conducteurs d'une couche isolante, c) graver cette couche isolante pour mettre à nu des zones du second conducteur qui serviront de plots de contact électrique, d) former sur ces zones et au-dessus de la couche isolantes des éléments conducteurs par croissance galvanique d'un métal , et e) éliminer la couche isolante par dissolution dans un solvant, ne dissolvant ni les premier et second conducteurs, ni le métal des éléments conducteurs .
Selon une variante de réalisation de ce procédé, celui-ci comprend de plus le dépôt d'une couche métallique au-dessus de la couche isolante, qui servira de fonds pour la croissance galvanique des éléments conducteurs et présentera des dimensions correspondant à celles des éléments conducteurs à former . Selon cette variante, les étapes d) et e) du procédé défini ci-dessus sont remplacées par les étapes suivantes : d' ) déposer sur l'ensemble une couche métallique, puis une couche de résine de photolithographie, e' ) insoler la résine et la développer pour mettre à nu des zones de la couche métallique ayant les dimensions des éléments conducteurs à former, f ' ) former sur ces zones de la couche métallique les éléments conducteurs par croissance galvanique d'un métal, g' ) éliminer la résine et la couche métallique sauf sur les endroits qui correspondent aux éléments conducteurs, et h' ) éliminer la couche isolante par dissolution dans un solvant, ne dissolvant ni les premier et second conducteurs, ni le métal des éléments .
Pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention, on peut utiliser soit un support isolant en verre, soit un support isolant en silicium.
Dans le cas d'un support isolant en verre, on forme de préférence, les premier et second conducteurs par dépôt de métal sur le support isolant aux endroits correspondants. Ceci peut être effectué par une métallisation suivie d'une gravure pour définir les zones conductrices correspondant aux premier et second conducteurs .
Dans le cas où l'on part d'un support isolant en silicium, on forme de préférence les premier second conducteurs sur ce support par implantation d'ions, par exemple d'ions bore ou phosphore aux endroits voulus.
Dans les deux cas, on dépose ensuite sur le support comportant les premier et second conducteurs, une couche isolante, par exemple de silice, que l'on grave ensuite pour définir sur le second conducteur les plots de contact des éléments conducteurs qui formeront la seconde électrode. Ceux-ci peuvent être obtenus par croissance galvanique d'un métal tel que l'or.
Comme on le verra plus loin, les différentes étapes de ce procédé de fabrication peuvent être réalisées par les techniques employées de façon classique en microélectronique.
Après réalisation de ces étapes, on effectue généralement une étape complémentaire de revêtement du premier conducteur et des éléments conducteurs, soit des électrodes du dispositif, par un ligand spécifique de l' analyte à détecter. Le mode de réalisation de cette étape dépend, d'une part, du matériau constituant les électrodes et, d'autre part, du ligand spécifique utilisé.
D' autres caractéristiques et avantage de l'invention apparaîtront mieux à la lecture de la description qui suit, donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif.
Brève description des dessins .
La figure 1 est une vue en perspective d'un dispositif de détection conforme à l'invention.
La figure 2 est une vue en coupe verticale du dispositif de l'invention suivant la ligne XX' de la figure 1.
Les figures 3 à 7 illustrent les étapes principales de fabrication du dispositif de la figure 1 dans le cas où le support isolant est un verre.
Les figures 8 à 12 illustrent une variante de réalisation du procédé de fabrication illustré par les figures 3 à 7.
Les figures 13 à 17 illustrent un autre mode de réalisation du dispositif de la figure 1 adapté à l'emploi d'un support en silicium.
Exposé détaillé des modes de réalisations
Sur la figure 1, on a représenté en perspective un microsystème pour analyse biologique conforme à 1' invention.
Ce microsystème comprend un support isolant 1 muni sur sa surface supérieure d'un premier conducteur 3 et. d'un second conducteur 5. Le premier conducteur 3 qui constitue l'une des électrodes du microsystème, a la forme d'un peigne dont les dents 3a sont relativement larges par rapport à l'espace entre dents successives . Le second conducteur 5 a également la forme d'un peigne comportant des dents 5a intercalées entre les dents 3a du premier conducteur 3, ces dents 5a sont plus étroites que les dents 3a et elles supportent des éléments conducteur 7 ayant la forme de champignons qui s'étendent au-dessus du premier conducteur 3 à une distance d de celui-ci. Les éléments conducteurs 7 forment la seconde électrode du microsystème. Les électrodes 3 et 7 peuvent être reliées à un circuit électrique extérieur respectivement par les conducteurs 13 et 15 en vue de polariser les électrodes et d'effecteur des mesure d'impédance entre celles-ci.
Sur la figure 2 qui est une coupe verticale du dispositif de la figure 1 selon la ligne XX' , on voit que l'élément conducteur 7 en forme de champignon est disposé à une distance d des dents 3a du premier conducteur 3, en étant supporté par les dents 5a du second conducteur. Comme on peut le voir sur cette figure, la forme de champignon permet d'avoir une surface d'électrode importante pour la réaction de reconnaissance de l' analyte à détecter.
Sur les figures 3 à 7, on a représenté de façon schématique la réalisation du microsystème de la figure 1 en partant d'un support isolant en verre. La réalisation est effectuée par un procédé « froid », les étapes de fabrication s' effectuant à des températures ne dépassant pas 300K.
La figure 3 illustre la réalisation de la première étape du procédé de fabrication selon laquelle on dépose sur le support 1 les premier et second conducteurs ayant la forme de peignes . Ceci peut être effectué par métallisation du support 1, suivie d'une gravure qui permet de définir les zones conductrices qui constitueront le premier conducteur en forme de peigne 3 avec ses dents 3a et le second conducteur en forme de peigne 5 avec les dents 5a. Ces peignes peuvent être réalisés en or, en alliage or-chrome ou en alliage or-nickel-chrome. En effet, l'emploi d'or ou d'alliage d'or permet, d'une part, d'obtenir ensuite une bonne croissance galvanique des champignons et, d'autre part, de réaliser dans de bonnes conditions le greffage sur les électrodes de molécules biologiques qui constitueront le ligand spécifique de l' analyte à détecter.
Sur la figure 4, on a représenté la réalisation des étapes b) et c) du procédé de l'invention.
Dans l'étape b) on dépose sur le support revêtu obtenu dans la première étape, une couche isolante 6 par exemple de silice, que l'on grave ensuite pour mettre à nu les zones 7a correspondantes aux plots de contact entre le second conducteur et les éléments en forme de champignons. Ceci peut être effectué en déposant à froid la couche 6, par exemple par PECVD (dépôt chimique en phase vapeur activé par plasma) ou par dépôt à la tournëtte de silice colloïdale. Les trous correspondant aux plots de contact sont ensuite pratiqués dans la couche 6 par photolithogravure .
On peut utiliser dans ce but une résine organique photosensible au ultraviolets et éliminer la couche de silice aux endroits voulus correspondant aux plots de contact par dissolution dans l'acide fluorhydrique . On obtient ainsi. la configuration représentée sur la figure 4 où les trous 7a correspondent aux plots de contact des éléments conducteurs 7.
Sur la figure 5, on a illustré l'étape d) du procédé de l'invention. Dans cette étape, on forme les éléments conducteurs 7 en forme de champignons par croissance galvanique de métal, en utilisant les plots de contact comme électrodes de dépôt. Lorsque le métal est de l'or ou un alliage d'or, elle peut être effectuée à température ambiante avec une tension de polarisation de l'ordre du volt. Cette croissance galvanique développe directement la forme de champignon .
Sur la figure 6, on a représenté l'étape e) du procédé de l'invention dans laquelle on retire la couche de silice 6 par dissolution au moyen d'acide fluorhydrique . On obtient ainsi le dispositif représenté sur la figure 1.
En vue de son utilisation pour la détection d' analyte, ce dispositif est soumis à une dernière étape de revêtement des deux électrodes par un ligand spécifique de l' analyte à détecter. Dans ce but, on modifie la surface des électrodes par exemple par des thioalcanes lorsque les électrodes sont en or. Sur les figures 8 à 12, on a représenté une variante de réalisation- du procédé décrit ci-dessus.
Dans cette variante, les premières étapes du procédé sont réalisées comme il est illustré sur les figures 3 et 4, mais après gravure de la couche de silice et obtention de la configuration représentée sur la figure 4, on dépose une couche continue de métal sur l'ensemble du support. La figure 8 illustre cette étape qui peut être réalisée par pulvérisation cathodique d'un métal. Sur cette figure, on voit la couche de métal 8.
Après ce dépôt, on recouvre l'ensemble d'une résine de photolithographie qui sera durcie ensuite par irradiation de façon à devenir insoluble sur certaines zones du substrat, la résine non durcie étant éliminée par un solvant approprié.
Les figures 9 et 10 représentent ces étapes. Sur la figure 9, on voit le support recouvert de la couche continue métallique 8 qui est revêtu de la couche de résine 9, par exemple la résine organique photosensible aux ultraviolets.
Par insolation sur les zones voulues repérées par des flèches, on durcit cette résine pour la rendre insoluble .
Sur la figure 10, on a représenté l'ensemble après élimination de la résine non durcie, ce qui met à nu la couche métallique 8 sur des zones qui correspondent aux éléments conducteurs 7 à former.
La figure 11 illustre la réalisation des éléments conducteurs 7. Ceci peut être effectué par croissance galvanique, par exemple d'or, dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. On obtient la structure représentée sur la figure 11 où les éléments 7 sont délimités dans la couche de résine durcie 9.
Bien entendu, on peut utiliser à la place de la résine durcissabie, une résine susceptible d'être dégradée et rendue soluble par irradiation, les zones irradiées étant dans ce cas inversées.
Sur la figure 12, on a représenté l'étape d'élimination de la couche de résine durcie 9 et de la couche métallique 8 sur les zones qui ne correspondent pas aux éléments conducteurs 7. Ceci peut être effectué par applications d'un plasma oxygène.
On obtient la structure représentée sur la figure 12 qui correspond sensiblement à celle de la figure 5.
On réalise ensuite l'étape d'élimination de la couche 6 de silice et l'étape de greffage d'un ligand comme dans le cas des figures 6 et 7.
Sur les figures 13 à 17, on a décrit un autre mode de réalisation du dispositif de la figure 1, à partir d'un support isolant en silicium. Le procédé utilisé est un procédé de type microélectronique silicium. Les étapes de fabrication sont compatibles avec les lignes de fabrication de circuits CMOS. La figure 13 illustre la première étape du procédé selon laquelle on forme sur le support le premier et le second conducteurs. Dans ce cas, on réalise les zones conductrices correspondant aux peignes 3 et 5 par implantation d'ions dans le support en silicium pour le rendre conducteur sur ces zones représentées par 3a et 5a sur la figure. Les ions utilisés pour l'implantation sont par exemple des ions de bore ou phosphore, et on réalise l'implantation à travers un masque définissant les zones à implanter en utilisant une énergie suffisante pour rendre conducteur le silicium sur ces - zones, sur une épaisseur de quelques 1 000 Â à 1 micron.
La figure 14 illustre l'étape b) du procédé, dans laquelle on forme sur l'ensemble une couche isolante 6. Cette couche isolante est de la silice qui peut être formée par oxydation thermique du silicium sur l'ensemble du support (zones implantées et non implantées). Après cette étape, l'épaisseur des zones implantées est plus faible. La figure 9 illustre également l'étape c) du procédé de l'invention dans laquelle on grave la couche isolante 6 pour mettre à nu certaines zones 7a du second conducteur qui serviront de plots de contact. Cette gravure peut être réalisée par photolithogravure dans . les mêmes conditions que précédemment .
Sur la figure 15, on a représenté l'étape intermédiaire de métallisation des plots de contact 10 qui peut être effectuée par une métallisation complète suivie d'une gravure localisée correspondant à l'emplacement des plots de contacts.
La figure 16 représente l'étape de formation des éléments conducteurs au-dessus de la couche 6. Ceci peut être effectué par croissance galvanique comme dans le cas de la figure 5.
La figure 17 représente l'étape e) d'élimination de la couche de silice, par exemple au moyen d'acide fluorhydrique . La dernière étape du procédé peut être réalisée comme précédemment en greffant sur les éléments conducteurs 7 et sur l'électrode formée par le premier conducteur 3 un ligand spécifique de l' analyte à détecter. Lorsque le conducteur 3 et les éléments 7 sont en or ou en alliage d"or, on modifie la surface des électrodes par des thioalcanes, puis on fixe le ligand sur les surfaces d' or ainsi modifiées par réaction entre le ligand et les chaînes terminales de thioalcanes.
Lorsque le premier conducteur 3 est en silicium, cette fixation peut être effectuée par des techniques classiques, par exemple par adsorption sur l'électrode après l'avoir oxydée très superficiellement, ou par formation d'une liaison covalente entre l'électrode et le ligand en utilisant un réactif de couplage bifonctionnel capable de réagir à la fois avec l'électrode et avec le ligand.
L'utilisation de tels réactifs est bien connue. A titre d'exemple de réactif convenant pour le couplage de ligands constitués par des anticorps, des protéines et des peptides, sur le silicium, on peut citer les dérivés de silane comportant un groupe alkoxysilane et un groupe NH2 séparés l'un de l'autre par une chaîne hydrocarbonée. Des techniques de ce type sont décrites dans les références 1, 3 et 4 citées précédemment.
Ainsi, on peut modifier chimiquement le silicium par un alcoxy ou un chlorosilane comportant une fonction capable de réagir avec le ligand spécifique, par exemple un groupe terminal-CN, -NH2 ou -SH. En effet, ces groupes sont capables de réagir après activation par un agent fonctionnel approprié, avec les groupements de molécules telles que des fragments d'anticorps et des oligonucléotides .
A titre d'exemple d' alcoxy silane utilisable, on peut citer les composés de formules :
R1
C2H5— O— Si — (CH2)n-LR2
R1
dans laquelle R1 représente CH3, C2H5, OCH3 ou OCH2H5, R2 représente -CN, -NH2 ou -SH, et n est un nombre entier de 1 à 17. De tels composés se fixent sur le silicium par réaction avec les hydroxyles libres, selon le schéma réactionnel :
Figure imgf000019_0001
,2
Lorsque R" représente NH , on peut fixer sur ce groupe un fragment d' oligonucleotide par des réactions classiques .
2 Lorsque R représente SH, on peut fixer sur ce groupement un fragment d'anticorps également par des réactions de couplage classiques.
On précise que les techniques utilisables pour réaliser les différentes étapes de fabrication du microsystème sont celles de la microélectronique.
L'utilisation des microtechnologies permet notamment :
- d'améliorer la sensibilité du dispositif (contrôle précis des géométries, des paramètres optiques ou électriques),
- d'améliorer la spécificité de la détection en utilisant plusieurs dispositifs du même type sur une seule plaquette de silicium (redondance, détection multiple) , - d'améliorer la fiabilité de la détection en s' affranchissant des problèmes de pollutions localisées ou de réactions .non spécifiques, et
- d'obtenir une réduction du coût de fabrication ( miniaturisation des éléments sensibles, utilisation des techniques collectives d'hybridation et de packaging développées pour les microsystèmes) .
Ainsi, ces dispositifs fabriqués par des procédés de microtechnologies offriront-ils aux utilisateurs finaux, notamment aux laboratoires d'analyse décentralisés, l'avantage d'une haute praticabilité .
Le dispositif de l'invention dont les éléments conducteurs 7 et éventuellement le premier conducteur 3 ont été revêtus d'un ligand spécifique approprié, peut être utilisé pour la détection d' analyte de la façon suivante .
On dépose sur la plaquette support 1 une goutte de l'échantillon à analyser. Etant donné les dimensions de la plaquette, la goutte recouvre les éléments 7 et l'électrode 3. Si l'échantillon contient l' analyte A, il se forme une couche active sur la surface des électrodes 3 a et 7 par formation du complexe L-A qui occupe pratiquement toute l'épaisseur d entre les électrodes. On détecte la présence de cette couche par une mesure de l'impédance entre ces électrodes.
Ceci peut être effectué en appliquant aux électrodes 3 et 5 une tension appropriée et en mesurant l'intensité du courant circulant entre ces électrodes. En comparant cette mesure avec une mesure effectuée dans les mêmes conditions en l'absence d' analyte, on peut vérifier si l'épaisseur de la couche sensible a augmenté et en déduire la présence ou non d' analyte. Références citées :
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(2) Schyber et al, Sensors and Actuators, B26-27, 1995, pages 457-460.
(3) FR-A-2 598 227
(4) EP-A-244 326

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de détection d'un analyte, comprenant : - un support isolant (1) revêtu d'un premier conducteur (3) formant une première électrode, et d'un second conducteur (5) supportant une pluralité d'éléments conducteurs (7) s' étendant au-dessus du premier conducteur de façon à former une seconde électrode coplanaire disposée à une distance d du premier conducteur, et
- des moyens de polarisation (13, 15) du premier et du second conducteurs.
2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel l'une au moins des électrodes est recouverte d'un ligand spécifique L de l' analyte A à détecter.
3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le premier conducteur a la forme d'un peigne à dents larges (3a), le second conducteur a la forme d'un peigne à dents plus étroites (5a), les dents du second conducteur étant intercalées entre les dents du premier conducteur et supportant des éléments conducteurs (7) s' étendant au-dessus des dents du premier conducteur.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel la distance d est de 20 à 500 nm.
5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le support est en verre, le premier et le second conducteurs sont réalisés en métal et les éléments conducteurs sont en métal .
6. Dispositif selon la revendication 5, dans lequel le métal est l'or ou un alliage d'or.
7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications l à 4, dans lequel le support est en silicium, le premier et le second conducteurs sont en silicium rendu conducteur par implantation d'ion, et les éléments conducteurs formant la seconde électrode sont en métal.
8. Dispositif selon la revendication 7, dans lequel le métal est l'or.
9. Procédé de fabrication .d'un dispositif selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : a) former sur un support isolant (1) un premier conducteur (3) et un second conducteur (5) espacés l'un de l'autre, b) revêtir le support isolant comportant les premier et second conducteurs d'une couche isolante (6), c) graver cette couche isolante pour mettre à nu des zones (7a) du second conducteur qui serviront de plots de contact électrique, d) former sur ces zones et au-dessus de la couche isolante des éléments conducteurs (7) par croissance galvanique d'un métal , et e) éliminer la couche isolante (6) par dissolution dans un solvant, ne 'dissolvant ni les premier et second conducteurs, ni le métal des éléments conducteurs .
10. Procédé de fabrication d'un dispositif selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : a) former sur un support isolant (1) un premier conducteur (3) et un second conducteur (5) espacés l'un de l'autre, b) revêtir le support isolant comportant les premier et second conducteurs d'une couche isolante (6), c) graver cette couche isolante pour mettre à nu des zones (7a) du second conducteur qui serviront de plots de contact électrique, d) déposer sur l'ensemble une couche métallique (8), puis une couche (9) de résine de photolithographie, e) insoler la résine et la développer pour mettre à nu des zones de la couche métallique ayant les dimensions des éléments conducteurs (7) à former, f) former sur ces zones de la couche métallique les éléments conducteurs (7) par croissance galvanique d'un métal, g) éliminer la résine (9) et la couche métallique (8) sauf sur les endroits qui correspondent aux éléments conducteurs (7), et h) éliminer la couche isolante (6) par dissolution dans un solvant, ne dissolvant ni les premier et second conducteurs, ni le métal des éléments .
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, comportant en outre une étape de revêtement du premier conducteur et des éléments conducteurs par un ligand L spécifique de l' analyte à détecter .
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans lequel l'étape a) consiste à déposer un métal sur le support isolant aux endroits correspondant aux premier et second conducteurs.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans lequel le support étant en silicium, on forme sur ce support le premier et le second conducteurs par implantation d'ions.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, dans lequel dans l'étape b) , on dépose une couche de silice sur le support comportant les premier et second conducteurs, on grave cette couche dans l'étape c) par photolithogravure, et on élimine cette couche en fin d'opération par dissolution dans l'acide fluorhydrique .
15. Procédé selon les revendications 11 et 12, dans lequel le métal des éléments conducteurs étant de l'or, on modifie celui-ci par des thioalcanes avant de revêtir les éléments par le ligand spécifique de 1' analyte à détecter.
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