WO2002085840A1

WO2002085840A1 - Process for producing n-formylamino acid and utilization thereof

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Publication number: WO2002085840A1
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Authority: WO
Inventors: Shigeru Kawahara; Tadashi Takemoto; Shinji Fujita; Ayako Ohno
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Filing date: 2002-04-16
Publication date: 2002-10-31
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Description

明細書

N—ホルミルァミノ酸の製造方法及びその使用技術分野

本発明は、 N—ホルミル中性アミノ酸及び N—ホルミルァスパラギン酸の新規製造方法に関し、更にァスパルテームの前駆体である N—ホルミル一 α— Lーァスパルチルー L—フエ二ルァラニンメチルエステル及びアスパルテームの新規製造方法に関する。背景技術 ,

アミノ基がホルミル基で保護された Ν—ホルミルァスパラギン酸、 Ν—ホルミル中性アミノ酸等の Ν—ホルミルアミノ酸は、各種ペプチド化合物の合成中間体として、食品や医薬品の分野で重要な化合物である。

特に、 Ν—ホルミルァスパラギン酸は、甘味料であるアスパルテームの中間体として重要な化合物である。アミノ酸のアミノ基保護基としてのホルミル基は比較的安価な試薬により導入することができ、例えば脱保護にパラジウム炭素による還元により脱保護されるベンジルォキシカルポニル基等に比べ、低コストで脱保護することができる。 Ν—ホルミルァスパラギン酸の合成法としては、例えば下記反応工程 1に示されるように、ギ酸及び無水酢酸を用いてァスパラギン酸を Ν—ホルミルァスパラギン酸無水物に変換した後に、加水分解する方法が知られている（例えば、ョ一口ピアンジャーナルォブバイオケミストリ一、 1 9 6 9年、 1 0号、 3 1 8— 3 2 3頁 (European Journal of Biochemistry, vol. 10， 318.323, 1969) 参照。）。

(反応工程 1 )

H0₂C、

，2" 、C0。 2H

アス^ラキ'ン酸 Ν―ホルミルァス /\°ラキ'ン酸無水物. Ν -ホルミルァス /\°ラキ'ン酸タン粒子とからなる複合粉末が得らこの複合粉末を用いることにより、窒化チタン粒子が窒化ケィ素の! ^長を抑制し、微細な結冓造で鍵の窒化ケィ素焼結体を ¾iできることが報告されている。

しかしながら、前述の窒化ケィ素結体は敏を示すものの、 ¾ϋϋ造用材料としての摩擦に関する特性、特にの省エネルギ化の傾向に関して最も期待されている無潤滑下での摩擦を低下させることについては未だ研究されていなかつに。

一方、ィ»擦係数を有するセラミック材料を作製するために的に行われる手法としては、窒化ホウ素、硫化モリブデン、グラフアイト等の固側滑材を材料中に分散させる手法がよく知られている。しかし、これら固 # 骨材の第 2相はサブミク口ン程度の大きさでしか分散させることができず、そのため摩擦係数の低下には限界があった。

また、特開平 1 1 - 4 3 3 7 2号公幸には Ml炭素を 0. 5〜5 0S*%未満含窒化ケィ素系結立の平均短難が。. 5 以下で、無潤滑下条件での摩擦係数が 0. 2以下を有する窒化ケィ素系セラミックスが ϋ¾されている。しかし、窒化ケィ素と避觸の組み合せは比摩耗量が 1 0一⁷ mm²/Nと低摩耗量については未だ課題が残っている。発明の開示

本発明は、このようなの事倩に鑑室温から中俯显域で優れた觀的特性を有すると共に、低い摩擦係数を有し耐摩耗性に優れた窒化ケィ素系焼結 # その ii方法、その!^結体を！ ^するに適した複^末及びその複合粉末の方法を ¾することを目的とする。 1 ホウ素を含む窒化ケィ素系複合粉末

本発明の第一の態様では、平均来立径が 2 0 nm以下の、窒ィ匕ケィ素、窒化チ夕ン、ホウ化チタン及び窒化ホウ素それそれの一次粒子と、該一次粒子の表面を覆う少なくともアモルファス相を含む相とからなるニ^ 立子粉末であり、上記二次複 "^立子の平均粒径が 0. 3〃m以上である窒化ケィ素系複末が搬さしかしながら、本方法は多量の無水酢酸とギ酸を用いる上に多段階の反応を必要とするため、 N—ホルミルァスパラギン酸の製法として満足できるものではない。

また、下記反応工程 2に示されるようにホルムアミドを用いた N—ホルミル— L一ァスパラギン酸の合成法が報告されている（米国第 4, 789, 757号特許、実施例 1参照。）。

(反応工程 2)

H0₂C、

9 、C0₇H

L-ァスハ。ラキ'ン酸 N—ホルミル— L—ァスハ。ラキ'ン酸

前記米国第 4, 789, 757号特許の実施例 1には、 Lーァスパラギン酸及び 5 倍モルのホルムアミド存在下、 95〜100°Cにて 2時間加熱攪拌することにより N 一ホルミル— Lーァスパラギン酸が定量的に生成する旨が記載されている。

しかしながら、本発明者等が当該実施例 1を追試した結果、生成する N—ホルミル —Lーァスパラギン酸の収率は出発原料である Lーァスパラギン酸に対して約 4 0%程度であった。このように、 N—ホルミルァスパラギン酸の工業的製造方法として十分に満足のいく方法が確立されているとは言い難い。

次に、 N—ホルミル— Lーァスパラギン酸（以下、「F— As p」と略記することがある。）から、アスパルテームの前駆体である N—ホルミル一 a— L—ァスパルチル—L—フエ二ルァラニンメチルエステル（以下、「F— APM」と略記することがある。）を合成する方法としては、 L一フエ二ルァラニンメチルエステル（以下、「L 一 PM」と略記することがある。）と F— As pを有機溶媒中で反応させる方法が提案されている（例えば、米国第 3， 786， 039号特許参照。）。

しかしながら、この方法は、 α異性体と /3異性体の両方が生成し、不要な j6異性体を除去するための分離、精製操作が必要となるため工業的に有利な方法とは言い難い。上記のような異性体を生じない方法としては、例えば特開昭 60— 164495号公報（EP 0149594) に、水溶液中、酵素としてサーモリシン存在下、 F— A

2 s pと L—フエ二ルァラニンメチルエステルとの縮合反応により F—APMを得る方法が報告されている。この実施例 1によると、 F— As pと L— PMを 1 ： 1のモル比で反応させ、スラリーを分離後、得られた固体（N—ホルミル— a— L—ァスパルチルー L—フエ二ルァラニンメチルエステル及び L一フエ二ルァラニンメチルェステルの（1 : 1) 付加物と同定。）を水に浮遊させ、 ρΗ値を 1. 6に調整し、酢酸ェチルで F— ΑΡΜを抽出しているが、収率は、全体で 12%程度である。また、実施例 3では F—As pと L— PMを 1 ： 2のモル比で反応させているが、縮合収率は F— As pに対して 41%と低い。実施例 2では F— As pと L一 PMを 5 ： 1のモル比で反応させ、縮合収率は L— PMに対しては 90 %となっているが、 F— As Pに対しては 9 %と低く、工業的に有利な方法とは言い難い。

また、特開平 10— 174597号公報には、酵素による縮合反応により F— AP Mを合成する際に、 F— As pと L— PMを溶解させた水非混和性有機溶媒を、酵素水溶液に連続的に供給し、生成した F— A P Mを有機層に抽出し連続的に取り出す方法が開示されている。しかしながら、本方法で有機層から F— APMを単離する方法については全く開示されておらず、最終的に F— APMを効率良く製造することができるか不明である。一方、 N—ホルミル中性アミノ酸は、前述の如く各種ペプチド化合物の合成中間体として重要であり、例えば、中性アミノ酸であるロイシンのァミノ基がホルミル化された N—ホルミルロイシンはロシュ（Roche) 社が上市した食欲調節剤、商品名「ォ —リスタツト（Orlistat)」の側鎖として使用されている。 N—ホルミルアミノ酸の合成法としては、ギ酸及び無水酢酸を用いてアミノ酸をホルミル化する方法（ジャーナルォブアメリカンケミカルソサイティー、 1958年、 80号、 1154頁参照。）が知られているが、この方法は、例えばアミノ酸に対して前者を 56倍モル、後者を 7倍モルというように大量のギ酸及び無水酢酸を使用するため N—ホルミルアミノ酸の工業的製法としては満足できるものとは言い難い。また、ホルムアミドを用いた N—ホルミルアミノ酸の合成法が提案されており（米国第 4， 789, 757号特許参照。）、この中でアミノ酸を 5倍モルのホルムアミド

3 中、 9 5〜1 0 0 °Cにて 2時間加熱攪拌することにより N—ホルミルアミノ酸が定量的に生成する旨報告されているが、本発明者等がこの方法を追試した結果では、生成する N—ホルミルアミノ酸の収率は僅かに 4 0 %程度であった。従って、この方法でも N—ホルミルアミノ酸の工業的製法としては満足できるものと言い難い。以上のような情況下に、 N—ホルミルァスパラギン酸及びァスパルテームの前駆体である N—ホルミル一一 L—ァスパルチル一 L -フエ二ルァラニンメチルエステル、並びに N—ホルミル中性アミノ酸を効率良くかつ工業的に簡便に製造する方法が求められている。発明が解決しょうとする課題

本発明が解決しょうとする課題は、甘味料アスパルテームの合成中間体として、重要な N—ホルミルァスパラギン酸（又はその塩）及びこれを出発物質とする甘味料ァスパルテームの前駆体である N—ホルミル— a—L—ァスパルチル— L—フエニルァラニンメチルエステルやアスパルテームの効率的な製造方法、更にはべプチド化合物の合成中間体として重要な N—ホルミル中性アミノ酸（又はその塩）を効率的かつ簡便に製造する方法の開発にある。発明の開示

本発明者等は前記多くの課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、下記のような多くの新知見を得、これ等の知見に基いて、下記のような各種の形態の発明を含む本発明を完成するに到った。

(新知見）

1 . 塩基の存在下にァスパラギン酸と、ホルムアミド及び Z又はギ酸メチルとを反応させることにより、 N_ホルミルァスパラギン酸（又はその塩）を高収率で製造することができる。ァスパラギン酸の塩と、ホルムアミド及び又はギ酸メチルとを反応させることにより N—ホルミルァスパラギン酸（又はその塩）を高収率で製造することができる。

4 2. F— As p及び/又はその塩と、 L一及び/又は DL—フエ二ルァラニンメチルエステル（以下、「L/DL— PM」と称することがある。）との酵素縮合反応により F— APMを製造する方法において、 F— As pの濃度を特定することで、効率良く F— APMを製造することができる。更に、特定のトリアルキルリン酸エステルを共存させることにより、目的化合物 F— A P Mがスラリ一状態で得られこれを分離 (濾過等）することにより容易に目的化合物を取得することができる。

3. 前記酵素縮合反応で得られるような F— APMと L一及び/又は D—フエ二ルァラニンメチルエステル (以下、「L/D - PM」と称することがある。) 付加物を特定範囲の P H値の水溶液中に懸濁させ、固体を分離することにより F— APMを得ることができる。

4. 塩基の存在下に、中性アミノ酸と、ホルムアミド及び Z又はギ酸メチルとを反応させることにより、 N—ホルミル中性アミノ酸（又はその塩）を高収率で製造することができる。中性アミノ酸の塩と、ホルムアミド及び/又はギ酸メチルとを反応させることにより、 N—ホルミル中性アミノ酸（又はその塩）を高収率で製造することができる。

(本発明に包含される各種形態の発明）

上記新知見に基づいて、本発明に含まれる下記各種形態の発明が提供される。

1. 塩基の存在下にァスパラギン酸と、ホルムアミド及び Z又はギ酸メチルとを反応させることに特徴を有する N—ホルミルァスパラギン酸又はその塩の製造方法；並びに

ァスパラギン酸の塩と、ホルムアミド及び Z又はギ酸メチルとを反応させることに特徴を有する N—ホルミルァスパラギン酸又はその塩の製造方法に特徴を有する N 一ホルミルァスパラギン酸又はその塩の製造方法。

以上、併せて「本発明のホルミル化法 1」と称することがある。

2. N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸及び Z又はその塩と、 L一及び Z又は D L—フエ二ルァラニンメチルエステルとの酵素縮合反応において、水溶液中の N—ホルミルー Lーァスパラギン酸の濃度が 1. 2mo 1/L以上であることに特徴を有す

5 る N—ホルミル—ひ一 L—ァスパルチルー L一フエ二ルァラニンメチルエステル（F - A P M) の製造方法（N—ホルミル一ひ— Lーァスパルチルー L一フエ二ルァラ二ンメチルエステルは、フエ二ルァラニンメチルエステルとの付加物の形態でもよい。）；並びに

前記酵素縮合反応において、トリー n—プチルリン酸エステル等のトリアルキルリン酸エステルを共存させ、スラリー状態で得られる目的生成物（当該付加物の形態で）を分離することにより F— A P Mを製造する方法。

以上併せて、「本発明の F— A P Mの製造方法；縮合反応」と称することがある。

3 . N—ホルミル—a _ L—ァスパルチル— L—フエ二ルァラニンメチルエステルのフエ二ルァラニンメチルエステル付加物を p H値 1 . 0 4. 5の水溶液中に懸濁し、固体を分離することに特徴を有する N—ホルミル— α— Lーァスパルチル一 L —フエ二ルァラニンメチルエステルの製造方法。

以上併せて、「本発明の F— Α Ρ Μの製造方法；分離方法」と称することがある。

4 . 塩基の存在下に中性アミノ酸と、ホルムアミド及び/又はギ酸メチルとを反応させることに特徴を有する Ν—ホルミル中性ァミノ酸又はその塩の製造方法；並び ϊ 中性アミノ酸の塩と、ホルムアミド及び/又はギ酸メチルとを反応させることに特徴を有する Ν—ホルミル中性アミノ酸又はその塩の製造方法。

以上、併せて「本発明のホルミル化法 2」と称することがある。

(本発明のホルミル化法 1について）

この発明は前述の如く、塩基の存在下にァスパラギン酸とホルムアミド及び 7又はギ酸メチルとを反応させるか；又は

ァスパラギン酸の塩とホルムアミド及び Ζ又はギ酸メチルとを反応させて Ν—ホルミルァスパラギン酸又はその塩を製造する方法に存する。

使用する塩基の種類には特に制限は無いが、塩基の例としては水酸化ナトリゥム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア等を挙げることができ、

6 この中から 1種又は複数種を選択し、使用することができる。

塩基の使用量に関しては特に制限は無いが、塩基をァスパラギン酸 1当量に対して 0. 15-2. 5当量程度使用することができる。

ァスパラギン酸の光学活性体に関しては特に制限は無く、 L一体、 D—体、及び D L—体何れも使用可能である。アスパルテームの前駆体用には Lーァスパラギン酸が好ましく使用される。

反応溶媒を使用することが好ましく、その際水、極性溶媒、又は水と極性溶媒との混合溶媒を使用することができる。

ホルムアミド及び/ ^/又はギ酸メチルの使用量に関しては特に制限は無いが、ホルムアミド及び/ ^又はギ酸メチルをァスパラギン酸に対して 0. 5〜 6倍モル程度使用することができる。

この発明においては、 N—ホルミルァスパラギン酸を遊離体又は塩の形態で製造し、取得することができる。例えば、遊離体を取得したい場合、生成する N—ホルミルァスパラギン酸の塩を通常の脱塩工程に付することでその遊離体を容易に製造し、取得することができ、これら全てこの発明に含まれる。

このようにして、 N—ホルミル一 L—ァスパラギン酸（及び又はその塩）を得た後、当該 N—ホルミル— L—ァスパラギン酸（及び Z又はその塩）とフエ'二ルァラ二ンメチルエステル (L—体、 DL—体等）とを縮合し N—ホルミル— α— L—ァスパルチルー L一フエ二ルァラニンメチルエステルとし、更にこれをアスパルテームに変換することによりアスパルテームを製造することができる。このような N—ホルミルアスパルテーム（アスパルテーム前駆体）やアスパルテームの製造方法もこの発明に含まれる。

(本発明の F—APMの製造方法；縮合反応について）

この発明は、 N—ホルミル一 L—ァスパラギン酸及び/又はその塩と、 L—及び/ 又は DL—フエ二ルァラニンメチルエステルとの酵素縮合反応において、水溶液中の N—ホルミル— L—ァスパラギン酸の濃度が 1. 2mo 1 /L以上、好ましくは 2. 7〜27mo lZL、より好ましくは 3. 5〜17mo l /Lで酵素反応を行い N— ホルミル一一 Lーァスパルチルー L—フエ二ルァラニンメチルエステルを製造す

7 る方法に存し、このとき N—ホルミル一 α— L—ァスパルチルー L—フエ二ルァラ二ンメチルエステルは、フェニルァラニンメチルエステルとの付加物の形態でもよい。酵素の反応系において、 N—ホルミル—L—ァスパラギン酸及び /"又はその塩と、 L—及び/又は D L—フエ二ルァラニンメチルエステルとのモル比を、 N—ホルミル —L—ァスパラギン酸 1に対して後者が好ましくは 0 . 5 ~ 3程度、より好ましくは 1 . 7〜2 . 3程度になるように調整するとよい。

使用する酵素については、 N—ホルミル— Lーァスパラギン酸と、 L一及び/又は D L—フエ二ルァラニンメチルエステルとで酵素縮合反応を行う酵素であれば特に制限は無いが、プロテア一ゼが好ましく使用される。

ここで使用する N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸及ぴ Z又はその塩については、前記本発明のホルミル化法 1で製造されたものを好ましく使用することができる。、従って，前記本発明のホルミル化法 1に引き続き、この発明を実施するのが好適である。

トリアルキルリン酸エステルとしては水に対して非混和性の液状トリアルキルリン酸エステルが用いられ、好ましくは 3つのアルキル基がそれぞれ相互に独立して炭素数 4〜 6のアルキル基であるトリアルキルリン酸エステルが用いられる。特にトリ一 n—プチルリン酸エステルが好適である。

当該トリアルキルりン酸エステルの使用量については、好ましくは水溶媒 1に対して重量比 2〜3 0程度、より好ましくは 5〜 2 0程度卜リアルキルリン酸エステルを使用することができる。

(本発明の F— A P Mの製造方法；分離方法について）

この発明は、 N—ホルミル— Q!— L—ァスパルチル— L—フエ二ルァラニンメチルエステルのフエ二ルァラニンメチルエステル付加物を p H 1 . 0〜4. 5、好ましくは 2〜 3程度の水溶液中に懸濁し、固体を分離することにより N—ホルミル一 — L ーァスパルチル一 L—フエ二ルァラニンメチルエステルを製造する方法に存する。当該付加物は、本発明の F— A P Mの製造方法；縮合反応で得られる付加物を使用することができる。従って、本発明の F—A P Mの製造方法；縮合反応に引き続き、本発明の F— A P Mの製造方法；分離方法を実施するのが好適である。

8 以上の如く、 N—ホルミル— a— L—ァスパルチル— L一フエ二ルァラニンメチルエステルを得た後、ホルミル基を除去することにより一 Lーァスパルチルー L一フェニルァラニンメチルエステル（アスパルテーム）を製造することができ、このようなアスパルテームの製造方法もこの発明に含まれる。

(本発明のホルミル化法 2について）

この発明は、塩基の存在下に中性アミノ酸と、ホルムアミド及び/又はギ酸メチルとを反応させるか；又は

中性アミノ酸の塩と、ホルムアミド及び Z又はギ酸メチルとを反応させることにより N—ホルミル中性アミノ酸又はその塩を製造する方法に存する。

この発明に使用する塩基には特に制限は無く、例えば水酸化ナトリウム、水酸化力リウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア等を挙げることができ、この中から 1種又は複数種を選択、使用することができる。

当該反応において、中性アミノ酸に対し、塩基を 0 . 1〜1 0倍モル程度使用することができる。

この発明に使用する中性アミノ酸の塩には特に制限は無く、例えばナトリゥム塩、カリウム塩、アンモニゥム塩等を挙げることができ、この中から 1種又は複数種を選択、使用することができる。

使用する中性ァミノ酸の種類等には特に制限は無く、例えば中性アミノ酸の例としてロイシン、イソロイシン及びバリンを挙げることが'できる。これらの何れか 1種又は複数種をこの発明の出発物質に使用することができる。

当該反応においては、中性アミノ酸に対し、ホルムアミド及び/又はギ酸メチルを 0 . 5〜6倍モル程度使用することができる。

この発明においては、 N—ホルミル中性アミノ酸を遊離体又は塩の形態で製造し、取得することができる。例えば、遊離体を取得したい場合、生成する N—ホルミル中性アミノ酸の塩を通常の脱塩工程に付することでその遊離体を容易に製造し、取得することができ、これら全てこの発明に含まれる。

出発物質に使用する中性アミノ酸の光学活性体には特に制限は無い。 L—体、 D— 体、 D L—体何れも使用可能である。

9 実施の形態

以下に、本発明の実施の形態について詳細に説明する。好ましい代表例を中心に説明するので本発明がこれに制限されることはない。

(本発明のホルミル化法 1 )

この発明は、塩基の存在下にァスパラギン酸と、ホルムアミド及び/又はギ酸メチルとを反応させることによる N—ホルミルァスパラギン酸又はその塩の製造方法；及び

ァスパラギン酸の塩と、ホルムアミド及び Z又はギ酸メチルとを反応させることによる N—ホルミルァスパラギン酸又はその塩の製造方法

に存する。この発明に使用するァスパラギン酸の光学異性は特に限定されず、 D L—ァスパラギン酸、 L—ァスパラギン酸又は D—ァスパラギン酸の何れを用いてもよい。本発明の製造方法においては、通常の反応条件に従えばラセミ化は起こり難く、光学活性なァスパラギン酸を用いることにより N—ホルミルァスパラギン酸又はその塩を光学活性体として得ることができる。

この発明における反応は溶媒中で行うのが好ましいが、溶媒を用いずに行うこともできる。溶媒を使用する場合'、溶媒は反応に不活性なものであれば特に制限されないが、水、極性溶媒、又は水と極性溶媒との混合溶媒が好ましく用いられる。

極性溶媒としては水と混和する極性溶媒が好ましく、例えば、メタノール、ェタノール、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。これらの極性溶媒は 1種以上を混合して用いてもよい。

使用する塩基の種類は特に制限されないが、好ましいものとして、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニアを挙げることができる。特に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアが好ましい。これらの塩基は 1種以上を混合して用いてもよい。

'酸の塩には特に制限は無く、その例としてァスパラギン酸：

10 ゥム塩、ァスパラギン酸ジナトリウム塩、ァスパラギン酸モノカリウム塩、ァスパラギン酸ジカリウム塩、ァスパラギン酸モノアンモニゥム塩、ァスパラギン酸ジアンモ二ゥム塩等を挙げることができ、この中から 1種又は複数種を選択して、使用することができる。

溶媒を使用する場合、使用する溶媒の量は特に限定されず、原料のァスパラギン酸又はその塩や塩基がこの発明の効果を妨げない程度に溶解できればよい。当業者であれば好ましい条件を適宜容易に設定することができる。

使用するホルムアミド又はギ酸メチルの使用量としては特に制限はないが、ァスパラギン酸又はその塩に対して通常 0 . 5〜 6倍モル程度、好ましくは 1 . 5〜3倍モル程度で使用することができる。尚、溶媒を用いずに反応を行う場合は通常 2〜1 0 倍モル程度、好ましくは 3〜 5倍モル程度で使用することができる。

ギ酸メチルとホルムアミドを併用して使用することもでき、その場合ホルムアミド及びギ酸メチルの合計の使用量を上記範囲で使用することができる。

塩基を使用する場合、塩基の量としては、使用するァスパラギン酸 1当量に対して通常 2〜 1 0当量程度であり、好ましくは 0 . 3〜 5当量程度である。尚、ここで「当量」とは酸塩基の当量のことである。例えば、ァスパラギン酸 1当量に対して水酸化ナトリウムを 1当量添加する場合、ァスパラギン酸が 1 m o 1存在していれば水酸化ナトリウムを 2 m o 1添加することになる。

塩基の量が少な過ぎると反応速度が遅くなる傾向にあるため好ましくない。また塩' 基め量が多過ぎると副反応が進行する傾向にあるため好ましくない。

反応温度としては特に制限は無いが、通常 3 0〜1 3 0 °Cの範囲であり、好ましくは 4 0〜1 0 0 °Cの範囲である。温度が高過ぎるとラセミ化等の副反応が進行する傾向にあり、低過ぎると反応速度が遅くなる傾向にあるため好ましくない。尚、反応は撹拌下に行うのが好ましい。

この発明において、塩基とァスパラギン酸は中和反応を起こして対応するァスパラギン酸の塩を生成する。従って本発明においては、ァスパラギン酸の代わりにァスパラギン酸の塩を用いることで、塩基を添加せずに反応させることもできる。この場合、その他の反応条件は前記に記載したのと同様の条件を用いればよい。また、ァスパラギン酸の塩の光学異性も前記と同様に特に限定されず、 D L—ァスパラギン酸塩、 L

11 ーァスパラギン酸塩又は D—ァスパラギン酸塩の何れを用いてもよい。

この発明により得られた N—ホルミルァスパラギン酸は、反応終了時には溶液中に対応する塩の形態で存在する。反応液溶液を常法に従って、中和、抽出、晶析等の操作を任意に行うことにより、また必要な脱塩工程や造塩工程を利用して製造すべき目的物質を N—ホルミルァスパラギン酸（遊離体）の形態で、或いはその塩の形態で単離精製することができる。

上記の如く調製製造した N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸は公知方法、例えば特公昭 6 0— 1 6 4 4 9 5号公報の実施例 1に記載されているように、 L一フエニルァラニンメチルエステルと酵素的に縮合させることでアスパルテームの重要中間体（前駆体）である N—ホルミル一 a— L—ァスパルチルー L一フエニルァラニンメチルェステルを調製することもできるが、本発明の F— A Ρ Mの製造方法に従って L一フエ二ルァラニンメチルエステルと酵素的に縮合させることで上記 N—ホルミル一ひ一 L—ァスパルチルー L一フエ二ルァラニンメチルエステルをより効率的に得ることができる。

また、このようにして得られる N—ホルミル一 α— Lーァスパルチル— L一フエ二ルァラニンメチルエステルは、公知方法例えば、特開昭 5 8 - 1 8 5 5 4 5実施例 1 0に記載されているように、塩酸存在下においてメ夕ノ一ル—水混合溶媒を用いてホルミル基を加水分解した後に、炭酸ナトリウムで中和することでアスパルテームに変換することができる。，

この発明の方法において、特に低温で反応を行う場合、反応途中から結晶が析出してくることがある。この場合、反応溶液を比較的強く撹拌しながら反応を行えばよい。撹拌は、例えばニーダ一やホモジナイザー等の撹拌装置により行うことができる。

(本発明の F— Α Ρ Μの製造方法；縮合反応）

この発明は、 Ν—ホルミル—Lーァスパラギン酸及び/又はその塩（F— A s p ) と、 L一及び/又は D L—フエ二ルァラニンメチルエステル及び/又はその塩 (し/ D L - P M) との酵素縮合反応において、水溶液中の F— A s pの濃度を 1 . 2 m o 1 以上とすることに特徴を有する N—ホルミル一 α— L—ァスパルチルー L一フエ二ルァラニンメチルエステル（F— Α Ρ Μ) の製造方法（Ν—ホルミル— a— L

12 —ァスパルチルー L一フエ二ルァラニンメチルエステルは、 L一及び/又は D—フエ二ルァラニンメチルエステルとの付加物〔以下、「F - APM · LXD-PMJ と略記することがある。] の形態でもよい）に存する。

尚、本発明の酵素縮合反応における N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸は遊離体で用いてもよく、ナトリウム塩等の塩の形態で用いてもよい。同様に L—及び Z又は D L一フエ二ルァラニンメチルエステルは遊離体で用いてもよく塩酸塩等の塩の形態で用いてもよい。

水溶液中の F— As pの濃度は好ましくは 2. 7〜27mo 1 ZLの範囲とするのがよく、より好ましくは 3. 5~17mo 1 /Lの範囲とするのがよい。このように水溶液中の F— As pの濃度を 1. 2mo 1 ZL以上、好ましくは 2. 7〜27mo 1ZL、より好ましくは 3. 5〜17mo 1ZLとすることにより、酵素縮合反応が高い転化率で進行することにより、 F— A s pに対する F— APMの収率を 50 %以上、好ましくは 60%以上とすることが可能となる。

酵素縮合反応の溶媒としては、通常、水が単独で用いられる。酵素縮合反応に支障が無い範囲でメ夕ノ一ル、エタノール等の水とよく混和する有機溶媒を水に混合することもできるが、通常その必要性はない。尚、本発明における「水溶液」には酵素縮合反応における溶媒が水のみである場合だけでなく、メタノール、エタノール等の水とよく混和する有機溶媒と水との混合溶媒である場合も含まれる。

酵素縮合反応における水溶液中の F— A s pと L/DL— PMの比率はモル比で通常 1 ： 0. 5〜1 ： 3の範囲で設定される。本発明においては、通常、酵素縮合反応の進行と同時に反応生成物である N—ホルミル一 α— Lーァスパルチル一 L—フェニルァラニンメチルエステルが L一及び/又は D—フエ二ルァラニンメチルエステルとの 1 ： 1の付加物の形態で析出してくる（該付加物は HP LCで分析した場合 F— As pと LZD— PMのそれぞれのピークが観察される。）。従って、反応収率を上げるため、上記比率をモル比で 1 : 1. 7〜1 ： 2. 3の範囲とするのがより好ましい。実際には上記比率をモル比で約 1 ： 2として酵素縮合反応を行えばよい。このような比率で酵素縮合反応を行い未反応物を低減化することで、未反応物を除去するための複雑な精製工程を省略化することが可能となる。

尚、反応開始時に存在する水とは別に、縮合反応が進行すると副生物として水が生

13 成する。酵素縮合反応をバッチ法で行う場合には反応開始時の水溶液中の F— A s p の濃度及び F— A s pと L/D L— P Mの比率を上記範囲に設定すればよく、また酵素縮合反応を連続式で行う場合には反応中の反応槽の F— A s pの濃度及び F— A s pと L /D L— P Mの比率を上記範囲に設定すればよい。

酵素は中性プロテア一ゼが好ましく用いられる。例えば、「サモア一ゼ P S 1 6 0」

(大和化成製）或いは「サモア一ゼ C 1 6 0」（大和化成製）のような市販のサ一モリシン様金属プ口テァ一ゼが使用できる。このようなサモア一ゼの至適 p H値は通常の酵素縮合反応においては 6〜 8であるが、本発明の酵素縮合反応における p H値は、通常 5〜 6の範囲、より好ましくは 5 . 2〜5 . 8の範囲に設定される。この範囲外の p H値で酵素縮合反応を行った場合、転化率が低下するため好ましくない。尚、 p Hの調整は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等の塩基又は塩酸、硫酸等の酸を用いて行えばよい。 '

酵素の使用量は F— A s pを 1とした場合に重量比で通常 0 . 0 2 5〜4、好ましくは 0 . 0 5〜2の範囲とすることができる。これらの酵素は通常少量のカルシウムイオン（II) の存在により酵素の安定化及び作用に有利な効果があることが知られており、この発明における酵素縮合反応においてもカルシウムイオン（II) を存在させるのが好ましい。カルシウムイオン（II) を反応溶液中（水溶液中）に存在させるための試薬としては、炭酸カルシウム、塩化カルシウム及び酢酸カルシウム等のカルシゥム塩を用いることができる。水溶液中に存在させるカルシウムイオン（II) の量は使用する酵素基に対し、重量比で通常 0. 1 5〜0 . 5の範囲で設定される。

酵素による縮合反応は、通常 1 0〜6 0 °Cの範囲で設定することができ、好ましくは 3 0〜5 0 °Cの範囲で設定するのがよい。反応時間は特に限定されないが、通常 3 0分〜 2 4時間程度とすることができる。

本発明における酵素縮合反応では、反応基質が高濃度の状態で反応が行われるため、通常、反応が進行するにつれ N—ホルミル一 α— Lーァスパルチルー L—フエニルァラニンメチルエステルの L一及び Ζ又は D—フエ二ルァラニンメチルエステルとの付加物の生成により反応容器内で反応溶液が流動性を失い固化した状態となる。しかしな力 Sら、水に非混和性である特定のトリアルキルリン酸エステルの存在下に酵素縮合反応を行うことにより反応溶液をスラリ一状態とすることができ、該スラリ一から

14 固体（当該付加物の結晶）を濾過、遠心分離等の公知の分離方法により分離することで、効率的に当該付加物の結晶を取得することができる。この場合、スラリー状態とするために攪拌下で反応を行うのが好ましい。尚、酵素縮合反応は反応開始時に出発原料等が十分に均一に混合されていれば、反応系に何ら力学的作用が付加されない状態、例えば静置状態であっても反応は良好に進行するため、流動性が失われ攪拌が困難となった場合でも酵素反応の転化率の観点からは問題はない。

本発明で用いられるトリアルキルリン酸エステルとしては、水に非混和性の液状のアルキルリン酸エステルが用いられる。好ましくはトリアルキルリン酸エステルを構成する 3つのアルキル基がそれぞれ相互に独立して炭素数 4〜 6のアルキル基であるものが用いられる。特に入手が容易であるトリー n—ブチルリン酸エステルが好ましい。トリメチルリン酸エステル、トリェチルリン酸エステル等の水と混和性のトリアルキルリン酸エステルは酵素を失活させる傾向にあるので好ましくない。

トリアルキルリン酸エステルの使用量は、酵素縮合反応の溶媒として用いる水 1に対して重量比で 2〜 3 0とするのが好ましく、更には 5〜2 0とするのが好ましい。溶媒として水とよく混和する有機溶媒と水との混合溶媒が用いられる場合、混合溶媒中の水の量を 1として重量比で上記値に設定すればよい。

反応開始時に存在する水とは別に、縮合反応が進行すると副生物として水が生成するが、酵素縮合反応をバッチ法で行う場合には上記トリアルキルリン酸エステルの比は反応開始時の水の量を 1として設定すればよく。また酵素縮合反応を連続式で行う場合には反応中の反応容器内の水の量を 1として設定すればよい。

尚、酵素縮合反応中、 L—及び Z又は D L—フエ二ルァラニンメチルエステルがトリアルキルリン酸エステル相に移動する^向にあるため、酵素縮合反応の収率を上げる観点から、予め使用するトリアルキルリン酸エステルに L—及び又は D L—フエ二ルァラニンメチルエステル（遊離体）を溶解させておくのが好ましく、更には飽和状態で溶解させておくの力好ましい。また反応系中に存在させるトリアルキルリン酸エステルの基からトリアルキルリン酸エステル相に移動する L ZD L一 P Mの量を予測して、予めその分の L ZD L— P Mを余分に水溶液中に溶解させておくこともできるが、水溶液中では L /D L— P Mが加水分解される傾向にあり、また L—及び又は D L—フエ二ルァラニンメチルエステルの塩を用いる場合に、反応中に無機塩

15 が蓄積し酵素反応に悪影響を及ぼすことがあるため、予めトリアルキルリン酸エステル中に溶解させておくの力反応収率及び L/DL— PMの回収、再利用の観点から好ましい。 L—及び/又は DL—フエ二ルァラニンメチルエステル（遊離体）が溶解或いは飽和したトリアルキルリン酸エステルは、例えば L/D L一 PMを水に溶解し、卜リアルキルリン酸エステルを加えて抽出し有機層を分離することにより得ることができる。この際、抽出は実際に実施する酵素縮合反応の温度で行うのが好ましい。このように抽出操作をした場合など、トリアルキルリン酸エステルはある程度の水を含むことがあるが、上述した F— As pの濃度計算において、この卜リアルキルリン酸エステルに含まれる水は水溶液中の水の量には含めない。尚、卜リアルキルリン酸エステル中に含まれる水の量は例えばカールフィッシャ一法等により測定することができる。実際の反応温度において上記の抽出操作により L及び又は DL—フエ二ルァラニンメチルエステル並びに水を卜リアルキルリン酸エステル中に飽和させた場合に同じく飽和状態で含まれる水（並びに L及び/又は D L—フエ二ルァラニンメチルエステル) の量を測定し、予め実際に使用するトリアルキルリン酸エステルを飽和させる量の水を過剰に水溶液に添加しておくこともできる。この場合、過剰に添加された水は上述した F— A s pの濃度計算において水溶液中の水の量には含めない。本発明においては、 F— APMは通常 L— /D— PMの 1 ： 1の付加物の形態で得られるが、公知の分離方法、或いは後述する本発明の F— APMの製造方法：分離方法）により F— APMの遊離体を得ることができる。また更に遊離体を任意の塩とすることもできる。

(本発明の F— APMの製造方法：分離方法）

この発明は、 N—ホルミル一 Q!— L—ァスパルチルー L一フエ二ルァラニンメチルエステルの L一及び/又は D—フエ二ルァラニンメチルエステル付加物、例えばその 1 ： 1の付加物を pH値 1. 0〜4. 5、好ましくは 2〜 3の水溶液中に懸濁し、固体を分離することに特徴を有する N—ホルミル一ひ一 L—ァスパルテル一 L—フエ二ルァラニンメチルエステルの製造方法に存する。尚、本発明に用いる当該付加物 (即ち F— APM · L/D-PM)は前述した本発明における縮合反応で得られる当該付加物、好ましくは前述したトリアルキルリン酸エステル存在下に行う縮合反応により、

16 結晶として得られた当該付加物を好適に用いることができる。

本発明の酵素縮合反応により得られるような N—ホルミル—a— L—ァスパルチルー L—フエ二ルァラニンメチルエステルの L一及び/又は D—フエ二ルァラニンメチルエステル付加物（通常はその 1 ： 1付加物）は、上述したような p H値の水溶液中に懸濁することにより、 L—及び/又は D一フエ二ルァラニンメチルエステルが水溶液中に溶解するため N—ホルミル一 α— L—ァスパルチル— L一フエニルァラニンメチルエステルを選択的に固体として分離することができる。水溶液の ρ Ηは当該付加物を懸濁させる前に予め上記値に調整していてもよく、また懸濁後に Ρ Η調整を行ってもよい。水溶液の溶媒としては、通常、水が単独で用いられる。メタノール、エタノ一ル等の水とよく混和する有機溶媒を水に混合することもできるが、通常その必要性はない。尚、ここでいう「水溶液」には溶媒が水のみである場合;^けでなく、メタノール、エタノール等の水とよく混和する有機溶媒と水との混合溶媒である場合も含まれる。

水溶液の量は上記目的を達成すれば特に限定されず当業者は適宜好ましい条件を設定することができるが、例えば当該付加物 1に対し重量比で 7〜 1 0の範囲で行うことができる。温度も特に限定されず、通常は室温で行えばよい。なお更に純度を高めるため必要によりこの操作を繰り返してもよい。

このようにして得られる Ν—ホルミル一 - L—ァスパルチルー L―フエニルァラニンメチルエステルは当業者に公知の方法、例えば塩酸存在下において、メタノ一ルー水混合溶媒を用いてホルミル基を除去する方法等（例えば、特開昭 5 8 - 1 8 5 5 4 5号公報、実施例 1 0参照）により Q!— L—ァスパルチル— L一フエ二ルァラ二ンメチルエステル (アスパルテーム) とすることができる。

尚、アスパルテームの製造に当たり、「本発明のホルミル化法 1」、「本発明の F— A P Mの製造方法；縮合反応」（好ましくは卜リアルキルリン酸エステル存在下に行う該方法)及び「本発明の F— A P Mの製造方法；分離方法」の各プロセスを任意に組み合わせて、好ましくは全てのプロセスを組み合わせて用いることで、より効率的に、かつ工業的に簡便にアスパルテームを製造することができる。

(本発明のホルミル化法 2 )

17 この発明は、塩基の存在下に中性アミノ酸と、ホルムアミド及び/又はギ酸メチルとを反応させることに特徴を有する N—ホルミル中性アミノ酸又はその塩の製造方法；並びに

中性アミノ酸の塩と、ホルムアミド及び/又はギ酸メチルとを反応させることに特徴を有する N—ホルミル中性ァミノ酸又はその塩の製造方法

に存する。この発明の出発物質には中性アミノ酸又は中性アミノ酸の塩を使用するが、反応の具体的な形態としては中性アミノ酸（遊離体)、中性アミノ酸の塩、これ等遊離体と塩の混合物を出発物質として使用することができる。更に、当該中性アミノ酸は 1種類のアミノ酸でも複数種アミノ酸の混合物でもよく、また当該塩についても 1種単独の塩でも複数種混合塩でもよいが、反応を工業的に制御する上から 1種のアミノ酸或いはその塩（1種） ¾使用する方が望ましい。

前記の如く、本発明で使用する中性アミノ酸の光学異性については特に限定されず、 L体、 D体又は D L体の何れを用いてもよい。本発明においては N—ホルミル化反応' 中ラセミ化は起こり難く、光学活性な中性アミノ酸（又はその塩）を出発物質に用いることにより、当該反応後に N—ホルミル中性ァミノ酸又はその塩を光学活性体として得ることができる。

この発明における N—ホルミル化反応については、前記本発明の特徴部分以外ではァミノ基の N—ホルミル化法としてそれ自体知られている従来法や今後開発される方法を利用することができる。

この発明におけるホルミル化反応は溶媒を使用せずに行うことができる。溶媒を使用する場合、溶媒は反応に不活性なものであれば特に制限されないが、水、極性溶媒、又は水と極性溶媒との混合溶媒が好適に使用される。

極性溶媒としては水と混和するものが好ましく、例えば、メタノール、エタノール等アルコールや、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。勿論、これ等の極性溶媒は 1種以上混合してもよい。

使用する塩基の種類には特に制限は無いが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等炭酸塩、アンモニア、卜リエチルァミン

18 等ァミン類が好適に用いられる。特に、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニァ等が好ましい。勿論、これらの塩基は混合して用いてもよい。

溶媒を使用する場合、使用する溶媒の量に特に制限は無く、出発物質の中性アミノ酸（或いはその塩）や塩基が本発明の効果を妨げない程度に溶解できればよい。当業者であれば好ましい条件を適宜選択して容易に設定することができる。

使用するホルムアミド、或いはギ酸メチルの使用量については特に制限は無いが、出発物質に使用する中性アミノ酸或いはその塩に対して、また遊離体と塩の混合物の形態で使用する場合この混合物に対し、好ましくは 0 . 5〜6倍モル程度であり、より好ましくは 1 . 5〜3倍モル程度である。尚、溶媒を用いずに反応を行なう場合、好ましくは 2〜 1 0倍モル程度、より好ましくは 3〜 5倍モル程度使用することができる。前記したようにホルミルィ匕剤としてホルムアミドとギ酸メチルの混合物を使用することもできるが、この場合この混合物を前記出発物質に対して好ましくは 0 . 5 〜6倍モル程度、より好ましくは 1 . 5〜 3倍モル程度使用することができるし、また溶媒を用いずに反応を行なう場合には、好ましくは 2〜1 0倍モル程度、より好ましくは 3〜 5倍モル程度使用することができる。

この発明において塩基の使用量に関しては、出発物質の中性アミノ酸に対し、塩基を好ましくは 0 . 1〜1 0倍モル程度、より好ましくは 0 . 2〜5倍モル程度、更に好ましくは 0 . 2〜2 . 5倍モル程度使用することができる。

塩基の量が少な過ぎると反応速度が遅くなる傾向にあるため好ましくはない。また、塩基の量は多過ぎると、副反応が進行する傾向にあるため好ましくはない。

この発明に使用する反応温度としては特に制限は無いが、高過ぎるとラセミ化等の副反応の問題があり、低過ぎると反応が遅くなる傾向にあるため、好ましくは 3 0〜 1 3 0 °C程度の範囲、より好ましくは 4 0〜 1 0 0 °C程度の範囲から選択することができる。

この発明においては、出発物質として中性アミノ酸（遊離体）を使用することができるが、中性アミノ酸の塩を用いることもできる。反応の具体的な形態としてその混合物を使用することもできる。中性アミノ酸の塩を出発物質に使用する場合でも、反応条件等は前記同様であり前記説明から容易に実施することができる。尚、本発明において、出発物質に遊離体の中性アミノ酸を使用する場合、当該反応において塩基と

19 中性アミノ酸は中和反応を起こして対応する塩を生成する。従って、このように生成した塩を出発物質の中性アミノ酸の塩と称することもできるし、別途出発物質用に調製、又は用意された中性アミノ酸の塩を前記中性アミノ酸の塩と称することもできる。中性アミノ酸の塩としてはナトリウム塩、カリウム塩、アンモニゥム塩等が挙げられる。

本発明により得られた N—ホルミル中性アミノ酸は、通常反応終了時に対応する塩の形態で存在する。反応液を定法に従って、中和、抽出、晶析等の操作を任意に行なうことにより、また必要な脱塩工程や造塩工程を利用して、製造すべき目的物質を、 N—ホルミル中性アミノ酸（遊離体）或いはその塩の形態で得ることができる。好適な実施の形態

以下、実施例、比較例及び参考例により本発明を詳細に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。

(本発明のホルミル化法 1)

ぐ実施例 1 >

反応容器に、 Lーァスパラギン酸を 1. O g (7. 5mmo l )、ホルムアミドを 0. 30m l (7. 5mmo l)、水を 0. 21 m 1順次加えた後に、水酸化ナトリゥム水溶液を 0. 78ml (9. 6M、 7. 5 mm o 1 ) 加えて p Hを 8. 7に調整した。 50°Cで 22時間反応させた後に、高速液体クロマトグラフィー（HPLC) により生成物を分析したところ、 N—ホルミル— Lーァスパラギン酸が 0. 45 g (3 6. 8 %：対 Lーァスパラギン酸）生成していた。

ぐ実施例 2 >

反応容器に、 L—ァスパラギン酸を 1. 02 g (7. 7mmo l)、ホルムアミドを 0. 61ml (15. Ommo l )、水を 0. 19 m 1順次加えた後に、水酸化ナトリウム水溶液を 0. 80ml (9. 6M、 7. 7 mm o 1 ) 加えて p Hを 8. 4に調節した。 50°Cで 22時間反応させた後に、高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、 N—ホルミル〜 Lーァスパラギン酸が 0, 42 g (33. 9 %：対 Lーァスパラギン酸）生成していた。

20 ぐ実施例 3 >

反応容器に、 Lーァスパラギン酸を 1. 00 g (7. 5mmo 1 )、ホルムアミドを 0. 91m l (22. 5mmo l)、水を 0. 21m l順次加えた後に、水酸化ナトリウム水溶液を 0. 78ml (9. 6M、 7. 5 mm o 1 ) 加えて p Hを 8. 7に調節した。 50°Cで 22時間反応させた後に、高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、 N—ホルミル一 L—ァスパラギン酸が 0. 59 g (48. 7 %：対 Lーァスパラギン酸）生成していた。

<実施例 4>

反応容器に、 Lーァスパラギン酸を 1. 03 g (7. 7mmo l )、ホルムアミドを 0. 30ml (7. 5mmo 1 )、水を 0. 77m l順次加えた後に、ペレット状の水酸化ナトリウムを 0. 61 g (15. 4mmo 1 ) 加えて pHを 11. 1に調節した。 50 °Cで 22時間反応させた後に、高速液体ク口マトグラフィ一により生成物を分析したところ、 N—ホルミル— L—ァスパラギン酸が 0. 76 g (61. 6% 対 Lーァスパラギン酸）生成していた。

<実施例 5 >

反応容器に、 L—ァスパラギン酸を 1. O l g (7. 6mmo l)、ホルムアミドを 0. 61ml (15. 01111110 1)、水を0. 77 m 1順次加えた後に、ペレット状の水酸化ナトリウムを 0. 57 g (15. lmmo 1 ) 加えて pHを 11. 2に調節した。 50°Cで 22時間反応させた後に、高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、 N—ホルミル— Lーァスパラギン酸が 1. l g (90. 6% 対 Lーァスパラギン酸）生成していた。

<実施例 6 > ，

反応容器に、 L—ァスパラギン酸を 1. 02 g (7. 7mmo l)、ホルムアミドを 0. 91ml (22. 51111110 1)、水を0. 77 m 1順次加えた後に、ペレット状の水酸化ナトリウムを 0. 61 g (15. 4mmo 1) 加えて pHを 11. 2に調節した。 50°Cで 22時間反応させた後に、高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、 N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸が 1. 2 g (94. 4% 対 L—ァスパラギン酸）生成していた。

ぐ実施例 7 >

21 反応容器に、 Lーァスパラギン酸モノカリウム塩を 1. 50 g (8. 8mmo l)、ホルムアミドを 1. 20 g (26. 3mmo l) 加えた後に、 100°Cで 4. 5時間反応させた。高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、 N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸が 1. 20 g (85. 0%：対 L—ァスパラギン酸）生成していた。

<実施例 8>

反応容器に、 L—ァスパラギン酸を 1. O g (7. 6mmo l)、ホルムアミドを 0. 71 g (15. 2mmo 1 )、 29 %アンモニア水を 1. 1 1 g ( 19. Omm o 1) 順次加えた後に、 50°Cで 27時間反応させた。高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、 N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸が 1. l g (8 8. 8%：対 L—ァスパラギン酸）生成していた。

ぐ実施例 9 >

反応容器に、 Lーァスパラギン酸を 10. O g (75. lmmo l)、ホルムアミドを 7. O g (150. 3mmo I)、 30 %メタノール一水を 21. 4ml順次加えた後に、ペレット状水酸化ナトリウムを 6. 26 g (150. 3mmo l) 加えて pHを 10. 4に調節した。 40°Cで 27時間反応させた後に、高速液体クロマトグラフィ一により生成物を分析したところ、 N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸が 9. 4 g (77. 7 %：対 L—ァスパラギン酸）生成していた。

ぐ比較例 1 >

US 4789757の実施例 1に従い、反応容器に Lーァスパラギン酸を 1. 0 g (7. 7mmo 1 )、ホルムアミドを 1. 8 g (38. 4mm o 1 ) 加え、 95°Cで 2時間反応させた。高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、 N 一ホルミルァスパラギン酸が 0. 49 g (39. 8%：対 Lーァスパラギン酸）生成していた。

<比較例 2>

反応容器に Lーァスパラギン酸を 1. 0 g (7. 5mmo l)、ホルムアミドを 0. 91m l (22. 51111110 1 )、水を1. 0ml順次加えた後に、 50°〇で22時間反応させた。高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、 N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸が 0. 015 g (1. 2%：対 L—ァスパラギン酸）生成

22 していた。

<実施例 10 >

反応容器に、 Lーァスパラギン酸を 1 9. 9 g (0. 1 5mo l )、ペレツ卜状水酸化ナトリウムを 12. 1 g (0. 3 Omo 1 )、水を 30m 1加えて 0°Cに冷却した。ギ酸メチル 27. 3 g (0. 45mo 1 ) を 9時間かけて滴下した後に、 0°Cにて更に 1 1時間強力に攪拌した。生成物を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、 N—ホルミル—Lーァスパラギン酸が 16. 6 g (68. 9% :対 L—ァスパラギン酸）生成していた。

ぐ実施例 1 1 >

反応容器に、 Lーァスパラギン酸を 1 9. 9 g (0. 1 5mo 1 )、ペレット状水酸化ナトリウムを 12. 1 g (0. 3 Omo 1 )、水を 6 Om 1加えて 0°Cに冷却した。ギ酸メチル 27. 3 g (0. 45mo 1 ) を 9時間かけて滴下した後に、 0°Cにて更に 12時間強力に攪拌した。生成物を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、 N—ホルミル—Lーァスパラギン酸が 1 2. 6 g (52. 1 % :対 Lーァスパラギン酸）生成していた。

ぐ実施例 12 >

反応容器に、 Lーァスパラギン酸を 19. 9 g (0. 15mo l)、ペレット状水酸化ナトリウムを 12. 1 g (0. 3 Omo 1 )、水を 1 5m 1加えて 0°Cに冷却した。ギ酸メチル 27. 8 g (0. 45mo 1 ) を 9時間かけて滴下した後に、 0°Cにて更に 12時間強力に攪拌した。得られたスラリーを高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、 N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸が 17. 7 g (73. 2%：対 Lーァスパラギン酸）生成していた。

ぐ実施例 1 3 >

反応容器に、 L—ァスパラギン酸を 19. 9 g (0. 1 5mo l)、ペレット状水酸化ナトリウムを 12. 1 (0. 3 Omo 1)、水を 3 Om l加えて 25°Cに温度制御した。ギ酸メチル 27. 3 g (0. 45mo 1) を 1時間かけて滴下した後に、 2 5°Cにて更に 13時間強力に攪拌した。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィ一により分析した結果、 N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸が 13. 5 g (56. 0 % :対 Lーァスパラギン酸）生成していた。

23 く実施例 14>

攪拌装置としてィリエ商会製ベンチニーダーを用いた。

二一ダ一に、 L—ァスパラギン酸を 99. 7 g (0. 75mo l )、ペレット状水酸化ナトリウムを 60. 4 g (1. 45mo 1 )、水を 1 5 lm 1加えて 0°Cに温度制御した。ギ酸メチル 136. 4 g (2. 2 Omo 1 ) を 9時間かけて滴下した後に、 0°Cにて更に 2時間強力に攪拌した。得られたスラリーを高速液体ク口マトグラフィ一により分析した結果、 N—ホルミル一 L—ァスパラギン酸が 84. 2 g (69. 8% :対 Lーァスパラギン酸）生成していた。

ぐ実施例 1 5>

反応容器に、 Lーァスパラギン酸を 19. 9 g (0. 1 5mo 1 )、ペレット状水酸化カリウムを 1 9. 8 g (含有量 85%、 0. 3 Omo 1 )、水を 30m 1加えて

25 °Cに温度制御した。ギ酸メチル 27. 3 g (0. 45mo 1 ) を 1時間かけて滴下した後に、 25°Cにて更に 13時間強力に攪拌した。得られた反応液を高速液体ク口マトグラフィ一により分析した結果、 N—ホルミル—Lーァスパラギン酸が 9· 9 l g (41 % :対 Lーァスパラギン酸）生成していた。

ぐ実施例 1 6 >

反応容器に、 Lーァスパラギン酸を 10. O g (75. lmmo l)、 29%アンモニァ水を 28. 4 g (480. 8mmo 1 ) 加えて 25 に温度制御した。ギ酸メチル 9. 2 g (1 50. 3mmo 1 ) を 5分かけて加えた後に、 50°0にて更に24 時間攪拌した。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、 N—ホルミル—L—ァスパラギン酸が 9. 4 g (77. 9 % ：対 Lーァスパラギン酸）生成していた。

ぐ実施例 1 7 >

反応容器に、 L—ァスパラギン酸を 1 9. 9 g (0. 1 5mo l )、ペレット状水酸化ナトリウムを 1 2. 1 g (0. 3 Omo 1 ), 20 %メタノール—水を 40 m 1 加えて 25 °Cに温度制御した。ギ酸メチル 27. 3 g (0. 45mo 1) を 1時間かけて滴下した後に、 25°Cにて更に 1 3時間強力に攪拌した。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、 N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸が 1 0. 2 g (42. 2% :対 Lーァスパラギン酸）生成していた。

24 <比較例 3 >

反応容器に、 Lーァスパラギン酸 19. 9 g (0. 15mo U 及び水 30m 1を加えて 25°Cに温度制御した。ギ酸メチル 27. 3 g (0. 45mo l) を加えた後に、 48時間そのまま攪拌した。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、 N—ホルミル— Lーァスパラギン酸は全く生成していなかった。ぐ比較例 4 >

米国第 4, 789, 757号特許に記載の実施例 1に従い、反応容器に Lーァスパラギン酸を 1. O l g (7. 7mmo l)、ホルムアミドを 1. 55ml (38. 4mmo 1) 加えた後に、 95 °Cで 2時間反応させた。高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析したところ、 N—ホルミル— L—ァスパラギン酸が 0.49 g (3 9. 8% :対 Lーァスパラギン酸）生成していた。

(本発明の F— A PMの製造方法；縮合反応）

酵素縮合反応の転化率については、いわゆる高速夜体クロマトグラフィー（HPL C) により、 210 nmの紫外線分光検知器を用いて、ォク夕デシル基結合シリカゲルを充填したカラムで、 0. 1M燐酸二水素カリウム水溶液（pH=2. 8) Zァセトニトリル溶媒を使用して定量した。

ぐ実施例 18 >

L—フエ二ルァラニンメチルエステル塩酸塩（2. 16 g ： 10. Ommo l)、 N—ホルミル一 L—ァスパラギン酸ナトリウム塩 2. 11 g (N—ホルミル一 Lーァスパルギン酸 0. 81 g ： 5. Ommo 1含有）、塩化カルシウム二水和物 65mg 及び水 1. 6 gを 2 Om 1のナスフラスコで 40°Cにおいて混合し、溶角？した。その後、混合水溶液を 25 w t %の水酸化ナトリゥム水溶液を添加して、 p H値を 5. 4 5に調整した。減圧下、水を留去し、混合水溶液中の水含有量を 17. 5 w t %とした後（N—ホルミル一 L—ァスパラギン酸濃度 7. 2mo 1/L)、残存している清浄な溶液に 0. 3 O gの粗サーモリシン（大和化成社製粉末：商品名「サモアーゼ P S 160」、約 40 %のプロテアーゼ蛋白質及び約 60%の硫酸ナトリウムを含有する）と混合した。 40°Cで 20時間反応の後、反応液は固形状になった。固体物を水に溶解し、 HP LCにより分析したところ、 F— APMへの最終転化率は N'—ホルミ

25 ルー L—ァスパラギン酸を基準にして 85%に達することが確認された。

<実施例 19 >

実施例 18において水留去後の混合水溶液中の水含有量を 3 Owt % (N—ホルミルー Lーァスパラギン酸濃度 3. 6mo 1 /L) とする以外実施例 18と同様の操作を行ったところ、 F— APMへの最終転化率は F— As pを基準にして 62. 9%に達することが確認された。

<実施例 20 >

L一フエ二ルァラニンメチルエステル塩酸塩（1. 08 g : 5. Ommo l) 及び N—ホルミル _Lーァスパラギン酸（0. 81 g : 5. Ommo 1 ) に 1 Owt %塩化カルシウム水溶液 0. 668及び水1. O gを加え、 40°Cにおいて溶解し、 15 wt %水酸化ナトリウム水溶液で pH値を 5. 8に調整した。減圧下、水を留去し、混合水溶液中の水含有量を 17. 5wt % (N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸濃度 10. 8mo lZL) とした後、これに 30 gの粗サ一モリシン（実施例 18において使用したものと同じ「サモアーゼ P S 160」）を加え、反応液が均一になるように撹拌した。 40°Cで 20時間反応の後、反応液は固形状となった。固形物を水に溶解し、 HP LCにより分析したところ、 L— PMの付加物の収率は N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸を基準にして 41. 7%に達することが確認され、これは、 F 一 APMへの転化率として、 83. 4%であることを示している。

く実施例 21>

実施例 20において L—フエ二ルァラニンメチルエステル塩酸塩を 0. 54g (2. 5mmo 1 ) とする以外、実施例 20と同様の縮合反応を行った。 HPLCにより分析したところ、 L一 PMの付加物の収率は、 N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸を基準にして 34. 8 %に達することが確認され、これは、 F— APMへの転化率として、 69. 6 %であることを示している。

ぐ比較例 5 >

L—フエ二ルァラニンメチルエステル塩酸塩 2. 16 g (10. Ommo l) 及び N—ホルミル一 L—ァスパラギン酸ナトリウム塩 2. 1 1 (N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸 0. 8 l g： 5. Ommo 1含有）に 10 w t %塩化カルシウム水溶液 0. 71 g及び水 1. 0 を加え、 25 w t %水酸化ナトリゥム水溶液で p H値を

26 5. 5に調整し、更に水で全量を 8. 62 gとした（混合水溶液中の水含有率 59. 0w t ) (N—ホルミル—L—ァスパラギン酸濃度 1. Omo lZL)。この溶液に 0. 30 gの粗サ一モリシン（実施例 18において使用したものと同じ「サモアーゼ

PS 160J) と混合した。 40°Cで 20時間反応の後、反応により析出した固体を水に溶解し、 HPLCにより分析したところ F— APMへの最終転化率は F— As p を基準にして 45. 7%であった。

<参考例 1〉

L一フエ二ルァラニンメチルエステル塩酸塩 2. 15 g (10. Ommo 1) 及び F— N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸ナトリウム塩 2. 11 (F-A s p 0. 81 g ： 5. Ommo 1含有）に 10 w t %塩化カルシウム水溶液 0. 7 ^及び水1. O gを加え、 25wt %水酸化ナトリウム水溶液で pH値を 6. 5に調整した。減圧下、水を留去し、混合水溶液中の水含有量を 18'. 7wt %とした後（N—ホルミル —Lーァスパラギン酸濃度 6. 6mo 1 /L), これに 0. 3 O gの粗サーモリシン (実施例 18において使用したものと同じ「サモアーゼ P S 160」）と混合した。 40°Cで 18時間反応の後、反応液は固形状となった。固形物を水に溶解し、 HPL Cにより分析したところ、 F— APMへの最終転化率は F— As pを基準にして 43. 0%であった。

ぐ参考例 2 >

参考例 1において pH値を 7. 5に調整した以外、参考例 1と同様の縮合反応を実施した。 F—APMへの最終転化率は F— A s pを基準にして 5. 8%であった。

(本発明の F— APMの製造方法；縮合反応：トリアルキルリン酸エステル共存） <実施例 22>

L一フエ二ルァラニンメチルエステル塩酸塩（8. 61 g： 4 Omrno 1 ) を水 2 0. O gに溶解させ、これにトリー n—プチルリン酸エステル（以下、「TBP」と略記する。） 20. O gを加え、激しく撹拌し、 15w t %水酸化ナトリウム水溶液で pH値を 7. 0に調整した。これを、更に 40°Cで 30分間激しく撹拌、抽出後、水層と有機層を分離した。この有機層を L— PM/TBP溶液（PM: 1. 05mm o 1 /g ； 7wt ) として以下の反応に用いた。

27 L一フエ二ルァラニンメチルエステル塩酸塩（2. 15 g： 10 mm o 1 ) 及び N 一ホルミル一 Lーァスパラギン酸（0. 81 g : 5. Ommo 1 ) に 1 Owt %塩化カルシウム水溶液 0. 66 及び水1. O gを加え、 40°Cにおいて溶解し、 15w t%水酸化ナトリウム水溶液で pH値を 5. 8に調整した。減圧下、水を留去し、混合水溶液中の水含有量を 23. 3%とした後（N—ホルミル一 L—ァスパラギン酸濃度 5. 05mo l/L)、 PM/TBP溶液 12 g (TBP 8. 9 g) 及び粗サーモリシン（大和化成社製粉末：商品名「サモア一ゼ PS 160」、約 40%のプロテアーゼ蛋白質及び約 60%の硫酸ナトリウムを含有する。）を 0. 3 g加え、反応液が均一になるように撹拌した。 40 °Cで 20時間撹拌後、得られたスラリーを濾別し、 F _ APMの L _ PM付加物の結晶を得た。結晶と母液それぞれについて HP L Cにより分析したところ、 F— APMへの最終転化率は F— As pを基準にして 77. 3 % (結晶中に 73. 3%、母液中に 4. 0 %) に達することが確認された。

ぐ実施例 23 >

PMZTBP溶液を 6. 0 g (TBP4. 45 g) 添加した以外は実施例 22と同様に酵素縮合反応を行った。得られたスラリーを濾別し、結晶と母液について HP L Cにより分析したところ F— APMへの最終転化率は 72. 0% (結晶中に 68.4%、母液中に 3. 6 %) であった。

ぐ実施例 24>

PMZTBP溶液を 16. 6 g (TBP 12. 32 g) 添加した以外は実施例 22 と同様に酵素縮合反応を行った。得られたスラリーを濾別し、結晶と母液について H PLCにより分析したところ F—APMへの最終転化率は 54. 1 % (結晶中に 47. 3%、母液中に 6. 8 %) であった。

ぐ実施例 25>

N—ホルミル— Lーァスパラギン酸の濃度を 6. 25 mo 1ZLとした以外は実施例 22と同様に酵素縮合反応を行った。得られたスラリーを濾別し、結晶と母液について HPLCにより分析したところ F— APMへの最終転化率は 65. 1 % (結晶中に 62. 8 %、母液中に 2. 3%) であった。

<実施例 26 >

N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸の濃度を 3. 58mo 1 ZLとした以外は実施

28 例 2 2と同様に酵素縮合反応を行った。得られたスラリーを濾別し、結晶と母液について HPL Cにより分析したところ F— APMへの最終転化率は 5 8. 2 % (結晶中に 54. 9 %、母液中に 3. 3 %) であった。

<実施例 2 7>

N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸の濃度を 1. 5 3mo 1 /Lとした以外は実施例 2 2と同様に酵素縮合反応を行った。得られたスラリーを濾別し、結晶と母液について HPL Cにより分析したところ F— APMへの最終転化率は 54. 6 % (結晶中に 49. 0 %、母液中に 5. 6 %) であった。

(本発明の F— APMの製造方法；分離方法）

<実施例 2 8 >

実施例 1 8と同様の反応を行い、得られた反応液に水 1 Om lを加え、析出した固体を分散させ、氷冷下、 1時間撹拌後、固液分離した。更に、湿結晶を 2m.lの水で洗浄した。得られた湿結晶 2. 7 3 gを HPLCで分析したところ、 F— APMが' 4 2. 4w t % (3. 5 9mmo 1 ) 及び L一 PMが 2 5. 1 w t % (3. 8 2mmo 1 )含有していた。また、結晶洗浄液を加えた母液 1 3. 4 gには、 1. Ow t % (0. 42mmo 1 ) の F— APMが含有していた。即ち、全反応収率は、 80 %であり、分離後の収率は、 7 2 %である。ここで得られた湿結晶を 1 Om 1の水に懸濁し、 1 N塩酸で pH値を 1. 7に調整した。氷冷下、 1時間撹拌後、この懸濁液を分離したところ、 1. 8 6 gの湿結晶が得られた。この湿結晶には、 F— APM S54. 0 w t % (3. 1 lmmo 1 ) 及び L— PMが 2. 9w t % (0. 3mmo 1 ) 含まれていた。即ち、 F— APMの収率は、 8 6. 8 %であり、 9 1. 4%の L一 PMが母液に淘汰されたことが確認された。

<実施例 2 9 >

実施例 2 2と同様の操作を行い、 F— APMの L— PM付加物の湿結晶を 4. 9 8 g得た（F— APM : 3. 64mmo 1 ), L— PM： 4. 6 2mmo 1、反応収率： 7 7. 4%、結晶中の F— APMの収率 7 2. 8 %)。得られた湿結晶をを 1 0 m 1 の水に懸濁した後、氷冷した。これを 1 N塩酸で pH値を 1. 8に調整した。氷冷下、 1時間攪拌後、この懸濁液を濾過したところ、 1. 9 2 gの湿結晶が得られた。この

29 湿結晶には、 F— APMが 3. 17mmo l、 L— PMが 0. 43mmo l含まれていた。即ち、？ー八？]\の収率は87. 1 %であり、 93 %の L— PMが母液に淘汰されたことが確認された。

(本発明のホルミル化法 2)

<実施例 30 >

反応容器に L一口イシン 1. 31 g (0. 01モル）、水酸化ナトリウム 0. 40 g (0. 01モル）、ホルムアミド 1. 35 g (0. 03モル）及び水 1. 2m lを加え、 50 で 48時間反応させた。得られた反応液について高速液体クロマトダラフィ一にて生成物を分析したところ、 N—ホルミル一 L一口イシンが 1. 18 g (7 4. 1%対 L一口イシン）生成していた。

ぐ実施例 31 >

反応容器に L一口イシン 1. 31 g (0. 01モル）、 29%アンモニア水 0. 6 4 g (0. 01 1モル）、ホルムアミド 1. 35 g (0. 03モル）及び水 1 - 2m 1を加え、 50°Cで 48時間反応させた。得られた反応液について高速液体クロマトグラフィ一にて生成物を分析したところ、 N—ホルミル一 L一口イシンが 1. 14 g

(71. 6%対 L—ロイシン）生成していた。

ぐ実施例 32>

反応容器に L一口イシン 1. 3 1 g (0. 01モル）、水酸化ナトリウム 0. 40 g (0. 01モル）、ホルムアミド 0. 90 g (0. 02モル）及び水 1. 2m lを加え、 80°Cで 5時間反応させた。得られた反応液について高速液体クロマトグラフィ一にて生成物を分析したところ、 N—ホルミル一 L一口イシンが 1. l l g (69. 7%対 L_ロイシン）生成していた。

<実施例 33>

反応容器に L一口イシン 1. 31 g (0. 01モル）、水酸化ナトリウム 0. 40 g (0. 01モル）、ギ酸メチル 1. 80 g (0. 03モル）及び水 1. 2mlをカロえ、氷冷下 2時間、その後室温で 22時間反応させた。得られた反応液について高速液体クロマトグラフィーにて生成物を分析したところ、 N—ホルミル一 L一口イシンが 1. 27 g (79. 8%対 L一口イシン）生成していた。

30 ぐ実施例 34>

反応容器に L—ロイシン 1. 3 1 g (0. 0 1モル）、 29%アンモニア水 0. 6 4 g (0. 0 1 1モル）、ギ酸メチル 1. 80 g (0. 03モル）及び水 1. 2m l を加え、氷冷下 2時間、その後室温で 22時間反応させた。得られた反応液について高速液体クロマトグラフィーにて生成物を分析したところ、 N—ホルミル一 L一ロイシンが 1. 2 1 g (76. 0%対 L—ロイシン）生成していた。

ぐ実施例 35 > '

反応容器に L一口イシン 19. 7 g (0. 1 5モル）、水酸化ナトリウム 6. 0 g (0. 1 5モル）を水 30m 1に加えて 0°Cに冷却した。ギ酸メチル 27. 3 g (0. 45モル）を 9時間かけて滴下した後に、室温にて 1 5時間強力に攪拌した。得られた反応 If友について高速夜体ク口マトグラフィーにて生成物を分析したところ、 Ν—ホルミル— L一口イシンが 19. 2 g (80. 4%対 L一口イシン）生成していた。以上から明らかな如く、 N—ホルミルァスパラギン酸（又はその塩）を効率良く製造し、これと L—及びノ又は DL—フエ二ルァラニンメチルエステルの酵素縮合反応、それに引き続く分離方法により、アスパルテーム前駆体である F— A P Mを高収率かつ高純度に製造することができる。このように製造された F— APMから、前記常法に基いて脱ホルミル化することによりアスパルテームを高収率で製造することができる。

更に、中性アミノ酸を極めて収率良く N—ホルミル化することができる。

尚、上記ホルミル化反応においては、反応中ラセミ化は起こり難く、光学活性なァスパラギン酸や中性アミノ酸（又はこれらの塩）を出発物質に用いることにより、当該 N—ホルミル化反応後に N—ホルミルアミノ酸又はその塩を光学活性体として得ることができる。発明の効果

本発明によれば、各種合成中間体、特にペプチド合成中間体等として重要な N—ホルミルアミノ酸、特に N—ホルミルァスパラギン酸（又はその塩）や、ロイシン等 N —ホルミル中性アミノ酸（又はその塩）を効率良く工業上簡便に製造することができ

31 る。

更に、 N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸から甘味料アスパルテームの前駆体である N—ホルミル—ひ—L—ァスパルチルー L一フエ二ルァラニンメチルエステル及び当該アスパルテームを効率良く工業上簡便に製造することができる。

従って、本発明は工業上、特に食品分野や医薬品分野で極めて有用である。

32

Claims

請求の範囲

1 . 塩基の存在下にァスパラギン酸と、ホルムアミド及び/又はギ酸メチルとを反応させることを特徴とする N—ホルミルァスパラギン酸又はその塩の製造方法。

2 . ァスパラギン酸の塩と、ホルムアミド及び/ "又はギ酸メチルとを反応させることを特徴とする N—ホルミルァスパラギン酸又はその塩の製造方法。

3 . 請求の範囲 1〜 2記載の方法に従って N—ホルミル—Lーァスパラギン酸又はその塩を得た後、当該 N—ホルミル一Lーァスパラギン酸又はその塩と L—フエニルァラニンメチルエステル又はその塩とを縮合し N—ホルミル一ひ—Lーァスバルチルー L—フエ二ルァラニンメチルエステルに変換した後、ホルミル基を除去することを特徴とするアスパルテームの製造方法。

4. N—ホルミル一 L—ァスパラギン酸又はその塩と、 L—及び Z又は D L—フエ二ルァラニンメチルエステル又はその塩との酵素縮合反応において、水溶液中の N— ホルミル— L—ァスパラギン酸の濃度が 1 . 2 m o 1 ZL以上であることを特徴とする N—ホルミル一ひ一 Lーァスパルチル一 L一フエ二ルァラニンメチルエステルの製造方法。

N—ホルミル一ひ一 Lーァスパルチル _ L一フエ二ルァラニンメチルエステルは、 L—及び/又は D—フエ二ルァラニンメチルエステル付加物の形態でもよい。

5 . 請求の範囲 1〜 2記載の方法に従つて N—ホルミル _ L—ァスパラギン酸又はその塩を得た後、該 N—ホルミル一 L—ァスパラギン酸又はその塩と、 L—及び Z又は D L—フエ二ルァラニンメチルエステル又はその塩との酵素縮合反応において、水溶液中の N—ホルミル— Lーァスパラギン酸の濃度が 1 . 2 m o 1 /L以上であることを特徴とする N—ホルミル一 α— L—ァスパルチル— L—フエ二ルァラニンメチルエステルの製造方法。

Ν—ホルミル一 α— Lーァスパルチルー L―フェニルァラニンメチルエステルは、 L一及び Ζ又は D—フエ二ルァラニンメチルエステルの付加物の形態でもよい。

6 . Ν—ホルミル— Lーァスパラギン酸又はその塩と、 L—及び/又は D L—フエ二ルァラニンメチルエステル又はその塩との酵素縮合反応において、反応進行により反応溶液が固形状となる酵素縮合反応をトリアルキルリン酸エステルの存在下に行

33 うことで反応溶液をスラリー状態とし、該スラリーから N—ホルミル一 α— L—ァスパルチルー L一フエ二ルァラニンメチルエステルの L一及び/又は D—フエニルァラニンメチルエステル付加物の結晶を分離することを特徴とする Ν—ホルミル一 Q!

—L—ァスパルチル— L一フエ二ルァラニンメチルエステルの L一及び/又は D— フエ二ルァラニンメチルエステル付加物の製造方法。

7 . 請求の範囲 1〜 2記載の方法に従って Ν—ホルミル—Lーァスパラギン酸又はその塩を得た後、該 Ν—ホルミル—Lーァスパラギン酸又はその塩と、 L一及び Ζ又は D L—フエ二ルァラニンメチルエステル又はその塩との酵素縮合反応において、反応進行により反応溶液が固形状となる酵素縮合反応を卜リアルキルリン酸エステルの存在下に行うことで反応溶液をスラリ一状態とし、該スラリーから Ν—ホルミル一 α—L—ァスパルチルー L一フエ二ルァラニンメチルエステルの L—及び/又は D —フエ二ルァラニンメチルエステル付加物の結晶を分離することを特徴とする N— ホルミル—ひ一 L—ァスパルチルー L一フエ二ルァラニンメチルエステルの L一及び/又は D—フエ二ルァラニンメチルエステル付加物の製造方法。

8 . N—ホルミル一 Lーァスパラギン酸又はその塩と、 L—及び Z又は D L—フエ二ルァラニンメチルエステル又はその塩との酵素縮合反応において、水溶液中の N— ホルミル一 Lーァスパラギン酸の濃度を 1 . S m o l Z L以上とし、トリアルキルリン酸エステルの存在下に反応を行い、スラリー状態の反応溶液から N—ホルミル一 α ― Lーァスパルチルー L一フエ二ルァラニンメチルエステルの L一及び Ζ又は D— フエ二ルァラニンメチルエステル付加物の結晶を分離することを特徴とする Ν—ホルミルー ― Lーァスパルチルー L一フエ二ルァラニンメチルエステルの L一及び Z又は D _フエ二ルァラニンメチルエステル付加物の製造方法。

9 . 請求の範囲 1〜 2記載の方法に従って N—ホルミル一 L—ァスパラキン酸又はその塩を得た後、該 N—ホルミル—Lーァスパラギン酸又はその塩と、 L—及び/又は D L—フエ二ルァラニンメチルエステル又はその塩との酵素縮合反応において、水溶液中の N—ホルミル— L—ァスパラギン酸の濃度が 1 . 2 m o l ZL以上とし、トリアルキルリン酸エステルの存在下に反応を行い、スラリー状態の反応溶液から N— ホルミル一 Q! _ L—ァスパルチルー L一フエ二ルァラニンメチルエステルの L—及び/又は D—フエ二ルァラニンメチルエステル付加物の結晶を分離することを特徴

34 とする N—ホルミル一《— L—ァスパルチル一 L一フエ二ルァラニンメチルエステルの L一及び又は D—フエ二ルァラニンメチルエステル付加物の製造方法。

1 0 . 請求項 4〜 9記載の方法に従って N—ホルミル一 α— L—ァスパルチルー L 一フエ二ルァラニンメチルエステル又は Ν—ホルミル— — L—ァスパルチル— L 一フエ二ルァラニンメチルエステルの L—及び Ζ又は D—フエ二ルァラニンメチルエステル付加物を得た後、これをアスパルテームに変換することを特徴とするァスパルテームの製造方法。

1 1 . Ν—ホルミル— α— Lーァスパルチルー L一フエ二ルァラニンメチルエステルのフエ二ルァラニンメチルエステル付加物を ρ Η I . 0〜4. 5の水溶液中に懸濁し、固体を分離することを特徴とする Ν—ホルミル— α— L—ァスパルチルー L―フェニルァラニンメチルエステルの製造方法。

1 2 . 請求の範囲 4〜9何れか記載の方法により Ν—ホルミル— α— L—ァスパルチルー L—フエ二ルァラニンメチルエステルのフエ二ルァラニンメチルエステル付加物を得た俊、これを p H l . 0〜4. 5の水溶液中に懸濁し、固体を分離することを特徴とする N—ホルミル一 α— Lーァスパルチル— L一フエ二ルァラニンメチルエステルの製造方法。

1 3 . 請求の範囲 4〜1 2記載の方法に従って N—ホルミル一 α— Lーァスパルチルー L—フエ二ルァラニンメチルエステルを得た後、ホルミル基を除去することを特徴とするアスパルテームの製造方法。

1 4. 塩基の存在下に中性アミノ酸と、ホルムアミド及び Ζ又はギ酸メチルとを反応させることを特徴とする Ν—ホルミル中性アミノ酸又はその塩の製造方法。

1 5 . 中性アミノ酸の塩と、ホルムアミド及び/又はギ酸メチルとを反応させることを特徴とする Ν—ホルミル中性ァミノ酸又はその塩の製造方法。

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