WO2002064787A1

WO2002064787A1 - Neurotonine et utilisation

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Publication number: WO2002064787A1
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Inventors: Toshihiro Nakajima
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Description

明細書ニューロトニンおよびその利用技術分野

本発明は、ニューロトニンおよびその利用に関する。詳しくは、二ユーロトニン、ニューロトニンをコードする c D N A、核酸分子、ニューロトニンに対するモノクローナル抗体など、およびそれらの利用に関する。背景技術

末梢神経障害は、運動神経筋接合部終末において神経の興奮伝達の欠陥に由来し筋疾患をも伴うことが多いために、感覚異常、運動障害、自律神経障害など様々の病態が知られている。その病因も多様であり、詳しくは不明な場合も多い。それらのうち、末梢神経の V G K C (Voltage gated potassium channel) 異常、神経末端力、らの持続的なァセチルコリンの放出を伴う神経'筋疾患として、 Isaacs 症候群が知られ、これは持続性筋線維活動症候群ともいわれている。その臨床的特徴として、四肢の筋硬直、有痛性筋痙攣、手指の開排制限などの筋収縮後の弛緩困難、歩行障害、発汗過多などの症状が観察されている。発症の機作は不明であるが、胸腺腫との合併の存在、血中に免疫複合体を有する症例が見られることから、自己免疫疾患機序の存在も想定されている。

このような Isaacs 症候群を始めとする末梢神経障害の治療方法として、今のところ選択的かつ有効な方法がないのが実情であり、血漿交換による方法、ビタミン B ₁₂投与などの対処的な治療法に留まる。本格的な高齢化社会の到来を間近に控えて、上記末梢神経障害に加えて、糖尿病の合併症である末梢性多発性神経炎、筋の全般的な有痛性痺れなどにも有効に治療できる方法が待たれている。本発明者は、 I saac s症候群患者から単離された c D N Aが、ある特定のタンパク質をコードして、そのタンパク質が患者の血中に増加している事実を捉えた。そこで、鋭意研究を進めた結果、上記 c D N Aおよびそのタンパク質を同定して、本病態に関わる因子であることを突き止めるとともに、それらの配列構造を決定し、これらの核酸分子とタンパク質を利用した診断治療に係る本発明を完成した。本発明に係る D N A分子およびタンパク質は、末梢神経障害に関する基礎研究ならびに臨床応用に資するさまざまな物質および方法を提供する。発明の目的

本発明は、ニューロトニン、ニューロトニンをコードする c D N Aの構造と機能に基づき、核酸分子、ニューロトニンに対するモノ 'クローナル抗体、これらを利用して、関連する臨床検査薬、治療薬、新規なベクター、抗ニューロトニン抗体を結合する血液濾過材、培養媒体、トランスジヱニック動物、スクリーニング用動物などを提供することを目的とする。発明の概要本発明に係るタンパク質は、下記の性状を有する末梢神経細胞タンパク質（以下「ニューロトニン」という）である。

a ) Isaacs患者、またはそれ以外の末梢神経障害患者の末梢神経細胞に見出され、

b ) 前記患者の血液中に見出される抗体と反応し、

c ) ゥサギに免疫すると Isaacs症候群様の症状を引き起こし、かつ d ) SDS- PAGEにより求めた分子量約 6 6 k Da を持つ

本発明に係る c D NAは、ニューロトニンをコードする c D NAでめる。

さらに本発明に係る D NAは、ニューロトニンをコードするカあるいは図 1 または 2 に示すヌクレオチド配列の全てのヌクレオチド配列を含む D N Aである。

ニューロトニンをコードする力、あるいは図 1 または 2に示すヌクレオチド配列の全てまたは一部に実質的に対応する 1つ以上のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記配列のいずれかと実質的に相同性であるかもしくは前記配列のいずれかとハイプリダイズする配列を含む核酸分子も本発明に含まれる。

本発明に係る D NAには、マウスニューロトニンをコードする力あるいは図 3または 4に示すヌクレオチド配列の全てのヌクレオチド配列を含む D N Aも包含される。また、マウスニューロトニンをコードするマウス c D NAも本発明に属する。

さらに、マウスニューロトニンをコードするカヽあるいは図 3 または 4 に示すヌクレオチド配列の全てまたは一部に実質的に対応する 1つ以上のヌクレオチド配列を含むか、または前記配列のいずれかと実質的に相同性であるかもしくは前記配列のいずれかとハイブリダィズするマウスニューロトニンをコードする配列を含む核酸分子も本発明に含まれる。

さらに上記 c D N Aまたは上記核酸分子の何れかに対するアンチセンス R N Aもしくはアンチセンス D N A、上記の c D N Aまたは上記核酸分子、またはそれらの一部から転写された R N Aを認識し切断するリボザィムも本発明に含まれる。

本発明に係る発現ベクター、クロー-ングベクタ一またはコスミドは、上記 c D N A、または上記核酸分子の何れかを含む。

本発明に係る形質転換体は、上記ベクターまたはコスミドを保持する形質転換体である。

本発明に係る原核細胞、真核細胞または突然変異生物細胞は、上記核酸分子の何れかを含有する。

本発明に係る -ユーロトニンは、図 5または 6に示すアミノ酸配列を有する。

本発明に係るタンパク質は、上記患者の血液に見出される抗体と結合する活性を有し、下記 a)または b)の特徴を有するタンパク質である。

a) 図 5または 6 に示されるアミノ酸配列のポリペプチド、図 5または 6に示されるアミノ酸配列において 1 もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加および/または揷入されたァミノ酸配列を有するポリペプチド、またはニューロトニンの抗原性部分を構成するァミノ酸配列を含む合成ポリペプチド、あるいは機能的に等価なこれらの変異体、あるいはこれらのアミノ酸配列をさらに含む融合ポリペプチドの形態のポリペプチド

b)図 1 〜 4 の何れかに記載の塩基配列からなる D N Aにハイプリダィズする D N Aがコードするタンパク質

また本発明に係るタンパク質は、末梢神経細胞にある「 1 4 一 3 一 3」タンパク質と結合でき、下記 a)または b)の特徴を有するタンパク質である。

a) 図 5または 6 に示されるアミノ酸配列のポリペプチド、図 5または 6 に示されるアミノ酸配列において 1 もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加およびノまたは挿入されたァミノ酸配列を有するポリぺプチド、またはニューロトニンの抗原性部分を構成するアミノ酸配列を含む合成ポリペプチド、あるいは機能的に等価なこれらの変異体、あるいはこれらのアミノ酸配列をさらに含む融合ポリペプチドの形態のポリペプチド

b)図 1 〜 4の何れ力に記載の塩基配列からなる D N Aにハイプリダィズする D N Aがコードするタンパク質

さらに本発明は、上記タンパク質の免疫学的に活性なドメインまたはそのドメインを有する断片を含むものである。

本発明に係るポリぺプチドは、図 7または 8 に示されるアミノ酸配列のポリペプチド、図 7または 8 に示されるアミノ酸配列において 1個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加および/または揷入されたァミノ酸配列を有するポリぺプチド、あるいはニューロトニンの抗原性部分を構成するアミノ酸配列を含む合成ポリペプチド、または機能的に等価なこれらの変異体、あるいはこれらのアミノ酸配列をさらに含む融合ポリペプチドの形態のポリペプチドも包含する。

本発明に係る免疫学的分析用試薬は、上記のタンパク質の何れかを含む、当該タンパク質を認識する抗体を分析するための分析用試薬でもある。

また、上記免疫学的分析用試薬は、 I s aac s症候群またはそれ以外の末梢神経障害の診断または治療効果の判定を目的とするものである。

本発明に係る免疫学的分析用試薬は、上記のタンパク質の何れかと反応する抗体を含む、当該タンパク質を分析するための免疫学的分析用試薬である。

また、上記免疫学的分析用試薬は、 I s aa c s症候群またはそれ以外の末梢神経障害の診断または治療効果の判定を目的とするものでもある。

さらに、上記免疫学的分析用試薬は、その分析すべき上記タンパク質の何れかが末梢神経細胞に存在するものである。

本発明の-ユーロトニンの検出方法は、被験者の体液中に存在する抗体であって、上記タンパク質の何れかと反応する抗体を分析することによる。

本発明による上記タンパク質と結合するリガンドのスタリーニング方法は、次の工程を含む。

a)リガンドの候補化合物を上記のタンパク質と接触させる工程、およぴ

b)前記タンパク質に対する結合活性を示す候補化合物を選択するェ本発明による測定方法は、上記スクリーニング方法によって得ることができるリガンドを、上記タンパク質の何れかをアンチリガンドとして用い、両者の親和性に基づいて該タンパク質を測定する方法である。

本発明によるスクリーニング方法には、上記タンパク質の何れかと上記リガンドとの結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法も含まれ、これは次の工程を有する。

a)候補化合物の存在下で、上記のタンパク質と上記リガンドとを接触させる工程、および

b)前記タンパク質とそのリガンドとの結合を阻害する活性を示す候補化合物を選択する工程

本発明に係る化合物は、上記スクリ一二ング方法によって得ることができる化合物も含む。

本発明に係るニューロトニン阻害剤は、上記スクリーニング方法によつて得ることができる化合物を含む。

本発明に係る末梢神経障害の治療用薬剤は、上記スクリーニング方法によって得ることができる化合物を含む。

本発明に係る抗体は、上記タンパク質の何れかに結合する抗体である。

前記抗体には、モノクローナル抗体が含まれる。当該モノクロ一ナル抗体には末梢神経障害の原因となる抗体に対するモノクローナル抗体が含まれる。

本発明による方法には上記タンパク質の何れかまたは該タンパク質をコードする遺伝子の発現を指標に、該タンパク質を発現する細胞を検出または分離する方法が含まれる。この方法は細胞が末梢神経細胞である場合を含む。

本発明に係る上記タンパク質の何れかを発現する細胞の検出または分離用試薬は、上記抗体を含む。

本発明に係る試薬には、上記 D N Aまたはその一部、あるいはそれらから転写された R N Aとハイブリダィズできるヌクレオチド配列を有する核酸分子を含み、これらの D N Aまたは R N Aを検出するための試薬が含まれる。

本発明に係るトランスジエニック非ヒト脊椎動物は、上記 D N A の発現が改変されているかまたは該改変を誘導することができるトランスジヱニック非ヒト脊椎動物である。

上記動物は、末梢神経障害モデル動物でもある。

本発明に係るノックアウト非ヒト脊椎動物は、上記非ヒト脊椎動物であって、内因性に有する上記 D N Aの発現が抑制されているノックアウト非ヒト脊椎動物である。

上記ノックアウト非ヒト脊椎動物には、他の遺伝子がノックァゥトされている非ヒト脊椎動物も含まれる。

本発明に係る細胞には、上記非ヒト脊椎動物の何れから由来する細胞が含まれる。

本発明に係るスクリーニング方法には、図 1 〜 4に記載の D N A の内因性プロモーターの活性を上昇または低下させる化合物のスクリーニング方法も含まれ、これは、

a)被検化合物の存在下、図 1 〜 4に記載の D N Aの内因性プロモーターの下流に結合されている遺伝子の発現を検出する工程、および b )該発現を上昇または低下させる化合物を選択する工程、

を含む方法である。

また、上記スクリーニング方法は、図 1〜4に記載の D N Aの内因性プロモーターの活性を上昇または低下させる化合物のスクリ一ニング方法であって、

a)上記の非ヒト脊椎動物または該動物に由来する細胞に、被検化合物を適用する工程、および

b)ノックインされた遺伝子の発現を上昇または低下させる化合物を選択する工程、

を含む方法でもある。

本発明に係るニューロトニンで免疫された動物とは、 I s aa c s症候群またはそれ以外の末梢神経障害の研究のために、および I s aac s 症候群またはそれ以外の末梢神経障害の改善作用を有する物質のスクリーニングのために使用する、ュユーロトニンで免疫された動物である。

本発明に係るゥサギとは、 VGKC機能の抑制、神経終末におけるシグナル伝達不全、または有痛性筋痙攣を改善するタンパク質または非タンパク性物質をスクリーユングするためのニューロトェンで免疫されたゥサギである。

本発明に係る診断マーカーは、ニューロトニンもしくはその関連タンパク質またはそれ以外の末梢神経障害の原因となる抗体をマーカーとして、上記モノクローナル抗体との特異的結合を検出することで、被検者からの試料検体中の-ユーロトニンもしくはその関連タンパク質抗体または末梢神経障害の原因となる抗体のレベルを測定することにより I saa c s症候群、またはそれ以外の末梢神経障害を診断するための診断マーカーである。

本発明による検査方法とは、 I s a ac s症候群あるいはそれ以外の末梢神経障害を診断するためのデータを供する検査方法であり、被検者からの試料検体中のニューロトニンまたは末梢神経障害の原因となる抗体レベルを測定することを特徴とする検查方法である。

本発明に係る血液濾過剤とは、血液の透析濾過により血中のニュ一口トニン抗体または末梢神経障害の原因となる抗体を、濾過材に固定化した上記モノクローナル抗体に結合させることにより体内のニューロトニン抗体または末梢神経障害の原因となる抗体を低減せしめることを可能とする、ニューロトニンまたは末梢神経障害の原因となる抗体の存在に起因するしぴれを解除して治療するための血液濾過材である。

本発明に係るヮクチン組成物とは、製剤上許容される担体と一緒に、上記の少なくとも 1つのポリペプチドを含み該ポリペプチドの免疫応答を、あるいは細胞中に挿入された上記の核酸分子の何れかを有するウィルス細胞または宿主細胞を含み、揷入された核酸分子によりコードされるポリペプチドの免疫応答を刺激するための、ヒトまたはヒト以外の動物における I s aa c s 症候群あるいはそれ以外の末梢神経障害にたいする免疫応答を刺激するヮクチン組成物である。

本発明に係る細胞培養用媒体とは、末梢神経障害患者から分離された末梢神経 · 筋系の細胞とインキュベートすることにより、特異的に上記のモノクローナル抗体と結合させて、末梢神経障害の原因となる抗体を排除し、末梢神経となる細胞をインビトロで再生するための該抗体を含む細胞培養用媒体である。図面の簡単な説明図 1 は、ヒトニユーロトニン ' コーディング c D NA (short) のヌクレオチド配列を示す。図 2は、ヒトニューロトニン ' コーディング c D NA ( long) のヌクレオチド配列を示す。図 3 は、マウスニューロトニン ' コーディング c D NA (short) のヌクレオチド配列を示す。図 4は、マウス-ユーロトニン ' コーディング c D NA (long) のヌクレオチド配列を示す。図 5 は、ヒトニューロトニン（short) のァミノ酸配列を示す。図 6 は、ヒトニューロトニン（long) のァミノ酸配列を示す。図 7は、マウス -ユーロトニン（short) のァミノ酸配列を示す。図 8は、マウス -ユーロトニン（long) のァミノ酸配列を示す。図 9は、ウェスタンブロッテイングによるニューロトニンの検出および分子量の推定を示す写真である。 N B- 1神経細胞（左側）とともにラット（ P C— 1 2 ) の結果も示す。 66KD Aがニューロトニン (long) に対応し、 44 KD Aがニューロトニン（short) に対応する。図 1 0は、ゥサギにヒトニユーロトニンを免疫することによる末梢神経障害の誘発を示す写真である。 Aは、正常なゥサギを示し、自然な伏臥姿勢を保持している。 Bは、免疫後に末梢神経障害を誘発したゥサギを示し、その後肢は、痺れて歩行障害を呈している。図 1 1は、ニューロトニンによる免疫によるゥサギの筋肉組織異常を示す写真である。 Aは正常ゥサギの筋肉組織、 Bは、末梢神経障害を示すゥサギの筋肉組織を示す。 H E染色による結果を 100倍の倍率で示す。図 1 2は、ヒトニューロトニンを用いて、ヒト血清中の-ユーロトニン抗体を検出した結果を示す写真である。二次抗体として西洋ヮサビペルォキシダーゼ結合一抗ヒト ' 免疫グロブリン M

(anti - human I g M— H R P ) を使用した。

Aは末梢神経障害患者 Mの血清、 Bは末梢神経障害患者 Aの血清、 Cは正常なヒトの血清を示す。発明の具体的説明本発明に係るタンパク質は、下記の性状を有する末梢神経細胞タンパク質（以下「ニューロトニン」という）である。

a ) Isaacs症候群患者、またはそれ以外の末梢神経障害患者の末梢神経細胞に見出され、

b ) 前記患者の血液中に見出される抗体と反応し、

c ) ゥサギに免疫すると Isaacs症候群様の症状を引き起こし、かつ d ) SDS-PAGEにより求めた分子量約 6 6 k Daを持つ

以下、本発明を、ニューロトニンをコードする c D N A、関連核酸分子、ニューロトニン、ニューロトニンの生理機能、関連タンパク質、医用材料および動物への応用の順に詳細に説明する。

本明細書において、

「末梢神経障害」とは、 Isaacs症候群を除く末梢神経の障害をいうが、文中では必要に応じて Isaacs症候群を含めた広義の意味に使うこともある。

「VGKC」とは、 Voltage gated potassium channel の略であり、電位依存性力リゥムチャンネルをいう。

「ニューロトニンおよびその関連タンパク質」および「ュユーロトニンもしくはその関連タンパク質」において、「その関連タンパク質」には、ニューロト -ン抗体も含まれる。

ニューロトニンをコードする c D N A

ニューロト -ンをコードする c D NAは、ヒトゲノムに対応する c D N Aライブラリーに対して Isaacs 症候群患者の血清などを用いるィムノスクリー-ング手法を適用して調製できる。すなわち、 N B — 1細胞などの神経由来の c D N Aライブラリ一は、常法により m R N Aを分離し、公知の技術により λベクターなどに組み込んで、 mR Ν Α混合物に逆転写酵素が作用することによつて作成される。これにニューロトニン抗体を含む血清を使用して、ニューロトンを発現している c D NAを含むクローンが同定される。

本発明者が、上記のように Isaacs症候群患者の血清を用いてィムノスクリー-ングを行うことにより、新規タンパク質をコードしている c D N Aを得た過程において、鎖長が異なる 2つの c D N Aが見出された。このタンパク質をコードする長い c D NAを「long c D NA」と称し、最初に得られた 386アミノ酸のタンパク質をコードしている短い c D NAを「short cD NA」と称する。

図 1、 2にニューロトニンをコ一ドする c D NAについて、「 short cD NA」、「long cD NA」のヌクレオチド配列をそれぞれ示す。

本発明に係る D NAは、ニューロトニンをコードする力、あるいは図 1 または 2に示すヌクレオチド配列の全てを含む D NAである _c これには-ユーロトニンのアミノ酸情報、開始および終結コドンを含む D N Aの他に、スプライシングを受ける前の情報を担うゲノム構造遺伝子の D NAも包含される。

さらに-ユーロトニンをコードする力あるいは図 1または 2に示すヌクレオチド配列の全てまたは一部に実質的に対応する 1っ以上のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記配列のいずれかと実質的に相同性であるかもしくは前記配列のいずれかとハイプリダイズする配列を含む核酸分子もまた本発明に属する。本発明に係る核酸分子は、一本鎖または二本鎖の D NA, c D NAまたは R N Aであつてもよい。ここで「実質的に相同性」である配列には、約 5 0 %以上、例えば 60%以上の配列同一性を有する配列、およぴ機能的に等価な対立遺伝子変異体の配列、および単一または複数の塩基の置換、付加、およびノまたは削除により修飾された関違配列が包含される。同様に「機能的に等価」とは、ニューロトニンと同様の作用を示すポリペプチドに対応することを意味する。

図 1 、 2に示す配列または上記の定義のように実質的に相同な配列あるいは機能的に等価な配列とハイプリダイズする核酸分子もまた、本発明の範囲内に含まれる。ここで，用いられる「ハイブリダィズ」とは、非緊縮（ノンストリンジヱントな）条件（ 6 X SSC, 1% SDS, 10% Dextran, 100g/ml salmon sperm D N A , 室温） ίこおレヽて結合し、低い緊縮条件（ 2 x SSC,室温、より好ましくは 2 X SSC, 30°C) にて、またはより高い緊縮条件、例えば 2 X SS 65°Cにて洗浄された酉己歹 IJと定義される。ここで SSC とは、 Standard Saline Citrate の略で、 0.15M NaCl, 0.015Mクェン酸ナトリウム pH 7· 2を意味する。

ニューロトニンに対する抗体のポリぺプチドをコ一ドする 1っ以上のヌクレオチド配列を含み、この配列が図 1 または 2に示されるニューロトニンをコードする配列からの 1つ以上の抗原決定基をコ一ドする領域を組み込んだ核酸分子もまた遺伝子工学の公知の方法を利用して作成することができる。このような核酸分子も本発明に含まれる。

ニューロトニンをコ一ドする構造遺伝子およびそれからの D NA、それから産生される c D NA、あるいは図 1 または 2に示すヌクレォチド配列の全てまたは一部に実質的に対応する 1 つ以上のヌクレォチド配列を含むか、または前記配列のいずれかと実質的に相同性であるか、もしくは機能的に等価な配列、あるいは前記配列のいずれかとハイプリダイズする配列を含む D N A、それらの D N Aから転写される R NAを検出するには、これらの D NA鎖または R NA 鎖とのハイブリダィゼーションを利用する原理に基づき、これらの核酸分子を含む試薬が好ましく用いられる。さらにこれらの核酸分子は、 P C Rプライマーまたは相同部分を探索するためのハイプリダイゼーシヨン · プローブとして利用することができる。

通常は、そのプローブは放射性アイソトープか、より好ましくは蛍光色素、化学発光など非ァイソトープを利用して、 5 '末端ラベル、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法などにより標識することができる。かかる D NA, それから転写された R NAを検出する試薬は、 in situハイプリダイゼーシヨン、サザンハイブリダィゼーシヨン、ノーザンハイブリダィゼーシヨン、プラークノヽイブリダィゼーシヨン、コロニーハイブリダィゼーシヨンなどにおいて、ハイブリダイゼーション用プローブとして好ましく利用される。

このようなプローブは、ゲノムライブラリーまたは c D NAライブラリーから、核酸レベルでのハイプリダイゼーションにより目的クローンの検索にも好ましく使用される。

ェユーロト— -ン

本発明に係るニューロトニンは、図 5 または 6 に示すアミノ酸配列を有するタンパク質である力あるいは上記 c D NA、この c D N Aに対応する遺伝子、または上記のヌクレオチド塩基配列のいずれカにハイプリダイズする D N Aによりによりコードされるタンパク質である。ニューロトニンは、上記患者の血液に見出される抗体と結合する活性を有し、さらに末梢神経細胞にある「 1 4一 3 — 3 タンパク質」と結合することができる。

ニューロトニンは、 I saac s症候群またはこれ以外の末梢神経障害患者の血清などを利用するィムノスクリーニングにより取得することができる。あるいは、その c D N Aが得られれば、公知の組替え D N A技術を利用して c D N Aの転写 · 翻訳により調製することもできる。

さらに、本発明に係るタンパク質は、図 5または 6 に示されるァミノ酸配列のポリべプチド、図 5または 6に示されるアミノ酸配列において 1個もしくは複数のァミノ酸が欠失、置換もしくは付加および Zまたは挿入されたァミノ酸配列を有するポリぺプチド、またはニューロトニンの抗原性部分を構成するアミノ酸配列を含む合成ポリぺプチド、あるいは機能的に等価なこれらの変異体ポリぺプチド、あるいはこれらのァミノ酸配列をさらに含む融合ポリぺプチドの形態のポリペプチドにまで拡張され、これらのポリペプチドもまた本発明に含まれる。また、本発明に係るタンパク質は、生物起源のタンパク質の他に、人工的に一部もしくは全部合成されたもの、または生物起源のタンパク質を改変して得られたものであってもよい。本発明に係る生物起源のタンパク質には、遺伝子組替え技術に基づき製造されたものも包含される。

ここで用いられる「ポリペプチド」とは、完全長のタンパク質、およびこれより配列の短いポリべプチド両方を含む。これにより上記ニューロトニンの免疫学的に活性なドメインまたはそのドメインを有する断片も本発明に包含される。「免疫学的に活性」とは、該タンパク質に対する抗体に対するェピトープを含み抗原性を有するこ. とをいう。したがって、そのようなドメインを含む断片は、抗原性を保持する。同様に- ユーロトニンの抗原性部分を構成するァミノ酸配列を含む合成ポリペプチドもまた本発明に係るタンパク質に含まれる。 '

ポリぺプチドのァミノ酸配列に関して上記で用いられた「機能的に等価」なる用語は、アミノ酸配列において単一または複数のアミノ酸の欠失、置換、付加および Zまたは挿入により修飾されたアミノ酸配列である力、あるいは.、アミノ酸配列において、例えばリン酸化もしくは脱リン酸化、ダルコシル化もしくは脱ダルコシル化などにより化学的にァミノ酸残基の側鎖が修飾された配列であるが、それにも関わらず、ニューロトニンと実質的に同等の作用あるいは活性が維持されていることに対応している。このような機能的に等価な変異体は、天然の生物学的変異として発生することがあり、あるいは公知技術を利用して製造することもできる。例えば、機能的に等価な組替えポリペプチドは、特定部位の突然変異誘発、不特定部位の突然変異誘発、またはアミノ酸の酵素的開裂および Zまたは連結反応などの公知技術を用いて製造することができる。

上記のタンパク質、すなわちニューロトニンおょぴその関連タンパク質は、それらのタンパク質を認識して結合する抗体を分析するために使用することができる。その目的のための免疫学的分析用試薬は、上記タンパク質のいずれかを含み、これとの抗原抗体反応および該反応とリンクした検知手段の測定を通じて検体中の抗体を検出することができる。そのための検知手段には、蛍光もしくは化学的発光を含む分光学的諸法の他に、免疫抗体法、放射能を利用する方法など公知の検出手段を適宜適用できる。

このような免疫学的分析用試薬は、疾病マーカーとしての上記抗体とニューロトニンもしくはその関連タンパク質との特異的結合を検出し分析するものでもあることから診断にも利用することができる。すなわち、被検者からの試料検体中のニューロトニンの特異的抗体または末梢神経障害の原因となる抗体のレベルを測定することにより I s aac s症候群、またはそれ以外の末梢神経障害を診断、または治療効果を判定する目的として利用することもできる。

他の適用例として、後述するモノクローナル抗体の製造において、抗体を産生する融合細胞の検出のため、すなわち多くの融合細胞の中から目的の特異抗体を産生している融合細胞を効率的に検出する目的に使用できる。例えば、抗原であるニューロトニンなどのタンパク質を固相支持体に固定化し、それに結合する融合細胞上清中の抗体を検出することによる。

上記ニューロトニンもしくはその関連タンパク質と結合できる物質、あるいは結合できるリガンドを有する化合物は、上記抗体を含めニューロトニンの機能を調節する物質として、またはその分析に利用できる物質として有用である。さらに抗ニューロトニンの抗体産生に抑制作用を示す化合物、抗ニューロトニン抗体の作用に影響を及ぼし得る化合物、あるいは抗体がニューロトニンに結合するのをブロックできる化合物などであってもよい。これらの化合物は、 I s a a c s 症候群またはそれ以外の末梢神経障害において何らかの薬理学的作用を発揮することができる。

そのような物質を選別するスクリーニング方法とは、好ましくは次の工程を含む。

a)リガンドの候補化合物を上記ニューロトニンもしくはその関連タンパク質と接触させる工程、および

b)前記タンパク質に対する結合活性を示す候補化合物を選択するェ程

上記のタンパク質を分析するには、このタンパク質をアンチリガンドとして、上記スクリーニング方法によって得ることができるリガンドとの特異的結合を通じて測定することによる。

さらに、上記タンパク質とそのリガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニング方法とは、好ましくは次の工程を含む。

a)候補化合物の存在下で、上記ニュ一ロトニンもしくはその関連タンパク質とリガンドとを接触させる工程、および

かかるスクリーニング方法によって得ることができるリガンドまたは化合物は、ニューロトニンもしくはその関連タンパク質の阻害剤となり得るものである。従って、上記のスクリーニングで得られる化合物は、ニューロトニンもしくはその関連タンパク質との結合を利用することにより、 I s aa c s症候群を始めとする末梢神経障害の治療用薬剤として使用することができる。マウスニューロトニンをコ一ドする c D NA

マウスの c D N Aライブラリ一力ら、マウスニューロトニンをコードする c D N Aを、ハィブリダィゼーション · クローニングにより単離することができる。そのためのプローブとして、上記ニュー口トニン c D NAの完全長配列を使用し、ポジティブクローンを含むプラークのスクリーニングを行ってもよい。

このようにして単離され、ヌクレオチド配列分析がなされたマゥスの-ユーロトニンをコ一ドする c D NAのヌクレオチド配列を図 3および 4に示す。

本発明に係る D NAとは、マウスニューロトニンをコ一ドする力、、あるいは図 3または 4 に示すヌクレオチド配列の全てのヌクレオチド配列を含む D NAである。さらにマウスニューロトニンをコ一ドするカあるいは図 3 または 4 に示すヌクレオチド配列の全てまたは一部に実質的に対応する 1つ以上のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記配列のいずれかと実質的に相同性である力、もしくは前記配列のいずれかとハイブリダィズする配列を含む核酸分子もまた本発明に包含される。本発明に係る核酸は、一本鎖または二本鎖の D NA, c D NAまたは R NAであってもよい。

ここで「実質的に相同性」である配列には、約 5 0 %以上、例えば 60%以上の配列同一性を有する配列、および機能的に等価な対立遺伝子変異体、さらに単一または複数の塩基の置換、付加、および Zまたは削除により修飾された関連配列が包含される。「機能的に等価」とは、ニューロトニンと同様の作用を示すポリペプチドをコードする配列を有することを意味する。図 1 、 2に示す配列または上記定義のように実質的に相同な配列あるいは機能的に等価な配列とハイブリダィズする核酸分子もまた本発明の範囲内に含まれる。ここで，用いられる「ハイブリダィズ」とは、上記に定義したとおりである。

ニューロトニンに対する抗体のポリペプチドをコードする 1っ以上のヌクレオチド配列を含み、この配列が図 3または 4に示されるニューロトニンをコードする配列からの 1つ以上の抗原決定基をコードする領域を組み込んだ核酸分子もまた公知の遺伝子工学技術を利用して作成することができる。

ヒトニユーロトニンをコードする D N Aまたは核酸分子について記載した事柄、利用などについては、そのままマウス -ユーロトニンおよびその関連タンパク質をコードする核酸についてもあてはまる。

マウスニューロ卜ニン

本発明に係るマウスニューロトニンは、図 7または 8に示されるアミノ酸配列のポリペプチドである。さらに本発明は、図 7または 8に示されるアミノ酸配列において 1個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加およぴまたは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいはニューロトニンの抗原性部分を構成するアミノ酸配列を含む合成ポリぺプチド、または機能的に等価なこれらの変異体、あるいはこれらのアミノ酸配列をさらに含む融合ポリぺプチドの形態のポリペプチドまで拡張される。ここで用いられた「ポリペプチド」および「機能的に等価」とは、上記で定義したとおりである。ヒトニユーロトニンについて記載した事柄、利用などについては、そのままマウスニューロトニンおょぴその関連タンパク質についてもあてはまる。

ニューロトニンおよびニューロトニン遺伝子の生理機能

発明者らが Isaacs 症候群患者の血清中に存在する対応抗体を利用したィムノスクリーニング法によって新規に発見したタンパク質であるニューロトニンのァミノ酸配列情報を担う構造遺伝子が、ヒトゲノム中に存在する。その位置、発現生理およびその調節機能などの詳細は今のところ不明である。さらに Isaacs症候群またはそれ以外の末梢神経障害がニュ一口トニンの過剰発現に由来するのか、異所性発現による影響なのか、あるいはニューロトニンおよびその抗体と末梢神経障害との関係についても今後の解明に待たねばならない。

ヒトからのニューロトニンは、ヒト以外の動物に免疫するとする Isaacs症候群様の症状を引き起こすタンパク質である。動物は、霊長類からヒッジ、ゥサギ、ラット、マウスなど免疫応答を示すものなら種を問わない。

例えば、ゥサギの場合、全長 5 1 1個のアミノ酸からなるニュー口トニンを用いて GST との融合タンパク質を作成し、これを抗原としてゥサギに免疫する。接種して 6週間ほど後には、後肢の痺れなど、 Isaacs症候群に類似した症状の末梢神経障害が誘発されることが認められる。このニューロトニンを免疫したゥサギの筋肉では、正常の筋肉組織と比べると、筋細胞の大きさが不均一になり、神経の変性も観察される。 Isaacs症候群の患者では、ニューロトニン遺伝子の発現が亢進しこれによりコードされるニューロトニンに結合する抗体の血中レべルが上昇している。その遺伝子の発現の原因、ニューロトニンの生理機能、 Isaacs症候群の病態との関係などは不明である。ニューロトニンに対する抗体産生も増大していることから、自己免疫疾患的な機序を基盤とする末梢神経障害の様相もある。これらの観察または実験結果を総合すると、新規に発見され同定されたニューロトニンは、 Isaacs症候群あるいはその他の末梢神経障害に関係するタンパク質であることが示されている。

マウスニューロトニンの c D N Aは、対応するヒト c D N Aの塩基配列と 85%以上の相同性があるが、マウスニューロトニン c D N Aから導き出されるアミノ酸配列レベルにおいては、相同性を示す他の因子は存在せず、機能もわかっていない。マウスニューロトニン遺伝子も、ヒトニューロトニン遺伝子と同様に機能しており、ヒトのニューロトニンをマウスに免疫すると、後肢がしびれるなど Isaacs 症候群に類似した末梢神経障害を誘発することが考えられる。

上記遺伝子の発現に関連して、その D NAの内因性プロモーターの活性を上昇または低下させる化合物は、

a)被検化合物の存在下、当該 D N Aの内因性プロモーターの下流に結合されている遺伝子の発現を検出する工程、

b)該発現を上昇または低下させる化合物を選択する工程、

を含む方法によりスクリーニングすることができる。

ヒトニユーロトニン c D N Aの塩基配列をァミノ酸配列に変換し、モチーフ検索を行うと、主なモチーフは存在しないが、その C末端側に脂質による修飾がなされる部位の存在が判明している。ニュー口トニンの C末端側部分による免疫でゥサギが後肢の痺れを示したこと、痺れを訴える患者の血清に見られるニューロトニンに対する抗体は、ニューロトニンの C末端側に対するものが多く見出される事実などから、ニューロトニンは、膜タンパク質であり、少なくともその C末端側は膜内に存在して機能している。

これまで本発明者の研究により、ニューロトニンの C末端部分は、「 1 4一 3 — 3タンパク質」に結合することが明らかにされている。この「 1 4 一 3 — 3タンパク質」は、細胞内に存在し、セリン残基がリン酸化されたタンパク質を認識し、種々のシグナル伝達のモジユレータとしての役割が想定されている。したがって、ニューロトニンに代わり、あるいは競争的に「 1 4一 3 — 3タンパク質」に結合または相互作用をすることができるタンパク質または非タンパク性物質は、ニューロトニンに類似した影響を「 1 4— 3— 3 タンパク質」に及ぼすことができる。このようなタンパク質または非タンパク性物質は、明らかに I saac s症候群またはそれ以外の末梢神経障害において何らかの薬理学的作用を発揮することが可能である。

I saac s症候群またはそれ以外の末梢神経障害のうち、一部の患者の血清には、 V G K C抗体が検出されたことがこれまで報告されており、これらの病態において V G K Cの機能異常の関与が示唆されている。さらにこれらの患者の血清にはニューロトニンに対する種々の抗体も存在すること、とくにその C末端側に対する抗体が多くの患者に見られたことが本発明者らの研究により明らかになり、これらの抗体も同様にニューロトニンの生理機能と関連して症状に関与している。このため、これらの抗体に結合できる抗体、抗体産生に抑制作用を示す化合物、または抗体の作用に影響を及ぼし得る化合物、抗体がニュ一ロトニンに結合するのをブロックできる化合物などは、 Isaacs症候群またはそれ以外の末梢神経障害において何らかの薬理学的作用を発揮することができる。

関連核酸分子

本発明に係る上記ニュ一ロトニン遺伝子、その mR NA, c D N Aあるいはこれらに関連する核酸分子を組替え D N A技術により組み込んだアンチセンス R NAおよびアンチセンス D NA, リボザィム、コスミドなども本発明の範囲に包含される。これらの組替え D N A、核酸分子もまた、遺伝子診断および遺伝子治療の方法の確立、医薬品開発において適用される各種の遺伝子クローニング操作において、必要に応じて利用することが可能である。

• アンチセンス R NA、アンチセンス D NA

ニューロトニンの翻訳情報を担う mR NA鎖とこれと相補的になっているアンチセンス鎖とからハイプリダイゼシヨンにより作成されたニ本鎮 R NAもしくは D NA、あるいは上記 c D NAあるいは上記核酸分子に対するアンチセンス R NA、アンチセンス D N Aは、相補的な m R N Aとハイプリダイゼーションして翻訳を阻害し相当する遺伝子の発現の抑制機能を有するため、アンチセンス医療、ノックアウトマウスの作成に応用できる。

アンチセンス医療では、遺伝子レベルでの発症の機作の解明、治療方法の開発などに、アンチセンス R NA、アンチセンス D NAが利用される。またニューロトニン遺伝子の発現を調節する目的にもこれらの R N A、 D N Aを利用することができる。標的となる遺伝子の発現を抑制するためには、細胞内にアンチセンス R N Aを注入するカこれを作る D N Aを導入してもよい。

• リボザィム

酵素活性部位が解明されたリポザィムの中で、ニューロトニンの R N A、上記 c D N Aまたは上記核酸分子から転写された関連 R N A、またはそれらの一部から転写された関連 R N Aの任意の塩基配列を特異的に切断するように設計され、化学的な合成により作成されたリボザィムあるいは、その酵素活性部位の塩基配列を有し R N A切断活性があるオリゴ D N Aも本発明に包含される。

• コスミド

プラスミド由来の複製起点および λバタテリオファージの c o s部位などの必要な要素の他に、ニューロトニン遺伝子またはその D N A断片、関連核酸を組み込んだ環状 D N Aは、プラスミドと同様に複製されるため、ベクターとして利用できる。このような人工核酸粒子は、比較的大きい D N A断片であっても挿入できるため、クロ一ユング目的のために大腸菌などの細菌に効率よく導入することができる。また、遺伝子ライブラリーを作るのにも好適である。

• 発現べクターおよびクローニングべクター

形質転換された上記核酸を含有する原核細胞微生物、真核細胞微生物は、問題とするタンパク質の大量発現に使用することができる。本発明に係るニューロトニンをコ一ドするヌクレオチド配歹 IJは、一群の公知技術および発現システム、例えば大腸菌、枯草菌などの原核細胞における発現系、酵母、形質転換哺乳類細胞などの真核細胞における発現系、ならびにトランスジエニック哺乳類における発現系などを適宜利用することによりクローン化し、発現を達成することができる。

上記の核酸分子を含む真核細胞または原核細胞を上記ポリべプチドが発現する条件下で培養し、このようにして産生されたポリぺプチドを回収することからなるニューロトニン関連の合成ポリべプチドの製造方法も好ましく用いることができる。

以上より、本発明の範囲は、本発明に係る核酸分子またはヌクレォチド配列を含むクローニングべクターおよび発現ベクターも包含している。かかる発現ベクターは、本発明の核酸分子とリーデイングフレームを適合させて結合された適切な制御配列、例えば開始および停止コドンなどの翻訳調節要素およぴプ口モータ ¹——オペレーター領域、リボソーム結合部位、終了停止配列などの転写調節要素を含んでいる。

本発明に係るベクターには、遺伝子工学分野での公知の、または文献に記載された技術に用いられるプラスミド、バタテリオファージおよびウィルス（真核ウィルスも含む）などが挙げられ、これらのベクターは、公知のさまざまな発現システムにおいて使用することができる。好ましいウイウルス性ベクターとしてパキュ口ウィルス、アデノウィルスおよびワクシニアウィルスなどを例示することができる。

様々な公知技術を使用することによつて本発明に係る核酸分子またはヌクレオチド配列の発現の目的で、上記のベクターまたはコスミドを原核細胞または真核細胞内に挿入することができる。あるいは、トランスジエニック動物を作成するため生殖系列細胞または体細胞にこれらベクターまたはコスミドを保持している形質転換体を作成することができる。

さらに本発明は、本発明に係る核酸分子またはヌクレオチド分子を有する、形質転換もしくはトランスフエクシヨンされた、真核もしくは原核宿主細胞またはトランスジエニック微生物も含む。これらの形質転換体などを製造するため、公知の形質転換技術またはトランスフエクション技術を使用することができる。

哺乳類細胞発現システムは、ニューロトニンがジスルフィド結合、グリコシレーシヨン、脂質付加などの翻訳後修飾を多かれ少なかれ必要とするならば、哺乳類宿主細胞が抗原のネィティブな形態およびェピトープの良好な再生を可能とすることから、より好ましい。すなわち、真核発現システムは、抗原のネイティブな形態の再生に乏しく不溶性タンパク質を産生するおそれがある大腸菌（E. co l i ) に対して、翻訳後修飾を遂行しうるからである。この目的により好ましく用いることができる動物細胞として、ヒトまたは動物の繊維芽細胞またはミエローマセルライン、例えば He l a-ヒトセルライン、 BHK-幼児ハムスター腎臓細胞、 VER0— サル腎臓セルライン、 FR3T3- F i sher ラット繊維芽細胞、 NIH3T3—マゥス繊維芽細胞セルライン、 C127 I—マウス乳癌セルライン、 CV-1-アフリカグリーンモンキー腎臓繊維芽細胞、 3T6—マウス胚繊維芽細胞、 L細胞一マウスセルライン、 CH0—チャイニーズハムスター卵巣セルライン、 NS0NS I 一 SP2および他のマウスミエローマセルライン、 YB2/0および Y3 などの他のマウスミエローマセノレラインおょぴラットミエローマセノレラインなどを挙げることができる。

異なったクラスの哺乳類セルラインに適切なベクターは、種々知られているが、一般的にこれらは、ニューロトニンまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列に作動的に結合されたプロモーターおよび/またはェンハンサーを含む。好適なプロモーターとして、 S V40初期または後記プロモーター、例えば PSVLべクター、サイトメガロウィルス ( CMV) プロモーター、マウスメタロチォネィン I プロモーターおよびマウス乳癌ウィルス LTR ( l ong t ermi na l repea t ) などが挙げられる。ベクターは、好適なマーカー、例えばジヒド口葉酸還元酵素またはグルタミン合成酵素など.の遺伝子などを含んでいる。

宿主細胞のトランスフエクションは、標準的な公知技術を使用して行うことができる。そのために例えば、リン酸カルシウム法、リン酸カルシウムの代わりに DEAE—デキストランまたはポリブレンを用いる方法、プロトプラスト融合法、赤血球ゴースト融合法、リポソーム融合法もしくはリポフエクシヨン法、直接マイクロインジェクシヨン法、ジーンキャノンまたはエレクトロポレーシヨンを用いた哺乳類セルラインのトランスフエクション方法が確立されている。一般的に線状 D N Aは環状 D N Aよりも容易に導入される。関連タンパク質

ニューロトニンに関連した合成ポリぺプチドは、ニューロトニンと同様に以下に述べる抗体産生、ワクチン製造などにおいて利用することができる。かかる合成ポリペプチドは、発現制御配列に作動的に結合した、上記のヌクレオチド配列を含む組替え D N Aを含む宿主細胞、またはこのような組替え D N A分子を含むビヒクルまたはベクターを含む宿主細胞中での発現により製造することができるあるいは、ポリペプチドは本発明に係る裸の D N A分子を宿主細胞に直接注入することによっても発現させることができる。

このようにして発現された合成ポリペプチドは、ニューロトニンのすベてまたは一部の免疫原性を示す部分を含む融合ポリペプチドおよびそれに融合した組替え分子の D N Aによってコードされた付加的ポリペプチドであってもよい。例えばグルタチオン一 S — トランスフェラーゼ、ホスファターゼ、 β—ガラタトシダーゼ、ゥレアーゼ、 Η Βコア（ hepat i t i s B core) 抗原などのタンパク質に力ップリングされた本発明に係る合成ニューロトニンまたは他のポリぺプチドを含む融合タンパク質を製造することが望ましい。大抵の融合タンパク質は、 2つのコード配列が、同調したリーディングフレームとともに結合された組替え遺伝子の発現により形成される。あるいはポリペプチドは、インビトロで化学的手段により結合することができる。このような融合またはハイブリッド誘導体もまた本発明に包含され、合成ポリぺプチドは、例えば公知の Merr i f i el d固相合成法などの化学的手段を使用することにより製造することができる _c

• 抗体タンパク質

ニューロト -ンおよびその関連タンパク質に対する抗体は、

I s aac s 症候群およびそれ以外の末梢神経患者において産生されている。したがって、患者の血清にはニューロトニンに対する種々の抗体も存在するが、本発明者らの研究により特にその C末端側部分に対する抗体が多くの患者に見出されている。これらの抗体もニュ一口トニンの生理機能と密接に関連して症状に関与している。このため、これらの抗ニューロトニン抗体に結合できる抗体もまた、 I s aac s 症候群または末梢神経障害において何らかの薬理学的作用を発揮することができる。

上記抗体は、抗原となるタンパク質を動物に接種して免疫することにより調製することができる。そのための動物として、広く利用されている、ゥサギ、ヒッジ、マウス、ラットなどが挙げられる。しかしながら、産生される抗体はいずれもポリクローナルであり、しかも動物由来の抗体であるためヒトにとつては異物である。

抗体の中で、モノクローナノレ抗体は、単一のェピトープに特異的に結合する均一な抗体で特に有用で好ましい抗体である。すなわち、ニューロトニンに対するモノクローナル抗体、 VGKC抗体に対するモノクローナル抗体、末梢神経障害の原因となる抗体またはそれ以外の上記の関連タンパク質などに対するモノク口ーナル抗体などは、本発明の範囲に含まれる。

これらのモノクローナル抗体の製造は、抗原となるニューロトニンなどで免疫した動物脾臓からのリンパ球細胞と H A T感受性の骨髄腫細胞とのハイプリドーマ細胞を調製しクローン化する従来の確立された細胞融合技術を利用してもよく、また公知の遺伝子組替え技術を利用しても大量に生産することができる。

ヒト化モノクローナル抗体を得るには、マウス、ラットなどからの動物細胞の抗体 c D N Aとヒト抗体 c D N A との融合を含む遺伝子組替え技術によるキメラまたはヒト化抗体の産生がある。ヒト由来細胞 · 腫瘍細胞クローンの利用、マウス腫瘍細胞とヒト細胞との融合、トランスジエニックマウス利用によるヒト抗体の産生方法も挙げられる。

上記抗体の一般的な用途として、ニューロトニン、その関連タンパク質、「 1 4 一 3 — 3タンパク質」に関連する検查薬、診断薬、治療薬、研究用試薬、分析用試薬、免疫スクリーニング用抗体などが挙げられる。これらの抗体の利用態様について一例を挙げると、二ユーロトニンもしくはその関連タンパク質と反応する抗体を含み、該抗体がニューロトニンなどと検知可能に結合する ^とに基づく、ニューロトニンもしくはその関連タンパク質を測定するための免疫学的分析用試薬が示される。ここで検知可能とは、分光学的諸方法の他に免疫抗体法、放射能を利用する方法など公知の検出手段を適宜適用できる状態にすることをいう。具体的な利用態様として、ラジオイムノアッセィ（R I A )、酵素標識抗体測定法（ E L I S A ) などが挙げられる。 R I Aでは、 ¹²⁵ I または ¹³¹ I などで標識した上記抗体を固相支持体に固定化し、その放射活性を測定することによる。また E L I S Aでは、同様に抗体を支持体に固定し、アルカリホスファターゼまたは西洋ヮサビペルォキシダーゼなどを結合させた二次抗体を添加して酵素反応を行い比色、蛍光を測定することによる。

また、上記抗体を利用する態様の別の例として、 I s aac s症候群またはそれ以外の末梢神経障害を診断したり、その治療の効果を判定するためのデータを供する検查方法が示される。これは、被検者からの試料検体中のニューロトニンもしくはその関連タンパク質、二ユーロトニン抗体または末梢神経障害の原因となる抗体レベルを測定することを特徴とする検査方法である。

また、ニューロトニンもしくはその関連タンパク質、あるいは末梢神経障害の原因となる抗体をマーカーとして、上記抗体との特異的結合を検出することで、被検者からの試料検体中の-ユーロトニンもしくはその関連タンパク質のレベルあるいは末梢神経障害の原因となる抗体のレベルを測定する。その結果は I s aa c s症候群またはそれ以外の末梢神経障害を診断するために、または治療効果の判定のために供される。これらの分析用試薬は、分析対象とするニュー口トニンもしくはその関連タンパク質などが本来、神経細胞に存在するものである。しかしながら、被験者の体液中に存在する上記抗体を分析することにより、ニューロトニンもしくはその関連タンパク質を検出することができる。

ニューロトニンもしくはその関連タンパク質をコードする遺伝子の発現を手がかりに、該タンパク質が産生されている細胞を検出または分離することができる。例えば、ニューロトニンおよび関連タンパク質に対する抗体、好ましくはそのモノクローナル抗体を検出手段として使用することにより、フローサイトメトリー（F l ow cyt ometry) の技術を利用することにより、これらのタンパク質を発現している細胞を分離または検出することができる。このための検出または分離用試薬として、上記の抗体、より好ましくはそれらのモノクローナル抗体に、例えば蛍光物質を標識として付加した抗体を含むものが使用される。具体的にはその検出は、細胞に結合した抗体の蛍光励起を追跡することにより行われ、分離は自動選別機能を備えたセルソーター（Ce l l sort er) による。

この方法を使用することにより、細胞集団の中から、ニューロトニンを発現している末梢神経細胞を特異的に検出または分離することができる。例えば、下記トランスジエニック非ヒト脊椎動物またはノックアウト非ヒト脊椎動物に由来する末梢神経細胞は、この手法を利用して検出 · 分離することができ、これらの細胞はニューロトニン遺伝子の発現とその調節を調べるための有用な材料を提供する。

本発明に係る核酸分子またはヌクレオチド分子を含み、形質転換されたまたはトランスフエクションされた真核または原核宿主細胞またはトランスジェニック微生物もまた本発明に含まれる。さらに上記モノク口ーナル抗体を産生する B細胞と腫瘍細胞との融合細胞も含まれる。上記抗体およびフローサイトメトリーを組合わせて利用することにより、目的とする上記形質転換体や融合細胞などの分離にも利用することができる。

医用材料としての応用

本発明に係るニューロトニンおょぴその関連タンパク質は、上記の分析、検查、診断、治療用として利用されることの他に、血液濾過材、細胞培養媒体、薬物送達システムの担体、ワクチンなど、種々の医用材料にも応用することができる。以下、その利用態様の例を挙げるが、これらのみに限定されるものではない。

血液の透析濾過により血中のニューロトニン抗体または末梢神経障害の原因となる抗体を、濾過材に固定化した上記モノクローナル抗体に結合させ、次いで濾過した血液を再ぴ患者に戻せば、体内のニューロトニン抗体または末梢神経障害の原因となる抗体を低減せしめることができる。このような全血透析に代わる血液の濾過は、ニューロトニンもしくはその抗体、または末梢神経障害の原因となる抗体に起因するしびれを解除する治療法を提供する。本発明は、その目的のための抗体を結合させた血液濾過材としての利用もある, 他の利用態様として、末梢神経障害患者から分離された末梢祌経 · 筋系の細胞とインキュベートすることにより、特異的にニュー口トニンに反応するモノクローナル抗体と結合させて、末梢神経障害の原因に関与する抗体を排除し、末梢神経となる細胞をインビト口で再生するための該抗体を含む細胞培養用媒体の利用も挙げられる。

ヒト型抗体は、ヒトに対する抗原性がないため、 I s aac s症候群を始めとする末梢神経障害の原因に関与するニューロトニンあるいは他のタンパク質、生体成分などに直接反応し、その機能を失わせる治療目的、あるいは有効な生理活性物質、薬効を有する化合物を目的咅 IH立まで有効に送達するための D D S ( Drug De l i v ery S ys t em) 担体としての利用が挙げられる。反応の均一性から、ヒト型モノクローナル抗体は特に好適に使用することができる。

本発明に係るワクチン組成物とは、製剤上許容される担体と一緒に、本発明に含まれる上記のタンパク質の中で、 1つのポリぺプチドを含み該ポリべプチドの免疫応答を、あるいは細胞中に挿入された上記の何れかの核酸分子を有するウィルス細胞または宿主細胞を含み、挿入された核酸分子によりコードされるポリペプチドの免疫応答を刺激するための、ヒトまたはヒト以外の動物における I s aa c s 症候群あるいはそれ以外の末梢神経障害にたいする免疫応答を刺激するワクチン組成物である。

かかるワクチン組成物は、ワクチン製造分野において公知の方法により製造することができる。従来からのワクチン処方は、 1っ以上の薬剤的に許容される担体または希釈剤の存在のもとに、適切であれば、 1つ以上の好適なアジュパント、例えば水酸化アルミニゥム、サポニン、 Qu i l Aまたはその精製された形態、ムラミルジぺプチド、鉱油、またはノバソームなどと一緒に、 1つ以上の本発明に係るポリぺプチドを含むことができる。好ましい担体としては、患者にぺプチドまたはポリぺプチドを導入するのに使用されるビヒクルとして好適な生理食塩水溶液などの液体媒体を挙げることができる。防腐剤などの添加成分が含まれていてもよい。

他のワクチン処方として、本発明に係る核酸分子を揷入されたゥィルス、または宿主細胞、例えばワクシニアウィルス、アデノウィルス、サルモネラ族などの微生物を含んでもよい。これは、挿入された核酸分子によってコードされるポリペプチドに対する免疫応答を刺激するためである。

したがって、ヒトまたはヒト以外の動物における I s aa c s症候群あるいはそれ以外の末梢神経障害にたいする免疫応答を刺激するワクチン組成物の製造に本発明に係る核酸分子またはポリペプチドを使用する方法も本発明に含まれる。

このようなワクチンの投与は、従来の経路、例えば、経口または非経口（例えば、任意に間隔をおいた筋肉内注射、例えば 7〜 2 8 日間隔での 2回の注射）など任意に利用できる。動物

ニューロトニン遺伝子おょぴニューロトニンの機能おょぴその発現調節を探り、これに基づき I saac s症候群を始めとする末梢神経障害の診断治療の方法を確立し、治療薬を開発するためには、疾患モデル動物が有用である。すなわち、本発明に係る末梢神経障害モデル動物は、ニューロトニンをコードする D N Aカあるレヽは図 1 または 2に示すヌクレオチド配列、図 3または 4に示すヌクレオチド配列と相同性を有するかまたはハイプリダイズする D N Aの発現が改変されているカあるいはそのような改変を誘導できるトランスジエニック非ヒト脊椎動物である。

さらに有用なトランスジエニック非ヒト動物として、非ヒト脊椎動物であって、内因性のニューロトニン遺伝子 D N Aまたは関連 D N Aの発現が抑制されているノックアウト非ヒト脊椎動物、他の遺伝子がノックアウトされている非ヒト脊椎動物が挙げられる。他の遺伝子とは、ニューロトニンをコ一ドする遺伝子以外のものをいい、末梢神経細胞の他のタンパク質、例えば「 1 4一 3 _ 3」タンパク質などをコードする遺伝子などであってもよい。非ヒト脊椎動物の種類は特に限定されない。これらの動物も末梢神経障害のモデル動物として上記の目的に利用することができる。

その中で特に好ましく使用される非ヒト脊椎動物として、上記遺伝子をノックァゥトしたトランスジエニック · マウスは容易に作成することができる。かかるマウスは、ノックアウトされた遺伝子の機能の他に、末梢神経障害の機作の解明、その診断治療の方法の確立、薬剤開発の研究、ワクチンの検定などに広く利用することができる。このようなトランスジエニックマウスは、ノックアウトする遺伝子と転写の向きを逆にした D N Aをマウス受精卵に入れて作る公知の方法、あるいはアンチセンス R N Aを加える周知のアンチセンス法により作成できる。これらの場合、マウスゲノムからのニュ一口トニン遺伝子をもとにターゲティングベクターを介して行うことができる。さらに胚性幹細胞、すなわち E S細胞（embryonic stem cells) を利用する方法なども挙げられる。

ニューロトニンで免疫された動物は、 Isaacs症候群あるいはそれ以外の末梢神経障害の改善作用を有する化合物のスクリーニングに使用することができる。このような動物は、特に限定されないが、免疫応答を示すものであればその種類を問わない。そのための動物として、広く利用されている、ゥサギ、ヒッジ、マウス、ラットなどが挙げられる。

例えば、上記のようにヒトニユーロトニンで免疫したゥサギは、ヒトニユーロトニンに対する抗体が 6週間前後には産生されており、 Isaacs症候群に似た症状を呈する。この Isaacs類似の症状を示すゥサギは、上記モノクローナル抗体などの抗体類の機能、ワクチン - 薬剤類の効能を調べたり、ニューロトニンに結合する因子をプロックする化合物、タンパク質に結合してその機能を調整する化合物、 VGKC機能の抑制、神経終末におけるシグナル伝達不全、または有痛性筋痙攣を改善するタンパク質または非タンパク性物質などのスクリーニングに使用することができる。

上記ニューロトニン遺伝子の発現に関連して、その D N Aの内因性プロモーターの活性を上昇または低下させる化合物は、上記「関連タンパク質」の項に記載した方法とは別の方法として、

a)非ヒト脊椎動物または該動物に由来する細胞に、被検化合物を適用する工程、 b )ノックィンされた遺伝子の発現を上昇または低下させる化合物を選択する工程、

を含む方法によりスクリーニングすることができる。発明の効果

本発明によれば、 I s aa c s 症候群のキー物質ともいうべきニューロトニンが同定されその構造が明ら力こされたため、これに対するモノク口一ナル抗体、これらの物質の機能をモジュレートできる化合物、その化合物をスクリーニングできる動物などを作成または調製することができる。ニューロトニン、その関連物質および動物を利用して I s aac s症候群を含む末梢神経障害の検査方法、診断■治療方法を確立することができる。

本発明によれば、ニューロトニン遺伝子の存在が、その c D N A の単離と同定により明らかとなり、ニューロトニンあるいは末梢神経障害の原因となる抗体に対する抗体、モノクローナル抗体、トランスジエニックマウスの利用などにより、ニューロトニン遺伝子の機能おょぴその発現の機構、調節機作などの研究に有力な手段を与え、さらに末梢神経における機能不全の機作と実体の解明などに資するものである。実施例

以下、本発明を実施例に基づいてさらに説明するが、本発明の範囲は、これらの記載に限定されるものではない。実施例 1

• Isaacs症候群患者の血清が認識する抗原（ニューロトニン）の遺伝子クローニング

ニューロトニンをコードする c D NAは、ヒトゲノムの対応する遺伝子が発現している Isaacs 症候群患者の血清抗体を用いてィムノスタリーニングから得た。ヒト神経芽腫由来細胞（N B— 1 ) 株力、ら Acid guanidine/phenol chloroform法 ίこより全 R NAをキ由出し. さらにオリゴ（ d T) ビーズを用いてァフィ二ティークロマトグラフィ一により m R N Aを分離した（Anal. Biochem.，162:159， 1987)。 λΖΑΡ ベクター（STRATAGENE 社）を用いて、 c D N Aライブラリーを常法こ従レヽ作成した。 icoBlue immunoscreening Kit (STRATAGENE 社）により上記患者の血清によるィムノスクリーニングを行った。得られた陽性クローン（ファージ）をヘルパーファージによりプラスミド pBluescript II SK(+)へと変換した。 pBluescript II SK(+) に挿入された D N A の塩基配列は M13PrimerM4 および M13PrimerRV(Takara)を用いてダイターミネータ一法 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 74:5463, 1977) に基づき ABI PRISM377 D N A Sequencing System (Perkin Elmer社)により決定した。 Isaacs症候群患者の血清が認識する抗原（ニューロトニン）をコードする _C D N Aの 3 '末端から塩基配列を決定し、 Poly ( A ) ⁺鎖を含む塩基配列を明ら力こした（図 1 )。この塩基配列を GenBank によりホモロジ一 ' サーチした結果、類似の配列は報告されておらず新規な遺伝子であることが判明した。この c D N A (「 short c D N A」 'と名づけた）は、全部で 1347個のヌクレオチドから構成されており、 386ァミノ酸からなる新規タンパク質をコードしている。

この c D NAによりコードされるタンパク質を得ようとしたが、開始メチォニンが得られていなかつたため、この塩基配列を用いて上記 c D NAライブラリ一力ら 5 '—R A C E (Rapid Amplification of cDNA Ends) 法 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998-9002 1988) により、 PCR を行ったところ、全長 5 1 1個のアミノ酸からなるタンパク質、すなわち -ユーロトニンに対応する c D N A (「 long c D N A」と名づけた）が得られた。

図 1 2に「short cD NA」、「long cD NA」ヌクレオチド酉 S列をそれぞれ示す。実施例 2

. 大腸菌での組み替えタンパク質の発現

実施例 1 のィムノスクリーニングで得られた c D NAクローンからニューロトニンの一部分をコードする short c D NAを抽出した。 EcoRI/XhoIの認識配列を末端に持つ short c D N Aを、グルタチォン S-トランスフェラーゼ（GST) 融合タンパク質発現ベクター PGEX-5X-3に挿入してサブクローニングした。この short

c D N Aを組み込んだ pGEX- 5X- 3 を BL21大腸菌株に 42°C 4 5秒のヒートショックにより導入し、 BL21/short c D N A— G S T gene/pGEX-5X-3を得た。この BL21 を 0. Img/mLアンピシリンを含む LB 培地で培養し、 0. ImM isopropylthio-6-D-galactoside ( IPTG) を添加して 37°Cでさらに 2時間培養し、前記融合タンパク質の発現を誘導した。遠心分離法により回収した BL21 を PBS (Phosphate buffered saline)で洗净後、 lmg/mL リゾチーム消ィ匕し、 0.1% Triton X- 100 により可溶化した。可溶化された GST 融合タンパク質を含む BL21 由来タンパク質懸濁液をダルタチオンセファロース 4 B (GS4B) に適用後、 PBSで洗浄し 50mM還元型グルタチオンン /PBS により目的とする GST— short ニューロトニン融合タンパク質を精製した。さらに SDS-電気泳動法（SDS-PAGE)により、分子量、均一性、サブュニット構造などを調べた。

• ニューロトニンをコードする完全長 c D NA組み替えタンパク質の大腸菌での発現

実施例 1 で得られた EcoRI/XhoI の認識配列を末端に持つ完全長 c D N Aの 3'末端に、 2 分子のインフルエンザ赤血球凝集素

(hemagglutinin;HA) - tag を付カロしたェユーロトニン c D N Aを、発現ベクターとしてダルタチオン S-トランスフヱラーゼ（GST) 融合タンパク質発現べクタ一 pGEX - 5X- 1 に挿入してサブクローニングした。この c D N Aを組み込んだ pGEX- 5X- 1を BL21大腸菌株に 42。C、 4 5秒のヒートショックにより導入し、 BL21/long cD NA— G S T gene/pGEX-5X- 1 を得た。この BL21 を 0. lmg/mLアンピシリンを含む培地で培養し、 0. ImM isopropylthio-6-D- galactoside (IPTG) を添加して 30°Cでさらに 3時間培養し、 N末端に GST、 C末端に H Aを融合した融合タンパク質（ G S T -ニューロトニン- HAHA) の発現を誘導した。遠心分離法により回収した BL21 を PBS で洗浄後、 lmg/mL リゾチーム消化し、 0.1% Triton X-100により可溶化した。可溶化された上記 GST融合タンパク質を含む BL21由来タンパク質懸濁液を、ダルタチオンセファロース 4 B ( GS4B) に適用後 PBSで洗浄し、 50mM還元型グルタチオンン /Tris- HC1 (pH8.0) により目的とする GST—二ユーロトニン一 HAHA融合タンパク質を精製した。発現の確認は、 50mM還元型ダルタチオン溶出画分を PBSで 200倍、 2, 000倍に希釈して 25mMTris - HC1 (pH6.8)、 0.25 SDS 0.05%メルカプトエタノール、 0.1%グリセロールで処理した後、 8 % SDS-PAGE に適用した。 SDS - PAGE 後、上記融合タンパク質（G S T-ニューロト二ン - HAHA) は、エレクトロプロッティング法によりナイロン膜に転写した。このナイロン膜は 5 %スキムミルクを含む PBSで室温、 60 分間プロッキングを行い、 0.5%スキムミルクを含む PBSで 400倍に希釈した抗 HAモノクローナノレ抗体 (Boehringer mannheim ¾) で室温、 60分間免疫反応を行わせた。反応後、 0. l°/。Tween20/PBSで洗浄して力ら、西洋ヮサビぺルォキシグ■ E (Horse radish peroxidase) 結合ー抗マウス - 免疫グロプリン G (anti- mouce I g G - H R P ) を 2次抗体として室温で 60分免疫反応させ、 0. l%Tween20/PBSで洗浄して、 HRP 活性を検出することにより目的抗原を検出した。 HRP 活十生の検出 ίこ ίま ECL(Amersham社）を用レヽた (Clin. Chem. , 25： 1531, 1979)。結果を図 9 に示した。上記 GST-二ユーロトニン- HAHA融合タンパク質の分子量サイズからニューロトニンの分子量は約 6 6 k DA と推測された。

• In vitro における完全長 c D N A組み替えタンパク質の発現ニューロトニン c D NA (図 2 ) の末端を制限酵素 EcoRIで修飾し、 pBlue script I IKSベクタに挿入した。その後、この pBluescript ( 1 g ) と TNT- coupled

Translation System (Promega社) を用レヽて、 in vitro translation 法により、ニューロトニンを試験管内で〔³⁵S〕ラベル体として発現させた。〔³⁵S〕ラベルしたタンパク質は 10%SDS- PAGE に適用し、ィメージアナライザー（BAS2000, Fujix)により放射活性を検出した。ニューロトニン c D NAからインビトロで翻訳されるニューロトニンの SDS-PAGE による分子量は約約 6 6 k DA であることが認、められた。実施例 3

• ノーザンブロッテイング法による -ユーロトニン遺伝子の発現確

NB— 1糸田月包、 A549細月包; ¾、 Jurkat糸田月包ぉょぴ HeLa糸田月包; 1*よりそれぞれ常法により mR N Aを採取した。この mR N A 1 μ g を 1 % ァガロースゲル電気泳動で分離し、ナイ口ン膜にコンタクトブロッティング法で転写した。このナイロン膜を 80°C、 2時間処理し、デンハルト液中で、 42°C、 2 時間のプレハイブリダィゼーシヨンを行つた。次いで ³² P放射ラベルしたニューロトニン c D NAをプロ一ブとして 42°C、 12時間ハイブリダイズさせた。反応後のナイロン膜を 300mM NaCl、 30mM sodium citrateで洗浄後、 15mM NaCl、 1.5mM sodium citrate を使って 50°Cで再度洗浄を行つた。目的の mR NA は、 X線フィルムを感光させることにより検出した。得られたォートラジオグラフから、ニューロトニン遺伝子が、神経細胞の NB-1 細胞に強く発現していることを認めた。 . ニューロトニンのゥサギへの免疫（図 10、 1 1 )

全長 5 1 1個のアミノ酸からなるニューロトニンを用いて GST との融合タンパク質を作成し、これを抗原としてアジュパントとともに常法に従い、 3羽のゥサギに免疫した。 6週間後には、 3羽のゥサギ全部に後肢の癉れ、筋硬直、これらに基づく歩行障害など、 I s aac s 症候群に類似した症状の末梢神経障害を誘発することが認められた（図 1 0 )。このニューロトニンを免疫したゥサギから採取した筋肉を H E染色して顕微鏡で観察すると、正常の筋肉組織と比ベると、筋細胞の大きさが不均一になり、神経細胞の変性も観察された（図 1 1 )。

次に、 5羽のゥサギを用いて、ヒトニューロトニンを C末端側部分、 N末端側部分およびそれらの中間部の 3区分に分割し、これらを別々にゥサギに免疫したところ、ニューロトニンの C末端側部分を免疫したゥサギに、上記症状が誘発され、他の部分を免疫した場合にはそうした結果は得られなかった。

ニューロトニンを免疫したゥサギから得た血清を、抗ニューロトニン抗血清として以下の実験に使用した。

• ウェスタンブロッテイング法による各種細胞におけるニューロトニン遺伝子の発現の確認

実施例 1 で調製した G S T一 short ニューロトニン融合タンパク質（陽十生ン卜 Π2 — /レ）および B-1ネ中経細胞、 HEK ( human embryoni c ki dney) - 293T を用いて、ニューロトニン遺伝子の発現状態をゥェスタンプロッテイング法で確認した。

まず試料とする各種細胞から、 1 °/。NP - 40 で可溶化した細胞溶解液を調製した。各細胞溶解液は、 25mM Tris- HC1 (pH6.8)、 0.25% SDS、 0.05 メルカプトエタノール、 0.1%グリセロールで処理し、 8% SDS-PAGEにより分離した。 SDS-PAGE後，各種細胞由来タンパク質は、エレクトロプロッティング法によりニトロセルロース（ NC) B莫に転写した。この NC膜に対して、抗ニューロトニン抗血清を、 2. Omg/mL の G S T— short ニューロトニン融合タンパク質と 5 %スキムミルクをカロえた TBS (Tris Buff ered Saline)により 1, 000倍に希釈して室温で 60分免疫反応させた。また陰性コントロールとして同じ抗体溶液を NC膜と反応させる実験、あるいは抗体溶液の G S T - short ニューロトニン融合タンパク質を GSTのみに代えた実験を同時に行つた。反応後の NC膜を 0. l%Tween20/TBSで洗浄し、 HRP標識抗ゥサギ IgG 抗体を 2 次抗体として室温で 60 分間免疫反応させ、 0. l%Tween20/TBS で洗浄し、 HRP活性を検出することにより目的抗原を検出した。 HRP活性の検出には ECL(Amersham社）を用いた（Clin. Chem.， 25:1531， 1979)。その結果、ニューロトニンが、 NB— 1細胞に産生されていることを認めた。実施例 4

• 患者血清中の抗ヒトニユーロトニン抗体の検出（図 12 )

上記のとおり調製した GST— shortニューロトニン-融合タンパク質を抗原として用い、ウェスタンブロッテイング法によってヒト血清中の抗ニューロトニン抗体の検出を行った。

まず GST— shortニューロトニン-融合タンパク質（ lOOng/lane) を SDS- PAGEにより泳動により NC膜に転写した。 1 次抗体として、 Isaacs症候群患者（ 5名）、糖尿病などの合併症として手足の有痛性痺れを訴える Isaacs症候群以外の末梢神経障害患者（30名）および健常者（8 名）からの血清を用いた。その血清中の杭-ユーロトニン抗体の有無を調べるため、 TBS で 1 , 000倍に希釈した血清試料を上記 NC 膜に対して室温で 60 分間免疫反応させた。 0. 1% Tween20/TBSで C膜を洗浄した後、 HRP標識抗ヒ卜 IgG抗体を 2次抗体として室温で 6 0分免疫反応させた。 0.1% Tween20/TBS で NC 膜を洗浄してから、 HRP 活性を検出することを通じて、目的抗原と反応したヒト IgG を検出した。 HRP活性の検出は上記の方法によつた。

その結果、抗ニューロトニン抗体は、 Isaacs症候群患者から 5名中 4名、非 Isaacs症候群の末梢神経障害患者 30名から 7名が検出されたが、健常者（8名）からは、抗体は検出されなかった。図 11 にその一部の結果を示す。

抗体が検出された患者血清について、 Isaacs症候群患者では、陽性の 4名は、いずれもニューロトニンの C末端側に対する抗体であり、非 Isaacs症候群の末梢神経障害患者でも、陽性の上記 7名は同様であつたが、他に 2名においてニューロトニンの N末端側部分に対する抗体がさらに検出された。実施例 5

マウスゲノムのハイブリダイゼーションクローニングによるニュー口トニンコード c D N Aの検出

ライプラリーとして、マウス肝臓由来の Mouse Genomic Library (Clontech社）を使用し、プローブには、上記ヒトニユーロトニン c D N Aの完全長配列を使用した。プローブは、放射性同位元素 [³²P] ίこより Bca BEST Labeling Kit (Takara社）を用レヽて標識した。ファージ D N Aは、 Gene Screen Plus (Du Pont社）に 1 プレートにっき 2枚ずつ写し取り、標識したプローブと反応液（1 M NaCl, 1% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) ， 10% Dextr an, lOOg/ml salmon sperm D N A ) 中にて、一晚ハイブリダィゼーシヨンを行った。ハイプリダイゼーシヨンの終了後、フィルタ一は、 2 X SSC (Standard Saline Citrate の略、 0.15M NaCl, 0.015Mクェン酸ナトリウム pH 7.2 を意味する）で室温で 2回、 2 X SSC 1 %SDSで 6 5 °Cで 2回、 0. IX SSC で室温で 2回洗浄した後、オートラジオグラフィ一により、ポジティブプラークを検出した。同様の条件下でセカンドおよびサードスクリーニングを行い、ポジティブプラークをイメージアナライザ一（Fujix社）を使用して検出し、単離した。

解析に用いたファージ D N Aは、 Wizard ^TM Lambda Preps D N A Purification System (Promega 社）を用いて精製した。その結果、 9個のポジティブクローンが得られた。

• サザンブロット解析

ハイブリダイゼーションクローニングにより得られた 9個のポジティブクローンが、開始メチォニンに相当する A T Gを含む領域を含有しているかを調べるため以下の分析を行った。

精製したゲノムファージ D N A 1 ng を制限酵素 Sacl で消化し、 0.5%ァガロース電気泳動法により分離した。ゲルはェチジゥムプロマイド染色し、ゲノム D N Aが消化されたことを確認した後、プロッティングストーン法により、ァルカリ性緩衝液（0.4M NaOH, 0.6M NaCl) にてー晚かけてゲル中の D N Aをフィルター上にトランスファーさせた。 50mM NaOH， 1M Tr i s - HC1 (pH8.0)で中禾口したフイノレターは風乾後、プレハイブリダィゼーシヨン溶液（1°/。 SDS, lMNaCl, 10% Dextran) に浸したフィルタ一は、 6 5 °Cにて 3 0分間、プレハイブリダイゼーションを行った。

次に、ニューロトニンの c D NAの開始メチォニンに相当する A T Gを含む領域およびその近傍配列を特異的に認識するプロープを、放射性同位元素 [³²P]により Bca BEST Labeling Kit (Takara社）を用いて標識した。このプローブと 100g/ml salmon sperm D NAを先ほどのプレハイブリダィゼーシヨン溶液に加えて、 6 5 °Cにてー晚ハイプリダイゼーションを行った。このハイブリダイゼーションの終了後、フィルタ一は、 2 X SSC で室温で 2回、 2 XSSC/ 1 %SDS で 6 5 °Cで 2回、 0. IX SSCで室温で 2回洗浄した。その後、フィルターをイメージングプレートに感光し、ポジティブプラークをィメージアナライザー（Fujix社）を使用して検出し、単離した。

その結果、上記 9 クローンのうち、 3 クローンに開始メチォニンに相当するコドン A T Gを含む 5 '領域が存在することが判明した。すなわち、一つのクローンに約 2 k b、二つのクローンに約 7 k b のバンドが検出された。これら 3つのクローンは、 5，の上流領域を含んでいるゲノム D N Aであることが判明した。実施例 6

マウス c D NAの単離マウスゲノムのハイブリダイゼーションクローニングによりマウスニューロトニンをコードする c D NAを以下のようにして得ることができる。

ライブラリ一として、マウス胎児由来の Mouse Embryo Lambda c D NA Library (STRATAGENE 社）を使用し、プローブには、上記ヒトニユーロトニン c D N Aの完全長配列を使用した。プローブは、放射性同位元素 [³²P]により Bca BEST Labeling Ki t (Takara社）を用レヽて標識した。ファージ D NAiま、 Gene Screen Plus (Du Pont社）に 1 プレートにっき 2枚ずつ写し取り、標識したプローブと反応液 (1 M NaCl, 1% SDS, 10% Dextran, 100g/ml salmon sperm D NA) 中にて、 6 5 °Cで 8時間反応させた。フィルタ一は、 2 X SSC で室温で 2回、 2 X SSC/ 1 % SDSで 6 5 °Cで 2回、 0. IX SSCで室温で 2 回洗浄した後、オートラジオグラフィ一により、ポジティブプラークを検出した。同様の条件下でセカンドおよびサードスクリーニングを行い、ポジティブプラークをイメージアナライザー（Fujix社）を使用して検出し、単離した。

角军析に用いたファージ D N Aは、 Wizard ^TM Lambda Preps D NA Purification System (Promega 社）を用レヽて精製した。その結果、 1個のポジティブクローンを得た。

精製したゲノムファージ D NA 1 を制限酵素 E coRI， Xhol によつて切断した後、インサートを切り出した。インサートは、さらにクローニングベクター、 pBluescriptll の E coRI, Xhol部位にサブクローニングした。これによりマウスニューロトニンをコードする c D N Aを得ることができた。 c D N Aの塩基配列の解析は、 ABI PRISM377 D N A Sequencing System (Perkin Elmer社）により酉己歹 IJ を決定した。

解析された塩基配列をァミノ酸配列に変換したところ、開始メチォェンを含んでおり、ヒトニューロトニンの核酸塩基配列と 8 5 % 以上の配列相同性があることが判明した。

Claims

請求の範囲

1 . 下記の性状を有する末梢神経細胞タンパク質（以下「ニューロトニン」とレ、う）。

b ) 前記患者の血液中に見出される抗体と反応し、

2. ニューロトニンをコードする c D NA。

3 . ニューロトニンをコードする力、あるいは図 1 または 2 に示すヌクレオチド配列の.全てのヌクレオチド配列を含む D NA。

4. ニューロトニンをコードする力、あるいは図 1 または 2 に示すヌクレオチド配列の全てまたは一部に実質的に対応する 1 つ以上のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記配列のいずれかと実質的に相同性であるかもしくは前記配列のいずれかとハイプリダィズする配列を含む核酸分子。

5 . マウスニューロト -ンをコードするマウス c D NA。

6 . マウス -ユーロトニンをコードする力、、あるレ、は図 3 または 4 に示すヌクレオチド配列の全てのヌクレオチド配列を含む D N A_C

7. マウスニューロトニンをコードする力、、あるいは図 3 または 4 に示すヌクレオチド配列の全てまたは一部に実質的に対応する 1 つ以上のヌクレオチド配列を含むか、または前記配列のいずれかと実質的に相同性であるかもしくは前記配列のいずれかとハイブリダィズするマウスニューロトニンをコ一ドする配列を含む核酸分子。

8. 請求項 2または 5に記載の c D NA、あるいは請求項 3、 4、 6または 7のいずれかに記載の核酸分子に対するアンチセンス R N Aまたはアンチセンス D NA。

9. 請求項 2または 5に記載の c D NA、または請求項 3、 4、 6 もしくは 7のいずれかに記載の核酸分子、あるいはそれらの一部から転写された R NAを認識し切断するリボザィム。

1 0. 請求項 2〜 8の何れかに記載の核酸分子を含む発現べクタ一、クローニングベクターまたはコスミド。 .

1 1. 請求項 10 のべクターまたはコスミドを保持する形質転換体,

1 2. 請求項 2〜 8の何れかに記載の核酸分子を含有する原核細胞、真核細胞または突然変異生物細胞。

1 3. 図 5または 6に示すアミノ酸配列を有するニューロトニン。

1 4. 上記患者の血液に見出される抗体と結合する活性を有する下記 a)または b)に記载のタンパク質。

a) 図 5または 6 に示されるアミノ酸配列のポリペプチド、図 5または 6に示されるァミノ酸配列において 1 もしくは複数のァミノ酸が欠失、置換もしくは付加および/または挿入されたァミノ酸配列を有するポリペプチド、またはニューロトニンの抗原性部分を構成するアミノ酸配列を含む合成ポリペプチド、あるいは機能的に等価なこれらの変異体、あるいはこれらのアミノ酸配列をさらに含む融合ポリペプチドの形態のポリペプチド

b)請求項 2〜 4の何れかに記載の塩基配列からなる D N Aにハイブリダイズする D N Aがコードするタンパク質

1 5 . 末梢神経細胞にある「 1 4— 3 — 3」タンパク質と結合でき、下記 a)または b)に記載のタンパク質。

a) 図 5 または 6 に示されるアミノ酸配列のポリペプチド、図 5 または 6 に示されるアミノ酸配列において 1 もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加およびノまたは挿入されたアミノ酸配列を有するポリぺプチド、またはニューロトニンの抗原性部分を構成するァミノ酸配列を含む合成ポリぺプチド、あるいは機能的に等価なこれらの変異体、あるいはこれらのアミノ酸配列をさらに含む融合ポリぺプチドの形態のポリぺプチド

1 6 . 請求項 13から 15の何れかに記載のタンパク質の免疫学的に活性なドメインまたはそのドメインを有する断片。

1 7 . 図 7または 8 に示されるアミノ酸配列のポリペプチド、図 7または 8 に示されるアミノ酸配列において 1個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加およびまたは挿入されたァミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいはニューロトニンの抗原性部分を構成するアミノ酸配列を含む合成ポリペプチド、または機能的に等価なこれらの変異体、あるいはこれらのアミノ酸配列をさらに含む融合ポリペプチドの形態のポリペプチド。

1 8 . 請求項 13〜17 の何れかに記載のタンパク質を含む、請求項 13〜： 17 の何れかに記載のタンパク質を認識する抗体を分析するための免疫学的分析用試薬。

1 9 . I saac s症候群またはそれ以外の末梢神経障害の診断または治療効果の判定を目的とするものである請求項 18 に記載の免疫学的分析用試薬。

2 0 . 請求項 13〜 17の何れかに記載のタンパク質と反応する抗体を含む、請求項 13〜17の何れかに記載のタンパク質を分析するための免疫学的分析用試薬。

2 1 . Isaacs症候群またはそれ以外の末梢神経障害の診断または治療効果の判定を目的とするものである請求項 20 に記載の免疫学的分析用試薬。

2 2. 分析すべき請求項 13〜： 17の何れかに記載のタンパク質が、末梢神経細胞に存在するものである請求項 21 の免疫学的分析用試薬。■

2 3 . 被験者の体液中に存在する抗体であって、請求項 13〜： L7 の何れかに記載のタンパク質と反応する抗体を分析することによるニューロトニンの検出方法。

2 4 . 次の工程を含む、請求項 13〜 17の何れかに記載のタンパク質と結合するリガンドのスタリ一二ング方法。

a)リガンドの候補化合物を請求項 13〜17 の何れかに記載のタンパク質と接触させる工程、および

b)前記タンパク質に対する結合活性を示す候補化合物を選択するェ程。

2 5 . 請求項 13〜 17の何れかに記載のタンパク質をアンチリガンドとして用い、請求項 24の方法によって得ることができるリガンドを両者の親和性に基づいて該タンパク質を測定する方法。

2 6. 次の工程を含む、請求項 13〜 17の何れかに記載のタンパク質と上記リガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニング方法, a)候補化合物の存在下で、請求項 13〜 1 7の何れかに記載のタンパク質と上記リガンドとを接触させる工程、および

b)前記タンパク質と上記リガンドとの結合を阻害する活性を示す候捕化合物を選択する工程

2 7 . 請求項 26 のスクリーユング方法によって得ることができる化合物。

2 8 · 請求項 26 のスクリーユング方法によって得ることができる化合物を含む、ニューロトニン阻害剤。

2 9 . 請求項 26 のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を含む、末梢神経障害の治療用薬剤。

3 0 . 請求項 13〜 17の何れかに記載のタンパク質に結合する抗体 _c 3 1 . 前記抗体がモノク口ーナル抗体である請求項 30に記載の抗体。

3 2 . 末梢神経障害の原因となる抗体に対するモノクローナル抗体。

3 3 . 請求項 13〜： 17の何れかに記載のタンパク質または該タンパク質をコードする遺伝子の発現を指標に、該タンパク質を発現する細胞を検出または分離する方法。

3 4 . 細胞が末梢神経細胞である、請求項 33に記載の方法。

3 5 . 請求項 30〜32 の何れかに記載の抗体を含む、請求項 13〜 17 の何れかに記載のタンパク質を発現する細胞の検出または分離用試薬。

3 6 . 請求項 2〜 7の D N Aもしくはその一部、またはそれらから転写された R N Aとハイプリダイズできるヌクレオチド配列を有する核酸分子を含み、これらの D N Aまたは R N Aを検出するための試薬。

3 7 . 請求項 3または 6に記載の D N Aの発現が改変されているかまたは該改変を誘導することができるトランスジェニック非ヒト脊椎動物。

3 8 . 末梢神経障害モデル動物である、請求項 37に記載の動物。

3 9 . 請求項 37 に記載の非ヒト脊椎動物であって、内因性に有する請求項 3または 6に記載の D N Aの発現が抑制されているノックアウト非ヒト脊椎動物。

4 0 . 他の遺伝子がノックアウトされている請求項 37に記載の非ヒト脊椎動物。

4 1 . 請求項 37〜 40の何れかに記載の非ヒト脊椎動物から由来する細胞。

4 2 . 請求項 3または 6に記載の D N Aの内因性プロモーターの活性を上昇または低下させる化合物のスクリーニング方法であって. a)被検化合物の存在下、請求項 3または 6に記載の D N Aの内因性プロモーターの下流に結合されている遺伝子の発現を検出する工程およぴ

b)該発現を上昇または低下させる化合物を選択する工程、

を含む方法。

4 3 . 請求項 3または 6に記載の D N Aの内因性プロモータ一の活性を上昇または低下させる化合物のスクリーニング方法であって、 a)請求項 37〜40 に記載の非ヒト脊椎動物または該動物に由来する細胞に被検化合物を適用する工程、および

を含む方法。

4 4 . Isaacs症候群またはそれ以外の末梢神経障害の研究のために、およぴ Isaacs症候群またはそれ以外の末梢神経障害の改善作用を有する物質のスクリーニングのために使用する、ニューロトニンで免疫された動物。

4 5 . VGKC機能の抑制、神経終末におけるシグナル伝達不全、または有痛性筋痙攣を改善するタンパク質または非タンパク性物質をスクリーニングするための、ニューロトニンで免疫されたゥサギ。 4 6 . ニューロトニンもしくはその関連タンパク質またはそれ以外の末梢神経障害の原因となる抗体をマーカーとして、上記モノクローナル抗体との特異的結合を検出することで、被検者からの試料検体中の-ユーロトニンもしくはその関連タンパク質または末梢祌経障害の原因となる抗体のレベルを測定することにより Isaacs 症候群、またはそれ以外の末梢神経障害を診断するための診断マーカ

4 7 . Isaacs症候群あるいはそれ以外の末梢神経障害を診断するためのデータを供する検查方法であり、被検者からの試料検体中のニューロト -ンまたは末梢神経障害の原因となる抗体レベルを測定することを特徴とする検査方法。

4 8 . 血液の透析濾過により血中の-ユーロトニン抗体または末梢神経障害の原因となる抗体を、濾過材に固定化した上記モノク口ーナル抗体に結合させることにより体内のニューロトニン抗体または末梢神経障害の原因となる抗体を低減せしめることを可能とするニューロトニンまたは末梢神経障害の原因となる抗体の存在に起因するしびれを解除して治療するための血液濾過材。

4 9 . 製剤上許容される担体と一緒に、請求項 1 3〜1 7の何れかに記載の少なくとも 1つのポリペプチドを含み該ポリペプチドの免疫応答を、あるいは細胞中に挿入された請求項 2〜 8の何れかに記載の核酸分子を有するウィルス細胞または宿主細胞を含み、揷入された核酸分子によりコードされるポリぺプチドの免疫応答を刺激するための、ヒトまたはヒト以外の動物における I s aac s症候群あるいはそれ以外の末梢神経障害にたいする免疫応答を刺激するヮクチン組成物。

5 0 . 末梢神経障害患者から分離された末梢神経 · 筋系の細胞とインキュベートすることにより、特異的に請求項 3 1または 32に記載のモノクローナル抗体と結合させて、末梢神経障害の原因となる抗体を排除し、末梢神経となる細胞をィンビト口で再生するための該抗体を含む細胞培養用媒体。