JP2000232884A - 結合組織増殖因子に対するモノクローナル抗体及びその医薬用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）に起因す
る種々の疾患の治療及び該疾患の発症の予防に有用なヒ
トモノクローナル抗体並びにその医薬用途を提供する。
さらには、該疾患に罹患している哺乳動物の体液中のＣ
ＴＧＦの検出及び定量において有用な種々の哺乳動物の
ＣＴＧＦに対する種々の特性を有する種々のモノクロー
ナル抗体を提供するものである。 【解決手段】 ヒト、マウス及びラットに由来する各々
の組換えＣＴＧＦを、マウス、ラットまたはヒト抗体産
生トランスジェニックマウスに免疫することにより、抗
原特異性、抗原親和性、中和活性及び交叉反応性等の性
質の点で、異なる特性を有する該各々のＣＴＧＦに対す
る種々のモノクローナル抗体を調製した。とりわけ、ヒ
トＣＴＧＦに対するヒト抗体は、免疫拒絶反応等の副作
用を惹起することのない抗体医薬品として極めて有用で
ある。また、本発明の種々のモノクローナル抗体を用い
た種々のイムノアッセイにより、種々の哺乳動物の体液
中のＣＴＧＦを簡便かつ高感度で定量することが可能で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、哺乳動物の結合組
織増殖因子（Connective Tissue Growth Factor、ＣＴ
ＧＦ）に反応性を有するモノクローナル抗体若しくはそ
の一部、該モノクローナル抗体を産生する細胞、該モノ
クローナル抗体若しくはその一部を固定化してなる抗体
固定化不溶性担体、該モノクローナル抗体を標識物質で
標識してなる標識抗体、哺乳動物のＣＴＧＦの検出、定
量、分離または精製に用いられるキット、哺乳動物のＣ
ＴＧＦを検出、定量、分離または精製する方法、該モノ
クローナル抗体を含んでなる医薬組成物、ヒトＣＴＧＦ
遺伝子導入トランスジェニックマウス、ラットのＣＴＧ
Ｆポリペプチド、ラットのＣＴＧＦをコードするＤＮ
Ａ、及びラットのＣＴＧＦに反応性を有する抗体に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】組織傷害における組織の再生は、傷害部
位に移入したマクロファージ等の貪食細胞等による不用
の組織片や細胞片あるいは細菌等の除去、血管系の復
元、並びにそれに続く新しい組織との置換を経て行われ
る。この組織の再生、修復の過程においては、該再生・
修復の過程で出現するマクロファージや好中球が産生す
るトランスフォーミング増殖因子β（Transforming Gro
wth Factor β (TGF-β)）が最初の調節因子として働く
ことが明らかとなってきている。ＴＧＦ−βの機能は多
彩であり、間葉細胞の増殖誘導、血管内皮細胞及び上皮
細胞の増殖抑制だけでなく、結合組織細胞からの細胞外
マトリックス（Extracellular Matrix (ECM)）の産生を
調節する機能を有することが知られている。

【０００３】前記ＴＧＦ−βで刺激し増殖誘導が見られ
る間葉細胞の培養上清においては、血小板由来増殖因子
（Platelet-derived Growth Factor (PDGF)）や結合組
織成長因子（Connective Tissue Growth Factor (CTG
F)；Ｈｃｓ２４とも呼ぶ）の産生の増加が観察されるこ
とから、ＴＧＦ−βによる細胞増殖誘導活性は、それら
の他の制御因子により間接的に発揮されるものであると
考えられている。

【０００４】ＣＴＧＦについては、ヒト及びマウスのＣ
ＴＧＦが既に同定されており（なお、ラットのＣＴＧＦ
の同定については、未だ何ら報告されていない。）、そ
れらの物理化学的及び生物学的性状の解析が進められて
きている（［ヒトＣＴＧＦ］J. Cell Biology, Vol.11
4, No.6, p.1285-1294, 1991；Int. J. Biochem. CellB
iol., Vol.29, No.1, p.153-161, 1997；Circulation,
Vol.95, No.4, p.831-839, 1997；Cell Growth Diffe
r., Vol.7, No.4, p.469-480, 1996；J. Invest.Dermat
ol., Vol.106, No.4, p.729-733, 1996；J. Invest. De
rmatol., Vol.105, No.2, p.280-284, 1995；J. Inves
t. Dermatol., Vol.105, No.1, p.128-132, 1995；及び
国際特許出願公開WO96/38172号公報。［マウスＣＴＧＦ
（Fisp12）］特開平5-255397号公報、Cell Growth Diff
er., Vol.2, No.5, p.225-233, 1991；FEBS Letters, V
ol.327, No.2, p.125-130, 1993；及びDNA Cell Biol.,
Vol.10, No.4, p.293-300, 1991）。

【０００５】ＣＴＧＦは、分子量約３８ｋＤを有するシ
ステイン残基に富んだ分泌型糖タンパクであり、その生
合成及び分泌はＴＧＦ−βより誘導されることが明らか
にされている。ＣＴＧＦは、ＴＧＦ−βによる産生誘導
を受ける点、ＰＤＧＦ受容体に結合する点、間葉細胞系
の増殖を誘導する点、線維芽細胞や上皮細胞から産生さ
れるという点等でＰＤＧＦと類似の性質を有するが、ア
ミノ酸配列相同性はほとんど有さない全く異なる分子で
ある（The Journal of Cell Biology, Vol.114, No.6,
p.1287-1294, 1991及びMolecular Biology of the Cel
l, Vol.4, p.637-645, 1993）。また、最近の研究によ
り、ヒト及びマウス繊維芽細胞の培養上清中、並びにブ
タの子宮由来分泌液中には、３８ｋＤａのＣＴＧＦの分
解物と考えられる生物学的に活性な分子量約１０乃至１
２ｋＤａの低分子量ＣＴＧＦが同定されている（Growth
Factors, Vol.15, No.3, p.199-213, 1998；J. Biol.
Chem., Vol.272,No.32, p.20275-20282, 1997）。

【０００６】ＣＴＧＦの生理学的機能及び疾患との関連
性についての詳細は未だ完全に明らかにされてはいない
ものの、ＣＴＧＦのＴＧＦβによる産生誘導、種々の疾
患患者の組織及び細胞におけるＣＴＧＦのｍＲＮＡの有
意な発現（Int. J. Biochem.Cell. Biol., Vol.29, No.
1, p.153-161, 1997；Circulation, Vol.95, No.4,p.83
1-839, 1997；J. Invest. Dermatol., Vol.106, No.4,
p.729-733, 1996；J. Invest. Dermatol., Vol.105, N
o.2, p.128-132, 1995；J. Cell Physiol., Vol.165, N
o.3, p.556-565, 1995及びKidney Int., Vol.48, No.2,
p.5001-5009,1995など）、並びにＣＴＧＦの血管内皮
細胞の遊走及び増殖の促進に関する知見（J. Cell. Bio
l., Vol.114, No.6, p.1285-1294, 1991；Exp. Cell Re
s., Vol.233, p.63-77, 1997；歯科基礎医学会誌、第３
８巻、増刊、第463頁、PD0187、1996及び第６９回日本
生化学会要旨、第683頁、1P0535、1996など）等から、
ＣＴＧＦが種々疾患の発症及び／または進行に関与する
可能性が示唆され初めてきている。

【０００７】具体的疾患の特定については、今後の研究
展開及び研究結果を待たなければならないが、ＣＴＧＦ
は、例えば、癌、動脈硬化症、皮膚疾患（例えば、乾
癬、強皮症、アトピー、ケロイド）、腎疾患、関節炎
（例えば、慢性関節リウマチ）、各種線維症（動脈硬
化、肝硬変、関節炎、強皮症、ケロイド、腎線維化、及
び肺線維症等で見られる組織線維化）等の幅広い範囲の
疾患の発症及び／または進行に関与するのではないかと
推測される。

【０００８】このような各種疾患とＣＴＧＦとの係わり
の解明においては、種々の疾患に罹患している患者及び
疾患哺乳動物の体液（血清など）中に含まれるＣＴＧＦ
及び／またはその断片を検出及び定量し、その値を、正
常な生体（健常人、正常マウス、正常ラット、及び正常
ウサギ等の哺乳動物）における測定値と比較すること
が、有効な一般的な手段である。ＣＴＧＦのような分泌
性タンパクの検出あるいは定量には、検出しようとする
分泌性タンパクに対する抗体（特には、モノクローナル
抗体）を用いた抗原抗体反応に基づく免疫学的測定方
法、具体的には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）ある
いはエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）
等のイムノアッセイが、最も簡便で有用な方法として汎
用されている。

【０００９】同様に、ＣＴＧＦの検出及び定量において
も、このようなイムノアッセイによる検出方法及び定量
方法、該定量方法の確立に必要とされるＣＴＧＦに対す
るモノクローナル抗体の作製、開発が必要となる。しか
しながら、ＣＴＧＦに対する抗体については、抗血清の
作製についての報告はあるものの（Exp. Cell Res.,Vo
l.233, p.63-77, 1997；Cell Growth Differ., Vol.8,
No.1, p.61-68, 1997；及び第６９回日本生化学会要
旨、第683頁、1P0534、1996）、モノクローナル抗体、
とりわけＣＴＧＦに対する高い親和性及び／またはＣＴ
ＧＦの活性を中和する能力を有する機能的なモノクロー
ナル抗体については未だ報告されておらず、イムノアッ
セイによるＣＴＧＦの定量系も全く提供されていない。
また、前記のようなＣＴＧＦの活性を中和する能力を有
するモノクローナル抗体は、そのようなイムノアッセイ
における構成要素としてだけでなく、前述のようなＣＴ
ＧＦの分泌に起因する各種疾患の治療及び／または予防
における抗体医薬品として有用であるが、該抗体医薬品
として使用可能なモノクローナル抗体についても、全く
報告されていない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って、前記のような
種々疾患の発症及び／または進行に関連する可能性を有
するＣＴＧＦの生物学的機能及び該ＣＴＧＦと各種疾患
との因果関係の解明、並びにＣＴＧＦに起因する疾患の
治療及び予防における医薬品の有効成分として使用可能
な、ヒト、マウス、ラット及びウサギ等の各種哺乳動物
のＣＴＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体の開発
が望まれている。特に、ＣＴＧＦの機能及びＣＴＧＦと
各種疾患との関係の解明において必要な手段であるＣＴ
ＧＦのイムノアッセイにおいて用いられるモノクローナ
ル抗体としては、該ＣＴＧＦに対する所望の親和性、Ｃ
ＴＧＦの生物学的活性を中和する能力、及び／または種
々の哺乳動物に対する所望の交叉反応性（cross reacti
vity）を有するモノクローナル抗体の開発が求められて
いる。さらに、該種々疾患に罹患している患者の治療及
び／または予防に用いられるモノクローナル抗体として
は、該中和活性に加え、該患者に対する抗原性を低減ま
たは消失させたモノクローナル抗体の開発が求められて
いる。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述のよ
うな社会的ニーズを満たすために、各種哺乳動物のＣＴ
ＧＦに対するモノクローナル抗体に関して鋭意研究した
結果、種々の哺乳動物に由来するＣＴＧＦを免疫原とし
て用いることにより、抗原特異性、抗原親和性、中和活
性、及び交叉反応性等の性質の点で、各々異なる特性を
有する種々の哺乳動物のＣＴＧＦに対する種々のモノク
ローナル抗体を作製することに成功した。また、遺伝子
組換え技術を用いてヒトの抗体を産生するように作製し
たトランスジェニックマウスをヒトのＣＴＧＦで免疫す
ることによって、ヒトＣＴＧＦに対する種々のヒトモノ
クローナル抗体を作製することに世界に先んじて初めて
成功した。

【００１２】さらに、前者の種々のモノクローナル抗体
を用いて構築した種々のイムノアッセイ系により、種々
哺乳動物（ヒト、マウス、ラット及びウサギ等）の体液
（血清等）中のＣＴＧＦを、インタクトな状態で簡便か
つ高感度で定量できることを見出し本発明を完成するに
到った。また、後者のヒト抗体が、ヒトＣＴＧＦの活性
を有意に中和するのみならず、例えば、組織繊維症（例
えば、腎繊維症など）の治療効果を有することを見出
し、本願発明を完成するに到った。これらのヒト抗体
は、マウス由来の抗体等の非ヒト哺乳動物由来の抗体か
らなる抗体医薬品の治療上の大きな問題点（副作用）で
あったヒトに対する抗原性を全く有しないことから、抗
体の医薬品としての価値を劇的に増大させるものであ
る。

【００１３】即ち、本発明は、患者の治療及び予防にお
ける医薬品として、またヒト、マウス及びラット等の各
種哺乳動物の体液中に含まれるＣＴＧＦを検出及び定量
するためのイムノアッセイにおける構成要素として有用
な種々の特性を有する各種哺乳動物に対するモノクロー
ナル抗体を、本発明の分野において初めて提供するもの
である。さらに、本発明は、そのようなＣＴＧＦに対す
る種々のモノクローナル抗体を用いることによるＣＴＧ
Ｆのイムノアッセイ方法及びアッセイキットを初めて提
供するものである。

【００１４】本発明のヒトＣＴＧＦに対するモノクロー
ナル抗体は、ヒトに対する抗原性を惹起することなく、
ＣＴＧＦに起因する種々の疾患の治療及び予防するため
の医薬品として極めて有用である。また、本発明のモノ
クローナル抗体を用いたイムノアッセイにより、ヒトは
勿論、種々哺乳動物（ヒト、マウス、ラット及びウサギ
など）の正常な生体並びに疾患に罹患している生体の体
液中に存在するＣＴＧＦを、インタクト（intact）な状
態で簡便かつ高感度で検出及び定量できる。

【００１５】即ち、本発明の下記のとおりの発明であ
る。 （１） 下記の（ａ）乃至（ｇ）のいずれかに記載の性
質を有することを特徴とするモノクローナル抗体または
その一部： （ａ）ヒト、マウス及びラットの結合組織増殖因子（Ｃ
ＴＧＦ）のいずれにも反応性を有する； （ｂ）ヒト及びマウスのＣＴＧＦのいずれにも反応性を
有し、且つラットのＣＴＧＦに反応性を有しない； （ｃ）マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反応性
を有し、且つヒトのＣＴＧＦに反応性を有しない； （ｄ）ヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-157
3）とヒトのＣＴＧＦとの結合、または該細胞株293-Tと
マウスのＣＴＧＦとの結合を阻害する； （ｅ）ラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-
1570）、ヒト骨肉腫由来細胞株MG-63（ATCC CRL-1427）
またはヒト肺由来繊維芽細胞のいずれかとヒトのＣＴＧ
Ｆとの結合を阻害する； （ｆ）ヒトのＣＴＧＦまたはマウスのＣＴＧＦの刺激に
よるラット腎臓由来線維芽NRK-49F（ATCC CRL-1570）の
細胞増殖を阻害する；または （ｇ）ヒドロシキプロリンの生成が上昇的傾向を示して
いる腎臓における該ヒドロキシプロリンの上昇を抑制す
る。 （２） モノクローナル抗体が、下記の（ａ）乃至
（ｃ）のいずれかに記載の性質を有することを特徴とす
る前記（１）に記載のモノクローナル抗体またはその一
部： （ａ）ヒトのＣＴＧＦまたはその一部をマウスに免疫し
て得られるモノクローナル抗体またはその一部であっ
て、ヒト、マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反
応性を有する； （ｂ）マウスのＣＴＧＦまたはその一部をハムスターに
免疫して得られるモノクローナル抗体またはその一部で
あって、ヒト、マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれに
も反応性を有する；または （ｃ）マウスのＣＴＧＦまたはその一部をラットに免疫
して得られるモノクローナル抗体またはその一部であっ
て、ヒト、マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反
応性を有する。 （３） モノクローナル抗体が、下記の（ａ）乃至
（ｃ）のいずれかに記載の性質を有することを特徴とす
る前記（１）に記載のモノクローナル抗体またはその一
部： （ａ）ヒトのＣＴＧＦまたはその一部をマウスに免疫し
て得られるモノクローナル抗体であって、ヒト、マウス
及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反応性を有し、且つ
ヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-1573）とヒ
トのＣＴＧＦとの結合を阻害する； （ｂ）マウスのＣＴＧＦまたはその一部をラットに免疫
して得られるモノクローナル抗体であって、ヒト、マウ
ス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反応性を有し、且
つヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-1573）と
マウスのＣＴＧＦとの結合を阻害する；または （ｃ）マウスのＣＴＧＦまたはその一部をハムスターに
免疫して得られるモノクローナル抗体であって、ヒト、
マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反応性を有
し、且つヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-15
73）とマウスのＣＴＧＦとの結合を阻害する （４） 該モノクローナル抗体が、国際寄託番号FERM B
P-6208で識別される融合細胞から産生されるモノクロー
ナル抗体であることを特徴とする前記（１）に記載のモ
ノクローナル抗体またはその一部。 （５） 該モノクローナル抗体が、国際寄託番号FERM B
P-6208で識別される融合細胞から産生されるモノクロー
ナル抗体と実質的に同一の性質を有するモノクローナル
抗体であることを特徴とする前記（１）に記載のモノク
ローナル抗体またはその一部。 （６） 該モノクローナル抗体が、国際寄託番号FERM B
P-6209で識別される融合細胞から産生されるモノクロー
ナル抗体であることを特徴とする前記（１）に記載のモ
ノクローナル抗体またはその一部。 （７） 該モノクローナル抗体が、国際寄託番号FERM B
P-6209で識別される融合細胞から産生されるモノクロー
ナル抗体と実質的に同一の性質を有するモノクローナル
抗体であることを特徴とする前記（１）に記載のモノク
ローナル抗体またはその一部。 （８） ヒト、マウス、またはラットのＣＴＧＦのいず
れかに反応性を有するヒトモノクローナル抗体またはそ
の一部。 （９） ヒトモノクローナル抗体が、ヒトのＣＴＧＦに
反応性を有するモノクローナル抗体であることを特徴と
する前記（８）に記載のヒトモノクローナル抗体または
その一部。 （１０） 下記の（ａ）乃至（ｄ）のいずれかに記載の
性質を有するヒトのＣＴＧＦに反応性を有するヒトモノ
クローナル抗体またはその一部： （ａ）ヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-157
3）とヒトのＣＴＧＦとの結合を阻害する； （ｂ）ラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-
1570）、ヒト骨肉腫由来細胞株MG-63（ATCC CRL-1427）
またはヒト肺由来繊維芽細胞のいずれかとヒトのＣＴＧ
Ｆとの結合を阻害する； （ｃ）ヒトのＣＴＧＦまたはマウスのＣＴＧＦの刺激に
よるラット腎臓由来線維芽NRK-49F（ATCC CRL-1570）の
細胞増殖を阻害する；または （ｄ）ヒドロシキプロリンの生成が上昇的傾向を示して
いる腎臓における該ヒドロキシプロリンの上昇を抑制す
る。 （１１） ヒトモノクローナル抗体が、ヒト抗体を産生
する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に
由来するモノクローナル抗体であることを特徴とする前
記（８）乃至前記（１０）のいずれかに記載のヒトモノ
クローナル抗体またはその一部。 （１２） ヒトモノクローナル抗体が、ヒトのＣＴＧＦ
を、ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニッ
ク非ヒト哺乳動物に免疫することにより得られるモノク
ローナル抗体であることを特徴とする前記（１１）に記
載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。 （１３） トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、トラ
ンスジェニックマウスであることを特徴とする前記
（８）乃至前記（１２）のいずれかに記載のヒトモノク
ローナル抗体またはその一部。 （１４） 該ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域を
コードするＶ領域のＤＮＡが、DP-5、DP-38、DP-65及び
DP-75からなる群がら選ばれるいずれかの遺伝子セグメ
ントに由来することを特徴とする前記（８）乃至前記
（１３）のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体ま
たはその一部。 （１５） 該ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域を
コードするＶ領域のＤＮＡが、DPK1、DPK9、DPK12及びD
PK24からなる群がら選ばれるいずれかの遺伝子セグメン
トに由来することを特徴とする前記（８）乃至前記（１
３）のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体または
その一部。 （１６） 該ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域を
コードするＶ領域のＤＮＡが、DP-5、DP-38、DP-65及び
DP-75からなる群がら選ばれるいずれかの遺伝子セグメ
ントに由来し、且つ該ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可
変領域をコードするＶ領域のＤＮＡが、DPK1、DPK9、DP
K12及びDPK24からなる群がら選ばれるいずれかの遺伝子
セグメントに由来することを特徴とする前記（８）乃至
前記（１５）のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗
体またはその一部。 （１７） 該ヒトモノクローナルの重鎖可変領域が、下
記（ａ）乃至（ｊ）のいずれかのアミノ酸配列を含むア
ミノ酸を有することを特徴とする前記（９）に記載のヒ
トモノクローナル抗体またはその一部： （ａ）配列番号６に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号２１乃至１２０番目のアミノ酸配列； （ｂ）配列番号６に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号２１乃至１２０番目のアミノ酸配列において、１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加
されたアミノ酸配列； （ｃ）配列番号８に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号２１乃至１１８番目のアミノ酸配列； （ｄ）配列番号８に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
番号２１乃至１１８番目のアミノ酸配列において、１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加
されたアミノ酸配列； （ｅ）配列番号１０に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号２１乃至１１６番目のアミノ酸配列； （ｆ）配列番号１０に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号２１乃至１１６番目のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
加されたアミノ酸配列； （ｇ）配列番号１２に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号２１乃至１１６番目のアミノ酸配列； （ｈ）配列番号１２に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号２１乃至１１６番目のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
加されたアミノ酸配列； （ｉ）配列番号１４に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号２１乃至１１７番目のアミノ酸配列；または （ｊ）配列番号１４に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号２１乃至１１７番目のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
加されたアミノ酸配列。 （１８） 該ヒトモノクローナルの軽鎖可変領域が、下
記（ａ）乃至（ｊ）のいずれかのアミノ酸配列を含むア
ミノ酸を有することを特徴とする前記（９）に記載のヒ
トモノクローナル抗体またはその一部： （ａ）配列番号１６に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号２１乃至１２０番目のアミノ酸配列； （ｂ）配列番号１６に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号２１乃至１２０番目のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
加されたアミノ酸配列； （ｃ）配列番号１８に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号２１乃至１２１番目のアミノ酸配列； （ｄ）配列番号１８に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号２１乃至１２１番目のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
加されたアミノ酸配列； （ｅ）配列番号２０に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号２３乃至１１７番目のアミノ酸配列； （ｆ）配列番号２０に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号２３乃至１１７番目のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
加されたアミノ酸配列； （ｇ）配列番号２２に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号１７乃至１１１番目のアミノ酸配列； （ｈ）配列番号２２に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号１７乃至１１１番目のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
加されたアミノ酸配列； （ｉ）配列番号２４に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号２３乃至１１８番目のアミノ酸配列；または （ｊ）配列番号２４に記載されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号２３乃至１１８番目のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
加されたアミノ酸配列。 （１９） ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクロー
ナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6535で識別さ
れる融合細胞から産生されるモノクローナル抗体または
その一部。 （２０） ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクロー
ナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6535で識別さ
れる融合細胞から産生されるモノクローナル抗体と実質
的に同一の性質を有するモノクローナル抗体またはその
一部。 （２１） ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクロー
ナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6598で識別さ
れる融合細胞から産生されるモノクローナル抗体または
その一部。 （２２） ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクロー
ナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6598で識別さ
れる融合細胞から産生されるモノクローナル抗体と実質
的に同一の性質を有するモノクローナル抗体またはその
一部。 （２３） ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクロー
ナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6599で識別さ
れる融合細胞から産生されるモノクローナル抗体または
その一部。 （２４） ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクロー
ナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6599で識別さ
れる融合細胞から産生されるモノクローナル抗体と実質
的に同一の性質を有するモノクローナル抗体またはその
一部。 （２５） ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクロー
ナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6600で識別さ
れる融合細胞から産生されるモノクローナル抗体または
その一部。 （２６） ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクロー
ナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6600で識別さ
れる融合細胞から産生されるモノクローナル抗体と実質
的に同一の性質を有するモノクローナル抗体またはその
一部。 （２７） ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノクロー
ナル抗体またはその一部であって、該モノクローナル抗
体が、該モノクローナル抗体をヒトのＣＴＧＦに反応性
を有する前記（１７）若しくは前記（１８）に記載のい
ずれかのモノクローナル抗体とヒトのＣＴＧＦからなる
抗原抗体複合体に反応させた時、該抗原抗体複合体に反
応性を有しないことを特徴とするモノクローナル抗体ま
たはその一部。 （２８） 該モノクローナル抗体が、ヒトモノクローナ
ル抗体であることを特徴とする前記（２７）に記載のモ
ノクローナル抗体またはその一部。 （２９） ラットのＣＴＧＦに反応性を有するモノクロ
ーナル抗体またはその一部。 （３０） 可変領域が前記（２）乃至前記（７）、前記
（２７）または前記（２９）のいずれかに記載のモノク
ローナル抗体由来の可変領域であり、かつ定常領域がヒ
トイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴と
するヒトのＣＴＧＦに反応性を有する組換えキメラモノ
クローナル抗体。 （３１） 超可変領域の相補性決定領域の一部または全
部が前記（２）乃至前記（７）、前記（２７）または前
記（２９）のいずれかに記載のモノクローナル抗体由来
の相補性決定領域であり、超可変領域の枠組領域がヒト
イムノグロブリン由来の枠組領域であり、かつ定常領域
がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特
徴とするヒトのＣＴＧＦに反応性を有する組換えヒト型
モノクローナル抗体。 （３２） 前記（１）乃至前記（２９）のいずれかに記
載のモノクローナル抗体を産生する細胞。 （３３） 前記（３０）または前記（３１）に記載の組
換えモノクローナル抗体を産生する細胞。 （３４） 該細胞が、該モノクローナル抗体を産生する
能力を哺乳動物由来のＢ細胞と哺乳動物由来のミエロー
マ細胞とを融合して得られる融合細胞であることを特徴
とする前記（３２）に記載の細胞。 （３５） 該細胞が、該モノクローナル抗体の重鎖をコ
ードするＤＮＡ若しくはその軽鎖をコードするＤＮＡの
いずれか一方のＤＮＡ、または両方のＤＮＡが細胞内に
導入されることにより形質転換された遺伝子組換え細胞
であることを特徴とする前記（３２）または前記（３
３）に記載の細胞。 （３６） 該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-6535で
識別される融合細胞であることを特徴とする前記（３
４）に記載の融合細胞。 （３７） 該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-6598で
識別される融合細胞であることを特徴とする前記（３
４）に記載の融合細胞。 （３８） 該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-6599で
識別される融合細胞であることを特徴とする前記（３
４）に記載の融合細胞。 （３９） 該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-6600で
識別される融合細胞であることを特徴とする前記（３
４）に記載の融合細胞。 （４０） 該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-6208で
識別される融合細胞であることを特徴とする前記（３
４）に記載の融合細胞。 （４１） 該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-6209で
識別される融合細胞であることを特徴とする前記（３
４）に記載の融合細胞。 （４２） 前記（１）乃至前記（３１）のいずれかに記
載のモノクローナル抗体が固定化されていることを特徴
とする抗体固定化不溶性担体。 （４３） 不溶性担体が、プレート、試験管、チュー
ブ、ビーズ、ボール、フィルター及びメンブレンからな
る群から選ばれる不溶性担体であることを特徴とする前
記（４２）に記載の抗体固定化不溶性担体。 （４４） 不溶性担体が、フィルター若しくはメンブレ
ン、またはアフィニティーカラムクロマトグラフィーに
用いられる不溶性担体であることを特徴とする前記（４
２）に記載の抗体固定化不溶性担体。 （４５） 前記（１）乃至前記（３１）のいずれかに記
載のモノクローナル抗体を、単独でまたは他の物質と反
応することにより検出可能なシグナルをもたらすことが
できる標識物質で標識してなる標識抗体。 （４６） 標識物質が、酵素、蛍光物質、化学発光物
質、ビオチン、アビジン、または放射性同位体であるこ
とを特徴とする前記（４５）に記載の標識抗体。 （４７） 前記（１）乃至前記（３１）のいずれかに記
載のモノクローナル抗体、前記（４２）若しくは前記
（４３）に記載の抗体固定化不溶性担体、及び前記（４
５）若しくは前記（４６）に記載の標識抗体からなる群
から選ばれる少なくともいずれか１つのモノクローナル
抗体、抗体固定化不溶性担体または標識抗体を含んでな
ることを特徴とする哺乳動物のＣＴＧＦの検出または定
量に用いられるキット。 （４８） 前記（４２）若しくは前記（４３）に記載の
抗体固定化不溶性担体、及び前記（４５）若しくは前記
（４６）に記載の標識抗体を含んでなることを特徴とす
る前記（４７）に記載の哺乳動物のＣＴＧＦの検出また
は定量に用いられるキット。 （４９） 前記（１）乃至前記（３１）のいずれかに記
載のモノクローナル抗体、前記（４２）若しくは前記
（４３）に記載の抗体固定化不溶性担体、及び前記（４
５）若しくは前記（４６）に記載の標識抗体からなる群
から選ばれる少なくともいずれか１つのモノクローナル
抗体、抗体固定化不溶性担体、または標識抗体を用いる
ことを特徴とするイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴ
ＧＦを検出または定量する方法。 （５０） 少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含
むイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検出また
は定量する前記（４９）に記載の方法： （ａ）前記（４２）または前記（４３）に記載の抗体固
定化不溶性担体に、試料を反応せしめる工程；及び （ｂ）該抗体固定化不溶性担体と該試料中に含まれる哺
乳動物のＣＴＧＦとの結合により形成される抗原抗体複
合体に、前記（４５）または前記（４６）に記載の標識
抗体を反応せしめる工程。 （５１） 少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含
むイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検出また
は定量する前記（４９）に記載の方法： （ａ）前記（４５）または前記（４６）に記載の標識抗
体と、試料を反応せしめる工程；及び （ｂ）該標識抗体と試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧ
Ｆとの結合により形成される抗原抗体複合体に、前記
（４２）または前記（４３）に記載の抗体固定化不溶性
担体を反応せしめる工程。 （５２） 少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノア
ッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検出または定量する
前記（４９）に記載の方法： （ａ）前記（４２）若しくは前記（４３）に記載の抗体
固定化不溶性担体、前記（４５）若しくは前記（４６）
に記載の標識抗体、及び試料を含む混合物を反応せしめ
る工程。 （５３） 少なくとも下記（ａ）の工程を含むイムノア
ッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検出または定量する
前記（４９）に記載の方法： （ａ）前記（４２）または前記（４３）に記載の抗体固
定化不溶性担体に、試料、並びに単独でまたは他の物質
と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすこ
とができる標識物質で標識された哺乳動物のＣＴＧＦの
標準物質を反応せしめる工程。 （５４） 少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含
むイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検出また
は定量する前記（４９）に記載の方法： （ａ）試料、並びに単独でまたは他の物質と反応するこ
とにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標
識物質で標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質との
混合物に、前記（１）乃至前記（３１）のいずれかに記
載のモノクローナル抗体を反応せしめる工程；及び （ｂ）該試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧＦ若しくは
該標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質と、該モノ
クローナル抗体との結合により形成される抗原抗体複合
体に、該モノクローナル抗体に反応性を有する哺乳動物
由来の抗血清を反応せしめる工程。 （５５） 少なくとも下記（ａ）乃至（ｃ）の工程を含
むイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検出また
は定量する前記（４９）に記載の方法： （ａ）試料に、前記（１）乃至前記（３１）のいずれか
に記載のモノクローナル抗体を反応せしめる工程； （ｂ）（ａ）の工程を行った反応系に、単独でまたは他
の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもた
らすことができる標識物質で標識された哺乳動物のＣＴ
ＧＦの標準物質を反応せしめる工程；及び （ｃ）該試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧＦ若しくは
該標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質と、該モノ
クローナル抗体との結合により形成される抗原抗体複合
体に、該モノクローナル抗体に反応性を有する哺乳動物
由来の抗血清を反応せしめる工程。 （５６） 前記（４２）または前記（４４）に記載の抗
体固定化不溶性担体を含んでなる哺乳動物のＣＴＧＦの
分離または精製に用いられるキット。 （５７） 前記（４２）または前記（４４）に記載の抗
体固定化不溶性担体を用いたアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いることを特徴とする哺乳動物のＣＴＧＦ
を分離または精製する方法。 （５８） アフィニティクロマトグラフィーがアフィニ
ティーカラムクロマトグラフィーである前記（５７）に
記載の哺乳動物のＣＴＧＦの精製方法。 （５９） ヒトのＣＴＧＦをコードするＤＮＡが、内在
性遺伝子座に組み込まれていることを特徴とするトラン
スジェニックマウス。 （６０） 配列番号２に記載されるアミノ酸配列または
該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する
ラットのＣＴＧＦ。 （６１） 配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有す
るラットのＣＴＧＦをコードするＤＮＡ。 （６２） ＤＮＡが、配列番号１に記載される塩基配列
中の塩基番号213乃至1256迄の塩基配列を含むことを特
徴とする前記（６１）に記載のＤＮＡ。 （６３） 前記（２）乃至前記（３１）のいずれかに記
載のモノクローナル抗体若しくはその一部、及び薬学的
に許容されうる担体とを含んでなる医薬組成物。 （６４） 前記（９）乃至前記（１８）または前記（２
８）のいずれかに記載されるヒトモノクローナル抗体若
しくはその一部、及び薬学的に許容され得る担体とを含
んでなる医薬組成物。 （６５） 前記（１４）乃至前記（１８）または前記
（２８）のいずれかに記載されるヒトモノクローナル抗
体若しくはその一部を含んでなる医薬組成物。 （６６） 該医薬組成物が、ＣＴＧＦの刺激により増殖
する能力を有する細胞の増殖を抑制するために用いられ
ることを特徴とする前記（６３）乃至前記（６５）のい
ずれかに記載の医薬組成物。 （６７） 該医薬組成物が、ＣＴＧＦの刺激により増殖
する能力を有する細胞の増殖を伴う疾患を治療または予
防するための前記（６３）乃至前記（６５）のいずれか
に記載の医薬組成物。 （６８） 該細胞の増殖が、脳、頚部、肺、心臓、肝
臓、膵臓、腎臓、胃、大腸、小腸、十二指腸、骨髄、子
宮、卵巣、精巣、前立腺、皮膚、口腔、舌、及び血管か
らなる群から選ばれる組織における細胞の増殖であるこ
とを特徴とする前記（６６）または前記（６７）に記載
の医薬組成物。 （６９） 該組織が、肺、肝臓、腎臓、または皮膚であ
ることを特徴とする前記（６８）に記載の医薬組成物。 （７０） 該組織が、腎臓であることを特徴とする前記
（６９）に記載の医薬組成物。 （７１） 該疾患が、さらに組織の繊維化を伴う疾患で
あることを特徴とする前記（６７）に記載の医薬組成
物。 （７２） 該組織の繊維化が、肺、肝臓、腎臓または皮
膚における繊維化であることを特徴とする前記（７１）
に記載の医薬組成物。 （７３） 該組織の繊維化が、腎臓における繊維化であ
ることを特徴とする前記（７２）に記載の医薬組成物。 （７４） ＣＴＧＦ阻害剤またはＣＴＧＦ産生阻害剤、
並びに薬学的に許容され得る担体とを含んでなり、腎臓
における疾患を治療または予防するための医薬組成物。 （７５） 該阻害剤が、ＣＴＧＦに反応性を有するモノ
クローナル抗体であることを特徴とする前記（７４）に
記載の医薬組成物。 （７６） 該阻害剤が、前記（９）乃至前記（３１）の
いずれかに記載のモノクローナル抗体であることを特徴
とする前記（７４）に記載の医薬組成物。 （７７） 該阻害剤が、前記（１４）乃至前記（１８）
または前記（２８）のいずれかに記載のヒトモノクロー
ナル抗体であることを特徴とする前記（７６）に記載の
医薬組成物。 （７８） 該疾患が、組織の繊維化と伴う疾患であるこ
とを特徴とする前記（７４）乃至前記（７７）のいずれ
かに記載の医薬組成物。 （７９） ＣＴＧＦの刺激により増殖する能力を有する
細胞のＣＴＧＦの刺激による増殖を抑制する能力を有す
る物質、及び薬学的に許容され得る担体とを含んでな
り、腎臓における該細胞の増殖を抑制するための医薬組
成物。 （８０） 該物質が、ＣＴＧＦに反応性を有するモノク
ローナル抗体であることを特徴とする前記（７９）に記
載の医薬組成物。 （８１） 該阻害剤が、前記（９）乃至前記（３１）の
いずれかに記載のモノクローナル抗体であることを特徴
とする前記（７９）に記載の医薬組成物。 （８２） 該阻害剤が、前記（１４）乃至前記（１８）
または前記（２８）のいずれかに記載のヒトモノクロー
ナル抗体であることを特徴とする前記（８１）に記載の
医薬組成物。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明で用いる語句の意味
を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
本発明における「哺乳動物」とは、ヒト、ウシ、ヤギ、
ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモット
等を意味し、好ましくは、ヒト、ウサギ、ラット、ハム
スターまたはマウスであり、特に好ましくは、ヒト、ラ
ット、ハムスターまたはマウスである。本発明で用いら
れる「ヒト以外の哺乳動物」及び「非ヒト哺乳動物」な
る用語は各々同義であり、前述に定義した哺乳動物にお
けるヒト以外のあらゆる哺乳動物を意味する。

【００１７】本発明において用いられる「アミノ酸」と
は、自然界に存在するあらゆるアミノ酸を意味し、好ま
しくは、アミノ酸を表記するために用いられるアルファ
ベットの三文字表記法または一文字表記法に従って各々
下記のように表されるアミノ酸を意味する。 グリシン（Gly／G）、アラニン（Ala／A）、バリン（Va
l／V）、ロイシン（Leu／L）、イソロイシン（Ile／
I）、セリン（Ser／S）、スレオニン（Thr／T）、アス
パラギン酸（Asp／D）、グルタミン酸（Glu／E）、アス
パラギン（Asn／N）、グルタミン（Glu／Q）、リジン
（Lys／K）、アルギニン（Arg／R）、システイン（Cys
／C）、メチオニン（Met／M）、フェニルアラニン（Phe
／F）、チロシン（Tyr／Y）、トリプトファン（Trp／
W）、ヒスチジン（His／H）、プロリン（Pro／P）。

【００１８】本発明でいう「結合組織増殖因子（Connec
tive Tissue Growth Factor (CTGF)）」とは、前記哺乳
動物のＣＴＧＦであり、例えば、前述に記載したとおり
の既報に報告される構造及び機能を有するヒト及びマウ
スのＣＴＧＦを包含する（例えば、The Journal of Cel
l Biology, Vol.114, No.6, p.1287-1294, 1991、Molec
ular Biology of the Cell, Vol.4, p.637-645, 1993、
及びBiochem. Biophys. Res. Comm., Vol.234, p.206-2
10, 1997など）。また、本願発明の１つであるラットの
ＣＴＧＦも包含することは言うまでもない。

【００１９】また、本発明で言う結合組織増殖因子に
は、当該文献に記載された分子量約38kDaのＣＴＧＦ
（例えば、ヒトＣＴＧＦ）はもちろんのこと、当該分子
量約38kDaの全長ＣＴＧＦ（例えば、ヒトＣＴＧＦ）の
分解物と考えられる分子量約10乃至12kDaの低分子量CTG
F蛋白をも包含する（Growth Factors, Vol.15, No.3,
p.199-213, 1998；J. Biol. Chem., Vol.272, No.32,
p.20275-20282, 1997）。この低分子量CTGFの構造は未
だ明らかにされていないものの、ヒトＣＴＧＦにあって
は、349アミノ酸からなる全長ヒトＣＴＧＦの246番目の
ロイシン（Leu246）と247番目のグルタミン酸（Glu24
7）の間で切断されることにより生ずると考えられる103
個のアミノ酸からなるＣ末端蛋白（分子量：約11,800D
a）、あるいは、同全長ヒトＣＴＧＦの247番目のグルタ
ミン酸（Glu247）と248番目のグルタミン酸（Glu248）
との間で切断されることにより生ずると考えられる102
個のアミノ酸からなるＣ末端蛋白（分子量：約11,671D
a）である可能性を有する。さらに、後述する本願発明
に係る「モノクローナル抗体」が天然型のタンパク一次
構造（アミノ酸配列）を有するＣＴＧＦ（特には、ヒト
ＣＴＧＦ）またはその一部に反応性を有する限り、本発
明でいう該ＣＴＧＦには、該天然型のタンパクまたはそ
の一部のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を
有するＣＴＧＦも包含する。

【００２０】本発明において使用される、「実質的に同
一のアミノ酸配列を有する」なる用語は、天然型のＣＴ
ＧＦと実質的に同等の生物学的性質を有する限り、該ア
ミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１
０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸
が置換、欠失及び／または修飾されているアミノ酸配列
を有するタンパク、並びに該アミノ酸配列に、複数個の
アミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好
ましくは１乃至５個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配
列を有するタンパクをも包含することを意味する。さら
に、そのような置換、欠失、修飾及び付加の複数の組み
合わせの場合であってもよい。本発明におけるＣＴＧＦ
は、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養
方法等のような当該技術的分野において知られる公知の
方法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造
することができる。

【００２１】また、本発明におけるＣＴＧＦには、該Ｃ
ＴＧＦの「一部」も包含される。ここで「ＣＴＧＦの一
部」とは、前記に定義したＣＴＧＦ（前述の分子量約10
乃至12ｋDaの低分子量ＣＴＧＦを含む）のアミノ酸配列
中の任意の部分配列を含むポリペプチドを意味し、具体
的には５乃至１００アミノ酸残基を有するＣＴＧＦペプ
チドフラグメント（例えば、Ｃ末端側）、より具体的に
は５乃至５０アミノ酸残基を有するＣＴＧＦペプチドフ
ラグメント、さらに具体的には５乃至３０アミノ酸残基
を有するペプチドフラグメントが包含される。好ましく
は、ＣＴＧＦがその受容体と結合若しくは相互作用する
部位（受容体結合部位など）またはＣＴＧＦがその生物
学的機能を発揮するために必要な部位（活性部位など）
を含むＣＴＧＦの部分構造である。これらのポリペプチ
ド（部分構造、フラグメント）は、後述する当該技術的
分野において知られる公知の方法あるいはその修飾方法
に従って、遺伝子組換え技術または化学的合成法により
製造することもできるし、また細胞培養方法により単離
したＣＴＧＦをタンパク分解酵素等を用いて適切に切断
することにより製造することができる。

【００２２】本発明における「モノクローナル抗体」と
は、哺乳動物の結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）またはそ
の一部に反応性を有するモノクローナル抗体である。具
体的には、前記発明（１）乃至前記発明（３１）のいず
れかに記載される特徴を有するモノクローナル抗体であ
る。さらに具体的には、後述の実施例並びに図面に記載
されるような様々な特性及び産業上の有用性を有する各
種のモノクローナル抗体である。

【００２３】本発明のモノクローナル抗体における好ま
しい態様としては、例えば、下記（イ）乃至（ニ）のモ
ノクローナル抗体が挙げられる。 （イ） 前記（１）に記載のモノクローナル抗体におけ
る（ｄ）乃至（ｇ）のいずれかの性質を有するモノクロ
ーナル抗体。 （ロ） 前記（２）に記載のモノクローナル抗体。 （ハ） 前記（４）乃至前記（７）のいずれかに記載さ
れるモノクローナル抗体。 （ニ） 前記（９）乃至前記（３１）のいずれかに記載
されるモノクローナル抗体。 本態様において、種々疾患の治療または予防、即ち医薬
品としての適用の目的における使用においては、上記
（イ）乃至（ニ）に記載のモノクローナル抗体に包含さ
れるヒトモノクローナル抗体が好ましい。本態様におい
て、本願発明の別の主題である哺乳動物のＣＴＧＦの定
量、検出、分離または精製の目的における使用において
は、上記（イ）乃至（ニ）に記載のいずれのモノクロー
ナル抗体をも使用し得る。

【００２４】本願発明のモノクローナル抗体のさらに好
ましい態様としては、例えば、下記（ホ）または（ヘ）
のモノクローナル抗体が挙げられる。 （ホ） 前記（１）に記載のモノクローナル抗体におけ
る（ｄ）乃至（ｇ）のいずれかの性質を有するモノクロ
ーナル抗体。 （ヘ） 前記（４）乃至前記（７）のいずれかに記載さ
れるモノクローナル抗体。ト） 前記（１０）、前記
（１４）乃至前記（２８）のいずれかに記載されるモノ
クローナル抗体。 本態様において、種々疾患の治療または予防、即ち医薬
品としての適用の目的における使用においては、上記
（ホ）乃至（ヘ）に記載のモノクローナル抗体に包含さ
れるヒトモノクローナル抗体が好ましい。本態様におい
て、本願発明の別の主題である哺乳動物のＣＴＧＦの定
量、検出、分離または精製の目的における使用において
は、上記（ホ）乃至（ヘ）に記載のいずれのモノクロー
ナル抗体をも使用し得る。

【００２５】本願発明のモノクローナル抗体の特に好ま
しい態様としては、例えば、下記（ト）または（チ）の
モノクローナル抗体を挙げることができる。 （ト） 前記（ニ）乃至（ト）に記載のモノクローナル
抗体。 （チ） 前記（１４）乃至（２６）または前記（２８）
のいずれかに記載のモノクローナル抗体。 本態様において、種々疾患の治療または予防、即ち医薬
品としての適用の目的における使用においては、上記
（チ）に記載のモノクローナル抗体が好ましい。本態様
において、本願発明の別の主題である哺乳動物のＣＴＧ
Ｆの定量、検出、分離または精製の目的における使用に
おいては、上記（ト）乃至（チ）に記載のいずれのモノ
クローナル抗体をも使用し得る。

【００２６】本願発明のモノクローナル抗体のとりわけ
好ましい態様としては、例えば、下記（リ）乃至（カ）
のモノクローナル抗体を挙げることができる。 （リ） 前記（４）または（６）に記載のモノクローナ
ル抗体。 （ヌ） 前記（１４）乃至前記（１６）のいずれかに記
載のモノクローナル抗体。 （ル） 前記（１７）に記載のモノクローナル抗体にお
ける（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）または（ｉ）に記
載の特徴を有するモノクローナル抗体。 （ヲ） 前記（１８）に記載のモノクローナル抗体にお
ける（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）または（ｉ）に記
載の特徴を有するモノクローナル抗体。 （ワ） 前記（１９）、前記（２１）、前記（２３）ま
たは前記（２５）のいずれかに記載のモノクローナル抗
体。 （カ） 前記（２８）に記載のモノクローナル抗体。 本態様において、種々疾患の治療または予防、即ち医薬
品としての適用の目的における使用においては、上記
（ヌ）乃至（カ）のいずれかに記載のモノクローナル抗
体が好ましい。本態様において、本願発明の別の主題で
ある哺乳動物のＣＴＧＦの定量、検出、分離または精製
の目的における使用においては、上記（リ）乃至（カ）
に記載のいずれのモノクローナル抗体をも使用し得る
が、特には上記（リ）に記載のモノクローナル抗体が好
ましい。

【００２７】本発明の「モノクローナル抗体」は、前記
に定義した結合組織増殖因子（天然体、組換え体、合成
物、細胞培養上清を含む）若しくはその一部を抗原（免
疫源）として用い、マウス、ラット、ハムスター、モル
モットあるいはウサギ等の哺乳動物に免疫して得られる
天然型抗体、遺伝子組換え技術を用いて製造され得るキ
メラ抗体及びヒト型抗体（CDR-grafted抗体）、並びに
例えば、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用い
て製造され得るヒトモノクローナル抗体も包含する。さ
らには。後述する本発明の「組換えモノクローナル抗体
を産生する細胞」から産生されるような、遺伝子組換え
モノクローナル抗体も本発明のモノクローナル抗体に包
含される。またモノクローナル抗体の場合には、Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＭ、ＩｇＡ（IgA1、IgA2）、ＩｇＤあるいはＩ
ｇＥ等のいずれのアイソタイプを有するモノクローナル
抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧ（IgG1、IgG2、
IgG3、IgG4、好ましくはIgG2またはIgG4）またはＩｇＭ
であり、さらに好ましくはＩｇＧである。。

【００２８】本発明で言うポリクローナル抗体（抗血
清）あるいはモノクローナル抗体は、既存の一般的な製
造方法によって製造することができる。即ち、例えば、
抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freun
d's Adjuvant）とともに、哺乳動物（後述するヒト抗体
産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の
抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動
物を含む）、好ましくは、マウス、ラット、ハムスタ
ー、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウ
マあるいはウシ、より好ましくはマウス、ラット、ハム
スター、モルモットまたはウサギに免疫する。ポリクロ
ーナル抗体は、該免疫感作動物から得た血清から取得す
ることができる。またモノクローナル抗体は、該免疫感
作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない
骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）から融合細胞（ハイブ
リドーマ）を調製し、該ハイブリドーマをクローン化
し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性
を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択す
ることによって製造される。また、後述する本発明の
「組換えモノクローナル抗体を産生する細胞」によって
も製造できる。

【００２９】モノクローナル抗体は、具体的には下記の
ようにして製造することができる。即ち、前述の結合組
織増殖因子（ＣＴＧＦ；天然体、組換え体、合成物、細
胞培養上清を含む）若しくはその一部を免疫原として、
該免疫原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Fr
eund's Adjuvant）とともに、非ヒト哺乳動物、具体的
には、マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるい
はウサギ、好ましくはマウス、ラットあるいはハムスタ
ー（後述するヒト抗体産生トランスジェニックマウスの
ような他の動物由来の抗体を産生するように作出された
トランスジェニック動物を含む）の皮下内、筋肉内、静
脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射
するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通
常、初回免疫から約１乃至１４日毎に１乃至４回免疫を
行って、最終免疫より約１乃至５日後に免疫感作された
該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。免疫を施す
回数及び時間的インターバルは、使用する免疫原の性質
などにより、適宜変更することができる。

【００３０】モノクローナル抗体を分泌する融合細胞
（ハイブリドーマ）の調製は、ケーラー及びミルシュタ
インらの方法（ネイチャー(Nature)、第２５６巻、第４
９５〜第４９７頁、１９７５年）及びそれに準じる修飾
方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫
感作された非ヒト哺乳動物から取得される脾臓、リンパ
節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗
体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモッ
ト、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より
好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産
生能のないミエローマ細胞との細胞融合させることによ
り調製される。

【００３１】細胞融合に用いられるミエローマ細胞とし
ては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（AT
CC No. CRL-1580）、P3/NSI/1-Ag4-1（ＮＳ−１）、P3/
X63-Ag8.U1（P3U1）、SP2/0-Ag14（Sp2/O,Sp2）、PAI、
F0あるいはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag.
2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-
2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11あるいはCEM-T15を使用す
ることができる。モノクローナル抗体を産生する細胞
（例えば、ハイブリドーマ）のスクリーニングは、該細
胞を、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増
殖の見られたウェルの培養上清の前述のマウス免疫感作
で用いた免疫抗原に対する反応性を、例えばＲＩＡやＥ
ＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することによ
り行なうことができる。

【００３２】ハイブリドーマからのモノクローナル抗体
の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、またはマウ
ス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、
好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウス
の腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、ま
たは哺乳動物の腹水から単離することにより行うことが
できる。また、該ハイブリドーマあるいは後述する本発
明の「組換えモノクローナル抗体を産生する細胞」から
モノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニング
し、トランスジェニック動物作製技術を用いて当該遺伝
子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックな
ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタを作製し、当該トランス
ジェニック動物のミルク中から当該抗体遺伝子に由来す
るモノクローナル抗体を大量に取得することも可能であ
る（日系サイエンス、1997年４月号、第７８頁乃至８４
頁）。該細胞をインビトロで培養する場合には、培養す
る細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々
条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存
させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるた
めに用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本
培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施
することが可能である。

【００３３】基本培地としては、例えば、Ham'F12培
地、MCDB153培地あるいは低カルシウムMEM培地等の低カ
ルシウム培地及びMCDB104培地、MEM培地、D-MEM培地、R
PMI1640培地、ASF104培地あるいはＲＤ培地等の高カル
シウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じ
て、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または
種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あ
るいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン
沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換ク
ロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イ
ムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等の
アフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等
により行うことができる。

【００３４】本発明のモノクローナル抗体には、該抗体
を構成する重鎖及び／または軽鎖の各々のアミノ酸配列
において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しく
は付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／または軽
鎖からなるモノクローナル抗体も包含されるが、ここ
で、「数個のアミノ酸」とは、複数個のアミノ酸を意味
し、具体的には１乃至１０個のアミノ酸であり、好まし
くは１乃至５個のアミノ酸である。本発明のモノクロー
ナル抗体のアミノ酸配列中に、前記のようなアミノ酸の
部分的改変（欠失、置換、挿入、付加）は、該アミノ酸
配列をコードする塩基配列を部分的に改変することによ
り導入することができる。この塩基配列の部分的改変
は、既知の部位特異的変異導入法（Site specific muta
genesis ）を用いて常法により導入することができる
（Proc. Natl. Acsd. Sci. USA, Vol.81, p.5662-5666,
1984）。

【００３５】本発明における「ヒトモノクローナル抗
体」とは、前記に定義したような哺乳動物のＣＴＧＦ
（好ましくはヒトのＣＴＧＦ）に反応性を有するヒトモ
ノクローナル抗体である。例えば、後述の実施例及び図
面に記載されるような様々な特性を有する各種のヒトモ
ノクローナル抗体を挙げることができる。具体的には、
イムノグロブリンを構成する重鎖（Ｈ鎖）の可変領域
（Variableregion）及びＨ鎖の定常領域（Constant Reg
ion）並びに軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域及びＬ鎖の定常領
域を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードす
る遺伝子に由来するヒトイムノグロブリンである。Ｌ鎖
としては、ヒトκ鎖またはヒトλ鎖が挙げられる。

【００３６】本発明のヒトモノクローナル抗体は、例え
ば、既報の方法に従って製造することができる「ヒト抗
体を産生する能力を有するトランスジェニックマウス」
に代表されるような「ヒト抗体を産生する能力を有する
トランスジェニック非ヒト哺乳動物」を、前記に定義し
た哺乳動物のＣＴＧＦで免疫することによって製造する
ことができる。当該非ヒト哺乳動物への免疫及び抗体産
生融合細胞（ハイブリドーマ）の製造及びスクリーニン
グ、並びに当該ヒトモノクローナル抗体の大量調製は、
前述の一般的な方法を用いて実施することができる（Na
ture Genetics,Vol.7, p.13-21, 1994；Nature Genetic
s, Vol.15, p.146-156, 1997；特表平4-504365号公報；
特表平7-509137号公報；日経サイエンス、６月号、第４
０〜第５０頁、１９９５年；国際出願公開ＷＯ９４／２
５５８５号公報；Nature, Vol.368, p.856-859, 1994；
及び特表平６−５００２３３号公報など）。該ヒト抗体
産生トランスジェニックマウスは、具体的には、例えば
下記の工程からなる手法を用いることにより作製でき
る。他のヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動
物も同様にして製造することができる。

【００３７】（１）マウス内在性イムノグロブリン重鎖
遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性
マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子など）で置換
することにより該マウス内在性イムノグロブリン重鎖遺
伝子が機能的に不活性化されたノックアウトマウスを作
製する工程。 （２）マウス内在性イムノグロブリン軽鎖遺伝子座の少
なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝
子（ネオマイシン耐性遺伝子など）で置換することによ
り該マウス内在性イムノグロブリン軽鎖遺伝子（特にκ
鎖遺伝子）が機能的に不活性化されたノックアウトマウ
スを作製する工程。 （３）酵母人工染色体（Yeast artificial chromosome,
YAC）ベクター等に代表されるような巨大遺伝子を運搬
可能なベクターを用いて、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝
子座の所望の領域がマウス染色体中に組み込まれたトラ
ンスジェニックマウスを作製する工程。 （４）YAC等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能
なベクターを用いて、ヒト免疫グロブリン軽鎖（特にκ
鎖）遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組み込ま
れたトランスジェニックマウスを作製する工程。 （５）前記（１）乃至（４）のノックアウトマウス及び
トランスジェニックマウスを任意の順序で交配すること
により、マウス内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座及び
マウス内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座がともに機能
的に不活性化され、且つヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子
座の所望の領域及ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の所
望の領域がともにマウス染色体上に組み込まれたトラン
スジェニックマウスを作製する工程。

【００３８】前記ノックアウトマウスは、マウス内在性
イムノグロブリン遺伝子座の適当な領域を外来性マーカ
ー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子など）で相同組換え
により置換することにより該遺伝子座が再構成（リアレ
ンジメント）できないように不活性化することにより作
製できる。該相同組換えを用いた不活性化には、例え
ば、ポジティブ・ネガティブ・セレクション（Positive
Negative Selection; PNS）と呼称される方法を用いる
ことができる（日経サイエンス, ５月号, p.52-62, 199
4）。イムノグロブリン重鎖遺伝子座の機能的不活性化
には、例えば、Ｊ領域またはＣ領域（例えばＣμ領域）
の一部に障害を導入することにより達成できる。またイ
ムノグロブリン軽鎖（例えばκ鎖）に機能的不活性化
は、例えば、Ｊ領域若しくはＣ領域の一部、またはＪ領
域及びＣ領域にまたがる領域を含む領域に障害を導入す
ることにより達成可能である。

【００３９】トランスジェニックマウスは、トランスジ
ェニック動物の製造において通常使用されるような常法
（例えば、最新動物細胞実験マニュアル、エル・アイ・
シー発行、第７章、第３６１〜第４０８頁、１９９０年
を参照）に従って作製することが可能である。具体的に
は、例えば、正常マウス胚盤胞（blastcyst）に由来す
るHPRT陰性（ヒポキサンチングアニン・フォスフォリボ
シルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている）ＥＳ細胞
（embryonic stem cell）を、該ヒトイムノグロブリン
重鎖遺伝子座または軽鎖遺伝子座をコードする遺伝子ま
たはその一部並びにHPRT遺伝子が挿入されたYACベクタ
ーを含む酵母とスフェロプラスト融合法により融合す
る。該外来性遺伝子がマウス内在性遺伝子上にインテグ
レートされたＥＳ細胞をHATセレクション法により選別
する。次いで、選別したＥＳ細胞を、別の正常マウスか
ら取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクショ
ンする（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, No.12,
pp.7380-7384, 1980；米国特許第4,873,191号公報）。
該胚盤胞を仮親としての別の正常マウスの子宮に移植す
る。そうして該仮親マウスから、キメラトランスジェニ
ックマウスが生まれる。該キメラトランスジェニックマ
ウスを正常マウスと交配させることによりヘテロトラン
スジェニックマウスを得る。該ヘテロ（heterogeneic）
トランスジェニックマウス同士を交配することにより、
メンデルの法則に従って、ホモ（homogeneic）トランス
ジェニックマウスが得られる。

【００４０】本発明における「キメラモノクローナル抗
体」は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体
であって、具体的には、その可変領域が、非ヒト哺乳動
物（マウス、ラット、ハムスターなど）のイムノグロブ
リン由来の可変領域であり、かつその定常領域がヒトイ
ムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とする
マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体等のキメラモノ
クローナル抗体を意味する。ヒトイムノグロブリン由来
の定常領域は、ＩｇＧ（IgG1, IgG2, IgG3, IgG4）、Ｉ
ｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプによ
り各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明における
組換えキメラモノクローナル抗体の定常領域はいずれの
アイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域
であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域で
ある。

【００４１】本発明におけるキメラモノクローナル抗体
は、例えば以下のようにして製造することができる。し
かしながら、そのような製造方法に限定されるものでな
いことは言うまでもない。例えば、マウス／ヒトキメラ
モノクローナル抗体は、実験医学（臨時増刊号）、第
１．６巻、第１０号、１９８８年及び特公平３−７３２
８０号公報等を参照しながら作製することができる。即
ち、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マから単離した該マウスモノクローナル抗体をコードす
るＤＮＡから取得した活性なＶ_H遺伝子（Ｈ鎖可変領域
をコードする再配列されたＶＤＪ遺伝子）の下流に、ヒ
トイムノグロムリンをコードするＤＮＡから取得したＣ
_H遺伝子（Ｈ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、ま
た該ハイブリドーマから単離したマウスモノクローナル
抗体をコードするＤＮＡから取得した活性なＶ_L遺伝子
（Ｌ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＪ遺伝子）
の下流にヒトイムノグロムリンをコードするＤＮＡから
取得したＣ_L遺伝子（Ｌ鎖定常領域をコードするＣ遺伝
子）を、各々発現可能なように配列して１つ又は別々の
発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形
質転換し、該形質転換細胞を培養することにより作製す
ることができる。

【００４２】具体的には、まず、マウスモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマから常法によりＤＮＡを抽出
後、該ＤＮＡを適切な制限酵素（例えばEcoRI、HindIII
等）を用いて消化し、電気泳動に付して（例えば0.7%ア
ガロースゲル使用）サザンブロット法を行う。泳動した
ゲルを例えばエチジウムブロマイド等で染色し、写真撮
影後、マーカーの位置を付し、ゲルを２回水洗し、0.25
M HCl溶液に１５分間浸す。次いで、0.4NのNaOH溶液に
１０分間浸し、その間緩やかに振盪する。常法により、
フィルターに移し、４時間後フィルターを回収して２×
SSCで２回洗浄する。フィルターを十分乾燥した後、ベ
イキング（７５℃、３時間）を行う。ベイキング終了後
に、該フィルターを0.1×SSC／0.1%SDS溶液に入れ、６
５℃で３０分間処理する。次いで、３×SSC／0.1%SDS溶
液に浸す。得られたフィルターをプレハイブリダイゼー
ション液と共にビニール袋に入れ、６５℃で３〜４時間
処理する。

【００４３】次に、この中に³²Ｐ標識したプローブＤＮ
Ａ及びハイブリダイゼーション液を入れ、６５℃で１２
時間程度反応させる。ハイブリダイゼーション終了後、
適切な塩濃度、反応温度および時間（例えば、２×SSC
−0.1%SDS溶液、室温、１０分間）のもとで、フィルタ
ーを洗う。該フィルターをビニール袋に入れ、２×SSC
を少量加え、密封し、オートラジオグラフィーを行う。
上記サザンブロット法により、マウスモノクローナル抗
体のＨ鎖及びＬ鎖を各々コードする再配列されたＶＤＪ
遺伝子及びＶＪ遺伝子を同定する。同定したＤＮＡ断片
を含む領域をショ糖密度勾配遠心にて分画し、ファージ
ベクター（例えば、Charon 4A、Charon 28、λＥＭＢＬ
３、λＥＭＢＬ４等）に組み込み、該ファージベクター
で大腸菌（例えば、LE392、NM539等)を形質転換し、ゲ
ノムライブラリーを作製する。そのゲノムライブラリー
を適当なプローブ（Ｈ鎖Ｊ遺伝子、Ｌ鎖（κ）Ｊ遺伝子
等）を用いて、例えばベントンデイビス法（サイエンス
(Science)、第１９６巻、第１８０〜第１８２頁、１９
７７年）に従って、プラークハイブリダイゼーションを
行い、再配列されたＶＤＪ遺伝子あるいはＶＪ遺伝子を
各々含むポジティブクローンを得る。得られたクローン
の制限酵素地図を作製し、塩基配列を決定し、目的とす
る再配列されたＶ_H(VDJ)遺伝子あるいはＶ_L(VJ)遺伝子
を含む遺伝子が得られていることを確認する。

【００４４】一方、キメラ化に用いるヒトＣ_H遺伝子及
びヒトＣ_L遺伝子を別に単離する。例えば、ヒトＩｇＧ1
とのキメラ抗体を作製する場合には、Ｃ_H遺伝子である
Ｃγ₁遺伝子とＣ_L遺伝子であるＣκ遺伝子を単離する。
これらの遺伝子はマウス免疫グロブリン遺伝子とヒト免
疫グロブリン遺伝子の塩基配列の高い相同性を利用して
ヒトＣγ₁遺伝子及びヒトＣκ遺伝子に相当するマウス
Ｃγ₁遺伝子及びマウスＣκ遺伝子をプローブとして用
い、ヒトゲノムライブラリーから単離することによって
得ることができる。

【００４５】具体的には、例えば、クローンIg146（プ
ロシーディングスナショナルアカデミーオブサイエンス
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、第７５巻、第４７０９
〜第４７１３頁、１９７８年）からの３ｋｂのHindIII
−BamHI断片とクローンMEP10（プロシーディングスナシ
ョナルアカデミーオブサイエンス(Proc. Natl. Acad.Sc
i. USA)、第７８巻、第４７４〜第４７８頁、１９８１
年）からの6.8kbのEcoRI断片をプローブとして用い、ヒ
トのラムダCharon 4AのHaeIII−AluIゲノムライブラリ
ー（セル(Cell)、第１５巻、第１１５７〜第１１７４
頁、１９７８年）中から、ヒトＣκ遺伝子を含み、エン
ハンサー領域を保持しているＤＮＡ断片を単離する。ま
た、ヒトＣγ₁遺伝子は、例えばヒト胎児肝細胞ＤＮＡ
をHindIIIで切断し、アガロースゲル電気泳動で分画し
た後、5.9Kbのバンドをλ778に挿入し、前記のプローブ
を用いて単離する。

【００４６】このようにして単離されたマウスＶ_H遺伝
子とマウスＶ_L遺伝子、及びヒトＣ_H遺伝子とヒトＣ_L遺
伝子を用いて、プロモーター領域及びエンハンサー領域
などを考慮しながらマウスＶ_H遺伝子の下流にヒトＣ_H遺
伝子を、またマウスＶ_L遺伝子の下流にヒトＣ_L遺伝子
を、適切な制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて、例え
ばpSV2gptあるいはpSV2neo等の発現ベクターに常法に従
って組み込む。この際、マウスＶ_H遺伝子／ヒトＣ_H遺伝
子とマウスＶ_L遺伝子／ヒトＣ_L遺伝子のキメラ遺伝子
は、一つの発現ベクターに同時に配置されてもよいし、
各々別個の発現ベクターに配置することもできる。

【００４７】このようにして作製したキメラ遺伝子挿入
発現ベクターを、例えばP3X63・Ag8・653細胞あるいはSP2
10細胞といった、自らは抗体を産生していない骨髄腫細
胞にプロトプラスト融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン
法、リン酸カルシウム法あるいは電気穿孔法等により導
入する。形質転換細胞は、発現ベクターに導入された薬
物耐性遺伝子に対応する薬物含有培地中での培養により
選別し、目的とするキメラモノクローナル抗体産生細胞
を取得する。このようにして選別された抗体産生細胞の
培養上清中から目的のキメラモノクローナル抗体を取得
する。

【００４８】本発明における「ヒト型モノクローナル抗
体（CDR-grafted抗体）」は、遺伝子工学的に作製され
るモノクローナル抗体であって、具体的には、その超可
変領域の相補性決定領域の一部または全部が非ヒト哺乳
動物（マウス、ラット、ハムスターなど）のモノクロー
ナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であ
り、その可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由
来の可変領域の枠組領域であり、かつその定常領域がヒ
トイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴と
するヒト型モノクローナル抗体を意味する。

【００４９】ここで、超可変領域の相補性決定領域と
は、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相
補的に直接結合する部位である３つの領域（Complement
arity-determining residue；CDR1、CDR2、CDR3）を指
し、また可変領域の枠組領域とは、該３つ相補性決定領
域の前後に介在する比較的保存された４つの領域（Fram
ework；FR1、FR2、FR3、FR4）を指す。換言すれば、非
ヒト哺乳動物由来のモノクローナル抗体の超可変領域の
相補性決定領域の一部または全部以外の全ての領域が、
ヒトイムノグロブリンの対応領域と置き代わったモノク
ローナル抗体を意味する。ヒトイムノグロブリン由来の
定常領域は、ＩｇＧ（IgG1,IgG2,IgG3,IgG4）、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより
各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明におけるヒ
ト型モノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタ
イプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であって
もよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。ま
た、ヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域に
ついても限定されるものではない。

【００５０】本発明におけるヒト型モノクローナル抗体
は、例えば以下のようにして製造することができる。し
かしながら、そのような製造方法に限定されるものでな
いことは言うまでもない。例えば、マウスモノクローナ
ル抗体に由来する組換えヒト型モノクローナル抗体は、
特表平４−５０６４５８号公報及び特開昭６２−２９６
８９０号公報等を参照して、遺伝子工学的に作製するこ
とができる。即ち、マウスモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマから、少なくとも１つのマウスＨ鎖Ｃ
ＤＲ遺伝子と該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子に対応する少な
くとも１つのマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子を単離し、またヒ
トイムノグロブリン遺伝子から前記マウスＨ鎖ＣＤＲに
対応するヒトＨ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒト
Ｈ鎖遺伝子と、前マウスＬ鎖ＣＤＲに対応するヒトＬ鎖
ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＬ鎖遺伝子を単離
する。

【００５１】単離した該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒ
トＨ鎖遺伝子を発現可能なように適当な発現ベクターに
導入し、同様に該マウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＬ鎖
遺伝子を発現可能なように適当なもう１つの発現ベクタ
ーに導入する。または、該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒ
トＨ鎖遺伝子とマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＬ鎖遺伝
子を同一の発現ベクターに発現可能なように導入するこ
ともできる。このようにして作製された発現ベクターで
宿主細胞を形質転換することによりヒト型モノクローナ
ル抗体産生形質転換細胞を得、該形質転換細胞を培養す
ることにより培養上清中から目的のヒト型モノクローナ
ル抗体を得る。

【００５２】本発明における「モノクローナル抗体」に
は、該モノクローナル抗体の「一部」も包含される。該
「モノクローナル抗体の一部」とは、前述の本発明にお
けるモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、具体
的にはF(ab')₂、Fab'、Fab、Ｆｖ（variable fragment
of antibody）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（disulphide stabil
ised Fv）あるいはｄＡｂ（single domain antibody）
である（エキスパート・オピニオン・オン・テラピュー
ティック・パテンツ(Exp. Opin. Ther. Patents)，第６
巻，第５号，第441〜456頁，1996年）。

【００５３】ここで、「F(ab')₂」及び「Fab'」とは、
イムノグロブリン（モノクローナル抗体）を、蛋白分解
酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理すること
により製造され、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在す
るジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体
フラグメントを意味する。例えば、ＩｇＧをパパインで
処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジ
スルフィド結合の上流で切断されてＶ_L（Ｌ鎖可変領
域）とＣ_L（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、及びＶ _H（Ｈ
鎖可変領域）とＣ_Hγ1（Ｈ鎖定常領域中のγ1領域）と
からなるＨ鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド
結合により結合した相同な２つの抗体フラグメントを製
造することができる。これら２つの相同な抗体フラグメ
ントを各々Fab'という。またＩｇＧをペプシンで処理す
ると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフ
ィド結合の下流で切断されて前記２つのFab'がヒンジ領
域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを
製造することができる。この抗体フラグメントをF(ab')
₂という。

【００５４】本発明の「モノクローナル抗体を産生する
細胞」あるいは「組換えモノクローナル抗体を産生する
細胞」とは、前述した本発明のモノクローナル抗体を産
生する任意の細胞を意味する。具体的には、例えば、下
記（１）乃至（３）のいずれかに記載される細胞を挙げ
ることができる。 （１）前記で定義した哺乳動物のＣＴＧＦ（好ましくは
ヒトのＣＴＧＦ）若しくはその一部または該ＣＴＧＦを
分泌する細胞等で、前述のヒト以外の哺乳動物または前
述のヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニッ
クマウス（若しくは他のトランスジェニック非ヒト哺乳
動物）を免疫することにより得られ、該ＣＴＧＦに反応
性を有するモノクローナル抗体を産生する該動物から採
取され得るモノクローナル抗体産生Ｂ細胞。 （２）そのようにして得られた抗体産生Ｂ細胞を哺乳動
物由来のミエローマ細胞と細胞融合して得られる前述の
融合細胞（ハイブリドーマ）。 （３）該モノクローナル抗体産生Ｂ細胞またはモノクロ
ーナル抗体産生融合細胞（ハイブリドーマ）から単離さ
れる該モノクローナル抗体をコードする遺伝子（重鎖を
コードする遺伝子若しくは軽鎖をコードする遺伝子のい
ずれか一方、または両方の遺伝子）で、該Ｂ細胞及びハ
イブリドーマ以外の細胞（例えば、CHO（Chinese hamst
er ovarian）細胞）、BHK（Baby hamster kydney）細胞
など）を形質転換して得られるモノクローナル抗体産生
形質転換細胞（遺伝子組換え細胞）。 ここで、前記（３）に記載のモノクローナル抗体産生形
質転換細胞（遺伝子組換え細胞）は、即ち、前記（１）
のＢ細胞または（２）のハイブリドーマが産生するモノ
クローナル抗体の遺伝子組換え体を産生する遺伝子組換
え細胞を意味する。これらの抗体産生形質転換細胞は、
前述のキメラモノクローナル抗体及びヒト型モノクロー
ナル抗体の製造において用いられる一般的遺伝子組換え
技術を用いて製造することができる。

【００５５】本発明における「実質的に同一の性質を有
するモノクローナル抗体」とは、当該モノクローナル抗
体の生物学的性質が、他のモノクローナル抗体の生物学
的性質と比較した場合に、少なくとも下記の点で有意な
差を有しないことを意味する。 （１）当該モノクローナル抗体を作製するために、非ヒ
ト哺乳動物の免疫に用いた特定の動物由来のＣＴＧＦに
対する反応性。 （２）当該特定の動物種のＣＴＧＦに対応する他の動物
種のＣＴＧＦに対する反応性（所謂、交叉反応性）。 （３）後述の実施例に記載される種々の試験により求め
られる特性。

【００５６】本発明における「哺乳動物由来の抗血清」
とは、該本発明のモノクローナル抗体またはその一部に
反応性を有する抗体を含む血清を意味する。該抗血清
は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤ
ギ、ブタあるいはウシ等の哺乳動物、好ましくはラッ
ト、モルモット、ウサギあるいはヤギに、前記本発明の
モノクローナル抗体あるいはその一部を、前述モノクロ
ーナル抗体の製造方法で述べたような方法で免疫して製
造することができる。

【００５７】本発明における「不溶性担体」とは、本発
明のモノクローナル抗体若しくはその一部（抗体フラグ
メント）、または試料（例えば、血漿等の体液試料、培
養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるＣＴＧＦを物
理学的吸着あるいは化学的結合等によって坦持させるた
めの支持体を意味する。例えば、下記（Ａ）並びに
（Ｂ）などを挙げることができる。 （Ａ）ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリ
コン樹脂あるいはナイロン樹脂等からなるプラスチック
や、ガラス等に代表されるような水に不溶性の物質から
なるプレート、試験管若しくはチューブ等の内容積を有
するもの、ビーズ（特には、マイクロビーズ）、ボー
ル、フィルター、あるいはメンブレン等。 （Ｂ）セルロース系担体、アガロース系担体、ポリアク
リルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン
系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系
担体あるいは多孔性シリカ系担体等のようなアフィニテ
ィークロマトグラフィーに用いられる不溶性担体を挙げ
ることができる。

【００５８】本発明の「抗体固定化不溶性担体」とは、
前記のような不溶性担体上に、本発明のモノクローナル
抗体（または該抗体の一部、即ち抗体フラグメント）
が、物理的吸着あるいは化学的結合等によって坦持され
た状態にある不溶性担体を意味する。これらの抗体固定
化不溶性担体は、試料（例えば、血清や血漿等の体液試
料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるＣＴＧ
Ｆを検出、定量、分離または精製するために用いること
ができる。該検出または定量の目的においては、前記
（Ａ）に例示した不溶性担体を用いることができ、とり
わけ定量に用いる不溶性担体としては、操作の簡便性及
び多数検体の同時処理の観点を考慮すると、例えば９６
穴マイクロタイタープレートあるいは４８穴マイクロタ
イタープレート等の多数のウェル（Well、穴）を有する
プラスチック等で作製されたマルチウェルマイクロタイ
タープレートを用いるのが好ましい。また、該分離また
は精製の目的においては、前記（Ａ）に例示したフィル
ター若しくはメンブレンまたは前記（Ｂ）に例示した不
溶性担体を用いることができる。

【００５９】本発明における「単独でまたは他の物質と
反応することにより検出可能なシグナルをもたらすこと
ができる標識物質」とは、それらを、前述のようなモノ
クローナル抗体若しくはその一部（抗体フラグメン
ト）、あるいはＣＴＧＦの標準物質に物理化学的結合等
により結合させることによりそれらの存在を検出可能に
するために用いられる物質を意味する。具体的には、酵
素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジンある
いは放射性同位体等であり、さらに具体的には、ペルオ
キシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アル
カリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱
水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコー
スオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくは
アセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセイ
ンイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金
属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチル
ローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、³Ｈ、¹⁴
Ｃ、¹²⁵Ｉ若しくは¹³¹Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、
アビジン、または化学発光物質が挙げられる。

【００６０】ここで、放射性同位体及び蛍光物質は、単
独で検出可能なシグナルをもたらすことができる。一
方、酵素、化学発光物質、ビオチン及びアビジンは、単
独では検出可能なシグナルをもたらすことができないた
め、さらに１種以上の他の物質と反応することにより検
出可能なシグナルをもたらす。例えば、酵素の場合には
少なくとも基質が必要であり、酵素活性を測定する方法
（比色法、蛍光法、生物発光法あるいは化学発光法等）
に依存して種々の基質が用いられる。例えば、ペルオキ
シダーゼの場合には、基質として過酸化水素を用いる。
また、ビオチンの場合には少なくともアビジンあるいは
酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的であるが、こ
の限りではない。必要に応じてさらに該基質に依存する
種々の発色物質が用いられる。

【００６１】本発明における「標識抗体」及び「標識さ
れた哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質」とは、各々前記の
ような種々標準物質で標識されたモノクローナル抗体
（または抗体フラグメント）及びＣＴＧＦを意味する。
これらの標識抗体及び標識標準物質は、試料（例えば、
血清や血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清
等）中に含まれるＣＴＧＦを検出、定量、分離または精
製するために用いることができる。本発明においては、
上記のいずれの標識物質をも使用可能であるが、検出感
度あるいは定量感度の高さ及び操作の利便性の点を考慮
すると、ペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオチンで
標識するのが好ましい。

【００６２】ここで「ＣＴＧＦの標準物質」とは、試料
中に含まれる濃度（含量）未知のＣＴＧＦと対照的に、
あらかじめ単離されているＣＴＧＦを意味し、アッセイ
の目的に応じて自由にその濃度をコントロールすること
ができる標品（スタンダード）を意味する。該標準物質
は、例えば、検量線の作成に用いることができる。

【００６３】本発明における「イムノアッセイ」とは、
抗原抗体反応の原理に基づき、試料（例えば、血漿等の
体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれる
抗原の検出あるいは定量を行う方法を意味し、本発明に
おいては、該抗原抗体反応における抗体が、本発明の哺
乳動物のＣＴＧＦに反応性を有する前記のようなモノク
ローナル抗体（若しくはその抗体のフラグメント）、前
記のような抗体固定化不溶性担体（若しくは抗体フラグ
メント固定化不溶性担体）、または前記のような標識抗
体（若しくは標識抗体フラグメント）から選ばれる一つ
以上の該モノクローナル抗体（または抗体フラグメン
ト）をであること、及び抗原が哺乳動物のＣＴＧＦであ
ること以外は、これまでに知られているイムノアッセイ
をも適用することができる。

【００６４】具体的には、酵素免疫測定法（第３版、石
川榮治ら編集、医学書院発行、１９８７年）に記載され
ているような、例えば、一抗体固相法、二抗体液相法、
二抗体固相法、サンドイッチ法、ＥＭＩＴ法（Enzyme m
ultiplied immunoassay technique）、エンザイムチャ
ネリングアッセイ（Enzyme channeling immunoassa
y）、酵素活性修飾物質標識イムノアッセイ（Enzyme mo
dulator mediated enzyme immunoassay、ＥＭＭＩ
Ａ）、酵素阻害物質標識イムノアッセイ（Enzyme inhib
itor immunoassay）、イムノエンザイムメトリックアッ
セイ（Immunoenzymometricassay）、酵素活性増強イム
ノアッセイ（Enzyme enhanced immunoassay）あるいは
プロキシマールリンケージイムノアッセイ（Proximal l
inkage immunoassay）等、さらには、特公平２−３９７
４７号公報に記載されているようなワンポット法を挙げ
ることができる。

【００６５】本発明においては、このようなイムノアッ
セイを、目的に応じて適宜選択して用いることができる
が、操作上の簡便性及び／または経済的な利便性、とり
わけ臨床上での汎用性の点を考慮すると、サンドイッチ
法、ワンポット法、一抗体固相法または二抗体液相法を
用いるのが好ましく、より好ましくは、サンドイッチ法
またはワンポット法である。特に好ましくは、本発明の
モノクローナル抗体を、９６穴マイクロプレートに代表
されるような多数のウェルを有するマルチウェルマイク
ロプレートに固定化した抗体固定化不溶性担体と、酵素
あるいはビオチンにより標識された標識抗体とを用いる
サンドイッチ法、あるいは本発明のモノクローナル抗体
を、マイクロビーズ等のビーズまたは微小なボールに固
定化した抗体固定化不溶性担体と、酵素あるいはビオチ
ンにより標識された標識抗体とを用いるワンポット法で
ある。

【００６６】特に好ましい態様において具体的な一例を
挙げるならば、図１に記載のモノクローナル抗体である
「8-64-6」または「13-51-2」をマイクロプレートまた
はマイクロビーズに固定化した抗体固定化不溶性担体
と、図１に記載されるモノクローナル抗体である「8-86
-2」を酵素またはビオチンで標識した標識抗体との組合
わせによるサンドイッチ法またはワンポット法である。
「8-64-6」を固定化した抗体固定化不溶性担体と、「8-
86-2」を酵素またはビオチンで標識した標識抗体との組
合わせによるイムノアッセイでは、ヒト及びマウスのＣ
ＴＧＦを高感度で検出、定量することができる。また、
「13-51-2」を固定化した抗体固定化不溶性担体と、「8
-86-2」を酵素またはビオチンで標識した標識抗体との
組合わせによるイムノアッセイでは、ラット（本願にお
いて初めて開示される）及びマウスのＣＴＧＦを高感度
で検出、定量することができる。

【００６７】以下に、サンドイッチ法、ワンポット法、
一抗体固相法及び二抗体液相法について詳述する。サン
ドイッチ法は、前述の本発明の前記（５０）で述べた方
法、即ち、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含
むイムノアッセイ法である。 （ａ）本発明の抗体固定化不溶性担体に、試料を反応せ
しめる工程；及び （ｂ）該抗体固定化不溶性担体と該試料中に含まれる哺
乳動物のＣＴＧＦとの結合により形成される抗原抗体複
合体に、本発明の標識抗体を反応せしめる工程。

【００６８】本発明に即して、「抗体固定化不溶性担
体」として図１に記載のモノクローナル抗体「8-64-6」
をマイクロプレートに固定化した「抗体固定化マイクロ
プレート」を用い、また「標識抗体」として図１に記載
のモノクローナル抗体「8-86-2」をペルオキシダーゼ等
の酵素あるいはビオチンで標識した「標識抗体」を用い
て、ヒトまたはマウスのＣＴＧＦを定量する方法につい
て具体的に説明すると、例えば下記のような工程により
構成されるが、該具体例のみに限定されるものではな
い。また、「抗体固定化不溶性担体」として図１に記載
のモノクローナル抗体「13-51-2」をマイクロプレート
に固定化した「抗体固定化マイクロプレート」を用い、
また「標識抗体」として図１に記載のモノクローナル抗
体「8-86-2」をペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオ
チンで標識した「標識抗体」を用いて下記と同様に操作
することによって、マウスのＣＴＧＦだけでなくラット
（本願において初めて開示される）のＣＴＧＦも定量す
ることができる。

【００６９】（工程１）本発明のモノクローナル抗体
「8-64-6」をマイクロプレートに固定化し、抗体固定化
マイクロプレートを作製する工程； （工程２）該抗体固定化マイクロプレートにヒトまたは
マウスの血清等の試料を加え、該マイクロプレート上に
固定化されているモノクローナル抗体と試料とを反応さ
せる工程； （工程３）該マイクロプレートを洗浄し未反応の試料を
該マイクロプレートから取り除く工程； （工程４）本発明のモノクローナル抗体「8-86-2」をビ
オチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識
し、標識抗体を作製する工程； （工程５）工程３で洗浄されたマイクロプレートに、該
標識抗体を加え、該マイクロプレート上に固定化された
モノクローナル抗体と試料中に含まれるヒトまたはマウ
スのＣＴＧＦとが反応して形成される抗原抗体複合体に
該標識抗体を反応させる工程；

【００７０】（工程６）マイクロプレートを洗浄し、未
反応の標識抗体を、該マイクロプレートから取り除く工
程； （工程７）工程６で洗浄されたマイクロプレートに、必
要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に依存し
て種々の基質（但し、工程５でペルオキシダーゼ等の酵
素で標識した標識抗体を用いた場合）またはアビジンあ
るいは酵素修飾アビジン（但し、工程５でビオチンで標
識した標識抗体を用いた場合）を加え、該基質、アビジ
ンまたは酵素修飾アビジンと標識抗体上の標識物質とを
反応させる工程； （工程８）工程７で酵素修飾アビジンを加えた場合に
は、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を
加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工
程； （工程９）マイクロプレートに反応停止液を加え、酵素
反応及び発色反応を停止させる工程；及び （工程１０）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測
定する工程。

【００７１】ワンポット法は、前述の本発明の（５
０）、（５１）または（５２）で各々述べた方法であ
る。即ち、第１は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の
工程を含むイムノアッセイ法である。 （ａ）本発明の抗体固定化不溶性担体に、試料を反応せ
しめる工程；及び （ｂ）該抗体固定化不溶性担体と該試料中に含まれる哺
乳動物のＣＴＧＦとの結合により形成される抗原抗体複
合体に、本発明の標識抗体を反応せしめる工程。

【００７２】第２は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）
の工程を含むイムノアッセイ法である。 （ａ）本発明の標識抗体と、試料を反応せしめる工程；
及び （ｂ）該標識抗体と試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧ
Ｆとの結合により形成される抗原抗体複合体に、本発明
の抗体固定化不溶性担体を反応せしめる工程。

【００７３】第３は、少なくとも下記（ａ）の工程を含
むイムノアッセイ法である。 （ａ）本発明の抗体固定化不溶性担体、本発明の標識抗
体、及び試料を含む混合物を反応せしめる工程。 本発明に即して、「抗体固定化不溶性担体」として図１
に記載のモノクローナル抗体「8-64-6」をマイクロビー
ズに固定化した「抗体固定化マイクロビーズ」を用い、
また「標識抗体」として図１に記載のモノクローナル抗
体「8-86-2」をペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオ
チンで標識した「標識抗体」を用いて、ヒトまたはマウ
スのＣＴＧＦを定量する方法について具体的に説明する
と、例えば下記のような工程により構成されるが、該具
体例のみに限定されるものではない。

【００７４】また、「抗体固定化不溶性担体」として図
１に記載のモノクローナル抗体「13-51-2」をマイクロ
ビーズに固定化した「抗体固定化マイクロビーズ」を用
い、また「標識抗体」として図１に記載のモノクローナ
ル抗体「8-86-2」をペルオキシダーゼ等の酵素あるいは
ビオチンで標識した「標識抗体」を用いて下記と同様に
操作することによって、マウスのＣＴＧＦだけでなくラ
ット（本願において初めて開示される）のＣＴＧＦも定
量することができる。

【００７５】第１の方法は、下記のような工程から構成
される。 （工程１）本発明のモノクローナル抗体「8-64-6」をマ
イクロビーズに固定化し、抗体固定化マイクロビーズを
作製する工程； （工程２）試験管、マイクロプレートあるいはチューブ
等のような内容積を有する容器に緩衝液とともに該抗体
固定化マイクロビーズとヒトまたはマウスの血清等の試
料を加え、該マイクロビーズ上に固定化されたモノクロ
ーナル抗体と試料とを反応させる工程； （工程３）容器中の内溶液を除去し、ビーズを洗浄する
工程； （工程４）本発明のモノクローナル抗体「8-86-2」をビ
オチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識
し、標識抗体を作製する工程； （工程５）工程３で洗浄されたビーズを含有する容器に
該標識抗体を加え、該ビーズ上に固定化されたモノクロ
ーナル抗体と試料中に含まれるヒトまたはマウスのＣＴ
ＧＦとが反応して形成される抗原抗体複合体に該標識抗
体を反応させる工程；

【００７６】（工程６）容器中の内溶液の除去し、ビー
ズを洗浄することにより、未反応の標識抗体を取り除く
工程； （工程７）工程６で洗浄されたビーズを含む容器に、必
要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に依存し
て種々の基質（但し、工程５でペルオキシダーゼ等の酵
素で標識した標識抗体を用いた場合）またはアビジンあ
るいは酵素修飾アビジン（但し、工程５でビオチンで標
識した標識抗体を用いた場合）を加え、該基質、アビジ
ンまたは酵素修飾アビジンと標識抗体上の標識物質とを
反応させる工程； （工程８）工程７で酵素修飾アビジンを加えた場合に
は、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を
加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工
程； （工程９）工程７または工程８の反応系に反応停止液を
加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び （工程１０）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測
定する工程。

【００７７】第２の方法は、下記のような工程から構成
される。 （工程１）本発明のモノクローナル抗体「8-86-2」をビ
オチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識
し、標識抗体を作製する工程； （工程２）試験管、マイクロプレートあるいはチューブ
等のような内容積を有する容器に緩衝液とともに該標識
抗体とヒトまたはマウスの血清等の試料を加え、該標識
抗体と試料とを反応させる工程； （工程３）本発明のモノクローナル抗体「8-64-6」をマ
イクロビーズに固定化し、抗体固定化マイクロビーズを
作製する工程； （工程４）工程２の反応系に、該ビーズを加え、標識抗
体と試料中に含まれるヒトまたはマウスのＣＴＧＦとが
反応して形成される抗原抗体複合体と、該ビーズ上に固
定化されたモノクローナル抗体とを反応させる工程； （工程５）容器中の内溶液の除去し、ビーズを洗浄する
ことにより、未反応の標識抗体を取り除く工程；

【００７８】（工程６）工程５で洗浄されたビーズを含
む容器に、必要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の
種類に依存して種々の基質（但し、工程２でペルオキシ
ダーゼ等の酵素で標識した標識抗体を用いた場合）また
はアビジンあるいは酵素修飾アビジン（但し、工程２で
ビオチンで標識した標識抗体を用いた場合）を加え、該
基質、アビジンまたは酵素修飾アビジンと標識抗体上の
標識物質とを反応させる工程； （工程７）工程６で酵素修飾アビジンを加えた場合に
は、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を
加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工
程； （工程８）工程６または工程７の反応系に反応停止液を
加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び （工程９）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定
する工程。

【００７９】第３の方法は、下記のような工程から構成
される。 （工程１）本発明のモノクローナル抗体「8-64-6」をマ
イクロビーズに固定化し、抗体固定化マイクロビーズを
作製する工程； （工程２）本発明のモノクローナル抗体「8-86-2」をビ
オチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識
し、標識抗体を作製する工程； （工程３）試験管、プレートあるいはチューブ等のよう
な内容積を有する容器に緩衝液とともに、工程１で作製
された抗体固定化マイクロビーズ、工程２で作製された
標識抗体、及びヒトまたはマウスの血清等の試料を加
え、該ビーズ上に固定化されたモノクローナル抗体、標
識抗体、及び試料を同時に反応させる工程； （工程４）容器中の内溶液を除去し、該ビーズを洗浄す
ることにより、未反応の標識抗体を取り除く工程；

【００８０】（工程５）工程４で洗浄されたビーズを含
む容器に、必要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の
種類に依存して種々の基質（但し、工程３でペルオキシ
ダーゼ等の酵素で標識した標識抗体を用いた場合）また
はアビジンあるいは酵素修飾アビジン（但し、工程３で
ビオチンで標識した標識抗体を用いた場合）を加え、該
基質、アビジンまたは酵素修飾アビジンと標識抗体上の
標識物質とを反応させる工程； （工程６）工程５で酵素修飾アビジンを加えた場合に
は、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を
加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工
程； （工程７）工程５または工程６の反応系に反応停止液を
加え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び （工程８）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定
する工程。

【００８１】一抗体固相法は、前述の本発明の（５３）
で述べた方法、即ち、少なくとも下記（ａ）の工程を含
むイムノアッセイ法である。 （ａ）本発明の抗体固定化不溶性担体に、試料、並びに
単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能な
シグナルをもたらすことができる標識物質で標識された
哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質を反応せしめる工程。

【００８２】本発明に即して、「抗体固定化不溶性担
体」として図１に記載のモノクローナル抗体「8-64-6」
をマイクロプレートに固定化した「抗体固定化マイクロ
プレート」を用い、また「標識物質」として、特に一般
的であるペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオチンを
用いて、ヒトまたはマウスのＣＴＧＦを定量する方法に
ついて具体的に説明すると、例えば下記のような工程に
より構成されるが、該具体例のみに限定されるものでは
ない。また、「抗体固定化不溶性担体」として図１に記
載のモノクローナル抗体「13-51-2」をマイクロプレー
トに固定化した「抗体固定化マイクロプレート」を用
い、また「標識物質」として、特に一般的であるペルオ
キシダーゼ等の酵素あるいはビオチンを用いて下記と同
様に操作することによって、マウスのＣＴＧＦだけでな
くラット（本願において初めて開示される）のＣＴＧＦ
も定量することができる。

【００８３】（工程１）本発明のモノクローナル抗体
「8-64-6」をマイクロプレートに固定化し、抗体固定化
マイクロプレートを作製する工程； （工程２）ヒトまたはマウスのＣＴＧＦの標準物質をビ
オチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識
し、標識ＣＴＧＦ標準物質を作製する工程； （工程３）該マイクロプレートにヒトまたはマウスの血
清等の試料及び該標識ＣＴＧＦ標準物質を加え、該試料
と標識標準物質とを、該マイクロプレート上に固定化さ
れたモノクローナル抗体と競合的に反応させる工程； （工程４）マイクロプレートを洗浄し、未反応の標識標
準物質を、マイクロプレートから取り除く工程；

【００８４】（工程５）工程４で洗浄されたマイクロプ
レートに、必要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の
種類に依存して種々の基質（但し、工程３でペルオキシ
ダーゼ等の酵素で標識した標識標準物質を用いた場合）
またはアビジンあるいは酵素修飾アビジン（但し、工程
３でビオチンで標識した標識標準物質を用いた場合）を
加え、該基質、アビジンまたは酵素修飾アビジンと標識
標準物質上の標識物質とを反応させる工程； （工程６）工程５で酵素修飾アビジンを加えた場合に
は、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を
加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工
程； （工程７）マイクロプレートに反応停止液を加え、酵素
反応及び発色反応を停止させる工程；及び （工程８）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定
する工程。

【００８５】二抗体液相法は、前述の本発明の（５４）
及び（５５）に記載した方法である。即ち、第一は、少
なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むイムノアッ
セイ法である。 （ａ）試料、並びに単独でまたは他の物質と反応するこ
とにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標
識物質で標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質との
混合物に、本発明のモノクローナル抗体を反応せしめる
工程；及び （ｂ）該試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧＦ若しくは
該標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質と、該モノ
クローナル抗体との結合により形成される抗原抗体複合
体に、該モノクローナル抗体に反応性を有する哺乳動物
由来の抗血清を反応せしめる工程。

【００８６】第２は、少なくとも下記（ａ）乃至（ｃ）
の工程を含むイムノアッセイ法である。 （ａ）試料に、本発明のモノクローナル抗体を反応せし
める工程； （ｂ）（ａ）の工程を行った反応系に、単独でまたは他
の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもた
らすことができる標識物質で標識された哺乳動物のＣＴ
ＧＦの標準物質を反応せしめる工程；及び （ｃ）該試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧＦ若しくは
該標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質と、該モノ
クローナル抗体との結合により形成される抗原抗体複合
体に、該モノクローナル抗体に反応性を有する哺乳動物
由来の抗血清を反応せしめる工程。

【００８７】本発明に即して、「モノクローナル抗体」
として図１に記載のモノクローナル抗体「8-64-6」また
は「8-86-2」を用い、また「標識物質」として、特に一
般的であるペルオキシダーゼ等の酵素またはビオチンを
用いて、ヒトまたはマウスのＣＴＧＦを定量する方法に
ついて具体的に説明すると、例えば下記のような工程に
より構成されるが、該具体例のみに限定されるものでは
ない。また、「モノクローナル抗体」として図１に記載
のモノクローナル抗体「13-51-2」を用い、また「標識
物質」としてペルオキシダーゼ等の酵素またはビオチン
を用いて下記と同様に操作することによって、マウスの
ＣＴＧＦだけでなくラット（本願において初めて開示さ
れる）のＣＴＧＦも定量することができる。

【００８８】第１の方法は、下記のような工程から構成
される。 （工程１）ヒトまたはマウスのＣＴＧＦの標準物質をビ
オチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識
し、標識ＣＴＧＦ標準物質を作製する工程； （工程２）試験管、プレートあるいはチューブ等のよう
な内容積を有する容器に、マウスまたはヒトの血清等の
試料と工程１で作製された標識ＣＴＧＦ標準物質との混
合物を加え、次いで本発明のモノクローナル抗体「8-64
-6」または「8-86-2」を加え、該試料と標識ＣＴＧＦ標
準物質とを競合的に該モノクローナル抗体と反応させる
工程； （工程３）ヤギ抗マウスγグロブリン血清等のようなマ
ウス由来のモノクローナル抗体に反応性を有するマウス
以外の動物由来の抗血清を加え、工程２において形成さ
れる試料中に含まれる哺乳動物ＣＴＧＦ若しくは標識Ｃ
ＴＧＦ標準物質と該モノクローナル抗体との抗原抗体複
合体に該抗血清を反応させ、該複合体と抗血清とからな
る複合凝集物を凝集沈殿させる工程； （工程４）工程３の反応系を遠心分離して凝集沈殿した
複合体を分離する工程；

【００８９】（工程５）工程４で分離された複合凝集物
に、必要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に
依存して種々の基質（但し、工程２でペルオキシダーゼ
等の酵素で標識した標識標準物質を用いた場合）または
アビジンあるいは酵素修飾アビジン（但し、工程２でビ
オチンで標識した標識標準物質を用いた場合）を加え、
該基質、アビジンまたは酵素修飾アビジンと標識標準物
質上の標識物質とを反応させる工程； （工程６）工程５で酵素修飾アビジンを加えた場合に
は、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を
加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工
程； （工程７）工程５乃至工程６の反応系に反応停止液を加
え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び （工程８）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定
する工程。

【００９０】第２の方法は、下記のような工程から構成
される。 （工程１）ヒトまたはマウスのＣＴＧＦの標準物質をビ
オチンあるいはペルオキシダーゼ等の酵素により標識
し、標識ＣＴＧＦ標準物質を作製する工程； （工程２）試験管、プレートあるいはチューブ等のよう
な内容積を有する容器にヒトまたはマウスの血清等の試
料を加え、次いで本発明のモノクローナル抗体「8-64-
6」または「8-86-2」を加え、該試料と該モノクローナ
ル抗体とを反応させる工程； （工程３）工程２の反応系に、工程１で作製した標識Ｃ
ＴＧＦ標準物質を加え、該標識ＣＴＧＦ標準物質と、工
程２で試料と未反応であった残余のモノクローナル抗体
とを反応させる工程； （工程４）ヤギ抗マウスγグロブリン血清等のようなマ
ウス由来のモノクローナル抗体に反応性を有するマウス
以外の動物由来の抗血清を加え、工程２において形成さ
れる試料中に含まれる哺乳動物ＣＴＧＦと該モノクロー
ナル抗体との抗原抗体複合体、及び／または工程３にお
いて形成される標識ＣＴＧＦ標準物質と該モノクローナ
ル抗体との抗原抗体複合体に、該抗血清を反応させ、該
複合体と抗血清とからなる複合凝集物を凝集沈殿させる
工程； （工程５）工程４の反応系を遠心分離して凝集沈殿した
複合体を分離する工程；

【００９１】（工程６）工程５で分離された複合凝集物
に、必要に応じて発色物質と共に、用いた酵素の種類に
依存して種々の基質（但し、工程３でペルオキシダーゼ
等の酵素で標識した標識標準物質を用いた場合）または
アビジンあるいは酵素修飾アビジン（但し、工程３でビ
オチンで標識した標識標準物質を用いた場合）を加え、
該基質、アビジンまたは酵素修飾アビジンと標識標準物
質上の標識物質とを反応させる工程； （工程７）工程６で酵素修飾アビジンを加えた場合に
は、該修飾に用いた酵素の種類に依存して種々の基質を
加え、アビジンに結合した酵素と基質を反応させる工
程； （工程８）工程６乃至工程７の反応系に反応停止液を加
え、酵素反応及び発色反応を停止させる工程；及び （工程９）比色強度、蛍光強度あるいは発光強度を測定
する工程。

【００９２】本発明における「アフィニティークロマト
グラフィー」とは、抗原と抗体、酵素と基質、あるいは
受容体とリガンドといった物質間の相互作用（親和性）
を利用することにより試料（例えば、血清及び血漿等の
体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれる
目的物質を分離または精製する方法を意味する。本発明
発明の方法は、抗原抗体反応、即ち、抗原としての哺乳
動物のＣＴＧＦと、哺乳動物のＣＴＧＦに反応性を有す
る本発明のモノクローナル抗体との親和性を利用するこ
とにより、試料（例えば、血清及び血漿等の体液試料、
培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるＣＴＧＦを
分離または精製する方法を意味する。

【００９３】具体的には、（１）前述のような不溶性担
体であるフィルターあるいはメンブレン等に哺乳動物の
ＣＴＧＦに反応性を有する本発明のモノクローナル抗体
（あるいは抗体フラグメント）を固定化した後、該フィ
ルターあるいはメンブレンに試料を接触させることによ
り該試料中に含まれるＣＴＧＦを分離する方法、及び
（２）前述のようなセルロース系担体、アガロース系担
体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、
ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポ
リアミノ酸系担体あるいは多孔性シリカ系担体等のよう
な不溶性担体上に本発明の哺乳動物のＣＴＧＦに反応性
を有するモノクローナル抗体（あるいは抗体フラグメン
ト）を常法により固定化（物理的吸着、架橋による高分
子化、マトリックス中への封印あるいは非共有結合等に
よる固定化）し、該不溶性担体をガラス製、プラスチッ
ク製あるいはステンレス製等のカラムに充填し、該カラ
ム（例えば、円柱状カラム）に、試料（例えば、血清若
しくは血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清
等）を通じて溶出させることにより、該試料中に含まれ
るＣＴＧＦを分離あるいは精製する方法である。後者
（２）の方法を特にアフィニティーカラムクロマトグラ
フィーという。

【００９４】該アフィニティーカラムクロマトグラフィ
ーに用いられる前記不溶性担体としては、本発明のモノ
クローナル抗体（あるいは抗体フラグメント）を固定化
でき得るものであればどのような不溶性担体でも使用で
きるが、例えば、市販品である、ファルマシア(Pharmac
ia)社製のSepharose 2B、Sepharose 4B、Sepharose 6
B、CNBr-activated Sepharose 4B、AH-Sepharose 4B、C
H-Sepharose 4B、Activated CH-Sepharose 4B、Epoxy-a
ctivated Sepharose 6B、Activated thiol-Sepharose 4
B、Sephadex、CM-Sephadex、ECH-Sepharose 4B、EAH-Se
pharose 4B、NHS-activated SepharoseあるいはThiopro
pyl Sepharose 6B等、バイオラッド(Bio-Rad)社製のBio
-Gel A、Cellex、Cellex AE、Cellex-CM、Cellex PAB、
Bio-Gel P、Hydrazide Bio-Gel P、Aminoethyl Bio-Gel
P、Bio-Gel CM、Affi-Gel 10、Affi-Gel 15、Affi-Pre
p 10、Affi-Gel Hz、Affi-Prep Hz、Affi-Gel 102、CM
Bio-Gel A、Affi-Gel heparin、Affi-Gel 501あるいはA
ffi-Gel 601等、和光純薬工業社製のクロマゲルＡ、ク
ロマゲルＰ、エンザフィックス P-HZ、エンザフィック
スP-SHあるいはエンザフィックスP-AB等、セルバ(Serv
a)社製のAE-Cellurose、CM-CelluroseあるいはPAB Cell
urose等を挙げることができる。

【００９５】本発明における「医薬組成物」は、有効成
分としての本発明のモノクローナル抗体若しくはその一
部、後述の「ＣＴＧＦ阻害剤」、「ＣＴＧＦ産生抑制
剤」または「ＣＴＧＦの刺激の刺激により増殖する能力
を有する細胞のＣＴＧＦの刺激による増殖を抑制する能
力を有する物質」のいずれかと「薬学的に許容され得る
担体」とからなる医薬品として有用な組成物である。こ
こで「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈
剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化
剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補
助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのよう
な担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散
剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トロー剤、エ
リキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態
の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組
成物は、経口あるいは非経口的に投与することができ
る。非経口投与のためのその他の形態としては、一つま
たはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される
外用液剤、腸溶内投与のための坐剤およびペッサリーな
どが含まれる。

【００９６】投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症
状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組
成物に含有される活性成分（前記タンパクや抗体など）
の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回
につき10μgから1000mg（あるいは10μgから500mg）の
範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は
種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない
量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量
が必要な場合もある。とりわけ注射剤の場合には、例え
ば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の
薬学的に許容され得る担体中に0.1μg抗体／ml担体〜10
mg抗体／ml担体の濃度となるように溶解または懸濁する
ことにより製造することができる。

【００９７】このようにして製造された注射剤は、処置
を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋ
ｇ体重あたり、１μg〜100mgの割合で、好ましくは50μ
g〜50mgの割合で、１日あたり１回〜数回投与すること
ができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注
射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような
医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内
注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希
釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール、オリーブ油のような植物油、エタノールのよう
なアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調
製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バ
クテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合
または照射により行うことができる。注射剤は、用時調
製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥
法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の
注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することが
できる。

【００９８】本発明の医薬組成物は、生体の種々の組織
に由来するＣＴＧＦの刺激により増殖する能力を有する
細胞（例えば、種々の繊維芽細胞、種々の血管内皮細
胞、種々の細胞など）の増殖を抑制するために有用であ
る。該組織としては、例えば、脳、頚部、肺、心臓、肝
臓、膵臓、腎臓、胃、大腸、小腸、十二指腸、骨髄、子
宮、卵巣、精巣、前立腺、皮膚、口腔、舌、及び血管が
挙げられる。好ましくは、肺、肝臓、腎臓または皮膚を
挙げることができる。上述したとおり、本発明の医薬組
成物は、上記のようなＣＴＧＦの刺激により増殖する能
力を有する細胞の増殖を抑制できることから、本発明の
医薬組成物は、また、上記のような種々の組織における
該細胞の増殖を伴う種々の疾患の治療または予防のため
の医薬品として有用である。当該疾患における細胞増殖
を伴う組織としては、例えば、脳、頚部、肺、心臓、肝
臓、膵臓、腎臓、胃、大腸、小腸、十二指腸、骨髄、子
宮、卵巣、精巣、前立腺、皮膚、口腔、舌、及び血管が
挙げられる。好ましくは、肺、肝臓、腎臓または皮膚を
挙げることができる。

【００９９】該疾患としては、例えば、種々組織におけ
る繊維症（腎繊維症、肺繊維症、肝臓における繊維症、
皮膚における繊維症など）、腎臓疾患（例えば、腎繊維
症、腎炎、腎不全など）、肺における疾患（例えば、肺
繊維症、肺炎など）、皮膚疾患（例えば、乾癬、強皮
症、アトピー、ケロイドなど）、肝臓疾患（例えば、肝
臓での繊維症、肝炎、肝硬変など）、関節炎（例えば、
慢性関節リウマチ）、種々の癌、あるいは動脈硬化症等
の治療または予防への適用が可能である。好ましくは、
腎臓疾患（例えば、腎繊維症、腎炎、腎不全など）、肺
における疾患（例えば、肺繊維症、肺炎など）、皮膚疾
患（例えば、乾癬、強皮症、アトピー、ケロイドな
ど）、あるいは肝臓疾患（例えば、肝臓での繊維症、肝
炎、肝硬変など）を挙げることができる。さらに好まし
くは、腎臓疾患（例えば、腎繊維症、腎炎、腎不全な
ど）をあげることができる。

【０１００】また、本発明の医薬組成物には、「ＣＴＧ
Ｆ阻害剤」、「ＣＴＧＦ産生阻害剤」、あるいは「ＣＴ
ＧＦの刺激の刺激により増殖する能力を有する細胞のＣ
ＴＧＦの刺激による増殖を抑制する能力を有する物質」
を含んでなる医薬組成物も包含される。ここで、該「Ｃ
ＴＧＦ阻害剤」、該「ＣＴＧＦ産生阻害剤」あるいは該
「物質」とは、ＣＴＧＦの生物学的機能を抑制または阻
害する活性を有する物質または各種細胞からのＣＴＧＦ
の産生を抑制若しくは阻害する活性を有する物質を意味
する。例えば下記のいずれかの活性を有する物質を挙げ
ることができる。 （１）ヒト腎臓由来繊維芽細胞（例えば、細胞株293-T
（ATCC CRL-1573））とヒトのＣＴＧＦとの結合、また
は該細胞とマウスのＣＴＧＦとの結合を抑制若しくは阻
害する。 （２）ラット腎臓由来繊維芽細胞株（例えば、細胞株NR
K-49F（ATCC CRL-1570））、ヒト骨肉腫由来細胞株MG-6
3（ATCC CRL-1427）またはヒト肺由来繊維芽細胞のいず
れかとヒトのＣＴＧＦとの結合を抑制若しくは阻害す
る。 （３）ヒトのＣＴＧＦまたはマウスのＣＴＧＦの刺激に
よるラット腎臓由来繊維芽細胞株（例えば、細胞株NRK-
49F（ATCC CRL-1570））の細胞増殖を抑制若しくは阻害
する。 （４）ヒドロキシプロリンの生成が上昇傾向を示してい
る腎臓における該ヒドロキシプロリンの生成の上昇を抑
制若しくは阻害する。

【０１０１】上述の「物質」は具体的には、例えば下記
のような物質を挙げることができる。 （ａ）前述した本発明のモノクローナル抗体（天然由来
の抗体若しくは組換え抗体に限らない。）または該抗体
の一部。 （ｂ）アンチセンスＤＮＡ。 （ｃ）アンチセンスＲＮＡ。 （ｄ）上記（ａ）乃至（ｃ）以外の低分子化学物質（化
学的合成物または天然物）。

【０１０２】本発明におけるアンチセンスＤＮＡとは、
哺乳動物（好ましくはヒト）のＣＴＧＦタンパクをコー
ドするＤＮＡの塩基配列中の部分塩基配列を含むＤＮＡ
若しくは該ＤＮＡの一部が化学修飾されているＤＮＡ、
または該部分塩基配列に相補的な塩基配列を含むＤＮＡ
若しくは該ＤＮＡの一部が化学修飾されているＤＮＡを
あげることができる。

【０１０３】ここで、「部分塩基配列」とは、哺乳動物
（好ましくはヒト）のＣＴＧＦタンパクをコードするＤ
ＮＡの塩基配列中に含まれる任意の部位における任意の
数の塩基からなる部分塩基配列を意味する。該ＤＮＡ
は、該タンパクコードするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブ
リダイズすることにより、該ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写
あるいは該ｍＲＮＡのタンパクへの翻訳を阻害すること
により、ＣＴＧＦタンパクの産生を阻害することができ
る。

【０１０４】該部分塩基配列としては、連続した５乃至
１００塩基の部分塩基配列が挙げられ、好ましくは、連
続した５乃至７０塩基の部分塩基配列、さらに好ましく
は連続した５乃至５０塩基の部分塩基配列、より好まし
くは連続した５乃至３０塩基の部分塩基配列が挙げられ
る。また、このＤＮＡをアンチセンス医薬として用いる
場合には、該ＤＮＡが患者の体内に投与された場合の血
中半減期の増大（安定性）、細胞内膜の透過性の増大、
あるいは経口投与の場合の消化器官での分解耐性の増大
若しくは吸収の増大などの目的のために、該ＤＮＡの塩
基配列の一部に化学修飾を施すことが可能である。化学
修飾としては、例えば、オリゴヌクレオチドの構造中の
リン酸結合、リボース、核酸塩基、糖部位、3’及び／
または5’末端等の化学修飾が挙げられる。

【０１０５】リン酸結合の修飾としては、１以上の該結
合を、ホスホジエステル結合（D-オリゴ）、ホスホロチ
オエート結合、ホスホロジチオエート結合（S-オリ
ゴ）、メチルホスホネート結合（MP-オリゴ）、ホスホ
ロアミデート結合、非リン酸結合及びメチルホスホノチ
オエート結合のいずれかまたはそれらの組み合わせへの
変更を挙げることができる。リボースの修飾としては、
2'-フルオロリボースあるいは2'-O-メチルリボースへな
どへの変更を挙げることができる。核酸塩基の修飾とし
ては、5-プロピニルウラシルまたは2-アミノアデニンな
どへの変更が挙げられる。

【０１０６】本発明におけるアンチセンスＲＮＡとは、
哺乳動物（好ましくはヒト）のＣＴＧＦタンパクをコー
ドするＲＮＡの塩基配列中の部分塩基配列を含むＲＮＡ
若しくは該ＲＮＡの一部が化学修飾されているＲＮＡ、
または該部分塩基配列に相補的な塩基配列を含むＲＮＡ
若しくは該ＲＮＡの一部が化学修飾されているＲＮＡを
あげることができる。

【０１０７】ここで、「部分塩基配列」とは、哺乳動物
（好ましくはヒト）のＣＴＧＦタンパクをコードするＲ
ＮＡの塩基配列中に含まれる任意の部位における任意の
数の塩基からなる部分塩基配列を意味する。該ＲＮＡ
は、該タンパクコードするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブ
リダイズすることにより、該ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写
あるいは該ｍＲＮＡのタンパクへの翻訳を阻害すること
により、ＣＴＧＦタンパクの産生を阻害することができ
る。

【０１０８】該部分塩基配列としては、連続した５乃至
１００塩基の部分塩基配列が挙げられ、好ましくは、連
続した５乃至７０塩基の部分塩基配列、さらに好ましく
は連続した５乃至５０塩基の部分塩基配列、より好まし
くは連続した５乃至３０塩基の部分塩基配列が挙げられ
る。また、このＲＮＡをアンチセンス医薬として用いる
場合には、該ＲＮＡが患者の体内に投与された場合の血
中半減期の増大（安定性）、細胞内膜の透過性の増大、
あるいは経口投与の場合の消化器官での分解耐性の増大
若しくは吸収の増大などの目的のために、該ＲＮＡの塩
基配列の一部に化学修飾を施すことが可能である。化学
修飾としては、例えば、オリゴヌクレオチドの構造中の
リン酸結合、リボース、核酸塩基、糖部位、3’及び／
または5’末端等の化学修飾が挙げられる。

【０１０９】リン酸結合の修飾としては、１以上の該結
合を、ホスホジエステル結合（D-オリゴ）、ホスホロチ
オエート結合、ホスホロジチオエート結合（S-オリ
ゴ）、メチルホスホネート結合（MP-オリゴ）、ホスホ
ロアミデート結合、非リン酸結合及びメチルホスホノチ
オエート結合のいずれかまたはそれらの組み合わせへの
変更を挙げることができる。リボースの修飾としては、
2'-フルオロリボースあるいは2'-O-メチルリボースへな
どへの変更を挙げることができる。核酸塩基の修飾とし
ては、5-プロピニルウラシルまたは2-アミノアデニンな
どへの変更が挙げられる。

【０１１０】また、本発明の医薬組成物の種々疾患症状
の治療効果については、常法に従って、既知の疾患モデ
ル動物に投与することにより試験、検討することができ
る。例えば、組織繊維症の一つであり、また腎臓疾患の
１つでもある腎繊維症の治療効果の検討の場合には、マ
ウスの一方の尿管を結紮し腎臓の血液等のろ過機能を停
止させることにより腎機能不全を惹起させたモデルマウ
ス（UUOモデル、Unilateral ureteral obstruction）
に、本発明の医薬組成物を投与し、該腎機能不全により
惹起される腎炎及び腎繊維症の発症の指標であるヒドロ
キシプロリンの生成の上昇を抑制する程度を測定する方
法を用いることができる。該ヒドロキシプロリンの濃度
の低減は、該医薬組成物が該腎臓疾患の治療に有効であ
ることを示すものである。

【０１１１】腎疾患、例えば、微小糸球体異常（例え
ば、ネフローゼ型微小変化群（MCNS)）、巣状糸球体硬
化症（FGS）、膜性糸球体腎炎（膜性腎症、MN)、IgA腎
症、メサンギウム増殖性腎炎、溶連菌感染後急性糸球体
腎炎（APSGN）、半月体形成性（管外性）腎炎、間質性
腎炎、あるいは急性腎不全などについては、既報に詳述
されるモデル動物を用いることができる（「疾患別モデ
ル動物の作製と新薬開発のための試験・実験法」、p.34
-46、1993、技術情報協会（発行））。皮膚疾患、例え
ば、創傷、ケロイド、アトピー、皮膚炎、強皮症あるい
は乾癬などについては、既報に詳述されるモデル動物を
用いることができる（「疾患別モデル動物の作製と新薬
開発のための試験・実験法」、p.229-235、1993、技術
情報協会（発行））。

【０１１２】肝臓疾患、例えば、肝炎（例えば、ウイル
ス性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型など）など）、肝硬
変あるいは薬物肝障害などについては、既報に詳述され
るモデル動物を用いることができる（「疾患別モデル動
物の作製と新薬開発のための試験・実験法」、p.119-12
9及びp.349-358、1993、技術情報協会（発行））。例え
ば、動脈硬化症及び再狭窄への効果の検討の場合には、
ラット大動脈にバルーンカテーテルを挿入しPTCAを施し
疑似的に作成した再狭窄モデルを使用することができ
る。

【０１１３】例えば、腫瘍の増殖及び転移への効果の確
認の場合には、Ｂａｌｂ／ｃマウス等の正常マウス、ヌ
ードマウスもしくはＳＣＩＤマウス等のモデルマウス等
の市販のマウスの例えば皮下、尾静脈、脾臓内、腎被膜
下、腹腔内あるいは盲腸壁内等に、癌細胞を移植するこ
とにより作製した癌転移モデルを用いることができる。

【０１１４】本発明の「ラットのＣＴＧＦ」（具体的に
は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列または該アミ
ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する）及び
「ラットのＣＴＧＦをコードするＤＮＡ」（具体的に
は、配列番号１に記載される塩基配列中の塩基番号213
乃至1256迄の塩基配列を含むＤＮＡ）は、下記のような
意味を以て定義されるとともに、下記に述べるような常
法に従って製造することができる。

【０１１５】なお、「実質的に同一」なる用語は前述の
とおりの意味を有する。本発明の「ラットのＣＴＧＦ」
は、後述するような遺伝子組換え技術のほか、化学的合
成法、細胞培養方法等のような当該技術的分野において
知られる公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いる
ことにより製造することができる。本発明の「ＤＮＡ」
は、本発明のラットのＣＴＧＦをコードするＤＮＡであ
って、本発明のラットのＣＴＧＦをコードし得るいかな
る塩基配列をも包含する。具体的には、配列番号２に記
載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡが挙げられる。好適な態様としては、配列番号
１に記載される塩基配列中の塩基番号213乃至1256迄の
塩基配列を含むＤＮＡ（例えば、配列番号１に記載の塩
基配列を有するＤＮＡ）が挙げられる。

【０１１６】本発明におけるラットのＣＴＧＦをコード
するＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ及びゲノミックＤＮＡの
いずれをも包含する。本発明においては、同一のアミノ
酸をコードするコドンであればどのようなコドンから構
成されるＤＮＡを含む。また、本発明のＤＮＡは、いか
なる方法で得られるものであってもよい。例えばｍＲＮ
Ａから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮ
Ａから調製されるＤＮＡ、化学合成によって得られるＤ
ＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増幅
させて得られるＤＮＡおよびこれらの方法を適当に組み
合わせて構築されるＤＮＡをも全て包含するものであ
る。

【０１１７】本発明におけるラットのＣＴＧＦをコード
するＤＮＡは、常法に従って、該ラットのＣＴＧＦをコ
ードするｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法、
ゲノムＤＮＡを単離してスプライシング処理する方法、
該ｃＤＮＡ配列若しくはｍＲＮＡ配列を鋳型としてＰＣ
Ｒにより調製する方法、または化学合成する方法等によ
り取得することができる。本発明のラットのＣＴＧＦを
コードするＤＮＡは、そのようにして調製した該ラット
のＣＴＧＦをコードする各々のＤＮＡを適切な制限酵素
による切断（消化）し、得られたＤＮＡ断片を、必要に
応じてリンカーＤＮＡあるいはタグ（Ｔａｇ）と共に、
適切なＤＮＡポリメラーゼ等を用いて連結することによ
り調製することができる。

【０１１８】該ラットのＣＴＧＦ（以下、目的蛋白とい
う）をコードするｃＤＮＡをｍＲＮＡからクローン化す
る方法としては、以下の方法が例示される。まず、目的
蛋白を発現・産生する組織あるいは細胞（例えば、ラッ
ト線維芽細胞など）から目的蛋白をコードするｍＲＮＡ
を調製する。ｍＲＮＡの調製は、例えばグアニジンチオ
シアネート法（チャーグウィン（Chirgwin）ら、バイオ
ケミストリー（Biochemistry）、第１８巻、第５２９４
頁、１９７９年）、熱フェノール法もしくはＡＧＰＣ法
等の公知の方法を用いて調製した全ＲＮＡをオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースやポリＵ−セファロース等によるアフィ
ニティクロマトグラフィーにかけることによって行うこ
とができる。次いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例
えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法、例えばオカヤ
マらの方法（モレキュラーセルバイオロジー（Mol. Cel
l. Biol.）、第２巻、第１６１頁、１９８２年及び同誌
第３巻、第２８０頁、１９８３年）やホフマン（Hoffm
an）らの方法（ジーン（Gene）、第２５巻、第２６３
頁、１９８３年）等によりｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃＤＮ
Ａの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行う。このｃＤＮＡをプ
ラスミドベクター、ファージベクターまたはコスミドベ
クターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはイ
ンビトロパッケージング後、大腸菌に形質移入（トラン
スフェクト）することによりｃＤＮＡライブラリーを作
製する。

【０１１９】ここで用いられるプラスミドベクターとし
ては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限さ
れず、また用いられるファージベクターとしても宿主内
で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるク
ローニング用ベクターとしてｐＵＣ１９、λｇｔ１０、
λｇｔ１１等が例示される。ただし、後述の免疫学的ス
クリーニングに供する場合は、宿主内で目的蛋白をコー
ドする遺伝子を発現させうるプロモーターを有したベク
ターであることが好ましい。プラスミドにｃＤＮＡを組
み込む方法としては、例えばマニアティス（Maniatis）
らの方法（モレキュラークローニング、ア・ラボラトリ
ー・マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Ma
nual, second edition）、コールドスプリングハーバー
ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、第
1.53頁、１９８９年）に記載の方法などが挙げられる。
また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法とし
ては、ヒュン（Hyunh）らの方法（ＤＮＡクローニン
グ、プラクティカルアプローチ（DNA Cloning, a pract
ical approach）、第1巻、第49頁、１９８５年）などが
挙げられる。簡便には、市販のクローニングキット（例
えば、宝酒造社製等）を用いることもできる。このよう
にして得られる組換えプラスミドやファージベクター
は、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＨＢ１０１、Ｄ
Ｈ５α、Ｙ１０９０、ＤＨ１０ＢまたはＭＣ１０６１／
Ｐ３等）等の適当な宿主に導入する。

【０１２０】プラスミドを宿主に導入する方法として
は、（モレキュラークローニング、ア・ラボラトリー・
マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manua
l, second edition）、コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー（Cold Spring HarborLaboratory）、第1.74
頁、１９８９年）に記載の塩化カルシウム法または塩化
カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーショ
ン法等が挙げられる。また、ファージベクターを宿主に
導入する方法としてはファージＤＮＡをインビトロパッ
ケージングした後、増殖させた宿主に導入する方法等が
例示される。インビトロパッケージングは、市販のイン
ビトロパッケージングキット（例えば、ストラタジーン
社製、アマシャム社製等）を用いることによって簡便に
行うことができる。上記の方法によって作製されたｃＤ
ＮＡライブラリーから、目的蛋白をコードするｃＤＮＡ
を単離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニング法
を組み合わせることによって行うことができる。

【０１２１】例えば、別個に目的蛋白のアミノ酸配列に
対応すると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成し
たのち、これを³²Ｐでラベルしてプローブとなし、公知
のコロニーハイブリダイゼーション法（クランシュタイ
ン（Crunstein）ら、プロシーディングスオブナショナ
ルアカデミーオブサイエンス（Proc. Natl. Acid. Sci.
USA）、第７２巻、第３９６１頁、１９７５年）または
プラークハイブリダイゼーション法（Molecular Clonin
g, A Laboratory Manual, second edition , Cold Spri
ng Harbor Laboratory、第2.108 頁、１９８９年）によ
り、目的のｃＤＮＡを含有するクローンをスクリーニン
グする方法、ＰＣＲプライマーを作製し目的蛋白の特定
領域をＰＣＲ法により増幅し、該領域をコードするＤＮ
Ａ断片を有するクローンを選択する方法等が挙げられ
る。

【０１２２】また、ｃＤＮＡを発現しうるベクター（例
えば、λｇｔ１１等のファージベクター）を用いて作製
したｃＤＮＡライブラリーを用いる場合には、目的蛋白
に反応性を有する抗体を用いる抗原抗体反応を利用し
て、目的のクローンを選択することができる。大量にク
ローンを処理する場合には、ＰＣＲ法を利用したスクリ
ーニング法を用いることが好ましい。この様にして得ら
れたＤＮＡの塩基配列はマキサム・ギルバート法（マキ
サム（Maxam）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、第７
４巻、第５６０頁、１９７７年）あるいはファージＭ１
３を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止の方法
（サンガー（Sanger）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A.、第７４巻、第５４６３〜５４６７頁、１９７７年）
によって決定することができる。目的蛋白をコードする
遺伝子は、その全部または一部を上記のようにして得ら
れるクローンから制限酵素等により切り出すことにより
取得できる。

【０１２３】また、前述のような目的蛋白を発現する細
胞に由来するゲノムＤＮＡから目的蛋白をコードするＤ
ＮＡを単離することによる調製方法としては、例えば以
下の方法が例示される。該細胞を好ましくはＳＤＳまた
はプロテナーゼＫ等を用いて溶解し、フェノールによる
抽出を反復してＤＮＡの脱蛋白質を行う。ＲＮＡを好ま
しくはリボヌクレアーゼにより消化する。得られるＤＮ
Ａを適当な制限酵素により部分消化し、得られるＤＮＡ
断片を適当なファージまたはコスミドで増幅しライブラ
リーを作成する。そして目的の配列を有するクローン
を、例えば放射性標識されたＤＮＡプローブを用いる方
法等により検出し、該クローンから目的蛋白をコードす
る遺伝子の全部または一部を制限酵素等により切り出し
取得する。

【０１２４】目的蛋白をコードするＤＮＡのＰＣＲによ
る調製は、該目的蛋白の既知のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ
等を鋳型として常法により調製することができる（「遺
伝子増幅ＰＣＲ法・基礎と新しい展開」、共立出版株式
会社発行、1992年など）。また、化学的合成による目的
蛋白をコードするＤＮＡの製造は、目的蛋白の塩基配列
をもとにして、常法に従って行うことができる。

【０１２５】本発明のラットのＣＴＧＦは、上述に例示
した方法を用いて調製したラットのＣＴＧＦをコードす
るＤＮＡ（ｃＤＮＡあるいはイントロンを含むゲノミッ
クＤＮＡ）を、各々適切な制限酵素で切断することによ
り、該ラットのＣＴＧＦコードするＤＮＡ断片を得、そ
れらの断片を、必要に応じてリンカーＤＮＡあるいはタ
グ（Ｔａｇ）と共に、適切なＤＮＡポリメラーゼ等を用
いて連結させて得たＤＮＡを用いて、慣用される遺伝子
組換え技術を用いて、常法により組換え蛋白として調製
することができる。具体的には下記の例示されるとおり
である。即ち、上述のようにして調製したＤＮＡを、下
記に詳述するようなベクターに挿入して発現ベクターを
作成し、該発現ベクターで後述するような宿主細胞を形
質転換して形質転換体を得る。該形質転換体を培養する
ことにより、培養上清中に該目的蛋白を産生させる。培
養上清中の該目的蛋白は、カラムクロマトグラフィー等
を用いて容易に精製することができる。

【０１２６】本発明は、また本発明のラットＣＴＧＦを
コードするＤＮＡを含有する発現ベクターに関する。本
発明の発現ベクターとしては、原核細胞及び／または真
核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できる
ものであれば特に制限されず、プラスミドベクターおよ
びファージベクターが包含される（Cloning Vectors:A
Laboratory Manual, エルスビュ−社、ニューヨーク、1
985年）。当該発現ベクターは、簡便には当業界におい
て入手可能な組換え用ベクター（プラスミドＤＮＡおよ
びバクテリアファージＤＮＡ）に本発明のラットＣＴＧ
ＦをコードするＤＮＡを常法により連結することによっ
て調製することができる。用いられる組換え用ベクター
として具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして例え
ばpBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC19など、酵母由
来プラスミドとして例えばpSH19、pSH15など、枯草菌由
来プラスミドとして例えばpUB110、pTP5、pC194などが
例示される。また、ファージとしては、λファージなど
のバクテリオファージが、さらにレトロウイルス、ワク
シニヤウイルス、核多角体ウイルスなどの動物や昆虫の
ウイルス（pVL1393、インビトロゲン社製）が例示され
る。

【０１２７】本発明のラットＣＴＧＦをコードするＤＮ
Ａを発現させ該ラットＣＴＧＦを生産させる目的におい
ては、プラスミドベクターが有用である。プラスミドベ
クターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各
種の宿主細胞中で該ラットＣＴＧＦをコードする遺伝子
を発現し、これらのポリペプチドを生産する機能を有す
るものであれば特に制限されない。例えば、pMAL C2、p
cDNA3.1(-)、pEF-BOS（ヌクレイックアシッドリサーチ
（Nucleic Acid Research）、第１８巻、第５３２２
頁、１９９０年等）あるいはpME18S（実験医学別冊「遺
伝子工学ハンドブック」、１９９２年等）等を挙げるこ
とができる。

【０１２８】宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる
場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−
オペレーター領域、開始コドン、本発明のタンパクをコ
ードするＤＮＡ、終止コドン、ターミネーター領域およ
び複製可能単位から構成される。宿主として酵母、動物
細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは少な
くともプロモーター、開始コドン、本発明のラットＣＴ
ＧＦをコードするＤＮＡ、終止コドンを含んでいること
が好ましい。またシグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ、エンハンサー配列、本発明のラットＣＴＧＦをコー
ドする遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、スプ
ライシング接合部、ポリアデニレーション部位、選択マ
ーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよ
い。また、目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝
子（マーカー）を含んでいてもよい。

【０１２９】細菌中で本発明のラットＣＴＧＦを発現さ
せるためのプロモーター−オペレータ−領域は、プロモ
ーター、オペレーターおよびShine-Dalgarno(SD)配列
（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば宿
主がエシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｐプロモー
ター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λ
ＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモ
ーターなどを含むものが例示される。酵母中で本発明の
ラットＣＴＧＦを発現させるためのプロモーターとして
は、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡ
Ｐプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主
がバチルス属菌の場合は、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ
０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げら
れる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場
合、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプ
ロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げら
れる。好ましくは、ＳＶ−４０、レトロウイルスであ
る。しかし、特にこれらに限定されるものではない。ま
た、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法であ
る。

【０１３０】好適な開始コドンとしては、メチオニンコ
ドン（ＡＴＧ）が例示される。終止コドンとしては、常
用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＡＡ、ＴＧＡ）が
例示される。ターミネーター領域としては、通常用いら
れる天然または合成のターミネーターを用いることがで
きる。複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配
列を複製することができる能力をもつＤＮＡを言い、天
然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然
のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）およ
び合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとし
ては、E.coliではプラスミドｐＢＲ３２２、もしくはそ
の人工的修飾物（ｐＢＲ３２２を適当な制限酵素で処理
して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母では酵母２
μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡが、また哺乳
動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 37198、プラスミ
ドpSV2dhfr ATCC 37145、プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC
37224、プラスミドpSV2neo ATCC37149、プラスミドpSV
2bsr等があげられる。エンハンサー配列、ポリアデニレ
ーション部位およびスプライシング接合部位について
は、例えばそれぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者
において通常使用されるものを用いることができる。

【０１３１】選択マーカーとしては、通常使用されるも
のを常法により用いることができる。例えばテトラサイ
クリン、アンピシリン、またはカナマイシン等の抗生物
質耐性遺伝子等が例示される。遺伝子増幅遺伝子として
は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、チ
ミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グル
タミン酸合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝
子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイ
シン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパル
ラートトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示すること
ができる。

【０１３２】本発明の発現ベクターは、少なくとも、上
述のプロモーター、開始コドン、本発明のタンパクをコ
ードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域
を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結すること
によって調製することができる。またこの際、所望によ
り制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライ
ゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント
（例えば、リンカー、他のリストリクションサイトな
ど）を用いることができる。本発明の形質転換細胞は、
上述の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調
製することができる。

【０１３３】本発明で用いられる宿主細胞としては、前
記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであ
れば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使
用される天然細胞あるいは人工的に樹立された組換え細
胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、
バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属
など）、動物細胞または昆虫細胞など）が例示される。
好ましくは大腸菌あるいは動物細胞であり、具体的には
大腸菌（DH5α、DH10B、TB1、HB101、XL-2Blue等）、マ
ウス由来細胞（ＣＯＰ、Ｌ、C127、Sp2/0、NS-1またはN
IH3T3等）、ラット由来細胞、ハムスター由来細胞（BHK
およびCHO等）、サル由来細胞（COS1、COS3、COS7、CV1
及びVelo等）およびヒト由来細胞（Hela、２倍体線維芽
細胞に由来する細胞、ミエローマ細胞およびNamalwa
等）などが例示される。発現ベクターの宿主細胞への導
入（形質転換（形質移入））は従来公知の方法を用いて
行うことができる。

【０１３４】例えば、細菌（E.coli、Bacillus subtili
s等）の場合は、例えばCohenらの方法（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA.、第６９巻、第２１１０頁、１９７２
年）、プロトプラスト法（Mol. Gen. Genet.、第１６８
巻、第１１１頁、１９７９年）やコンピテント法（ジャ
ーナルオブモレキュラーバイオロジー（J. Mol. Bio
l.）、第５６巻、第２０９頁、１９７１年）によって、
Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばハイネン
（Hinnen）らの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、
第７５巻、第１９２７頁、１９７８年）やリチウム法
（J. Bacteriol.、第１５３巻、第１６３頁、１９８３
年）によって、動物細胞の場合は、例えばグラハム（Gr
aham）の方法（バイロロジー（Virology）、第５２巻、
第４５６頁、１９７３年）、昆虫細胞の場合は、例えば
サマーズ（Summers）らの方法（Mol. Cell. Biol.、第
３巻、第２１５６〜第２１６５頁、１９８３年）によっ
てそれぞれ形質転換することができる。

【０１３５】本発明のラットＣＴＧＦは、上記の如く調
製される発現ベクターを含む形質転換細胞（以下、形質
移入体を包含する意味で使用する。）を栄養培地で培養
することによって製造することができる。栄養培地は、
宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒
素源もしくは有機窒素源を含でいることが好ましい。炭
素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶
性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒
素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、ア
ミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイ
ン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示さ
れる。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例
えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マ
グネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサ
イクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン
等）など）を含んでいてもよい。培養は当業界において
知られている方法により行われる。培養条件、例えば温
度、培地のｐＨおよび培養時間は、本発明のタンパクが
大量に生産されるように適宜選択される。

【０１３６】なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる
具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこれら
に限定されるものではない。宿主が細菌、放線菌、酵
母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液
体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である
培地である。宿主がE.coliの場合、好ましい培地として
ＬＢ培地、Ｍ９培地（ミラー（Miller）ら、Exp. Mol.
Genet、Cold Spring Harbor Laboratory、第４３１頁、
１９７２年）、ＹＴ培地等が例示される。かかる場合、
培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４
３℃、約３〜２４時間行うことができる。

【０１３７】宿主がBacillus属菌の場合、必要により通
気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６
時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地と
して、例えばBurkholder最小培（ボスチアン（Bostia
n）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第７７巻、第４５
０５頁、１９８０年）が挙げられ、ｐＨは５〜８である
ことが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜
１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこと
もできる。宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約
５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（サイエンス
（Science）、第１２２巻、第５０１頁、１９５２
年）、ＤＭＥＭ培地（バイロロジー（Virology）、第８
巻、第３９６頁、１９５９年）、ＲＰＭＩ１６４０培地
（J. Am. Med. Assoc.、第１９９巻、第５１９頁、１９
６７年）、１９９培地（proc. Soc. Exp. Biol. Med.、
第７３巻、第１頁、１９５０年）、HamF12培地等を用い
ることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ま
しく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行
なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。

【０１３８】宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清
を含むGrace's培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第
８２巻、第８４０４頁、１９８５年）等が挙げられ、そ
のｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２
０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通
気や撹拌を行うこともできる。本発明のラットＣＴＧＦ
は、上述のような形質転換細胞（特に動物細胞または大
腸菌）を培養することにより、培養上清中に分泌させる
ことにより製造することができる。即ち、得られた培養
物を濾過または遠心分離等の方法で培養濾液（上清）を
得、該培養濾液から天然または合成蛋白質を精製並びに
単離するために一般に用いられる常法に従って該本発明
のラットＣＴＧＦを精製、単離する。

【０１３９】単離、精製方法としては、例えばアフィニ
ティーカラムクロマトグラフィーなどの特異的親和性を
利用する方法、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する
方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒド
ロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利
用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎
水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点
の差を利用する方法などが挙げられる。

【０１４０】一方、本発明のラットＣＴＧＦが培養され
た形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する
場合は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付し
て菌体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例
えば超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞
等の細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分
離やろ過などの方法で本発明のラットＣＴＧＦを含有す
る膜画分を得る。該膜画分をトライトン−Ｘ１００等の
界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を得る。そして、
当該粗溶液を先に例示したような常法を用いることによ
り、単離、精製することができる。

【０１４１】本発明における「トランスジェニックマウ
ス」は、上述のような方法に従って調製できるヒトＣＴ
ＧＦをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡまたはゲノミックＤ
ＮＡ）がマウスの内在性遺伝子座上にインテグレート
（integrate）されているトランスジェニックマウスマ
ウスであり、該トランスジェニックマウスは、体内にヒ
トＣＴＧＦを発現、分泌する。

【０１４２】該トランスジェニックマウスは、前述した
ようなトランスジェニック動物の製造において通常使用
されるような常法（例えば、最新動物細胞実験マニュア
ル、エル・アイ・シー発行、第７章、第３６１〜第４０
８頁、１９９０年を参照）に従って作製することが可能
である。具体的には、例えば、正常マウス胚盤胞（blas
tcyst）のから取得したＥＳ細胞（embryonic stem cel
l）を、該ヒトＣＴＧＦをコードする遺伝子が発現可能
なように挿入された発現ベクターで形質転換する。ヒト
ＣＴＧＦをコードする遺伝子が内在性遺伝子上にインテ
グレートされたＥＳ細胞を常法により選別する。次い
で、選別したＥＳ細胞を、別の正常マウスから取得した
受精卵（肺盤胞）にマイクロインジェクションする（Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, No.12, pp.7380-7
384, 1980；米国特許第4,873,191号公報）。該胚盤胞を
仮親としての別の正常マウスの子宮に移植する。そうし
て該仮親マウスから、キメラトランスジェニックマウス
が生まれる。該キメラトランスジェニックマウスを正常
マウスと交配させることによりヘテロトランスジェニッ
クマウスを得る。該ヘテロ（heterogeneic）トランスジ
ェニックマウス同士を交配することにより、メンデルの
法則に従って、ホモ（homogeneic）トランスジェニック
マウスが得られる。

【０１４３】

【実施例】以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに限
定されるものではないことは言うまでもない。

【０１４４】実施例１ ヒトＣＴＧＦに対するポリクロ
ーナル抗体の調製 ヒトＣＴＧＦの第242乃至第252番目のアミノ酸配列（Cy
s-Glu-Ala-Asp-Leu-Glu-Glu-Asn-Ile-Lys）にあたるペ
プチドを、ペプチドシンセサイザー（Applied Biosyste
ms社製）を用いて常法に従って合成した。免疫感作抗原
としては、該ペプチドをフロインド完全アジュバント
（Freuind's complete adjuvant）とともにエマルジョ
ン化したものを用いた。該ペプチド（0.32mg/kg）を、
ニュジーランドホワイトウサギ（ＮＺＷ、Simunek, In
c.製）の皮下に１日目（0.8mg）、１４日目（0.8mg）、
３５日目（0.8mg）及び４９日目（0.8mg）という間隔及
び量で投与した。該ペプチドを用いて、適宜、血清中の
抗体価を測定した。次いで、常法により血清を取得し、
該ペプチドをカップリングさせたアガロースを用いたア
フィニティークロマトグラフィーにより該血清から、ヒ
トＣＴＧＦに対するポリクローナル抗体（ＩｇＧ）を精
製した。ヒトＣＴＧＦに対する反応性を、ＥＬＩＳＡ
（Enzyme-linked immunosorbent assay）及びウェスタ
ンブロッティングにより確認した。

【０１４５】実施例２ 組換えヒトＣＴＧＦの調製 ＜２−１＞ヒト腎臓由来線維芽細胞株２９３での一過性
発現 ヒトＣＴＧＦをコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いて
常法により調製した。具体的には、ヒト軟骨腫細胞株Ｈ
ＣＳ２／８から調製したｃＤＮＡを鋳型とし、ヒトＣＴ
ＧＦのｃＤＮＡ（The Journal of Cell Biology, Vol.1
14, No.6, p.1287-1294, 1991）を基に設計したプライ
マーを用いて合成した。得られた翻訳領域を含むヒトＣ
ＴＧＦのｃＤＮＡをプラスミドｐｃＤＮＡ3.1(-)（Invi
trogen社製）に挿入し発現ベクターを作成し、エレクト
ロポレ−ションにより、該ベクターでヒト腎臓由来線維
芽細胞株293-T（ATCC CRL-1573）を形質転換した。形質
転換細胞を、無血清培地ASF104（味の素社製）中で３日
間培養し、組換えヒトＣＴＧＦを一過性に発現させた。
ヒトＣＴＧＦの発現を、実施例１で調製したポリクロー
ナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより確認
した。培養上清を回収し、硫酸アンモニウム沈澱法に供
した後、ヘパリンカラムクロマトグラフィーに供し、0.
3MのNaCl/PBSで洗浄した後、0.5MのNaCl/PBSで溶出し、
部分精製ヒトＣＴＧＦ画分を得た。

【０１４６】 ＜２−２＞ヒト上皮様細胞株Helaでの安定発現 実施例＜２−１＞と同様の方法により、ヒトＣＴＧＦを
コードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いて常法により調製
した。得られた翻訳領域を含むヒトＣＴＧＦのｃＤＮＡ
をプラスミドｐｃＤＮＡ3.1(-)（Invitrogen社製）に挿
入し発現ベクターを作成し、エレクトロポレ−ションに
より、該ベクターでヒト上皮様細胞株Hela（ATCC CCL-
2）を形質転換した。形質転換細胞を、Geneticin（0.8m
g/ml；GIBCO-BRL社製）及び10%ウシ胎児血清（fetal ca
lf serum）を含有するRPMI1640培地中で約２週間培養す
ることにより、Geneticin耐性形質転換細胞クローンを
選別した。選別された形質転換細胞を、無血清培地ASF1
04（味の素社製）中で培養し、組換えヒトＣＴＧＦをに
発現させた。ヒトＣＴＧＦの発現を、実施例１で調製し
たポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティン
グにより確認した。培養上清を回収し、硫酸アンモニウ
ム沈澱法に供した後、ヘパリンカラムクロマトグラフィ
ーに供し、0.3MのNaCl/PBSで洗浄した後、0.5MのNaCl/P
BSで溶出し、部分精製ヒトＣＴＧＦ画分を得た。

【０１４７】実施例３ 組換えマウスＣＴＧＦの調製 既報のマウスＣＴＧＦをコードするｃＤＮＡ配列（特開
平5-255397号公報、Cell Growth Differ., Vol.2, No.
5, p.225-233, 1991；FEBS Letters, Vol.327,No.2, p.
125-130, 1993；及びDNA Cell Biol., Vol.10, No.4,
p.293-300, 1991を参照。）に基づき、実施例２と同様
にして部分精製組換えマウスＣＴＧＦを調製した。

【０１４８】実施例４ 抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル
抗体並びに抗マウスＣＴＧＦモノクローナル抗体の調製 本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、実験医
学（別冊）細胞工学ハンドブック（黒木登志夫ら編集、
羊土社発行、第６６〜第７４頁、１９９２年）及び単ク
ローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発
行、１９９１年）等に記載されるような一般的方法に従
って調製した。免疫原としてのヒトＣＴＧＦは、実施例
２で２種類の方法を用いて調製した組換えヒトＣＴＧＦ
のいずれか、またはそれらの混合物を用いた。またマウ
スＣＴＧＦは、実施例３で調製した組換えマウスＣＴＧ
Ｆを用いた。被免疫動物としては、正常マウス（BALB
/cマウス、雌、４〜５週齢、静岡研究動物センター
（製））、正常ラット（Wistarラット、雌、４〜５週
齢、静岡研究動物センター（製））、正常ハムスター
（Armenianハムスター、雄、４〜５週齢、オリエンタル
酵母（製））並びに前述の方法を用いて製造したヒト
抗体産生トランスジェニックマウス（Nature Genetics,
Vol.7, p.13-21, 1994；Nature Genetics, Vol.15, p.
146-156, 1997；特表平4-504365号公報；特表平7-50913
7号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０
頁、１９９５年等に記載の方法に従って作製した。）を
用いた。特に断わりのない限り、いずれの動物を用いた
場合のモノクローナル抗体の作製も同一の方法を用い
た。また、細胞培養操作は、マルチウェルマイクロプレ
ートを用いて行った。

【０１４９】＜４−１＞ 抗ヒトＣＴＧＦモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマの調製 前記の正常マウス及びヒト抗体産生トランスジェニック
マウスの各々に、実施例２で調製した部分精製組換えヒ
トＣＴＧＦ（1μｇ/匹）を、完全フロインドアジュバン
ト（Complete Freund's Adjuvant）とともにフッドパッ
ド内注射することにより初回（０日）免疫した。初回免
疫から１週間毎に同組換えヒトＣＴＧＦをフッドパッド
内注射により４回以上追加免疫し、さらに以下に述べる
リンパ節細胞の取得の前々日にも同様にして最終免疫し
た。各々の動物から採取したリンパ節細胞とマウスミエ
ローマ細胞とを５：１で混合し、融合剤としてポリエチ
レングリコール4000またはポリエチレングリコール1500
（GIBCO社製）を用いて細胞融合させることによりハイ
ブリドーマを作製した。なお、正常マウスのリンパ節細
胞の細胞融合は、マウスミエローマＰＡＩ（JCR No.B01
13；Res. Disclosure Vol. 217, p.155, 1982）を用
い、ヒト抗体産生トランスジェニックマウスのリンパ節
細胞の細胞融合は、マウスミエローマP3/X63-AG8.653
（ATCC No.: CRL-1580）を用いた。ハイブリドーマの選
択は、１０％のウシ胎児血清（Fetal Calf Serum、ＦＣ
Ｓ）とアミノプテリンを含有するＨＡＴ含有ASF104培地
（味の素（製））中で培養することにより行った。各々
のハイブリドーマクローンの培養上清の、免疫原として
用いた組換えヒトＣＴＧＦに対する反応性を、後述する
ＥＬＩＳＡにより測定することにより各々の動物種につ
いて多数の抗体産生ハイブリドーマを得た。

【０１５０】正常マウス（マウス抗ヒトＣＴＧＦモノク
ローナル抗体）については、8-64-6、8-86-2、8-97-3、
8-149-3及び15-38-1と命名したクローンを得た（図
１）。ハイブリドーマクローン8-86-2及び8-64-6は共
に、平成９年１２月１８日付で通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東一丁目
1番3号）に国際寄託した（クローン8-86-2：国際寄託番
号FERM BP-6208；クローン8-64-6：国際寄託番号FERM B
P-6209）。ヒト抗体産生トランスジェニックマウス（ヒ
ト抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体）については、A
4.3、A11.1、A15.1、A29.6、B13.7、B22.2、B29.6、B3
5.1、C2.1、C26.11、C59.1、C114.4、M32.2、M33.3、M8
4.4、M107.2、M122、M124,6、M194.2、M244、M255、M26
8.1、M288.5、M291.2、M295.2、M315、M320.2、N45.2、
N50.1及びN60.1と命名したクローンを得た（図１及び図
２）。

【０１５１】ハイブリドーマクローンA11.1は、平成１
０年９月２５日付で通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（日本国茨城県つくば市東一丁目1番3号）に
国際寄託した（国際寄託番号FERM BP-6535）。また、ハ
イブリドーマクローンB22.2、M84.4及びM320.2は共に、
平成１０年１２月１５日付で通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東一丁目1
番3号）に国際寄託した（クローンB22.2：国際寄託番号
FERM BP-6598； クローンM84.4：国際寄託番号FERM BP
-6599； クローンM320.2：国際寄託番号FERM BP-660
0）。なお、上記に示したとおり、本実施例を含め以下
のいずれの実施例中、並びに当該実施例における試験結
果として示した図面または表中においては、本発明のヒ
トモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクロー
ンを、記号を用いて命名した。当該記号中のピリオド記
号より前に記載したアルファベットと数字は合わせて親
クローンの名前を表す。また、上記各々の親クローンか
らサブクローニングされたハイブリドーマクローンは、
その親クローン名の直後のピリオド記号の次にさらなる
番号を付加することによって命名した。なお、本実施例
を含め以下のいずれの実施例中、並びに当該実施例にお
ける試験結果として示した図面または表中においては、
当該サブクローニングによる番号を省略して記載する場
合があるが、それらのいずれも図１または図2に記載し
たクローンと同一の細胞である。

【０１５２】＜４−２＞ 抗マウスＣＴＧＦモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマの調製 前記の正常ラット及び正常ハムスターに、実施例３で調
製した部分精製組換えマウスＣＴＧＦ（2μｇ/匹）を、
完全フロインドアジュバント（Complete Freund's Adju
vant）とともにフッドパッド内注射することにより初回
（０日）免疫した。初回免疫から一週間毎に４回以上同
組換えマウスＣＴＧＦをフッドパッド内注射により追加
免疫し、さらに以下に述べるリンパ節細胞の取得の前々
日にも同様にして最終免疫した。各々の免疫感作動物の
膝窩リンパ節細胞を常法に従って外科手術により採取し
た。各々の動物から採取したリンパ節細胞とマウスミエ
ローマ細胞ＰＡＩ（JCR No.B0113；Res. Disclosure Vo
l. 217, p.155, 1982）とを５：１で混合し、融合剤と
してポリエチレングリコール4000またはポリエチレング
リコール1500（GIBCO社製）を用いて細胞融合させるこ
とによりハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの
選択は、１０％のウシ胎児血清（Fetal Calf Serum、Ｆ
ＣＳ）とアミノプテリンを含有するHAT含有ASF104培地
（味の素（製））中で培養することにより行った。

【０１５３】各々のハイブリドーマクローンの培養上清
の、免疫原として用いた組換えマウスＣＴＧＦに対する
反応性を、後述するＥＬＩＳＡにより測定することによ
り各々の動物種について多数の抗体産生ハイブリドーマ
を得た。正常ラット（ラット抗マウスＣＴＧＦモノクロ
ーナル抗体）については、13-51-2、17-132、23-96、24
-53、24-67、25-91、25-101、25-256、25-338、25-410
及び25-463と命名したクローンを得た（図１）。正常ハ
ムスター（ハムスター抗マウスＣＴＧＦモノクローナル
抗体）については、2-228-1と命名したクローンを得た
（図１）。

【０１５４】＜４−３＞ モノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマのELISAによるスクリーニング 実施例＜４−１＞及び＜４−２＞で行ったELISAは、下
記のとおりである。実施例２で調製した組換えヒトＣＴ
ＧＦ（0.2μｇ/ウェル）または実施例３で調製した組換
えマウスＣＴＧＦ（0.2μｇ/ウェル）を、ＥＬＩＳＡ用
９６穴マイクロプレート（コーニング（Corning）社
製）の各ウェルに加え、室温で２時間インキュベート
し、組換えヒトＣＴＧＦまたは組換えマウスＣＴＧＦを
マイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て、
各ウェルに、ブロッキング試薬（200μｌ、３％ＢＳＡ
含有リン酸緩衝液）を加え室温で２時間インキュベート
し、ＣＴＧＦが結合していない部位をブロックした。各
ウェルを、0.1%のTween20を含有するリン酸緩衝液200μ
lで３回洗浄した。このようにして、各ウェルを組換え
ヒトＣＴＧＦまたは組換えマウスＣＴＧＦでコーティン
グしたマイクロプレートを作製した。各ウェルに、各々
のハイブリドーマの培養上清（100μl）を加え、４０分
間反応させた後、各ウェルを、0.1%のTween20を含有す
るリン酸緩衝液200μlで３回洗浄した。

【０１５５】次いで、正常マウス由来のモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマの培養上清を加えたウェルには
ビオチンで標識したヒツジ抗マウスイムノグロブリン抗
体（50μl、アマシャム社製）を、正常ラット由来のモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清を加え
たウェルにはビオチンで標識したヒツジ抗ラットイムノ
グロブリン抗体（50μl、アマシャム社製）を、正常ハ
ムスター由来のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
の培養上清を加えたウェルにはビオチンで標識したヤギ
抗ハムスターイムノグロブリン抗体（50μl、Cedarlane
社製）を、またヒト抗体産生トランスジェニックマウス
由来のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上
清を加えたウェルにはビオチンで標識したヤギ抗ヒトイ
ムノグロブリン抗体（50μl、アメリカンコーレックス
社製）を加え、室温下で１時間インキュベートした。

【０１５６】マイクロプレートを、0.1%Tween20を含有
するリン酸緩衝液で洗浄後、ウシ血清アルブミン（BS
A、1mg/ml）を含有する0.5MのNaClと20mMのHEPESからな
る溶液（pH7.0）で1000倍に希釈したストレプトアビジ
ン−β−ガラクトシダーゼ（Streptoavidin-β-galacto
sidase、50μl、Gibco BRL社製））を各ウェルに加え、
室温下で３０分間インキュベートした。次いで、マイク
ロプレートを、0.1%Tween20を含有するリン酸緩衝液で
洗浄後、1mg/mlのBSAを含有する100mMのNaCl、1mMのMgC
l₂及び10mMのリン酸緩衝液からなる溶液（pH7.0）で希
釈した１％の４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−
ガラクトシド（4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactosi
de、50μl、シグマ（Sigma）社製）を各ウェルに加え、
室温下で１０分間インキュベートした。各ウェルに、1M
のNa₂CO₃（100μl）を加え、反応を止めた。波長460nm
（励起：355nm）での蛍光強度をフルオロスキャンIIマ
イクロプレートフルオロメーター（Fluoroscan II micr
oplate fluorometer、フロー研究所（Flow Laboratorie
s Inc.）（製））で測定した。

【０１５７】＜４−４＞ モノクローナル抗体の大量調
製 ＩＣＲヌードマウス（雌、７〜８週齢、チャールズリバ
ー社製）に、前記の各々のハイブリドーマクローン（各
々１０⁶〜１０⁷個／0.5ml／マウス）を、腹腔内注射し
た。１０〜２０日後、マウスを麻酔下で開腹し、常法に
より採取した腹水から各々のモノクローナル抗体を大量
に調製した。

【０１５８】＜４−５＞ モノクローナル抗体の精製 前記＜４−４＞で取得した各々のモノクローナル抗体腹
水を遠心して得た遠心上清を、0.06Mの酢酸緩衝液（pH
4.0）で３倍に希釈し、１Ｎの塩酸を加えｐＨを4.8に調
整した。次いで、カプリル酸（Caprylic acid、和光純
薬工業製）を、腹水１ｍｌに対して0.033mlになるよう
に室温下で撹拌しながら少しずつ加え、撹拌しながら３
０分間反応させた。次いで、遠心分離（10,000rpm、２
０分間）し、抗体以外の蛋白を沈殿させた。遠心上清を
回収し、フィルター（ミリポア社製）で濾過し、白沈を
除いた。得られた濾液を、リン酸緩衝液で透析（２時
間）した。透析後、硫酸アンモニウム（26.2g/100ml）
を撹拌しながら少しずつ加え、撹拌しながら４℃で120
分間反応させた。次いで、遠心分離（10,000ｒｐｍ、２
０分間）して、沈殿物を回収した。回収した沈殿物に、
リン酸緩衝液を加え、リン酸緩衝液で透析（４℃、２４
時間）し、各々の精製モノクローナル抗体を得た。

【０１５９】＜４−６＞ アイソタイプの決定 マウスモノクロ−ナル抗体アイソタイプ決定用キット
（アマシャム社製）を用い、該キットに添付の実験操作
プロトコールに従って操作を行い、前述の正常マウス由
来の抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体（8-64-6、8-86
-2、8-97-3、8-149-3及び15-38-1）の各々のアイソタイ
プを決定した。いずれもＩｇＧ１／κであることが確認
された（図１）。ヒトモノクロ−ナル抗体アイソタイプ
決定用キット（アメリカン・コーレックス社製）を用
い、該キットに添付の実験操作プロトコールに従って操
作を行い、前述のヒト抗体産生トランスジェニックマウ
ス由来のヒト抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体（A4.
3、A11.1、A15.1、A29.6、B13.7、B22.2、B29.6、B35.
1、C2.1、C26.11、C59.1、C114.4、M32.2、M33.3、M84.
4、M107.2、M122、M124,6、M194.2、M244、M255、M268.
1、M288.5、M291.2、M295.2、M315、M320.2、N45.2、N5
0.1及びN60.1）の各々のアイソタイプを決定した。いず
れもＩｇＧ２／κであることが確認された（図１及び図
２）。

【０１６０】＜４−７＞ アフィニティーカラムの作製 ＮＨＳ活性化ハイトラップカラム（HiTrap-NHS-activat
ed Sepharose HP、5ml、ファルマシアバイオテク社製）
を用い、添付のプロトコールに従ってアフィニティーカ
ラムを作製した。具体的には、下記のとおりである。0.
5MのNaClを含有する0.2Mの炭酸水素ナトリウム溶液（pH
8.3）中に溶解した実施例＜４−５＞で調製したモノク
ローナル抗体8-86-2（10mg／mlセファロース）を、ＮＨ
Ｓ活性化ハイトラップカラムに注入した。２０℃で４５
分間反応させ、モノクローナル抗体8-86-2をＮＨＳ活性
化セファロースに固定化した。モノクローナル抗体8-86
-2は、ヒトＣＴＧＦ、マウスＣＴＧＦ及びラットＣＴＧ
Ｆのいずれにも高い反応性を有するため、この抗体を用
いたアフィニティーカラムを作製することにより、ヒト
ＣＴＧＦ、マウスＣＴＧＦ及びラットＣＴＧＦのいずれ
も精製することが可能である。

【０１６１】＜４−８＞ アフィニティークロマトグラ
フィーによる哺乳動物ＣＴＧＦの精製 ヒトＣＴＧＦを発現する形質転換Hela細胞（実施例＜２
−２＞）、マウスＣＴＧＦを発現する形質転換Hela細胞
（実施例３）及びラットＣＴＧＦを発現する形質転換He
la細胞（実施例＜１１−２＞）の各々の培養上清を回収
し、ヘパリンカラムクロマトグラフィーに供し、0.3Mの
NaCl/PBSで洗浄した後、0.7MのNaCl/PBSで溶出し、ヒ
ト、マウス及びラットのＣＴＧＦ各々の粗精製画分を得
た。各々の粗精製物を、実施例＜４−７＞で作製した抗
ＣＴＧＦ抗体8-86-2を固定化したアフィニティーカラム
に加え、リン酸緩衝液で洗浄した後、0.1Mのグリシン緩
衝液（pH2.5）で溶出し、0.75MのTris緩衝液（pH9.0）
で中和した。集めた溶出物をリン酸緩衝液で透析し、高
純度精製された組換えヒトＣＴＧＦ、マウスＣＴＧＦ及
びラットＣＴＧＦを得た。各々の精製組換えＣＴＧＦ
を、10乃至20%の濃度勾配のドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。分離し
たバンドを銀染色した結果、ヒト、マウス及びラットの
ＣＴＧＦのいずれについても約38kDa付近にバンドが検
出された（図３）。

【０１６２】 ＜４−９＞ 精製ＣＴＧＦの細胞増殖促進活性の試験 実施例＜４−８＞で精製した各種組換えＣＴＧＦが生物
活性を保持しているか否かを確認するため、各々の精製
ＣＴＧＦの細胞増殖促進活性を調べた。９６マイクロプ
レートを用いて、ラット腎臓線維芽細胞NRK-49F（ATCC
CRL-1570；２×１０³／ウェル）を、１０％ウシ胎児血
清（ＦＣＳ）含有ＤＭＥＭ培地中で３日間培養した。培
養上清を取り除き、ＤＭＥＭ培地で１回洗浄後、ＤＭＥ
Ｍ培地中で１日培養した。次いで、各々の培養系に各種
濃度（100、50、25、12.5、6.3及び3.1ng/ml）の精製組
換えＣＴＧＦを添加して２日間培養した後、［³H]-Thym
idine（3.7kBq/ウェル）を添加してさらに６時間培養し
た。細胞を回収（ハーベスト）して、細胞内に取り込ま
れた［³H]-Thymidineの量を液体シンチレーションカウ
ンター（ベックマン社製）にて測定した。なお、対照と
して、ＣＴＧＦを添加せず同様にして培養した場合の［
³H]-Thymidineの取込みを測定した。結果を図４に示
す。ヒト、マウス及びラットのいずれの精製組換えＣＴ
ＧＦも、濃度依存的な細胞増殖促進活性を示し、いずれ
の組換えＣＴＧＦも生物学的機能を保持していることが
示された。

【０１６３】＜４−１０＞ 交叉反応性 前述のようにして調製した種々の抗ヒトＣＴＧＦモノク
ローナル抗体（10μg/ml)及び抗マウスＣＴＧＦモノク
ローナル抗体（10μg/ml)のヒトＣＴＧＦ、マウスＣＴ
ＧＦ及びラットＣＴＧＦの各々に対する反応性を、実施
例＜４−３＞に述べたELISAと同様にして調べた。な
お、本試験では、実施例＜４−７＞で作製したアフィニ
ティーカラムを用いて精製したヒト、マウス及びラット
の精製組換えＣＴＧＦの各々を、（Ａ）100、30及び10n
g/well、または（Ｂ）100、10及び1ng/wellの濃度でコ
ーティングしたマクロプレートを用いた。なお、（Ｂ）
の試験においては、陰性対照試験として、前述したヒト
抗体産生トランスジェニックマウスに、ＫＬＨ(keyhole
limpet hemocyanin、ピアース(PIERCE)社製）を免疫し
て調製した抗KLHヒトモノクローナル抗体を用いて、前
記と同様にして試験を行った。濃度（Ａ）での試験結果
を図５乃至図７に、また濃度（Ｂ）での試験結果を図８
乃至図１０に示す。また、図５乃至図１０に示した結果
を、図１及び図２の「交叉反応性」の欄に簡略化して示
した。図１の「交叉反応性」の欄においては、左から順
に、コーティング濃度が、１００、３０及び１０ｎｇ／
wellでの結果を示す。各濃度における反応性は、蛍光強
度が1000以上の場合は「○」を、500以上1000未満の場
合は「△」を、また500未満の場合は「×」を付した。
図２の「交叉反応性」の欄においては、左から順に、コ
ーティング濃度が、100、10及び１ng/wellでの結果を示
す。各濃度における反応性は、蛍光強度が1000以上の場
合は「○」を、500以上1000未満の場合は「△」を、ま
た500未満の場合は「×」を付した。本発明のモノクロ
ーナル抗体は、様々な交叉反応性の特徴を有することが
示された。

【０１６４】 ＜４−１１＞ ＣＴＧＦと種々細胞との結合の阻害活性 最近の研究によりＣＴＧＦが細胞接着に関与することが
明らかになっている（Exp. Cell. Res., Vol.233, p.63
-77, 1997）。そこで、前記のようにして調製した種々
のモノクローナル抗体がＣＴＧＦの機能を阻害する活性
（中和活性）を有するか否かを、ＣＴＧＦが媒介する細
胞接着作用に対する阻害効果を指標に調べた。試験は下
記<4-11-1>乃至<4-11-3>に記載する３種類の方法を用い
た。

【０１６５】<4-11-1> ヒト腎臓由来線維芽細胞株293-
Tとの結合の阻害 実施例＜４−３＞と同様にして作製した組換えヒトＣＴ
ＧＦ固定化マイクロプレート（コ−ティング濃度：0.5
μg/well）の各ウェルに、前記のようにして調製したヒ
トＣＴＧＦに反応性を有する各種のモノクローナル抗体
（0.5μg/well）を加えた。また、実施例＜４−３＞と
同様にして作製した組換えマウスＣＴＧＦ固定化マイク
ロプレート（コ−ティング濃度：0.5μg/well）の各ウ
ェルに、前記のようにして調製したマウスＣＴＧＦに反
応性を有する各種のモノクローナル抗体（0.5μg/wel
l）を加えた。

【０１６６】各プレートの上清を除いた後、各ウェルに
BCECF（2',7'-bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluor
escein tetraacetoxymethyl ester、モレキュラープロ
ーブ社）で標識したヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（A
TCC CRL-1573）（５×１０⁴／ウェル）を加え、４℃で
１時間静置した。浮遊細胞を除去し、１％NP-40含有リ
ン酸緩衝液（100μl）を加えて、プレートに接着してい
る細胞を可溶化した。細胞溶解により培養上清中に放出
されるBCECFの蛍光強度をフルオロスキャンIIマイクロ
プレートフルオロメーター（Fluoroscan II microplate
fluorometer、フロー研究所（Flow Laboratories In
c.）（製））を用いて測定した。なお、対照試験とし
て、いずれの抗体も加えないで上記と同様にして試験を
行った。結果を図１１に示す。また、図１１の結果を図
１の「293細胞の結合阻害活性」の欄に簡略化して示し
た。図１の当該欄においては、「○」は有意差をもって
細胞の接着を阻害する活性を示したこと示し、また
「×」印は、該活性を示さなかったことを示す。

【０１６７】<4-11-2> ラット腎臓由来線維芽細胞株NR
K-49Fとの結合の阻害 実施例＜４−３＞と同様にして作製した組換えヒトＣＴ
ＧＦ固定化マイクロプレート（コ−ティング濃度：１μ
g/well）の各ウェルに、前記のようにして調製したヒト
ＣＴＧＦに反応性を有する各種のヒトモノクローナル抗
体（最終濃度：20、６または２μg/ml）を加えた。次い
で、各ウェルにBCECF（2',7'-bis(2-carboxyethyl)-5
(6)-carboxyfluorescein tetraacetoxymethyl ester、
モレキュラープローブ社）で標識したラット腎臓由来線
維芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-1570）（１×１０⁴／ウ
ェル）を加え、４℃で１時間静置した。浮遊細胞を除去
し、１％NP-40含有リン酸緩衝液（100μl）を加えて、
プレートに接着している細胞を可溶化した。細胞溶解に
より培養上清中に放出されるBCECFの蛍光強度をフルオ
ロスキャンIIマイクロプレートフルオロメーター（Fluo
roscan II microplate fluorometer、フロー研究所（Fl
ow Laboratories Inc.）（製））を用いて測定した。な
お、対照試験として、いずれの抗体も加えないで上記と
同様にして試験を行った。陰性対照試験として、前述し
たヒト抗体産生トランスジェニックマウスに、ＫＬＨ(k
eyhole limpet hemocyanin、ピアース(PIERCE)社製）を
免疫して調製した抗KLHヒトモノクローナル抗体を用い
て、前記と同様にして試験を行った。また、別の対照試
験として、ＣＴＧＦをコーティングしないマイクロプレ
ートウェルを用いて、且ついずれの抗体も加えないで前
記と同様にして試験を行った。結果を図１２に示す。な
お、結果は、求められた蛍光強度の値を基に、細胞の結
合率（％）に換算して示した。また、図１２の結果を図
２の「NRK-49F細胞の結合阻害活性」の欄に簡略化して
示した。図２の当該欄における「○」印は、有意差をも
って細胞の接着を阻害したことを示し、「×」印は、当
該阻害活性が弱いかまたは阻害活性を示さなかったこと
を示す。

【０１６８】<4-11-3> 種々細胞との結合の阻害 実施例＜４−３＞と同様にして作製した組換えヒトＣＴ
ＧＦ固定化マイクロプレート（コ−ティング濃度：１μ
g/well）の各ウェルに、前記のようにして調製したヒト
ＣＴＧＦに反応性を有する各種のヒトモノクローナル抗
体（最終濃度：20μg/ml）を加えた。６０分静置後、各
プレートの上清を除いた後、各ウェルにBCECF（2',7'-b
is(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein tetraac
etoxymethyl ester、モレキュラープローブ社）で標識
した下記細胞（各々１×１０⁴／ウェル）を加え、４℃
で１時間静置した。細胞は下記を用いた。 （１）ヒト肺由来繊維芽細胞（NHLF2837；Clonetics
製）。 （２）ヒト骨肉腫由来細胞株MG-63（ATCC CRL-1427）。 （３）ラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-
1570）。 浮遊細胞を除去し、１％NP-40含有リン酸緩衝液（100μ
l）を加えて、プレートに接着している細胞を可溶化し
た。細胞溶解により培養上清中に放出されるBCECFの蛍
光強度をフルオロスキャンIIマイクロプレートフルオロ
メーター（Fluoroscan II microplate fluorometer、フ
ロー研究所（Flow Laboratories Inc.）（製））を用い
て測定した。なお、対照試験として、いずれの抗体も加
えないで上記と同様にして試験を行った。陰性対照試験
として、前述したヒト抗体産生トランスジェニックマウ
スに、ＫＬＨ(keyhole limpet hemocyanin、ピアース(P
IERCE)社製）を免疫して調製した抗KLHヒトモノクロー
ナル抗体を用いて、前記と同様にして試験を行った。ま
た、別の対照試験として、ＣＴＧＦをコーティングしな
いマイクロプレートウェルを用いて、且ついずれの抗体
も加えないで前記と同様にして試験を行った。結果を図
１３に示す。なお、結果は、求められた蛍光強度の値を
基に、細胞の結合率（％）に換算して示した。

【０１６９】＜４−１２＞ ウサギ組織への交叉反応性 高脂血症モデルウサギWHHL（オリエンタル酵母社製）の
動脈硬化巣を外科的手術により採取し、常法により動脈
硬化症部位の動脈の凍結切片を調製した。各切片を、下
記に述べるようにベクタステインエリート（Vectastain
Elite）ＡＢＣキット（フナコシ株式会社製）を用いて
染色した。該切片をアセトンで１〜２分間固定し、乾燥
後、希釈血清（PBS（10ml）／血清（150μl））で３０
分間湿潤させた。各切片をＰＢＳで洗浄後、１次抗体と
して前述のようにして調製した正常マウス由来の抗ヒト
ＣＴＧＦモノクローナル抗体（クローン：8-86-2及び8-
149-3）、正常ラット由来の抗マウスＣＴＧＦモノクロ
ーナル抗体（クローン：13-51-2）またはヒト抗体産生
トランスジェニックマウス由来の抗ヒトＣＴＧＦモノク
ローナル抗体（クローン：A4.3、A11.1、A29.6、B29.
6、B35.1、C26.11及びC114.4）（各々１０μｇ／ｍｌあ
るいはハイブリドーマ培養上清）を加え、４０分間静置
した。

【０１７０】次いで、PBSで洗浄し、ビオチン化二次抗
体溶液（100μｌ）を加え、３０分間静置した。なお、
一次抗体として正常マウス由来の抗ヒトＣＴＧＦモノク
ローナル抗体を用いた場合は、ビオチン標識ウマ抗マウ
スイムノグロブリン抗体を、一次抗体として正常ラット
由来の抗マウスＣＴＧＦモノクローナル抗体を用いた場
合は、ビオチン標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン抗
体を、また一次抗体としてヒト抗体産生トランスジェニ
ックマウス由来の抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体を
用いた場合にはビオチン標識ヤギ抗ヒトイムノグロブリ
ン抗体を用いた。各切片を、メタノ−ル中に溶解した３
％過酸化水素溶液中で１０分間静置し、ＰＢＳで洗浄し
た後、100μlのアビジン−ペルオキシダ−ゼ溶液（PBS
（5ml）／ペルオキシダ−ゼ標識アビジンＤＨ（100μ
l）／ビオチン化過酸化水素Ｈ（100μl））を加え３０
分間静置した。

【０１７１】ＰＢＳで洗浄後、ＤＡＢ溶液（水（5ml）
／緩衝溶液（100μl）／ＤＡＢ（ジアミノベンジジンテ
トラヒドロクロライド）溶液（200μl）／過酸化水素溶
液（100μl））を加え、２〜１０分間静置した。冷水で
５分間洗浄した後、ギムザ（Giemsa）染色法に供し封入
処理を行った。なお、１次抗体として、ＣＴＧＦに対す
る反応性を有さず、且つアイソタイプの一致したモノク
ローナル抗体を用いて前記と同様に染色したものを対照
とした。染色、封入された各組織切片を100及び200倍の
倍率にて顕鏡し、結果を図１４に示した。また、図１４
の結果を図１の「WHHLウサギの動脈硬化巣組織への反応
性」の欄に簡略化して示した。図１の当該欄において
は、組織切片が染色された場合は「○」を、組織切片の
染色が弱いかまたは染色されなかった場合は「×」を付
した。ヒト抗体産生トランスジェニックマウス由来の抗
ヒトＣＴＧＦヒトモノクローナル抗体であるクローンA
4.3、A11.1、A29.6、C26.11及びC114.4、並びに正常ラ
ット由来の抗マウスＣＴＧＦモノクローナル抗体である
クローン13-51-2は、ウサギの動脈硬化巣組織に反応性
を示した。

【０１７２】 ＜４−１３＞ ＣＴＧＦ刺激による細胞増殖の阻害活性 前記実施例＜４−９＞の試験で示されたように、ＣＴＧ
Ｆは、各種細胞（例えば、腎臓や肺等の種々組織に由来
する繊維芽細胞、各種腫瘍細胞、及び血管内皮細胞な
ど）の細胞増殖を誘導する。本試験では、本発明のモノ
クローナル抗体の、そのようなＣＴＧＦの刺激による細
胞増殖に対する阻害効果を下記のようにして調べた。

【０１７３】 <4-13-1> ＣＴＧＦを含む細胞培養液の調製 ヒト胎児皮膚由来繊維芽細胞（Neonatal human dermal
fibroblast, NHDF；Becton Dickinson製）をシャーレで
培養し、ウシ胎児血清（FCS）を含まないDMEM培養液で
２回洗浄後、ヒトTGF-β（Transforming growth facto
r；１ng/ml，R&DSystems製）を含有するDMEM培地を加え
さらに１日培養した。培養上清を回収し、ヘパリンカラ
ム（HiTrap、Pharmacia Biotech製）に添加した。カラ
ムを0.2MのNaCl/PBSで洗浄後、0.6MのNaCl/PBSでカラム
にトラップされた因子を溶出させた。溶出液をPBSで透
析し、以下の細胞増殖アッセイに用いた。ＣＴＧＦはヘ
パリン結合性であることから、ヘパリンカラムを用いる
ことによりＣＴＧＦを部分精製することができる。実施
例１で調製したヒトＣＴＧＦに対するウサギポリクロー
ナル抗体を用いて、常法に従ってウェスタンブロッティ
ングを行い、上記で得たサンプル中にＣＴＧＦが含まれ
ていることを確認した。なお、対照試験には、ヒトCTGF
で免疫する前に取得したウサギ（実施例１に同じ）の血
清を用いた。結果を図２４に示す。

【０１７４】 <4-13-3> 精製CTGFによる細胞増殖促進活性 ９６穴マイクロタータープレートにラット腎臓由来繊維
芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-1570、１×１０⁴個/well）
を加え、１日培養した。次いで、プレートをFCSを含ま
ないDMEM培地で２回洗浄した後、さらに１日培養した。
次いで、前記<4-13-1>で調製したＣＴＧＦサンプル（0.
6MのNaClによる溶出画分のDMEM培地による20倍希釈物）
を各ウェルに加え１８時間培養した。次いで、各ウェル
に、［³H]-Thymidine（3.7kBq/ウェル）を添加してさら
に６時間培養した。細胞を回収（ハーベスト）して、細
胞内に取り込まれた［³H]-Thymidineの量を液体シンチ
レーションカウンター（ベックマン社製）にて測定し
た。なお、陽性対照試験として、精製CTGFの代りにPDGF
（血小板由来増殖因子）を用いて上記と同様にして試験
を行った。また、陰性対照試験として、ＣＴＧＦサンプ
ルを添加せず上記と同様にして試験を行った。結果を図
２５に示す。前記で得た精製CTGFがラット腎臓由来繊維
芽細胞株NRK-49Fの増殖を濃度依存的に促進することが
示された。

【０１７５】<4-13-3> 細胞増殖の阻害活性 ９６穴マイクロタータープレートにラット腎臓由来繊維
芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-1570、１×１０⁴個/well）
を加え、１日培養した。次いで、プレートをFCSを含ま
ないDMEM培地で２回洗浄した後、さらに１日培養した。
次いで、前記<4-13-1>で調製したＣＴＧＦサンプル（0.
6MのNaClによる溶出画分のDMEM培地による20倍希釈物）
及び前記で調製した本発明の抗ヒトＣＴＧＦヒトモノク
ローナル抗体（最終濃度：20、２または0.2μg/ml）と
を３０分間反応させた混合物を各ウェルに加え１８時間
培養した。次いで、各ウェルに、［³H]-Thymidine（3.7
kBq/ウェル）を添加してさらに６時間培養した。細胞を
回収（ハーベスト）して、細胞内に取り込まれた［³H]-
Thymidineの量を液体シンチレーションカウンター（ベ
ックマン社製）にて測定した。なお、陽性対照試験とし
て、いずれの抗体も加えないで上記と同様にして試験を
行った。また、陰性対照試験として、ＣＴＧＦサンプル
及びいずれの抗体をも添加せず上記と同様にして試験を
行った。結果を図１５及び図１６に示す。また、前記と
同様の複数回の試験を行った結果（図１５及び図１６に
示した本試験の結果を含む）を、図２の「NRK-49F細胞
の増殖阻害活性」の欄に簡略化して示した。図２の当該
欄における「○」は、有意差をもって細胞の増殖を阻害
する活性を示したことを意味する。本発明の抗ヒトCTGF
ヒトモノクローナル抗体は、ヒト繊維芽細胞の増殖を有
意に抑制または阻害することが示された。

【０１７６】＜４−１４＞ エピトープマッピング 本発明の抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体が特異的に
結合するヒトＣＴＧＦの構造中の部位（エピトープ）を
解析する目的で下記の試験を行った。本試験は、後述の
実施例５に詳述する２種類のモノクローナル抗体を用い
た本発明のサンドイッチELISAを用いて行った。具体的
には下記の工程に従った。 （工程１）後述の実施例<5-1>と同様にして図２に記載
される各々の抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体（0.3
μg/50μl/well）が固定化された抗体固定化マイクロプ
レートを作製した。

【０１７７】（工程２）後述の実施例<5-2>と同様にし
て下記Ａ乃至Ｄの各々の本発明のモノクローナル抗体を
標識し、標識モノクローナル抗体を作製した。 ［抗体Ａ］ヒトCTGFに反応性を有するマウスモノクロー
ナル抗体8-64-6（国際寄託番号FERM BP-6209で識別され
るハイブリドーマに由来する。） ［抗体Ｂ］抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体A11.1
（国際寄託番号 FERM BP-6535で識別されるハイブリド
ーマに由来する。） ［抗体Ｃ］抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体C26.11
（配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むアミノ酸
配列を有する重鎖、並びに配列番号１８に記載されるア
ミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する軽鎖とからな
る。） ［抗体Ｄ］抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体C59.1
（配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を含むアミノ
酸配列を有する重鎖、並びに配列番号２０に記載される
アミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する軽鎖とからな
る。） （工程３）後述の実施例<5-3>と同様にしてELISAを行っ
た。即ち、工程１で作製した抗体固定化マイクロプレー
トの各々に、前記実施例で調製した精製組換えヒトCTGF
（15ng/well）を加えて抗原抗体反応を進めた後、工程
２で調製した各々の標識モノクローナル抗体（0.1μl/5
0μl/well）を加えて反応させた。後述の実施例<5-3>に
記載の同様の操作の後、各ウェルに反応停止液を加えて
反応を停止させ、波長460nm（励起：355nm）での蛍光強
度をフルオロメーターにより測定した。

【０１７８】求められる蛍光強度の値は、マイクロプレ
ートに固定化したモノクローナル抗体が結合するヒトCT
GF上の部位（エピトープ）と標識されたモノクローナル
抗体が結合するヒトCTGF上の部位（エピトープ）の異同
に依存して、下記（１）乃至（３）のような結果になる
ものと考えられた。 （１） マイクロプレートに固定化したモノクローナル
抗体が結合するヒトCTGF上の部位（エピトープ）と標識
されたモノクローナル抗体が結合するヒトCTGF上の部位
（エピトープ）が同一であるならば、マイクロプレート
に固定化したモノクローナル抗体とヒトCTGFとで形成さ
れる抗原抗体複合体に、後に加えた標識モノクローナル
抗体が結合し得ないことから、工程３で測定される蛍光
強度の値は極めてゼロに近いこととなる。 （２） マイクロプレートに固定化したモノクローナル
抗体が結合するヒトCTGF上の部位（エピトープ）と標識
されたモノクローナル抗体が結合するヒトCTGF上の部位
（エピトープ）が近い位置に存在するならば、マイクロ
プレートに固定化したモノクローナル抗体とヒトCTGFと
で形成される抗原抗体複合体への、後に加えた標識モノ
クローナル抗体の結合が多少の立体障害を受けることか
ら、工程３で測定される蛍光強度の値は低いこととな
る。 （３） マイクロプレートに固定化したモノクローナル
抗体が結合するヒトCTGF上の部位（エピトープ）と標識
されたモノクローナル抗体が結合するヒトCTGF上の部位
（エピトープ）が異なるならば、マイクロプレートに固
定化したモノクローナル抗体とヒトCTGFとで形成される
抗原抗体複合体に、後に加えた標識モノクローナル抗体
が結合し得えることから、工程３で測定される蛍光強度
の値は有意に高い値となる。

【０１７９】本試験の結果は、上記の推定に合致するも
のであった。結果を図２の「エピトープマッピング」の
欄に示した。なお、以下に図２における当該欄に示した
各々のアルファベットの意味を例示的に示す。 「（Ａ）」：前記で標識抗体として用いた「抗体Ａ」で
あることを意味する。 「（Ｂ）」：前記で標識抗体として用いた「抗体Ｂ」で
あることを意味する。 「（Ｃ）」：前記で標識抗体として用いた「抗体Ｃ」で
あることを意味する。 「（Ｄ）」：前記で標識抗体として用いた「抗体Ｄ」で
あることを意味する。 「Ａ」：「抗体Ａ」のエピトープと同一またはほぼ同一
のエピトープであることを意味する。 「Ｂ」：「抗体Ｂ」のエピトープと同一またはほぼ同一
のエピトープであることを意味する。 「Ｃ」：「抗体Ｃ」のエピトープと同一またはほぼ同一
のエピトープであることを意味する。 「Ｄ」：「抗体Ｄ」のエピトープと同一またはほぼ同一
のエピトープであることを意味する。 「−」：「抗体Ａ」、「抗体Ｂ」、「抗体Ｃ」または
「抗体Ｄ」のいずれ抗体のエピトープとも異なるエピト
ープであることを意味する。 「Ｂ／Ｃ」：「抗体Ｂ」のエピトープ及び／または「抗
体Ｃ」のエピトープと同一またはほぼ同一のエピトープ
であることを意味する。 「Ａ-／Ｂ」：「抗体Ａ」のエピトープに近い位置のエ
ピトープであり、且つ「抗体Ｂ」のエピトープと同一ま
たはほぼ同一のエピトープであることを意味する。 上記以外の記載方法も、上記と同様な意味を有するもの
である。

【０１８０】＜４−１５＞ 腎臓疾患及び組織繊維症に
対する治療効果 本発明の抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体の各種疾患
に対する治療効果を当該疾患のマウスモデルを用いて調
べた。本試験で用いたマウスモデルは、下記の疾患ある
いは病的状態のいずれにおいても見られる病理学的特徴
の一部または臨床所見の一部を呈する疾患モデルである
ことから、本試験で得られる治療効果は、下記全ての疾
患または病的状態の治療効果を代表するものである。腎
臓疾患（腎不全、腎炎、腎繊維症など）、各種組織繊維
症（腎繊維症、肺繊維症、肝臓組織での繊維症、皮膚組
織での繊維症など、関節リウマチに伴う滑膜組織での繊
維症、各種癌に伴う繊維症）、皮膚疾患（強皮症、乾
癬、アトピーなど）、肝臓疾患（肝硬変、肝臓組織での
繊維症、肝炎など）、肺疾患（肺繊維症、肺炎など）、
関節リウマチ、及び動脈硬化症など。

【０１８１】<4-15-1> 疾患マウスモデルの作製 B6C3F1マウス（雄、７週齢、各群６匹、SLC製）を、ペ
ントバルビタール（Pentobarbital、50mg/kg）による麻
酔下で外科手術により左脇腹を開腹した。次いで、左腎
から伸びる尿管の２箇所を縫合糸で結紮し、当該２箇所
の結紮部位の間の尿管を切断した（UUO、Unilateral ur
eteral obstruction）。当該処置の後、開腹部を縫合し
た。この手術により、当該左腎は、正常な腎臓の最も重
要な機能である血液等の体液のろ過機能を失い、種々の
腎疾患に見られる様々な病理的症状を発現するようにな
る。

【０１８２】 <4-15-2> 抗CTGFモノクローナル抗体による治療効果 上記で作製した各々のモデルマウスに、リン酸緩衝液に
溶解した抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体M84またはM
320（前記実施例で調製、各々５mg/kg）を腹腔内投与し
た。当該抗体投与は、上記手術完了直後に初回投与し、
さらに初回投与から３日おきに合計４回行った。最終投
与の後（当該手術完了から１４日目）、各々のマウスか
ら当該左腎を外科手術により摘出した。摘出した腎臓を
アセトンで脱脂及び脱水した後、６N塩酸でタンパクを
加水分解した。次いで、当該サンプルを温暖な条件下で
窒素ガスを当て乾燥させたた後、精製水に溶解して定量
用のサンプルとした。得られた腎臓組織サンプル中のヒ
ドロキシプロリン（OH-Proline）の濃度を既報の方法に
従って測定した（Analytical Biochemistry, Vol.55,
ｐ.288-291, 1973； Kidney Int., Vol.54, No.1, ｐ.
99-109, 1998）。該ヒドロキシプロリンの生成の上昇
は、腎機能不全により惹起される腎炎及び腎繊維症の発
症の指標であり、ヒドロキシプロリン濃度の低減は、該
モノクローナル抗体が該腎臓疾患の治療に有効であるこ
とを示すものである。

【０１８３】なお、前記と同様にして下記の対照実験を
行った。 （１）上述のUUO（尿管結紮処置）を施したマウスにリ
ン酸緩衝液のみ（いずれの抗体も含まない）を前記と同
様にして腹腔内投与した。 （２）開腹のみ行いUUOを施さずに開腹部を縫合した正
常マウスの場合。 （３）UUOを施さない正常マウスの場合。 （４）前記抗体の代わりに腎繊維症などの繊維症治療薬
として臨床試験中のPirfenidone（Kidney Int., Vol.5
4, No.1, ｐ.99-109, 1998）（約500mg/kg）を餌に混入
させて与えた場合（陽性対照試験）。 結果を、図１７に示した。この結果、本発明のモノクロ
ーナル抗体が、腎臓疾患並びに組織繊維症に対して有意
な抑制及び治療効果を有していることが示された。また
驚くべきことに、本発明のモノクローナル抗体による有
効性は、極めて高用量で投与した陽性対照薬（例えば、
50kgの患者への４回投与の場合に換算すると約100g）の
有効性と同様であった。

【０１８４】＜４−１６＞ 抗ヒトCTGFヒトモノクロー
ナル抗体の遺伝子配列及びアミノ酸配列の決定及び解析 前記実施例で作製された種々のヒトCTGFに対するヒトモ
ノクローナル抗体を構成する重鎖（Heavy Chain）の可
変領域をコードするｃDNA配列、並びに軽鎖（Light Cha
in）の可変領域及び定常領域をコードするｃDNA配列を
下記のようにして決定するとともに、該遺伝子の構造的
特徴を解析した。本実施例における配列解析の手順を図
１８に模式的に示した。前記実施例で作製したヒトCTGF
に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ（クローン：A29、C26、C59、C114及びM295； 各
々約5×10⁷細胞）を培養後、遠心分離し、沈殿物を回収
し、後述するPolyA⁺RNAの抽出時まで−80℃で保存し
た。

【０１８５】各々のハイブリドーマからのPolyA⁺RNAの
抽出、精製は、市販のFastTrack2.0kit(INVITROGEN製）
を用いて次のようにしてした。前記各々の凍結細胞を、
細胞溶解緩衝液（Lysis Buffer）に溶解し、POLYTRONに
より細胞を破壊し、可溶化させた。該可溶化物を45℃で
インキュベーションした後、Oligo(dT) celluloseを加
え約1時間緩やかに振盪した。次いで、Oligo(dT) cellu
loseを洗浄後、PolyA⁺RNAをEllution Bufferで溶出させ
た。溶出したPolyA⁺RNAをエタノール沈殿させ、20μlの
Tris-EDTA緩衝液に溶解した。得られたPolyA⁺RNAの濃度
を、260nmの波長での吸光度を測定することにより決定
した。

【０１８６】得られたPolyA⁺RNAを鋳型とし、市販のMar
athon cDNA Amplification Kit（CLONTECH製）を用いた
RACE-PCR法により常法によりcDNAを合成した（「遺伝子
増幅PCR法・基礎と新しい展開」、1992年第２刷、共立
出版株式会社発行、p.13-15）。即ち、各々のハイブリ
ドーマから精製したPolyA⁺RNA（1乃至5μg）を鋳型とし
て、1st strand cDNA及び2nd strand cDNAを順次合成し
た。該ｃDNAを、フェノール／クロロホルム／イソアミ
ノアルコール並びにクロロホルムを用いて各々1回ずつ
抽出に供した。次いで、cDNAをエタノール沈殿させ、ア
ダプターDNA（配列番号25）に連結させた。得られたDNA
反応物を1/250に希釈したものを鋳型とし、合成プライ
マーを用いて常法によりPCRを行い抗体重鎖及び抗体軽
鎖を各々コードするｃDNAを調製した。抗体重鎖に係るP
CRには、配列番号26に記載のプライマーを用いた。抗体
軽鎖に係るPCRには、配列番号27に記載のプライマーを
用いた。

【０１８７】各々のPCR産物をアガロースゲル電気泳動
で分画し、DNAを回収した。得られた各々のｃDNAの塩基
配列の決定を、市販のDyeTerminator Cycle Sequencing
FS Kit（PE-Applied Biosystems製）及びPRISM377 DNA
Sequencer（PE-Applied Biosystems製）を用いて行っ
た。なお、本配列決定のためのSequencing Primerは、
前述のPCRにおいて使用したプライマーを使用した。さ
らに、得られた配列から適切なSequencing Primerを作
成しさらに反応を実施した。前記の各々のハイブリドー
マが産生するヒトCTGFに対するヒトモノクローナル抗体
の重鎖の可変領域をコードするｃDNA配列、軽鎖（Light
Chain）の可変領域をコードするｃDNA配列、並びに該
各々のcDNA配列から演繹されるアミノ酸配列を下記のと
おり配列表に示した。

【０１８８】＜クローンA29＞ （重鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号５（シグナル配列：塩基番号１
乃至57、Ｖ領域：塩基番号58乃至363） アミノ酸配列：配列番号６（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至19、可変領域：アミノ酸番号21乃至120を含
む） （軽鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号15（シグナル配列：塩基番号１
乃至60、Ｖ領域：塩基番号61乃至365） アミノ酸配列：配列番号16（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至20、可変領域：アミノ酸番号21乃至120を含
む）

【０１８９】＜クローンC26＞ （重鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号７（シグナル配列：塩基番号１
乃至57、Ｖ領域：塩基番号58乃至357） アミノ酸配列：配列番号８（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至19、可変領域：アミノ酸番号21乃至118を含
む） （軽鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号17（シグナル配列：塩基番号１
乃至60、Ｖ領域：塩基番号61乃至364） アミノ酸配列：配列番号18（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至20、可変領域：アミノ酸番号21乃至121を含
む）

【０１９０】＜クローンC59＞ （重鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号９（シグナル配列：塩基番号１
乃至57、Ｖ領域：塩基番号58乃至350） アミノ酸配列：配列番号10（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至19、可変領域：アミノ酸番号21乃至116を含
む） （軽鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号19（シグナル配列：塩基番号１
乃至66、Ｖ領域：塩基番号67乃至353） アミノ酸配列：配列番号20（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至22、可変領域：アミノ酸番号23乃至117を含
む）

【０１９１】＜クローンC114＞ （重鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号11（シグナル配列：塩基番号１
乃至57、Ｖ領域：塩基番号58乃至350） アミノ酸配列：配列番号12（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至19、可変領域：アミノ酸番号21乃至116を含
む） （軽鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号21（シグナル配列：塩基番号１
乃至47を含む、Ｖ領域：塩基番号48乃至335） アミノ酸配列：配列番号22（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至16を含む、可変領域：アミノ酸番号17乃至111
を含む）

【０１９２】＜クローンM295＞ （重鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号13（シグナル配列：塩基番号１
乃至58、Ｖ領域：塩基番号59乃至353） アミノ酸配列：配列番号14（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至19、可変領域：アミノ酸番号21乃至117を含
む） （軽鎖の可変領域） ＤＮＡ配列 ：配列番号23（シグナル配列：塩基番号１
乃至66、Ｖ領域：塩基番号67乃至356） アミノ酸配列：配列番号24（シグナル配列：アミノ酸番
号１乃至22、可変領域：アミノ酸番号23乃至118を含
む）

【０１９３】決定された各々のＤＮＡ配列を基に、遺伝
子配列解析ソフトウェアーを用いて、Tomlinsonらによ
り作成されたヒトイムノグロブリンの可変領域遺伝子の
ライブラリーV BASE Sequence（Immunol. Today, Vol.1
6, No.5, p.237-242, 1995）を検索した。その結果、上
記ヒトモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の各々のＶ領
域遺伝子は、各々下記のセグメントから構成されている
ことが分かった。 ＜重鎖Ｖ領域遺伝子＞ クローンA29： DP-38 クローンC26： DP-75 クローンC59： DP-5 クローンC114： DP-5 クローンM295： DP-65 ＜軽鎖Ｖ領域遺伝子＞ クローンA29： DPK24 クローンC26： DPK12 クローンC59： DPK1 クローンC114： DPK1 クローンM295： DPK9 なお、上記ヒトモノクローナル抗体の重鎖をコードする
cDNA配列には、Ｖ領域と下流のＤ領域の間、並びにＤ領
域とさらに下流のＪ領域の間にＮ領域（N-addition）を
有しているものと考えられた。

【０１９４】実施例５ ヒトＣＴＧＦ及びマウスＣＴＧ
Ｆの定量のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ系確立 ＜５−１＞ 抗体固定化マイクロプレートの作製 本実施例においてマイクロプレートに固定化するモノク
ローナル抗体は、前述のようにして調製した正常マウス
由来のモノクローナル抗体8-64-6（国際寄託番号FERM B
P-6209で識別されるハイブリドーマに由来する）を用い
た。このモノクローナル抗体は、ヒトＣＴＧＦに高い反
応性を有するとともに、マウスＣＴＧＦにも交叉反応性
を示す。モノクローナル抗体8-64-6をリン酸緩衝液で希
釈し、１μg／50μl／ウェルの濃度で、ELISA用９６穴
マイクロプレート（コーニング（Corning）社製）の各
ウェルに加え、室温で１時間インキュベートし、モノク
ローナル抗体8-64-6をマイクロプレートに吸着させた。
次いで、プレ−トをリン酸緩衝液で洗浄した後、各ウェ
ルに３％のウシ血清アルブミン（BSA; Bovine serum al
bumin）を含有するリン酸緩衝液（200μl／ウェル）を
加え、室温で２時間インキュベーションすることにより
抗体が結合していない部位をブロックした。次いで、プ
レートをリン酸緩衝液で３回洗浄した。

【０１９５】＜５−２＞ 標識モノクローナル抗体の作
製 本実施例において標識されるモノクローナル抗体は、前
述のようにして調製した正常マウス由来のモノクローナ
ル抗体8-86-2（国際寄託番号FERM BP-6208で識別される
ハイブリドーマに由来する）を用いた。このモノクロー
ナル抗体は、ヒトＣＴＧＦ、マウスＣＴＧＦ及びラット
ＣＴＧＦのいずれにも高い反応性を有する。モノクロー
ナル抗体8-86-2（20mg／mlを１ml）を、0.1MのNaHCO
₃（pH8.2〜8.3）溶液で、透析（４℃、２４時間）し
た。次いで、ＮＨＳ−ビオチン（2mg／mlを100μｌ、ピ
アス社製）を加え、激しく撹拌した後、室温下で３０分
インキュベートした。次いで、リン酸緩衝液で透析（４
℃、２４時間）した。

【０１９６】＜５−３＞ サンドイッチＥＬＩＳＡによ
る定量法の確立 本発明で確立されたヒトＣＴＧＦ及びマウスＣＴＧＦの
定量のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ系は以下の通りで
ある。実施例＜５−１＞で作製した抗体固定化マイクロ
プレートの各ウェルに、測定試料（50μl／ウェル）を
加え、室温で１時間インキュベートした。マイクロプレ
ートを、0.1% Tween20を含有するリン酸緩衝液で３回洗
浄後、各ウェルに、1%BSA、0.1% Tween20を含有するリ
ン酸緩衝液で希釈した実施例＜５−２＞で作製したビオ
チン標識モノクローナル抗体（0.3μl／50μl／ウェ
ル）を加え、室温下で１時間インキュベートした。マイ
クロプレートを、0.1% Tween20を含有するリン酸緩衝液
で３回洗浄後、0.5MのNaClと20mMのHEPESからなる溶液
（BSA(１mg/ml)を含有、pH7.0）で1000倍に希釈したス
トレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ（Streptoavi
din-β-galactosidase、５０μｌ、ギブコ（Gibco BR
L）社製）を各ウェルに加え、室温下で３０分間インキ
ュベートした。

【０１９７】マイクロプレートを、0.1% Tween20を含有
するリン酸緩衝液で３回洗浄後、100mMのNaCl、1mMのMg
Cl₂及び10mMのリン酸緩衝液（Na及びKを含有）からなる
溶液（BSA(1mg／ml))を含有、pH7.0）で希釈した１％の
４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド
（4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactoside、５０μ
ｌ、シグマ（Sigma）社製）を各ウェルに加え、室温下
で１０分間インキュベートした。各ウェルに、1MのNa₂C
O₃（100μl）を加え、反応を止めた。波長460nm（励
起：355nm）での蛍光強度をフルオロスキャンIIマイク
ロプレートフルオロメーター（Fluoroscan II micropla
te fluorometer、フロー研究所（Flow Laboratories In
c.）（製））で測定した。測定試料中のヒトＣＴＧＦま
たはマウスＣＴＧＦ量は、下記実施例で作成した検量線
から求めた。

【０１９８】＜５−４＞ 検量線の作成 実施例＜４−８＞で調製したアフィニティー精製した組
換えヒトＣＴＧＦまたは組換えマウスＣＴＧＦをＣＴＧ
Ｆ標準物質（スタンダード）として用い、実施例＜５−
３＞で確立したサンドイッチELISAを用いて検量線を作
成した。結果を図１９に示す。ヒトＣＴＧＦについて
は、極めて低濃度である３ng/ml〜1000ng/mlの濃度範囲
で有意差を持った検量線が得られた。マウスＣＴＧＦに
ついては、30ng/ml〜1000ng/mlの濃度範囲で有意差を持
った検量線が得られた。しかしながら、実施例＜５−３
＞で確立したサンドイッチELISA系では、ラットＣＴＧ
Ｆは定量できなかった。

【０１９９】実施例６ マウスＣＴＧＦ及びラットＣＴ
ＧＦの定量のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ系確立 ＜６−１＞ 抗体固定化マイクロプレートの作製 本実施例においてマイクロプレートに固定化するモノク
ローナル抗体は、前述のようにして調製した正常ラット
由来のモノクローナル抗体13-51-2を用いた。このモノ
クローナル抗体は、マウスＣＴＧＦに高い反応性を有す
るとともに、ラットＣＴＧＦにも交叉反応性を示す。モ
ノクローナル抗体13-51-2をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で
希釈し、１μg／50μl／ウェルの濃度で、ELISA用９６
穴マイクロプレート（コーニング（Corning）社製）の
各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートし、モノ
クローナル抗体13-51-2をマイクロプレートに吸着させ
た。次いで、プレ−トをリン酸緩衝液で洗浄した後、各
ウェルに３％のウシ血清アルブミン（BSA; Bovine seru
m albumin）を含有するリン酸緩衝液（200μl／ウェ
ル）を加え、室温で２時間インキュベーションすること
により抗体が結合していない部位をブロックした。次い
で、プレートをリン酸緩衝液で３回洗浄した。

【０２００】 ＜６−２＞ 標識モノクローナル抗体の作製 実施例＜５−２＞で作製したビオチン標識モノクローナ
ル抗体、即ち、ヒトＣＴＧＦ、マウスＣＴＧＦ及びラッ
トＣＴＧＦのいずれにも高い反応性を有するモノクロー
ナル抗体8-86-2（国際寄託番号FERM BP-6208で識別され
るハイブリドーマに由来する）をビオチンで標識した標
識モノクローナル抗体を用いた。

【０２０１】＜６−３＞ サンドイッチＥＬＩＳＡによ
る定量法の確立 本発明で確立されたマウスＣＴＧＦ及びラットＣＴＧＦ
の定量のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ系は以下の通り
である。実施例＜６−１＞で作製した抗体固定化マイク
ロプレートの各ウェルに、測定試料（50μl／ウェル）
を加え、室温で１時間インキュベートした。マイクロプ
レートを、0.1% Tween20を含有するリン酸緩衝液で３回
洗浄後、各ウェルに、1%BSA、0.1% Tween20を含有する
リン酸緩衝液で希釈した実施例＜６−２＞で作製したビ
オチン標識モノクローナル抗体（0.3μl／50μl／ウェ
ル）を加え、室温下で１時間インキュベートした。マイ
クロプレートを、0.1% Tween20を含有するリン酸緩衝液
で３回洗浄後、0.5MのNaClと20mMのHEPESからなる溶液
（BSA(１mg/ml)を含有、pH7.0）で1000倍に希釈したス
トレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ（Streptoavi
din-β-galactosidase、５０μｌ、ギブコ（Gibco BR
L）社製）を各ウェルに加え、室温下で３０分間インキ
ュベートした。

【０２０２】マイクロプレートを、0.1% Tween20を含有
するリン酸緩衝液で３回洗浄後、100mMのNaCl、1mMのMg
Cl₂及び10mMのリン酸緩衝液（Na及びKを含有）からなる
溶液（BSA(1mg／ml))を含有、pH7.0）で希釈した１％の
４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド
（4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactoside、５０μ
ｌ、シグマ（Sigma）社製）を各ウェルに加え、室温下
で１０分間インキュベートした。各ウェルに、1MのNa₂C
O₃（100μl）を加え、反応を止めた。波長460nm（励
起：355nm）での蛍光強度をフルオロスキャンIIマイク
ロプレートフルオロメーター（Fluoroscan II micropla
te fluorometer、フロー研究所（Flow Laboratories In
c.）（製））で測定した。測定試料中のマウスＣＴＧＦ
またはラットＣＴＧＦ量は、下記実施例で作成した検量
線から求めた。

【０２０３】＜６−４＞ 検量線の作成 実施例＜４−８＞で調製したアフィニティー精製した組
換えマウスＣＴＧＦまたは組換えラットＣＴＧＦをＣＴ
ＧＦ標準物質（スタンダード）として用い、実施例＜６
−３＞で確立したサンドイッチELISAを用いて検量線を
作成した。結果を図２０に示す。マウスＣＴＧＦについ
ては、極めて低濃度である１ng/ml〜1000ng/mlの濃度範
囲で有意差を持った検量線が得られた。ラットＣＴＧＦ
については、10ng/ml〜1000ng/mlの濃度範囲で有意差を
持った検量線が得られた。しかしながら、実施例＜６−
３＞で確立したサンドイッチELISA系では、ヒトＣＴＧ
Ｆは定量できなかった。

【０２０４】実施例７ 各種疾患に罹患している患者の
血清中のＣＴＧＦの定量 実施例＜５−３＞で確立されたサンドイッチＥＬＩＳＡ
による定量法を用いて各種患者の血清中のＣＴＧＦを定
量した。

【０２０５】＜７−１＞胆道閉鎖症、リウマチ性血管
炎、悪性慢性関節リウマチ、乾癬及びアトピー性皮膚炎 本試験で用いたヒト血清は、健常人（３３検体）、胆道
閉鎖症に罹患し、外科手術を受けた患者の術後サンプル
（＜第１群＞臨床所見は正常な患者（１７検体）、＜第
２群＞症状進行中の患者（１４検体）、及び＜第３群＞
肝臓移植を必要とする重症患者（８検体））、リウマチ
性血管炎に罹患している患者（１０検体）、悪性慢性関
節リウマチ（Malignant rheumatoid arthritis,MRA）に
罹患している患者（１７検体）、乾癬に罹患に罹患して
いる患者（２４検体）、及びアトピー性皮膚炎に罹患し
ている患者（３４検体）の各々から採取した血清であ
る。結果を図２１（胆道閉鎖症）及び図２２（リウマチ
性血管炎、悪性慢性関節リウマチ、乾癬及びアトピー性
皮膚炎）に示す。胆道閉鎖症患者では、ＣＴＧＦが第２
群（症状進行期）で有意な発現することが明らかとなっ
た。また、リウマチ性血管炎、悪性慢性関節リウマチで
は、健常人に比べ有意に多くのＣＴＧＦを発現している
ことが明らかとなった。

【０２０６】 ＜７−２＞ 慢性関節リウマチ及び変形性関節症 本試験で用いたヒト血清は、慢性関節リウマチ（Rheuma
toid arthritis,RA）に罹患に罹患している患者（３６
名）及び変形性関節症（Osteoarthritis, OA）に罹患し
ている患者（１９名）の各々から採取した関節液であ
る。結果を図２３に示す。慢性関節リウマチ患者の関節
液中のCTGF濃度は、変形性関節症のそれに比べ有意に高
いことが明らかとなった。この結果から、本発明のアッ
セイ系は、健常人のみならず種々の疾患患者でのＣＴＧ
Ｆの発現状態を高感度で定量することができ、その病状
の進行程度を的確に把握するための臨床診断薬としての
有用性を有していると言うことができる。

【０２０７】 実施例８ 抗体フラグメントF(ab')₂及びFabの調製 前述のようにして調製した各種モノクローナル抗体の抗
体フラグメントF(ab') ₂及びFabは、下記のようにして調
製する。モノクローナル抗体（5mg/ml）を、20mMの酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐH3.5）に加え、３７℃で３０分間
インキュベートする。次いで、不溶化ペプシン（１ｍ
ｌ、ピアス社製）を加え、ローテーターで回転させなが
ら３７℃で１２時間インキュベートする。反応液を回収
し、遠心分離（3000rpm、１０分間）し、上清を回収す
る。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー
を、プロテインＡカラムキット（アマシャム社製）のプ
ロトコールに従って以下のようにして行う。遠心沈殿物
に結合緩衝液を加え、遠心分離（3000rpm、１０分間）
し、上清を回収する。２回の遠心分離で回収した上清を
集め、等量の結合緩衝液を加え、さらに１Ｎの水酸化ナ
トリウムを加えてpH8.9に調整する。該混合溶液を、該
結合緩衝液で平衡化した該プロテインＡカラムに添加し
た後、該結合緩衝液（5ml）で２回洗浄し、溶出分画を
回収する。得られた溶出分画を、5mMのリン酸緩衝液
（２Ｌ、pH6.8）で透析（４℃、２４時間）する。

【０２０８】さらなる精製のためヒドロキシアパタイト
カラム（バイオラッド社製）を用いて、高速液体クロマ
トグラフィー（HPLC）を行う。透析により得られる溶液
を、該ヒドロキシアパタイトカラムに添加し、5mMのリ
ン酸緩衝液を１５分間流した後、5mM〜0.4Mのリン酸緩
衝液で直線濃度勾配溶出させる。溶出液をフラクション
コレクターで分取し、280nmでの吸光度を測定し、F(a
b')₂を含む分画を回収する。得られた分画をリン酸緩衝
液（２Ｌ）で透析（４℃、２４時間）し、モノクローナ
ル抗体の精製F(ab')₂を得る。

【０２０９】実施例９ ヒトＣＴＧＦ発現トランスジェ
ニックマウスの作製 実施例２で取得したヒトＣＴＧＦをコードするｃＤＮＡ
を、ニワトリβアクチンプローモーターを有する発現ベ
クターpCAGGS（Gene, Vol.108, p.193-200, 1991）に、
ＤＮＡ末端平滑化キット（タカラ社製）を用いて挿入
し、プラスミドphCTGFを得た。エレクトロポレーション
法により、phCTGFでヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（A
TCC CRL-1573）を形質転換した。実施例５で確立したサ
ンドイッチＥＬＩＳＡにより、得られた形質転換細胞が
培養上清中にヒトＣＴＧＦを発現、分泌していることを
確認した。トランスジェニックマウス作製のために、ph
CTGFを制限酵素処理して直鎖状にした。

【０２１０】仮親マウスには、白色ＩＣＲマウス（雌、
日本エスエルシー社製）と精管結紮した白色ＩＣＲマウ
ス（雄、日本エスエルシー社製）とを交配して得られた
プラグ（または腟栓）を有する雌ＩＣＲマウスを用い
た。また、ヒトＣＴＧＦ遺伝子を導入するための受精卵
を得るための採卵用マウスは、PEAMEX（５ユニット、三
共ゾーキ社製）及びプレグニール（５ユニット、オルガ
ノン社製）を投与することにより過剰排卵させたBDF-1
マウス（雌、日本エスエルシー社製）をBDF-1マウス
（雄、日本エスエルシー社製）と交配させて作製した。
交配後、BDF-1マウス（雌）から卵管部を摘出し、ヒア
ルロニダーゼ処理により受精卵のみを得、培地中で保存
した。

【０２１１】受精卵へのヒトＣＴＧＦ遺伝子の導入は、
顕微鏡下でマニピュレーターを用いて常法により行っ
た。受精卵を保定針で固定し、３７℃条件下、トリスＥ
ＤＴＡ緩衝液で希釈したヒトＣＴＧＦの前記直鎖状遺伝
子を含有する溶液を、ＤＮＡ導入針を用いて受精卵の雄
性前核内に注入した。遺伝子導入後、正常な状態を保持
する受精卵のみを選別し、仮親マウス（白色ＩＣＲマウ
ス）の卵巣内にある卵管采に、ヒトＣＴＧＦ遺伝子導入
受精卵を挿入した。仮親から生まれた子マウス（キメラ
マウス）の尾を切取りゲノム遺伝子を回収し、ＰＣＲに
よりマウスゲノム内にヒトＣＴＧＦ遺伝子が導入されて
いることを確認した。また、実施例５で確立したサンド
イッチＥＬＩＳＡにより、該マウスの血清中にヒトＣＴ
ＧＦが発現、分泌されていることを確認した。次いで、
このキメラマウスを正常マウスと交配させることにより
ヒトＣＴＧＦ高発現ヘテロトランスジェニックマウスを
作製した。該ヘテロマウス同士を掛け合わせることによ
りホモマウスを作製した。

【０２１２】実施例１１ ラットＣＴＧＦの調製 ＜１１−１＞ ｃＤＮＡのクローニング （１）ラットｃＤＮＡライブラリー及びプローブの作製 ラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-1570、
約1×10⁶/ml）を遠心（2,000×g、５分間、４℃）し
て、沈殿した細胞をISOGEN（ニッポンジーン社製）を用
いて懸濁させた後、クロロホルムで振とう抽出して上清
を回収した。得られた上清にイソプロパノールを添加し
て室温で１０分間放置した後、遠心（12,000×g、10分
間、4℃）し、RNAを沈殿させた。沈殿したRNAをエタノ
ールで洗浄した後、ＴＥ緩衝液に溶解した。得られた全
RNAから、mRNA Purification Kit（Pharmacia社製）を
用いてpoly(A)⁺RNAを精製した。

【０２１３】poly(A)⁺RNA（５μｇ）を鋳型とし、Super
script l system for cDNA Synthesis Kit（GIBCO-BRL
社製）を用いてcDNAを合成した。スクリーニングの効率
を上げるため、NotI切断部位を有するoligo dTプライマ
ー（GIBCO-BRL社製）を用いた。SalIアダプター付加し
た後NotI消化を行い、単一方向性を有するcDNAを得た。
さらにｃＤＮＡサイズ分画カラム（cDNA size fraction
ation column、GIBCO-BRL社製）を用いてサイズ分画を
行った。実施例２で取得したヒト及びマウスCTGFをコー
ドするcDNA塩基配列を比較しヒト・マウス間で相同性の
高い領域を利用して5'プライマー（配列番号３）及び3'
プライマー（配列番号４）を設計し、合成した。

【０２１４】上記のようにして作製したcDNAライブラリ
ーを鋳型とし、前記両プライマー及びEx Taq DNAポリメ
ラーゼ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲ（Polymerase Cha
in Reaction）を行った。反応は、DNAサーマルサイクラ
ー（Perkin Elmer Cetus社製）を用いて、プライマー終
濃度が0.4μM及びMg²⁺濃度が1.5mMの条件下で、94℃で
１分、55℃で１分及び72℃で１分の反応を１サイクルと
して合計35サイクル行った。増幅されたDNAを、アガロ
ースゲル電気泳動した後、QUIAEX DNA抽出キット（QUIA
EX DNA Extraction Kit、QUIAGEN社製）を用いて精製し
た。

【０２１５】回収したDNA断片をTAクローニングキット
（Invitrogen社製）を用いてベクターpCRII（Invitroge
n社製）に連結した後、オートリードシークエンシング
キット（Auto Read Sequencing Kit、Pharmacia社製）
及びA.L.F.DNAシークエンサー（Pharmacia社製）を用い
てジデオキシ法により塩基配列を決定した。得られたｃ
ＤＮＡ断片の塩基配列を、実施例２及び実施例３で各々
取得したヒト及びマウスのＣＴＧＦの塩基配列と比較し
た結果、当該ｃＤＮＡ断片はヒト及びマウスのＣＴＧＦ
のラットホモログ（ラットＣＴＧＦ）をコードする領域
を含んでいることが確認された。該ｃＤＮＡ断片（約0.
8kb）を、ECLランダムプライムラベリングキット（ECLr
andom prime labelling system、Amersham社製）を用い
てFITC標識し、プラークハイブリダイゼーション用プロ
ーブとして使用した。

【０２１６】（２）ｃＤＮＡライブラリーのベクターへ
の組み込み及びパッケージング 前記（１）で得られたｃＤＮＡ断片を、ベクターlZipLo
x NotI-SalI arm（GIBCO-BRL社製）に連結した。連結反
応にはDNAライゲーションキット（DNA ligation Kit、
宝酒造社製）を用いた。次いで、GIGA PACK II GOLD（S
tratagene社製）を用いてインビトロパッケージングし
た後、得られたファージ粒子を用いて、大腸菌Y1090（G
IBCO-BRL社製）を宿主として、組み換えファージを含有
するプラークからなるｃＤＮＡライブラリーを作製し
た。

【０２１７】 （３）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング ラピッドハイブリダイゼーション緩衝液（Rapid hybrid
ization buffer、Amersham社製）を用いたプラークハイ
ブリダイゼーション法（マニアティス（Maniatis）ら、
Molecular Cloning: A Labolatory Manual, Cold Sprin
g Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Yor
k）に従い、前記（２）で調製したｃＤＮＡライブラリ
ーのスクリーニングを下記のようにして行った。前記
（２）で得られたライブラリー（1×10⁴個プラーク）を
寒天プレートに蒔き、ハイボンド-N ナイロンメンブラ
ン（Hybond-N nylon menbrane、Amersham社製）を用い
てレプリカを作製した。このレプリカと前記（１）で作
製したFITC標識プローブを用いて、ラピッドハイブリダ
イゼーション緩衝液（Rapid hybridization buffer、Am
ersham社製）中でプラークハイブリダイゼーションを行
った。１次スクリーニング及び２次スクリーニングを行
い、１３個のポジティブ・クローンを得た。各クローン
をシングルプラークで単離した後、GIBCO-BRL社のマニ
ュアルに従ってインビボエクサイジョン（in vivo Exci
sion）に供し、１３クローンをプラスミドDNAとして回
収した。

【０２１８】（４）塩基配列決定 １３個のクローンについてオートリードシークエンシン
グキット（Auto ReadSequencing Kit、Pharmacia社製）
とA.L.F.DNAシークエンサー（Pharmacia社製）を用いて
ジデオキシ法により塩基配列を決定した。１３個のクロ
ーンはすべて同じ塩基配列を含んでいた。ヒト及びマウ
スCTGFのｃＤＮＡ配列と比較した結果、得られたクロー
ンｒ３１１にはラットＣＴＧＦの全長をコードするｃＤ
ＮＡ領域を含まれることが確認された。なお、得られら
ラットＣＴＧＦの全長ｃＤＮＡ配列（５’及び３’末端
塩基配列を含む）を配列番号１に、またその配列から演
繹されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。

【０２１９】＜１１−２＞ 組換えラットＣＴＧＦの調
製 実施例＜１１−１＞で取得したラットＣＴＧＦをコード
するｃＤＮＡを含むクローンｒ３１１をSalI-DraIで消
化して、ラットＣＴＧＦをコードするｃＤＮＡを含むＤ
ＮＡ断片を切りだした。該ＤＮＡ断片をプラスミドｐｃ
ＤＮＡ3.1(-)（Invitrogen社製）に挿入し発現ベクター
を作成した。エレクトロポレ−ションにより、該ベクタ
ーでヒト上皮様細胞株Hela（ATCC CCL-2）を形質転換し
た。形質転換細胞を、Geneticin（0.8mg/ml；GIBCO-BRL
社製）及び10%ウシ胎児血清（fetal calf serum）を含
有するRPMI1640培地中で約２週間培養することにより、
Geneticin耐性形質転換細胞クローンを選別した。選別
された形質転換細胞を、無血清培地ASF104（味の素社
製）中培養し、組換えラットＣＴＧＦを発現させた。ラ
ットＣＴＧＦの発現を、前記実施例４で調製したラット
ＣＴＧＦに交叉反応性を有するモノクローナル抗体を用
いたウェスタンブロッティングにより確認した。培養培
養上清を回収し、硫化アンモニウム沈澱法に供した後、
ヘパリンカラムクロマトグラフィーに供し、0.3MのNaCl
/PBSで洗浄した後、0.5MのNaCl/PBSで溶出し、部分精製
ラットＣＴＧＦ画分を得た。

【０２２０】

【発明の効果】本発明は、未だ提供されていない、ヒ
ト、マウス、ラット及びウサギ等の種々の哺乳動物のＣ
ＴＧＦに対して、抗原特異性、抗原親和性、中和活性、
及び交叉反応性等の性質の点で、異なる特性を有する種
々の哺乳動物由来の種々のモノクローナル抗体を提供す
るものである。特に、遺伝子組換え技術を用いてヒトの
抗体を産生するように作製したトランスジェニックマウ
スを免疫動物として用いることにより、ヒトＣＴＧＦに
対する種々のヒトモノクローナル抗体を世界に先んじて
初めて提供するものである。

【０２２１】本発明のモノクローナル抗体の内、ヒトＣ
ＴＧＦに対するモノクローナル抗体及びその医薬組成物
は、その発症がＣＴＧＦに起因することが予測される可
能性を有するような種々の疾患症状、例えば、腎疾患
（腎繊維症、腎炎、腎不全など）、肺疾患（例えば、肺
線維症、肺炎など）、肝臓疾患（例えば、肝臓組織繊維
症、肝硬変、肝炎など）、皮膚疾患（例えば、創傷、強
皮症、、乾癬、ケロイドなど）、関節炎（例えば、慢性
関節リウマチ、変形性関節症など）、血管疾患（例え
ば、リウマチ性血管炎など）、各種癌で併発する組織繊
維症、及び動脈硬化症（特にい、併発する組織繊維症）
などの発症及び／または進行を抑制、阻止し、該疾患を
治療または予防するための医薬品として有用である。特
に、ヒトモノクローナル抗体及びその医薬組成物は、マ
ウス由来の抗体等の非ヒト哺乳動物由来の抗体からなる
抗体医薬品の治療上の大きな問題点（副作用）であった
ヒトに対する抗原性を全く有しないことから、医薬品と
しての価値を劇的に増大させるものである。

【０２２２】さらに、本発明の種々のモノクローナル抗
体を用いることにより、種々哺乳動物（ヒト、マウス、
ラット及びウサギ等）の体液（血清等）中のＣＴＧＦ
を、インタクトな状態で簡便かつ高感度で定量できる種
々のイムノアッセイ系（方法及びキット）を提供するこ
とができる。また、該モノクローナル抗体を不溶性担体
の固定化したアフィニティーカラムを作製することによ
り、種々の哺乳動物のＣＴＧＦを高純度で容易に精製す
ることが可能となる。

【０２２３】また、本発明のヒトＣＴＧＦを発現するト
ランスジェニック非ヒト哺乳動物（タランスジェニック
マウス等）は、ヒトＣＴＧＦの生理学的機能を解明する
ためのモデル動物として有用であるだけでなく、ヒトＣ
ＴＧＦの機能を制御（阻害、抑制、活性化、刺激など）
する可能性を種々の医薬（低分子化合物、抗体、アンチ
センス、ヒトＣＴＧＦ以外のポリペプチドなど）をスク
リーニングするためのツールといして極めて有用であ
る。即ち、そのような薬剤を該トランスジェニック非ヒ
ト哺乳動物に投与し、該動物中でのヒトＣＴＧＦの発現
の程度を、本発明のアッセイ系（サンドイイッチELISA
など）を用いて定量することにより、投与された薬剤の
ヒトＣＴＧＦに対する効果を評価することが可能であ
る。

【０２２４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Tobacco, Inc. <120> Monoclonal Antibody For Connective Tissue Growth Factor and Pharmaceutical Use Thereof <130> J98-0215 <140> <141> <150> JP P1997-367699 <151> 1997-12-25 <150> JP P1998-356183 <151> 1998-12-15 <160> 27 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2338 <212> DNA <213> Rat <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(212) <220> <221> CDS <222> (213)..(1256) <220> <221> 3'UTR <222> (1257)..(2338) <220> <221> polyA_signal <222> (2297)..(2302) <400> 1 ctccaagaag actcagccag acccactcca gctccgaccc taggagaccg acctcctcca 60 gacggcagca gccccagccc agtggacaac cccaggagcc accacctgga gcgtccggac 120 accaacctcc gccccgagac cgagtccagg ctccggccgc gcccctcgtc gcctctgcac 180 cccgctgtgc gtcctcctgc cgcgccccga cc atg ctc gcc tcc gtc gcg ggt 233 Met Leu Ala Ser Val Ala Gly 1 5 ccc gtt agc ctc gcc ttg gtg ctc ctc ctc tgc acc cgg cct gcc acc 281 Pro Val Ser Leu Ala Leu Val Leu Leu Leu Cys Thr Arg Pro Ala Thr 10 15 20 ggc cag gac tgc agc gcg cag tgt cag tgc gca cgt gaa gcg gcg ccg 329 Gly Gln Asp Cys Ser Ala Gln Cys Gln Cys Ala Arg Glu Ala Ala Pro 25 30 35 cgc tgc ccc gcc ggc gtg agc ctg gtg ctg gac ggc tgc ggc tgc tgc 377 Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys 40 45 50 55 cgc gtc tgc gcc aag cag ctg gga gaa ctg tgc acg gag cgt gat ccc 425 Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro 60 65 70 tgc gac cca cac aag ggt ctc ttc tgc gac ttc ggc tcc ccc gcc aac 473 Cys Asp Pro His Lys Gly Leu Phe Cys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn 75 80 85 cgc aag att ggc gtg tgc cct gcc aaa gat ggt gca ccc tgt gtc ttc 521 Arg Lys Ile Gly Val Cys Pro Ala Lys Asp Gly Ala Pro Cys Val Phe 90 95 100 ggt ggg tcc gtg tac cgc agc ggc gag tcc ttc caa agc agt tgc aaa 569 Gly Gly Ser Val Tyr Arg Ser Gly Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys 105 110 115 tac cag tgc act tgc ctg gat ggg gcc gtg ggc tgt gtg ccc ctg tgc 617 Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp Gly Ala Val Gly Cys Val Pro Leu Cys 120 125 130 135 agc atg gac gtg cgc ctg ccc agc cct gac tgc ccc ttc ccg aga agg 665 Ser Met Asp Val Arg Leu Pro Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg 140 145 150 gtc aag ctg ccc ggg aaa tgc tgt gag gag tgg gtg tgt gat gag ccc 713 Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys Cys Glu Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro 155 160 165 aag gac cgc aca gtg gtt ggc cct gcc cta gct gcc tac cga ctg gaa 761 Lys Asp Arg Thr Val Val Gly Pro Ala Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu 170 175 180 gac aca ttt ggc cct gac cca act atg atg cga gcc aac tgc ctg gtc 809 Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro Thr Met Met Arg Ala Asn Cys Leu Val 185 190 195 cag acc aca gag tgg agc gcc tgt tct aag acc tgt ggg atg ggc atc 857 Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala Cys Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile 200 205 210 215 tcc acc cgg gtt acc aat gac aat acc ttc tgc agg ctg gag aag cag 905 Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Thr Phe Cys Arg Leu Glu Lys Gln 220 225 230 agt cgt ctc tgc atg gtc agg ccc tgt gaa gct gac cta gag gaa aac 953 Ser Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn 235 240 245 att aag aag ggc aaa aag tgc atc cgg acg cct aaa att gcc aag cct 1001 Ile Lys Lys Gly Lys Lys Cys Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ala Lys Pro 250 255 260 gtc aag ttt gag ctt tct ggc tgc acc agt gtg aag acc tac cgg gct 1049 Val Lys Phe Glu Leu Ser Gly Cys Thr Ser Val Lys Thr Tyr Arg Ala 265 270 275 aag ttc tgt ggg gtg tgc acg gac ggc cgc tgc tgc aca ccg cac aga 1097 Lys Phe Cys Gly Val Cys Thr Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg 280 285 290 295 acc acc aca ctg ccg gtg gag ttc aag tgc ccc gat ggc gag atc atg 1145 Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu Phe Lys Cys Pro Asp Gly Glu Ile Met 300 305 310 aaa aag aac atg atg ttc atc aag acc tgt gcc tgc cat tac aac tgt 1193 Lys Lys Asn Met Met Phe Ile Lys Thr Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys 315 320 325 ccc ggg gac aat gac atc ttt gag tcc ttg tac tac agg aag atg tat 1241 Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe Glu Ser Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr 330 335 340 gga gac atg gcg taa agccagggag taagggacac gaactcattt agactataac 1296 Gly Asp Met Ala 345 ttgaactgag ttacatctca ttttcttctg taaaaaaaac aaaaagggtt acagtagcac 1356 attaatttaa atctgggttc ctaactgctg tgggagaaaa caccccaccg aagtgagaac 1416 cgtgtgtcat tgtcatgcaa atagcctgtc aatctcagac actggtttcg agacagttta 1476 gacttgacag ttgttcacta gcgcacagtg acagaacgca cactaaggtg agcctcctgg 1536 aagagtggag atgccaggag aaagacaggt actagctgag gtcattttaa aagcagcgat 1596 atgcctactt tttggagtgt gacaggggag ggacattata gcttgcttgc agacagacct 1656 gctctagcaa gagctgggtg tgtgtcctcc actcggtgag gctgaagcca gctattcttt 1716 cagtaagaac agcagtttca gcgctgacat tctgattcca gygacactgg tcgggagtca 1776 gaaccttgtc tattagactg gacagcttgt ggcaagtgaa tttgccggta acaagccaga 1836 tttttatgga tcttgtaaat attgtggata aatatatata tttgtacagt tatctargtt 1896 aatttaaaga cgtttgtgcc tattgttctt gttttaagtg cttttggaat ttttaaactg 1956 atagcctcaa actccaaaca ccatcgatag gacataaagc ttgtctgtga ttcaaaacaa 2016 aggagatact gcagtggaaa ctgtaacctg agtgactgtc tgtcagaaca tatggtacgt 2076 agacggtaaa gcaatggatc agaagtcaga tttctagtag gaaatgtaaa atcactgttg 2136 gcgaacaaat ggcctttatt aagaaatggc ttgctcaggg taactggtca gatttccacg 2196 aggaagtgtt tgctgcttct ttgactatga ctggtttggg aggcagttta tttgttgaga 2256 gtgtgaccaa aagttacatg tttgcacctt tctagttgaa aataaagtat atatattttt 2316 tatatgaaaa aaaaaaaaaa aa 2338 <210> 2 <211> 347 <212> PRT <213> Rat <400> 2 Met Leu Ala Ser Val Ala Gly Pro Val Ser Leu Ala Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Leu Cys Thr Arg Pro Ala Thr Gly Gln Asp Cys Ser Ala Gln Cys Gln 20 25 30 Cys Ala Arg Glu Ala Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser Leu Val 35 40 45 Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu Gly Glu 50 55 60 Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu Phe Cys 65 70 75 80 Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val Cys Pro Ala Lys 85 90 95 Asp Gly Ala Pro Cys Val Phe Gly Gly Ser Val Tyr Arg Ser Gly Glu 100 105 110 Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp Gly Ala 115 120 125 Val Gly Cys Val Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro Ser Pro 130 135 140 Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys Cys Glu 145 150 155 160 Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Arg Thr Val Val Gly Pro Ala 165 170 175 Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro Thr Met 180 185 190 Met Arg Ala Asn Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala Cys Ser 195 200 205 Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Thr 210 215 220 Phe Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys 225 230 235 240 Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Cys Ile Arg 245 250 255 Thr Pro Lys Ile Ala Lys Pro Val Lys Phe Glu Leu Ser Gly Cys Thr 260 265 270 Ser Val Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys Thr Asp Gly 275 280 285 Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu Phe Lys 290 295 300 Cys Pro Asp Gly Glu Ile Met Lys Lys Asn Met Met Phe Ile Lys Thr 305 310 315 320 Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe Glu Ser 325 330 335 Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala 340 345 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <220> <221> 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50 55 60 tgg agt ggg ttg gcc gta tta aaa gca aaa ctg atg gtg gga cac aca 240 Trp Ser Gly Leu Ala Val Leu Lys Ala Lys Leu Met Val Gly His Thr 65 70 75 80 gac tac gct gca ccc gtg aaa ggc aga ttc acc atc tca aga gat gat 288 Asp Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp 85 90 95 tca aaa aac acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aaa acc gag gac 336 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp 100 105 110 aca gcc gtg tat tac tgt acc aca aaa tgg gtg gct acg gac tac ttt 384 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Lys Trp Val Ala Thr Asp Tyr Phe 115 120 125 gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc 432 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 aag ggc cca tcg 444 Lys Gly Pro Ser 145 <210> 6 <211> 148 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Ala Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Thr Ser Pro Val Gln Pro Leu Asp Ser Thr 35 40 45 Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly 50 55 60 Trp Ser Gly Leu Ala Val Leu Lys Ala Lys Leu Met Val Gly His Thr 65 70 75 80 Asp Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp 85 90 95 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp 100 105 110 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Lys Trp Val Ala Thr Asp Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser 145 <210> 7 <211> 447 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(447) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <220> <221> V_region <222> (58)..(357) <400> 7 atg gac tgg acc tgg agg atc tct ttc ttg gtg gca gca gcc aca gga 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Ser Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 gcc cac tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct ttc tgg cta cac ctt 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Trp Leu His Leu 35 40 45 tca ccc ggc tac tat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg 192 Ser Pro Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 50 55 60 ctt gag tgg atg gga tgg atc aac cct aac agt agt ggc aca cac tat 240 Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Ser Gly Thr His Tyr 65 70 75 80 gca cag atg ttt cag ggc agg gtc acc gtg acc agg gac acg tcc atc 288 Ala Gln Met Phe Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Ile 85 90 95 agc aca gcc tac atg gag ctg agc agg ctg aga tct gac gac acg gcc 336 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala 100 105 110 gtg tat tac tgt gcg aga gag ggg ata gca gca gct gcc atc tac ggt 384 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ile Ala Ala Ala Ala Ile Tyr Gly 115 120 125 atg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc 432 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 acc aag ggc cca tcg 447 Thr Lys Gly Pro Ser 145 <210> 8 <211> 149 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Ser Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Trp Leu His Leu 35 40 45 Ser Pro Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Ser Gly Thr His Tyr 65 70 75 80 Ala Gln Met Phe Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Ile 85 90 95 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ile Ala Ala Ala Ala Ile Tyr Gly 115 120 125 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 Thr Lys Gly Pro Ser 145 <210> 9 <211> 438 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(438) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <220> <221> V_region <222> (58)..(350) <400> 9 atg gac tgc acc tgg agg atc ctc ttc ttg gtg gca gca gct aca ggc 48 Met Asp Cys Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 acc cac gcc cag gtc cag ctg gta cag ttt ggg gct gag gtg aag aag 96 Thr His Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Phe Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aag gtc tcc tgc aag gtt tcc gga tac acc ctc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu 35 40 45 act gaa tta tcc atg cac tgg gtg cga cag gct cct gga aaa ggg ctt 192 Thr Glu Leu Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg atg gga agt ttt gat cct gaa gat ggt gaa aca atc tac gca 240 Glu Trp Met Gly Ser Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala 65 70 75 80 cag aag ttc cag ggc aga gtc acc atg acc gag gac aca tct aca gac 288 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp 85 90 95 aca gcc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca acc tct acg gtg gta act ccg tgg tac ttt gac tac 384 Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Thr Val Val Thr Pro Trp Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125 tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc 432 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 cca tcg 438 Pro Ser 145 <210> 10 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Asp Cys Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Phe Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu 35 40 45 Thr Glu Leu Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ser Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Thr Val Val Thr Pro Trp Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser 145 <210> 11 <211> 438 <212> DNA 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atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca acc tct acg gtg gta act ccg tgg tac ttt gac tac 384 Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Thr Val Val Thr Pro Trp Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125 tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc 432 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 cca tcg 438 Pro Ser 145 <210> 12 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Asp Cys Thr Trp Arg Ile Phe Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu 35 40 45 Thr Glu Leu Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ser Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Thr Val Val Thr Pro Trp Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser 145 <210> 13 <211> 450 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(450) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(58) <220> <221> V_region <222> (59)..(353) <400> 13 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctt cct gct ggt ggc agc tcc cag atg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Gln Met 1 5 10 15 ggt cct gtc cca ggt gca gct gca gga gtc ggg ccc agg act ggt gaa 96 Gly Pro Val Pro Gly Ala Ala Ala Gly Val Gly Pro Arg Thr Gly Glu 20 25 30 gcc ttc aca gac cct gtc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc 144 Ala Phe Thr Asp Pro Val Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 agc agt ggt ggt tac tac tgg agc tgg atc cgc cag cac cca ggg aag 192 Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 ggc ctg gag tgg att ggg tac atc tat tac agt ggg agc acc tac tac 240 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 aac ccg tcc ctc aag agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag 288 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 aac cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg act gcc gcg gac acg gcc 336 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 gtg tat tac tgt gcg agc tat tac tat gat agt ggt ggt tat tac gac 384 Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Tyr Tyr Asp Ser Gly Gly Tyr Tyr Asp 115 120 125 tac ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gcc 432 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140 tcc acc aag ggc cca tcg 450 Ser Thr Lys Gly Pro Ser 145 150 <210> 14 <211> 150 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Gln Met 1 5 10 15 Gly Pro Val Pro Gly Ala Ala Ala Gly Val Gly Pro Arg Thr Gly Glu 20 25 30 Ala Phe Thr Asp Pro Val Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Tyr Tyr Asp Ser Gly Gly Tyr Tyr Asp 115 120 125 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140 Ser Thr Lys Gly Pro Ser 145 150 <210> 15 <211> 423 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(423) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(60) <220> <221> V_region <222> (61)..(365) <400> 15 atg gtg ttg cag acc cag gtc ttc att tct ctg ttg ctc tgg atc tct 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggt gcc tac ggg gac atc gtg atg acc cag tct cca gac tcc ctg gct 96 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 gtg tct ctg ggc gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agc cag act 144 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Thr 35 40 45 gtt tta tac agc tcc aac aat aag aac tac tta gct tgg tac cag cag 192 Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 aaa cca gga cag cct cct aag ctg ctc att tac tgg gca tct acc cgg 240 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 gaa tcc ggg gtc cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat 288 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag gct gac gat gtg gca gtt tat 336 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Asp Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 tac tgt cag caa tat tat agt act cct ccg tgg acg ttc ggc caa ggg 384 Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly 115 120 125 acc aag gtg gaa atc aaa cga act gtg gct gca cca tct 423 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 130 135 140 <210> 16 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Thr 35 40 45 Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Asp Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 130 135 140 <210> 17 <211> 420 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(420) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(60) <220> <221> V_region <222> (61)..(364) <400> 17 atg aag gat ctg ctc agc ttc ctg ggg ctg cta atg ctc tgg ata cct 48 Met Lys Asp Leu Leu Ser Phe Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 gga tcc agt gca gat att gtc atg acc cag acg cca ctc ttc tgt ccg 96 Gly Ser Ser Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Phe Cys Pro 20 25 30 tca ccc ctg gac agc cga gcc tcc atc tcc tgc aag tct ggt ctg agc 144 Ser Pro Leu Asp Ser Arg Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Gly Leu Ser 35 40 45 ctc ctg cac agt gat gga aag acc tat ttg cat tgg tac ctg cag aag 192 Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 cca ggc cag cct cca cag ctc ctg atc tat gag agt ttc caa ccg gtt 240 Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Ser Phe Gln Pro Val 65 70 75 80 ctc ctg gag tgc cag ata ggc tca gtg gca gcg ggt cag gac aga ttt 288 Leu Leu Glu Cys Gln Ile Gly Ser Val Ala Ala Gly Gln Asp Arg Phe 85 90 95 cac act gaa aat cag ccg ggt gga agg ctg agg aat gtt ggg gtt tat 336 His Thr Glu Asn Gln Pro Gly Gly Arg Leu Arg Asn Val Gly Val Tyr 100 105 110 tac tgc atg caa agt tta cag ctt ccg ctc act ttc ggc gga ggg acc 384 Tyr Cys Met Gln Ser Leu Gln Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 aag gtg gag atc aaa cga act gtg gct gca cca tct 420 Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 130 135 140 <210> 18 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Lys Asp Leu Leu Ser Phe Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ser Ser Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Phe Cys Pro 20 25 30 Ser Pro Leu Asp Ser Arg Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Gly Leu Ser 35 40 45 Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Ser Phe Gln Pro Val 65 70 75 80 Leu Leu Glu Cys Gln Ile Gly Ser Val Ala Ala Gly Gln Asp Arg Phe 85 90 95 His Thr Glu Asn Gln Pro Gly Gly Arg Leu Arg Asn Val Gly Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Met Gln Ser Leu Gln Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 130 135 140 <210> 19 <211> 405 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(66) <220> <221> V_region <222> (67)..(353) <400> 19 atg gac atg agg gtc cct gct cag ctc ctg ggg ctc ctg ctg ctc tgg 48 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 ctc tca ggt gcc aga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc ttc 96 Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe 20 25 30 cct gtc tgc atc tgt agg aga cag agt cac cat cac ttg cca ggc gag 144 Pro Val Cys Ile Cys Arg Arg Gln Ser His His His Leu Pro Gly Glu 35 40 45 tca gga cat tca cca cta ttt aaa ttg gta tca gca gaa acc agg gaa 192 Ser Gly His Ser Pro Leu Phe Lys Leu Val Ser Ala Glu Thr Arg Glu 50 55 60 agc cct aag ctc ctg atc tac gat gca tcc aat ttg gaa aca ggg tcc 240 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Ser 65 70 75 80 cat cac ggt tca gtg gaa gtg gat ctg gga cag att tta ctt tca cca 288 His His Gly Ser Val Glu Val Asp Leu Gly Gln Ile Leu Leu Ser Pro 85 90 95 tca gca gcc tgc agc tct gaa gat att gca aca tat tac tgt caa cag 336 Ser Ala Ala Cys Ser Ser Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 tat aat aat ctc atc acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa 384 Tyr Asn Asn Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 115 120 125 cga act gtg gct gca cca tct 405 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 130 135 <210> 20 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe 20 25 30 Pro Val Cys Ile Cys Arg Arg Gln Ser His His His Leu Pro Gly Glu 35 40 45 Ser Gly His Ser Pro Leu Phe Lys Leu Val Ser Ala Glu Thr Arg Glu 50 55 60 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Ser 65 70 75 80 His His Gly Ser Val Glu Val Asp Leu Gly Gln Ile Leu Leu Ser Pro 85 90 95 Ser Ala Ala Cys Ser Ser Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Tyr Asn Asn Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 130 135 <210> 21 <211> 387 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(387) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(47) <223> Initiation codon and a portion of a signal sequence are lacked. <220> <221> V_region <222> (48)..(335) <400> 21 gat agg gtc cta ggg gtc ctg atg gtt ggg ttt tcg gtg ccg gat gag 48 Asp Arg Val Leu Gly Val Leu Met Val Gly Phe Ser Val Pro Asp Glu 1 5 10 15 aac atc cag atg acc cag tat cca tct ccc tgt ctg cat acc tgt agg 96 Asn Ile Gln Met Thr Gln Tyr Pro Ser Pro Cys Leu His Thr Cys Arg 20 25 30 aga cag agt cac cat cac ttg cca gag cga gct cag gac att cac cac 144 Arg Gln Ser His His His Leu Pro Glu Arg Ala Gln Asp Ile His His 35 40 45 tat cta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cta agc tct gat 192 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Leu Ser Ser Asp 50 55 60 cta cga tgc atc caa ttt gga aac agg gtc cca tca cgg ttc agt gga 240 Leu Arg Cys Ile Gln Phe Gly Asn Arg Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 65 70 75 80 agt gga tct ggg aca gat tct act tca cca tca gca gcc tgc agc tct 288 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Pro Ser Ala Ala Cys Ser Ser 85 90 95 gaa gat att gca aca tat tac tgt caa cag tat aat aat ctc atc acc 336 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Leu Ile Thr 100 105 110 ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa cga act gtg gct gca cca 384 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 115 120 125 tct 387 Ser <210> 22 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asp Arg Val Leu Gly Val Leu Met Val Gly Phe Ser Val Pro Asp Glu 1 5 10 15 Asn Ile Gln Met Thr Gln Tyr Pro Ser Pro Cys Leu His Thr Cys Arg 20 25 30 Arg Gln Ser His His His Leu Pro Glu Arg Ala Gln Asp Ile His His 35 40 45 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Leu Ser Ser Asp 50 55 60 Leu Arg Cys Ile Gln Phe Gly Asn Arg Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Pro Ser Ala Ala Cys Ser Ser 85 90 95 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Leu Ile Thr 100 105 110 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 115 120 125 Ser <210> 23 <211> 411 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(411) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(66) <220> <221> V_region <222> (67)..(356) <400> 23 atg gac atg agg gtc cct gct cag ctc ctg ggg ctc ctg ctg ctc tgg 48 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 ctc tca ggt gcc aga tgt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc 96 Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 ctg tct gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt 144 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 cag agc att agc agc tat tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa 192 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 gcc cct aag ctc ctg att tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg tcc 240 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ser 65 70 75 80 cat caa ggt tca gtg gca gtg gat tat gcg aca gat ttc cat ttc tca 288 His Gln Gly Ser Val Ala Val Asp Tyr Ala Thr Asp Phe His Phe Ser 85 90 95 cca tca gca gtt tgc cac ctg acg att ttg caa ctt act act gtc cac 336 Pro Ser Ala Val Cys His Leu Thr Ile Leu Gln Leu Thr Thr Val His 100 105 110 aga gtt aca gta tcc cat tca ctt tcg gcc ctg ggg acc aaa gtg gat 384 Arg Val Thr Val Ser His Ser Leu Ser Ala Leu Gly Thr Lys Val Asp 115 120 125 agc aaa cga act gtg gct gca cca tct 411 Ser Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 130 135 <210> 24 <211> 137 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ser 65 70 75 80 His Gln Gly Ser Val Ala Val Asp Tyr Ala Thr Asp Phe His Phe Ser 85 90 95 Pro Ser Ala Val Cys His Leu Thr Ile Leu Gln Leu Thr Thr Val His 100 105 110 Arg Val Thr Val Ser His Ser Leu Ser Ala Leu Gly Thr Lys Val Asp 115 120 125 Ser Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 130 135 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized adaptor sequence <220> <221> misc_difference <222> (1)..(27) <400> 25 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <400> 26 ccagggccgc tgtgctctcg gaggt 25 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(23) <400> 27 gggggtcagg ctggaactga gga 23

【０２２５】「配列表フリーテキスト」 配列番号：３ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列。 配列番号：４ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列。 配列番号：２１ 他の情報：開始コドン及びシグナル配列の一部が欠けて
いる。 配列番号：２５ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
アダプター配列。 配列番号：２６ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列。 配列番号：２７ 他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成した
プライマー配列。

【０２２６】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＣＴＧＦまたはマウスＣＴＧＦを各種哺乳
動物に免疫して調製した各種のモノクローナル抗体の特
性を示す図。

【図２】ヒトＣＴＧＦをヒト抗体産生トランスジェニッ
クマウスに免疫して調製した各種のヒトモノクローナル
抗体の特性を示す図。

【図３】ヒト、マウス及びラットのいずれのＣＴＧＦに
も反応性を有するモノクローナル抗体8-86-2を吸着させ
たアフィニティーカラムを用いて精製した組換えヒトＣ
ＴＧＦ、組換えマウスＣＴＧＦ及び組換えラットＣＴＧ
ＦのSDSポリアクリルアミドゲルでの電気泳動の状態を
示す図。

【図４】ヒト、マウス及びラットのいずれのＣＴＧＦに
も反応性を有するモノクローナル抗体8-86-2を吸着させ
たアフィニティーカラムを用いて精製した組換えヒトＣ
ＴＧＦ、組換えマウスＣＴＧＦ及び組換えラットＣＴＧ
Ｆの、ラット腎臓由来線維芽細胞NRK-49Fの細胞増殖促
進活性を示す図。縦軸は細胞増殖促進活性の強弱の指標
としての［³Ｈ］チミジンの細胞内への取込み量を示
し、横軸は各々の組換えＣＴＧＦの濃度を示す。

【図５】ヒトＣＴＧＦまたはマウスＣＴＧＦを各種哺乳
動物に免疫して調製した各種のモノクローナル抗体のヒ
トＣＴＧＦに対する反応性を示す図。縦軸は抗体の反応
性の指標となる蛍光強度を示し、横軸は各種濃度のヒト
ＣＴＧＦにおけるELISAで試験したモノクローナル抗体
のクローン名を示す。

【図６】ヒトＣＴＧＦまたはマウスＣＴＧＦを各種哺乳
動物に免疫して調製した各種のモノクローナル抗体のマ
ウスＣＴＧＦに対する反応性を示す図。縦軸は抗体の反
応性の指標となる蛍光強度を示し、横軸は各種濃度のマ
ウスＣＴＧＦにおけるELISAで試験したモノクローナル
抗体のクローン名を示す。

【図７】ヒトＣＴＧＦまたはマウスＣＴＧＦを各種哺乳
動物に免疫して調製した各種のモノクローナル抗体のラ
ットＣＴＧＦに対する反応性を示す図。縦軸は抗体の反
応性の指標となる蛍光強度を示し、横軸は各種濃度のラ
ットＣＴＧＦにおけるELISAで試験したモノクローナル
抗体のクローン名を示す。

【図８】ヒトＣＴＧＦをヒト抗体産生トランスジェニッ
クマウスに免疫して調製した各種のヒトモノクローナル
抗体のヒトＣＴＧＦに対する反応性を示す図。縦軸は抗
体の反応性の指標となる蛍光強度を示し、横軸は各種濃
度のヒトＣＴＧＦにおけるELISAで試験したヒトモノク
ローナル抗体のクローン名を示す。

【図９】ヒトＣＴＧＦをヒト抗体産生トランスジェニッ
クマウスに免疫して調製した各種のヒトモノクローナル
抗体のマウスＣＴＧＦに対する反応性を示す図。縦軸は
抗体の反応性の指標となる蛍光強度を示し、横軸は各種
濃度のマウスＣＴＧＦにおけるELISAで試験したヒトモ
ノクローナル抗体のクローン名を示す。

【図１０】ヒトＣＴＧＦをヒト抗体産生トランスジェニ
ックマウスに免疫して調製した各種のヒトモノクローナ
ル抗体のラットＣＴＧＦに対する反応性を示す図。縦軸
は抗体の反応性の指標となる蛍光強度を示し、横軸は各
種濃度のラットＣＴＧＦにおけるELISAで試験したヒト
モノクローナル抗体のクローン名を示す。

【図１１】ヒト腎臓由来線維芽細胞株293-TとヒトＣＴ
ＧＦまたはマウスＣＴＧＦとの接着に対する、ヒトＣＴ
ＧＦまたはマウスＣＴＧＦを各種哺乳動物に免疫して調
製した各種のモノクローナル抗体の阻害活性を示す図。
縦軸は阻害活性の指標となる蛍光強度を示し、横軸は試
験した各種モノクローナル抗体のクローン名を示す。

【図１２】ラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49Fとヒト
ＣＴＧＦの接着に対する、ヒトＣＴＧＦをヒト抗体産生
トランスジェニックマウスに免疫して調製した各種のヒ
トモノクローナル抗体の阻害活性を示す図。縦軸は細胞
結合率（％）を示し、横軸は試験した各種モノクローナ
ル抗体のクローン名を示す。なお、加えた細胞の総数を
100%とした。

【図１３】ラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49F、ヒト
骨肉腫由来細胞株MG-63またはヒト肺由来繊維芽細胞の
各々とヒトＣＴＧＦの接着に対する、ヒトＣＴＧＦをヒ
ト抗体産生トランスジェニックマウスに免疫して調製し
た各種のヒトモノクローナル抗体の阻害活性を示す図。
縦軸は細胞結合率（％）を示し、横軸は試験した各種モ
ノクローナル抗体のクローン名を示す。なお、加えた細
胞の総数を100%とした。

【図１４】ヒトＣＴＧＦまたはマウスＣＴＧＦを各種哺
乳動物に免疫して調製した各種のモノクローナル抗体の
動脈硬化症モデルウサギWHHLの動脈硬化巣組織切片への
反応性を示す該組織の染色状態を示す図。分図（ａ）は
対照試験での染色状態を示し、分図（ｂ）はモノクロー
ナル抗体B35.1での試験での染色状態を示し、分図
（ｃ）はモノクローナル抗体B29.6での試験での染色状
態を示し、分図（ｄ）はモノクローナル抗体13-51-2で
の試験での染色状態を示し、分図（ｅ）はモノクローナ
ル抗体A4.3での試験での染色状態を示し、分図（ｆ）は
モノクローナル抗体C114.4での試験での染色状態を示
し、分図（ｇ）はモノクローナル抗体A11.1での試験で
の染色状態を示し、分図（ｈ）はモノクローナル抗体A2
9.6での試験での染色状態を示し、また分図（ｉ）はモ
ノクローナル抗体C26.11での試験での染色状態を示す。

【図１５】精製ヒトCTGFの刺激によるラット腎臓由来繊
維芽細胞株NRK-49Fの細胞増殖に対する、ヒトＣＴＧＦ
をヒト抗体産生トランスジェニックマウスに免疫して調
製した各種のヒトモノクローナル抗体の阻害活性を示す
図。縦軸は細胞増殖促進活性の強弱の指標としての［³
Ｈ］チミジンの細胞内への取込み量を示し、横軸は各種
濃度の精製ヒトＣＴＧＦを用いて試験したヒトモノクロ
ーナル抗体のクローン名を示す。

【図１６】精製ヒトCTGFの刺激によるラット腎臓由来繊
維芽細胞株NRK-49Fの細胞増殖に対する、ヒトＣＴＧＦ
をヒト抗体産生トランスジェニックマウスに免疫して調
製した各種のヒトモノクローナル抗体の阻害活性を示す
図。縦軸は細胞増殖促進活性の強弱の指標としての［³
Ｈ］チミジンの細胞内への取込み量を示し、横軸は各種
濃度の精製ヒトＣＴＧＦを用いて試験したヒトモノクロ
ーナル抗体のクローン名を示す。

【図１７】ヒトＣＴＧＦをヒト抗体産生トランスジェニ
ックマウスに免疫して調製した各種のヒトモノクローナ
ル抗体の、腎臓疾患及び組織繊維症に対する治療効果を
示す図。縦軸は、疾患症状の進行の指標となるヒドキシ
プロリンの濃度を示し、横軸は投与したヒトモノクロー
ナル抗体のクローン名を示す。脚注のSham groupなる用
語は、正常マウス（開腹のみ実施群）を意味し、またVe
hicle groupなる用語は、PBS投与群を意味する。

【図１８】抗ヒトCTGFヒトモノクローナル抗体の重鎖及
び軽鎖の各々をコードするDNA配列の決定の手順を模式
的に示す図。

【図１９】モノクローナル抗体8-64-6及び8-86-2を用い
たサンドイッチELISAにより定量した標準ヒトＣＴＧ
Ｆ、標準マウスＣＴＧＦ及び標準ラットＣＴＧＦの検量
線を示す図。縦軸は蛍光強度を示し、横軸は標準ＣＴＧ
Ｆの濃度を示す。

【図２０】モノクローナル抗体13-51-2及び8-86-2を用
いたサンドイッチELISAにより定量した標準ヒトＣＴＧ
Ｆ、標準マウスＣＴＧＦ及び標準ラットＣＴＧＦの検量
線を示す図。縦軸は蛍光強度を示し、横軸は標準ＣＴＧ
Ｆの濃度を示す。

【図２１】モノクローナル抗体8-64-6及び8-86-2を用い
たサンドイッチELISAにより定量した胆道閉鎖症患者の
各種血清検体中に含まれるＣＴＧＦ濃度を示す図。縦軸
は定量値（ＣＴＧＦ含量）を示し、横軸は試験した検体
群の種類を示す。なお、第１群（I）は臨床所見は正常
な患者の検体であり、第２群（II）は症状進行中の患者
の検体であり、また第３群（III）は肝臓移植を必要と
する重症患者の検体である。

【図２２】モノクローナル抗体8-64-6及び8-86-2を用い
たサンドイッチELISAにより定量した各種患者の血清検
体中に含まれるＣＴＧＦ濃度を示す図。縦軸は定量値
（ＣＴＧＦ含量）を示し、横軸は試験した検体を採取し
た患者が罹患している疾患名を示す。

【図２３】モノクローナル抗体8-64-6及び8-86-2を用い
たサンドイッチELISAにより定量した慢性関節リウマチ
患者及び変形性関節症患者の関節液検体中に含まれるＣ
ＴＧＦ濃度を示す図。縦軸は定量値（ＣＴＧＦ含量）を
示し、横軸は試験した検体を採取した患者が罹患してい
る疾患名を示す。

【図２４】ウェスタンブロッティング試験によるヒト胎
児皮膚由来繊維芽細胞から精製したヒトCTGFのSDSポリ
アクリルアミドゲルでの電気泳動の状態を示す図。レー
ン１、２及び３は、各々0.2、0.6及び2.0MのNaClでの溶
出画分をプレイミューン抗体（ヒトCTGFで免疫する前の
正常ウサギの血清）を用いた場合の試験結果を示し、レ
ーン４、５及び６は、各々0.2、0.6及び2.0MのNaClでの
溶出画分をウサギ抗ヒトCTGFポリクローナル抗体を用い
た場合の試験結果を示す。

【図２５】種々濃度の精製ヒトCTGFの、ラット腎臓由来
繊維芽細胞株NRK-49Fの細胞増殖に対する細胞増殖促進
活性を示す図。縦軸は細胞増殖促進活性の強弱の指標と
しての［³Ｈ］チミジンの細胞内への取込み量を示し、
横軸は精製ヒトＣＴＧＦの濃度（希釈倍率）を示す。Ｎ
Ｃは、精製CTGFを加えない場合の陰性対照（ネガティブ
コントロール）試験の結果を示す。PDGFは、精製CTGFの
代りにPDGF（血小板由来増殖因子）を用いた場合の陽性
対照（ポジティブコントロール）試験の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 13/12 Ａ６１Ｋ 31/00 ６１３Ｇ 17/00 ６１７ 19/02 ６１９Ａ 29/00 ６２９Ａ 35/00 ６３５ Ａ６１Ｋ 39/395 39/395 Ｎ Ｃ０７Ｋ 1/22 Ｃ０７Ｋ 1/22 14/52 14/52 16/22 16/22 17/00 17/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/543 ５０１Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/545 33/543 ５０１ 33/577 Ｂ 33/545 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 坂本 信二 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−２ 日 本たばこ産業株式会社医薬探索研究所内 (72)発明者 滝川 正春 岡山県岡山市東山二丁目17−22−304 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA43 BA44 GA03 HA01 HA04 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CE13 DA01 DA13 4B065 AA90X AA91X AA91Y AA93Y AB04 BA08 CA25 CA44 CA46 4C085 AA14 BB17 CC02 EE01 4H045 AA10 AA30 BA10 BA42 CA40 DA76 EA28 EA50 FA72

Claims (82)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の（ａ）乃至（ｇ）のいずれかに記
   載の性質を有することを特徴とするモノクローナル抗体
   またはその一部： （ａ）ヒト、マウス及びラットの結合組織増殖因子（Ｃ
   ＴＧＦ）のいずれにも反応性を有する； （ｂ）ヒト及びマウスのＣＴＧＦのいずれにも反応性を
   有し、且つラットのＣＴＧＦに反応性を有しない； （ｃ）マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反応性
   を有し、且つヒトのＣＴＧＦに反応性を有しない； （ｄ）ヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-157
   3）とヒトのＣＴＧＦとの結合、または該細胞株293-Tと
   マウスのＣＴＧＦとの結合を阻害する； （ｅ）ラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-
   1570）、ヒト骨肉腫由来細胞株MG-63（ATCC CRL-1427）
   またはヒト肺由来繊維芽細胞のいずれかとヒトのＣＴＧ
   Ｆとの結合を阻害する； （ｆ）ヒトのＣＴＧＦまたはマウスのＣＴＧＦの刺激に
   よるラット腎臓由来線維芽NRK-49F（ATCC CRL-1570）の
   細胞増殖を阻害する；または （ｇ）ヒドロシキプロリンの生成が上昇的傾向を示して
   いる腎臓における該ヒドロキシプロリンの上昇を抑制す
   る。
2. 【請求項２】 モノクローナル抗体が、下記の（ａ）乃
   至（ｃ）のいずれかに記載の性質を有することを特徴と
   する請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその一
   部： （ａ）ヒトのＣＴＧＦまたはその一部をマウスに免疫し
   て得られるモノクローナル抗体またはその一部であっ
   て、ヒト、マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反
   応性を有する； （ｂ）マウスのＣＴＧＦまたはその一部をハムスターに
   免疫して得られるモノクローナル抗体またはその一部で
   あって、ヒト、マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれに
   も反応性を有する；または （ｃ）マウスのＣＴＧＦまたはその一部をラットに免疫
   して得られるモノクローナル抗体またはその一部であっ
   て、ヒト、マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反
   応性を有する。
3. 【請求項３】 モノクローナル抗体が、下記の（ａ）乃
   至（ｃ）のいずれかに記載の性質を有することを特徴と
   する請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその一
   部： （ａ）ヒトのＣＴＧＦまたはその一部をマウスに免疫し
   て得られるモノクローナル抗体であって、ヒト、マウス
   及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反応性を有し、且つ
   ヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-1573）とヒ
   トのＣＴＧＦとの結合を阻害する； （ｂ）マウスのＣＴＧＦまたはその一部をラットに免疫
   して得られるモノクローナル抗体であって、ヒト、マウ
   ス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反応性を有し、且
   つヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-1573）と
   マウスのＣＴＧＦとの結合を阻害する；または （ｃ）マウスのＣＴＧＦまたはその一部をハムスターに
   免疫して得られるモノクローナル抗体であって、ヒト、
   マウス及びラットのＣＴＧＦのいずれにも反応性を有
   し、且つヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-15
   73）とマウスのＣＴＧＦとの結合を阻害する
4. 【請求項４】 該モノクローナル抗体が、国際寄託番号
   FERM BP-6208で識別される融合細胞から産生されるモノ
   クローナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載
   のモノクローナル抗体またはその一部。
5. 【請求項５】 該モノクローナル抗体が、国際寄託番号
   FERM BP-6208で識別される融合細胞から産生されるモノ
   クローナル抗体と実質的に同一の性質を有するモノクロ
   ーナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載のモ
   ノクローナル抗体またはその一部。
6. 【請求項６】 該モノクローナル抗体が、国際寄託番号
   FERM BP-6209で識別される融合細胞から産生されるモノ
   クローナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載
   のモノクローナル抗体またはその一部。
7. 【請求項７】 該モノクローナル抗体が、国際寄託番号
   FERM BP-6209で識別される融合細胞から産生されるモノ
   クローナル抗体と実質的に同一の性質を有するモノクロ
   ーナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載のモ
   ノクローナル抗体またはその一部。
8. 【請求項８】 ヒト、マウス、またはラットのＣＴＧＦ
   のいずれかに反応性を有するヒトモノクローナル抗体ま
   たはその一部。
9. 【請求項９】 ヒトモノクローナル抗体が、ヒトのＣＴ
   ＧＦに反応性を有するモノクローナル抗体であることを
   特徴とする請求項８に記載のヒトモノクローナル抗体ま
   たはその一部。
10. 【請求項１０】 下記の（ａ）乃至（ｄ）のいずれかに
    記載の性質を有するヒトのＣＴＧＦに反応性を有するヒ
    トモノクローナル抗体またはその一部： （ａ）ヒト腎臓由来線維芽細胞株293-T（ATCC CRL-157
    3）とヒトのＣＴＧＦとの結合を阻害する； （ｂ）ラット腎臓由来線維芽細胞株NRK-49F（ATCC CRL-
    1570）、ヒト骨肉腫由来細胞株MG-63（ATCC CRL-1427）
    またはヒト肺由来繊維芽細胞のいずれかとヒトのＣＴＧ
    Ｆとの結合を阻害する； （ｃ）ヒトのＣＴＧＦまたはマウスのＣＴＧＦの刺激に
    よるラット腎臓由来線維芽NRK-49F（ATCC CRL-1570）の
    細胞増殖を阻害する；または （ｄ）ヒドロシキプロリンの生成が上昇的傾向を示して
    いる腎臓における該ヒドロキシプロリンの上昇を抑制す
    る。
11. 【請求項１１】 ヒトモノクローナル抗体が、ヒト抗体
    を産生する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳
    動物に由来するモノクローナル抗体であることを特徴と
    する請求項８乃至請求項１０のいずれかに記載のヒトモ
    ノクローナル抗体またはその一部。
12. 【請求項１２】 ヒトモノクローナル抗体が、ヒトのＣ
    ＴＧＦを、ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジ
    ェニック非ヒト哺乳動物に免疫することにより得られる
    モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１１
    に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
13. 【請求項１３】 トランスジェニック非ヒト哺乳動物
    が、トランスジェニックマウスであることを特徴とする
    請求項８乃至請求項１２のいずれかに記載のヒトモノク
    ローナル抗体またはその一部。
14. 【請求項１４】 該ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変
    領域をコードするＶ領域のＤＮＡが、DP-5、DP-38、DP-
    65及びDP-75からなる群がら選ばれるいずれかの遺伝子
    セグメントに由来することを特徴とする請求項８乃至請
    求項１３のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体ま
    たはその一部。
15. 【請求項１５】 該ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変
    領域をコードするＶ領域のＤＮＡが、DPK1、DPK9、DPK1
    2及びDPK24からなる群がら選ばれるいずれかの遺伝子セ
    グメントに由来することを特徴とする請求項８乃至請求
    項１３のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体また
    はその一部。
16. 【請求項１６】 該ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変
    領域をコードするＶ領域のＤＮＡが、DP-5、DP-38、DP-
    65及びDP-75からなる群がら選ばれるいずれかの遺伝子
    セグメントに由来し、且つ該ヒトモノクローナル抗体の
    軽鎖可変領域をコードするＶ領域のＤＮＡが、DPK1、DP
    K9、DPK12及びDPK24からなる群がら選ばれるいずれかの
    遺伝子セグメントに由来することを特徴とする請求項８
    乃至請求項１５のいずれかに記載のヒトモノクローナル
    抗体またはその一部。
17. 【請求項１７】 該ヒトモノクローナルの重鎖可変領域
    が、下記（ａ）乃至（ｊ）のいずれかのアミノ酸配列を
    含むアミノ酸を有することを特徴とする請求項９に記載
    のヒトモノクローナル抗体またはその一部： （ａ）配列番号６に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号２１乃至１２０番目のアミノ酸配列； （ｂ）配列番号６に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号２１乃至１２０番目のアミノ酸配列において、１若
    しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加
    されたアミノ酸配列； （ｃ）配列番号８に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号２１乃至１１８番目のアミノ酸配列； （ｄ）配列番号８に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸
    番号２１乃至１１８番目のアミノ酸配列において、１若
    しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加
    されたアミノ酸配列； （ｅ）配列番号１０に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号２１乃至１１６番目のアミノ酸配列； （ｆ）配列番号１０に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号２１乃至１１６番目のアミノ酸配列において、１
    若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
    加されたアミノ酸配列； （ｇ）配列番号１２に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号２１乃至１１６番目のアミノ酸配列； （ｈ）配列番号１２に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号２１乃至１１６番目のアミノ酸配列において、１
    若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
    加されたアミノ酸配列； （ｉ）配列番号１４に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号２１乃至１１７番目のアミノ酸配列；または （ｊ）配列番号１４に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号２１乃至１１７番目のアミノ酸配列において、１
    若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
    加されたアミノ酸配列。
18. 【請求項１８】 該ヒトモノクローナルの軽鎖可変領域
    が、下記（ａ）乃至（ｊ）のいずれかのアミノ酸配列を
    含むアミノ酸を有することを特徴とする請求項９に記載
    のヒトモノクローナル抗体またはその一部： （ａ）配列番号１６に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号２１乃至１２０番目のアミノ酸配列； （ｂ）配列番号１６に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号２１乃至１２０番目のアミノ酸配列において、１
    若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
    加されたアミノ酸配列； （ｃ）配列番号１８に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号２１乃至１２１番目のアミノ酸配列； （ｄ）配列番号１８に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号２１乃至１２１番目のアミノ酸配列において、１
    若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
    加されたアミノ酸配列； （ｅ）配列番号２０に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号２３乃至１１７番目のアミノ酸配列； （ｆ）配列番号２０に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号２３乃至１１７番目のアミノ酸配列において、１
    若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
    加されたアミノ酸配列； （ｇ）配列番号２２に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号１７乃至１１１番目のアミノ酸配列； （ｈ）配列番号２２に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号１７乃至１１１番目のアミノ酸配列において、１
    若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
    加されたアミノ酸配列； （ｉ）配列番号２４に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号２３乃至１１８番目のアミノ酸配列；または （ｊ）配列番号２４に記載されるアミノ酸配列のアミノ
    酸番号２３乃至１１８番目のアミノ酸配列において、１
    若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
    加されたアミノ酸配列。
19. 【請求項１９】 ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノ
    クローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6535で
    識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体
    またはその一部。
20. 【請求項２０】 ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノ
    クローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6535で
    識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体
    と実質的に同一の性質を有するモノクローナル抗体また
    はその一部。
21. 【請求項２１】 ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノ
    クローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6598で
    識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体
    またはその一部。
22. 【請求項２２】 ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノ
    クローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6598で
    識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体
    と実質的に同一の性質を有するモノクローナル抗体また
    はその一部。
23. 【請求項２３】 ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノ
    クローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6599で
    識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体
    またはその一部。
24. 【請求項２４】 ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノ
    クローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6599で
    識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体
    と実質的に同一の性質を有するモノクローナル抗体また
    はその一部。
25. 【請求項２５】 ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノ
    クローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6600で
    識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体
    またはその一部。
26. 【請求項２６】 ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノ
    クローナル抗体であって、国際寄託番号FERM BP-6600で
    識別される融合細胞から産生されるモノクローナル抗体
    と実質的に同一の性質を有するモノクローナル抗体また
    はその一部。
27. 【請求項２７】 ヒトのＣＴＧＦに反応性を有するモノ
    クローナル抗体またはその一部であって、該モノクロー
    ナル抗体が、該モノクローナル抗体をヒトのＣＴＧＦに
    反応性を有する請求項１７若しくは請求項１８に記載の
    いずれかのモノクローナル抗体とヒトのＣＴＧＦからな
    る抗原抗体複合体に反応させた時、該抗原抗体複合体に
    反応性を有しないことを特徴とするモノクローナル抗体
    またはその一部。
28. 【請求項２８】 該モノクローナル抗体が、ヒトモノク
    ローナル抗体であることを特徴とする請求項２７に記載
    のモノクローナル抗体またはその一部。
29. 【請求項２９】 ラットのＣＴＧＦに反応性を有するモ
    ノクローナル抗体またはその一部。
30. 【請求項３０】 可変領域が請求項２乃至請求項７、請
    求項２７または請求項２９のいずれかに記載のモノクロ
    ーナル抗体由来の可変領域であり、かつ定常領域がヒト
    イムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とす
    るヒトのＣＴＧＦに反応性を有する組換えキメラモノク
    ローナル抗体。
31. 【請求項３１】 超可変領域の相補性決定領域の一部ま
    たは全部が請求項２乃至請求項７、請求項２７または請
    求項２９のいずれかに記載のモノクローナル抗体由来の
    相補性決定領域であり、超可変領域の枠組領域がヒトイ
    ムノグロブリン由来の枠組領域であり、かつ定常領域が
    ヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴
    とするヒトのＣＴＧＦに反応性を有する組換えヒト型モ
    ノクローナル抗体。
32. 【請求項３２】 請求項１乃至請求項２９のいずれかに
    記載のモノクローナル抗体を産生する細胞。
33. 【請求項３３】 請求項３０または請求項３１に記載の
    組換えモノクローナル抗体を産生する細胞。
34. 【請求項３４】 該細胞が、該モノクローナル抗体を産
    生する能力を哺乳動物由来のＢ細胞と哺乳動物由来のミ
    エローマ細胞とを融合して得られる融合細胞であること
    を特徴とする請求項３２に記載の細胞。
35. 【請求項３５】 該細胞が、該モノクローナル抗体の重
    鎖をコードするＤＮＡ若しくはその軽鎖をコードするＤ
    ＮＡのいずれか一方のＤＮＡ、または両方のＤＮＡが細
    胞内に導入されることにより形質転換された遺伝子組換
    え細胞であることを特徴とする請求項３２または請求項
    ３３に記載の細胞。
36. 【請求項３６】 該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-
    6535で識別される融合細胞であることを特徴とする請求
    項３４に記載の融合細胞。
37. 【請求項３７】 該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-
    6598で識別される融合細胞であることを特徴とする請求
    項３４に記載の融合細胞。
38. 【請求項３８】 該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-
    6599で識別される融合細胞であることを特徴とする請求
    項３４に記載の融合細胞。
39. 【請求項３９】 該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-
    6600で識別される融合細胞であることを特徴とする請求
    項３４に記載の融合細胞。
40. 【請求項４０】 該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-
    6208で識別される融合細胞であることを特徴とする請求
    項３４に記載の融合細胞。
41. 【請求項４１】 該融合細胞が、国際寄託番号FERM BP-
    6209で識別される融合細胞であることを特徴とする請求
    項３４に記載の融合細胞。
42. 【請求項４２】 請求項１乃至請求項３１のいずれかに
    記載のモノクローナル抗体が固定化されていることを特
    徴とする抗体固定化不溶性担体。
43. 【請求項４３】 不溶性担体が、プレート、試験管、チ
    ューブ、ビーズ、ボール、フィルター及びメンブレンか
    らなる群から選ばれる不溶性担体であることを特徴とす
    る請求項４２に記載の抗体固定化不溶性担体。
44. 【請求項４４】 不溶性担体が、フィルター若しくはメ
    ンブレン、またはアフィニティーカラムクロマトグラフ
    ィーに用いられる不溶性担体であることを特徴とする請
    求項４２に記載の抗体固定化不溶性担体。
45. 【請求項４５】 請求項１乃至請求項３１のいずれかに
    記載のモノクローナル抗体を、単独でまたは他の物質と
    反応することにより検出可能なシグナルをもたらすこと
    ができる標識物質で標識してなる標識抗体。
46. 【請求項４６】 標識物質が、酵素、蛍光物質、化学発
    光物質、ビオチン、アビジン、または放射性同位体であ
    ることを特徴とする請求項４５に記載の標識抗体。
47. 【請求項４７】 請求項１乃至請求項３１のいずれかに
    記載のモノクローナル抗体、請求項４２若しくは請求項
    ４３に記載の抗体固定化不溶性担体、及び請求項４５若
    しくは請求項４６に記載の標識抗体からなる群から選ば
    れる少なくともいずれか１つのモノクローナル抗体、抗
    体固定化不溶性担体または標識抗体を含んでなることを
    特徴とする哺乳動物のＣＴＧＦの検出または定量に用い
    られるキット。
48. 【請求項４８】 請求項４２若しくは請求項４３に記載
    の抗体固定化不溶性担体、及び請求項４５若しくは請求
    項４６に記載の標識抗体を含んでなることを特徴とする
    請求項４７に記載の哺乳動物のＣＴＧＦの検出または定
    量に用いられるキット。
49. 【請求項４９】 請求項１乃至請求項３１のいずれかに
    記載のモノクローナル抗体、請求項４２若しくは請求項
    ４３に記載の抗体固定化不溶性担体、及び請求項４５若
    しくは請求項４６に記載の標識抗体からなる群から選ば
    れる少なくともいずれか１つのモノクローナル抗体、抗
    体固定化不溶性担体、または標識抗体を用いることを特
    徴とするイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検
    出または定量する方法。
50. 【請求項５０】 少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工
    程を含むイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検
    出または定量する請求項４９に記載の方法： （ａ）請求項４２または請求項４３に記載の抗体固定化
    不溶性担体に、試料を反応せしめる工程；及び （ｂ）該抗体固定化不溶性担体と該試料中に含まれる哺
    乳動物のＣＴＧＦとの結合により形成される抗原抗体複
    合体に、請求項４５または請求項４６に記載の標識抗体
    を反応せしめる工程。
51. 【請求項５１】 少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工
    程を含むイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検
    出または定量する請求項４９に記載の方法： （ａ）請求項４５または請求項４６に記載の標識抗体
    と、試料を反応せしめる工程；及び （ｂ）該標識抗体と試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧ
    Ｆとの結合により形成される抗原抗体複合体に、請求項
    ４２または請求項４３に記載の抗体固定化不溶性担体を
    反応せしめる工程。
52. 【請求項５２】 少なくとも下記（ａ）の工程を含むイ
    ムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検出または定
    量する請求項４９に記載の方法： （ａ）請求項４２若しくは請求項４３に記載の抗体固定
    化不溶性担体、請求項４５若しくは請求項４６に記載の
    標識抗体、及び試料を含む混合物を反応せしめる工程。
53. 【請求項５３】 少なくとも下記（ａ）の工程を含むイ
    ムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検出または定
    量する請求項４９に記載の方法： （ａ）請求項４２または請求項４３に記載の抗体固定化
    不溶性担体に、試料、並びに単独でまたは他の物質と反
    応することにより検出可能なシグナルをもたらすことが
    できる標識物質で標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準
    物質を反応せしめる工程。
54. 【請求項５４】 少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工
    程を含むイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検
    出または定量する請求項４９に記載の方法： （ａ）試料、並びに単独でまたは他の物質と反応するこ
    とにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標
    識物質で標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質との
    混合物に、請求項１乃至請求項３１のいずれかに記載の
    モノクローナル抗体を反応せしめる工程；及び （ｂ）該試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧＦ若しくは
    該標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質と、該モノ
    クローナル抗体との結合により形成される抗原抗体複合
    体に、該モノクローナル抗体に反応性を有する哺乳動物
    由来の抗血清を反応せしめる工程。
55. 【請求項５５】 少なくとも下記（ａ）乃至（ｃ）の工
    程を含むイムノアッセイにより哺乳動物のＣＴＧＦを検
    出または定量する請求項４９に記載の方法： （ａ）試料に、請求項１乃至請求項３１のいずれかに記
    載のモノクローナル抗体を反応せしめる工程； （ｂ）（ａ）の工程を行った反応系に、単独でまたは他
    の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもた
    らすことができる標識物質で標識された哺乳動物のＣＴ
    ＧＦの標準物質を反応せしめる工程；及び （ｃ）該試料中に含まれる哺乳動物のＣＴＧＦ若しくは
    該標識された哺乳動物のＣＴＧＦの標準物質と、該モノ
    クローナル抗体との結合により形成される抗原抗体複合
    体に、該モノクローナル抗体に反応性を有する哺乳動物
    由来の抗血清を反応せしめる工程。
56. 【請求項５６】 請求項４２または請求項４４に記載の
    抗体固定化不溶性担体を含んでなる哺乳動物のＣＴＧＦ
    の分離または精製に用いられるキット。
57. 【請求項５７】 請求項４２または請求項４４に記載の
    抗体固定化不溶性担体を用いたアフィニティークロマト
    グラフィーを用いることを特徴とする哺乳動物のＣＴＧ
    Ｆを分離または精製する方法。
58. 【請求項５８】 アフィニティクロマトグラフィーがア
    フィニティーカラムクロマトグラフィーである請求項５
    ７に記載の哺乳動物のＣＴＧＦの精製方法。
59. 【請求項５９】 ヒトのＣＴＧＦをコードするＤＮＡ
    が、内在性遺伝子座に組み込まれていることを特徴とす
    るトランスジェニックマウス。
60. 【請求項６０】 配列番号２に記載されるアミノ酸配列
    または該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を
    有するラットのＣＴＧＦ。
61. 【請求項６１】 配列番号２に記載されるアミノ酸配列
    を有するラットのＣＴＧＦをコードするＤＮＡ。
62. 【請求項６２】 ＤＮＡが、配列番号１に記載される塩
    基配列中の塩基番号213乃至1256迄の塩基配列を含むこ
    とを特徴とする請求項６１に記載のＤＮＡ。
63. 【請求項６３】 請求項２乃至請求項３１のいずれかに
    記載のモノクローナル抗体若しくはその一部、及び薬学
    的に許容されうる担体とを含んでなる医薬組成物。
64. 【請求項６４】 請求項９乃至請求項１８または請求項
    ２８のいずれかに記載されるヒトモノクローナル抗体若
    しくはその一部、及び薬学的に許容され得る担体とを含
    んでなる医薬組成物。
65. 【請求項６５】 請求項１４乃至請求項１８または請求
    項２８のいずれかに記載されるヒトモノクローナル抗体
    若しくはその一部を含んでなる医薬組成物。
66. 【請求項６６】 該医薬組成物が、ＣＴＧＦの刺激によ
    り増殖する能力を有する細胞の増殖を抑制するために用
    いられることを特徴とする請求項６３乃至請求項６５の
    いずれかに記載の医薬組成物。
67. 【請求項６７】 該医薬組成物が、ＣＴＧＦの刺激によ
    り増殖する能力を有する細胞の増殖を伴う疾患を治療ま
    たは予防するための請求項６３乃至請求項６５のいずれ
    かに記載の医薬組成物。
68. 【請求項６８】 該細胞の増殖が、脳、頚部、肺、心
    臓、肝臓、膵臓、腎臓、胃、大腸、小腸、十二指腸、骨
    髄、子宮、卵巣、精巣、前立腺、皮膚、口腔、舌、及び
    血管からなる群から選ばれる組織における細胞の増殖で
    あることを特徴とする請求項６６または請求項６７に記
    載の医薬組成物。
69. 【請求項６９】 該組織が、肺、肝臓、腎臓、または皮
    膚であることを特徴とする請求項６８に記載の医薬組成
    物。
70. 【請求項７０】 該組織が、腎臓であることを特徴とす
    る請求項６９に記載の医薬組成物。
71. 【請求項７１】 該疾患が、さらに組織の繊維化を伴う
    疾患であることを特徴とする請求項６７に記載の医薬組
    成物。
72. 【請求項７２】 該組織の繊維化が、肺、肝臓、腎臓ま
    たは皮膚における繊維化であることを特徴とする請求項
    ７１に記載の医薬組成物。
73. 【請求項７３】 該組織の繊維化が、腎臓における繊維
    化であることを特徴とする請求項７２に記載の医薬組成
    物。
74. 【請求項７４】 ＣＴＧＦ阻害剤またはＣＴＧＦ産生阻
    害剤、並びに薬学的に許容され得る担体とを含んでな
    り、腎臓における疾患を治療または予防するための医薬
    組成物。
75. 【請求項７５】 該阻害剤が、ＣＴＧＦに反応性を有す
    るモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７
    ４に記載の医薬組成物。
76. 【請求項７６】 該阻害剤が、請求項９乃至請求項３１
    のいずれかに記載のモノクローナル抗体であることを特
    徴とする請求項７４に記載の医薬組成物。
77. 【請求項７７】 該阻害剤が、請求項１４乃至請求項１
    ８または請求項２８のいずれかに記載のヒトモノクロー
    ナル抗体であることを特徴とする請求項７６に記載の医
    薬組成物。
78. 【請求項７８】 該疾患が、組織の繊維化と伴う疾患で
    あることを特徴とする請求項７４乃至請求項７７のいず
    れかに記載の医薬組成物。
79. 【請求項７９】 ＣＴＧＦの刺激により増殖する能力を
    有する細胞のＣＴＧＦの刺激による増殖を抑制する能力
    を有する物質、及び薬学的に許容され得る担体とを含ん
    でなり、腎臓における該細胞の増殖を抑制するための医
    薬組成物。
80. 【請求項８０】 該物質が、ＣＴＧＦに反応性を有する
    モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７９
    に記載の医薬組成物。
81. 【請求項８１】 該阻害剤が、請求項９乃至請求項３１
    のいずれかに記載のモノクローナル抗体であることを特
    徴とする請求項７９に記載の医薬組成物。
82. 【請求項８２】 該阻害剤が、請求項１４乃至請求項１
    ８または請求項２８のいずれかに記載のヒトモノクロー
    ナル抗体であることを特徴とする請求項８１に記載の医
    薬組成物。