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WO2002036788A2 - Acides nucleiques et polypeptides exprimes specifiquement dans les cellules de la zone de transfert d'un grain de plante et leurs applications - Google Patents

Acides nucleiques et polypeptides exprimes specifiquement dans les cellules de la zone de transfert d'un grain de plante et leurs applications Download PDF

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Publication number
WO2002036788A2
WO2002036788A2 PCT/FR2001/003439 FR0103439W WO0236788A2 WO 2002036788 A2 WO2002036788 A2 WO 2002036788A2 FR 0103439 W FR0103439 W FR 0103439W WO 0236788 A2 WO0236788 A2 WO 0236788A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
nucleotide
plant
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2001/003439
Other languages
English (en)
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WO2002036788A3 (fr
Inventor
Peter Rogowsky
Jean-Louis Magnard
Pascual Perez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Ecole Normale Superieure de Lyon
Ecole Normale Superieure de Paris
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Ecole Normale Superieure de Lyon
Ecole Normale Superieure de Paris
Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR0016602A external-priority patent/FR2818286A1/fr
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Recherche Agronomique INRA, Ecole Normale Superieure de Lyon, Ecole Normale Superieure de Paris, Universite Claude Bernard Lyon 1 filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to AU2002223038A priority Critical patent/AU2002223038A1/en
Publication of WO2002036788A2 publication Critical patent/WO2002036788A2/fr
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Publication of WO2002036788A3 publication Critical patent/WO2002036788A3/fr
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acids expressed specifically in the transfer zone of a plant grain, preferably nucleic acids constituting the DD1-a and DD1-b genes of maize.
  • the invention also relates to recombinant cloning and / or expression vectors comprising a nucleic acid according to the invention as well as to host cells transformed with a nucleic acid or a recombinant vector of the invention, in particular host cells of plant origin.
  • the subject of the invention is also a plant transformed with a nucleic acid or a recombinant vector as defined above as well as their production methods.
  • the invention also relates to a polypeptide encoded by a nucleic acid according to the invention.
  • Angiosperms or flowering plants, are characterized by their mode of sexual reproduction by double fertilization. Two male gametes are transported through the pollen tube and enter the ovum, then into the embryo sac. While one is going to fertilize the oosphere to give a diploid embryo, the other unites with the two polar nuclei of the central cell, thus allowing the formation of a second organism, this triploid, called albumen or embryo accessory.
  • albumen During the early development phase, from 0 to 12 JAP (day after pollination), after a syncitial development, the albumen becomes cellular, and cell territories differentiate within this organism mainly in four zones.
  • starchy endosperm which when mature occupies about two-thirds of the grain volume and is a storage location for various reserve substances including starch.
  • a second main area is the aleurone layer, consisting of cells at the periphery of the albumen and which synthesizes essential hydrolytic enzymes when mobilizing the reserves necessary for germination.
  • a third main area is the ESR (“embryo surrounding region”) area which surrounds the embryo, then is limited to the periphery of the suspensor from seven JAP and is formed of small cells with dense cytoplasm which would be involved in the transfer of metabolites towards the embryo.
  • the fourth main zone consists of the transfer zone which allows the passage of nutrients from maternal tissues to the endosperm and the developing embryo. It is during the early phase of development that the major structures that will constitute the future grain are put in place. However, very few specific genes for this phase are known, and their function has not been determined.
  • the transfer zone is the key location that controls the quantity and / or quality of the metabolites that transit from the mother plant to the grain.
  • the article by HUEROS et al. (1995) describes the BETL1 protein having a sequence of 85 amino acids in length, as well as the nucleotide sequence coding for this protein and shows the expression of the BETL1 gene in the transfer cells of the endosperm of corn.
  • This article discloses the sequence of messenger RNA which constitutes the transcription product of the BETL1 gene but does not describe any genomic sequence of this gene.
  • the article by HUEROS et al. (1999b) presents the amino acid sequence of the proteins BETL-2, BETL-3 and BETL-4 which are also expressed mainly in the grain transfer zone. This article also describes short partial nucleotide sequences localized upstream of these genes capable of intervening in the regulation of their expression in the plant. However, no complete sequence of a functional promoter is described.
  • regulatory sequences specifically expressed in the grain transfer zone which can be used to control the expression of sequences of interest, preferably sequences coding for proteins, for example enzymes, proteins involved in the defense of the plant against external stresses such as pathogens, signal proteins involved in communication between the mother plant and the endosperm or the embryo or between the endosperm and the embryo, marker proteins
  • enzymes there may be mentioned those making it possible to modify the quantity or the quality of the metabolites transferred from the mother plant to developing albumen in order to obtain mature grains having improved characteristics, in particular nutritive or industrial.
  • DD1-a and DD1-b two very highly homologous genes, respectively designated DD1-a and DD1-b, were expressed specifically in the transfer zone of the developing grain in maize and isolated and characterized these sequences as well as those of proteins encoded by the DD1-a and DD1-b genes.
  • the applicant has also characterized the regulatory sequences located upstream of the two genes.
  • nucleotide sequences of the DD1-a and DD1-b genes have less than 60% homology with the sequences of the BETL genes described by HUEROS et al. previously cited.
  • DD1-a and DD1-b genes are expressed earlier (Day 7 after pollination) than the BETL genes (Day 10 after pollination).
  • the nucleotide sequences of the two genes DD1-a and DD1-b each include, from the 5 'end to the 3' end, (i) the regulatory sequence allowing specific expression of the gene in the transfer zone, (ii ) a coding sequence comprising the exons and introns of the gene and (iii) a non-coding sequence downstream of the last exon of the gene.
  • sequence of the DD1-a gene according to the invention is referenced as the sequence SEQ ID No. 1 of the sequence listing.
  • a first subject of the invention consists of a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 80% nucleotide identity with a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2, or with a fragment of this nucleotide sequence.
  • the invention also relates to a nucleic acid of sequence complementary to the nucleic acid as defined above.
  • any conventional technique of molecular biology, microbiology and recombinant DNA known to those skilled in the art can be used. Such techniques are described for example by SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984), HAMES and HIGGINS (1985a), HAMES and HIGGINS (1984), BERBAL (1984) and AUSUBEL et al. (1994).
  • any nucleic acid and any polypeptide according to the invention are in an isolated or purified form.
  • isolated within the meaning of the present invention designates a biological material which has been removed from its original environment (the environment in which it is naturally located).
  • a polynucleotide found naturally in a plant is not isolated.
  • the same polynucleotide separated from the adjacent nucleic acids in which it is naturally inserted into the genome of the plant is isolated.
  • Such a polynucleotide may be included in a vector and / or such a polynucleotide may be included in a composition and nevertheless remain in an isolated state since the vector or the composition does not constitute its natural environment.
  • purified does not require that the material be present in a form of absolute purity, exclusive of the presence of other compounds. Rather, it is a relative definition.
  • a polynucleotide or a polypeptide is in the purified state after purification of the starting material or of the natural material of at least one order of magnitude, preferably 2 or 3 and preferably four or five orders of magnitude.
  • nucleotide sequence can be used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
  • nucleotide sequence encompasses the genetic material itself and is therefore not limited to information regarding its sequence.
  • nucleic acid include RNA, DNA, cDNA sequences or even RNA / DNA hybrid sequences of more than one nucleotide, indifferently in single strand form or in duplex form.
  • nucleotide designates both natural nucleotides (A, T, G, C) as well as modified nucleotides which comprise at least one modification such as (i) an analogue of a purine, (ii) an analogue of 'a pyrimidine, or (iii) a similar sugar, such modified nucleotides being described for example in PCT application No. WO 95/04064.
  • a first polynucleotide is considered to be “complementary” to a second polynucleotide when each base of the first nucleotide is paired with the complementary base of the second polynuleotide whose orientation is reversed.
  • the complementary bases are A and T (or A and U), and C and G.
  • a first nucleic acid having at least 80% identity with a second reference nucleic acid will have at least 80%, preferably at least 85%, 90%, 95%, 98%, 99% or 99.5% identity in nucleotides with this second reference polynucleotide, the percentage identity between two sequences being determined as described below.
  • the “percentage of identity” between two nucleotide or amino acid sequences, within the meaning of the present invention, can be determined by comparing two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the nucleotide or polypeptide sequence in the comparison window can thus include additions or deletions (for example “gaps”) with respect to the reference sequence (which does not include these additions or these deletions) so as to obtain an optimal alignment of the two sequences.
  • the percentage is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleic base or amino acid residue is observed for the two sequences (nucleic or peptide) compared, then by dividing the number of positions at which there is identity between the two bases or amino acid residues by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by one hundred to obtain the percentage of sequence identity.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be carried out by computer using known algorithms.
  • the percentage of sequence identity is determined using the BLAST software (BLAST version 2.06 of September 1998), using exclusively the default parameters.
  • a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleic acid according to the invention includes the "variants" of a nucleic acid according to the invention.
  • variant of a nucleic acid according to the invention is meant a nucleic acid which differs from the reference nucleic acid by a or several substitutions, additions or deletions of a nucleotide, with respect to the reference nucleic acid.
  • a variant of a nucleic acid according to the invention can be of natural origin, such as an allelic variant which exists naturally. Such a variant nucleic acid can also be an unnatural nucleic acid obtained, for example, by mutagenesis techniques.
  • the differences between the reference nucleic acid and the "variant" nucleic acid are reduced so that the reference nucleic acid and the variant nucleic acid have very similar nucleotide sequences and, in many regions , identical.
  • the nucleotide modifications present in a variant nucleic acid can be silent, which means that they do not affect the amino acid sequence which can be encoded by this variant nucleic acid.
  • Changes in nucleotides in the variant nucleic acid can also result in substitutions, additions or deletions of one or more amino acids in the sequence of the polypeptide which can be encoded by this variant nucleic acid.
  • a variant nucleic acid according to the invention comprising an open reading phase, code for a polypeptide which retains the same function or the same biological activity as the polypeptide coded by the reference nucleic acid.
  • a variant nucleic acid according to the invention and which comprises an open reading phase codes for a polypeptide which retains the capacity to be recognized by antibodies directed against the polypeptide encoded by the nucleic acid of reference.
  • fragment of a nucleic acid according to the invention is meant a nucleotide sequence of a reduced length compared to the reference nucleic acid, the nucleic acid fragment having a nucleotide sequence identical to the nucleotide sequence of the reference nucleic acid on the common part.
  • Such fragments of a nucleic acid according to the invention have at least 12, 15, 18, 25.30, 35, 40, 45, 50, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 , 3000 or 4000 consecutive nucleotides of the reference nucleic acid, the maximum length in nucleotides of a fragment of a nucleic acid according to the invention being of course limited by the maximum length in nucleotides of the reference nucleic acid.
  • genomic nucleic acid of the DD1-a gene is referenced as the nucleotide sequence SEQ ID No. 1 of the sequence listing.
  • the subject of the present invention is a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1, or with a fragment of this nucleotide sequence.
  • nucleic acid of sequence complementary to the nucleic acid as defined above is also part of the invention.
  • Another subject of the invention is a nucleic acid consisting of a polynucleotide having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1, or with a fragment of this nucleotide sequence, as well as a nucleic acid of complementary sequence.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 12, preferably at least 15 and very preferably at least 20 consecutive nucleotides of the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1, it being understood that such nucleic acid includes in its definition "fragments" of a nucleic acid according to the invention as defined in the present description.
  • sequence of the DD1-a gene as described in the sequence SEQ ID No. 1 comprises, from the 5 ′ end to the 3 ′ end, respectively: a) the regulatory sequence of the DD1-a gene allowing the expression of the protein DD1-a in the transfer zone of the developing grain; b) a so-called “coding” region which includes the exons and introns of the DD1-a gene; and 10
  • the regulatory region of the DD1-a gene begins at the nucleotide at position 1 and ends at the nucleotide at position 3598 of the sequence SEQ ID No. 1.
  • the non-coding region located downstream of the coding region of the DD1-a gene begins at the nucleotide at position 6541 and ends at the nucleotide at position 7159 of the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.
  • the sequence of the DD1-a gene also includes five exons and four introns, the structural characteristics of which are detailed in Tables 1 and 2 respectively below.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 12 consecutive nucleotides of an exonic polynucleotide of the DD1-a gene, such as the polynucleotides 1 to 5 described in Table 1 above, which are all included in the nucleic acid with sequence SEQ ID No. 1.
  • Such a nucleic acid codes for at least part of the polypeptide coded by the DD1-a gene and can in particular be inserted into a recombinant vector intended for the expression of the corresponding translation product in a host cell or in a plant transformed with this vector. recombinant. 11
  • Such a nucleic acid can also be used for the synthesis of probes and nucleotide primers intended for the detection or the amplification of nucleotide sequences included in the DD1-a gene in a sample, if necessary of sequences of the DD1- gene a carrying one or more mutations, preferably prefer one or more mutations of a nature to modify the phenotype of a plant carrying such a mutated DD1-a gene, for example by modifying the regulation of the transfer of metabolites from the mother plant to the albumen by formation in the grain or by modifying the regulation of the response to biotic stress such as infection with a plant pathogen, or the development of the endosperm or the embryo.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 12 consecutive nucleotides of an intronic polynucleotide of the DD1-a gene, such as the polynucleotides 1 to 4 described in table 2 above, which are all included in the nucleic acid with sequence SEQ ID No. 1.
  • Such a nucleic acid can be used as a probe or oligonucleotide primer to detect the presence of at least one copy of the DD1-a gene in a sample, or also to amplify a target sequence determined within the DD1-a gene.
  • genomic region of the DD1-a gene essentially restricted to the so-called “coding” region comprising the 5 exons and the 4 introns is referenced as the sequence SEQ ID No. 5 of the sequence listing. 12
  • sequence SEQ ID N ° 5 has a length of 3149 nucleotides and includes in particular:
  • the subject of the invention is also a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 5 or with a fragment of this nucleotide sequence as well as a nucleic acid of complementary sequence.
  • the invention also relates to a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 5 or with a fragment of this nucleotide sequence as well as a nucleic acid of complementary sequence.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid comprising the nucleotide sequence SEQ ID No. 5, or a nucleic acid of complementary sequence. 13
  • the invention also relates to a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence SEQ ID No. 5 or a nucleic acid of complementary sequence.
  • nucleic acid characterized in that it comprises one of the following nucleotide sequences: a) the sequence going from the nucleotide in position 1 to the nucleotide in position 197 of the sequence SEQ ID N ° 5, or a nucleic acid of complementary sequence; b) the sequence going from the nucleotide at position 908 to the nucleotide at position 1087 of the sequence SEQ ID No. 5, or a nucleic acid of complementary sequence; c) the sequence going from the nucleotide in position 1161 to the nucleotide in position 1214 of the sequence SEQ ID No.
  • nucleic acid of complementary sequence a nucleic acid of complementary sequence
  • sequence extending from the nucleotide at position 1294 to the nucleotide at position 1431 of the sequence SEQ ID No. 5, or a nucleic acid of complementary sequence e) the sequence going from the nucleotide at position 2600 to the nucleotide at position 3149 of the sequence SEQ ID No. 5, or a nucleic acid of complementary sequence
  • nucleic acid of complementary sequence g) the sequence going from the nucleotide in position 1088 to the nucleotide in position 1160 of the sequence SEQ ID No. 5, or a nucleic acid of complementary sequence; and h) the sequence going from the nucleotide at position 1215 to the nucleotide at position 1293 of the sequence SEQ ID No. 5; i) the sequence going from the nucleotide at position 1432 to the nucleotide at position 2599 of the sequence SEQ ID No. 5, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • nucleic acid of sequence SEQ ID No. 5 is shown in FIG. 1, in which the positions of the various exons and introns of the DD1-a gene are also detailed. 14
  • the DD1-a gene is transcribed in the form of a messenger RNA which has been partially isolated and characterized.
  • This messenger RNA includes an open reading frame partially coding for the protein DD1-a.
  • the partial cDNA of the DD1-a gene is 782 nucleotides in length and is referenced as the sequence SEQ ID No. 7 of the sequence listing.
  • Another subject of the invention consists of a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 7, or with a fragment of this nucleotide sequence as well as a nucleic acid of sequence complementary to the above nucleic acid.
  • the invention also relates to a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 7 or a fragment of this nucleotide sequence as well as a nucleic acid of sequence complementary to the nucleic acid. supra.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid characterized in that it comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 7 or a nucleic acid of complementary sequence. Also part of the invention is a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence SEQ ID No. 7, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the DD1-a gene codes for a polypeptide of 304 amino acids in length having a degree of amino acid identity of approximately 90% relative to the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DD1-b gene according to the invention , after aligning the two sequences.
  • polypeptide encoded by the nucleic acid of sequence SEQ ID No 1 or SEQ ID No 5 of the DD1-a gene is referenced as the sequence SEQ ID No 9 of the sequence listing. This polypeptide is also encoded by the cDNA resulting from the transcription of the DD1-a gene.
  • the invention also relates to a nucleic acid coding for a polypeptide having at least 80% identity in amino acids with the sequence SEQ ID No. 9. 15
  • the invention also relates to a nucleic acid characterized in that it codes for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 9.
  • Also part of the invention is a nucleic acid encoding a "fragment" of a polypeptide having at least 80% nucleotide identity with a polypeptide of amino acid sequence SEQ ID No. 9.
  • the invention also relates to a nucleic acid encoding a fragment of a polypeptide of amino acid sequence SEQ ID No. 9.
  • a polypeptide having at least 80% amino acid identity with a reference polypeptide comprises at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% at least 99.5% identity in amino acids with the reference polypeptide.
  • variant polypeptides are included in the definition of a polypeptide having at least 80% amino acid identity with a reference polypeptide according to the invention, the so-called “variant” polypeptides.
  • variant polypeptides means a polypeptide whose amino acid sequence comprises one or more substitutions, additions or deletions of at least one amino acid residue, relative to the sequence of amino acids of the reference polypeptide, it being understood that the amino acid substitutions can be of a conservative or non-conservative nature.
  • a variant of a reference polypeptide according to the invention consists of a polypeptide which retains the biological function or activity of the reference polypeptide and / or which is recognized by antibodies directed against the reference polypeptide.
  • These polypeptide variants can result from allelic variations characterized by differences in the nucleotide sequences of the gene coding for these polypeptides. Such polypeptide variants can also result from alternative splicing or from post-translational modifications.
  • fragment of a reference polypeptide according to the invention is meant a polypeptide having at least 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 or 250 consecutive amino acids of a polypeptide as defined in the present description.
  • the genomic nucleic acid of the DD1-b gene according to the invention is referenced as the sequence SEQ ID No. 2 of the sequence listing.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 2, or with a fragment of this nucleotide sequence.
  • the invention also relates to a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence
  • SEQ ID No. 2 or with a fragment of this nucleotide sequence as well as a nucleic acid of sequence complementary to the abovementioned nucleic acid.
  • the genomic sequence of the DD1-b gene according to the invention of sequence SEQ ID No. 2 comprises, from the 5 ′ end to the 3 ′ end, the following sequences: a) the regulatory sequence of the DD1-b gene allowing the specific expression of this gene in the transfer zone of the developing grain; b) a so-called “coding” nucleotide region comprising the four exons and the three introns of the DD1-b gene; and c) a non-coding region located downstream of the above coding region, and which is capable of containing additional regulatory elements of the DD1-b gene.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 12 consecutive nucleotides of the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 2.
  • the regulatory sequence of the DD1-b gene begins at the nucleotide in position No. 1 and ends at the nucleotide in position No. 2816 of the sequence SEQ ID No. 2. This regulatory sequence is referenced as the sequence SEQ ID No. 4 of the sequence listing. 17
  • the coding nucleotide sequence of the DD1-b gene which includes all of the exons and introns of this gene is referenced as the sequence SEQ ID No. 6 of the sequence listing.
  • sequence located downstream of the coding region of the DD1-b gene begins at the nucleotide at position 5459 and ends at the nucleotide at position 6128 of the nucleotide sequence SEQ ID No. 2.
  • the sequence of the DD1-b gene comprises 4 exons and 3 introns, the structural characteristics of which are detailed in Tables 3 and 4 respectively below.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 12 consecutive nucleotides of an exonic polynucleotide of the DD1-b gene, such as the polynucleotides 1 to 4 described in table 3 above, which are all included in the nucleic acid with sequence SEQ ID No. 2.
  • the invention also relates to a nucleic acid consisting of at least 12 consecutive nucleotides of an exonic polynucleotide of the gene
  • Such a nucleic acid codes for at least part of the DD1-b polypeptide and can in particular be inserted into a recombinant vector intended for the expression of the corresponding translation product in a host cell or in a plant transformed with this recombinant vector.
  • nucleic acid can also be used for the synthesis of probes and nucleotide primers intended for the detection or 18
  • nucleotide sequences included in the DD1-b gene in a sample if necessary of sequences of the DD1-b gene carrying one or more mutations, preferably one or more mutations such as to modify the genotype of a plant carrying a such a mutated DD1-b gene, for example by modifying the regulation of the transfer of metabolites from the mother plant to the developing albumen or else by modifying the regulation of the plant's response to biotic stress such as infection by a plant pathogen.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 12 consecutive nucleotides of an intronic polynucleotide of the DD1-b gene, such as the polynucleotides 1 to 3 described in Table 4 above, which are all included in the nucleic acid with sequence SEQ ID No. 2.
  • Such a nucleic acid can be used as a probe or oligonucleotide primer to detect the presence of at least one copy of the DD1-b gene in a sample, or also to amplify a target sequence determined within the DD1-b gene.
  • nucleotide sequence of the DD1-b gene essentially restricted to the “coding” region comprising the four exons and the three introns of the gene is referenced as the sequence SEQ ID No. 6 of the sequence listing.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 6, or with a fragment of this 19
  • nucleotide sequence as well as a nucleic acid of sequence complementary to the above-mentioned nucleic acid.
  • the invention also relates to a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 6, or with a fragment of this nucleotide sequence as well as a nucleic acid of sequence complementary to the abovementioned nucleic acid.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid characterized in that it comprises the nucleotide sequence SEQ ID No 6, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • Another subject of the invention consists of a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence SEQ ID No. 6, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the nucleotide sequence SEQ ID No. 6 comprises in particular the following sequences: a) the sequence of exon 1 of the DD1-b gene going from the nucleotide in position 1 to the nucleotide in position 197 of the sequence SEQ ID No. 6; b) the sequence of exon 2 going from the nucleotide in position 925 to the nucleotide in position 1104 of the sequence SEQ ID No. 6; c) the sequence of exon 3 going from the nucleotide in position 1303 to the nucleotide in position 1440 of the sequence SEQ ID No.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid, characterized in that it comprises one of the following nucleotide sequences: 20
  • nucleotide in position 1 a) the sequence from the nucleotide in position 1 to the nucleotide in position 197 of the sequence SEQ ID No. 6, or a nucleic acid of complementary sequence; b) the sequence going from the nucleotide in position 925 to the nucleotide in position 1104 of the sequence SEQ ID No. 6, or a nucleic acid of complementary sequence; c) the sequence going from the nucleotide at position 1303 to the nucleotide at position 1440 of the sequence SEQ ID No. 6, or a nucleic acid of complementary sequence; and d) the sequence going from the nucleotide at position 2300 to the nucleotide at position 2659 of the sequence SEQ ID No. 6, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • nucleotide sequences of introns 1, 2 and 3 of the DD1-b gene as well as their nucleic acids of complementary sequences also form part of the invention.
  • the DD1-b gene is transcribed in the form of a messenger RNA which has been isolated and characterized.
  • This messenger RNA comprises a unique open reading frame coding for the protein DD1-b with a length of 286 amino acids. On either side of the open reading frame, this messenger RNA respectively comprises a 5 'untranslated region (5'-UTR) and a 3' untranslated region (3'-UTR).
  • the cDNA corresponding to the transcript of the DD1-b gene can be defined as the sequence SEQ ID No. 8 of the sequence listing.
  • a cDNA derived from the messenger RNA of the DD1-b gene of nucleotide sequence SEQ ID No. 8 comprises respectively: a) a 5'-UTR sequence going from the nucleotide in position 1 to the nucleotide in position 14 of the sequence SEQ ID No. 8; b) an open reading phase going from the nucleotide in position
  • another object of the invention consists of a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 8, or with a fragment of this nucleotide sequence as well as a nucleic acid of sequence complementary to the abovementioned nucleic acid.
  • the invention also relates to a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 8 or a fragment of this nucleotide sequence as well as a nucleic acid of sequence complementary to the nucleic acid. supra.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence ranging from the nucleotide in position 15 to the nucleotide in position 875 of the sequence SEQ ID No. 8.
  • Another subject of the invention consists of a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with a nucleotide sequence ranging from the nucleotide in position 15 to the nucleotide in position 875 of the sequence SEQ ID No. 8.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid characterized in that it comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 8 or a nucleic acid of complementary sequence.
  • nucleic acid consisting of the nucleotide sequence SEQ ID No. 8, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • An object of the invention also constitutes a nucleic acid defined by the sequence going from the nucleotide in position 15 to the nucleotide in position 875 of the nucleotide sequence SEQ ID No. 8, or a nucleic acid of complementary sequence.
  • nucleic acids identity in nucleic acids and which have a length of 286 amino acids.
  • variant polypeptides do not induce the expression of a particular phenotype, for example a deficiency in the transfer of metabolites from the mother plant to the developing albumen in the plants under consideration. Consequently, it is permissible to consider that the rare amino acid substitutions which account for differences between the polypeptides coded by the DD1-b gene according to the plant considered do not affect the function or the biological activity of the polypeptide, the set of substitutions observed in the amino acid sequence of 286 amino acids in length thus being able to define a set of “variant” polypeptides which fall within the scope of the present invention.
  • polypeptide variants encoded by the DD1-b gene differ from each other exclusively by one or more amino acid substitutions.
  • the translation products of the DD1-b gene form a set of highly homologous polypeptides, this set of polypeptides being defined as the sequence SEQ ID No. 10 of the sequence listing.
  • the invention therefore also relates to a nucleic acid coding for a polypeptide having at least 80% amino acid identity with the sequence SEQ ID No. 10.
  • the invention also relates to a nucleic acid coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 10.
  • a first particular polypeptide variant encoded by the DD1-b gene is referenced as the sequence SEQ ID No. 11 of the sequence listing. This first polypeptide variant is encoded by the genome of the corn strain designated HD5 x HD7.
  • a second particular polypeptide variant encoded by the gene is referenced as the sequence SEQ ID No. 11 of the sequence listing. This first polypeptide variant is encoded by the genome of the corn strain designated HD5 x HD7.
  • DD1-b is referenced as the sequence SEQ ID No. 12 of the sequence listing.
  • This second polypeptide variant is encoded by the genome of the corn strain designated A188. 23
  • the subject of the invention is also a nucleic acid coding for a polypeptide having at least 80% identity in amino acids with the sequence SEQ ID No. 11.
  • the invention also relates to a nucleic acid coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 11.
  • Another object of the invention constitutes a nucleic acid coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 12.
  • the invention also relates to a nucleic acid coding for a peptide “fragment” of a polypeptide chosen from polypeptides of amino acid sequence SEQ ID Nos. 10 to 12.
  • the regulatory regions of the DD1-a and DD1-b genes have the capacity to direct the expression of these genes specifically in the cells of the developing grain transfer zone.
  • the control properties of a tissue-specific expression of a gene of interest which characterize the regulatory regions of the DD1-a and DD1-b genes can therefore be used to direct the expression of nucleic acids other than the nucleic acids containing the open reading phases of the DD1-a and DD1-b genes, respectively.
  • the regulatory sequences of the DD1-a and DD1-b genes can be used to construct expression cassettes containing a gene of interest placed under the control of the any of these regulatory sequences for the purpose of specifically expressing said gene of interest in cells of the developing grain transfer zone.
  • the regulatory sequence of the DD1-a gene which is included in the sequence SEQ ID No. 1, is referenced as the sequence SEQ ID No. 3 of the sequence listing. 24
  • the regulatory sequence of the DD1-b gene according to the invention which is included in the sequence SEQ ID No. 2, is referenced as the sequence SEQ ID No. 4 of the sequence listing.
  • FIG. 5 represents the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 according to the invention.
  • the different structural patterns characteristic of a regulatory sequence are indicated by boxes specifying the designation of each of the patterns identified by the applicant.
  • FIG. 6 represents the sequence SEQ ID No. 4 according to the invention.
  • the structural units characteristic of a regulatory sequence are represented by boxes containing the designations of each of the structural units identified by the applicant.
  • sequence SEQ ID No. 3 comprises a “TATA” box located from the nucleotide in position No. 3518 to the nucleotide in position 3524 of the sequence SEQ ID No. 3.
  • sequence SEQ ID No. 4 comprises a “TATA” box located from the nucleotide at position 2736 to the nucleotide at position 2742 of the sequence SEQ ID No. 4.
  • the applicant has also identified the presence of direct repeats in each of the regulatory sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4, in particular a repeated sequence designated “R6” of 33 base pairs present in number of seven copies in the SEQ ID No. 3 regulatory sequence of the DD1-a gene and seven copies in the SEQ ID No. 4 regulatory sequence of the DD1-b gene.
  • the regulatory sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4 of the DD1-a and DD1-b genes according to the invention comprise a few motifs consisting of reverse repeating sequences, respectively sequences of the “STEM-LOOP” type as well as sequences
  • the region around IR1 is not conserved between the promoters DD1-a and DD1-b.
  • the IR1-L sequence is itself a “stem-loop” structure composed of IR1A-L and IR1A-R.
  • IRI-R is a stem-loop between IR1B-L and IR1B-R.
  • the structure of type “STEM-LOOP” IR7 contains in the “loop” the repetition R6 described above. It contains in the “stem” the IR6 palindrome described below as well as the TATA box.
  • the BOXIINTPATPB motif is found in numerous plant promoters, including in the promoter of the tobacco atpB gene and various other plant plastid genes, this motif being described in particular in the article by KAPOOR et al. (1999).
  • the CCAATBOX1 motif constitutes a common sequence found in the non-coding regions located on the 5 ′ side of many eukaryotic genes.
  • the DOFCOREZM motif has a recognition site for corn Dof proteins.
  • Dof proteins are DNA-binding proteins that potentially have a unique zinc finger motif. 29
  • DOFCOREZM motif is described in particular by YANAGISAWA et al., (1999).
  • the DPBFCORECDC3 motif is a particular class of ZIP type transcription factor, found in particular in the promoter sequence of the Dc3 gene of carrots, the expression of which is specific for the embryo.
  • the DPBFCORECDC3 motif is described in particular by KIM et al. (1997).
  • the EBOXNNAPA motif is found in the regulatory sequence of a storage protein gene from Brassica napus and is described for example by STALBERG et al. (1996).
  • the IBOX motif is a conserved sequence found upstream of genes regulated by light. Such a motif has been found in particular in the promoter region of the rbcS gene in tomatoes and in
  • IBOX motif is described in particular by GIULIANO et al. (1998) and by DONALD et al. (1990).
  • the MYBCORE motif is a binding site for the proteins MYB, ATMYB1 and ATMYB2, all isolated from Arabidopsis.
  • the ATMYB2 protein is involved in the regulation of genes sensitive to water stress in Arabidopsis.
  • a MYB protein from petunia, the MYB.Ph3 protein is involved in the regulation of the biosynthesis of flavonoids as described by SOLANO et al., (1995).
  • MYBCORE motif is described in particular by LUSCHER et al; (1990), by URAO et al. (1993) and by SOLANO et al. (1995).
  • the POLLEN 1LELAT52 motif constitutes one of the two regulatory elements responsible for the specific activation of pollen in the tomato of the Iat52 gene. Such a structural motif is in particular described by BATE et al; (1998).
  • the ROOTMOTIFTAPOX1 motif is found both in the promoters of the rolD gene and of the POX1 peroxidase gene specific for wheat roots. Such a structural motif is described in particular by ELMAYAN et al. (1995). 30
  • the AT ⁇ TCT motif constitutes a part of a conserved DNA sequence of the gabB gene involved in the response to light.
  • Such a structural motif is for example described by KWON et al. (1994).
  • the GM ⁇ CAAT-box motif is a cis-acting element which is commonly found in promoter and activator regions ("enhancer").
  • the structural motif OS ⁇ TATC-box is a cis-acting element involved in the response to gibberellin, which is described in particular by TAKAIWA et al. (1991). 31
  • the PC ⁇ chs-CMA2a motif is the part of a conserved DNA module chs involved in the response to light, which is notably described by HERMANN et al. (1988).
  • the ZM ⁇ TATA-box motif is the promoter element proper located generally at a distance of about 30 bases from the site of initiation of transcription. Such a structural motif is described in particular by SHEEN et al. (1991).
  • the subject of the invention is also a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 3, or with a fragment of this nucleotide sequence as well as a nucleic acid of sequence complementary to the abovementioned nucleic acid.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 3, or with a fragment of this nucleotide sequence, or a nucleic acid of sequence complementary to the acid. aforementioned nucleic acid.
  • the invention also relates to a nucleic acid characterized in that it comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 3.
  • the invention also relates to a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence SEQ ID No. 3.
  • Another subject of the invention consists of a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 4, or with a fragment of this nucleotide sequence as well as a nucleic acid of sequence complementary to the above nucleic acid.
  • Another object of the invention constitutes a nucleic acid having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 4, or with a fragment of this nucleotide sequence as well as a nucleic acid of sequence complementary to l abovementioned nucleic acid.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising the nucleotide sequence SEQ ID No. 4, as well as a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence SEQ ID No. 4.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide regulating the expression of a nucleotide sequence of interest in a plant, said regulatory polynucleotide comprising a polynucleotide having at least 80% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID N ° 3 or SEQ ID N ° 4, or with a fragment of this nucleotide sequence.
  • fragment of a nucleic acid of one of the regulatory sequences of the DD1-a or DD1-b gene according to the invention is meant a nucleotide sequence with a base length less than that of the sequence SEQ ID N ° 3 or SEQ ID N ° 4 and retaining the ability to direct the expression of a nucleotide sequence of interest in a plant.
  • a fragment of a regulatory nucleic acid according to the invention consists of a nucleotide sequence with a base length less than that of the sequence SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 4 and retaining the ability to direct expression of a nucleotide sequence of interest in cells in the developing grain transfer zone.
  • a fragment of a regulatory nucleic acid according to the invention can be obtained by enzymatic cleavage of one of the nucleic acids described above, preferably a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 3 or SEQ ID N ° 4, using an exonuclease or a restriction endonuclease.
  • a fragment of a regulatory nucleic acid according to the invention can be obtained for example by deletion of one or more nucleotides of the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 3 OR SEQ ID No. 4 using the technique of exonuclease III, as described for example by AUSUBEL et al. (1989).
  • a fragment of a regulatory nucleic acid according to the invention advantageously has a length of at least 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000, 1200, 1500, 2000 or 2500 nucleotides, or even base pairs (bp ), if it is in double strand form.
  • restriction enzymes for the purpose of obtaining fragments of a regulatory nucleic acid according to the invention, those skilled in the art can advantageously refer to the work by SAMBROOK et al. (1989).
  • a fragment of a regulatory nucleic acid according to the invention can also be prepared by specific amplification of the fragment of interest using a pair of primers framing, respectively on the 5 ′ side and on the 3 ′ side, the sequence of interest, for example using the PCR method, as described in particular in American patents No. US 4,683,195, US 4,683,202 and US 4,965,188.
  • a person skilled in the art can obtain a fragment of the regulatory nucleic acid of the DD1-a gene of sequence SEQ ID No. 3 by amplification of the sequence SEQ ID No. 3 using the pair of primers of respective sequences SEQ ID No 13 and SEQ ID No 17, or also with the pair of primers of respective sequences SEQ ID No 14 and SEQ ID No 17.
  • Fragments of a nucleic acid regulating sequence SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 4 according to the invention preferably comprise at least one of the “TATA” boxes referenced for each of these sequences in Table 9 below. above, and even more preferably the three “TATA” boxes referenced in this table.
  • nucleic acid regulating the DD1-a or DD1-b gene according to the invention comprising the sequence SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 4, or also a fragment of one of these sequences, is to include this regulatory nucleic acid in a DNA construct, or expression cassette, also comprising a polynucleotide of interest whose specific expression is sought in the cells of the grain transfer zone.
  • the invention therefore also relates to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence of interest placed under the control of a regulatory polynucleotide as defined above.
  • a nucleic acid can be called an “expression cassette”.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising a regulatory polynucleotide as defined above, characterized in that it further comprises a nucleotide sequence of interest functionally associated with the regulatory polynucleotide.
  • nucleotide sequence of interest can be any sequence coding for a protein whose expression is sought in a plant or alternatively any sequence coding for a sense nucleic acid or an antisense nucleic acid.
  • the nucleotide sequence of interest codes for a protein involved in the transfer of metabolites to the developing endosperm of a plant grain.
  • the invention therefore also relates to the use of a nucleic acid regulating the DD1-a gene or the DD1-b gene as defined above in nucleotide constructs intended to improve the 35
  • agronomic, food or industrial quality of a plant in particular by controlling the size and / or development of the endosperm of the grain.
  • a stimulator gene e.g. hormone such as cytokinin or auxin.
  • a hormone under the control of a nucleic acid regulating the DD1-a or DD1-b gene in a plant can make it possible to modify the processes of cellularization and, correlatively, the development of albumen (SCOTT et al., 1998).
  • nucleotide sequences of interest derived from genes coding for nutrient transporters (in particular sugars) at the plant / albumen interface, or else derived from genes coding for inhibitors of these transportations, for the purpose of differential accumulation of nutrients in the endosperm.
  • nucleotide sequences of interest coding for proteins of therapeutic interest such as hemoglobin or Factor VIII.
  • nucleotide sequences of interest which can be placed under the control of a nucleic acid regulating the DD1-a or DD1-b genes according to the invention are presented below.
  • Nucleotide sequences of interest placed under the control of a regulatory nucleic acid according to the invention a) Sugar metabolism
  • the nucleotide sequence of interest can code for any of the enzymes involved in the storage of sugars in albumen, such as invertase, sucrose phosphate synthase, sucrose synthase, PUDP-glucose pyrophosphorylase, ADP-glucose pyrophosphorylase, "starch branching enzyme” or "starch synthase”.
  • the nucleotide sequence of interest can also code for a sucrose transporter or a hexose transporter in the BETL transfer zone in order to improve either the transfer of assimilates or to increase the hexose content in the endosperm or else in the transfer area itself. In the latter case, there may be an increase in mitotic activity via stimulation of the cell cycle, in particular because the promoters DD1-a and DD1-b are very early. Sequences coding for sugar transporters are for example those coding for the symplastic transporter H + of sucrose (AOKI et al., 1999) or for various transporters of monosaccharides described in the East ZmDB database (GAI et al., 2000 ).
  • the nucleotide sequence of interest can also code for a hexokinase as described by JANG et al., (1997) in order to improve the filling of the grain.
  • invertase (EC 3.2.1.26) would allow a more efficient cleavage of sucrose into glucose and fructose and would be likely to increase the speed of transport and also favor the obtaining of larger grains, since it is observed that mutant plants for this enzyme have very small grains.
  • invertase EC 3.2.1.26
  • sequence coding for a parietal invertase or for a soluble invertase can for example use the sequences derived from the genes Inc W1 (access number AF050129 from the GenBank database), Inc W2 (access number AF050128), Inc W3 (access number AF043346 and AF 043728 ), Inc W4 (access number AF 043347), Ivr1 (access number U16123 and AF171874) or the one referenced under access number Y16262.
  • sucrose synthase (EC 2.4.1.13) would induce an increase in the consumption of sucrose in the endosperm and should therefore decrease its transport to the embryo and reduce the size of the latter and increase the size of endosperm.
  • Sh1 access number X02382 and X02400 from the GenBank database
  • Sus1 access number L33244 and L22296.
  • An increase in localized cell division in the transfer zone can be induced by the use, as nucleotide sequence of interest, of certain cyclins, in particular cyclin D2 described by (COCKROFT et al., 2000), or again cyclin D3, in order to obtain better filling of the grain.
  • nucleotide sequences of interest coding for transporters of certain ions or else coding for ferritin.
  • the nucleotide sequence of interest can also code for a protein involved in resistance to diseases, such as chitinases (PCT request No. WO 92/01792), glucanases (PCT request No. WO 93/02197), oxalate oxidase (PCT application No.
  • WO 94/13790 or also anti-bacterial and / or anti-fungal peptides, in particular peptides of less than 100 amino acids rich in cysteine such as thionines or plant defensins, and more particularly peptides lytics of all origins comprising one or more disulfide bridges between the cysteines and regions comprising basic amino acids, in particular the following lytic peptides: androctonine (PCT application No. WO 97/30082 and PCT application / FR 98/01814 filed on August 18, 1998) or drosomicin (application No. PCT / FR 98/01462 filed July 8, 1998).
  • the nucleotide sequence of interest can also code for a protein or a peptide chosen from fungal eliciting peptides, in particular elicithins (KAMOUN et al., 1993; PANABIERES et al., 1995).
  • a defense protein of interest can also be an antimicrobial peptide of the thionine, defencin, knottine type, or a lipid transfer protein (BROEKAERT et al., 1997). It could be 39
  • the nucleotide sequence of interest can also code for a signaled molecule such as the IPT gene for isopentenyl transferase (HEIDEKAMP et al., 1983).
  • Sequences of the rolC and iaa genes can also be used for overexpression of auxin which also stimulates cell division.
  • sequences coding for ligand molecules such as the CLAVATA 3 protein.
  • mutated or truncated sequences of polycomb type genes such as the MEDEA, FIS and FIE sequences (MA, 1999) which participate in controlling the development of the endosperm before fertilization and which intervene in the configuration of the chromatin and can thus have a relationship with the level of methylation of the latter.
  • Overexpression of mutated polycomb type genes or inhibition of the expression of such genes by antisense oligonucleotides can lead to 40
  • nucleotide sequences of interest coding for cytotoxic proteins such as barnase or diphtheria toxin in order to specifically destroy a tissue, in this case the transfer zone, and to use the facts on the development of the grain , in particular on the development of the embryo in the absence of the transfer zone.
  • nucleic acids according to the invention and in particular the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8, their fragments of at least 12 nucleotides, the sequences having at least 80% nucleotide identity with at least part of the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8, as well as the nucleic acids of complementary sequence, are useful for detecting the presence of at least one copy of a nucleotide sequence of the DD1-a gene or DD1-b gene or a fragment or an allelic variant of the latter in a sample.
  • nucleotide probes and primers hybridizing, under high stringency hybridization conditions, with a nucleic acid chosen from the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8.
  • high stringency hybridization conditions within the meaning of the invention, is meant the following hybridization conditions:
  • Pre-hybridization same conditions as for hybridization duration: 1 night. 41
  • the parameters defining the stringency conditions depend on the temperature at which 50% of the paired strands separate (Tm).
  • Tm is defined by the relation:
  • Tm 81.5 + 0.41 (% G + C) +16.6 Log (cation concentration) - 0.63 (% formamide) - (600 / number of bases) (SAMBROOK et al., (1989) , pages 9.54-9.62).
  • Tm 4 (G + C) + 2 (A + T).
  • the hybridization temperature is approximately 5 to 30 ° C, preferably 5 to 10 ° C below Tm.
  • hybridization conditions described above can be adapted according to the length of the nucleic acid whose hybridization is sought or the type of labeling chosen, according to techniques known to those skilled in the art. 42
  • the suitable hybridization conditions can for example be adapted according to the teaching contained in the work of HAMES and HIGGINS (1985) or also in the work of AUSUBEL et al. (1989).
  • the nucleotide probes or primers according to the invention comprise at least 12 consecutive nucleotides of a nucleic acid according to the invention, in particular of a nucleic acid of sequences SEQ ID N ° 1 to 8 or of its complementary sequence, a nucleic acid having 80% nucleotide identity with a sequence chosen from the sequences SEQ ID N ° 1 to 8 or of its complementary sequence or of a nucleic acid hybridizing under conditions of high stringency hybridization with a sequence chosen from the sequences SEQ ID N ° 1 to 8 or from its complementary sequence.
  • nucleotide probes or primers according to the invention will have a length of at least 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 , 1000, 2000 or 3000 consecutive nucleotides of a nucleic acid according to the invention.
  • a probe or a nucleotide primer according to the invention will consist and / or include fragments with a length of 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 or 3000 consecutive nucleotides of a nucleic acid according to the invention.
  • primers and pairs of primers for amplifying a nucleic acid fragment of the DD1-a or DD1-b gene of respective sequence SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 are for example the primers SEQ ID N ° 13 to 17 and 20 to 25.
  • the pair of primers SEQ ID No. 13 and SEQ ID No. 17 makes it possible to amplify a fragment of approximately 3 kb contained in the regulatory sequence of the DD1-a gene of sequence SEQ ID No. 3. 43
  • the pair of primers SEQ ID No. 14 and SEQ ID No. 17 makes it possible to amplify a nucleic acid of approximately 1 kb contained in the regulatory sequence of the DD1-a gene of sequence SEQ ID No. 3.
  • the pair of primers SEQ ID No. 15 and SEQ ID No. 17 allows the amplification of a nucleic acid of approximately 2.5 kb contained in the regulatory sequence of the DD1-b gene of sequence SEQ ID No. 4.
  • the pair of primers with sequences SEQ ID No. 16 and SEQ ID No. 17 allows the amplification of a nucleic acid of approximately 1.6 kb contained in the regulatory sequence of the DD1-b gene of sequence SEQ ID No. 4.
  • the use of the primers of sequences SEQ ID Nos. 20 to 25 in amplification reactions is described in Example 1.
  • a primer or a nucleotide probe according to the invention can be prepared by any suitable method well known to those skilled in the art, including by cloning and action of restriction enzymes or also by direct chemical synthesis according to techniques such as the method to the phosphodiester of NARANG et al. (1979) or BROWN et al. (1979), the diethylphosphoramidite method of BEAUCAGE et al. (1980) or the solid support technique described in European patent n ° EP 0 707 592.
  • Each of the nucleic acids according to the invention can be labeled, if desired, by incorporating a detectable molecule, that is to say a detectable marker, by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or even chemical means.
  • detectable molecules that is to say a detectable marker
  • markers can consist of radioactive isotopes ( 32 P 3 H, 35 S), fluorescent molecules (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene, digoxigenin) or also ligands such as biotin.
  • the labeling of the probes is preferably done by incorporating labeled molecules within the polynucleotides by extension of primers, or else by adding to the 5 ′ or 3 ′ ends.
  • the probes according to the invention can have structural characteristics such as to allow amplification of the signal, such as the probes described by URDEA et al; (1991) or in European patent No. EP 0 225 807 (Chiron).
  • the oligonucleotide probes according to the invention can be used in particular in Southern type hybridizations to the genomic DNA of the DD1-a gene or of the DD1-b gene or also in hybridizations to the messenger RNA of any of the two genes when the expression of the corresponding transcript is sought in a sample.
  • the probes according to the invention can also be used for the detection of PCR amplification products or even for the detection of mismatches.
  • a particular probe according to the invention is for example the sequence probe SEQ ID No. 26 or even the sequence probe SEQ ID No. 29.
  • Nucleotide probes or primers according to the invention can be immobilized on a solid support.
  • Such solid supports are well known to those skilled in the art and comprise surfaces of the wells of microtitration plates, polystyrene beads, magnetic beads, nitrocellulose strips or even microparticles such as latex particles.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid which can be used as a nucleotide probe or primer, characterized in that it comprises at least 12 consecutive nucleotides of a nucleic acid as defined above, in particular of a nucleic acid of nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8. 45
  • the invention also relates to a nucleic acid which can be used as a nucleotide probe or primer, characterized in that it consists of a polynucleotide of at least 12 consecutive nucleotides of a nucleic acid according to the invention, quite preferred of a nucleic acid of sequences chosen from the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8.
  • nucleic acid which can be used as a probe or primer is for example the nucleic acid comprising and / or consisting of a nucleic acid chosen from the sequences SEQ ID No. 13 to SEQ ID No. 17.
  • such a nucleic acid can further be characterized in that it is labeled with a detectable molecule.
  • a nucleic acid which can be used as a nucleotide probe or primer for the detection or amplification of a genomic sequence, of the mRNA or of the cDNA of the DD1-a gene can also be characterized in that it is chosen among the following sequences: a) the nucleotide sequences hybridizing, under high stringency hybridization conditions, with a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1; and b) sequences comprising at least 12 consecutive nucleotides of a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1.
  • a nucleic acid which can be used as a nucleotide probe or primer for the detection or the amplification of a genomic sequence, of the mRNA or of the cDNA of the DD1-b gene can be characterized in that it is chosen from the following sequences: a) the nucleotide sequences hybridizing, under hybridization conditions of high stringency, with a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 2; and b) sequences comprising at least 12 consecutive nucleotides of a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 2.
  • the present invention also relates to a method for detecting the presence of a nucleic acid of the DD1-a or DD1-b gene in a sample, said method comprising the steps of:
  • the oligonucleotide probe (s) are immobilized on a support.
  • the oligonucleotide probes include a detectable marker.
  • the invention further relates to a kit or kit for detecting the presence of a nucleic acid according to the invention in a sample, said kit comprising: a) one or more nucleotide probes as described above; b) where appropriate, the reagents necessary for the hybridization reaction.
  • the detection kit or kit is characterized in that the probe or probes are immobilized on a support.
  • the detection kit or kit is characterized in that the oligonucleotide probes comprise a detectable marker.
  • such a kit will comprise a plurality of oligonucleotide probes in accordance with the invention which will be used to detect target sequences of interest of the DD1-a gene or of the DD1 gene - b or alternatively detect mutations in the coding regions or the non-coding regions of the DD1-a or DD1-b gene, more 47
  • nucleic acids of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ
  • Target sequence is understood to mean, within the meaning of the invention, a nucleotic sequence included in a nucleic acid, said nucleotide sequence hybridizing, under the hybridization conditions specified in the description, with a probe or a nucleotic primer of the invention .
  • a target sequence can for example be a sequence included in a nucleic acid regulating the DD1-a or DD1-b gene or else a sequence included in a genomic coding region or the cDNA of one or other of these genes or a sequence common to the DD1-a or DD1-b genes.
  • nucleotide primers according to the invention can be used to amplify any nucleotide fragment (gDNA, cDNA, mRNA) of the DD1-a gene or of the DD1-b gene, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 1
  • Another subject of the invention relates to a method for the amplification of a nucleic acid according to the invention, and more particularly of a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ
  • said method comprising the steps of: a) contacting the sample in which the presence of the target nucleic acid is suspected with a pair nucleotide primers whose hybridization position is localized respectively on the 5 'side and the 3' side of the target nucleic acid region of the gene
  • the subject of the invention is also a kit or kit for the amplification of a nucleic acid according to the invention, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequences SEQ ID No. 1 to 8, said kit or kit comprising: a) a pair of nucleotide primers in accordance with the invention, the hybridization position of which is located respectively on the 5 ′ side and on the 3 ′ side of the target nucleic acid of the DD1-a gene or of the DD1 gene -b whose amplification is sought; b) where appropriate, the reagents necessary for the amplification reaction.
  • Such an amplification kit or kit will advantageously comprise at least one pair of nucleotide primers as described above.
  • primers according to the invention comprise all or part of a polynucleotide chosen from the nucleotide sequences SEQ ID No. 13 to SEQ ID No. 17.
  • the invention relates to recombinant cloning and / or expression vectors comprising any of the nucleic acids defined above.
  • Another subject of the invention consists of recombinant vectors into which a regulatory sequence of the 49
  • a recombinant vector according to the invention may comprise a nucleic acid regulating sequence SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 4 or also a fragment of the sequence SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 4 capable of directing the expression of a gene of interest placed under its control in the cells of a plant, and most preferably in the cells of the transfer zone of a developing grain.
  • recombinant vectors for the expression of a polynucleotide of interest in the transfer zone of a developing plant grain comprising: a) a nucleic acid regulating the DD1-a gene or the gene DD1-b as defined in the present description; and b) a polynucleotide of interest placed under the control of the regulatory nucleic acid defined in a).
  • the polynucleotide of interest placed under the control of the regulatory acid of the DD1-a or DD1-b gene is a nucleic acid coding for a protein involved in the transfer of metabolites to the developing albumen of a grain of plant.
  • the polynucleotide of interest may consist of a polynucleotide coding for a detectable polypeptide, or marker polypeptide such as for example a polynucleotide coding for the GUS protein or also for a fluorescent protein, such as the GFP protein (Green Fluorescent
  • YFP Yellow Fluorescent Protein
  • a vector which can be used for the introduction of a regulatory nucleic acid according to the invention capable of controlling a polynucleotide of interest is the plasmid L127a5 represented in FIG. 7; 50
  • Recombinant vectors into which have been introduced a nucleic acid regulating the DD1-a gene or the DD1-b gene according to the invention located upstream of a polynucleotide of interest are for example the recombinant vector L246a represented in FIG. 8, the vector L246b represented in FIG. 9, the vector L247a represented in FIG. 10 and the vector L247b represented in FIG. 11.
  • the vector L246a comprises a nucleic acid of approximately 3 kb of the regulatory sequence of the DD1-a gene located upstream of the reporter gene GUS.
  • the vector L246a is contained in the strain of Escherichia coli deposited at the CNCM on October 4, 2000 under the access number 1-2567.
  • the recombinant vector L246b comprises a nucleic acid regulating approximately 1 kb of the DD1-a gene, more precisely a nucleic acid ranging from the nucleotide at position 2585 to the nucleotide at position 3595 of the nucleotide sequence SEQ ID No. 3.
  • the vector L 247a contains a regulatory nucleic acid of approximately 2.5 kb from the DD1-b gene.
  • the vector L247a is contained in the strain of Escherichia coli deposited at the CNCM on October 4, 2000 under the access number I-2568.
  • the vector L247b comprises a regulatory nucleic acid of approximately 1.6 kb of the sequence of the DD1-b gene, more precisely a regulatory nucleic acid going from the nucleotide in position 1204 to the nucleotide in position 2813 of the nucleotide sequence SEQ ID N ° 4 .
  • the subject of the invention is also a recombinant vector characterized in that it is chosen from the vectors L246a, L246b, L247a and L247b.
  • the regulatory nucleic acid of the DD1-a gene and of the DD1-b gene is located upstream of the GUS marker gene, the expression of which it controls.
  • Another subject of the invention consists of a recombinant cloning and / or expression vector containing a coding sequence of the DD1-a gene or of the DD1-b gene, placed under the control of an appropriate regulatory sequence functional in the host organism in which the expression of a polypeptide according to the invention is sought.
  • a polypeptide encoded by the DD1-a gene or the DD1-b gene is expressed specifically in the cells of the developing grain transfer zone and is thus likely to be involved in the transfer of metabolites from the mother plant to the endosperm, or to be involved in the defense of the plant against various plant pathogens, to constitute a signal for the development of the endosperm and / or the embryo as it is the case of the genes coding for the proteins BETL1 to BETL4 described by HUEROS et al. (1999b).
  • the subject of the invention is also a recombinant expression vector comprising: a) a nucleic acid regulating the expression of a polynucleotide of interest in a determined host organism; and b) a polynucleotide of interest coding for a polypeptide according to the invention, preferably a nucleic acid of sequences SEQ ID No. 1, 2, 5, 6 ) 7 or 8.
  • a nucleic acid coding for a coded polypeptide by the DD1-a gene or by the DD1-b gene.
  • the regulatory sequence capable of controlling the nucleic acid coding for a polypeptide according to the invention can be a regulatory sequence inducible by a particular metabolite, such as: 52
  • the regulatory sequence capable of controlling the nucleic acid coding for a polypeptide according to the invention can comprise a constitutive promoter, such as:
  • the regulatory sequence capable of controlling the nucleic acid coding for a polypeptide according to the invention can also direct expression of the nucleic acid of interest specifically in certain tissues, such as the seed, the leaf or the root. These may in particular be the following regulatory sequences:
  • a specific tissue promoter such as the HMWG wheat or barley promoter, or the pCRU promoter of the radish cruciferin gene, which all allow expression of the protein of interest in the seeds (ROBERTS et al. ( 1989); ANDERSON OD et al. (1989); DEPIGNY-THIS et al. (1992); 53
  • the promoters PGEA1 and PGEA6 corresponding to the 5 'non-coding region of the genes of the seed resent protein, GEA1 and GEA6 respectively Arab' Arabidopsis thaliana (GAUBIER et al., (1993) and allowing specific expression in the seeds; - the promoter of the corn zein gene (Pzein) contained in the plasmid p63, and allowing the expression in the albumen of corn seeds (REINA et al., 1990);
  • vector within the meaning of the present invention, is meant a circular or linear DNA or RNA molecule which is either in single strand or double strand form.
  • a recombinant vector according to the invention is either a cloning vector, an expression vector, or more specifically an insertion vector, a transformation vector or an integration vector.
  • a recombinant vector according to the invention is used in order to amplify the nucleic acid which is inserted therein after transformation or transfection of the desired cellular host. 54
  • it is an expression vector comprising: a) either a nucleic acid regulating the DD1-a gene or the DD1-b gene as defined above placed close to a polynucleotide d interest placed under the control of this regulatory nucleic acid; b) or a nucleic acid coding for a polypeptide according to the invention coded by the DD1-a gene or the DD1-b gene, or alternatively for a fragment of such a polypeptide, said polynucleotide being placed under the control of a sequence functional regulator in the host organism in which the expression of the nucleic acid coding for a peptide according to the invention is sought.
  • a recombinant vector according to the invention advantageously also comprises sequences for initiating and stopping the appropriate transcription.
  • the recombinant vectors according to the invention may include one or more origins of functional replication in cellular hosts in which their amplification or expression is sought, as well as nucleotide selection marker sequences.
  • a recombinant vector according to the invention is an integrative vector allowing the insertion of multiple copies of the DNA sequence inserted in this vector into the genome of a plant, the transformation of which by a nucleic acid according to l invention is sought.
  • Promoters for the expression of a nucleic acid encoding a polypeptide according to the invention in plants are for example 55
  • chimeric promoters comprising activating sequences (“enhancer”), such as the 35S promoter described by HIGGINS et al. (1991).
  • promoters useful for the expression of a polynucleotide of interest in plants are described in particular in patents No. US 5,750,866 and US 5,633,363, all of the above documents and articles constituting references on which the man of the profession can be based to build recombinant vectors according to the invention.
  • a person skilled in the art can advantageously refer to the work by SAMBROOK et al. (1989) or to the techniques described by FULLER et al. (1996).
  • the expression cassette can also contain 5 ′ untranslated sequences called “leaders”. Such sequences can increase translation. Among those known to those skilled in the art, there may be mentioned:
  • the vectors according to the invention can also comprise so-called “terminator” sequences.
  • terminators which can be used in the constructions of the invention, there may be mentioned in particular:
  • the expression vector may also include sequences of the vacuolar or apoplastic signal peptide type when they are not already present in the sequence of the gene of interest, in order to bring the protein coded by the heterologous gene into particular compartments of the cells of plant, especially those comprising the endosperm transfer area.
  • the preferred bacterial vectors according to the invention are for example the vectors pBR322 (ATCC No. 37 017) or also the vectors such as pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) and pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, United States ).
  • vectors of the Baculovirus type such as the vector pVL1392 / 1393 (Pharmingen) used to transfect the cells of the line Sf9 (ATCC No. CRL 1711) derived from Spodoptera frugiperda. 57
  • vectors specially adapted for the expression of sequence of interest in plant cells such as the following vectors:
  • the nucleic acids or the recombinant vectors defined in the present description must be introduced into a host cell.
  • the introduction of the polynucleotides according to the invention into a host cell can be carried out in vitro, according to techniques well known to those skilled in the art to transform or transfect cells, either in primary culture or in the form of cell line.
  • the invention further relates to a host cell transformed with a nucleic acid according to the invention or with a recombinant vector as defined above. 58
  • Such a transformed host cell is preferably of bacterial, fungal or vegetable origin.
  • bacteria cells of different strains of Escherichia coli or even ⁇ 'Agrobacterium tumefaciens can be used in particular.
  • the transformed host cell is a plant cell or also a plant protoplast.
  • the cell or protoplast is preferably native to corn, wheat, barley, sorghum or millet.
  • a preferred transformed host cell according to the invention is the strain of Escherichia coli DH5 ⁇ containing the plasmid L246a deposited at the CNCM on October 4, 2000 under the access number I-2567.
  • a second host cell transformed according to the invention is the strain of Escherichia coli DH5 ⁇ containing the plasmid L247a deposited at the CNCM on October 4, 2000 under the access number I-2568.
  • Other preferred transformed host cells according to the invention are respectively host cells transformed with the plasmid L246b or the plasmid L247b represented respectively in FIGS. 9 and 11.
  • the invention also relates to a transformed multicellular plant organism, characterized in that it comprises a host cell 59
  • the invention also relates to a transgenic plant comprising, in a form integrated into its genome, a nucleic acid as defined in the present description.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid as defined in the present description for obtaining transformed (transgenic) plants with improved agronomic, food or industrial quality, for example by controlling the size and / or development of the endosperm of the grain.
  • One of the objectives pursued according to the present invention is the obtaining of transgenic plants whose mature grain has improved characteristics, in particular from the point of view of the quality or quantity of the nutrients contained in its albumen.
  • the invention therefore also relates to methods for modifying the agronomic and / or nutritional qualities of a plant, by a targeted and early action on the development of the endosperm, using the transformation of plants with a vector according to the invention.
  • she is interested in modifying the size and / or development of the endosperm.
  • a more specific subject of the invention is the use of an expression cassette as defined above, for obtaining a transgenic Angiosperm plant having improved agronomic or nutritional qualities.
  • the invention also relates to the use of the transgenic plants obtained according to the invention, or parts of these plants, in particular seeds, grains and fruits for the preparation of derived products, in particular food products.
  • the invention makes it possible to achieve this objective by obtaining transgenic plants whose characteristic transgene consists of a polynucleotide of interest placed under the control of a nucleic acid regulating the DD1-a gene or the DD1 gene. -b according to the invention, as described in detail in the corresponding part of this description.
  • Such a regulatory nucleic acid preferably comprises a nucleic acid of sequence SEQ ID No 3 or SEQ ID No 4, or a functional fragment of a nucleic acid of sequence SEQ ID No 3 or SEQ ID No 4, capable of directing the expression of the polynucleotide of interest in the plant, more particularly of directing the expression of the polynucleotide of interest in the cells of the transfer zone of the developing grain.
  • the polynucleotide of interest placed under the control of a nucleic acid regulating the DD1-a gene or the DD1-b gene, and constituting the transgene of a plant transformed according to the invention codes for a protein involved in the transfer of metabolites to the developing albumen of a plant grain.
  • polynucleotides of interest are those described previously in the description.
  • plants capable of being transformed according to the invention mention may be made, by way of examples, of cells of field crops (corn, wheat, rapeseed, sunflower, peas, soybeans, barley) or vegetable plants and flowers.
  • plants known to contain large reserves protein, carbohydrate and lipid
  • cereal plants or oil plants in particular cereal plants or oil plants.
  • the hybrid plants obtained by crossing plants according to the invention also form part of the invention.
  • a plant transformed according to the invention is a cereal and very preferably a corn, a wheat, a barley, a sorghum or a millet.
  • the subject of the invention is also a seed or a seed of a plant of which one or more constituent cells comprise in their genome one or more copies of a nucleic acid as defined above.
  • the invention also relates to a seed of a transgenic plant as defined above, or else a fruit of such a transgenic plant.
  • the seeds or mature grains of a transgenic plant as defined above have qualitative or quantitative characteristics of improved nutrients, which can be characterized for example by a higher content of various sugars and starches.
  • the subject of the invention is also a plant multi-cellular organism transformed with a nucleic acid coding for a polypeptide coded by the DD1-a gene or by the DD1-b gene.
  • the nucleic acid coding for a polypeptide according to the invention is placed under the control of functional regulatory elements in the plant in which its expression is sought.
  • the invention also relates to a plant transformed with a nucleic acid coding for a polypeptide according to the invention or also by a recombinant vector containing, inserted therein, a nucleotide sequence coding for a polypeptide according to the invention.
  • the nucleic acid coding for a polypeptide according to the invention is chosen from the nucleic acid of sequences SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 7 and 8.
  • the multicellular plant organism or the plant transformed with a nucleic acid coding for a polypeptide according to the invention is a cereal, and very preferably a corn, a wheat, a barley, a sorghum or a millet .
  • a polypeptide according to the invention has, as will be described below in the description, hydrophilicity properties characteristic of polypeptides of type " defensihe ”, which could make it possible to attribute to the polypeptides coded by the genes DD1-a and DD1-b according to the invention an active role in the defense of the plant with respect to various plant pathogens.
  • a plant transformed with a nucleic acid coding for a polypeptide according to the invention could have improved resistance characteristics to various plant pathogens.
  • the invention also relates to a process for obtaining a transgenic plant as defined in this section, characterized in that it comprises the following steps: a) obtaining a plant recombinant host cell according to the invention ; b) regeneration of an entire plant from the recombinant host cell obtained in step a); c) selection of the plants obtained in step b) having integrated a nucleic acid as defined in the present description.
  • the plant recombinant host cell is: - either a recombinant host cell transformed with a nucleic acid comprising a polynucleotide of interest placed under the control of a regulatory nucleic acid as defined in the description; 63
  • a recombinant host cell transformed with a nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide according to the invention, placed under the control of a functional regulatory sequence in plants.
  • the subject of the invention is also a method for obtaining a transgenic plant, transformed with a nucleic acid according to the invention, characterized in that it comprises the following steps: a) obtaining a recombinant host cell with Agrobacterium tumefaciens transformed with a nucleic acid according to the invention; b) transformation of a plant of interest by infection with the recombinant host cell obtained in step a); c) selection of plants which have integrated into their genome a nucleic acid according to the invention.
  • the invention also relates to a process for obtaining a transgenic plant characterized in that it comprises the following steps: a) transfecting a plant cell with a nucleic acid according to the invention or with a recombinant vector such as defined in this description; b) regenerating an entire plant from the cells of recombinant plants obtained in step a); c) selecting plants which have integrated a nucleic acid according to the invention into their genome.
  • Any of the processes for obtaining a transformed plant described above can also comprise the following additional steps: d) crossing between them of two transgenic plants as obtained in step c); e) selection of plants homozygous for the transgene.
  • any of the methods for obtaining a transgenic plant described above can also comprise the following additional steps: f) crossing of a transgenic plant obtained in step c) with a plant of the same species; g) selection of the plants resulting from the crossing of step f) having conserved the transgene.
  • Another object of the invention consists of a transgenic plant, as obtained according to any one of the methods for obtaining a transformed plant defined above.
  • the invention also relates to a process for obtaining an Angiosperm plant having improved agronomic or nutritional qualities, comprising the steps consisting in: transforming at least one Angiosperm plant cell with a vector as defined above; cultivating the cell thus transformed so as to generate a plant containing in its genome an expression cassette according to the invention.
  • the transformation of plant cells can be carried out by techniques known to those skilled in the art.
  • direct gene transfer methods such as direct microinjection into plant embryoids (NEUHAUS et al., 1987), vacuum infiltration (BECHTOLD et al., 1993) or electroporation (CHUPEAU and al., 1989) or direct precipitation by means of PEG (SCHOCHER et al., 1986) or the bombardment by cannon of particles covered with the plasmid DNA of interest (FROMM M. et al. 1990).
  • the plant can also be infected with a bacterial strain, notably Agrobacterium.
  • a bacterial strain notably Agrobacterium.
  • the plant cells are transfrormed by a vector according to the invention, said cellular host being susceptible 65
  • the above-mentioned cell host used is Agrobacterium tumefaciens, in particular according to the method described in the article by AN et al., (1986), or else Agrobacterium rhizogenes, in particular according to the method described in the article by GUERCHE et al ., (1987) or in PCT application No. WO 00 22.148.
  • the transformation of plant cells can be carried out by the transfer of the T region of the extrachromosomal circular plasmid inducing Ti tumors of Agrobacterium tumefaciens, using a binary system (WATSON et al. 1994). To do this, two vectors are constructed. In one of these vectors, the T region was deleted, with the exception of the right and left borders, a marker gene being inserted between them to allow selection in plant cells.
  • the other partner of the binary system is a helper Ti plasmid, a modified plasmid which no longer has a T region but still contains the vir virulence genes, necessary for the transformation of the plant cell.
  • the transformation is carried out according to the method described by FINER et al. (1992) using the tungsten or gold particle gun.
  • a person skilled in the art is capable of implementing numerous prior art methods in order to obtain plants transformed with a nucleic acid of the DD1-a gene or of the DD1-b gene according to the invention.
  • transgenic plant according to the invention can be obtained by biolistic techniques such as those described by FINER et al. (1992) or those described by VAIN et al. (1993).
  • Another subject of the invention is a plant seed, the constituent cells of which comprise a nucleic acid according to the invention which has been artificially inserted into their genome.
  • the invention also relates to a seed of a transgenic plant as defined above or also a fruit of such a transgenic plant.
  • Another subject of the invention consists in the use of a nucleic acid regulating the DD1-a gene or the DD1-b gene as defined in the present description for the expression in vitro or in vivo, preferably in planta , of a polynucleotide of interest, preferably a polynucleotide encoding a protein involved in the transfer of metabolites to the albumen in the formation of a plant grain.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid coding for a polypeptide coded by the DD1-a gene or by the DD1-b gene according to the invention for expression in vivo or in vitro, preferably in planta, of a polypeptide according to the invention or also of a fragment of such a polypeptide.
  • the above use is characterized in that it is an expression in vivo in a plant transformed with such a nucleic acid.
  • the DD1-a gene and the DD1-b gene according to the invention respectively code for polypeptides having a length of 304 and 286 amino acids, for which variant polypeptides have been observed.
  • the degree of identity between the amino acid sequences of the polypeptides coded respectively by the DD1-a gene and the DD1-b gene is very high, close to 90% of amino acid identity, after alignment of the sequences.
  • the polypeptides encoded by the DD1-a gene or the DD1-b gene have a putative signal peptide, which is a characteristic of a secreted protein.
  • the hydrophilic nature of the mature protein is compatible with a function in the extracellular medium.
  • the same putative signal peptide / mature hydrophilic protein combination of the polypeptides according to the invention is common with other polypeptides found mainly expressed in the cells of the maize transfer zone, such as the BETL-1 to BETL polypeptides. -4 described by HUEROS et al. (1999).
  • No. 1 is the polypeptide of sequence SEQ ID No. 9 from the sequence listing.
  • the DD1-a polypeptide has a calculated molecular weight of 33,408 daltons. It has 19 strongly basic amino acid residues (K, R), 29 strongly acidic amino acid residues (D, E), 98 hydrophobic amino acids (A, I, L, FW, V) and 97 polar amino acids ( N, C, Q, S, T, Y).
  • the polypeptide of sequence SEQ ID No. 9 encoded by the DD1-a gene has a calculated isoelectric point of 5.40 and a charge calculated at pH 7.0 of 8.61.
  • the subject of the invention is therefore also a polypeptide comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 9 as well as a polypeptide 68
  • the first variant polypeptide encoded by the DD1-b gene is the polypeptide of sequence SEQ ID No. 11 from the sequence listing.
  • the second variant polypeptide encoded by the DD1-b gene according to the invention is the polypeptide of sequence SEQ ID No. 12 from the sequence listing.
  • the polypeptide of sequence SEQ ID No. 12 has an apparent molecular weight of 31,357 daltons.
  • the polypeptide of sequence SEQ ID No. 12 has 18 strongly basic amino acid residues (K, R), 27 strongly acidic amino acid residues (DE), 91 hydrophobic amino acids A, I, L, F, W, V) and 91 polar amino acids (N, C, Q, S, T, Y).
  • the polypeptide of sequence SEQ ID No. 12 has a calculated isoelectric point of 5.44 and a charge calculated at pH 7.0 of -7.74.
  • the invention therefore also relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 10 as well as to a polypeptide having at least 80% amino acid identity with the sequence SEQ ID No. 10 or a fragment or a variant thereof.
  • the subject of the invention is also a polypeptide comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 11 as well as a polypeptide 69
  • Another subject of the invention consists of a polypeptide comprising the amino acid sequence SEQ ID No 12 as well as a polypeptide having at least 80% amino acid identity with the sequence SEQ ID No 12, or a fragment or a variant thereof.
  • a fragment of a polypeptide according to the invention will comprise at least 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 or 250 consecutive amino acids of a polypeptide of sequences SEQ ID N ° 9 to 12.
  • polypeptide comprising 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 or 250 consecutive amino acids of a polypeptide of sequences SEQ ID N ° 9 to 12.
  • the invention also relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 80% amino acid identity with the sequence of a polypeptide of sequences SEQ ID Nos. 9 to 12.
  • polypeptide having at least 85%, 90%, 95%, 98% or 99% of amino acid identity with the sequence of a polypeptide of sequences SEQ ID N ° 9 to 12 , or a peptide fragment thereof.
  • polypeptides according to the present invention are in an isolated or purified form.
  • Another subject of the invention consists of a polypeptide comprising amino acid modifications of 1, 2, 3, 4, 5, 10 to 20 substitutions, additions or deletions of an amino acid with respect to the acid sequence amines of a polypeptide of sequences SEQ ID No. 9 to
  • a polypeptide according to the invention can be obtained by genetic recombination according to well known techniques for 70
  • a polypeptide according to the invention can also be prepared by conventional techniques of chemical synthesis, either in homogeneous solution or in solid phase.
  • a polypeptide according to the invention may be prepared by the technique in homogeneous solution described by HOUBEN WEIL (1974) or also by the solid phase synthesis technique described by MERRIFIELD (1965a; 1965b).
  • the variant polypeptides of a polypeptide according to the invention retain their ability to be recognized by antibodies directed against the polypeptides of sequences SEQ ID No. 9 to 12.
  • a polypeptide encoded by the DD1-a gene or the DD1-b gene according to the invention such as a polypeptide of amino acid sequence SEQ ID Nos. 9 to 12, or a variant or a peptide fragment of the latter is useful especially for the . preparation of antibodies intended for the detection of the presence and / or of the expression of a polypeptide of sequences SEQ ID N ° 9 to 12 or of a peptide fragment of the latter in a sample.
  • antibodies directed against these polypeptides are used to quantify the synthesis of a polypeptide of sequences SEQ ID N ° 9 to 12, for example in cells of a plant, and thus determine the capacity of this plant to transfer metabolites from the mother plant to the albumen of the grain in formation or still the capacity of resistance of such a plant to various plant pathogens.
  • antibody within the meaning of the present invention, is meant in particular polyclonal or monoclonal antibodies or fragments (for example the fragments F (ab) ' z , F (ab)) or any polypeptide 71
  • Monoclonal antibodies can be prepared from hybridomas using the technique described by KOHLER and MILSTEIN (1975)
  • the present invention also relates to antibodies directed against a polypeptide as described above or a fragment or a variant thereof, as produced in the trioma technique or also the hybridoma technique described by KOZBOR et al. (1983).
  • the invention also relates to fragments of single chain Fv antibody (ScFv) as described in US Patent No. 4,946,778 or by MARTINEAU et al. (1998).
  • the antibodies according to the invention also comprise fragments of antibodies obtained using phage libraries as described by RIDDER et al. (1995) or humanized antibodies as described by REINMANN et al. (1997) and LEGER et al. (1997).
  • the antibody preparations according to the invention are useful in immunological detection tests intended for the identification of the presence and / or of the quantity of a polypeptide of sequences SEQ ID Nos. 9 to 12, or of a fragment peptide thereof, present in a sample.
  • an antibody according to the invention may also comprise an isotopic or non-isotopic detectable marker, for example fluorescent, or else be coupled to a molecule such as biotin, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the subject of the invention is also a method for detecting the presence of a polypeptide in accordance with the invention in a sample, said method comprising the steps of: a) bringing the sample to be tested into contact with an antibody such as described above; b) detecting the antigen / antibody complex formed.
  • the invention also relates to a kit or diagnostic kit for detecting the presence of a polypeptide according to the invention in a sample, said kit comprising: a) an antibody as defined above; b) where appropriate, one or more reagents necessary for the detection of the antigen / antibody complex formed.
  • FIG. 1 represents the genomic coding sequence of the gene
  • DD1-a identical to the sequence SEQ ID No. 5.
  • the upper line represents the coding strand and the lower line represents the non-coding strand.
  • Each of the five exons of the DD1-a gene is represented by boxes.
  • FIG. 2 represents the coding genomic sequence of the gene
  • DD1-b This sequence is identical to the sequence SEQ ID N ° 6.
  • the upper line represents the sequence of the coding strand and the lower line represents the sequence of the non-coding strand.
  • Each of the four exons of the DD1-b gene is represented by boxes.
  • FIG. 3 represents the partial sequence of the cDNA corresponding to the DD1-a gene.
  • the upper line represents the nucleotide sequence of the coding strand.
  • the bottom line represents the deduced amino acid sequence.
  • FIG. 4 represents the sequence of the cDNA corresponding to a transcript of the DD1-b gene.
  • the 5'-UTR and 3'-UTR regions are represented by arrows.
  • the open reading phase is represented by a box.
  • the box designated “DD1 AMPLICON” is the partial CDNA of sequence SEQ ID No. 26 from which the 73
  • primers intended for elongation in 5 '(5' RACE) and towards the 3 'end (3'RACE) have been designed.
  • the bottom line represents the amino acid sequence of the DD1-b polypeptide of sequence SEQ ID No. 12.
  • FIG. 5 represents the nucleic acid sequence regulating the DD1-a gene of sequence SEQ ID No. 3.
  • the boxes represent the different patterns characteristic of a regulatory region found in this sequence and which are defined precisely in the description.
  • FIG. 6 represents the nucleic acid sequence regulating the DD1-b gene of sequence SEQ ID No. 4.
  • the boxes represent the different patterns found in this sequence and which are defined more precisely in the description.
  • FIG. 7 represents a map of the vector L 127a5 which comprises the expression cassette which is not used to express a gene of interest under the control of different fragments of the nucleic acids regulating the DD1 -a and DD1-b genes.
  • FIG. 8 represents a map of the vector L 246a in which the reporter gene GUS is placed under the control of an approximately 3 kb fragment of the regulatory nucleic acid of the DD1-a gene.
  • FIG. 9 illustrates a map of the vector L246b which comprises the reporter gene GUS placed under the control of an approximately 1 kb fragment of the regulatory nucleic acid of the DD1-a gene.
  • FIG. 10 represents a map of the vector L247a which comprises the reporter gene GUS placed under the control of an approximately 2.5 kb fragment of the regulatory nucleic acid of the DD1-b gene.
  • FIG. 11 represents a map of the vector L247b which comprises the reporter gene GUS placed under the control of an approximately 1.6 kb fragment of the regulatory nucleic acid of the DD1-b gene.
  • FIG. 12 represents an alignment between the amino acid sequences of the polypeptide DD1-a of sequence SEQ ID No. 9, of the polypeptide DD1-b of sequence SEQ ID No. 11 and of the polypeptide DD1-b 74
  • the top line represents a consensus amino acid sequence.
  • the second line represents the amino acid sequence deduced from the partial sequence of the cDNA coding for DD1-a.
  • the third line represents the sequence of the DD1-a protein.
  • the two lower lines represent the amino acid sequences of the two polypeptide variants of DD1-b of sequences SEQ ID No. 11 and SEQ ID No. 12.
  • Figure 13 illustrates the expression profile of the DD1-a and DD1-b genes.
  • RT-PCR reverse transcription and amplification by PCR
  • the expression was visualized from DNA amplified in the following tissues: bristles, ears, stems; leaves; roots and endosperm at 7, 9, 12 and 15 days after pollination (JAP).
  • JAP pollination
  • FIG. 14 illustrates the tissue expression profile of the DD1-a and DD1-b genes produced using in situ hybridization on longitudinal sections of corn kernels 7, 9, 12 and 15 days after pollination (JAP ).
  • JAP pollination
  • the plants of the A188 line (GERDES and TRACY, 1993) were used for the isolation of RNA and for carrying out in situ hybridizations.
  • the DNA fragments contained in the screened genomic library come from the hybrid line HD5xHD7.
  • the mapping was performed using stable recombinant lines from the Co159xTx303 and Cm37xT232 crosses (BROOKHAVEN NATIONAL LABORATORY, Upton, N.Y. United States). All these plants were grown in a greenhouse, with an illumination period of 16 h, a relative humidity of 80%, and an alternation of 24 ° C / 19 ° C (day / eight).
  • the plasmid DNA was prepared according to the alkaline lysis protocol described by SAMBROOK et al. (1989). Digests of genomic and plasmid DNA by restriction enzymes were carried out according to the advice of the manufacturers (GIBCO, BOEHRINGER MANNHEIM, PROMEGA). The digestion or PCR amplification products were separated by agarose gel electrophoresis in TAE buffer SAMBROOK et al. 1989). The restriction fragments were ligated into the vector pBluescript and the PCR products into the vector pGEM-T-easy, using the T4-DNA ligase following the advice of the supplier (Promega), using 50 ng of vector, and an insert / vector molar ratio of the order of 3/1. These constructions were introduced into the bacterial strain DH5 ⁇ by transformation by thermal shock, according to the protocol of HANAHAN (1983).
  • the sequencing reactions were carried out either from mini-preparations of plasmid DNA having undergone volume-to-volume extraction with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) pH 8 and precipitation with ethanol, or from PCR products purified using the “QIAquick PCR purification” kit (Qiagen).
  • the reaction products 76 were carried out either from mini-preparations of plasmid DNA having undergone volume-to-volume extraction with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) pH 8 and precipitation with ethanol, or from PCR products purified using the “QIAquick PCR purification” kit (Qiagen).
  • the reaction products 76 were carried out either from mini-preparations of plasmid DNA having undergone volume-to-volume extraction with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) pH 8 and precipitation with ethanol, or from PCR products purified using the “QIAquick
  • Sequencher 3.1.1 Gene Codes Corporation
  • DNAstar DNAstar
  • blast software Basic local Alignment S Tool, National Center for Biotechnology Information, ALTSCHUL et al., (1997).
  • Protein "signature” reasons were sought in the "Prosite” databases profiles ”,“ Prosite patterns ”,“ Pfam ”and“ Gribskov collection ”, available on the ISB server (Institute of Swiss Bioinformatics).
  • the DNA fragments were transferred from agarose gels onto nylon membranes (Hybond N +, Amersham) by capillary action, in the presence of 0.4N sodium hydroxide.
  • the membranes were prehybridized according to the supplier's advice, for 4 to 12 hours under stringent conditions (at 65 ° C, in the presence of 5x SSPE and without formamide). Then they were hybridized for 16 h under the same conditions.
  • the probes used for the hybridization were radioactively labeled with 50 ⁇ Ci of ⁇ 32 P- dCTP, according to the following protocol: 25 to 100 ng of linear DNA were denatured 5 min in boiling water, in a volume of 9 ⁇ l, with two specific antiparallel primers (sequences listed in Table 10) at a final concentration of 5 ⁇ M. 77
  • the DNA and the primers were hybridized 10 min at room temperature and 5 min on ice.
  • the following reagents were then added on ice: 2 ⁇ l of dAGT (200 ⁇ M each: dATP, dGTP, dTTP) 1 ⁇ l SAB (1 mg / rnl), 2 ⁇ l #Z 10x concentrated restriction buffer (GIBCO), 5 ⁇ l d ' ⁇ 32 P-dCTP (activity 3000 Ci / mmol), and 1 ⁇ l of Klenow enzyme (1 U / ⁇ l).
  • the DNA fragments were labeled at 37 ° C.
  • the membranes were rinsed four times at 65 ° C in 0.1% solutions of SDS and SSC concentrations of 2x, 1x, 0.5x and 0.1x, and were exposed to films for autoradiography (X-OMAT, Kodak).
  • RNAs of these two organisms were extracted according to the protocol described by Me PHERSON et al. (1991). These various manipulations were carried out in parallel on control tissues of plants of the same genotype: 10 cm bristles, stems, leaves and mature roots, and young non-pollinated ears of 10 cm.
  • RNAs resuspended in 50 ⁇ l of Versol water (Aguettant), were denatured at 65 ° C for 5 min and treated with DNase I according to the indications of the supplier (Promega). They were then purified by two volume-to-volume phenol extracts: chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) pH 4.5 and precipitation with ethanol, 6 ⁇ g of purified RNA were “reverse” transcribed by MuLV reverse transcriptase (Gibco) in a total volume of 20 ⁇ l as recommended by the supplier, with the antisense primers presented in table 10 above, at a final concentration of 2.5 ⁇ M.
  • Gapdh gene transcripts constituted the positive reverse transcription control. Indeed, this gene codes for an enzyme involved in glycolysis, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, whose expression is ubiquitous and constitutive. Amplification was also carried out by omitting the RNAs, in order to have a negative control attesting to the absence of contaminating DNA in the reagents.
  • the technique is based on the amplification of cDNA fragments at the ends of which adapters have been ligated.
  • the cDNAs used for the reaction were prepared from polyA + RNA extracted from the basal part of corn grains of 7 JAP, comprising the embryo and 80
  • a first amplification was carried out between a specific primer of DD1 (containing at least 50% of GC; hybridization temperature between 65 and 70 ° C; located at one end of the partial clone) and a primer located in an adapter ligated to the other end of the template cDNA.
  • the products of this reaction are then amplified with a specific primer located more inside the amplicon and another primer of the adapter.
  • the isolated grains were immersed in a 4% fixation solution of paraformaldehyde and infiltrated under vacuum. Then they were dehydrated by successive incubations in salted ethyl solutions of increasing degree in ethanol. The samples were then impregnated for several days in a mixture of Histoclear II (National Diagnostics) and paraffin (Paraplast Plus, Sherwood Medical Co) in increasing concentration. They were then included in small blocks of pure paraffin to be cut in the microtome, in longitudinal and transverse sections of 7 ⁇ m 81
  • the sense and antisense DD1 probes were obtained by in vitro transcription of a partial cDNA of the DD1 gene (SEQ ID No. 26) cloned in the two orientations in the vector pGEM-T-easy. All the in vitro transcriptions were carried out by T7-RNA polymerase, in the presence of the following nucleotides: ATP, CTP and 1 mM GTP, 0.65 mM UTP, and 0.35 mM digoxinenin-11-UTP.
  • the membranes were hybridized with the probe of sequence SEQ ID No. 29 originating from a partial genomic DNA clone of the radioactive labeled DD1-b gene. After revelation of the membranes in autoradiography, the lysis plaques giving a signal were taken from the dishes and spread at a lower density, thus twice in succession in order to obtain a single clone per dish, in the form of isolated plaques.
  • the DNAs were then prepared according to SAMBROOK et al. (1989).
  • mapping was carried out as described by BURR and
  • the genomic DNA of the parental lines Co159, Tx303, Cm37 and T232 was digested with the following restriction enzymes: BamHI, EcoRI, Hindlll, EcoRV, Pstl, Xbal, Sacl, Spel, Xhol, Sali, Pvull, and Clal, and transferred to nylon membrane (see paragraph A.4).
  • RT-PCR In order to obtain precise spatio-temporal expression profiles of the DD1 genes, the "RT-PCR” technique was used with the oligonucleotides of Table 10 and the sequence SEQ ID No. 26 as probe. The results of the “RT-PCR” relating to the endosperm and the control tissues are represented in FIG. 13.
  • the DD1 gene (Figure 13) is not expressed in vegetative tissues, but has a very narrow expression window in the endosperm, located between 7 and 9 JAP. Additional whole grain experiments show that expression begins before 7 JAP. A low expression is even detectable in the mature ovum before fertilization. The maximum expression is at 7 JAP. At 12 JAP, you can still observe a very weak signal, which disappears completely at 15 JAP. The expression of DD1 is therefore specific to the early phase of albumen development.
  • the DD1 probe also gives a signal in the size marker track, since small regions of the cloning vector present at the ends of the probe are homologous to the sequences of the marker.
  • DD1 amplicon SEQ ID No. 26, (382 bp) seemed too small to produce a good probe usable for bank screening and mapping.
  • amplification by PCR on genomic DNA was carried out, using of the same primers (SEQ ID No. 20 and SEQ ID No. 21) as those used for "RT-PCR” (Table 10). Obtaining two products of larger size than those of "RT-PCR "Showed that there exists in genomic DNA at least one intron between the two specific primers. These two fragments, of approximately 1.2 kb and 1.5 kb, were cloned and then entirely sequenced.
  • the DNA of a range was isolated and digested by the enzymes Sali, Xbal, as well as by the two enzymes simultaneously. Once hybridized, the membranes of these digests allowed us to identify restriction fragments containing at least part of DD1. For a lambda clone DD1-a and a lambda clone DD1-b the restriction fragments were subcloned, and the different types of subclone were sequenced.
  • sequences obtained are listed here as SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2. They contain regulatory regions, coding regions and regions downstream of the DD1-a and DD1-b genes.
  • Mapping can provide information on the function of a gene if it co-maps with a mutation of known phenotype.
  • To map the DD1 genes we had two populations of stable recombinant lines, derived from the Co159xTx303 and T232xCm37 crosses. To find length polymorphisms of the restriction fragments of the DD1 genes, we digested the DNA of the 4 parental lines by different 87
  • the exact position of the DD1-a and DD1-b genes in relation to known markers on the maize genetic map has been determined.
  • the DD1-a gene is located on the long arm of chromosome 8, at position 130.5 centimeters, between the marker bnl17.17 and the spsl gene.
  • the DD1-b gene is located on the long arm of chromosome 6, at position 78 centimeters, between the markers p! 1 and tug8. 88
  • the sequencing of the GM2 / 203-3 'product revealed the presence of a small insertion of 54 bp compared to the GM2 / 204-3' product.
  • This sequence was found in the genomic DNA of DD1-a.
  • the presence of canonical splicing sites at its ends confirms the presence of a small exon.
  • a homologous sequence is present in the genomic DNA of DD1-b, but absent in the cDNA of the DD1-b gene (clone RACE and product GM2 / 204-3 '). it would seem that the two DD1 genes have diverged enough in evolution to allow alternative splicing.
  • the starting vector intended to receive the DNA inserts of interest is the vector L127a5 represented in FIG. 7.
  • the vector L127 a 5 as well as its construction are described by BONELLO et al. (2000). In this article, the vector L 127 to 5 is designated prEsr3-GUS.
  • each of the respective regulatory sequences of the DD1-a gene and of the DD1-b gene two vector constructs were produced, each of the constructions comprising a long fragment or, on the contrary, a short fragment of the regulatory sequence.
  • the regulatory sequences of the DD1-a and DD1-b genes were first amplified by PCR using primers containing restriction sites.
  • the amplified fragments of the regulatory sequences are integrated into the plasmid L127a5 represented in FIG. 7 and also described in French patent application No. 99 12305 filed on October 1, 1999.
  • primer 203 (3.0) ATGCCTGCAGCTACCGCATCGCATTACTGGCTCTG
  • the vector L246a was constructed after introduction of a sequence of approximately 3 kb of the promoter of the gene DD1 -a after amplification of a genomic fragment of this gene using the pair of primers of sequences SEQ ID No. 13 (primer 203 (3.0)) and SEQ ID No. 17 (primer GUS) then digestion with restriction endonucleases Pstl and Xbal. ( Figure 8).
  • the vector L246b was obtained by introducing into the vector L127a5 a nucleic acid constituting the amplification product of a genomic fragment of the DD1-a gene using the pair of primers with sequences SEQ ID No. 14 ( primer 203 (1, 0)) and SEQ ID No. 17 (primer GUS), before digestion with the restriction endonucleases Hindlll and Xbal. ( Figure 9). 91
  • the vector L247a was obtained by the introduction into the vector L127a5 of a nucleic acid constituting the product of amplification of a genomic fragment of the DD1-b gene using the pair of primers of sequences SEQ ID No. 15 (primer 204 (2.5)) and SEQ ID No. 17 (primer GUS) before digestion with the restriction endonucleases Pstl and Xbal. ( Figure 10).
  • the vector L318 is a derivative of L247a. It contains a translational fusion between the second exon of DD1-b and the reporter gene Gus.
  • the vector L247a was digested with the enzymes Spel and Smal and the smaller fragment was replaced by an amplification product obtained by PCR with the primers DD1-b-FT-5 '(SEQ ID No. 33 and DD1-b -FT-3 '(SEQ ID No. 34) on the plasmid L204b7 then digested with the enzymes Spel and Smal.
  • DD1 b-FT5 ' ATTATCATTT CAGGTAGCAC ATCTCC (SEQ ID N ° 33)
  • DD1b-FT3 ' TAATCCCGGG GACTTGCCAT TTGACACCCA CATTATT (SEQ ID N ° 34)
  • the vector L247b was produced by the introduction into the vector L127a5 of a genomic amplification fragment obtained using the pair of primers SEQ ID No. 16 (primer 204 (1, 6)) and SEQ ID N ° 17 (primer GUS), before digestion with the restriction endonucleases Pstl and Xbal. ( Figure 11).
  • the genomic DNA of the initial DD1-a gene used to amplify the sequences of interest intended to be introduced into the vectors L246a and L246b is contained in the plasmid L203b23, which comprises a genomic DNA insert of 6 kb cloned with the Sali and Xbal enzymes in the vector pBCSK + sold by the company Stratagene. 92
  • the starting material for the amplification of the DNA inserts of interest of the DD1-b gene is the plasmid L204b17 which comprises 12 kb of a genomic DNA insert cloned with the enzyme Xbal in the vector pBCSK + marketed by the Stratagene company.
  • Genomic DNA fragments come from lambda clones
  • the references for the plasmid L127a5 are the following: - plasmid pBSSK + marketed by the Company Stratagene;
  • transgenic plants transformed with a transgene comprising a polynucleotide of interest placed under the control of a regulatory sequence according to the invention.
  • Transformation of a plant in order to obtain a stable expression of the polynucleotide of interest in the transformed plant is necessary to ensure a lasting modification of the corn kernel. Tests are carried out with a construction of vectors L246a,
  • the method used is based on the use of a particle gun identical to that described by FINER (1992).
  • Target cells are undifferentiated cells in rapid divisions which have retained the ability to regenerate whole plants. This type of cell makes up the embryogenic callus (called type II) of corn. These calluses are obtained from immature embryos of 93
  • calluses are identified, individualized, multiplied and then cultivated so as to regenerate seedlings, by modifying the hormonal and osmotic balance of the cells according to the method described by VAIN et al. (1989). These plants are then acclimatized in the greenhouse where they can be crossed to obtain hybrids or self-fertilized. 94
  • Agrobacterium tumefaciens according to the protocol described by ISHIDA et al. (1996), in particular from immature embryos 10 days after fertilization. All the media used are referenced in the cited reference.
  • the transformation begins with a coculture phase where the immature embryos of the corn plants are brought into contact for at least 5 min with Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 containing the superbinary vectors.
  • the superbinary plasmid is the result of homologous recombination between an intermediate vector carrying the T-DNA containing the gene of interest and / or the selection marker derived from the plasmids described in the previous examples, and the vector pSB1 from Japan.
  • Tobacco (EP 672 752) which contains: the virB and virG genes of the plasmid pT ⁇ ' Bo542 present in the supervirulent strain A281 to 1 Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) and a homologous region found in the intermediate vector allowing this homologous recombination.
  • the embryos are then placed on LSAs medium for 3 days in the dark and at 25 ° C.
  • the second selection step is carried out by transfer of the embryos which have developed on LSD5 medium, on LSD10 medium (phosphinotricin at 10 mg / l) in the presence of cefotaxime, for 3 weeks under the same conditions as above.
  • the third selection step consists in excising the type I calluses which remain white (fragments of 1 to 2 mm) and in transferring them 3 weeks in the dark and at 25 ° C on LSD 10 medium in the presence of cefotaxime. 95
  • the regeneration of the seedlings is carried out by excising the type I calluses which have proliferated and by transferring them to LSZ medium in the presence of phosphinotricin at 5 mg / l and cefotaxime for 2 weeks at 22 ° C. and under continuous light.
  • the plants which have regenerated are transferred to RM + G2 medium containing 100 mg / l of Augmentin for 2 weeks at 22 ° C. and under continuous illumination for the development stage.
  • the plants obtained are then transferred to the phytotron for their acclimatization.
  • this plasmid was co-transformed in tobacco protoplasts according to the PEG technique (Pietrzak et al. 1986), with a plasmid containing the transcription factor ZmMRP-1 downstream of a constitutive promoter (GOMEZ et al., 1999 and GOMEZ et al., 2000).
  • PEG PEG
  • ZmMRP-1 a constitutive promoter
  • SHEEN J Molecular mechanisms underiying the differential expression of maize pyruvate, orthophosphate dikinase genes. seedling

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Abstract

La présente invention concerne des acides nucléiques exprimés spécifiquement dans la zone de transfert d'un grain de plante, de préférence des acides nucléiques constitutifs des gènes DD1-a et DD1-b du maïs. L'invention est également relative à des vecteurs recombinants de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique selon l'invention ainsi qu'à des cellules hôtes transformées par un acide nucléique ou un vecteur recombinant de l'invention, en particulier des cellules hôtes d'origine végétale.

Description

Acides nucléiques et polypeptides exprimés spécifiquement dans les cellules de la zone de transfert d'un grain de plante et leurs applications
La présente invention concerne des acides nucléiques exprimés spécifiquement dans la zone de transfert d'un grain de plante, de préférence des acides nucléiques constitutifs des gènes DD1-a et DD1-b du maïs.
L'invention est également relative à des vecteurs recombinants de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique selon l'invention ainsi qu'à des cellules hôtes transformées par un acide nucléique ou un vecteur recombinant de l'invention, en particulier des cellules hôtes d'origine végétale.
L'invention a également pour objet une plante transformée par un acide nucléique ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus ainsi que leurs procédés d'obtention.
L'invention a également trait à un polypeptide codé par un acide nucléique selon l'invention.
DESCRIPTION DE L'ETAT DE LA TECHNIQUE
Les angiospermes, ou plantes à fleurs, se caractérisent par leur mode de reproduction sexué par double fécondation. Deux gamètes mâles sont transportés par le tube pollinique et pénètrent dans l'ovule, puis dans le sac embryonnaire. Tandis que l'un va féconder l'oosphère pour donner un embryon diploïde, l'autre s'unit aux deux noyaux polaires de la cellule centrale, permettant ainsi la formation d'un deuxième organisme, celui-ci triploïde, appelé albumen ou embryon accessoire. Pendant la phase précoce de développement, de 0 à 12 JAP (jour après pollinisation), après un développement syncitial, l'albumen se cellularise, et des territoires cellulaires se différencient au sein de cet organisme principalement en quatre zones. L'une de ces zones est l'albumen amylacé, qui à maturité occupe environ les deux tiers du volume du grain et est un lieu de stockage des différentes substances de réserve dont l'amidon. Une seconde zone principale est la couche à aleurone, constituée des cellules à la périphérie de l'albumen et qui synthétise des enzymes hydrolytiques essentielles lors de la mobilisation des réserves nécessaires à la germination. Une troisième zone principale est la zone ESR (« embryo surrounding région ») qui entoure l'embryon, puis se limite au pourtour du suspenseur à partir de sept JAP et est formée de petites cellules au cytoplasme dense qui serait impliqué dans le transfert de métabolites vers l'embryon.
La quatrième zone principale consiste en la zone de transfert qui permet le passage de nutriments depuis les tissus maternels jusqu'à l'albumen et l'embryon en développement. C'est lors de la phase précoce du développement que se mettent en place les structures majeures qui constitueront le futur grain. Or, très peu de gènes spécifiques de cette phase sont connus, et leur fonction n'a pas été déterminée.
La zone de transfert est l'endroit clef qui préside au contrôle de la quantité et/ou de la qualité des métabolites qui transitent de la plante mère vers le grain.
Il existe un besoin dans l'état de la technique de disposer de séquences régulatrices s'exprimant de manière prépondérante, ou même de manière exclusive, dans la zone de transfert, qui puissent être intégrées dans des cassettes d'expression comprenant de telles séquences régulatrices contrôlant l'expression d'un gène d'intérêt, afin de modifier qualitativement ou quantitativement le contenu en métabolites de l'albumen du grain, en vue de l'obtention de grains matures, en particulier de céréales, ayant des caractéristiques de constitution améliorées, par exemple nutritives ou industrielles.
Il existe également un besoin dans l'état de la technique d'identifier des protéines exprimées spécifiquement dans la zone de transfert pendant la formation de l'albumen, qui sont susceptibles d'être impliquées dans le passage de nutriments de la plante mère vers l'albumen en développement, et dont une modulation de l'expression permettrait de contrôler la qualité ou la quantité de nutriments présente dans l'albumen du grain mature.
A la connaissance du demandeur, seules quelques protéines ont été décrites dans l'état de la technique comme étant exprimées de manière prépondérante dans la zone de transfert du grain. L'article de HUEROS et al. (1999a) concerne l'étude de l'expression du gène BETL1 de maïs et divulgue qu'une séquence de 985 bp localisée en amont du gène BETLIa peut contrôler l'expression d'un gène rapporteur dans des plants de maïs transgéniques. Toutefois, la séquence nucléotidique du promoteur du gène BETLIa n'est pas décrite dans cet article.
L'article de HUEROS et al. (1995) décrit la protéine BETL1 ayant une séquence de 85 acides aminés de longueur, ainsi que la séquence nucléotidique codant pour cette protéine et montre l'expression du gène BETL1 dans les cellules de transfert de l'endosperme du maïs. Cet article divulgue la séquence de l'ARN messager qui constitue le produit de transcription du gène BETL1 mais ne décrit aucune séquence génomique de ce gène.
L'article de HUEROS et al. (1999b) présente la séquence en acides aminés des protéines BETL-2, BETL-3 et BETL-4 qui sont également exprimés principalement dans la zone de transfert du grain. Cet article décrit également de courtes séquences nucléotidiques partielles localisées en amont de ces gènes susceptibles d'intervenir dans la régulation de leur expression dans la plante. Toutefois, aucune séquence complète d'un promoteur fonctionnel n'est décrite. Le demandeur s'est attaché à identifier et caractériser de nouveaux gènes exprimés spécifiquement dans les cellules de la zone de transfert du grain, tout particulièrement pendant le développement de l'albumen, dans le but d'identifier: a) des séquences régulatrices spécifiquement exprimées dans la zone de transfert du grain qui peuvent être utilisées pour contrôler l'expression de séquences d'intérêt, préférentiellement de séquences codant pour des protéines, par exemple des enzymes, des protéines impliquées dans la défense de la plante vis-à-vis de stress externes tels que des pathogènes, des protéines signal intervenant dans la communication entre la plante mère et l'albumen ou l'embryon ou encore entre l'albumen et l'embryon, des protéines marqueurs (luciférase, GUS, GFP, etc..) des protéines cytotoxiques (Bamase, toxine diphtérique, etc.). Parmi les enzymes, on peut citer celles permettant de modifier la quantité ou la qualité des métabolites transférés de la plante mère vers l'albumen en développement afin d'obtenir des grains matures ayant des caractéristiques, notamment nutritives ou industrielles améliorées. b) des séquences codant pour des protéines qui sont naturellement exprimées dans la zone de transfert du grain et qui sont susceptibles d'être impliquées dans le transfert de métabolites de la plante mère vers l'albumen en développement ou encore dans la défense des plantes contre des pathogènes ou encore la signalisation ainsi que les acides nucléiques codant pour de telles protéines, qui peuvent être placés sous le contrôle de promoteurs, le cas échéant de promoteurs inductibles, permettant de modifier la qualité ou la quantité des métabolites transférés de la plante mère vers l'albumen en développement ou encore d'accroître la résistance de la plante ainsi transformée à certains pathogènes ou d'influencer le développement de l'embryon ou de l'albumen.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Le demandeur a ainsi montré selon l'invention que deux gènes très fortement homologues, respectivement désignés DD1-a et DD1-b, étaient exprimés de manière spécifique dans la zone de transfert du grain en développement chez le maïs et a isolé et caractérisé ces séquences ainsi que celles des protéines codées par les gènes DD1-a et DD1-b.
Le demandeur a également caractérisé les séquences régulatrices localisées en amont des deux gènes.
Les séquences nucléotidiques des gènes DD1-a et DD1-b possèdent moins de 60% d'homologie avec les séquences des gènes BETL décrites par HUEROS et al. précédemment cités.
En outre, les gènes DD1-a et DD1-b sont exprimés plus précocement (Jour 7 après pollinisation) que les gènes BETL (Jour 10 après pollinisation).
Les résultats d'hybridation in situ et d'amplification par RT-PCR montrent que les gènes DD1-a et DD1-b sont exprimés avant la visualisation histochimique d'une zone basale de transfert de l'albumen complètement formée et définie. L'expression forte et précoce des gènes DD1-a et DD1-b contrôlée par leurs séquences régulatrices respectives, montre que ces deux gènes sont d'un grand intérêt industriel pour modifier les qualités et les caractéristiques de la zone de transfert qui est reconnue comme l'élément clef du remplissage du grain.
ACIDES NUCLEIQUES DES GENES DD1-a et DD1-b SELON L'INVENTION.
Les séquences nucléotidiques des deux gènes DD1-a et DD1-b comprennent chacune, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', (i) la séquence régulatrice permettant l'expression spécifique du gène dans la zone de transfert, (ii) une séquence codante comprenant les exons et les introns du gène et (iii) une séquence non codante en aval du dernier exon du gène.
La séquence du gène DD1-a selon l'invention est référencée comme la séquence SEQ ID N°1 du listage de séquences.
La séquence du gène DD1-b selon l'invention est référencée comme la séquence SEQ ID N°2 du listage de séquences. Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique. L'invention concerne aussi un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Selon l'invention, toute technique classique de biologie moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut être utilisée. De telles techniques sont décrites par exemple par SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984), HAMES et HIGGINS (1985a), HAMES et HIGGINS (1984), BERBAL (1984) et AUSUBEL et al. (1994) .
De manière préférée, tout acide nucléique et tout polypeptide selon l'invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée. Le terme « isolé » au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante est isolé. Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme « purifié » ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide ou un polypeptide est à l'état purifié après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement quatre ou cinq ordres de grandeur.
Aux fins de la présente description, l'expression ; « séquence nucléotidique » peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression « séquence nucléotidique » englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes « acide nucléique », « polynucléotide », « oligonucléotide » ou encore « séquence nucléotidique » englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex.
Le terme « nucléotide » désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N°WO 95/04064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant « complémentaire » d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynuléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 80%, de préférence au moins 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 99,5% d'identité en nucléotides avec ce second polynucléotide de référence, le pourcentage d'identité entre deux séquences étant déterminé comme décrit ci-dessous. Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des « gaps ») par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière préférée, le pourcentage d'identité de séquences est déterminé à l'aide du logiciel BLAST (version BLAST 2.06 de Septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut. Un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique selon l'invention englobe les « variants » d'un acide nucléique selon l'invention.
Par « variant » d'un acide nucléique selon l'invention, on entend un acide nucléique qui diffère de l'acide nucléique de référence par une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'un nucléotide, par rapport à l'acide nucléique de référence. Un variant d'un acide nucléique selon l'invention peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique qui existe naturellement. Un tel acide nucléique variant peut être également un acide nucléique non naturel obtenu, par exemple, par des techniques de mutagenèse.
En générai, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique « variant » sont réduites de telle sorte que l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant ont des séquences nucléotidiques très similaires et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications nucléotidiques présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'affectent pas la séquence d'acides aminés qui peut être codée par cet acide nucléique variant. Les modifications de nucléotides dans l'acide nucléique variant peuvent aussi résulter en des substitutions, additions ou délétions d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence du polypeptide qui peut être codé par cet acide nucléique variant.
De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention comportant une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la même fonction ou la même activité biologique que le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.
De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention et qui comporte une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la capacité d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.
Par « fragment » d'un acide nucléique selon l'invention, on entend une séquence nucléotidique d'une longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence, le fragment d'acide nucléique possédant une séquence nucléotidique identique à la séquence nucléotidique de l'acide nucléique de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un acide nucléique selon l'invention possèdent au moins 12, 15, 18, 25,30, 35, 40, 45, 50, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000 ou 4000 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de référence, la longueur maximale en nucléotides d'un fragment d'un acide nucléique selon l'invention étant bien entendu limitée par la longueur maximale en nucléotides de l'acide nucléique de référence.
ACIDES NUCLEIQUES DU GENE DD1-a
Comme indiqué ci-dessus, l'acide nucléique génomique du gène DD1-a est référencé comme la séquence nucléotidique SEQ ID N°1 du listage de séquences.
En conséquence, la présente invention a pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°1, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus. Un autre objet de l'invention est un acide nucléique consistant en un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°1, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire. L'invention est aussi relative à un acide nucléique comprenant au moins 12, de préférence au moins 15 et de manière tout à fait préférée au moins 20 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1, étant entendu qu'un tel acide nucléique englobe dans sa définition des « fragments » d'un acide nucléique selon l'invention tel que défini dans la présente description.
La séquence du gène DD1-a telle que décrite dans la séquence SEQ ID N°1 comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', respectivement: a) la séquence régulatrice du gène DD1-a permettant l'expression de la protéine DD1-a dans la zone de transfert du grain en développement; b) une région dite « codante » qui comprend les exons et les introns du gène DD1-a; et 10
(c ) une région non codante localisée en aval de la région codante et susceptible de contenir des éléments de régulation de l'expression du gène DD1-a.
La région régulatrice du gène DD1-a débute au nucléotide en position 1 et se termine au nucléotide en position 3598 de la séquence SEQ ID N°1.
La région non codante localisée en aval de la région codante du gène DD1-a débute au nucléotide en position 6541 et se termine au nucléotide en position 7159 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°1.
La séquence du gène DD1-a comprend aussi cinq exons et quatre introns, dont les caractéristiques structurales sont détaillées respectivement dans les tableaux 1 et 2 ci-après.
TABLEAU 1 Séquences des exons du gène DD1-a
Figure imgf000012_0001
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide exonique du gène DD1-a, tel que les polynucléotides 1 à 5 décrits dans le tableau 1 ci-dessus, qui sont tous inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1.
Un tel acide nucléique code pour au moins une partie du polypeptide codé par le gène DD1-a et peut notamment être inséré dans un vecteur recombinant destiné à l'expression du produit de traduction correspondant dans une cellule hôte ou dans une plante transformée avec ce vecteur recombinant. 11
Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour la synthèse de sondes et d'amorces nucléotidiques destinées à la détection ou à l'amplification de séquences nucléotidiques comprises dans le gène DD1-a dans un échantillon, le cas échéant de séquences du gène DD1-a portant une ou plusieurs mutations, préférentiejlement une ou plusieurs mutations de nature à modifier le phénotype d'une plante portant un tel gène DD1-a muté, par exemple en modifiant la régulation du transfert de métabolites de la plante mère vers l'albumen en formation dans le grain ou encore en modifiant la régulation de la réponse à un stress biotique tel que l'infection par un pathogène des végétaux, ou encore le développement de l'albumen ou de l'embryon.
TABLEAU 2 Séquences des introns du gène DD1-a
Intron n° Position du nucléotide en 5' sur Position du nucléotide en 3' sur la SEQ ID N°1 la SEQ ID N°1
1 3779 4488
2 4669 4741
3 4796 4874
4 5013 6180
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide intronique du gène DD1-a, tel que les polynucléotides 1 à 4 décrits dans le tableau 2 ci-dessus, qui sont tous inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1.
Un tel acide nucléique peut être utilisé comme sonde ou amorce oligonucléotidique pour détecter la présence d'au moins une copie du gène DD1-a dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène DD1-a.
La région génomique du gène DD1-a essentiellement restreinte à la région dite « codante » comprenant les 5 exons et les 4 introns est référencée comme la séquence SEQ ID N°5 du listage de séquences. 12
La séquence SEQ ID N°5 a une longueur de 3149 nucléotides et comprend notamment :
- la séquence de l'exon 1 du gène DD1-a allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 197 de la séquence SEQ ID N°5;
- la séquence de l'exon 2 allant du nucléotide en position 908 jusqu'au nucléotide en position 1087 de la séquence SEQ ID N°5;
- la séquence de l'exon 3 allant du nucléotide en position 1161 jusqu'au nucléotide en position 1214 de la séquence SEQ ID N°5; - la séquence de l'exon 4 allant du nucléotide en position 1294 jusqu'au nucléotide en position 1431 de la séquence SEQ ID N°5;
- la séquence de l'exon 5 allant du nucléotide en position 2600 jusqu'au nucléotide en position 3149 de la séquence SEQ ID N°5;
- la séquence de l'intron 1 du gène DD1-a allant du nucléotide en position 198 jusqu'au nucléotide en position 907 de la séquence SEQ
ID N°5;
- la séquence de l'intron 2 allant du nucléotide en position 1088 jusqu'au nucléotide en position 1160 de la séquence SEQ ID N°5;
- la séquence de l'intron 3 allant du nucléotide en position 1215 jusqu'au nucléotide en position 1293 de la séquence SEQ ID N°5;
- la séquence de l'intron 4 allant du nucléotide en position 1432 jusqu'au nucléotide en position 2599 de la séquence SEQ ID N°5.
L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°5 ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention concerne aussi un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°5 ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID N°5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. 13
L'invention a également trait à un acide nucléique consistant en la séquence nucléotidique SEQ ID N°5 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend l'une des séquences nucléotidiques suivantes: a) la séquence allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 197 de la séquence SEQ ID N°5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire; b) la séquence allant du nucléotide en position 908 jusqu'au nucléotide en position 1087 de la séquence SEQ ID N°5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire; c) la séquence allant du nucléotide en position 1161 jusqu'au nucléotide en position 1214 de la séquence SEQ ID N°5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire; d) la séquence allant du nucléotide en position 1294 jusqu'au nucléotide en position 1431 de la séquence SEQ ID N°5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire; e) la séquence allant du nucléotide en position 2600 jusqu'au nucléotide en position 3149 de la séquence SEQ ID N°5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire; f) la séquence allant du nucléotide en position 198 jusqu'au nucléotide en position 907 de la séquence SEQ ID N°5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire; g) la séquence allant du nucléotide en position 1088 jusqu'au nucléotide en position 1160 de la séquence SEQ ID N°5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire; et h) la séquence allant du nucléotide en position 1215 jusqu'au nucléotide en position 1293 de la séquence SEQ ID n°5; i) la séquence allant du nucléotide en position 1432 jusqu'au nucléotide en position 2599 de la séquence SEQ ID N°5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'acide nucléique de séquence SEQ ID N°5 est représenté à la figure 1 , dans laquelle sont également détaillées les positions des différents exons et introns du gène DD1-a. 14
Il a été montré selon l'invention que le gène DD1-a est transcrit sous la forme d'un ARN messager qui a été partiellement isolé et caractérisé. Cet ARN messager comporte un cadre de lecture ouvert codant partiellement pour la protéine DD1-a. L'ADNc partiel du gène DD1-a a une longueur de 782 nucléotides et est référencé comme la séquence SEQ ID N°7 du listage de séquences.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°7, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°7 ou un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°7 ou un acide nucléique de séquence complémentaire. Fait également partie de l'invention un acide nucléique constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID N°7, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Le gène DD1-a code pour un polypeptide de 304 acides aminés de longueur possédant un degré d'identité en acides aminés d'environ 90% par rapport à la séquence en acides aminés du polypeptide codé par le gène DD1-b selon l'invention, après alignement des deux séquences.
Le polypeptide codé par l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°5 du gène DD1-a est référencé comme la séquence SEQ ID N°9 du listage de séquences. Ce polypeptide est aussi codé par l'ADNc résultant de la transcription du gène DD1-a.
En conséquence, l'invention est également relative à un acide nucléique codant pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°9. 15
L'invention a également trait à un acide nucléique caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide de séquence SEQ ID N°9.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique codant pour un « fragment » d'un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N°9.
L'invention concerne aussi un acide nucléique codant pour un fragment d'un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N°9. Un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec un polypeptide de référence comprend au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% au moins 99,5% d'identité en acides aminés avec le polypeptide de référence.
Sont englobés dans la définition d'un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec un polypeptide de référence selon l'invention, les polypeptides dits « variants ». Par « variants » d'un polypeptide selon l'invention, on entend un polypeptide dont la séquence en acides aminés comprend une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'au moins un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide de référence, étant entendu que les substitutions d'acides aminés peuvent être de nature conservative ou non conservative.
Un variant d'un polypeptide de référence selon l'invention consiste en un polypeptide qui conserve la fonction ou l'activité biologique du polypeptide de référence et/ou qui est reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide de référence. Ces variants polypeptidiques peuvent résulter de variations alléliques caractérisées par des différences dans les séquences nucléotidiques du gène codant pour ces polypeptides. De tels variants polypeptides peuvent aussi résulter d'épissages alternatifs ou de modifications post-traductionnels. Par « fragment » d'un polypeptide de référence selon l'invention, on entend un polypeptide possédant au moins 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ou 250 acides aminés consécutifs d'un polypeptide tel que défini dans la présente description.
ACIDES NUCLEIQUES DU GENE DD1-b 16
Comme indiqué précédemment, l'acide nucléique génomique du gène DD1-b selon l'invention, est référencé comme la séquence SEQ ID N°2 du listage de séquences. . Ainsi, l'invention concerne aussi un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°2, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique.
Elle a également trait à un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique défini ci-dessus.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique
SEQ ID N°2, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
La séquence génomique du gène DD1-b selon l'invention de séquence SEQ ID N°2 comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', les séquences suivantes: a) la séquence régulatrice du gène DD1-b permettant l'expression spécifique de ce gène dans la zone de transfert du grain en développement; b) une région nucléotidique dite « codante » comprenant les quatre exons et les trois introns du gène DD1-b ; et c) une région non codante localisée en aval de la région codante ci-dessus, et qui est susceptible de contenir des éléments de régulation additionnels du gène DD1-b.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs du polynucléotide de séquence SEQ ID N°2. La séquence régulatrice du gène DD1-b débute au nucléotide en position n°1 et se termine au nucléotide en position n°2816 de la séquence SEQ ID N°2. Cette séquence régulatrice est référencée comme la séquence SEQ ID N°4 du listage de séquences. 17
La séquence nucléotidique codante du gène DD1-b qui comprend l'ensemble des exons et des introns de ce gène est référencée comme la séquence SEQ ID N°6 du listage de séquences.
La séquence localisée en aval de la région codante du gène DD1-b débute au nucléotide en position 5459 et se termine au nucléotide en position 6128 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2.
Comme déjà mentionné, la séquence du gène DD1-b comprend 4 exons et 3 introns, dont les caractéristiques structurales sont détaillées respectivement dans les tableaux 3 et 4 ci-après.
TABLEAU 3 Séquences des exons du gène DD1-b
Figure imgf000019_0001
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide exonique du gène DD1-b, tels que les polynucléotides 1 à 4 décrits dans le tableau 3 ci-dessus, qui sont tous inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°2. L'invention concerne aussi un acide nucléique consistant en au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide exonique du gène
DD1-b .
Un tel acide nucléique code pour au moins une partie du polypeptide DD1-b et peut notamment être inséré dans un vecteur recombinant destiné à l'expression du produit de traduction correspondant dans une cellule hôte ou dans une plante transformée avec ce vecteur recombinant.
Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour la synthèse de sondes et d'amorces nucléotidiques destinées à la détection ou à 18
l'amplification de séquences nucléotidiques comprises dans le gène DD1-b dans un échantillon, le cas échéant de séquences du gène DD1-b portant une ou plusieurs mutations, préférentiellement une ou plusieurs mutations de nature à modifier le génotype d'une plante portant un tel gène DD1-b muté, par exemple en modifiant la régulation du transfert de métabolites de la plante mère vers l'albumen en développement ou encore en modifiant la régulation de la réponse de la plante à un stress biotique tel que l'infection par un pathogène des végétaux.
TABLEAU 4 Séquences des introns du gène DD1-b
Figure imgf000020_0001
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide intronique du gène DD1-b, tels que les polynucléotides 1 à 3 décrits dans le tableau 4 ci-dessus, qui sont tous inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°2.
Un tel acide nucléique peut être utilisé comme sonde ou amorce oligonucléotidique pour détecter la présence d'au moins une copie du gène DD1-b dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène DD1-b.
La séquence nucléotidique du gène DD1-b essentiellement restreinte à la région « codante » comprenant les quatre exons et les trois introns du gène est référencée comme la séquence SEQ ID N°6 du listage de séquence.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°6, ou avec un fragment de cette 19
séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention est également relative à un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°6, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique consistant en la séquence nucléotidique SEQ ID N°6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
La séquence nucléotidique SEQ ID N°6 comprend notamment les séquences suivantes: a) la séquence de l'exon 1 du gène DD1-b allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 197 de la séquence SEQ ID N°6; b) la séquence de l'exon 2 allant du nucléotide en position 925 jusqu'au nucléotide en position 1104 de la séquence SEQ ID N°6; c) la séquence de l'exon 3 allant du nucléotide en position 1303 jusqu'au nucléotide en position 1440 de la séquence SEQ ID N°6; d) la séquence de l'exon 4 allant du nucléotide en position 2300 jusqu'au nucléotide en position 2859 de la séquence SEQ ID N°6; e) la séquence de l'intron 1 du gène DD1-b allant du nucléotide en position 198 jusqu'au nucléotide en position 924 de la séquence SEQ
ID N°6; f) la séquence de l'intron 2 allant du nucléotide en position 1105 jusqu'au nucléotide en position 1302 de la séquence SEQ ID N°6; et g) la séquence de l'intron 3 allant du nucléotide en position
1441 jusqu'au nucléotide en position 2299 de la séquence SEQ ID N°6. En conséquence, l'invention a encore pour objet un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend l'une des séquences nucléotidiques suivantes: 20
a) la séquence allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 197 de la séquence SEQ ID N°6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire; b) la séquence allant du nucléotide en position 925 jusqu'au nucléotide en position 1104 de la séquence SEQ ID N°6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire; c) la séquence allant du nucléotide en position 1303 jusqu'au nucléotide en position 1440 de la séquence SEQ ID N°6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire; et d) la séquence allant du nucléotide en position 2300 jusqu'au nucléotide en position 2659 de la séquence SEQ ID N°6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Les séquences nucléotidiques des introns 1 , 2 et 3 du gène DD1-b ainsi que leurs acides nucléiques de séquences complémentaire font également partie de l'invention.
Il a été montré selon l'invention que le gène DD1-b est transcrit sous la forme d'un ARN messager qui a été isolé et caractérisé. Cet ARN messager comporte un cadre de lecture ouvert unique codant pour la protéine DD1-b d'une longueur de 286 acides aminés. De part et d'autre du cadre ouvert de lecture, cet ARN messager comprend respectivement une région 5' non traduite (5'-UTR) et une région 3' non traduite (3'-UTR).
L'ADNc correspondant au produit de transcription du gène DD1- b peut être défini comme la séquence SEQ ID N°8 du listage de séquences.
Un ADNc dérivé de l'ARN messager du gène DD1-b de séquence nucléotidique SEQ ID N°8 comprend respectivement: a) une séquence 5'-UTR allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 14 de la séquence SEQ ID N°8; b) une phase ouverte de lecture allant du nucléotide en position
15, la base A du codon d'initiation de la traduction ATG, jusqu'au nucléotide en position 875, base G du codon TAG d'arrêt de la traduction de la séquence nucléotidique SEQ ID N°8, et qui correspond à la séquence codante de l'ARN messager du gène DD1-b ; et 21
c) une région 3' UTR allant du nucléotide en position 876 jusqu'au nucléotide en position 1075 de la séquence SEQ ID N°8.
En conséquence, un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°8, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°8 ou un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention a également trait à un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 15 jusqu'au nucléotide en position 875 de la séquence SEQ ID N°8.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 15 jusqu'au nucléotide en position 875 de la séquence SEQ ID N°8. L'invention a encore pour objet un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°8 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID N°8, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Constitue aussi un objet de l'invention un acide nucléique défini par la séquence allant du nucléotide en position 15 jusqu'au nucléotide en position 875 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°8, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. Les séquences nucléotidiques génomiques SEQ ID N°2 et SEQ
ID N°6 ainsi que l'ADNc de séquence SEQ ID N°8 codent pour un polypeptide du gène DD1-b.
Il a été montré selon l'invention l'existence de variants polypeptidiques codés par le gène DD1-b, selon les souches de maïs desquelles ils proviennent, et qui possèdent entre eux environ 98% 22
d'identité en acides nucléiques et qui possèdent une longueur de 286 acides aminés.
De tels polypeptides variants n'induisent pas l'expression d'un phénotype particulier, par exemple de déficience dans le transfert de métabolites de la plante mère vers l'albumen en développement dans les plantes considérées. En conséquence, il est permis de considérer que les rares substitutions d'acides aminés rendant compte de différences entre les polypeptides codés par le gène DD1-b selon la plante considérée n'affectent pas la fonction ni l'activité biologique du polypeptide, l'ensemble des substitutions observées dans la séquence en acides aminés de 286 acides aminés de longueur pouvant ainsi définir un ensemble de polypeptides « variants » qui entrent dans la portée de la présente invention.
Les variants polypeptidiques codés par le gène DD1-b diffèrent entre eux exclusivement par une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé.
Ainsi, les produits de traduction du gène DD1-b forment un ensemble de polypeptides fortement homologues, cet ensemble de polypeptides étant défini comme la séquence SEQ ID N°10 du listage de séquences.
L'invention a donc encore pour objet un acide nucléique codant pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°10.
L'invention est également relative à un acide nucléique codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID N°10.
Un premier variant polypeptidique particulier codé par le gène DD1-b est référencé comme la séquence SEQ ID N°11 du listage de séquences. Ce premier variant polypeptidique est codé par le génome de la souche de maïs désignée HD5 x HD7. Un second variant polypeptidique particulier codé par le gène
DD1-b est référencé comme la séquence SEQ ID N°12 du listage de séquences. Ce second variant polypeptidique est codé par le génome de la souche de maïs désignée A188. 23
En conséquence, l'invention a encore pour objet un acide nucléique codant pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°11.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID N°11.
Fait aussi partie de l'invention un acide nucléique codant pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°12.
Constitue un autre objet de l'invention un acide nucléique codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID N°12.
L'invention concerne aussi un acide nucléique codant pour un « fragment » peptidique d'un polypeptide choisi parmi les polypeptides de séquence en acides aminés SEQ ID N°10 à 12.
REGION REGULATRICE DES GENES DD1-a et DD1-b
On a montré selon l'invention que les régions régulatrices des gènes DD1-a et DD1-b ont la capacité de diriger l'expression de ces gènes spécifiquement dans les cellules de la zone de transfert du grain en développement. Les propriétés de contrôle d'une expression spécifique de tissu d'un gène d'intérêt qui caractérisent les régions régulatrices des gènes DD1-a et DD1-b, peuvent donc être mises à profit pour diriger l'expression d'acides nucléiques autres que les acides nucléiques contenant les phases de lecture ouvertes respectivement des gènes DD1-a et DD1-b.
Ainsi, les séquences régulatrices des gènes DD1-a et DD1-b, ainsi que des fragments « biologiquement actifs » de ces dernières, peuvent être utilisés pour construire des cassettes d'expression contenant un gène d'intérêt placé sous le contrôle de l'une quelconque de ces séquences régulatrices dans le but d'exprimer spécifiquement ledit gène d'intérêt dans les cellules de la zone de transfert du grain en développement.
La séquence régulatrice du gène DD1-a, qui est comprise dans la séquence SEQ ID N°1, est référencée comme la séquence SEQ ID N°3 du listage de séquences. 24
La séquence régulatrice du gène DD1-b selon l'invention, qui est comprise dans la séquence SEQ ID N°2, est référencée comme la séquence SEQ ID N°4 du listage de séquences.
La figure 5 représente la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 selon l'invention. Sur cette figure, les différents motifs structuraux caractéristiques d'une séquence régulatrice sont indiqués par des boîtes précisant la désignation de chacun des motifs identifiés par le demandeur.
La figure 6 représente la séquence SEQ ID N°4 selon l'invention. Sur cette figure, les motifs structuraux caractéristiques d'une séquence régulatrice sont représentés par des boîtes contenant les désignations de chacun des motifs structuraux identifiés par le demandeur.
La séquence SEQ ID N°3 comprend une boîte « TATA » localisée du nucléotide en position n°3518 jusqu'au nucléotide en position 3524 de la séquence SEQ ID N°3.
La séquence SEQ ID N°4 comprend une boîte « TATA » localisée du nucléotide en position 2736 jusqu'au nucléotide en position 2742 de la séquence SEQ ID N°4. Le demandeur a également identifié la présence de répétitions directes dans chacune des séquences régulatrices SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4, notamment d'une séquence répétée désignée « R6 » de 33 paires de bases présente au nombre de sept copies dans la séquence régulatrice SEQ ID N°3 du gène DD1-a et au nombre de sept copies dans la séquence régulatrice SEQ ID N°4 du gène DD1-b.
La position du nucléotide de départ de chacune des séquences répétées R6 dans les séquences SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4 sont représentées dans le tableau 5 ci-après.
25
Tableau 5
Figure imgf000027_0001
Les séquences régulatrices SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4 des gènes DD1-a et DD1-b selon l'invention comprennent quelques motifs constitués de séquences répétées inverses, respectivement des séquences du type « STEM-LOOP » ainsi que des séquences
« PALINDROMIQUES ».
Les structures de type « STEM-LOOP » sont représentées dans le tableau 6 ci-après.
26
Tableau 6
Figure imgf000028_0001
La région autour de IR1 n'est pas conservée entre les promoteurs DD1-a et DD1-b. La séquence IR1-L est elle-même une structure « stem-loop » composée de IR1A-L et IR1A-R. De même, IRI-R est un « stem-loop » entre IR1B-L et IR1B-R. La structure de type « STEM-LOOP » IR7 contient dans le « loop » la répétition R6 décrite ci- avant. Elle contient dans le « stem » le palindrome IR6 décrit ci-dessous ainsi que la boîte TATA.
Les structures de type « PALINDROMIQUES » de chacune des séquences SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4 selon l'invention sont décrites dans le tableau 7 ci-dessous. 27
Tableau 7
Figure imgf000029_0001
En outre, plusieurs éléments régulateurs cis potentiels ont été identifiés dans chacune des séquences SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4 à la fois. Ces éléments cis sont détaillés respectivement dans les tableaux 8 et 9 ci-dessous.
Par une étude d'homologie de séquences avec les données de séquences répertoriées dans la base de donnée PLACE, le demandeur a identifié des éléments structuraux caractéristiques de certaines séquences régulatrices, telles que représentées dans le tableau 8 ci- dessous.
28
Tableau 8
Figure imgf000030_0001
Le motif BOXIINTPATPB est retrouvé dans de nombreux promoteurs végétaux, y compris dans le promoteur du gène atpB du tabac et différents autres gènes de plastide végétaux, ce motif étant décrit notamment dans l'article de KAPOOR et al. (1999).
Le motif CCAATBOX1 constitue une séquence commune retrouvée dans les régions non codantes localisées du côté 5' de nombreux gènes eukaryotes .
Le motif DOFCOREZM possède un site de reconnaissance pour les protéines Dof de maïs. Les protéines Dof sont des protéines se liant à l'ADN possédant potentiellement un unique motif en doigt de zinc . 29
Le motif DOFCOREZM est décrit notamment par YANAGISAWA et al., (1999).
Le motif DPBFCORECDC3 est une classe particulière de facteur de transcription de type ZIP, retrouvé notamment dans la séquence promotrice du gène Dc3 de la carotte, dont l'expression est spécifique de l'embryon. Le motif DPBFCORECDC3 est notamment décrit par KIM et al. (1997).
Le motif EBOXNNAPA est retrouvé dans la séquence régulatrice d'un gène de protéine de stockage de Brassica napus et est décrit par exemple par STALBERG et al. (1996).
Le motif IBOX est une séquence conservée retrouvée en amont des gènes régulés par la lumière. Un tel motif a été notamment retrouvé dans la région promotrice du gène rbcS chez la tomate et chez
Arabidopsis. Le motif IBOX est notamment décrit par GIULIANO et al. (1998) et par DONALD et al. (1990).
Le motif MYBCORE est un site de fixation pour les protéines MYB, ATMYB1 et ATMYB2, toutes isolées chez Arabidopsis. La protéine ATMYB2 est impliquée dans la régulation de gènes sensibles à un stress hydrique chez Arabidopsis. Une protéine MYB de pétunia, la protéine MYB.Ph3 est impliquée dans la régulation de la biosynthèse des flavonoïdes comme décrit par SOLANO et al., (1995).
Le motif MYBCORE est décrit notamment par LUSCHER et al; (1990), par URAO et al. (1993) et par SOLANO et al. (1995).
Le motif POLLEN 1LELAT52 constitue l'un des deux éléments régulateurs responsables de l'activation spécifique du pollen chez la tomate du gène Iat52. Un tel motif structural est notamment décrit par BATE et al; (1998).
Le motif ROOTMOTIFTAPOX1 est retrouvé à la fois dans les promoteurs du gène rolD et du gène de la peroxydase POX1 spécifique des racines de blé. Un tel motif structural est notamment décrit par ELMAYAN et al. (1995). 30
Par une étude d'homologie de séquence entre les séquences nucléotidiques SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4 selon l'invention d'une part, et d'autre part les séquences répertoriées dans la base de données CARE, le demandeur a identifié des motifs caractéristiques supplémentaires dans les séquences régulatrices des gènes DD1-a et DD1-b, qui sont détaillés dans le tableau 9 ci-après.
Tableau 9
Figure imgf000032_0001
Les motifs structuraux du tableau 9 ci-dessus sont précisés ci- après.
Le motif AT~TCT constitue une partie d'une séquence d'ADN conservée du gène gabB impliqué dans la réponse à la lumière. Un tel motif structural est par exemple décrit par KWON et al. (1994).
Le motif GM~CAAT-box est un élément agissant en cis qui est retrouvé communément dans les régions promotrices et activatrices (« enhancer ») .
Le motif structural OS~TATC-box est un élément agissant en cis impliqué dans la réponse à la gibberelline, qui est décrit notamment par TAKAIWA et al. (1991). 31
Le motif PC~chs-CMA2a est la partie d'un module d'ADN conservé chs impliqué dans la réponse à la lumière, qui est notamment décrit par HERMANN et ai. (1988).
Le motif ZM~TATA-box est l'élément promoteur proprement dit localisé en général à une distance d'environ 30 bases du site d'initiation de la transcription. Un tel motif structural est notamment décrit par SHEEN et al. (1991).
En conséquence, l'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°3, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention a également pour objet un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°3, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention est également relative à un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°3. L'invention a également trait à un acide nucléique constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID N°3.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
Constitue un autre objet de l'invention un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité. 32
L'invention a également trait à un acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ainsi qu'un acide nucléique constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4.
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant un polynucléotide régulateur de l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt chez une plante, ledit polynucléotide régulateur comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique. Par « fragment » d'un acide nucléique de l'une des séquences régulatrices du gène DD1-a ou DD1-b selon l'invention, on entend une séquence nucléotidique d'une longueur en bases inférieure à celle de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 et conservant la capacité à diriger l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans une plante. De manière tout à fait préférée, un fragment d'un acide nucléique régulateur selon l'invention consiste en une séquence nucléotidique d'une longueur en bases inférieure à celle de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 et conservant la capacité à diriger l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans les cellules de la zone de transfert du grain en développement.
L'activité biologique d'un fragment d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 régulateur selon l'invention peut être aisément vérifiée par l'homme du métier, notamment à l'aide des constructions de vecteurs et des procédés de transformation de plantes avec ces derniers, tels que décrits dans les exemples de la présente description.
A titre illustratif, un fragment d'un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être obtenu par coupure enzymatique de l'un des acides nucléiques décrits ci-dessus, de manière préférée d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4, à l'aide d'une exonucléase ou encore d'une endonucléase de restriction. 33
Notamment, un fragment d'un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être obtenu par exemple par déiétion d'un ou plusieurs nucléotides du polynucléotide de séquence SEQ ID N°3 OU SEQ ID N°4 à l'aide de la technique à l'exonucléase III, telle que décrite par exemple par AUSUBEL et al. (1989).
Un fragment d'un acide nucléique régulateur selon l'invention a avantageusement une longueur d'au moins 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000, 1200, 1500, 2000 ou 2500 nucléotides, ou encore paires de bases (bp), s'il se présente sous la forme double brin. Pour la mise en oeuvre d'enzymes de restriction aux fins d'obtenir des fragments d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de SAMBROOK et al. (1989).
Un fragment d'un acide nucléique régulateur selon l'invention pourra également être préparé par amplification spécifique du fragment d'intérêt à l'aide d'un couple d'amorces encadrant, respectivement du côté 5' et du côté 3', la séquence d'intérêt, par exemple à l'aide de la méthode PCR, telle que décrite notamment dans les brevets américains n°US 4.683.195, US 4.683.202 et US 4.965.188. Par exemple, l'homme du métier peut obtenir un fragment de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-a de séquence SEQ ID N°3 par amplification de la séquence SEQ ID N°3 à l'aide de la paire d'amorces de séquences respectives SEQ ID N°13 et SEQ ID N°17, ou encore avec la paire d'amorces de séquences respectives SEQ ID N°14 et SEQ ID N°17.
L'homme du métier peut obtenir un fragment d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-b de séquence SEQ ID N°4 en mettant en oeuvre une paire d'amorces respectivement de séquences SEQ ID N°15 et SEQ ID N°17 ou encore une paire d'amorces de séquences respectives SEQ ID N° 16 et SEQ ID N° 17. 34
Des fragments d'un acide nucléique régulateur de séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 selon l'invention comprennent de préférence au moins l'une des boîtes « TATA » référencées pour chacune de ces séquences dans le tableau 9 ci-dessus, et encore plus préférentiellement les trois boîtes « TATA » référencées dans ce tableau.
L'intérêt d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou DD1-b selon l'invention, comprenant la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4, ou encore un fragment de l'une de ces séquences, est d'inclure cet acide nucléique régulateur dans une construction d'ADN, ou cassette d'expression, comprenant également un polynucléotide d'intérêt dont l'expression spécifique est recherchée dans les cellules de la zone de transfert du grain.
L'invention a donc encore pour objet un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur tel que défini ci-dessus. Un tel acide nucléique peut être appelé « cassette d'expression ».
L'invention concerne encore un acide nucléique comprenant un polynucléotide régulateur tel que défini ci-avant, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence nucléotidique d'intérêt fonctionnellement associée au polynucléotide régulateur.
De manière générale, la séquence nucléotidique d'intérêt peut être toute séquence codant pour une protéine dont l'expression est recherchée dans une plante ou encore toute séquence codant pour un acide nucléique sens ou un acide nucléique antisens.
Dans un mode de réalisation préféré, la séquence nucléotidique d'intérêt code pour une protéine impliquée dans le transfert de métabolites vers l'albumen en développement d'un grain de plante.
L'invention a donc aussi pour objet l'utilisation d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b tel que défini ci- dessus dans des constructions nucléotidiques destinées à améliorer la 35
qualité agronomique, alimentaire ou industrielle d'une plante, en contrôlant notamment la taille et/ou le développement de l'albumen du grain.
On peut par exemple rechercher une augmentation de la teneur en lysine et ainsi modifier qualitativement la composition en protéines de l'albumen. On peut aussi rechercher une modification du rapport amylose/amylopectine afin de modifier la qualité de l'amidon stocké dans l'albumen, ou encore une augmentation de la teneur en amidon et augmenter ainsi la taille de l'albumen par rapport à l'embryon. Par la transformation de plantes avec de telles constructions nucléotidiques, on peut également rechercher une action précoce et spécifique sur le développement des tissus de l'albumen en utilisant, en tant que séquence nucléotidique d'intérêt, une séquence dérivée d'un gène stimulateur (p. ex. hormone telle qu'une cytokinine ou une auxine). L'expression d'une hormone sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou DD1-b chez une plante peut permettre de modifier les processus de cellularisation et, de façon corrélée, le développement de l'albumen (SCOTT et al., 1998).
On peut aussi utiliser des séquences nucléotidiques d'intérêt dérivées de gènes codant pour des transporteurs de nutriments (notamment des sucres) à l'interface plante/albumen, ou encore dérivées de gènes codant pour des inhibiteurs de ces transports, en vue d'une accumulation différentielles de nutriments dans l'albumen.
On peut également utiliser des séquences nucléotidiques d'intérêt codant pour des protéines d'intérêt thérapeutique, telle que l'hémoglobine ou le Facteur VIII.
Des exemples illustratifs, mais non limitatifs, de séquences nucléotidiques d'intérêt pouvant être placées sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur des gènes DD1-a ou DD1-b selon l'invention sont présentés ci-dessous. 36
Séquences nucléotidiques d'intérêt placées sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention a) Métabolisme des sucres De manière générale, la séquence nucléotidique d'intérêt peut coder pour l'une quelconque des enzymes impliquées dans le stockage des sucres dans l'albumen, telles que l'invertase, la saccharose phosphate synthase, la saccharose synthase, PUDP-glucose pyrophosphorylase, l'ADP-glucose pyrophosphorylase, la " starch branching enzyme " ou la " starch synthase ".
La séquence nucléotidique d'intérêt peut aussi coder pour un transporteur de sucrose ou un transporteur d'hexose dans la zone de transfert BETL afin d'améliorer soit le transfert des assimilats soit d'augmenter la teneur en hexose dans l'endosperme ou bien dans la zone de transfert elle-même. Dans ce dernier cas, il peut y avoir un accroissement de l'activité mitotique via une stimulation du cycle cellulaire, notamment parce que les promoteurs DD1-a et DD1-b sont très précoces. Des séquences codant pour des transporteurs de sucres sont par exemple celles codant pour le transporteur symplastique H+ de sucrose (AOKI et al., 1999) ou pour divers transporteurs de monosaccharides décrits dans la base de données Est ZmDB (GAI et al., 2000).
La séquence nucléotidique d'intérêt peut aussi coder pour une hexokinase telle que décrite par JANG et al., (1997) afin d'améliorer le remplissage du grain.
L'utilisation de l'invertase (EC 3.2.1.26) permettrait un clivage plus efficace du saccharose en glucose et fructose et serait susceptible d'augmenter la vitesse de transport et aussi de favoriser l'obtention de grains plus gros, puisqu'il est observé que des plantes mutantes pour cette enzyme possède des grains très petits. On peut utiliser une 37
séquence codant pour une invertase pariétale ou pour une invertase soluble. On peut par exemple utiliser les séquences dérivées des gènes Inc W1 (N° d'accès AF050129 de la base de données GenBank), Inc W2 (N° d'accès AF050128), Inc W3 (N° d'accès AF043346 et AF 043728), Inc W4 (N° d'accès AF 043347), Ivr1 (N° d'accès U16123 et AF171874) ou encore celle référencée sous le N° d'accès Y16262.
L'utilisation de la saccharose synthase (E.C. 2.4.1.13) permettrait d'induire une augmentation de la consommation du saccharose dans l'albumen et devrait ainsi diminuer son transport vers l'embryon et réduire la taille de ce dernier et augmenter la taille de l'albumen. Ont peut par exemple utiliser les séquences dérivées des gènes Sh1 (N° d'accès X02382 et X02400 de la base de données GenBank) ou Sus1 (N° d'accès L33244 et L22296).
b) Protéines du cycle cellulaire
On peut induire une augmentation de la division cellulaire localisée dans la zone de transfert par l'utilisation, en tant que séquence nucléotidique d'intérêt, de certaines cyclines, en particulier la cycline D2 décrite par (COCKROFT et al. , 2000), ou encore la cycline D3, en vue d'obtenir un meilleur remplissage du grain.
c) Protéines de réserve
Afin d'augmenter la teneur en différents acides aminés, tels que la lysine ou encore les acides aminés soufrés comme la cystéine et la méthionine, il serait possible de favoriser le transport (flux) de ces acides aminés ou précurseurs de ces acides aminés vers l'albumen à l'aide de séquences nucléotidiques d'intérêt codant pour des transporteurs ou des perméases d'acides aminés, tels que par exemple les perméases de la lysine (CHEN et BUSCH, 1999) et les perméases de la méthionine 38
(FISCHER et al., 1998). On peut aussi utiliser une séquence codant pour un transporteur de soufre afin d'augmenter la synthèse d'acides aminés soufrés par les cellules de l'albumen et conduire ainsi à un accroîssement de la teneur en ces acides aminés. Des séquences codant pour un transporteur de soufre sont par exemple décrites par HAWKESFORD et al. (2000).
On peut aussi mettre en oeuvre des séquences nucléotidiques d'intérêt codant pour des transporteurs de certains ions ou encore codant pour la ferritine.
d) Protéines de défense
La séquence nucléotidique d'intérêt peut aussi coder pour une protéine impliquée dans la résistance aux maladies, telles que les chitinases (demande PCT N°WO 92/01792), les glucanases (demande PCT N°WO 93/02197), l'oxalate oxydase (demande PCT N° WO 94/13790) ou encore les peptides anti-bactériens et/ou antifongiques, en particulier des peptides de moins de 100 acides aminés riches en cystéine comme les thionines ou les défensines de plantes, et plus particulièrement les peptides lytiques de toutes origines comprenant un ou plusieurs ponts disulfures entre les cystéines et des régions comprenant des acides aminés basiques, notamment les peptides lytiques suivants: l'androctonine (demande PCT N°WO 97/30082 et demande PCT/FR 98/01814 déposée le 18 Août 1998) ou la drosomicine (demande n°PCT/FR 98/01462 déposée le 8 Juillet 1998). La séquence nucléotidique d'intérêt peut aussi coder pour une protéine ou un peptide choisi parmi les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicithines (KAMOUN et al., 1993; PANABIERES et al., 1995).
Une protéine de défense d'intérêt peut également être un peptide antimicrobien du type thionine, défencine, knottine, ou une protéine de transfert lipidique (BROEKAERT et al., 1997). Il peut s'agir 39
aussi d'un peptide antifongique PAFP-s de Phytolacca Americana (FENG-SHAO et al., 1999).
e) Molécule signal/métabolisme des hormones
La séquence nucléotidique d'intérêt peut aussi coder pour une molécule signale telle que le gène IPT de l'isopentenyl transferase (HEIDEKAMP et al., 1983).
On peut aussi utiliser des séquences des gènes rolC et iaa en vue de la surexpression d'auxine qui stimule aussi la division cellulaire.
On peut également mettre en oeuvre des séquences codant pour des molécules ligands, telles que la protéine CLAVATA 3
Figure imgf000041_0001
f) Autres séquences nucléotidiques d'intérêt
On peut utiliser les séquences des gènes Esr (« embryo surrounding région ») décrits par OPSAHL-FERSTAD et al. (1997) qui sont exprimées spécifiquement dans la région entourant l'embryon et dont une régulation (surexpression ou sous-expression) au niveau de la zone des cellules de transfert pourrait influer sur la taille de l'endosperme ou de son développement.
On peut aussi mettre en oeuvre des séquences mutées ou tronquées des gènes du type polycomb telles que les séquences MEDEA, FIS et FIE (MA, 1999) qui participent au contrôle du développement de l'endosperme avant fécondation et qui interviennent dans la configuration de la chromatine et peuvent ainsi avoir une relation avec le niveau de méthylation de cette dernière. La surexpression de gène du type polycomb muté ou encore l'inhibition de l'expression de tels gènes par des oligonucleotides antisense puissent conduire à un 40
développement plus important de la zone BETL et donc à un meilleur remplissage.
On peut également utiliser des séquences nucléotidiques d'intérêt codant pour des protéines cytotoxiques telles que la barnase ou la toxine diphtérique afin de détruire spécifiquement un tissu, en l'occurence la zone de transfert, et d'utiliser les faits sur le développement du grain, notamment sur le développement de l'embryon en l'absence de la zone de transfert.
SONDES ET AMORCES SELON L'INVENTION
Les acides nucléiques selon l'invention, et en particulier les séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 à SEQ ID N°8, leurs fragments d'au moins 12 nucléotides, les séquences ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec au moins une partie des séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°8, ainsi que les acides nucléiques de séquence complémentaire, sont utiles pour la détection dé la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique du gène DD1-a ou du gène DD1-b ou encore d'un fragment ou d'un variant allélique de cette dernière dans un échantillon.
Font également partie de l'invention les sondes et amorces nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°8. Par conditions d'hybridation de forte stringence, au sens de l'invention, on entend les conditions d'hybridation suivantes:
Préhvbridation: mêmes conhditions que pour l'hybridation durée: 1 nuit. 41
Hybridation:
5 x SSPE (0.9 M NaCI, 50 mM phosphate de sodium pH 7.7, 5 mM EDTA)
5 x Denhardt's (0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0.2% SAB) 100 μg/ml ADN de sperme de saumon
0.1% SDS durée: 1 nuit. Lavages:
2 x SSC, 0.1% SDS 10 min 65°C 1 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C
0.5 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C
0.1 x SSC, 0.1% SDS 10 min 65°C.
Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 360 bases, Tm est définie par la relation:
Tm= 81 ,5 + 0,41 (%G+C)+16,6 Log (concentration en cations) - 0,63 (% formamide)-(600/nombre de bases) (SAMBROOK et al., (1989), pages 9.54-9.62).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation: Tm= 4(G+C) + 2(A+T).
Dans des conditions de stringence appropriées, dans lesquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30°C, de préférence de 5 à 10°C en- dessous de Tm.
Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon les techniques connues de l'homme du métier. 42
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (1989).
Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier d'un acide nucléique de séquences SEQ ID N°1 à 8 ou de sa séquence complémentaire, d'un acide nucléique ayant 80% d'identité en nucléotide avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 à 8 ou de sa séquence complémentaire ou encore d'un acide nucléique hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 à 8 ou de sa séquence complémentaire. De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention auront une longueur d'au moins 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier un fragment d'acide nucléique du gène DD1-a ou DD1-b de séquence respective SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2 sont par exemple les amorces SEQ ID N°13 à 17 et 20 à 25.
Le couple d'amorces SEQ ID N°13 et SEQ ID N°17 permet d'amplifier un fragment d'environ 3 kb contenu dans la séquence régulatrice du gène DD1-a de séquence SEQ ID N°3. 43
Le couple d'amorces SEQ ID N°14 et SEQ ID N°17 permet d'amplifier un acide nucléique d'environ 1 kb contenu dans la séquence régulatrice du gène DD1-a de séquence SEQ ID N°3.
Le couple d'amorces SEQ ID N°15 et SEQ ID N°17 permet l'amplification d'un acide nucléique d'environ 2,5 kb contenu dans la séquence régulatrice du gène DD1-b de séquence SEQ ID N°4.
Le couple d'amorces de séquences SEQ ID N°16 et SEQ ID N°17 permet l'amplification d'un acide nucléique d'environ 1 ,6 kb contenu dans la séquence régulatrice du gène DD1-b de séquence SEQ ID N°4. L'utilisation des amorces de séquences SEQ ID N°20 à 25 dans des réactions d'amplification est décrite à l'exemple 1.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode au diéthylphosphoramidites de BEAUCAGE et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen n°EP 0 707 592. Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant une molécule détectable, c'est-à-dire un marqueur détectable, par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques. Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5- bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'. 44
Des exemples de marquage non radioactif de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n°FR 78 10 975 ou encore dans les articles de URDEA et al. (1988) ou SANCHEZ PESCADOR et al. (1988). De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par URDEA et al; (1991) ou encore dans le brevet européen n°EP 0 225 807 (Chiron).
Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique du gène DD1-a ou du gène DD1-b ou encore dans des hybridations à l'ARN messager de l'un quelconque des deux gènes lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon. Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
Une sonde particulière selon l'invention est par exemple la sonde de séquence SEQ ID N°26 ou encore la sonde de séquence SEQ ID N°29.
Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de micro-titration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des bandes de nitrocellulose ou encore des microparticules telles que des particules de latex.
En conséquence, l'invention a encore pour objet un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il comprend au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, en particulier d'un acide nucléique de séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 à SEQ ID N°8. 45
L'invention est également relative à un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il consiste en un polynucléotide d'au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, de manière tout à fait préférée d'un acide nucléique de séquences choisies parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 à SEQ ID N°8.
Un tel acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce est par exemple l'acide nucléique comprenant et/ou consistant dans un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N°13 à SEQ ID N°17.
Comme décrit ci-dessus, un tel acide nucléique peut en outre être caractérisé en ce qu'il est marqué par une molécule détectable.
Un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique pour la détection ou l'amplification d'une séquence génomique, de l'ARNm ou de l'ADNc du gène DD1-a peut en outre être caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences suivantes: a) les séquences nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°1; et b) les séquences comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°1.
Selon un autre aspect, un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique pour la détection ou l'amplification d'une séquence génomique, de l'ARNm ou de l'ADNc du gène DD1-b, peut être caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences suivantes: a) les séquences nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°2; et b) les séquences comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°2. 46
La présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique du gène DD1-a ou DD1-b dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de:
1) mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester;
2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support.
Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant: a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que décrites ci- dessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation. Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support. Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable. Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci-dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui vont être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt du gène DD1-a ou du gène DD1- b ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes du gène DD1-a ou DD1-b, plus 47
particulièrement des acides nucléiques de séquence SEQ ID N°1 à SEQ
ID N°8 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
On entend par « séquence cible » au sens de l'invention, une séquence nucléotique comprise dans un acide nucléique, ladite séquence nucléotidique hybridant, dans les conditions d'hybridation spécifiées dans la description, avec une sonde ou une amorce nucléotique de l'invention.
Une séquence cible peut être par exemple une séquence comprise dans un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou DD1-b ou encore une séquence comprise dans une région codante génomique ou de l'ADNc de l'un ou l'autre de ces gènes ou encore une séquence commune aux gènes DD1-a ou DD1-b.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier un fragment nucléotidique quelconque (ADNg, ADNc, ARNm) du gène DD1-a ou du gène DD1-b, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquence SEQ ID
N°1 à SEQ ID N°8, ou encore un fragment ou un variant de ces séquences.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 à SEQ
ID N°8 ou un fragment ou un variant allélique de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible du gène
DD1-a ou du gène DD1-b dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification; et b) détection de l'acide nucléique éventuellement amplifié. 48
Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification tel que défini ci-dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques décrites ci-après.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID N°1 à 8, ledit nécessaire ou kit comprenant: a) un couple d'amorces nucléotidiques conforme à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'acide nucléique cible du gène DD1-a ou du gène DD1-b dont l'amplification est recherchée; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telle que décrite ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent tout ou partie d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N°13 à SEQ ID N° 17.
VECTEURS RECOMBINANTS SELON L'INVENTION
Selon encore un autre aspect, l'invention concerne des vecteurs recombinants de clonage et/ou d'expression comprenant l'un quelconque des acides nucléiques définis ci-dessus.
VECTEURS RECOMBINANTS COMPRENANT UN ACIDE NUCLEIQUE REGULATEUR DU GENE DD1-a OU DU GENE DD1-b.
Un autre objet de l'invention consiste en des vecteurs recombinants dans lesquels a été insérée une séquence régulatrice du 49
gène DD1-a ou du gène DD1-b ou encore un fragment d'une telle séquence régulatrice, telle que les fragments définis dans la présente description.
Avantageusement, un vecteur recombinant selon l'invention pourra comprendre un acide nucléique régulateur de séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ou encore un fragment de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 capable de diriger l'expression d'un gène d'intérêt placé sous son contrôle dans les cellules d'une plante, et de manière tout à fait préférée dans les cellules de la zone de transfert d'un grain en développement.
Font ainsi partie de l'invention des vecteurs recombinants pour l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans la zone de transfert d'un grain de végétal en développement comprenant: a) un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b tel que défini dans la présente description; et b) un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur défini en a).
Préférentiellement, le polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de l'acide régulateur du gène DD1-a ou DD1-b est un acide nucléique codant pour une protéine impliquée dans le transfert de métabolites vers l'albumen en développement d'un grain de plante.
Les polynucléotides d'intérêt préférés ont été décrits précédemment dans la description.
Le polynucléotide d'intérêt peut consister en un polynucléotide codant pour un polypeptide détectable, ou polypeptide marqueur tel par exemple un polynucléotide codant pour la protéine GUS ou encore pour une protéine fluorescente, telle que la protéine GFP (Green Fluorescent
Protein) ou YFP (Yellow Fluorescent Protein).
Un vecteur qui peut être mis en oeuvre pour l'introduction d'un acide nucléique régulateur selon l'invention capable de contrôler un polynucléotide d'intérêt est le plasmide L127a5 représenté à la figure 7; 50
Des vecteurs recombinants dans lesquels ont été introduits un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b selon l'invention localisés en amont d'un polynucléotide d'intérêt sont par exemple le vecteur recombinant L246a représenté à la figure 8, le vecteur L246b représenté à la figure 9, le vecteur L247a représenté à la figure 10 et le vecteur L247b représenté à la figure 11.
Le vecteur L246a comprend un acide nucléique d'environ 3 kb de la séquence régulatrice du gène DD1-a localisé en amont du gène rapporteur GUS. Le vecteur L246a est contenu dans la souche de Escherichia coli déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le n° d'accès 1-2567.
Le vecteur recombinant L246b comprend un acide nucléique régulateur d'environ 1 kb du gène DD1-a, plus précisément un acide nucléique allant du nucléotide en position 2585 jusqu'au nucléotide en position 3595 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°3.
Le vecteur L 247a contient un acide nucléique régulateur d'environ 2,5 kb du gène DD1-b. Le vecteur L247a est contenu dans la souche de Escherichia coli déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le n° d'accès I-2568. Le vecteur L247b comprend un acide nucléique régulateur d'environ 1 ,6 kb de la séquence du gène DD1-b, plus précisément un acide nucléique régulateur allant du nucléotide en position 1204 au nucléotide en position 2813 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4.
L'invention a encore pour objet un vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les vecteurs L246a, L246b, L247a et L247b. Pour l'ensemble des vecteurs L246a, L246b, L247a et L247b, l'acide nucléique régulateur du gène DD1-a et du gène DD1-b est localisé en amont du gène marqueur GUS, dont il contrôle l'expression.
VECTEURS RECOMBINANTS CONTENANT UN ACIDE
NUCLEIQUE CODANT POUR UN POLYPEPTIDE SELON L'INVENTION. 51
Un autre objet de l'invention, consiste en un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression contenant une séquence codante du gène DD1-a ou du gène DD1-b, placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice appropriée fonctionnelle dans l'organisme hôte dans lequel l'expression d'un polypeptide selon l'invention est recherchée.
Il a été montré selon l'invention qu'un polypeptide codé par le gène DD1-a ou le gène DD1-b est exprimé spécifiquement dans les cellules de la zone de transfert du grain en développement et est ainsi susceptible d'être impliqué dans le transfert des métabolites de la plante mère vers l'albumen, ou encore d'être impliqué dans la défense de la plante envers divers pathogènes végétaux, de constituer un signal pour le développement de l'albumen et/ou de l'embryon comme c'est le cas des gènes codant pour les protéines BETL1 à BETL4 décrits par HUEROS et al. (1999b).
Ainsi, l'invention a encore pour objet un vecteur d'expression recombinant comprenant: a) un acide nucléique régulateur de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans un organisme hôte déterminé; et b) un polynucléotide d'intérêt codant pour un polypeptide selon l'invention, préférentiellement un acide nucléique de séquences SEQ ID N°1, 2, 5, 6) 7 ou 8.
Afin d'améliorer la qualité ou la quantité des métabolites présents dans l'albumen du grain mature, ou encore d'augmenter la résistance d'une plante à divers pathogènes végétaux, il est donc utile de surexprimer un acide nucléique codant pour un polypeptide codé par le gène DD1-a ou par le gène DD1-b.
Le cas échéant, la séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention peut être une séquence régulatrice inductible par un métabolite particulier, tel que: 52
- une séquence régulatrice inductible par les glucocorticoïdes telle que décrite par AOYMA et al. (1997) ou telle que décrit par McNELLYS ét al. (1998);
- une séquence régulatrice inductible par l'éthanol, telle que celle décrite par SALTER et al. (1998) ou encore telle que décrite par
KADDICK et al; (1998);
- une séquence régulatrice inductible par la tétracycline telle que celle commercialisée par la Société CLONTECH.
La séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention peut comprendre un promoteur constitutif, tel que:
- le promoteur 35S, ou avantageusement le promoteur constitutif double 35S (pd35S) du CaMV, décrits dans l'article de KAY ET6 AL (1987);
- le promoteur actine du riz suivi de l'intron actine de riz (PAR- LAR) contenu dans le plasrηide pAct-1-F4 décrit par McELROY et- al. (1991);
- le promoteur pUbil du gène codant- pour l'ubiquitine 1 de maïs (CHRISTENSEN et al., (1992).
La séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention peut aussi diriger une expression de l'acide nucléique d'intérêt spécifiquement dans certains tissus, comme la graine, la feuille ou la racine. Il peut s'agir notamment des séquences régulatrices suivantes:
- un promoteur tissu spécifique comme le promoteur HMWG de blé ou d'orge, ou encore le promoteur pCRU du gène de la cruciférine de radis, qui permettent tous trois une expression de la protéine d'intérêt dans les graines (ROBERTS et al. (1989) ; ANDERSON O.D. et al. (1989); DEPIGNY-THIS et al.(1992); 53
- les promoteurs PGEA1 et PGEA6 correspondant à la région 5' non codante des gènes de la protéine de résente de graines, GEA1 et GEA6 respectivement ô' Arabidopsis thaliana (GAUBIER et al., (1993) et permettant une expression spécifique dans les graines; - le promoteur du gène de zéine de maïs (Pzéine) contenu dans le plasmide p63, et permettant l'expression dans l'albumen des semences de maïs (REINA et al., 1990);
- des promoteurs spécifiques de régions ou de tissus particuliers des plantes, et plus particulièrement des promoteurs spécifiques des graines (DATLA, R. et al., 1997), notamment les promoteurs de la napine (EP 255 378), de la phaseoline, de la glutenine, de l'héliantinine (WO 92/17580), de l'albumine (WO 98/45460), de l'oélosine (WO 98/45461), de IΑTS1 ou de IΑTS3 (PCT/US 98/06978, déposée le 20 Octobre 1998, incorporée ici par référence); - promoteurs spécifiques des tissus feuilles ou racines.
caractéristiques générales des vecteurs recombinants selon l'invention.
Par « vecteur » au sens de la présente invention, on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme simple brin ou double brin.
Un vecteur recombinant selon l'invention est indifféremment un vecteur de clonage, un vecteur d'expression, ou plus spécifiquement un vecteur d'insertion, un vecteur de transformation ou un vecteur d'intégration.
Il peut s'agir d'un vecteur d'origine bactérienne ou virale. Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé afin d'amplifier l'acide nucléique qui y est inséré après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré. 54
Selon un second mode de réalisation, il s'agit de vecteur d'expression comprenant : a) soit un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b tel que défini ci-dessus placé à proximité d'un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de cet acide nucléique régulateur; b) soit un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention codé par le gène DD1-a ou le gène DD1-b, ou encore pour un fragment d'un tel polypeptide, ledit polynucléotide étant placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice fonctionnelle dans l'organisme hôte dans lequel l'expression de l'acide nucléique codant pour un peptide selon l'invention est recherchée.
Un vecteur recombinant selon l'invention comprend avantageusement aussi des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriée. En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication fonctionnelle chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée, ainsi que des séquences nucléotidiques marqueurs de sélection. Selon un aspect avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention est un vecteur intégratif permettant l'insertion de multiples copies de la séquence d'ADN insérée dans ce vecteur dans le génome d'une plante, dont la transformation par un acide nucléique selon l'invention est recherchée. A titre d'exemples de promoteurs utilisables dans un vecteur recombinant selon l'invention, on peut citer notamment les promoteurs bactériens tels que les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, ou encore les promoteurs PR ou PL du phage lambda. Des promoteurs pour l'expression d'un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention dans les plantes sont par exemple 55
le promoteur CaMV 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, Me ELROY et al. (1991), le promoteur du gène de l'actine 1 du riz (Me ELROY et al., (1990) ou encore le promoteur du gène AdH du maïs (DENNIS et al., 1984) ou le promoteur de l'ubiquitine du maïs (CHRISTENSEN et al., 1996).
On peut aussi utiliser des promoteurs chimériques comprenant des séquences activatrices (« enhancer »), tels que le promoteur 35S décrit par HIGGINS et al. (1991).
D'autres promoteurs utiles pour l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans les plantes sont décrits notamment dans les brevets n°US 5,750,866 et US 5,633,363, l'ensemble des documents et articles précités constituant des références sur lesquelles l'homme du métier pourra se fonder pour construire des vecteurs recombinants selon l'invention. De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de SAMBROOK et al. (1989) ou encore aux techniques décrites par FULLER et al. (1996).
De manière avantageuse, la cassette d'expression peut aussi contenir des séquences 5' non traduites dites « leaders ». De telles séquences peuvent augmenter la traduction. Parmi celles connues de l'homme du métier, on peut citer:
- le leader EMCV (EncephaloMyoCarditis VIRUS 5' non coding région) (ELROY-STEIN et al., 1989); - le leader TEV (Tobacco Etch Virus) (CARRINGTON AND
FREED, 1990);
- le leader du gène BiP codant pour la protéine de liaison à la chaîne lourde de l'immunoglobuline humaine (MACEJACK et al., 1991);
- le leader AMV RNA 4 provenant de l'ARNm de la protéine du virus de la mosaïque de la luzerne (JOBLING et al. 1987); 56
- le leader du virus de la mosaïque du tabac (GALLIE et al., 1989).
Les vecteurs selon l'invention peuvent aussi comprendre des séquences dites « terminâteurs ». Parmi les terminâteurs utilisables dans les constructions de l'invention, on peut citer notamment:
- le polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), décrit dans l'article de FRANCK et al. (1980);
- le terminateur nos correspondant à la région 3' non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti à'Agrobacterium tumefaciens (DEPICKER et al., 1992),
- le terminateur du gène histone (EP 0 633 317).
Le vecteur d'expression peut aussi comprendre des séquences de type peptides signaux vacuolaire ou apoplastique lorsqu'elles ne sont pas déjà présentes dans la séquence du gène d'intérêt, pour amener la protéine codée par le gène hétérologue dans des compartiments particuliers des cellules de plante, en particulier celles comprenant la zone de transfert de l'endosperme.
Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322 (ATCC n°37 017) ou encore les vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède) et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, Etats-Unis).
On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Quiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI et pSG (Stratagene).
Il peut s'agir également de vecteurs du type Baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N°CRL 1711) dérivée de Spodoptera frugiperda. 57
Préférentiellement, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptés pour l'expression de séquence d'intérêt dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants:
- vecteur pBlN19 (BEVAN et al.), commercialisé par la Société CLONTECH.(Palo Alto, Californie, USA);
- vecteur pB1 101 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH ;
- vecteur pBI121 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH; - vecteur pEGFP; Yang et al. (1996), commercialisé par la
Société CLONTECH;
- vecteur pCAMBIA 1302 (HAJDUKIIEWICZ et al., 1994)
- vecteur L127a5 représenté à la figure 7.
CELLULES HOTES TRANSFORMEES SELON L'INVENTION.
Pour permettre l'expression d'un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b selon l'invention ou encore pour permettre l'expression d'un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice appropriée, les acides nucléiques ou les vecteurs recombinants définis dans la présente description doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de Innomme du métier pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignée cellulaire.
L'invention a en outre pour objet une cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'invention ou par un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. 58
Une telle cellule hôte transformée est preferentiellement d'origine bactérienne, fongique ou végétale.
Ainsi, peuvent être notamment utilisées des cellules bactériennes de différentes souches de Escherichia coli ou encore ύ'Agrobacterium tumefaciens.
De manière préférée, la cellule hôte transformée est une cellule de plante ou encore un protoplaste de plante.
De manière tout à fait préférée, il s'agit d'une cellule ou d'un protoplaste d'une plante céréalière. La cellule ou le protoplaste est preferentiellement originaire du maïs, du blé, de l'orge, du sorgho ou du millet.
Cellules hôtes contenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléigue régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b.
Une cellule hôte transformée préférée selon l'invention est la souche de Escherichia coli DH5α contenant le plasmide L246a déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le numéro d'accès I-2567. Une seconde cellule hôte transformée selon l'invention est la souche de Escherichia coli DH5α contenant le plasmide L247a déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le numéro d'accès I-2568.
D'autres cellules hôtes transformées préférées selon l'invention sont respectivement des cellules hôtes transformées avec le plasmide L246b ou le plasmide L247b représentés respectivement dans les figures 9 et 11.
PLANTES TRANSFORMEES SELON L'INVENTION.
L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire végétal transformé, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule hôte 59
transformée ou une pluralité de cellules hôtes transformées par un acide nucléique tel que défini dans la présente description ou encore par un vecteur recombinant selon l'invention.
L'invention a encore pour objet une plante transgénique comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique tel que défini dans la présente description.
De manière générale, l'invention est aussi relative à l'utilisation d'un acide nucléique tel que défini dans la présente description pour l'obtention de plantes transformées (transgéniques) à qualité agronomique, alimentaire ou industrielle améliorée, par exemple en contrôlant la taille et/ou le développement de l'albumen du grain.
Plante transformée par un acide nucléique comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b.
L'un des objectifs poursuivi selon la présente invention est l'obtention de plantes transgéniques dont le grain mature possède des caractéristiques améliorées, notamment du point de vue de la qualité ou de la quantité des nutriments contenus dans son albumen.
L'invention vise donc également des procédés pour modifier les qualités agronomiques et/ou nutritionnelles d'une plante, par une action ciblée et précoce sur le développement de l'albumen, utilisant la transformation des plantes avec un vecteur selon l'invention. En particulier, elle s'intéresse à la modification de la taille et/ou du développement de l'albumen.
L'invention a plus précisément pour objet l'utilisation d'une cassette d'expression telle que définie précédemment, pour l'obtention d'une plante Angiosperme transgénique présentant des qualités agronomiques ou nutritionnelles améliorées. 60
L'invention concerne également l'utilisation des plantes transgéniques obtenues selon l'invention, ou parties de ces plantes, notamment semences, grains et fruits pour la préparation de produits dérivés, notamment de produits alimentaires. L'invention permet d'atteindre cet objectif au travers de l'obtention de plantes transgéniques dont le transgène caractéristique est constitué d'un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b selon l'invention, tel que décrit en détail dans la partie correspondante de la présente description.
Un tel acide nucléique régulateur comprend preferentiellement un acide nucléique de séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4, ou un fragment fonctionnel d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4, capable de diriger l'expression du polynucléotide d'intérêt dans la plante, plus particulièrement de diriger l'expression du polynucléotide d'intérêt dans les cellules de la zone de transfert du grain en développement.
De préférence, le polynucléotide d'intérêt, placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b, et constituant le transgène d'une plante transformée selon l'invention code pour une protéine impliquée dans le transfert de métabolites vers l'albumen en développement d'un grain de plante.
Les polynucléotides d'intérêt sont ceux décrits précédemment dans la description. Parmi les plantes susceptibles d'être transformées selon l'invention, on peut citer à titre d'exemples des cellules de plantes de grandes cultures (maïs, blé, colza, tournesol, pois, soja, orge) ou des plantes potagères et fleurs.
En particulier, on peut choisir des plantes connues pour contenir d'importantes réserves (protéiques, glucidiques et lipidiques), notamment les plantes céréalières ou les plantes oléagineuses. 61
Les plantes hybrides obtenues par le croisement de plantes selon l'invention, font aussi partie de l'invention.
Preferentiellement, une plante transformée selon l'invention est une céréale et de manière tout à fait préférée un maïs, un blé, une orge, un sorgho ou un millet.
L'invention a encore pour objet une semence ou un grain de plante dont une ou plusieurs cellules constitutives comprennent dans leur génome une ou plusieurs copies d'un acide nucléique tel que défini ci- dessus. Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi une semence d'une plante transgénique telle que définie ci-dessus, ou encore un fruit d'une telle plante transgénique.
Les semences ou grains matures d'une plante transgénique telle que définie ci-avant possèdent des caractéristiques qualitatives ou quantitatives en nutriments améliorées, pouvant se caractériser par exemple par une plus forte teneur en divers sucres et amidons.
Plantes transformées par un acide nucléique codant pour un polypeptide du gène DD1-a ou du gène DD1-b.
L'invention a également pour objet un organisme multi-cellulaire végétal transformé par un acide nucléique codant pour un polypeptide codé par le gène DD1-a ou par le gène DD1-b.
Preferentiellement, l'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention est placé sous le contrôle d'éléments de régulation fonctionnels chez la plante dans laquelle son expression est recherchée.
L'invention a également trait à une plante transformée par un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention ou encore par un vecteur recombinant contenant, insérée dans celui-ci, une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'invention. 62
De manière préférée, l'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention est choisi parmi l'acide nucléique de séquences SEQ ID N°1, 2, 5, 6 , 7 et 8.
De manière préférée, l'organisme multicellulaire végétal ou la plante transformée par un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention est une céréale, et de manière tout à fait préférée un maïs, un blé, une orge, un sorgho ou un millet.
Outre son rôle potentiel dans le transfert de métabolites de la plante mère vers l'albumen en formation, un polypeptide selon l'invention possède, comme il sera décrit ci-dessous dans la description, des propriétés d'hydrophilicité caractéristiques de polypeptides de type « défensihe », ce qui pourrait permettre d'attribuer aux polypeptides codés par les gènes DD1-a et DD1-b selon l'invention un rôle actif dans la défense de la plante vis-à-vis de divers pathogènes végétaux. Ainsi, une plante transformée par un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention pourrait posséder des caractéristiques de résistance améliorées à divers pathogènes de plantes.
L'invention est également relative à un procédé d'obtention d'une plante transgénique telle que définie dans la présente section, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) obtention d'une cellule hôte recombinante végétale selon l'invention; b) régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a); c) sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré un acide nucléique tel que défini dans la présente description.
La cellule hôte recombinante végétale est: - soit une cellule hôte recombinante transformée par un acide nucléique comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur tel que défini dans la description; 63
- soit une cellule hôte recombinante transformée avec un acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l'invention, placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice fonctionnelle chez les végétaux. L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention d'une plante transgénique, transformée avec un acide nucléique selon l'invention , caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) obtention d'une cellule hôte recombinante à'Agrobacterium tumefaciens transformée avec un acide nucléique selon l'invention; b) transformation d'une plante d'intérêt par infection avec la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a); c) sélection des plantes ayant intégré dans leur génome un acide nucléique selon l'invention.
L'invention a également trait à un procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisée en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) transfecter une cellule de plante avec un acide nucléique selon l'invention ou avec un vecteur recombinant tel que défini dans la présente description; b) régénérer une plante entière à partir des cellules de plantes recombinantes obtenues à l'étape a); c) sélectionner des plantes ayant intégré dans leur génome un acide nucléique selon l'invention.
L'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transformée décrits ci-dessus peut en outre comporter les étapes additionnelles suivantes: d) croisement entre elles de deux plantes transgéniques telle qu'obtenue à l'étape c); e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène. 64
Dans un second mode de réalisation particulier, l'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transgénique décrit ci-dessus peut en outre comporter les étapes additionnelles suivantes: f) croisement d'une plante transgénique obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce; g) sélection des plantes issues du croisement de l'étape f) ayant conservé le transgène.
Un autre objet de l'invention consiste en une plante transgénique, telle qu'obtenue selon l'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transformée définie ci-avant.
L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une plante Angiosperme présentant des qualités agronomiques ou nutritionnelles améliorées, comprenant les étapes consistant à : transformer au moins une cellule de plante Angiosperme par un vecteur tel que défini précédemment; cultiver la cellule ainsi transformée de manière à générer une plante contenant dans son génome une cassette d'expression selon l'invention.
La transformation de cellules végétales peut être réalisée par les techniques connues de l'homme du métier.
On peut citer notamment les méthodes de transfert direct de gènes telles que la microinjection directe dans des embryoïdes de plante (NEUHAUS et al., 1987), l'infiltration sous vide (BECHTOLD et al., 1993) ou l'électroporation (CHUPEAU et al., 1989) ou encore la précipitation directe au moyen de PEG (SCHOCHER et al., 1986) ou le bombardement par canon de particules recouvertes de l'ADN plasmidique d'intérêt (FROMM M. et al. 1990).
On peut également infecter la plante par une souche bactérienne notamment d'Agrobacterium. Selon un mode de réalisation du procédé de l'invention, les cellules végétales sont transfrormées par un vecteur selon l'invention, ledit hôte cellulaire étant susceptible 65
d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences nucléotidiques d'intérêt initialement contenues dans l'ADN du vecteur susmentionné. Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacterium tumefaciens, notamment selon la méthode décrite dans l'article d'AN et al., (1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de GUERCHE et al., (1987) ou encore dans la demande PCT N°WO 00 22.148.
Par exemple, la transformation des cellules végétales peut être réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (WATSON et al. 1994). Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans l'un de ces vecteurs, la région T a été éliminée par délétion, à l'exception des bordures droite et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifrié qui n'a plus de région T mais contient toujours les gènes de virulence vir, nécessaires à la transformation de la cellule végétale. Selon un mode préféré, on peut utiliser la méthode décfrite par
ISHIDA et al. (1996) pour la transformation des Monocotylédones.
Selon un autre protocole, la transformation est réalisée selon la méthode décrite par FINER et al. (1992) utilisant le canon à particules de tungstène ou d'or. L'homme du métier est capable de mettre en oeuvre de nombreux procédés de l'état de la technique afin d'obtenir des plantes transformées par un acide nucléique du gène DD1-a ou du gène DD1-b selon l'invention.
L'homme du métier pourra se référer avantageusement à la technique décrite par BECHTOLD et al. (1993) afin de transformer une plante à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Des techniques 66
utilisant d'autres types de vecteurs peuvent également être utilisées, telles que les techniques décrites par BOUCHEZ et al. (1993) ou encore par HORSCH et al. (1994).
A titre illustratif, une plante transgénique selon l'invention peut être obtenue par des techniques de biolistique telles que celles décrites par FINER et al. (1992) ou encore celles décrites par VAIN et al. (1993).
D'autres techniques préférées de transformation d'une plante conformément à l'invention par Agrobacterium tumefaciens sont celles décrites par ISHIDA et al. (1996) ou encore dans la demande PCT publiée sous le n°WO 95/06 722 au nom de JAPAN TOBACCO.
L'invention a encore pour objet une semence de plante dont les cellules constitutives comprennent un acide nucléique selon l'invention qui a été artificiellement inséré dans leur génome.
L'invention a encore pour objet une semence d'une plante transgénique telle que définie ci-avant ou encore un fruit d'une telle plante transgénique.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b tel que défini dans la présente description pour l'expression in vitro ou in vivo, de préférence in planta, d'un polynucléotide d'intérêt, preferentiellement un polynucléotide codant pour une protéine impliquée dans le transfert de métabolites vers l'albumen en formation d'un grain de plante.
Selon un autre aspect, l'invention concerne encore l'utilisation d'un acide nucléique codant pour un polypeptide codé par le gène DD1-a ou par le gène DD1-b selon l'invention pour l'expression in vivo ou in vitro, de préférence in planta, d'un polypeptide selon l'invention ou encore d'un fragment d'un tel polypeptide.
De manière tout à fait préférée, l'utilisation ci-dessus est caractérisée en ce qu'il s'agit d'une expression in vivo chez une plante transformée avec un tel acide nucléique. 67
POLYPEPTIDES CODES PAR LE GENE DD1-a ET LE GENE DD1-b
Comme déjà décrit précédemment, le gène DD1-a et le gène DD1-b selon l'invention codent respectivement pour des polypeptides possédant une longueur de 304 et 286 acides aminés, pour lesquels il a pu être observé des polypeptides variants.
Toutefois, le degré d'identité entre les séquences d'acides aminés des polypeptides codés respectivement par le gène DD1-a et le gène DD1-b est très élevé, proche de 90% d'identité en acides aminés, après alignement des séquences. Les polypeptides codés par le gène DD1-a ou le gène DD1-b possèdent un peptide signal putatif, ce qui est une caractéristique d'une protéine sécrétée.
Le caractère hydrophile de la protéine mature est compatible avec une fonction dans le milieu extracellulaire. De plus, la même combinaison peptide signal putatif/protéine mature hydrophile des polypeptides selon l'invention est commune avec d'autres polypeptides retrouvés principalement exprimés au niveau des cellules de la zone de transfert du maïs, tels que les polypeptides BETL- 1 à BETL-4 décrits par HUEROS et al. (1999). Le polypeptide codé par la séquence du gène DD1-a SEQ ID
N°1 est le polypeptide de séquence SEQ ID N°9 du listage de séquences.
Le polypeptide DD1-a possède un poids moléculaire calculé de 33408 daltons. Il possède 19 résidus d'acides aminés fortement basiques (K, R), 29 résidus d'acides aminés fortement acides (D,E), 98 acides aminés hydrophobes (A, I, L, F W, V) et 97acides aminés polaires (N, C, Q, S, T, Y). Le polypeptide de séquence SEQ ID N°9 codé par le gène DD1-a possède un point isoélectrique calculé de 5,40 et une charge calculée à pH 7,0 de 8,61. L'invention a donc encore pour objet un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°9 ainsi qu'un polypeptide 68
possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°9 ou un fragment ou un variant de celui-ci;
Pour le polypeptide codé par le gène DD1-b, deux polypeptides variants possédant entre eux une identité de 98% en acides aminés ont été identifiés par le demandeur.
En tenant compte des substitutions d'acides aminés permettant de différencier ces deux variants polypeptides codés par le gène DD1-b, il a été possible de définir une famille de polypeptides fortement homologues comprenant des résidus d'acides aminés variants, qui est défini comme le polypeptide de séquence SEQ ID N°10 du listage de séquences.
Le premier polypeptide variant codé par le gène DD1-b est le polypeptide de séquence SEQ ID N°11 du listage de séquences.
Le second polypeptide variant codé par le gène DD1-b selon l'invention est le polypeptide de séquence SEQ ID N°12 du listage de séquences.
Le polypeptide de séquence SEQ ID N°12 a un poids moléculaire apparent de 31357 daltons. Le polypeptide de séquence SEQ ID N°12 possède 18 résidus d'acides aminés fortement basiques (K,R), 27 résidus d'acides aminés fortement acides (DE), 91 acides aminés hydrophobes A,I,L,F,W,V) et 91 acides aminés polaires (N, C,Q, S, T, Y).
Le polypeptide de séquence SEQ ID N°12 a un point isoélectrique calculé de 5,44 et une charge calculée à pH 7,0 de -7,74. L'invention est donc également relative à un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°10 ainsi qu'à un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°10 ou un fragment ou un variant de celui-ci.
L'invention a encore pour objet un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°11 ainsi qu'un polypeptide 69
possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°11 , ou un fragment ou un variant de celui-ci.
Un autre objet de l'invention consiste en un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°12 ainsi qu'un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°12, ou un fragment ou un variant de celui-ci.
Un fragment d'un polypeptide selon l'invention, comprendra au moins 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 ou 250 acides aminés consécutifs d'un polypeptide de séquences SEQ ID N°9 à 12.
Fait également partie de l'invention un polypeptide comprenant 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 ou 250 acides aminés consécutifs d'un polypeptide de séquences SEQ ID N°9 à 12.
L'invention est également relative à un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence d'un polypeptide de séquences SEQ ID N° 9 à 12.
Avantageusement, fait aussi partie de l'invention un polypeptide ayant au moins 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% d'identité en acides aminés avec la séquence d'un polypeptide de séquences SEQ ID N°9 à 12, ou un fragment peptidique de ce dernier.
De manière générale, les polypeptides selon la présente invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
Un autre objet de l'invention consiste en un polypeptide comprenant des modifications d'acides aminés de 1, 2, 3, 4, 5, 10 à 20 substitutions, additions ou délétions d'un acide aminé par rapport à la séquence d'acides aminés d'un polypeptide de séquences SEQ ID N°9 à
12 ou encore d'un fragment ou d'un variant de celui-ci.
Un polypeptide selon l'invention peut être obtenu par recombinaison génétique selon des techniques bien connues de 70
l'homme du métier, par exemple des techniques décrites dans AUSUBEL
Figure imgf000072_0001
Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par des techniques classiques de synthèse chimique, indifféremment en solution homogène ou en phase solide.
A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé par la technique en solution homogène décrite par HOUBEN WEIL (1974) ou encore par la technique de synthèse en phase solide décrite par MERRIFIELD (1965a; 1965b). De préférence, les polypeptides variants d'un polypeptide selon l'invention conservent leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides de séquences SEQ ID N°9 à 12.
Un polypeptide codé par le gène DD1-a ou le gène DD1-b selon l'invention, tel qu'un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N°9 à 12, ou encore un variant ou un fragment peptidique de ce dernier est utile notamment pour la . préparation d'anticorps destinés à la détection de la présence et/ou de l'expression d'un polypeptide de séquences SEQ ID N°9 à 12 ou d'un fragment peptidique de ce dernier dans un échantillon. Outre la détection de la présence d'un polypeptide codé par le gène DD1-a ou le gène DD1-b ou encore d'un fragment peptidique d'un tel polypeptide dans un échantillon, des anticorps dirigés contre ces polypeptides sont utilisés pour quantifier la synthèse d'un polypeptide de séquences SEQ ID N°9 à 12, par exemple dans des cellules d'une plante, et déterminer ainsi la capacité de cette plante à transférer des métabolites de la plante mère vers l'albumen du grain en formation ou encore la capacité de résistance d'une telle plante à divers pathogènes de végétaux.
Par « anticorps » au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F(ab)'z, F(ab)) ou encore tout polypeptide 71
comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention.
Des anticorps monoclaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par KOHLER et MILSTEIN (1975)
La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tel que produit dans la technique du trioma ou encore la technique d'hybridome décrite par KOZBOR et al. (1983). L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N°4,946,778 ou encore par MARTINEAU et ai. (1998).
Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages telles que décrites par RIDDER et al. (1995) ou encore des anticorps humanisés tels que décrits par REINMANN et al. (1997) et LEGER et al. (1997). Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou de la quantité d'un polypeptide de séquences SEQ ID N°9 à 12, ou d'un fragment peptidique de celui-ci, présent dans un échantillon.
Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non isotopique, par exemple fluorescent, ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Ainsi, l'invention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de: a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que décrit ci-dessus; b) détecter le complexe antigène/anticorps formé. 72
L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant: a) un anticorps tel que défini ci-dessus; b) le cas échéant, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la détection du complexe antigène/anticorps formé.
La présente invention est en outre illustrée sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants:
Figures
La figure 1 représente la séquence génomique codante du gène
DD1-a, identique à la séquence SEQ ID N°5. La ligne supérieure représente le brin codant et la ligne inférieure représente le brin non codant. Chacun des cinq exons du gène DD1-a est représenté par des boîtes.
La figure 2 représente la séquence génomique codante du gène
DD1-b. Cette séquence est identique à la séquence SEQ ID N°6. La ligne supérieure représente la séquence du brin codant et la ligne inférieure représente la séquence du brin non codant. Chacun des quatre exons du gène DD1-b est représenté par des boîtes.
La figure 3 représente la séquence partielle de l'ADNc correspondant au gène DD1-a.
La ligne supérieure représente la séquence nucléotidique du brin codant . La ligne inférieure représente la séquence d'acides aminés déduite .
La figure 4 représente la séquence de l'ADNc correspondant à un produit de transcription du gène DD1-b. Les régions 5'-UTR et 3'-UTR sont représentées par des flèches. La phase de lecture ouverte est représentée par une boîte. La boîte désignée « DD1 AMPLICON » est l'ADNC partiel de séquence SEQ ID N°26 à partir de laquelle les 73
amorces destinées à l'élongation en 5' (5' RACE) et vers l'extrémité 3' (3'RACE) ont été conçues. La ligne inférieure représente la séquence en acides aminés du polypeptide DD1-b de séquence SEQ ID N°12.
La figure 5 représente la séquence de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-a de séquence SEQ ID N°3. Les boîtes représentent les différents motifs caractéristiques d'une région régulatrice retrouvés dans cette séquence et qui sont définis de manière précise dans la description.
La figure 6 représente la séquence de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-b de séquence SEQ ID N°4. Les boîtes représentent les différents motifs retrouvés dans cette séquence et qui sont définis plus précisément dans la description.
La figure 7 représente une carte du vecteur L 127a5 qui comprend la cassette d'expression inutilisée pour exprimer un gène d'intérêt sous le contrôle de différents fragments des acides nucléiques régulateurs des gènes DD1 -a et DD1-b.
La figure 8 représente une carte du vecteur L 246a dans lequel le gène rapporteur GUS est placé sous le contrôle d'un fragment d'environ 3 kb de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-a. La figure 9 illustre une carte du vecteur L246b qui comprend le gène rapporteur GUS placé sous le contrôle d'un fragment d'environ 1 kb de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-a.
La figure 10 représente une carte du vecteur L247a qui comprend le gène rapporteur GUS placé sous le contrôle d'un fragment d'environ 2,5 kb de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-b.
La figure 11 représente une carte du vecteur L247b qui comprend le gène rapporteur GUS placé sous le contrôle d'un fragment d'environ 1 ,6 kb de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-b.
Là figure 12 représente un alignement entre les séquences en acides aminés du polypeptide DD1-a de séquence SEQ ID N°9, du polypeptide DD1-b de séquence SEQ ID N°11 et du polypeptide DD1-b 74
de séquence SEQ ID N°12. La ligne supérieure représente une séquence en acides aminés consensus. La seconde ligne représente la séquence en acides aminés déduite de la séquence partielle de l'ADNc codant pour DD1-a. La 3 ème ligne représente la séquence de la protéine DD1-a. Les deux lignes inférieures représentent les séquences en acides aminés des deux variants polypeptidiques de DD1-b de séquences SEQ ID N°11 et SEQ ID N°12.
La figure 13 illustre le profil d'expression des gènes DD1-a et DD1-b. Après transcription inverse et amplification par PCR (RT-PCR), les ADN ont été transférés sur membrane puis hybrides avec la sonde de séquence SEQ ID N°26. L'expression a été visualisée à partir d'ADN amplifiés dans les tissus suivants: soies, épis, tiges; feuilles; racines et l'albumen à 7, 9, 12 et 15 jours après pollinisation (JAP). La piste désignée M correspond au marqueurs moléculaires utilisés comme témoins.
La figure 14 illustre le profil d'expression tissulaire des gènes DD1-a et DD1-b réalisés à l'aide d'hybridation in situ sur des coupes longitudinales de grain de maïs de 7, 9, 12 et 15 jours après pollinisation (JAP). a, b, 7 JAP; c, d, 9 JAP et 12 JAP; g, h15 JAP. a, c, e, g sonde DD1 antisens; b,d, f, f témoin négatif (sonde
DD1 sens).
EXEMPLE 1:
A-MATERIEL ET METHODES
A-1 LIGNEES VEGETALES
Les plantes de la lignée A188 (GERDES et TRACY, 1993) ont été utilisées pour l'isolement d'ARN et pour la réalisation des hybridations in situ. Les grains de ces plantes, obtenus par pollinisation à la main, ont été récoltés à différents stades compris entre 7 et 15 JAP. 75
Les fragments d'ADN contenus dans la banque génomique criblée proviennent quant à eux de la lignée hybride HD5xHD7. La cartographie a été réalisée grâce aux lignées recombinantes stables issues des croisements Co159xTx303 et Cm37xT232, (BROOKHAVEN NATIONAL LABORATORY, Upton, N.Y. Etats-Unis). Toutes ces plantes ont été cultivées en serre, avec une période d'éclairement de 16 h , une humidité relative de 80%, et une alternance 24°C/19°C (jour/huit).
A-2 CLONAGE
L'ADN plasmidique a été préparé suivant le protocole de lyse alcaline décrit par SAMBROOK et al. (1989). Les digestions d'ADN génomique et plasmidique par des enzymes de restriction ont été réalisées selon les conseils des fabricants (GIBCO, BOEHRINGER MANNHEIM, PROMEGA). Les produits de digestion ou d'amplification par PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose dans du tampon TAE SAMBROOK et al. 1989). Les fragments de restriction ont été ligués dans le vecteur pBluescript et les produits PCR dans le vecteur pGEM-T-easy, à l'aide de la T4-DNA ligase suivant les conseils du fournisseur (Promega), en utilisant 50 ng de vecteur, et un rapport molaire insert/vecteur de l'ordre de 3/1. Ces constructions ont été introduites dans la souche bactérienne DH5α par transformation par choc thermique, selon le protocole de HANAHAN (1983).
A-3 SEQU ENGAGE
Les réactions de séquençage ont été réalisées soit à partir de mini-préparations d'ADN plasmidique ayant subi une extraction volume à volume au phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1) pH 8 et une précipitation à l'éthanol, soit à partir de produits PCR purifiés à l'aide du kit « QIAquick PCR purification » (Qiagen). Les produits de la réaction 76
« dye terminator » obtenus avec le kit « Thermo Sequenase » (Amersham) ont migré sur un séqueneur automatique ABI 373 A (Applied Biosystems).
Les logiciels Sequencher 3.1.1 (Gène Codes Corporation) et DNAstar (Laser Gène) ont permis d'analyser et d'assembler les séquences obtenues. Les bases de données ont été consultées avec le logiciel blast (Basic local Alignment S Tool, National Center for Biotechnology Information, ALTSCHUL et al., (1997). Des motifs de « signature » protéiques ont été recherchés dans les bases de données « Prosite profiles », « Prosite patterns », « Pfam » et « Gribskov collection », disponibles sur le serveur de l'ISB (Institute of Swiss Bioinformatics).
A-4 Southern blot
Les fragments d'ADN ont été transférés des gels d'agarose sur des membranes de nylon (Hybond N+, Amersham) par capilarité, en présence de soude 0,4N. Les membranes ont été préhybridées selon les conseils du fournisseur, pendant 4 à 12 h en conditions stringentes (à 65°C, en présence de SSPE 5x et sans formamide). Puis elles ont été hybridées pendant 16 h dans les mêmes conditions. Les sondes utilisées pour l'hybridation ont été marquées radioactivement avec 50μCi d'α32P- dCTP, selon le protocole suivant : 25 à 100 ng d'ADN linéaire ont été dénaturés 5 min dans l'eau bouillante, dans un volume de 9 μl, avec deux amorces spécifiques antiparalleles (séquences listées dans le tableau 10) à une concentration finale de 5 μM. 77
TABLEAU 10 Séquences de 5' vers 3' des amorces utilisées pour la fabrication de sondes radioactives (§ A.4) et pour la « RT-PCR » (§ A.5.).
Figure imgf000079_0001
Puis l'ADN et les amorces ont été hybrides 10 min à température ambiante et 5 min sur glace. Les réactifs suivants ont alors été ajoutés sur glace: 2 μl de dAGT (200 μM chacun: dATP, dGTP, dTTP) 1 μl SAB (1 mg/rnl), 2μl tampon de restriction #Z concentré 10x(GIBCO), 5 μl d'α32P-dCTP (activité 3000 Ci/mmol), et 1 μl d'enzyme de Klenow (1 U/μl). Les fragments d'ADN ont été marqués à 37°C pendant 45 minutes, puis l'élongation a été prolongée par une incubation de 15 min avec 1 μl de dCTP froid 200 μM et 1 μl d'enzyme de Klenow. Les sondes ainsi obtenues ont été purifiées sur des colonnes de Sepharose CL-6B par centrifugation 3 minutes à 400g. 78
Après hybridation, les membranes ont subi quatre rinçages , à 65°C dans des solutions à 0,1% de SDS et de concentrations en SSC de 2x, 1x, 0,5x et 0,1x, et ont été exposées à des films pour autoradiographie (X-OMAT, Kodak).
A-5 (« RT-PCR »)
Des grains de maïs ont été disséqués sous la loupe binoculaire à différents stades de développement (7, 9, 12 et 15 JAP) en séparant l'embryon de l'albumen. Les ARN totaux de ces deux organismes ont été extraits selon le protocole décrit par Me PHERSON et al. (1991). Ces différentes manipulations ont été conduites en parallèle sur des tissus témoins de plantes du même génotype: soies de 10 cm, tiges, feuilles et racines matures, et jeunes épis non pollinisés de 10 cm.
Les ARN, resuspendus dans 50 μl d'eau Versol (Aguettant), ont été dénaturés à 65°C pendant 5 min et traités à la DNase I selon les indications du fournisseur (Promega). Ils ont ensuite été purifiés par deux extractions volume à volume au phénoI:chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1) pH 4,5 et une précipitation à l'éthanol, 6 μg d'ARN purifiés ont été « reverse » transcrits par la MuLV reverse transcriptase (Gibco) dans un volume total de 20 μl comme conseillé par le fournisseur, avec les amorces antisens présentées dans le tableau 10 ci-dessus, à une concentration finale de 2,5 μM.
Après inactivation de la reverse transcriptase par chauffage à 95°C pendant 5 min, 2 μl de la réaction de transcription inverse ont été amplifiés par la Taq polymérase avec le tampon fourni par le fabricant (Pharmacia). Les couples d'amorces sens/antisens présentés dans le tableau 10 ont été utilisés à une concentration finale de 1 μM. La réaction a été réalisée dans un amplificateur PCR Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 2400 de la façon suivante: après dénaturation de l'ADN 2 min à 94°C, les échantillons ont subit 30 cycles de 30 s de dénaturation à 94°C/45 s d'hybridation à 55°C/1 min d'élongation à 72°C. 79
Une amplification des transcrits du gène Gapdh a constitué le témoin positif de transcription inverse. En effet, ce gène code pour une enzyme impliquée dans la glycolyse, la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase, dont l'expression est ubiquitaire et constitutive. Une amplification a également été réalisée en omettant les ARN, afin de disposer d'un témoin négatif attestant de l'absence d'ADN contaminant dans les réactifs. A-6 ELONGATION D'AMORCES (« RACE-PCR »)
Le kit « Marathon cDNA Amplification » a été utilisé pour obtenir des extrémités d'ADNc, en suivant les indications du fabricant (CLONTECH), à l'aide des amorces suivantes:
TABLEAU 11 Séquences de 5' vers 3' des amorces utilisées pour la
« RACE-PCR »
Figure imgf000081_0001
Cette technique repose sur l'amplification de fragments d'ADNc aux extrémités desquels ont été ligués des adaptateurs. Les ADNc utilisés pour la réaction ont été préparés à partir d'ARN polyA+ extraits de la partie basale de grains de maïs de 7 JAP, comprenant l'embryon et 80
la partie basale de l'albumen. Une première amplification a été effectuée entre une amorce spécifique de DD1 (contenant au moins 50% de GC; température d'hybridation entre 65 et 70°C; située à une extrémité du clone partiel) et une amorce située dans un adaptateur ligué à l'autre extrémité de l'ADNc servant de matrice. Les produits de cette réaction sont alors amplifiés avec une amorce spécifique située plus à l'intérieur de l'amplicon et une autre amorce de l'adaptateur.
Afin de disposer d'un témoin positif de la présence du gène
DD1 parmi les ADNc utilisés, une amplification a été réalisée entre les deux amorces SEQ ID N°20 et SEQ ID N°21. Le témoin négatif , qui vérifie l'absence d'ADN amplifiable dans les réactifs, a été obtenu en remplaçant les ADNc par de l'eau, puis en amplifiant par les amorces situées en 5'.
A.7 HYBRIDATION IN SITU
Les hybridations in situ ont été réalisées selon le protocole de COEN et al. (1990), avec les modifications décrites par BRADLEY et al. (1993). Les principales étapes en sont, en résumé:
A.7.1 PREPARATION DES TISSUS
Les grains isolés ont été immergés dans une solution de fixation à 4% de paraformaldéhyde et infiltrés sous vide. Puis ils ont été déshydratés par des incubations successives dans des solutions éthyliques salées de degré croissant en éthanol. Les échantillons ont alors été imprégnés pendant plusieurs jours dans un mélange d'Histoclear II (National Diagnostics) et de paraffine (Paraplast Plus, Sherwood Médical Co) en concentration croissante. Ils ont ensuite été inclus dans de petits blocs de paraffine pure pour être coupés au microtome, en sections longitudinales et transversales de 7 μm 81
d'épaisseur. Ces coupes ont été fixées sur des lames Probe-On Plus préchargées positivement (Fisher Scientific).
A.7.2. FABRICATION DE SONDES MARQUEES A LA DIGOXINENINE
Les sondes DD1 sens et antisens ont été obtenues par transcription in vitro d'un ADNc partiel du gène DD1 (SEQ ID N°26) clone dans les deux orientations dans le vecteur pGEM-T-easy. Toutes les transcriptions in vitro ont été réalisées par la T7-ARN polymérase, en présence des nucléotides suivants: ATP, CTP et GTP 1 mM, UTP 0,65 mM, et digoxinénine-11-UTP 0,35 mM.
A.7.3. HYBRIDATION
Les lames ont été hybridées avec la sonde pendant 16 h, à
55°C, dans un tampon d'hybridation contenant entre autre 50% de formamide. Elles ont ensuite été rincées à 55°C dans une solution à 0,1% de SDS et de concentration en SSC de 0,1x pendant 30 min, puis dans une solution à 50% de formamide et de concentration en SSC de 2x pendant deux fois 1 h 30 min, avec agitation lente.
A.7.4 REVELATION
Après une incubation de 1 h 30 min avec une dilution 1/1000 d'anticorps anti-digoxigénine couplé à la phosphatase alcaline, les lames ont été révélées par une solution de NBT (nitroblue tetrazolium chloride) et BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate p-toluidine sait), des substrats chromogènes de la phosphatase alcaline. Elles ont ensuite été lavées dans des bains de 30 à 100% d'éthanol, et colorées au calcofluor à 0,1%. Les photographies ont été faites sous un microscope avec un 82
objectif Plan fluor 10/0,30, à l'aide d'un appareil Nikon FDX 35 sur des pellicules Kodak Elite Chrome 100 ASA.
A8.CRIBLAGE DE BANQUE D'ADN GENOMIQUE
Une banque d'ADN génomique contenue dans le phage lambda EMBL3 SP6/T7 (Stratagene) a été étalée à la densité de 1 ,5 x 105 plages de lyse par boîte, sur 10 boîtes, puis transférée sur membrane Hybond N, selon la technique décrite par SAMBROOK et al. (1989). Les membranes ont été hybridees avec la sonde de séquence SEQ ID n° 29 provenant d'un clone d'ADN génomique partiel du gène DD1-b marqué radioactivement. Après révélation des membranes en autoradiographie, les plages de lyse donnant un signal ont été prélevées sur les boîtes et étalées à une densité moindre, ainsi deux fois de suite afin d'obtenir un clone unique par boîte, sous forme de plages isolées. Les ADN ont alors été préparés selon SAMBROOK et al. (1989).
A.9.- CARTOGRAPHIE
La cartographie a été réalisée comme décrit par BURR et
BURR (1991 ). L'ADN génomique des lignées parentales Co159, Tx303, Cm37 et T232 a été digéré par les enzymes de restriction suivantes: BamHI, EcoRI, Hindlll, EcoRV, Pstl, Xbal, Sacl, Spel, Xhol, Sali, Pvull, et Clal, et transféré sur membrane de nylon (voir paragraphe A.4). Une sonde marquée radioactivement, correspondant à un clone d'ADN génomique partiel du gène DD1-b de séquence SEQ ID N°29, a été utilisée pour identifier des polymorphismes de longueur des fragments de restriction.
Un polymorphisme a été observé avec la digestion par EcoRI de l'ADN des deux parents Co 159 et Tx303 et l'ADN génomique de 41 descendants Co159xTx303 a donc été digéré par EcoRI. Selon que la 83
digestion a conduit à l'obtention du même polymorphisme que le parent Tx303 ou que le parent Co159, un score de 1 ou de 2 a été respectivement attribué à l'individu. Pour les individus chez qui la discrimination n'a pas été possible, il a été attribué un x.
Ces résultats ont permis de déterminer la position des gènes sur la carte génétique du maïs, à l'aide du programme Map Maker.
B - RESULTATS
B.1. PROFIL D'EXPRESSION DES GENES DD1
Afin d'obtenir des profils d'expression spatio-temporelle précis des gènes DD1 , la technique de « RT-PCR » a été utilisée avec les oligonucleotides du tableau 10 et la séquence SEQ ID N°26 comme sonde. Les résultats des « RT-PCR » relatifs à l'albumen et aux tissus témoins sont représentés sur la figure 13.
Le gène DD1 (figure 13) n'est pas exprimé dans les tissus végétatifs, mais présente une fenêtre d'expression très étroite dans l'albumen, située entre 7 et 9 JAP. Des expériences supplémentaires sur grain entier montrent que l'expression commence avant 7 JAP. Une faible expression est même détectable dans l'ovule mature avant fécondation. Le maximum d'expression se situe à 7 JAP. A 12 JAP, on peut encore observer un signal très faible, qui disparaît totalement à 15 JAP. L'expression de DD1 est donc spécifique de la phase précoce du développement de l'albumen. La sonde DD1 donne également un signal dans la piste du marqueur de taille, car de petites régions du vecteur de clonage présentes aux extrémités de la sonde sont homologues aux séquences du marqueur.
B.2 CARACTERISATION DE DD1 B.2.1 PROFIL D'EXPRESSION TISSULAIRE DE DD1 84
Afin de préciser le profil d'expression tissulaire de DD1 , nous avons réalisé des hybridations in situ sur des coupes longitudinales de grains de maïs de 7, 9, 12 et 15 JAP. Avec une sonde antisens, on observe un signal restreint à la zone de transfert de l'albumen. Ce signal est fort à 7 et à 9 JAP (figures 14a et 14c, puis plus faible à 12 JAP (figure 14e), indiquant une diminution du niveau d'expression de l'ARN correspondant au gène DD1. A 15 JAP, on n'observe plus aucun signal (figure 14g) , ni dans la zone de transfert, ni dans le reste du grain. Une sonde sens, utilisée comme contrôle négatif, ne donne qu'un signal diffus qui correspond au bruit de fond (figures 14b, d f h). Des expériences sur des stades plus précoces montrent une expression dans le sac embryonnaire (gamétophyte femelle) avant fécondation et une expression à la base du grain à 5 JAP. Ceci confirme les résultats obtenus par RT-PCR : le gène DD1 est spécifiquement exprimé dans le gamétophyte femelle avant la fécondation et à la base du grain entre la fécondation et le stade 12 JAP. Cette zone d'expression coïncide avec la zone de transfert dès sa différenciation à 7 JAP.
B-2.2. CLONAGE DE L'ADNC DU GENE DD1-B Afin d'obtenir la séquence d'ADNc de DD1, nous avons effectué une « RACE-PCR » vers chaque extrémité du gène. Après « DNA gel blot » des produits des deux réactions, on obtient plusieurs bandes après hybridation avec la sonde DD1 (SEQ ID N°26) entre 0,4 et 0,8 kb pour la réaction 5', et entre 0,4 kb et 0,6 kb pour la réaction 3'. Les produits de ces deux réactions ont été clones et séquences. Toutes les séquences correspondaient au gène désigné plus tard comme DD1-b.
B-2.3 SEQUENCE DE DD1
Les séquences des produits des réactions 5' et 3' étant chevauchantes, une séquence consensus de 1075 pb a été obtenue sur 85
la base des clones les plus longs vers chaque extrémité. Cette séquence contient un cadre ouvert de lecture de 858 pb, et plusieurs sites de polyadénylation. Elle code pour une protéine de 286 acides aminés, très hydrophile, qui comporte néanmoins un domaine hydrophobe dans sa partie N-terminale. La séquence d'ADNc né révèle aucune homologie significative avec les bases de données de séquences.
B.2.4- CLONES GENOMIQUES DE DD1
Pour élucider la structure intron/exon et avoir accès au promoteur, il était nécessaire de disposer de clones génomiques. L'amplicon DD1 (SEQ ID N°26, (382 pb) semblait trop petit pour produire une bonne sonde utilisable pour le criblage de banque et la cartographie. Aussi, une amplification par PCR sur ADN génomique a été réalisée, à l'aide des mêmes amorces (SEQ ID N°20 et SEQ ID N°21) que celles utilisées pour la « RT-PCR » (tableau 10). L'obtention de deux produits de taille supérieure à celle des produits de la « RT-PCR » a montré qu'il existe dans l'ADN génomique au moins un intron entre les deux amorces spécifiques. Ces deux fragments, d'environ 1 ,2 kb et 1,5 kb, ont été clones puis enlièrement séquences. Leurs séquences exoniques comme introniques sont très homologues. Le plus grand fragment contient deux insertions, de 49 et 282 pb, ainsi que 26 délétions ponctuelles. Ceci est une première indication de la présence de deux gènes DD1-a (produit de 1,5 kb) et DD1-b (produit de 1,2 kb) dans le génome du maïs. Disposant de clones suffisamment longs, une banque d'ADN génomique a été cribléee utilisant comme sonde le fragment d'environ 1 ,2 kb de DD1-b (SEQ ID N°29). Ce fragment présente suffisamment d'homologie avec le fragment d'environ 1 ,5 kb de DD1-a pour lui permettre de s'hybrider avec les deux gènes, mais ne contient pas les insertions qui pourraient correspondre à des séquences répétées, et 86
donc s'hybrider avec d'autres parties du génome sans relation avec les gènes DD1.
Lors du premier criblage, trente clones positifs en autoradiographie ont été obtenus. Les plages de lyse correspondantes ont été prélevées et testées par PCR pour la présence des fragments de 1 ,5 kb (DD1-a) ou de 1 ,2 kb (DD1-b). Pour le deuxième tour de criblage, nous avons retenu 3 clones donnant un fragment PCR de 1 ,5 kb, 2 clones donnant une bande de 1 ,2 kb , ainsi que 7 clones ne présentant pas de fragment d'amplification. Après hybridation, 8 de ces 12 clones émettaient des signaux, notamment tous ceux qui avaient répondu en PCR. Nous avons donc étalé à nouveau ces clones pour obtenir des plages de lyse isolées. Pour chaque clone, l'ADN d'une plage a été isolé et digéré par les enzymes Sali, Xbal, ainsi que par les deux enzymes simultanément. Une fois hybridees, les membranes de ces digestions nous ont permis d'identifier des fragments de restriction contenant au moins une partie de DD1. Pour un clone lambda DD1-a et un clone lambda DD1-b les fragments de restriction ont été sous-clonés, et les différents types de sous-clones ont été séquences.
Les séquences obtenues sont répertoriées ici comme SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2. Elles contiennent les régions régulatrices, les régions codantes et des régions en aval des gènes DD1-a et DD1-b.
B 2.5 CARTOGRAPHIE DES GENES DD1
La cartographie peut apporter des renseignements sur la fonction d'un gène si celui-ci co-cartographie avec une mutation de phénotype connu. Pour cartographier les gènes DD1 , nous disposions de deux populations de lignées recombinantes stables, issues des croisements Co159xTx303 et T232xCm37. Pour trouver des polymorphismes de longueur des fragments de restriction des gènes DD1 , nous avons digéré l'ADN des 4 lignées parentales par différentes 87
enzymes. Après hybridation avec une sonde correspondant au clone génomique partiel de DD1-b de 1 ,2 kb (SEQ ID N°29), plusieurs polymorphismes ont été révélés. La digestion par Xhol montre un polymorphisme entre les parents T232 et Cm37; les digestions par Hindlll et Clal entre les lignées Tx303 et Co159; enfin les digestions par BamHI, EcoRI, EcoRV, Xbal et Sacl montrent l'existence d'un polymorphisme chez les deux couples de parents. Par ailleurs, le nombre de bandes hybridantes (entre 1 et 4) indique un faible nombre de copies du gène DD1 dans le génome du maïs. Les gènes DD1 ont été cartographiés en digérant par EcoRI l'ADN de 41 individus Co159xTx303. L'hybridation des membranes avec la même sonde montre la présence de trois fragments de restriction dans chaque plante, dont deux ségrègent de façon indépendante (tableau 12). Comme attendu la sonde de 1,2 kb reconnaît donc deux gènes différents.
TABLEAU 12
Polymorphismes observés après digestion par EcoRI des
ADN de 41 individus Co159xTx303
(classés de gauche à droite), où 1=Co159. 2=Tx303 et x = illisible
Gène DD1-a x1111112122211222121 x22112111221212x11121
Gène DD1-b 11212112111121112112x2212112222122x21212
La position exacte des gènes DD1-a et DD1-b par rapport à des marqueurs connus sur la carte génétique du maïs a été déterminée. Le gène DD1-a se trouve sur le bras long du chromosome 8, à la position 130,5 centimorgans, entre le marqueur bnl17.17 et le gène spsl . Le gène DD1-b est situé sur le bras long du chromosome 6, à la position 78 centimorgans, entre les marqueurs p!1 et tug8. 88
B 2.6. EXPRESSION DES DEUX GENES DD1-a ET DE DD1-b
Le séquençage de clones génomiques et la cartographie avaient mis en évidence l'existence de deux gènes DD1 dans le génome du maïs. Cependant l'expression des deux gènes ne pouvait pas être affirmée par les expériences de RT-PCR et d'hybridation in situ décrites ci-dessus, parce que les amorces et sondes utilisées ne différenciaient pas entre les deux gènes. La quasi-identité entre tous les clones RACE et le gène DD1-b était une première preuve de l'expression du gène DD1-b. Pour confirmer ce résultat et pour adresser l'expression du gène DD1-a, de nouveaux expériences de RT-PCR ont été entreprises. Les amorces 203-3' et 204-3' (Tableau 10) spécifiques respectivement de DD1-a et de DD1-b ont été testées en combinaison avec l'amorce GM2 (Tableau 10) s'hybridant sur les deux gènes. Sur des ADN plasmidiques contenant soit un fragment DD1-a ou un fragment DD1-b une amplification a été obtenue uniquement avec l'amorce correspondante. Par la suite des ADNc de caryopses de 7 JAP ont été amplifiés avec les couples GM2/203-3' et GM2/204-3'. Une bande hybridant à une sonde DD1 a été obtenue dans les deux cas. Le clonage et séquençage des fragments correspondants a montré qu'il s'agissait d'ADNc de DD1-a et de DD1-b. Par conséquent les deux gènes sont exprimés dans des caryopses de 7 JAP. Par ailleurs le séquençage du produit GM2/203-3' a révélé la présence d'une petite insertion de 54 pb par comparaison au produit GM2/204-3'. Cette séquence a été retrouvée dans l'ADN génomique de DD1-a. La présence de sites d'épissage canoniques à ses extrémités confirme la présence d'un petit exon. Une séquence homologue est présente dans l'ADN génomique de DD1-b, mais absente dans l'ADNc du gène DD1-b (clone RACE et produit GM2/204-3'). il semblerait alors que les deux gènes DD1 aient assez divergé dans l'évolution pour permettre un épissage alternatif. 89
EXEMPLE 2:
Construction de vecteurs recombinants selon l'invention dans lesquels est inséré un acide nucléique comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b.
Plusieurs vecteurs comprenant un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b localisé en amont d'un gène rapporteur, le gène GUS, ont été réalisés. Le vecteur de départ destiné à recevoir les inserts d'ADN d'intérêt est le vecteur L127a5 représenté dans la figure 7. Le vecteur L127 a 5 ainsi que sa construction sont décrits par BONELLO et al. (2000). Dans cet article, le vecteur L 127 a 5 est désigné prEsr3-GUS.
Pour chacune des séquences régulatrices respectives du gène DD1-a et du gène DD1-b, deux constructions de vecteurs ont été réalisées, chacune des constructions comprenant un fragment long ou au contraire un fragment court de la séquence régulatrice.
Les séquences régulatrices des gènes DD1-a et DD1-b ont tout d'abord été amplifiées par PCR à l'aide d'amorces contenant des sites de restriction.
Après digestion avec des endonucléases de restriction appropriés, les fragments amplifiés des séquences régulatrices sont intégrés dans le plasmide L127a5 représenté à la figure 7 et décrit également dans la demande de brevet français N° 99 12305 déposée le 1er Octobre 1999.
Le tableau 13 ci-après représente schématiquement les différentes constructions réalisées. 90
Tableau 13
Figure imgf000092_0001
amorce 203 (3,0) ATGCCTGCAGCTACCGCATCGCATTACTGGCTCTG
(SEQ ID N°13) amorce 203 (1,0) ATGCAAGCTTTGCATTCACACCCCTAAAG
(SEQ ID N°14) amorce 204 (2,5) ATGCCTGCAGGGGACCTGAGTGAGTTGA
(SEQ ID N°15) amorce 204 (1 ,6) ATGCCTGCAGGAGATGCCAAGAATAAAGGGTAAAG
(SEQ ID N°16) amorce Gus ATGCTCTAGATTTGTAAGGATGGTTATATTTCTCT
(SEQ ID N°17)
Adaptateurs utilisés: adaptateur JFB34 TCGACTGCAGCCCA
GACGTCGGGTTCGA adaptateur JFB56 CTAGACCCGAATTCGC
TGGGCTTAAGCGCCGG
Le vecteur L246a a été construit après introduction d'une séquence d'environ 3 kb du promoteur du gène DD1 -a après amplification d'un fragment génomique de ce gène à l'aide du couple d'amorces de séquences SEQ ID N°13 (amorce 203(3,0)) et SEQ ID N°17 (amorce GUS) puis digestion par les endonucléases de restriction Pstl et Xbal. (Figure 8).
Le vecteur L246b a été obtenu par introduction dans le vecteur L127a5 d'un acide nucléique constituant le produit d'amplification d'un fragment génomique du gène DD1-a à l'aide du couple d'amorces de séquences SEQ ID N°14 (amorce 203(1 ,0)) et SEQ ID N°17 (amorce GUS), avant digestion par les endonucléases de restriction Hindlll et Xbal. (Figure 9). 91
Le vecteur L247a a été obtenu par l'introduction dans le vecteur L127a5 d'un acide nucléique constituant le produit d'amplification d'un fragment génomique du gène DD1-b à l'aide du couple d'amorces de séquences SEQ ID N°15 (amorce 204(2,5)) et SEQ ID N°17 (amorce GUS) avant digestion par lés endonucléases de restriction Pstl et Xbal. (Figure 10). Le vecteur L318 est un dérivé de L247a. Il contient une fusion traductionnelle entre le deuxième exon de DD1-b et le gène rapporteur Gus. Le vecteur L247a a été digéré par les enzymes Spel et Smal et le fragment plus petit a été remplacé par un produit d'amplification obtenu par PCR avec les amorces DD1-b-FT-5' (SEQ ID N°33 et DD1-b-FT-3' (SEQ ID N°34) sur le plasmide L204b7 puis digéré par les enzymes Spel et Smal.
Séquences des amorces :
DD1 b-FT5' : ATTATCATTT CAGGTAGCAC ATCTCC (SEQ ID N°33)
DD1b-FT3' :TAATCCCGGG GACTTGCCAT TTGACACCCA CATTATT (SEQ ID N°34)
Le vecteur L247b a été réalisé par l'introduction dans le vecteur L127a5 d'un fragment d'amplification génomique obtenu à l'aide du couple d'amorces SEQ ID N°16 (amorce 204(1 ,6)) et SEQ ID N°17 (amorce GUS), avant digestion par les endonucléases de restriction Pstl et Xbal. (Figure 11).
L'ADN génomique du gène DD1-a de départ utilisé pour amplifier les séquences d'intérêt destinées à être introduites dans les vecteurs L246a et L246b est contenu dans le plasmide L203b23, qui comprend un insert d'ADN génomique de 6 kb clone avec les enzymes Sali et Xbal dans le vecteur pBCSK+ commercialisé par la Société Stratagene. 92
Le matériel de départ pour l'amplification des inserts d'ADN d'intérêt du gène DD1-b est le plasmide L204b17 qui comprend 12 kb d'un insert d'ADN génomique clone avec l'enzyme Xbal dans le vecteur pBCSK+ commercialisé par la Société Stratagene. Les fragments d'ADN génomique proviennent de clones lambda
EMBL3 SP6/T7 d'une banque génomique du génotype HD5xHD7 obtenue après digestion partielle avec l'enzyme Sau3A décrite à l'exemple 1 , au paragraphe A.8 de la section « Matériels et Méthodes ».
Les références pour le plasmide L127a5 sont les suivantes: - plasmide pBSSK+ commercialisé par la Société Stratagene ;
- plasmide pBI101 décrit par JEFFERSON et al., 1987
EXEMPLE 3:
Obtention de plantes transgéniques transformées par un transgène comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice selon l'invention.
La transformation d'une plante dans le but d'obtenir une expression stable du polynucléotide d'intérêt dans la plante transformée est nécessaire pour assurer une modification durable du grain de maïs. Des essais sont réalisés avec une construction de vecteurs L246a,
L246b, L247a et L247b décrits à l'exemple 2.
4-1 CANON A PARTICULES
La méthode utilisée repose sur l'utilisation d'un canon à particules identique à celui décrit par FINER (1992).
Les cellules cibles sont des cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal embryogène (dit de type II) de maïs. Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de 93
génotype Hill selon la méthode et sur les milieux décrits par ARMSTRONG (1994). Des fragments de tels cals d'une surface de 10 à 20 mm2 ont été disposés, 4 h avant bombardement, à raison de 16 fragments par boîte au centre d'une boîte de Pétri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de 0,2M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les plasmides décrits dans les exemples précédents et portant les gènes à introduire, sont purifiés sur colonne QiagenRen suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungstène (M10) en suivant le protocole décrit par KLEIN (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrit par J. FINER (1992). Les boîtes de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées à l'aide de ScellofraisR puis cultivées à l'obscurité à 27°C. Le premier repiquage a lieu 24 h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, des cals dont la croissance n'est pas. inhibée par l'agent sélectif, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal par boîte bombardée.
Ces cals sont identifiés, individualisés, multipliés puis cultivés de façon à régénérer des plantules, en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par VAIN et al. (1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées pour l'obtention d'hybrides ou autofécondées. 94
5.2 Transformation par Agrobacterium
Une autre technique de transformation utilisable dans le cadre de l'invention utilise Agrobacterium tumefaciens, selon le protocole décrit par ISHIDA et al. (1996), notamment à partir d'embryons immatures de 10 jours après la fécondation. Tous les milieux utilisés sont référencés dans la référence citée. La transformation débute avec une phase de co- culture où les embryons immatures des plantes de maïs sont mis en contact pendant au moins 5 min avec Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 contenant les vecteurs superbinaires. Le plasmide superbinaire est le résultat d'une recombinaison homologue entre un vecteur intermédiaire porteur de l'ADN-T contenant le gène d'intérêt et/ou le marqueur de sélection dérivé des plasmides décrits dans les exemples précédents, et le vecteur pSB1 de Japan Tobacco (EP 672 752) qui contient: les gènes virB et virG du plasmide pTι'Bo542 présent dans la souche supervirulente A281 à1 Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) et une région homologue retrouvée dans le vecteur intermédiaire permettant cette recombinaison homologue. Les embryons sont ensuite placés sur milieu LSAs pendant 3 jours à l'obscurité et à 25°C. Une première sélection est effectuée sur les cals transformés: les cals embryogènes sont transférés sur milieu LSD5 contenant de la phosphinotricine à 5 mg/l et de la céfotaxime à 250 mg/l (élimination ou limitation de la contamination par Agrobacterium tumefaciens). Cette étape est menée 2 semaines à l'obscurité et à 25°C. La deuxième étape de sélection est réalisée par transfert des embryons qui se sont développés sur milieu LSD5, sur milieu LSD10 (phosphinotricine à 10 mg/l) en présence de céfotaxime, pendant 3 semaines dans les mêmes conditions que précédemment. La troisième étape de sélection consiste à exciser les cals de type I qui restent blancs (fragments de 1 à 2 mm) et à les transférer 3 semaines à l'obscurité et à 25°C sur milieu LSD 10 en présence de céfotaxime. 95
La régénération des plantules est effectuée en excisant les cals de type I qui ont proliféré et en les transférant sur milieu LSZ en présence de phosphinotricine à 5 mg/l et de céfotaxime pendant 2 semaines à 22°C et sous lumière continue.
Les plantes ayant régénéré sont transférées sur milieu RM + G2 contenant 100 mg/l d'Augmentin pendant 2 semaines à 22°C et sous illumination continue pour l'étape de développement. Les plantes obtenues sont alors transférées au phytotron en vue de leur acclimatation.
EXEMPLE 4 - Test de l'activité du promoteur DD1-b
Pour tester l'activité de la construction L 247a contenant le gène rapporteur Gus sous contrôle du promoteur DD1-b, ce plasmide a été co- transformé dans des protoplastes de tabac selon la technique du PEG (Pietrzak et al. 1986), avec un plasmide contenant le facteur de transcription ZmMRP-1 en aval d'un promoteur constitutif (GOMEZ et al., 1999 et GOMEZ et al., 2000). Une forte activité Gus a été observée indiquant que le promoteur contenait tous les éléments nécessaires pour être reconnus par ce facteur de transcription spécifique de la base du grain de maïs.
96
TABLEAU 14
Séquences de l'invention
Figure imgf000098_0001
97
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Claims

104REVENDICATIONS
1. Acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
2. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID n°3, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
3. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide régulateur de l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt chez une plante, ledit polynucléotide régulateur comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N° 3, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
4. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide régulateur de l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt chez une plante, ledit polynucléotide régulateur comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N° 4, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. 105
5. Acide nucléique selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle du polynucléotide régulateur.
6. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N° 5, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
7. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°9.
8. Acide nucléique selon la revendication 7 comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N° 7, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
9. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N° 6, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
10. Acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce 'il code pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 10. 106
11. Acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 11.
12. Acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N° 12.
13. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend au moins
12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
14. Acide nucléique selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences SEQ ID N° 13 à 17 et 20 à 32.
15. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 13 et 14, caractérisé en ce qu'il est marqué par une molécule détectable.
16. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 15.
17. Vecteur recombinant pour l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans la zone de transfert d'un grain de végétal en développement comprenant : a) un acide nucléique selon l'une des revendications 3 et 4 ; et b) un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de l'acide nucléique défini en a). 107
18. Vecteur recombinant d'expression comprenant : a) un acide régulateur de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans un organisme hôte déterminé ; et b) un polynucléotide d'intérêt constitué d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 6 à 12, le polynucléotide d'intérêt défini en b) étant placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur défini en a).
19. Vecteur recombinant selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur contenu dans la souche Escherichia coli déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le Numéro d'accès I-2567.
20. Vecteur recombinant selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur contenu dans la souche Escherichia coli déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le Numéro d'accès I-2568.
21. Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'une quelconques des revendications 1 à 15 ou par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 17 à 20.
22. Cellule hôte recombinante selon la revendication 21 caractérisée en ce qu'elle est d'origine bactérienne ou végétale.
23. Cellule hôte selon la revendication 21, caractérisée en en ce qu'il s'agit d'une cellule de la souche de Escherichia coli déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le Numéro d'accès I-2567 108
24. Cellule hôte selon la revendication 21 , caractérisée en en ce qu'il s'agit d'une cellule de la souche de Escherichia coli déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le Numéro d'accès I-2568
25. Cellule hôte selon la revendication 21 , caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de plante.
26. Plante transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14 ou par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 16 à 20.
27. Procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) obtention d'une cellule hôte recombinante végétale selon l'une des revendications 21 et 24; b) Régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue, à l'étape a) ; c) Sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14.
28. Procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Obtention d'une cellule hôte recombinante d' 'Agrobacterium tumefaciens selon la revendication 22 ; bj Transformation d'une plante d'intérêt par infection avec la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ; c) Sélection des plantes ayant intégré dans leur génome un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14.
29. Procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : 109
a) transfecter une cellule de plante avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14 ou avec un vecteur recombinant selon l'une des revendications 16 à 20 ; b) régénérer une plante entière à partir des cellules de plante recombinantes obtenues à l'étape a) ; c) sélectionner des plantes ayant intégré dans leur génome un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14.
30. Procédé d'obtention d'une plante transgénique selon l'une des revendications 27 à 29, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes de : d) croisement entre elles de deux plantes transgéniques telles qu'obtenues à l'étape c) ; e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène.
31. Procédé d'obtention d'une plante transgénique selon une des revendications 27 à 29, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes de : f) croisement d'une plante transgénique obtenue à l 'étape c) avec une plante de la même espèce ; g) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) ayant conservé le transgène.
32. Plante transgénique, telle qu'obtenue selon le procédé selon l'une des revendications 27 à 31.
33. Semence d'une plante transgénique selon la revendication 32.
34. Polypeptide codé par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 et 15 à 30. 110
35. Polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°9 ou polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°9, ou un fragment ou un variant de celui-ci.
36. Polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°10 ou polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°10 ou un fragment ou un variant de celui-ci.
37. Polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°11 ou polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°11 ou un fragment de celui-ci.
38. Polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID N°12 ou polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°12 ou un fragment de celui-ci.
39. Anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38.
40. Procédé pour détecter la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38 dans un échantillon comprenant les étapes de : a) mise en contact de l'échantillon avec un anticorps selon la revendication 39 ; b) détection du complexe antigène/anticorps formé 111
42. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 2 à 5 pour l'obtention d'une plante transformée à qualité agronomique, alimentaire ou industrielle améliorée.
41. Nécessaire ou kit pour la détection d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38 dans un échantillon, comprenant : a) un anticorps selon la revendication 39 ; b) le cas échéant, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la détection du complexe antigène/anticorps formé.
42. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 2 à 5 pour l'obtention d'une plante transformée à qualité agronomique, alimentaire ou industrielle améliorée.
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