JP2000078997A - アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 - Google Patents
アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法Info
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- JP2000078997A JP2000078997A JP10250888A JP25088898A JP2000078997A JP 2000078997 A JP2000078997 A JP 2000078997A JP 10250888 A JP10250888 A JP 10250888A JP 25088898 A JP25088898 A JP 25088898A JP 2000078997 A JP2000078997 A JP 2000078997A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 加水分解酵素（プロテアーゼ）を用い、高基
質濃度でジペプチド（アスパルチルフェニルアラニン低
級アルキルエステル）を合成する方法を提供すること。 【解決手段】 Ｎ−置換アスパラギン酸（Ａ）とフェニ
ルアラニン低級アルキルエステル塩酸塩（Ｂ）とをプロ
テアーゼの存在下に反応させてペプチド合成するに際
し、酵素反応基質として、基質Ａと基質Ｂおよびこれら
の基質の濃度がそれぞれの水に対する溶解度以上の濃度
となる量のアルカリ性水溶液からなるペーストを用いる
ことを特徴とするアスパルチルフェニルアラニン低級ア
ルキルエステルの製造方法。
質濃度でジペプチド（アスパルチルフェニルアラニン低
級アルキルエステル）を合成する方法を提供すること。 【解決手段】 Ｎ−置換アスパラギン酸（Ａ）とフェニ
ルアラニン低級アルキルエステル塩酸塩（Ｂ）とをプロ
テアーゼの存在下に反応させてペプチド合成するに際
し、酵素反応基質として、基質Ａと基質Ｂおよびこれら
の基質の濃度がそれぞれの水に対する溶解度以上の濃度
となる量のアルカリ性水溶液からなるペーストを用いる
ことを特徴とするアスパルチルフェニルアラニン低級ア
ルキルエステルの製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、プロテアーゼを利
用してペプチド合成する際に、高濃度基質ペーストを用
いたアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステ
ルの合成法に関するものである。
用してペプチド合成する際に、高濃度基質ペーストを用
いたアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステ
ルの合成法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】プロテアーゼは加水分解酵素として、タ
ンパク質、ポリペプチドの加水分解反応に幅広く利用さ
れている。一方、加水分解反応の逆反応を利用した有用
ペプチドの合成に関する研究も増加している。しかしな
がら、基質となるアミノ酸の水に対する溶解度は必ずし
も高くなく、低濃度基質を用いざるをえない場合も多
い。
ンパク質、ポリペプチドの加水分解反応に幅広く利用さ
れている。一方、加水分解反応の逆反応を利用した有用
ペプチドの合成に関する研究も増加している。しかしな
がら、基質となるアミノ酸の水に対する溶解度は必ずし
も高くなく、低濃度基質を用いざるをえない場合も多
い。
【０００３】一般に、反応平衡定数Ｋｃは質量保存則に
従い、次のように表すことができる。 （Ｓ1、Ｓ2：基質濃度 Ｐ：生産物濃度）従って、基
質濃度を高めることで高い生産物濃度を得ることができ
る。
従い、次のように表すことができる。 （Ｓ1、Ｓ2：基質濃度 Ｐ：生産物濃度）従って、基
質濃度を高めることで高い生産物濃度を得ることができ
る。
【０００４】プロテアーゼを用いたペプチド合成の例と
して、人工甘味料アスパルテームの前駆体であるＮ−ベ
ンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェ
ニルアラニンメチルエステル（以下ではＺＡＰＭと略記
することがある。）が挙げられる。ところで、上記合成
に用いられる基質のＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−アスパラギン酸（以下ではＺＡと略記することがあ
る。）およびＬ−フェニルアラニンメチルエステル（以
下ではＰＭと略記することがある。）は、いずれも水に
対する溶解度が１〜１．５Ｍ程度と低いため、数百ｍＭ
程度の基質を用いた報告例が多い。
して、人工甘味料アスパルテームの前駆体であるＮ−ベ
ンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェ
ニルアラニンメチルエステル（以下ではＺＡＰＭと略記
することがある。）が挙げられる。ところで、上記合成
に用いられる基質のＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−アスパラギン酸（以下ではＺＡと略記することがあ
る。）およびＬ−フェニルアラニンメチルエステル（以
下ではＰＭと略記することがある。）は、いずれも水に
対する溶解度が１〜１．５Ｍ程度と低いため、数百ｍＭ
程度の基質を用いた報告例が多い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】先に述べたように、高
濃度基質を用いることにより高い反応速度、生産物濃度
を得ることが期待でき、また、反応器容積の低減も可能
である。しかしながら、基質の水等に対する溶解度が低
いために、高濃度基質での反応のメリットが享受できな
いのが現状である。従って、本発明の目的は、プロテア
ーゼを用い、高基質濃度でジペプチド（アスパルチルフ
ェニルアラニン低級アルキルエステル）を合成すること
ができる方法を提供することである。本発明者らは、上
記目的を達成すべく種々検討した結果、ＺＡの粉末とフ
ェニルアラニン低級アルキルエステル（以下ではＰｈｅ
ＯＲと略記することがある。）塩酸塩の粉末及び極少量
のアルカリ性水溶液を混合してペースト状としたものに
酵素を加えて反応を行わせたところ、高収率で目的物質
ＺＡＰＭが得られることを見出し、この知見に基づいて
本発明を完成するに至った。
濃度基質を用いることにより高い反応速度、生産物濃度
を得ることが期待でき、また、反応器容積の低減も可能
である。しかしながら、基質の水等に対する溶解度が低
いために、高濃度基質での反応のメリットが享受できな
いのが現状である。従って、本発明の目的は、プロテア
ーゼを用い、高基質濃度でジペプチド（アスパルチルフ
ェニルアラニン低級アルキルエステル）を合成すること
ができる方法を提供することである。本発明者らは、上
記目的を達成すべく種々検討した結果、ＺＡの粉末とフ
ェニルアラニン低級アルキルエステル（以下ではＰｈｅ
ＯＲと略記することがある。）塩酸塩の粉末及び極少量
のアルカリ性水溶液を混合してペースト状としたものに
酵素を加えて反応を行わせたところ、高収率で目的物質
ＺＡＰＭが得られることを見出し、この知見に基づいて
本発明を完成するに至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記の目的は以下の本発
明によって達成される。即ち、本発明は、Ｎ−置換アス
パラギン酸（Ａ）とフェニルアラニン低級アルキルエス
テル塩酸塩（Ｂ）とをプロテアーゼの存在下に反応させ
てペプチド合成するに際し、酵素反応基質として、基質
Ａと基質Ｂ及びこれらの基質の濃度がそれぞれの水に対
する溶解度以上の濃度となる量のアルカリ性水溶液とか
らなるペーストを用いることを特徴とするアスパルチル
フェニルアルキルエステルの製造方法である。
明によって達成される。即ち、本発明は、Ｎ−置換アス
パラギン酸（Ａ）とフェニルアラニン低級アルキルエス
テル塩酸塩（Ｂ）とをプロテアーゼの存在下に反応させ
てペプチド合成するに際し、酵素反応基質として、基質
Ａと基質Ｂ及びこれらの基質の濃度がそれぞれの水に対
する溶解度以上の濃度となる量のアルカリ性水溶液とか
らなるペーストを用いることを特徴とするアスパルチル
フェニルアルキルエステルの製造方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】次に好ましい実施の形態を挙げて
本発明を更に詳細に説明する。本発明のプロテアーゼを
用いるアスパルチルフェニルアルキルエステルの製造方
法は、反応の基質であるＮ−置換アスパラギン酸とフェ
ニルアラニン低級アルキルエステル（ＰｈｅＯＲ）塩酸
塩を、これら基質およびアルカリ性水溶液とからなるペ
ーストに高濃度で含むものを使用することが特徴であ
る。以下では、Ｎ−置換アスパラギン酸をＮ−ベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸（ＺＡ）で代表
させて、又、フェニルアラニン低級アルキルエステル塩
酸塩をＬ−フェニルアラニンメチルエステル（ＰＭ）塩
酸塩で代表させて説明するが、本発明はこれらの例に限
定されるものではない。
本発明を更に詳細に説明する。本発明のプロテアーゼを
用いるアスパルチルフェニルアルキルエステルの製造方
法は、反応の基質であるＮ−置換アスパラギン酸とフェ
ニルアラニン低級アルキルエステル（ＰｈｅＯＲ）塩酸
塩を、これら基質およびアルカリ性水溶液とからなるペ
ーストに高濃度で含むものを使用することが特徴であ
る。以下では、Ｎ−置換アスパラギン酸をＮ−ベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸（ＺＡ）で代表
させて、又、フェニルアラニン低級アルキルエステル塩
酸塩をＬ−フェニルアラニンメチルエステル（ＰＭ）塩
酸塩で代表させて説明するが、本発明はこれらの例に限
定されるものではない。
【０００８】本発明においては上記のペーストを調製す
る方法は、両基質とアルカリ水溶液とが混合されてペー
スト状となる方法であれば、どのような方法でもよく、
特に制限されない。ペーストを調製する際のＺＡとＰＭ
の混合比は特に限定されないが、ＺＡ／ＰＭが０．１〜
１．５（モル比）程度が好ましい。また、アルカリ性水
溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど
の一般的なアルカリの水溶液が用いられる。アルカリ水
溶液の使用量は、ＺＡとＰＭの濃度が、これらの水に対
する溶解度以上の濃度となる量であり、ペプチドの収量
を高めるうえから出来るだけ高濃度となる量が望まし
い。アルカリ水溶液の濃度は、特に限定されないが、通
常、１５Ｎ〜飽和溶液が好ましい。
る方法は、両基質とアルカリ水溶液とが混合されてペー
スト状となる方法であれば、どのような方法でもよく、
特に制限されない。ペーストを調製する際のＺＡとＰＭ
の混合比は特に限定されないが、ＺＡ／ＰＭが０．１〜
１．５（モル比）程度が好ましい。また、アルカリ性水
溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど
の一般的なアルカリの水溶液が用いられる。アルカリ水
溶液の使用量は、ＺＡとＰＭの濃度が、これらの水に対
する溶解度以上の濃度となる量であり、ペプチドの収量
を高めるうえから出来るだけ高濃度となる量が望まし
い。アルカリ水溶液の濃度は、特に限定されないが、通
常、１５Ｎ〜飽和溶液が好ましい。
【０００９】また、上記のペーストに更に有機溶媒を含
有させることもできる。有機溶媒としては、例えば、ク
ロロホルム、ジエチレングリコール、グリセロール、エ
タノール、メタノール、アセトニトリルなどが挙げられ
る。有機溶媒の添加量は特に限定されないが、両基質濃
度がそれぞれの水に対する溶解度以上の濃度となる量が
望ましい。
有させることもできる。有機溶媒としては、例えば、ク
ロロホルム、ジエチレングリコール、グリセロール、エ
タノール、メタノール、アセトニトリルなどが挙げられ
る。有機溶媒の添加量は特に限定されないが、両基質濃
度がそれぞれの水に対する溶解度以上の濃度となる量が
望ましい。
【００１０】本発明で使用するプロテアーゼとしては、
例えば、サーモライシン、サーモアーゼなどのバチルス
属起源の金属プロテアーゼが好ましく、ストレプトマイ
セス属起源または緑濃菌起源の金属プロテーアーゼなど
も使用することができる。酵素濃度は、反応が進行する
濃度であれば特に限定されない。また、本発明における
反応温度は４０〜６０℃が好ましく、これ以外の温度で
もペプチド合成は行われるが、実用的な速度は得られ難
い。
例えば、サーモライシン、サーモアーゼなどのバチルス
属起源の金属プロテアーゼが好ましく、ストレプトマイ
セス属起源または緑濃菌起源の金属プロテーアーゼなど
も使用することができる。酵素濃度は、反応が進行する
濃度であれば特に限定されない。また、本発明における
反応温度は４０〜６０℃が好ましく、これ以外の温度で
もペプチド合成は行われるが、実用的な速度は得られ難
い。
【００１１】本発明で使用するＺＡ以外のＮ−置換アス
パラギン酸としては、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル
アスパラギン酸、アセチルアスパラギン酸などが、ま
た、ＰＭ塩酸塩以外のフェニルアラニン低級アルキルエ
ステル塩酸塩としては、例えば、フェニルアラニンエチ
ルエステル、フェニルアラニンブチルエステル、フェニ
ルアラニンプロピルエステルなどの塩酸塩が挙げられ
る。
パラギン酸としては、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル
アスパラギン酸、アセチルアスパラギン酸などが、ま
た、ＰＭ塩酸塩以外のフェニルアラニン低級アルキルエ
ステル塩酸塩としては、例えば、フェニルアラニンエチ
ルエステル、フェニルアラニンブチルエステル、フェニ
ルアラニンプロピルエステルなどの塩酸塩が挙げられ
る。
【００１２】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
する。文中の％は特に断らない限り重量基準である。
する。文中の％は特に断らない限り重量基準である。
【００１３】実施例１ ＰＭ粉末２１５ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ) およびＺＡ粉末
２６５ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）に２０Ｎ水酸化ナトリウ
ム水溶液９０μｌを加え、よく混合してペースト状とし
た。ペースト中の各物質の濃度は、ＰＭ、ＺＡともに１
１．１Ｍである。上記ペーストにサモアーゼ（大和化成
株式会社製）５０ｍｇを加えて混合し、５０℃で反応を
行った。反応液組成はＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラ
フィー）によって分析した。反応８時間後に４．７ｍｇ
のＺＡＰＭを得た。
２６５ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）に２０Ｎ水酸化ナトリウ
ム水溶液９０μｌを加え、よく混合してペースト状とし
た。ペースト中の各物質の濃度は、ＰＭ、ＺＡともに１
１．１Ｍである。上記ペーストにサモアーゼ（大和化成
株式会社製）５０ｍｇを加えて混合し、５０℃で反応を
行った。反応液組成はＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラ
フィー）によって分析した。反応８時間後に４．７ｍｇ
のＺＡＰＭを得た。
【００１４】実施例２〜４ 実施例１と同様に、表１に示す濃度条件で反応を行っ
た。反応８時間後に得られたＺＡＰＭの量を同表に示
す。 表１
た。反応８時間後に得られたＺＡＰＭの量を同表に示
す。 表１
【００１５】実施例５ 実施例１でペーストにジエチレングリコール１００μｌ
を加えて、実施例１と同様に反応させた。基質濃度はＰ
Ｍ、ＺＡとも５Ｍである。反応８時間後に１６４．９ｍ
ｇのＺＡＰＭを得た。
を加えて、実施例１と同様に反応させた。基質濃度はＰ
Ｍ、ＺＡとも５Ｍである。反応８時間後に１６４．９ｍ
ｇのＺＡＰＭを得た。
【００１６】実施例６ ＰＭの代わりにフェニルアラニンエチルエステルを用い
る以外は実施例２と同様にして反応させた。反応８時間
後に２０８．７ｍｇのペプチドを得た。
る以外は実施例２と同様にして反応させた。反応８時間
後に２０８．７ｍｇのペプチドを得た。
【００１７】
【発明の効果】以上の本発明によれば、ペースト状基質
を用いることにより、基質の溶解度に関わらず高濃度の
基質を用いてペプチド合成が可能となった。その結果、
反応器容積の縮小化が可能となり、例えば、５Ｍ濃度の
基質を用いた場合では１００ｍＭ濃度の基質を用いた場
合の５０分の１の反応器容積で製造を行うことが可能と
なり、単位反応器容積あたりのペプチド合成量を著しく
向上させることができる。
を用いることにより、基質の溶解度に関わらず高濃度の
基質を用いてペプチド合成が可能となった。その結果、
反応器容積の縮小化が可能となり、例えば、５Ｍ濃度の
基質を用いた場合では１００ｍＭ濃度の基質を用いた場
合の５０分の１の反応器容積で製造を行うことが可能と
なり、単位反応器容積あたりのペプチド合成量を著しく
向上させることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 星野 明 東京都中央区日本橋馬喰町一丁目７番６号 大日精化工業株式会社内 Ｆターム(参考） 4B064 AG01 CA02 CA04 CA21 CB26 CC03 CC07 CC09 CD02 CD13 DA10
Claims (2)
- 【請求項１】 Ｎ−置換アスパラギン酸（Ａ）とフェニ
ルアラニン低級アルキルエステル塩酸塩（Ｂ）とをプロ
テアーゼの存在下に反応させてペプチド合成するに際
し、酵素反応基質として、基質Ａと基質Ｂおよびこれら
の基質の濃度がそれぞれの水に対する溶解度以上の濃度
となる量のアルカリ性水溶液からなるペーストを用いる
ことを特徴とするアスパルチルフェニルアラニン低級ア
ルキルエステルの製造方法。 - 【請求項２】 該ペーストは、更に有機溶媒を基質Ａお
よび基質Ｂの濃度が上記の濃度となる量含まれている請
求項１に記載のアスパルチルフェニルアラニン低級アル
キルエステルの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25088898A JP3621271B2 (ja) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25088898A JP3621271B2 (ja) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000078997A true JP2000078997A (ja) | 2000-03-21 |
| JP3621271B2 JP3621271B2 (ja) | 2005-02-16 |
Family
ID=17214523
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25088898A Expired - Fee Related JP3621271B2 (ja) | 1998-09-04 | 1998-09-04 | アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3621271B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020015742A (ko) * | 2000-08-23 | 2002-03-02 | 신철수 | 단백질 가수분해효소를 이용한 아스파탐 전구체의 제조방법 |
| WO2002085840A1 (en) * | 2001-04-20 | 2002-10-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing n-formylamino acid and utilization thereof |
-
1998
- 1998-09-04 JP JP25088898A patent/JP3621271B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020015742A (ko) * | 2000-08-23 | 2002-03-02 | 신철수 | 단백질 가수분해효소를 이용한 아스파탐 전구체의 제조방법 |
| WO2002085840A1 (en) * | 2001-04-20 | 2002-10-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing n-formylamino acid and utilization thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3621271B2 (ja) | 2005-02-16 |
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