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WO2002050542A1 - Multiple-inspection multiplexing method and suspension for multiple-inspection multiplexing - Google Patents

Multiple-inspection multiplexing method and suspension for multiple-inspection multiplexing Download PDF

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WO2002050542A1
WO2002050542A1 PCT/JP2001/010994 JP0110994W WO0250542A1 WO 2002050542 A1 WO2002050542 A1 WO 2002050542A1 JP 0110994 W JP0110994 W JP 0110994W WO 0250542 A1 WO0250542 A1 WO 0250542A1
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WO
WIPO (PCT)
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test
labeled
types
type
site
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2001/010994
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masayuki Machida
Hiroko Hagiwara
Hideji Tajima
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Precision System Science Co Ltd
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Original Assignee
Precision System Science Co Ltd
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Precision System Science Co Ltd, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST filed Critical Precision System Science Co Ltd
Priority to US10/450,584 priority Critical patent/US20040096857A1/en
Priority to DE10197053T priority patent/DE10197053T1/de
Publication of WO2002050542A1 publication Critical patent/WO2002050542A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/102—Multiple non-interacting labels

Definitions

  • the present invention relates to a multiple test multiplex method and a multiple test multiplex suspension.
  • the present invention is particularly applicable to the fields that require testing, analysis, and analysis of biopolymers such as genes, immune systems, proteins, amino acids, and sugars, such as engineering, food, agricultural, and fishery processing. It relates to all fields such as agriculture, pharmacy, hygiene, health, immunity, disease, genetics and other medical fields, and chemistry or biology and other science fields.
  • the present invention particularly relates to a multiple test multiplex method and a multiple test multiplex suspension suitable for gene mutation analysis, polymorphism analysis, mapping, nucleotide sequence analysis, expression analysis and the like.
  • gene amplification techniques eg, PCR
  • hybridization and ligation detection methods are used.
  • the sequence of the probe hybridized to the target sequence can be separated and detected (e.g., the probe contains a combination of magnetic particles and ataridinium S) using a specific sequence. There was something that determined whether or not it was present (Tokuheihei 91-5108878).
  • This method is specifically a method for identifying a target polynucleic acid sequence
  • the probes are made to be complementary to part or all of the predicted sequence of the target polynucleic acid, and one of the probes is used in a reaction mixture.
  • the other probe should be attached to a label that can be easily separated from the
  • the analysis is always limited to the inspection of one kind of base sequence. Therefore, in order to perform multiple analyses, the above method must be performed separately for each type. For this purpose, it is necessary to prepare a large number of containers, reactants, and reagents for each type, to wash containers and the like for each test, and to provide equipment such as a thermostat. However, it is necessary to sequentially perform the processing for each type, which requires a long processing time, and also requires a large processing space and processing equipment.
  • An object of the present invention is to provide a method for multiplexing a plurality of tests and a suspension for a plurality of tests capable of efficiently performing processing by omitting a work space.
  • the second purpose is to perform multiple types of tests collectively and in parallel, so that even small amounts for each test can be handled together and handled in a parsed amount, making it easier to handle and easier to use.
  • the third objective is to collect multiple types of tests in parallel and to reduce the cost of testing, such as reagents and other items that are commonly needed for each test, equipment such as temperature and other environment, and labor. It is an object of the present invention to provide a method for multiplexing multiple tests, which can reduce the number of samples.
  • the fourth purpose is to perform multiple types of tests in parallel and collectively
  • the same conditions can be set for inspection, and the results of inspection can be compared under the same conditions for each type, thereby finding essential differences between types and improving reliability. It is an object of the present invention to provide a method for multiplexing multiple tests and a suspension for multiplexing multiple tests capable of obtaining highly accurate and accurate test results.
  • the fifth purpose is to perform a large number of information, such as the determination of the base sequence of genetic material, etc. It is an object of the present invention to provide a multiplexing method and a suspension for multiple test multiplexing. Disclosure of the invention
  • a first invention includes a generation step of generating a group of labeled detectors of a plurality of test types that are labeled so as to be mutually identifiable among the test types; A group of labeled detectors of a plurality of test types generated, and a plurality of test types selected to bind or not bind to the labeled detectors for each test type according to the content of the test of each test type.
  • Inspection type refers to a plurality of inspection types to be performed in parallel. Inspection types can be distinguished by, for example, the type of inspection object and the type of inspection site in the same inspection object.
  • labeled detector refers to a labeled detector
  • detector refers to a minute solid used for detection, and is contained in the suspension for each test type. Many are included. “Labeling” is performed, for example, by binding to a labeling substance. Labeling may be performed not only with optical substances but also with substances having various other physical quantities and stoichiometric quantities that can be quantified instantaneously.
  • degree of retention means the amount of retention, that is, the degree of labeling at the time of detection, and when labeling is performed optically, for example, the intensity of light. In the embodiment “having a binding substance”, the binding substance is bound, the binding substance is attached or fixed, the binding substance is adsorbed, and the binding substance is coated on the surface of the fine particles. Or the presence of a binding substance via another substance.
  • the test for identifying the particle by the label can be performed.
  • the type can be specified, and various information can be easily obtained for the test type.
  • a plurality of types of tests can be executed in parallel by multiplexing the tests. Therefore, the processing time can be shortened and the efficiency can be improved, the work area required for the processing can be reduced, and the equipment to be used can be compact.
  • the same condition can be set for each type of inspection, and the inspection results can be compared between the types under the same condition. This makes it possible to discover essential differences between the types and obtain reliable and accurate inspection results. It is also suitable for efficient detection processes that require repetition of many simple processes because a large amount of information needs to be obtained, such as when determining the base sequence of genetic material. Te, ru.
  • the “labeling substance” includes, for example, a luminescent substance such as a fluorescent substance, a substance that emits an electromagnetic wave, a substance that emits a magnetic field, and a charged substance.
  • the labeling is performed by making the labeling substance containing the predetermined type contained in the predetermined quantitative ratio different so as to be identifiable among the respective test types. Therefore, in addition to the effects described above, there is an effect that it is possible to distinguish between a large number of test types (for example, hundreds, thousands, tens of thousands or more types) using a small number of types of labeling substances. Also, By suspending a large number of related substances for each test type, accurate and precise labeling can be achieved easily and within statistical errors.
  • the entirety of the labeling substance of each test type is distributed to substantially all of the labeled detectors for each test type, and one label
  • the detection reagent is a multiple test and multiplexing method including a step of binding only one kind of labeling substance.
  • each of the detection objects binds to only one kind of the labeling substance. Therefore, the quantitative ratio becomes the detection intensity of the labeling substance specifically bound to each fine particle, so that not only the presence or absence but also the degree of presence can be easily detected.
  • the labeled detection object is Each of the test objects is labeled, and in the test step, the binding substance is a substance that can bind only when the test object has a predetermined structure.
  • Test object includes genetic material, immune system, proteins, amino acids, biomolecules such as bran, and the like.
  • the structure of the DNA base sequence and the like can be determined with high reliability and high accuracy.
  • the generation step includes:
  • the labeled detector is a plurality of types of known structures that are expected to bind to the binding substance only when the unknown structure is present, and is labeled differently from each other.
  • the unknown structure of the inspection target substance of a plurality of inspection types can be determined with high accuracy.
  • the detection body and the binding substance in the inspection step are substances selected so as to bind to each other only when the inspection object is present, and in the processing step, the inspection object and the binding substance are also suspended. It is a turbid multiple test multiplexing method.
  • the sixth invention in addition to the above-described effects, for example, it is easy to apply to a test on whether or not a microorganism species is present in a certain sample. This makes it possible to easily and surely carry out a test for the presence of E. coli, O-157, and the like.
  • a seventh aspect of the present invention in any one of the first to third aspects of the invention, when the structure of a predetermined test site of a plurality of test types of genetic material is tested for validity, the labeling detection is performed in the generation step.
  • a single-stranded test site as a body is cut to include one test type at a time and generates genetic material such as a labeled DNA fragment, and the binding substance of each test type has a normal or abnormal structure. If so, a multiple test multiplexing method is a genetic material having a single-stranded base sequence selected to bind or not bind to the test site of the genetic material.
  • a labeled detection object which is cut so as to include a single-stranded test site where a test of the structure of one kind of DNA or the like is performed is included. Used. Therefore, multiple mutations in the DNA base sequence can be efficiently and accurately identified in parallel.
  • the production step is labeled with a double-stranded DNA having a plurality of test types of test sites, and a labeling substance bound to one end for each test type, Mix a primer group with a recognition site for Type S restriction enzyme, which has a cleavage site where the test site downstream of the 3 'end of the primer is a protruding end, and a primer group that pairs with it. Amplifying the double-stranded DNA fragment by PCR, and treating the amplified DNA fragment with a Type S restriction enzyme, so that the labeled detector has a protruding end of the test site at the other end.
  • DNA fragments with protruding ends The number exam type of particle groups, and mixed by suspending the labeled detector in the liquid is a plurality inspection multiplexing method for performing a ligation reaction.
  • a double-stranded DNA having a plurality of test sites is used as the detector, and a type II S in which a recognition site and a cleavage site are separated by 10 base pairs or more for each test site.
  • a restriction enzyme recognition sequence is provided upstream of the 3 'end and treated with a Type S restriction enzyme using a plurality of labeled detection primers and a corresponding pair of detection primers.
  • the DNA fragment is labeled at one end and has a protruding end of the detection site at the other end.
  • double-stranded DNA can be obtained at any position without adversely affecting the test site. Because it can be cut, a versatile or versatile test can be performed.
  • the generation step is labeled such that each test type is identifiable, and DNA extraction for suspending a large number of unknown DNAs for each test type.
  • a primer group that initiates DNA synthesis for multiple known test types to be tested for the presence of the base sequence in the solution, and a primer group for multiple test types that form a pair with each primer type This is a multiple test multiplexing method having an amplification step of amplifying by a PCR method by suspending a large number of microparticles in a DNA extract in which a large number of unknown DNAs are suspended.
  • a test is also performed to determine whether or not genetic material is present in a DNA extract in which unknown DNA, which is a test object of a plurality of types, is suspended. And can be done quickly and efficiently.
  • the amplification step comprises:
  • Each of the above-mentioned structures has a base or base sequence which is expected to be mutated or inserted at the position corresponding to the mutation site at or near the end of the primer 3, or does not have a corresponding base or base sequence Wherein those having different structures are labeled so as to be distinguishable from each other, and the binding substance is mutated or mutated at a position corresponding to the mutation site, which is located at the 3 ′ end of the primer or in the vicinity or upstream thereof.
  • a primer having a predicted base or base sequence or no corresponding base or base sequence This is a multiple test multiplex method in which microparticles having a large number of molecules are suspended in a DNA extract in which a large number of unknown DNAs are suspended and amplified by PCR.
  • the term "primer at or near the 3 'end” means that the further away from the 3' end of the primer, the more the base or base sequence at the position corresponding to the mutation site is synthesized and amplified by PCR. In this case, the effect of the reaction is reduced, and synthesis and amplification may be performed regardless of the difference in the base or the base sequence. Further, “having no corresponding base or base sequence” means a primer in the case where a deletion is present at the corresponding position of the DNA to be tested.
  • the eleventh invention is the invention according to any one of the first to third inventions, wherein the structure of a predetermined detection site of a protein of a plurality of test types having a predetermined immobilization site is correct or not, and whether or not the structure is present.
  • the labeled detector in the production step and the treatment step is a protein of a plurality of test types, and is specifically bound to or not bound to the test site.
  • the labeling substance is labeled with the labeling substance via the selected substance so that each of the plurality of detection types can be distinguished from each other, and the binding substance is selected so as to specifically bind to the immobilization site. This is a multiple test multiplexing method.
  • the inspection site is determined so that the structure of one type of protein is checked for its existence, its presence, and the degree of its existence. It is labeled with a labeling substance via a group of antibodies selected to bind or not bind. As a result, it is possible to quickly and efficiently carry out a parallel and parallel test for a protein variant at a plurality of protein test sites.
  • a group of labeled detectors of a plurality of test types which are labeled so as to be mutually identifiable among the test types, and each of the test types according to the test content of each test type.
  • the same effects as the effects described in the first invention are exerted.
  • the labeled detector of each test type is labeled by binding only to a labeling substance of each test type, and a labeling substance for each test type is provided.
  • the whole of the sample contains a predetermined type and a predetermined quantitative ratio, and the type or the quantitative ratio is different so that each test type can be distinguished from each other. Liquid.
  • the same effects as the effects described in the second invention are exerted.
  • the entirety of the labeling substance for each test type is distributed to substantially all of the labeled detectors for each test type, and one labeled detector is This is a suspension for multiple detection and multiplexing which is bound only to one type of labeling substance.
  • the same effect as the effect described in the third aspect can be obtained.
  • the labeled detection object group when inspecting the structure of a plurality of types of test objects, is The test object group is labeled differently for each test type, and the binding substance group is a substance that can bind only when the labeled test object has a predetermined structure.
  • the labeling detector in any one of the twelfth invention to the fourteenth invention, in the case of a test for determining an unknown structure of a test object in each test type, the labeling detector It is anticipated that the binding to the binding substance is expected only when the unknown structure is present, and a plurality of types of known structures that are labeled so as to be different from each other. This is a multiple detection multiplex suspension for determining the unknown structure from the bound known structure.
  • the seventeenth invention is directed to any one of the twelfth invention to the fifteenth invention, in the case where the presence or absence of a plurality of inspection types of inspection objects or the degree of the existence thereof is inspected,
  • the label ⁇ : the detection substance and the binding substance are substances selected so as to bind to each other only through the test object.
  • the seventeenth aspect in addition to the above-described effects, it is easy to apply, for example, to a test regarding whether or not a microorganism species is present in a certain sample. This makes it possible to easily and surely carry out a test for the presence or absence of E. coli, 0-157, and the like.
  • the eighteenth invention is the invention according to the fifteenth invention, wherein, in the case of detecting whether or not the structure of a predetermined test site of a plurality of test types of genetic material is correct, each of the labeled detectors is a single-stranded probe.
  • the site is a genetic material such as a DNA fragment that has been cut so that each test type is included in each test type, and the binding substance of each test type has a normal or abnormal structure. It is a genetic material having a single-stranded base sequence selected to bind to or not bind to the detection site of the genetic material.
  • a labeled detector which has been cut so as to include a single-stranded test site in which the structure of one type of DNA or the like is tested for conformity is included. Used. Therefore, a plurality of mutations in the DNA base sequence can be efficiently and accurately identified in parallel.
  • the nineteenth invention is the invention according to any one of the fifteenth invention and the seventeenth invention, which relates to the presence or absence of the structure of a predetermined detection site of a plurality of types of proteins having a predetermined immobilization site.
  • the labeled detector may be the protein, via the substance selected to specifically bind or not bind to the test site.
  • the binding substance is labeled with a labeling substance so as to be distinguishable from each other for each of a plurality of test types, and the binding substance is a substance selected so as to specifically bind to the immobilization site.
  • the “substance” includes, for example, an antibody.
  • the inspection site is determined so as to examine whether or not the structure of one type of protein is present, whether or not it is present, and the degree of its existence. It is labeled with a labeling substance via a group of antibodies selected to bind or not bind. As a result, it is possible to quickly and efficiently carry out a parallel and parallel examination of protein variants for a plurality of types of protein test sites.
  • a twenty-first invention is the invention according to the seventeenth invention, which comprises a plurality of types of predetermined base sequences.
  • a large number of the labeled detection groups are included for each test type.
  • the twenty-second invention in addition to the above-described effects, it is also possible to detect whether or not genetic material is present in a DNA extract in which unknown DNA, which is a test object of a plurality of test types, is suspended. It can be done quickly and efficiently in parallel.
  • a twenty-first invention is the sixteenth invention, wherein, in the case of a test for determining a base sequence of a genetic material having a mutation site where a mutation is predicted, each structure of the labeled detector is the primer
  • a substance having a different structure is labeled so as to be distinguishable from each other, and the binding substance is mutated or inserted at a position corresponding to the mutation site distant from the 3 ′ end of the primer or its vicinity or upstream.
  • a twenty-second invention is the suspension for multiple inspection multiplexing according to any one of the twelfth invention to the twenty-first invention, wherein the fine particles are remotely controllable by a magnetic field or the like.
  • the processing can be performed more efficiently and easily by using fine particles that can be remotely controlled, such as magnetic particles.
  • the labeled detector comprises a double-stranded DNA having a plurality of test sites, The bases at the recognition site and the cleavage site do not overlap for each A Type S restriction enzyme recognition sequence that is so distant as to have no effect is provided upstream of the 3 'end, and labeled multiple types of primers and corresponding multiple types of primers Is a DNA fragment having one end labeled by treatment with Type S restriction enzyme using, and having a protruding end of the test site at the other end.
  • the bases in the recognition site and the cleavage site in each test site do not overlap and are separated so as not to affect the PCR primer
  • the bases are separated by 10 bases or more. Say. Ideally, it should be about 20 to 30 bases apart. In the case of the currently known Typel S restriction enzyme, the maximum is about 10 to 20 bases.
  • a double-stranded DNA having a plurality of detection sites is used as the detector, and the recognition site and the cleavage site are each 10 sites.
  • a Type II S restriction enzyme recognition sequence separated by more than a base pair is provided upstream of the 3 'end, and multiple labeled test types of primers are paired with multiple test type primers. Is a DNA fragment having one end labeled and the other end having a protruding end of the test site, obtained by treatment with Type S restriction enzyme.
  • double-stranded DNA can be cleaved at any position without adversely affecting a test site by using a Type S restriction enzyme recognition sequence. Inspection can be performed.
  • the fine particles preferably include, for example, magnetic particles and can be remotely controlled by a magnetic field or the like.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram of a suspension and a method according to a first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram of a suspension and a method according to a second embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of a suspension and a method according to a third embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram of a suspension and a method according to a fourth embodiment of the present invention.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION A multiple test multiplex method and a multiple test multiplex suspension according to an embodiment of the present invention will be described below with reference to the drawings. This embodiment should not be interpreted as limiting the present invention unless otherwise specified.
  • FIG. 1 shows a multiple test multiplex method and a multiple test multiplex suspension according to the first embodiment.
  • a plurality of test sites 12 and 13 of a specific double-stranded sample DNA 11 which is a genetic material extracted from one patient Is performed to check whether the structure of each test object having the base sequence described in (1) matches the expected structure, that is, whether the structure is correct or not.
  • test type means the types of the test sites 12 and 13 having different positions on the sample DNA 11 and their base sequences.
  • the number of bases in each of the test sites 12 and 13 is only 2 bases. It is not limited to this kind number and this base number.
  • Fig. 1 (a) shows that one end binds to only one of the two types of labeling substances 14 and 15 and is provided upstream of the 3 'end and has a cleavage site at the test site 12
  • the primer group 18 includes the primer 17 containing the Type S restriction enzyme recognition sequence 16 in which the recognition site and the base in the cleavage site are separated by 10 bases or more.
  • the primer group 21 includes a primer group 21 composed of unlabeled primers 20 which are paired with the primer 17.
  • the labeling substances 14 and 15 are, for example, two different types of fluorescent substances.
  • the fluorescent substance include an inducing substance such as FITC (fluorescein isothiocyanate), rhodamine, isothiocyanate, IRD 40 and Cy 3 and an inorganic substance such as europium complex.
  • the test site 13 is similarly labeled, and has a primer group 22 consisting of primers 19 containing the TipelS restriction enzyme recognition sequence.
  • the primer group 24 includes a primer group 24 consisting of the unlabeled primer 23 paired with the primer 19.
  • the quantitative ratio of the primer 17 bound to the labeling substance 14 to the primer 17 bound to the labeling substance 15 (labeling each primer (If the substance is distributed almost equally, it is almost equivalent to the number ratio.) Is 2: 1.
  • the quantitative ratio of the primer 19 bound to the labeling substance 14 to the primer 19 bound to the labeling substance 15 is 1: 2.
  • FIG. 1 (b) the sample DNA 11, the primer group 18 and the primer group 21, the primer group 22, and the primer group 24 are mixed and PCR is performed.
  • Fig. 1 (b) two types of double-stranded DNA fragment groups 25 and 26 having a Tipell S restriction enzyme recognition site near the labeled primer end were synthesized in parallel. Is done.
  • the amplified DNA fragment groups 25 and 26 were treated with a specific S restriction enzyme to have a label at one end and a detection site at the other end.
  • a DNA fragment group 27 consisting of a large number of DNA fragments having 12 protruding ends 6 and a DNA fragment group 29 consisting of a large number of DNA fragments having the protruding end 28 of the test site '13 at the other end are similarly generated.
  • the zero fragment groups 27 and 29 correspond to the labeled detection body groups of the above-described multiple detection types.
  • FIGS. 1 (a), (b), and (c) described above corresponds to the generation step.
  • fine particles 32 having a DNA fragment 31 having a protruding end 30 at the end are prepared as the binding substance.
  • the protruding end 30 of the DNA fragment 31 is complementary to the nucleotide sequence of the detection site 12 when the nucleotide sequence of the detection site 12 is a normal type (GA is used when the test site 12 is normal).
  • GA is used when the test site 12 is normal.
  • TC protruding end
  • a fine particle 35 having a DNA fragment 34 having a protruding end 33 at the end is prepared as the binding substance.
  • the protruding end 33 of the DNA fragment 34 is a complementary protruding end when the nucleotide sequence of the test site 13 is a normal type (AC when the test site 13 is normal). (GT).
  • a collection of many of these is the particle group 37 corresponding to the inspection site 13.
  • the microparticles 32 and 35 have only the same type of DNA fragments 31 and 34, respectively.
  • the DNA fragment groups 27 and 29 generated in Fig. 1 (c) are mixed to perform a ligation reaction.
  • the DNA fragments 31 and DNA fragments which are a large number of binding substances of each of the fine particle groups 36 and 37, are obtained.
  • 34 binds to a large number of DNA fragment groups 27 and 29 each of which is a labeled detector.
  • FIG. 1 (d) corresponds to the processing step.
  • the binding is performed randomly between a large number of substances, the binding is possible in a state where the quantitative ratio of the detected substance to the labeled substance 14 and the labeled substance 15 is maintained except for a statistical error. Binds with substance. This error becomes smaller as the number increases.
  • F 1: F 2 1:
  • the composite particles 38 and 39 labeled in any state as close as possible to 2 are obtained.
  • the structure (AT, CA) of the inspection site 12 or the inspection site 13 is normal or abnormal, respectively. If the structure of each test site 12 and test site 13 is to be specified, the combination of base sequences corresponding to the structures of all test sites expected as the above-mentioned structure is used as the primer group 1 A primer group 18 containing at or near the 3 'end of 8 is formed and labeled so that they can be distinguished from each other, and labeled so that all are different from each other for each test site (12, 13) It can be performed by using a modified material.
  • the two-base overhang used in the above description may be a three- or more-base overhang, such as a four-base overhang by a Type S restriction enzyme such as Fokl.
  • a Type S restriction enzyme such as Fokl.
  • Fokl a Type S restriction enzyme
  • the presence of a plurality of microbial species contaminated in food or the like is detected by reacting each microbial species in one reaction vessel.
  • FIG. 2 (a) prepare a microorganism-containing sample 40 that is expected to contain a plurality of microorganism species.
  • FIG. 2 (b) from the microorganism-containing sample 40, various unknown various sample DNAs contained in the microorganism-containing sample 40 (DNA (1), DNA (2), DNA (3), etc.) 4 Extract 1
  • the test object to be tested for inclusion in the microorganism-containing sample 40 is, for example, two types (of course, three or more types of microorganisms). May be used). These two types correspond to the inspection types.
  • primers 43 and 46 labeled (encoded) by binding the two kinds of labeling substances are prepared so as to be unique to the first microorganism species and the second microorganism species, respectively.
  • primers 43 and 46 for example, a large number of primers having one end bound to only one of two kinds of labeling substances (for example, fluorescent substances) 42 and 44 are prepared. 7 is assumed.
  • the primer groups 45 and 47 correspond to the labeled detection object groups of a plurality of test types.
  • the quantitative ratio of the primer 43 bound to the labeling substance 42 to the primer 43 bound to the labeling substance 44 (if the labeling substance is substantially evenly distributed to each primer, Is about 2: 1).
  • the amount ratio of the primer 46 bound to the labeling substance 42 to the primer 46 bound to the labeling substance 44 is different from each other as 1: 2.
  • FIG. 2 (c) which is a step until the labeling is performed, corresponds to the generation step.
  • the binding substance one in which primers 48 and 49 paired with the primers 43 and 46 are immobilized on microparticles 50 and 51, respectively, is prepared. At that time, before the same The fine particles 50 or 51 have two detection types consisting of a large number of fine particles 50 and 51 in which only the primer 48 or the primer 49 having the same sequence is immobilized. Prepare the particle groups 52, 53.
  • the extracted DNA sample shown in FIG. 2 (b) was used as a test object in a suspension in which the primer groups 45, 47 and the fine particle groups 52, 53 were suspended. Mix and perform PCR. Then, when the first microbial species and the second microbial species were present in the sample, the primers 48 and 49 of the microparticles 50 and 51 were labeled with PCR by PCR. The labeled primers 43 and 46 form a labeled double-stranded DNA fragment as shown in FIG. 2 (d).
  • the labeled substance 42 and the labeled A double strand is formed in a state where the quantitative ratio of the detection substance to the labeling substance 44 is maintained.
  • FIGS. 2D and 2E correspond to the processing step, and the analysis by the flow cytometer corresponds to the detection step.
  • each of the composite particles 54 or 55 will not be detected.
  • Each protein 60, 63 has a predetermined immobilization site 61, 64 to be immobilized on the fine particle group 77, 79 described later, and whether or not there is a mutation, whether the structure is correct or not.
  • Inspection sites 62 and 65 which are sites to be inspected for whether or not they exist or how much they are, are present.
  • test sites 62, 65 of the proteins 60, 63 are of a normal type, they are labeled so as to specifically bind to the test sites 62, 65.
  • antibody groups 69 and 71 consisting of a large number of antibodies 68 and 70 are shown.
  • each antibody group 69 the ratio of the number of the antibodies 68 bound to the labeling substance 66 and the number of the antibodies 68 bound to the labeling substance 67 is 2: 1.
  • the ratio of the number of the antibodies 70 bound to the labeling substance 66 to the number of the antibodies 70 bound to the labeling substance 67 is 1: 2.
  • these proteins 60 and 63 are put into a suspension in which the antibody groups 69 and 71 are suspended, mixed and reacted.
  • a protein group 72 is obtained, which is labeled with protein 60 so that the labeling substances 66, 67 are in a two-to-one relationship, and labeled with protein 63.
  • a protein group 73 is obtained, which is labeled so that the substances 66 and 67 have a ratio of 1: 2.
  • labeled protein groups 72 and 73 are suspended and mixed in a suspension in which the microparticle groups 77 and 79 are suspended. If the detection sites 62, 65 of the proteins 60, 63 are normal, labeled composite particles 80, 81 are formed as shown in FIG. 3 (e). Is done.
  • the labeled substance 66 and the detected substance of the detector are excluded except for statistical errors.
  • the composite particles 80 and 81 are formed in a state where the quantitative ratio with the labeling substance 67 is maintained. This error decreases as the number increases.
  • the steps in FIGS. 3 (d) and 3 (e) correspond to the processing steps, and the detection by the flow cytometer corresponds to the detection step.
  • carcinogenesis may be used instead of the antibodies 68 and 70.
  • Antibodies 68, 70 that specifically bind to the mutated test site of the relevant protein are selected so that the presence or absence of the mutation determines the binding.
  • the presence or absence of a mutated (carcinogenic) protein is determined by measuring the fluorescence intensity of each composite particle 80, 81 bound by such a group of antibodies. It is possible to detect differences and ratios of the amounts between types or differences and ratios of the number of mutation sites per protein.
  • This embodiment is a second embodiment in which a genetic material having a predetermined nucleotide sequence of a plurality of test types described in FIG. 2 includes a genetic material having a mutation site where a mutation is expected. In order to specify the structure of the mutation.
  • FIG. 4 (a) shows a method for determining the structure of a sample DNA 90 when a single base mutation site 91 is present as a test site for the sake of simplicity.
  • Each primer 93 belonging to each primer group 96, 98 having each A, G (T, C) binds only to one type of labeling substance 92, 94, and for each type, the aforementioned labeling substance 92, 94
  • primer 100 paired with primer 93 is used as a binding substance.
  • the large number of fine particles 99 having the large number of primers 100 constitute a fine particle group 101.
  • primer groups 96 and 98 and the fine particle group 1 ° 1 were suspended in a liquid, amplified by PCR, and bound to any of the primer groups 96 and 98 to form a complex formed in the fine particles 99.
  • the structure of the mutation site 91 can be specified.
  • Fig. 4 (b) shows the case where the two types of sample DNA (l) 102 and sample DNA (2) 111 have mutation sites 103 and 112 (for simplicity, the structure of one base is increased). Then, the appropriateness of the structure of the mutation site is determined.
  • labeled primers 105 and 109 are prepared as labeled detectors.
  • the primers 105 and 109 for example, a large number of primers each having one end bonded to only one of two types of labeling substances (for example, fluorescent substances) 92 and 94 are prepared, and are respectively referred to as a primer group 104 and a primer group 110.
  • the ratio of the number of the primer 105 bound to the labeling substance 92 to the number of the primer 105 bound to the labeling substance 94 is 1: 2, and the primer 109 bound to the labeling substance 92 and the labeling substance 94
  • the ratio of the number of primers and the number of primers 109 bound to each other is 2: 1 so that they are different from each other.
  • the binding substance includes primers 106 and 113 paired with the primers 105 and 109, respectively, at a position corresponding to the mutation site 103 or 112 at the 3 ′ end or in the vicinity 107 or 117 thereof.
  • a group of microparticles 108 and 115 comprising two types of microparticles 99 having a large number of primers 106 and 113 each having one base A and G which is expected to be mutated is prepared.
  • This primer group 104, 110 sample DNA (l) 102, DNA (2) 11 1. Suspend particles 108 and 115 in the liquid and amplify them by PCR method. As a result, only when the mutation site 103, 112 of the DNA (l) or DNA (2) has the corresponding base, fluorescence having the above quantitative ratio is observed with a flow cytometer, and the mutation site of the mutation site is detected. The success or failure of the structure can be determined.
  • FIG. 4 (c) shows a method for determining the structure of a single DNA mutation site 122 as a test site in the sample DNA 121 for the sake of simplicity.
  • the respective structures of the labeled detector include the 3 ′ end of the primer 116 or the vicinity thereof at 117 or 119, and the mutation at the positions 117 and 119 corresponding to the mutation site 122.
  • the first particle group bases which are paired with the primer 1 16 and whose mutation is expected at positions 3 and 4 corresponding to the mutation site 122 at the 3, terminal or in the vicinity thereof.
  • a number of primers 123 having A, G (T, C) are used as binding substances.
  • Fine particle groups 126 and 127 composed of four kinds of fine particles 99 having a large number of primers 123 are used.
  • bases A and G that are mutated at positions 124 and 125 corresponding to the mutation site 122 at or near the 3 ′ end of the primer 116 are paired with the primer 116.
  • a number of primers 123 having (T, C) are used as binding substances.
  • the four primers 123 have the same quantitative ratio.
  • a fine particle group 1 29 composed of one type of fine particles 99 is used. Suspension of these primer groups 118, 120, sample DNA 121, and microparticles group 12 9 in the solution and amplification by PCR method, amplifies the mutation site 122. The corresponding fluorescence intensity ratio will be detected. Also, by measuring the overall strength, it is possible to analyze the proportion of the DNA having the mutation site present in the sample.
  • an appropriate base at position 131 which is paired with the primer 116 and is located away from the 3 ′ end thereof and corresponds to the mutation site 131,
  • one type of multiple primers 132 having A (G, T, C or inosine) is used as a binding substance.
  • the fine particle group 130 composed of the fine particles 99 having a large number of primers 13 2 is used.
  • the detection process can be simplified when the third particle group is used, as compared with the case of the first particle group. Note that the use of the first particle group and the third particle group enables parallel inspection in the presence of other DNA.
  • the primer group 118, 120, sample DNA 121, and microparticle group 130 are suspended in a solution and amplified by PCR to respond to the structure of the mutation site 122. Is detected. In addition, by measuring the overall strength, it is possible to analyze how much DNA having the mutation site is present in the sample.
  • the above embodiment has been specifically described for better understanding of the present invention, and does not limit another embodiment. Therefore, it can be changed without changing the gist of the invention.
  • two types of tests were performed in parallel using two types of labeled detectors and labeled with two types of labeling substances.
  • P is not good, and it is possible to perform the test using three or more types of test substances and three or more types of labeling substances.
  • the labeling substance is a luminescent substance
  • the labeling substance is not limited to this example, and may be a substance having various instantaneously quantifiable physical quantities such as a magnetic field, a nuclear spin state, and the like. good.
  • luminescence wavelength and the luminescence intensity may be detected.
  • luminescence polarization degree, luminescence phase, luminescence life and the like may be detected.
  • the above tests are performed for DNA polymorphisms, microbial types, and protein mutations, but are not limited to these examples, and may be used for tests on sugars, amino acids, etc. It goes without saying that you can do it.
  • substances that specifically bind to test substances such as lectins, other proteins, and low-molecular substances can be used.
  • test substances capable of specific binding such as sugars, lipids, and other low and high molecular weight substances.
  • the mutation site was described only for the case of mutation of one or two bases.However, the mutation site is not limited to this example.For example, for a mutation having a base sequence of three or more bases, Needless to say, it can be applied to the case where there is a deletion or insertion. Furthermore, the method of analyzing a mutation site is not necessarily limited to the case of performing multiple tests in parallel, and can be used for performing only one test.

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Description

明 細 書 複数検査多重化方法および複数検査多重化用懸濁液 技術分野
本発明は、 複数検査多重化方法および複数検査多重化用懸濁液に関する。 本発 明は、 特に、 遺伝子、 免疫系、 タンパク質、 アミノ酸、 糖等の生体高分子に関す る検査、 解析、 分析が要求される分野、 例えば、 工学分野、 食品、 農産、 水産加 ェ等の農学分野、 薬学分野、 衛生、 保健、 免疫、 疾病、 遺伝等の医学分野、 化学 もしくは生物学等の理学分野等、 あらゆる分野に関係するものである。
本発明は、 特に、 遺伝子の変異解析、 多型解析、 マッピング、 塩基配列解析、 発現解析等において適した複数検査多重化方法および複数検査多重化用懸濁液に 関する。 背景技術
従来、 遺伝子プローブ （標識化された特定の D NAまたは R NA配列） 分析を 行うために、 遺伝子増幅技術 （例えば P C R) を用いて目的の遺伝子配列を増幅 し、 ハイプリダイゼーシヨン 'ライゲーシヨン検出法を用いて、 ターゲット配列 にハイブリダイズされたプローブの配列が分離され且つ検出されるようにするこ とにより （例えば、 プローブは磁性粒子とアタリジニゥムエスエルの組み合わせ を含有する） 特定の配列が存在するか否かを決定するものがあった （特表平 9一 5 1 0 8 7 8号）。
この方法は、 詳しくは、 ターゲットポリ核酸配列を同定する方法であって、
( a ) 2種類プローブがライゲーシヨンされたときに、 それらのプローブが、 前 記ターゲットポリ核酸の予想配列の一部または全部に相補的であるようにし、 該 プローブの一方は、 そのプローブが反応混合物から容易に分離され得るようにす る部分に結合され、 さらに、 他方のプローブは、 ラベルに結合されるようにし、
( b ) 該プローブをターゲットポリ核酸と混合することにより、 それらのプロ一 プが該ターゲットポリ核酸にハイブリダイズするようにし、 （ c )ライゲーション 用試薬を添加し、 （d )反応混合物を変成することにより、ターゲットポリ核酸か らプロープが分離されるようにし、 （ e )分離を容易にする前記部分を利用して、 プローブを分離し、 さらに、 （f )分離後のプローブを分析して該プローブに前記 ラベルが結合されているか否かを決定するものである。
ところで、 上記の遺伝子プローブ分析方法にあっては、 分析は、 常に 1種類の 塩基配列の検査に限られるものである。 そのために、 複数の分析を行うには、 上 記の方法を、 各種類ごとに別途行う必要がある。 そのために、 各種類ごとに、 容 器や、 反応物質や、 試薬の多種類を大量に用意する必要や、 各検査毎に容器等を 洗浄する必要や、 恒温装置等の設備が必要になったり、 各種類ごとに処理を順次 行う必要があり、 処理時間を長く必要とし、 また、 大きな処理空間や処理設備を 必要とすることになるという問題点を有していた。
また、 各種類の検查ごとに種々の手間がかかるため、 処理が煩雑になり、 使用 者に大きな手間がかかるという問題点をも有していた。
さらに、 各処理ごとに異なる懸濁液や試薬等を種類間でクロスコンタミネーシ ヨンが生じないように用意する必要があるので、 処理の管理に大きな手間がかか ることになるという問題点を有していた。
そこで、 本発明は、 以上の問題点を解決するためになされたものであり、 第 1 の目的は、 複数種類の検査をまとめて並行して行うことにより、 その処理時間の みならず、 その作業空間を省き、 効率的に処理を行うことができる複数検査多重 化方法および複数検査用懸濁液を提供することである。
第 2の目的は、 複数種類の検査をまとめて並行して行うことにより、 各検査ご とには微小な量であっても、 それらをまとめてパルクな量を扱うことによって、 より扱いやすく使い勝手の良い複数検査多重化方法および複数検査多重化用懸濁 液を提供することである。
第 3の目的は、 複数種類の検査をまとめて並行して行うことにより、 各検査に おける共通に必要とする試薬等の物品や、温度等の環境等の設備、人手を節約し、 検査コストを低下させることができる複数検查多重化方法おょぴ複数検査多重化 用懸濁液を提供することである。
第 4の目的は、 複数種類の検査をまとめて並行して行うことにより、 各種類の 検査に同一の条件を設定することが可能となり、 各種類間で同一条件での検査結 果の比較を行うことができ、 これによつて各種類間の本質的な相違点の発見や、 信頼性のある精度の高い検査結果を得ることができる複数検査多重化方法および 複数検査多重化用懸濁液を提供することである。
第 5の目的は、 特に、 遺伝物質の塩基配列の決定等のように大量の情報を得る 必要があるために、 多数の単純な処理を繰り返す必要があるような検査や処理に 適した複数検査多重化方法および複数検査多重化用懸濁液を提供することである。 発明の開示
以上の課題を解決するために、 第 1の発明は、 各検査種類間で相互に識別可能 となるように標識化された複数検査種類の標識化検出体群を生成する生成工程と、 少なくとも、 生成された複数検査種類の標識化検出体群、 および、 各検査種類の 検査の内容に応じて検査種類ごとに前記標識化検出体と結しまたは結合しないよ うに選ばれた複数検查種類の結合物質を、 各検査種類ごとに有する複数検査種類 の微粒子群を、 液中に懸濁させて処理を行う処理工程と、 前記検査種類ごとに、 前記微粒子による標識化検出体の保持の有無またはその程度を検出する検出工程 とを有することによって、 複数検查種類の検査を並行して行う複数検査多重化方 法である。
ここで、 「検査種類」 とは、並行して行おうとする複数の検査の種類をいう。検 査種類は、 例えば、 検查対象物の種類、 同一検査対象物における検査部位の種類 によって区別することができる。
また、 「標識化検出体」 とは、 標識化された検出体であり、 「検出体」 とは、 検 出に用いられる微小な固体であって、 各検査種類ごとに前記懸濁液中に多数含ま れる。 「標識化」 は、例えば標識物質と結合することによって行う。標識物質は、 光学物質のみならず、 種々の瞬時に定量可能な他の物理量、 化学量をもつ物質に よって行っても良い。 「保持の程度」 は、保持量の多少、すなわち検出の際の標識 の程度を意味し、 標識化が光学的に行われる場合には、 例えば光の強度である。 「結合物質を有する」 態様としては、 結合物質が結合し、 結合物質が付着し、 も しくは固定し、 結合物質を吸着し、 結合物質を微粒子の表面にコーティングして いる場合、 または他物質を媒介にして結合物質を有する場合を含む。
第 1の発明によれば、 各微粒子ごとに前記結合物質を介して保持された前記標 識化検出体による標識化の状態を検出しまた検出できないことによって、 その標 織によって識別しようとする検査種類を特定し、 その検査種類について種々の情 報を容易に得ることができる。
また、 第 1の発明によれば、 複数検査種類の検査を多重化することによって並 行して実行することができる。 したがって、 処理時間を短縮化し、 かつ効率化す ることができるとともに、 処理に必要な作業面積を省略化し、 使用する装置はコ ンパクトなもので済むことになる。
また、 各検查ごとには微小な量であっても、 それらをまとめてバルタな量を扱 うことによって、 より扱いやすく使い勝手が良い。 さらに、 各検查における共通 に必要とする試薬等の物品や、 温度等の環境等の設備、 人手を節約し、 検査コス トを低下させることができる。
さらに、 各種類の検査に同一の条件を設定することが可能となり、 各種類間で 同一条件での検查結果の比較を行うことができる。 これによつて各種類間の本質 的な相違点の発見や、 信頼性のある精度の高い検査結果を得ることができる。 ま た、 遺伝物質の塩基配列の決定等のように大量の情報を得る必要があるために、 多数の単純な処理を操り返す必要があるような検查ゃ処理を効率的に行う場合に 適してレ、る。
第 2の発明は、 第 1の発明において、 前記生成工程は、 各検査種類ごとに、 多 数の検出体と、 所定の種類が所定の量比含まれた各検査種類の標識物質とを液中 に懸濁させて結合させる工程を有し、 前記種類またはその量比は、 各検査種類ご とに相互に識別可能となるように異なる複数検査多重化方法である。 ここで、 「標 識物質」 には、 例えば、 蛍光物質等の発光物質、 電磁波を発する物質、 磁場を発 する物質、 電荷をもつ物質等がある。
第 2の発明によれば、 所定の種類が所定の量比含まれた標識物質が各検査種類 間で識別可能となるように異ならせることによって標識化している。したがって、 前述した効果の他に、少数の種類の標識物質を用いて多数の検査種類間（例えば、 数百、 数千、 数万種以上） を識別することができるという効果を奏する。 また、 各検査種類ごとに多数の関係物質を懸濁させることによつて容易にかつ統計誤差 内の正確で精密な標識化を実現することができる。
第 3の発明は、 第 2の発明において、 前記生成工程において、 各検査種類の標 識物質の全体は、 各検査種類ごとの前記標識化検出体の略全てに分配され、 1個 の前記標識化検出体は 1種類の標識物質とのみ結合する工程を有する複数検査多 重化方法である。
第 3の発明によれば、 前述した効果の他に、 各検出体ごとに 1種類の種類の標 識物質とのみ結合するようにしている。 したがって、 量比は個々の微粒子に特異 的に結合した標識物質の検出強度になるので、 単に存在の有無のみならず、 存在 の程度をも容易に検出することができる。
第 4の発明は、 第 1の発明ないし第 3の発明のいずれかにおいて、 複数検査種 類の検査対象物の構造の当否を検査する場合には、 前記生成工程において、 前記 標識化検出体は、 各々前記検査対象物を標識化したものであり、 前記検査工程に おいて、 前記結合物質はその検査対象物が所定構造をもつ場合のみ結合しうる物 質である。
「検査対象物」 には遺伝物質、 免疫系、 タンパク質、 アミノ酸、 糠等の生体高 分子等を含む。
第 4の発明によれば、 前述した効果の他に、 例えば、 D N Aの塩基配列等の構 造について、 高い信頼性をもつて高い精度で決定することができる。
第 5の発明は、 第 1の発明ないし第 3の発明のいずれかにおいて、 各検査種類 における検查対象物の未知の構造の決定を行う検査の場合には、 前記生成工程に おいて、 前記標識化検出体は、 未知の前記構造が存在する場合にのみ、 前記結合 物質との結合が予想される既知の複数種類の構造体であって、 相互に異なるよう に標識化されたものであり、 前記結合物質と結合した前記既知の構造体から前記 未知の構造を決定する複数検查多重化方法である。
第 5の発明によると、 前述した効果の他に、 複数検査種類の検査対象物質の未 知の構造をも高い精度で決定することができる。
第 6の発明は、 第 1の発明ないし第 3の発明のいずれかにおいて、 前記検査対 象物の存在の有無および存在の程度を検査する場合には、 前記生成工程および前 記検査工程における前記検出体およぴ結合物質は、 前記検査対象物が存在する場 合のみ互いに結合するように選ばれた物質であり、 前記処理工程においては、 前 記検査対象物をも懸濁する複数検査多重化方法である。
第 6の発明によると、 前述した効果の他に、 例えば、 ある試料中に微生物種が 存在するか否かに関する検査に適用しやすい。 これによつて、 大腸菌、 O - 157等 の有無の検査を容易かつ確実に実行することができる。
第 7の発明は、 第 1の発明ないし第 3の発明のいずれかにおいて、 遺伝物質の 複数検査種類の所定検査部位の構造の当否を検査する場合には、 生成工程におい て、 前記標識化検出体として一本鎖の検査部位が 1検査種類ずつ含まれるように 切断され、 かつ、 標識化された D N A断片等の遺伝物質を生成し、 各検査種類の 前記結合物質は、 正常または異常な構造であれば、 前記遺伝物質の前記検査部位 と結合しまたは結合しないように選ばれた一本鎖の塩基配列を有する遺伝物質で ある複数検査多重化方法である。
第 7の発明によると、 前述した効果の他に、 標識化検出体として、 1種類の D N A等の構造の当否の検査が行われる 1本鎖の検査部位が含まれるように切断し たものを用いている。 したがって、 D N Aの塩基配列にある複数の変異を並行し て効率的にかつ正確に特定することができる。
第 8の発明は、 第 4の発明において、 前記生成工程は、 複数検査種類の検査部 位をもつ二本鎖の D N Aと、 各検査種類ごとに、 一端に結合した標識物質で標識 化され、 プライマーの 3 ' 末端の下流側にある検査部位が突出末端となる切断部 位をもつ T y p e ll S制限酵素の認識部位が揷入されたプライマー群と、それと 対をなすプライマー群と、 を混合して P C Rにより 2本鎖 D N A断片を増幅する 増幅工程と、増幅された前記 D N A断片を T y p e ll S制限酵素で処理すること によって、 前記標識化検出体として、 他端に検査部位の突出末端を有する D N A 断片を生成する酵素反応工程とを有し、 前記処理工程は、 各検査種類毎に、 前記 標識化検出体の突出末端の塩基配列が正常型である場合に結合可能な塩基配列を もつ突出末端を有する D N A断片を有する複数検査種類の微粒子群、 および前記 標識化検出体を液中に懸濁して混合しライゲーション反応を行う複数検査多重化 方法である。 第 8の発明によれば、 前記検出体として、 複数の検査部位をもつ二本鎖の D N Aを、 各検查部位ごとに認識部位と切断部位とが 1 0塩基対以上離れた T y p e II S制限酵素認識配列を 3 ' 末端の上流側に設けるとともに、標識化された複数 の検查種類のプライマーと、 それと対をなす複数検查種類のプライマーとを用い て T y p e ll S制限酵素で処理することによって得られた一端が標識化され、他 端に検查部位の突出末端を有する D N A断片を用いている。
したがって、 第 8の発明によれば、 前述した効果の他に、 T y p e ll S制限酵 素認識配列を用いることによって、 検査部位に悪影響を与えることなく、 任意の 位置で二本鎖の D N Aを切断することができるので、 多様性または汎用性のある 検查を行うことができる。
第 9の発明は、 第 6の発明において、 前記生成工程は、 各検査種類ごとに識別 可能となるように標識化され、 各検査種類ごとに、 未知の多数の D NAを懸濁す る D N A抽出液中にその塩基配列が存在するか否かの検査の対象となる既知の複 数検査種類の D N A合成を開始するプライマー群と、 それと対をなす複数検査種 類のプライマー群を各検査種類ごとに多数有する微粒子とを、 未知の多数の D N Aを懸濁する D N A抽出液中に懸濁して P C R法により増幅する増幅工程を有す る複数検査多重化方法である。
第 9の発明によれば、 前述した効果の他に、 複数検查種類の検査対象物である 未知の D N Aが懸濁する D N A抽出液中に遺伝物質が存在するか否かの検査を並 行して迅速かつ効率的に行うことができる。
第 1 0の発明は、 第 5の発明において、 各検査種類における変異が予想される 変異部位を有する遺伝物質の塩基配列を決定する検査の場合には、 前記増幅工程 は、 前記標識化検出体の各構造体として、 前記プライマー 3， 末端もしくはその 近傍であって前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想され る塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しない プライマーであって、 その構造が異なるものを互いに識別可能に標識化させ、 前 記結合物質は、 前記プライマーの 3 ' 末端もしくはその近傍もしくは上流側に離 れた前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基も しくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマ 一を多数有する微粒子とを、 未知の多数の D N Aを懸濁する D NA抽出液中に懸 濁して P C R法により増幅する複数検査多重化方法である。
ここで、 「プライマーの 3，末端もしくはその近傍」 としたのは、 プライマーの 3 ' 末端から離れれば離れるほど、 その変異部位に相当する位置における塩基ま たは塩基配列が P C R法による合成、 増幅における影響が小さくなり、 その塩基 または塩基配列の相違に拘わらず合成、 増幅されるおそれがあるからである。 ま た、 「相当する塩基もしくは塩基配列を有しない」 とは、検査対象である D N Aの 対応する位置に欠失が存在する場合のプライマーを意味する。
第 1 0の発明によると、 前述した効果の他に、 複数検査種類の検査対象物質の 未知の構造をも高い精度で決定することができる。
第 1 1の発明は、 第 1の発明ないし第 3の発明のいずれかにおいて、 所定の固 定化部位を有する複数検査種類のタンパク質の所定の検查部位についての構造の 当否、 その存在の有無またはその存在の程度を検査する場合には、 前記生成工程 および前記処理工程における前記標識化検出体は、 複数検査種類のタンパク質で あって、 前記検査部位と特異的に結合しまたは結合しないように選ばれた物質を 介して前記標識物質で各複数検查種類毎に相互に識別可能となるように標識化さ れ、 前記結合物質は、 前記固定化部位と特異的に結合するように選ばれた物質で ある複数検査多重化方法である。
第 1 1の発明によると、 前述した効果の他に、 標識化検出体として、 1種類の タンパク質の構造の当否、 その存在の有無、 その存在の程度の検査が行われるよ うに、 検査部位と結合しまたは結合しないように選ばれた抗体群を介して標識物 質で標識化したものである。 これによつて、 複数種類のタンパク質の検査部位に ついて、 迅速かつ効率的にタンパク質の変異型の検査を並行して行うことができ る。
第 1 2の発明は、 各検査種類間で相互に識別可能となるように標識化された複 数検査種類の標識化検出体群と、 各検査種類の検査内容に応じて検査種類ごとに 前記標識化検出体と結合しまたは結合しないように選ばれた複数検査種類の結合 物質を、 各検査種類ごとに有する複数検査種類の微粒子群とを含む懸濁液であつ て、 前記検査種類ごとに、 前記微粒子による前記標識化検出体の保持の有無また はその程度を検出することによって、 複数検査種類の検査が前記懸濁液を用いて 並行して行われる複数検査多重化用懸濁液である。
第 1 2の発明によれば、 第 1の発明で説明した効果と同様な効果を奏する。 第 1 3の発明は、 第 1 2の発明において、 前記各検査種類の前記標識化検出体 は各検査種類の標識物質とのみ結合することによって標識化され、 各検查種類ご との標識物質の全体は、 所定の種類が所定の量比含まれたものであって、 その種 類またはその量比は、 各検査種類ごとに相互に識別可能となるように異なる複数 検査多重化用懸濁液である。
第 1 3の発明によれば、 第 2の発明で説明した効果と同様な効果を奏する。 第 1 4の発明は、第 1 3の発明において、各検査種類ごとの標識物質の全体は、 各検査種類ごとに前記標識化検出体の略全てに分配され、 1個の標識化検出体は 1種類の標識物質とのみ結合したものである複数検查多重化用懸濁液である。 第 1 4の発明によれば、 第 3の発明で説明した効果と同様な効果を奏する。 第 1 5の発明は、 第 1 2の発明ないし第 1 4の発明のいずれかにおいて、 複数 検査種類の検查対象物の構造の当否を検査する場合には、前記標識化検出体群は、 その検査種類ごとに異なるように標識化された前記検査対象物群であり、 前記結 合物質群はその標識化検査対象物が所定構造を持つ場合のみ結合しうる物質であ る。
第 1 5の発明によれば、 第 4の発明で説明した効果と同様な効果を奏する。 第 1 6の発明は、 第 1 2の発明ないし第 1 4の発明のいずれかにおいて、 各検 查種類における検査対象物の未知の構造の決定を行う検査の場合には、 前記標識 化検出体は、 未知の前記構造が存在する場合にのみ、 前記結合物質との結合が予 想され、 相.互に異なるように標識化されたら既知の複数種類の構造体であって、 前記結合物質と結合した該既知の構造体から前記未知の構造の決定を行う複数検 查多重化用懸濁液である。
第 1 6の発明によると、 前述した効果の他に、 複数検査種類の検査対象物質の 未知の構造をも高い精度で決定することができる。 '
第 1 7の発明は、 第 1 2の発明ないし第 1 4の発明のいずれかにおいて、 複数 検査種類の検査対象物の存在の有無、またはその存在の程度を検査する場合には、 前記標識^:検出体および結合物質は、 前記検査対象物を介してのみ互いに結合す るように選ばれた物質である。
第 1 7の発明によると、 前述した効果の他に、 例えば、 ある試料中に微生物種 が存在するか否かに関する検査に適用しやすい。 これによつて、 大腸菌、 0-157 等の有無の検査を容易かつ確実に実行することができる。
第 1 8の発明は、 第 1 5の発明において、 遺伝物質の複数検査種類の所定検査 部位の構造の当否を検查する場合には、 前記標識化検出体は、 各々、 一本鎖の検 查部位が 1検査種類ずつ含まれるように切断され、 かつ、 標識化された D N A断 片等の遺伝物質であり、 各検査種類の前記結合物質は、 正常なまたは異常な構造 であれば、 前記遺伝物質の前記検查部位と結合しまたは結合しないように選ばれ た一本鎖の塩基配列を有する遺伝物質である。
第 1 8の発明によると、 前述した効果の他に、 標識化検出体として、 1種類の D N A等の構造の当否の検査が行われる 1本鎖の検査部位が含まれるように切断 したものを用いている。 したがって、 D N Aの塩基配列にある複数の変異を並行 して効率的にかつ正確に特定することができる。
第 1 9の発明は、 第 1 5の発明または第 1 7の発明のいずれかにおいて、 所定 の固定化部位を有する複数検査種類のタンパク質の所定の検查部位についての構 造の当否、 その存在の有無またはその存在の程度を検査する場合には、 前記標識 化検出体は、 前記タンパク質であって、 前記検査部位と特異的に結合しまたは結 合しないように選ばれた物質を介して前記標識物質で各複数検査種類毎に相互に 識別可能となるように標識化され、 前記結合物質は、 前記固定化部位と特異的に 結合するように選ばれた物質である。 「物質」 には、 例えば抗体を含む。
第 1 9の発明によると、 前述した効果の他に、 標識化検出体として、 1種類の タンパク質の構造の当否、 その存在の有無、 その存在の程度の検査が行われるよ うに、 検査部位と結合しまたは結合しないように選ばれた抗体群を介して標識物 質で標識化したものである。 これによつて、 複数種類のタンパグ質の検査部位に ついて、 迅速かつ効率的にタンパク質の変異型の検査を並行して行うことができ る。
第 2 0の発明は、 第 1 7の発明において、 複数検查種類の所定塩基配列をもつ 遺伝物質について、 未知の D N Aを懸濁する D N A抽出液中での存在の有無、 ま たは存在の程度を検査する場合には、 前記標識化検出体群は、 各検査種類ごとに 多数含まれ、 各検査種類ごとに識別可能となるように標識化され、 各検査種類ご とに該当する塩基配列の合成、 増幅を開始する既知の多数の複数検查種類のブラ イマ一群であり、 前記結合物質は、 そのプライマー群と対をなす複数検查種類の プライマー群である。
第 2 0の発明によれば、 前述した効果の他に、 複数検査種類の検査対象物であ る未知の D N Aが懸濁する D N A抽出液中に遺伝物質が存在するか否かの検查を 並行して迅速かつ効率的に行うことができる。
第 2 1の発明は、 第 1 6の発明において、 変異が予想される変異部位を有する 遺伝物質の塩基配列を決定する検査の場合には、前記標識化検出体の各構造体は、 前記プライマーの 3 ' 末端もしくはその近傍であって前記変異部位に相当する位 置において変異もしくは挿入が予想される塩基若しくは塩基配列を有しまたは相 当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであって、 その構造の異なる ものを互いに識別可能に標識化させたものであり、 前記結合物質は、 前記プライ マーの 3 ' 末端もしくはその近傍もしくは上流側に離れた前記変異部位に相当す る位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまた は相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであり、 前記微粒子は、 前記構造ごとに前記標識化されたプライマーを前記プライマーを介して保持する 複数検査多重化懸濁液である。
第 2 1の発明によると、 前述した効果の他に、 複数検査種類の検查対象物質の 未知の構造をも高い精度で決定することができる。
第 2 2の発明は、 第 1 2の発明ないし第 2 1の発明のいずれかにおいて、 前記 微粒子は、 磁場等により遠隔操作可能となる複数検査多重化用懸濁液である。 第 2 2の発明によれば、 前述した効果の他に、 磁性粒子等の遠隔操作可能とな る微粒子を用いることによって、処理を一層効率的かつ容易に行うことができる。 第 2 3の発明は、 第 1 2の発明、 第 1 5の発明または第 1 7の発明のいずれか において、 前記標識化検出体は、 複数の検査部位をもつ二本鎖の D NAを、 各検 查部位ごとに認識部位と切断部位とにある塩基が重複せず、 P C Rプライマーに 影響を及ぼさない程度に離れている T y p e ll S制限酵素認識配列を 3 '末端の 上流側に設けるとともに、 標識化された複数検查種類のプライマーと、 それと対 をなす複数検査種類のプライマーとを用いて T y p e ll S制限酵素で処理する ことによつて得られた一端が標識化され、 他端に検査部位の突出末端を有する D NA断片である。
ここで、 「各検査部位ごとに認識部位と切断部位とにある塩基が重複せず、 P C Rプライマーに影響を及ぼさない程度に離れている」 とは、 好ましくは 1 0塩基 以上離れている場合をいう。 理想的には、 2 0〜 3 0塩基程度離れているのが良 い。 し力、し、 現在知られている T y p e ll S制限酵素では、最大 1 0〜2 0塩基 程度である。
第 2 3の発明によれば、 前述した効果の他に、 前記検出体として、 複数の検查 部位をもつ二本鎖の D NAを、 各検査部位ごとに認識部位と切断部位とが 1 0塩 基対以上離れた T y p e II S制限酵素認識配列を 3 '末端の上流側に設けるとと もに、 標識化された複数の検査種類のプライマーと、 それと対をなす複数検査種 類のプライマーとを用いて T y p e ll S制限酵素で処理することによって得ら れた一端が標識化され、 他端に検査部位の突出末端を有する D N A断片である。 本発明によれば、 T y p e ll S制限酵素認識配列を用いることによって、検査 部位に悪影響を与えることなく、 任意の位置で二本鎖の D N Aを切断することが できるので、 多様性または汎用性のある検查を行うことができる。
なお、 以上の第 1から第 1 1の発明において、 前記微粒子は、 例えば、 磁性粒 子を有し、 磁場等により遠隔操作可能となるものが好ましい。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の第 1の実施め形態に係る懸濁液および方法の説明図である。 図 2は、 本発明の第 2の実施の形態に係る懸濁液および方法の説明図である。 図 3は、 本発明の第 3の実施の形態に係る懸濁液および方法の説明図である。 図 4は、 本発明の第 4の実施の形態に係る懸濁液およぴ方法の説明図である。 発明を実施するための最良の形態 本発明の実施の形態に係る複数検査多重化方法および複数検査多重化用懸濁液 を図面に基づいて以下に説明する。 なお、 この実施の形態は特に指定のない限り 本発明を制限するものと解してはならない。
図 1は、 第 1の実施の形態に係るその複数検査多重化方法および複数検查多重 化用懸濁液を示すものである。
図 1 ( a ) に示すように、 本実施の形態では、 例えば、 一人の患者から抽出し た遺伝物質である特定の二本鎖の検体 D N A 1 1の複数箇所の検査部位 1 2、 1 3にある塩基配列をもつ各検査対象の構造が予想される構造と一致するか否か、 すなわち構造の当否の検査を行うものである。
前記 「検查種類」 とは、 ここでは検体 D N A 1 1上の位置およびその塩基配列 が異なる検査部位 1 2、 1 3の種類を意味する。 この例では、説明上簡単のため、 2種類の前記検査部位 1 2、 1 3のみを示し、 また、 各検査部位 1 2、 1 3の塩 基数は 2塩基の場合のみを示しているが、 この種類数およびこの塩基数に限定さ れるものではない。
図 1 ( a ) は、 さらに、 一端が 2つの種類の標識物質 1 4、 1 5のどちらかの みと結合し、 3 ' 末端の上流側に設けられ前記検査部位 1 2に切断部位をもつよ うに、認識部位と切断部位にある塩基とが 1 0塩基以上離れた T y p e ll S制限 酵素認識配列 1 6を含有するプライマー 1 7からなるプライマー群 1 8を有する。 また、 このプライマー 1 7と対をなし、 標識化のされていないプライマー 2 0 からなるプライマー群 2 1を有している。 ここで、 前記標識物質 1 4、 1 5は例 えば種類の異なる 2種類の蛍光物質である。蛍光物質には、例えば、 F I T C (フ ルォレツセイン イソチオシァネート）、 ローダミン、イソチオシァネート、 I R D 4 0 , C y 3等の誘起物質またはユウ口ピウム錯体等の無機物質がある。
前記検査部位 1 3に対しても、 同様にして、 標識化がされ、 前記 T y p e ll S 制限酵素認識配列を含有するプライマー 1 9からなるプライマー群 2 2を有する。 また、 このプライマー 1 9と対をなし、 標識化のされていないプライマー 2 3か らなるプライマー群 2 4を有する。
ここで、 前記プライマー群 1 8では、 前記標識物質 1 4と結合したプライマー 1 7と、 標識物質 1 5と結合したプライマー 1 7との量比 （各プライマーに標識 物質が略均等に分配されるとすれば、個数比に略相当する） とは、 2対 1である。 それに対して、 プライマー群 22では、 前記標識物質 14と結合したプライマー 19と、 標識物質 15と結合したプライマー 19との量比は、 1対 2である。 次に、 図 1 (b) において、 これらの検体 DNA11、 プライマー群 18およ ぴプライマー群 21、 プライマー群 22、 およびプライマー群 24を混合し、 P CRを実行する。
すると、 図 1 (b) に示すように、 標識化されたプライマー側末端の近傍に T y p ell S制限酵素認識部位を有する 2種類の二本鎖 DN A断片群 25、 26が 並行して合成される。
次に、 図 1 (c) に示すように、 増幅された前記 DNA断片群 25、 26を丁 y p ell S制限酵素で処理することによって、 末端に標識物質を有し、 他端に検 查部位 12の突出末端 6を有する多数の DNA断片からなる DNA断片群 27、 同様に、 他端に検査部位' 13の突出末端 28を有する多数の DNA断片からなる DNA断片群 29が生成される。 この0 断片群27、 29が前記複数検查種 類の標識化検出体群に相当する。
以上説明した、 図 1 (a)， (b), (c) の各工程が、前記生成工程に対応する。 次に、 図 1 (d) に示すように、 前記結合物質として、 末端に突出末端 30を 有する DN A断片 31を有する微粒子 32を用意する。 この DN A断片 31の突 出末端 30は、 前記検查部位 12の塩基配列が正常型 （検査部位 12が正常であ つた場合には GA とする） であった場合には、 それと相補的な突出末端を有する (TC)。
これを多数集めたものが前記検査部位 12に対応する微粒子群 36である。 同 様にして、 前記結合物質として、 末端に突出末端 33をもつ DNA断片 34を有 する微粒子 35を用意する。 この DNA断片 34の突出末端 33は、 前記検査部 位 13の塩基配列が正常型 （検査部位 13が正常であった場合には ACとする）で あった場合には、 それと相補的な突出末端を有する（GT)。 これを多数集めたもの が前記検査部位 13に対応する微粒子群 37である。 なお、 前記微粒子 32、 3 5には、 各々同種の DNA断片 31、 34のみを有している。
図 1 (c) で生成された， DNA断片群27、 29と、 前記図 1 (d) におい て生成された前記微粒子群 3 6、 3 7を混合し、 ライゲーシヨン反応を行う。 こ れにより、 いずれの検査部位 1 2、 1 3も正常型である場合には、 前記微粒子群 3 6、 3 7の各々が有する多数の結合物質である D NA断片 3 1および D NA断 片 3 4は、 各々標識化検出体である多数の D N A断片群 2 7および D N A断片群 2 9と結合する。 この図 1 ( d ) が前記処理工程に対応する。
その結合は、 多数の物質同士でランダムに行われるため、 統計的誤差を除き検 出体の前記標識物質 1 4および前記標識物質 1 5との量比が維持された状態で、 結合可能な結合物質と結合する。 この誤差は、 個数が増加すればするほど小さく なる。
したがって、 図 1 ( e ) に示すように、 各々標識物質 1 4および標識物質 1 5 は、 各検査種類毎に異なる量比、 すなわち、 F 1 ： F 2 = 2 ： 1 , および F 1 ： F 2 = 1 ： 2に限りなく近いいずれかの状態で標識ィヒされた複合粒子 3 8および 複合粒子 3 9が得られることになる。
—方、 いずれかの検查部位 1 2、 1 3が変異型である場合 （dでの配列と異な る場合） には、 それぞれ、 各複合粒子 3 8または複合粒子 3 9は検出されないこ とになる。
したがって、 1本の反応容器中で上記の反応を行い、 フローサイトメータで検 出を行うことにより、 2種類以上の変異部位を同時に検出することが可能である。 このフローサイトメータによる検出が、 前記検出工程に相当する。
以上の実施の形態の説明では、検査部位 1 2のまたは検査部位 1 3の構造 (各々 AT， CA)が正常か異常かであるかを調べるのみであった。 もし、 各検查部位 1 2、 検査部位 1 3の構造をも特定しょうとするのであれば、 前記構造体として予想さ れる全検査部位の構造に対応する塩基配列の組み合わせを、 前記プライマー群 1 8の 3 ' 末端またはその近傍に含むプライマー群 1 8を形成し、 相互に識別可能 とするように標識化したものを各検査部位 （1 2、 1 3 ) ごとに全て互いに異な るように標識化したものを用いることによって行うことができる。
また、 以上の説明で用いられた 2塩基突出は、 例えば Fok l等の T y p e ll S 制限酵素による 4塩基突出末端など、 3塩基以上の突出末端を用いることが可能 である。 例えば、 4塩基突出末端の場合には、 異なる配列として認識が可能な場 合の数は 2 5 6種類となり、 同時に検出可能な変異部位ある変異からなる検出の 種類の数を増加させることができる。
続いて、 第 2の実施の形態に係る複数検査多重化方法および複数件多重化用懸 濁液を、 図 2に基づいて説明する。
本実施の形態は、 食品等に汚染されている複数の微生物種の存在を、 その微生 物種毎に、 1本の反応容器中で反応させることによって検出するものである。 図 2 ( a ) で、 複数の微生物種を含むと予想される含微生物試料 4 0を用意す る。 図 2 ( b ) において、 この含微生物試料 4 0から、 その含微生物試料 4 0に 含有されている様々な未知の各種検体 D N A (D N A (1)、 D N A (2)、 D N A (3) 等） 4 1を抽出する。
次に、 図 2 ( c ) に示すように、 前記含微生物試料 4 0に含有されているか否 かの検査の対象となる検査対象物が、 例えば、 2種類 （もちろん、 3種類以上の 微生物種であっても良い） の微生物種であるとする。 この 2種類が前記検査種類 に相当する。
また、 第 1の微生物種および第 2の微生物種に各々特有となるように、 前記 2 種類の標識物質を結合することによって標識化 （コード化） されたプライマー 4 3、 4 6を用意する。 前記プライマー 4 3、 4 6は、 例えば、 一端が 2種類の標 識物質 （例えば蛍光物質） 4 2、 4 4の一方のみと結合したものを多数用意し、 各々プライマー群 4 5とプライマー群 4 7とする。 このプライマー群 4 5、 4 7 が標識化された複数検査種類の標識化検出体群に相当する。
但し、プライマー群 4 5では、前記標識物質 4 2と結合したプライマー 4 3と、 標識物質 4 4と結合したプライマー 4 3との量比 （各プライマーに標識物質が略 均等に分配されるとすれば、 個数比に略相当する） は、 2対 1である。 それに対 して、 プライマー群 4 7では、 前記標識物質 4 2と結合したプライマ一 4 6と、 標識物質 4 4と結合したプライマー 4 6との量比は、 1対 2として互いに異なる ように標識化する。 この標識化を行うまでの工程である図 2 ( c ) は前記生成ェ 程に相当する。
前記結合物質として、 前記プライマー 4 3、 4 6と対をなすプライマー 4 8、 4 9を微粒子 5 0、 5 1に各々固定化されたものを用意する。 その際、 同一の前 記微粒子 5 0または微粒子 5 1には、 同一の配列を有するプライマー 4 8、 また はプライマー 4 9のみが固定化されるようにした多数の微粒子 5 0、 5 1からな る 2検查種類の微粒子群 5 2、 5 3を用意する。
次に、 これらのプライマー群 4 5、 4 7および微粒子群 5 2、 5 3を懸濁させ た懸濁液に、 検查対象物として図 2 ( b ) で示した抽出された D NA試料を混合 し、 P C Rを行う。 すると、 前記試料中に、 第 1の微生物種および第 2の微生物 種が存在していた場合には、 P C R法により、 前記微粒子 5 0、 5 1が有するプ ライマー 4 8、 4 9と標識化されたプライマー 4 3、 4 6によって、 図 2 ( d ) に示すように標識化された二本鎖の D NA断片が形成される。
多数のプライマー 4 3、 4 6と多数のプライマー 4 8、 4 9による二本鎖の形 成はランダムに行われるため、 統計的誤差を除き標識化検出体の前記標識物質 4 2および前記標識化検出体の前記標識物質 4 4との量比が維持された状態で二本 鎖が形成される。
この誤差は、 個数が増加すればするほど小さくなる。 したがって、 図 2 ( d ) に示すように、 各々標識物質 4 2および標識物質 4 4は、 各微生物種毎に異なる 量比、 すなわち、 F 1 ： F 2 = 2 ： 1、 および F 1 ： F 2 = 1 ： 2に限りなく近 いいずれかの状態で標識化された複合粒子 5 4、 5 5が得られることになる。 し たがって、 フローサイトメータを用いた分析によって、 前記量比を検出すること によって、 これらの複合粒子 5 4、 5 5の存在を確認することができる。
この図 2 ( d ) ( e ) が前記処理工程に相当し、前記フローサイトメータによる 分析が前記検出工程に相当する。
—方、 いずれかの微生物種が前記試料中に存在しない場合には、 それぞれ、 各 複合粒子 5 4または複合粒子 5 5は検出されないことになる。
続いて、 第 3の実施の形態に係る複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を 用いた複数検査多重化方法を図 3に基づいて説明する。
この実施の形態では、 試料中に存在する複数の異なるタンパク質について、 そ れぞれ構造の変異を有するか否かの検査を 1個の容器中での反応によって可能と するものである。
図 3 ( a ) に示すように、 ヒト等の組織より、 タンパク質 （P 1 ) 6 0および 異なる種類のタンパク質 （P 2) 6 3を含む粗抽出液を用意する。
各タンパク質 6 0、 6 3には、 後述する微粒子群 7 7、 7 9に固定化されるベ き所定の固定化部位 6 1、 64と、 変異があるか否かの構造の当否、 もしくはそ れが存在するか否か、 またはどのくらい存在するか否かの存在の程度の検査の対 象となる部位である検査部位 6 2、 6 5とを有する。
図 3 (b) に示すように、 タンパク質 6 0、 6 3の前記検査部位 6 2、 6 5が 正常型である場合に、 その検査部位 6 2、 6 5と特異的に結合する標識化された 多数の抗体 6 8、 70からなる抗体群 6 9、 7 1を示す。
各抗体群 6 9では、 前記標識物質 66と結合した抗体 6 8と、 標識物質 6 7と 結合した抗体 6 8との個数の比は、 2対 1である。 それに対して、 抗体群 7 1で は、 前記標識物質 6 6と結合した抗体 7 0と、 前記標識物質 6 7と結合した抗体 70との個数の比は、 1対 2である。
次に、 これらのタンパク質 60、 6 3を、 抗体群 6 9、 7 1が懸濁されている 懸濁液中に投入して混合し、 反応させる。
すると図 3 (c) に示すように、 タンパク質 6 0によって、 前記標識物質 6 6、 6 7が 2対 1となるように標識化されたタンパク質群 7 2が得られ、 タンパク質 6 3によって、 標識物質 6 6、 6 7が 1対 2となるように標識化されたタンパク 質群 7 3が得られる。 このタンパク質群 7 2、 7 3は前記標識化検出体群に相当 する。 すなわち、 図 3 (a), (b), (c) が前記生成工程に相当する。
一方、 図 3 (d) に示すように、 前記結合物質として、 前記固定化部位 6 1、 64と結合可能な多数の抗体 76、 78を多数の微粒子 74、 7 5に固定化させ た微粒子群 7 7、 7 9を用意する。 但し、 同一の粒子には、 同一の抗体のみが固 定化されるようにする。
次にその微粒子群 7 7、 7 9が懸濁する懸濁液中に、 前記標識化されたタンパ ク質群 72、 7 3を懸濁させて混合する。 もし、 前記タンパク質 6 0、 6 3の検 查部位 6 2、 6 5が正常型である場合には、 図 3 (e) に示すような、 標識化さ れた複合粒子 80、 8 1が形成される。
多数の抗体 6 8、 7 1と、 多数のタンパク質 6 0、 6 3との結合はランダムに 行われるため、 統計的誤差を除き検出体の前記標識物質 6 6および前記検出体の 前記標識物質 6 7との量比が維持された状態で複合粒子 8 0、 8 1が形成される。 この誤差は、 個数が增大すればする程小さくなる。
したがって、 図 3 ( e ) に示すように、 各々標識物質 6 6および 6 7は、 各タ ンパク質毎に異なる量比、 すなわち、 F 1 ： F 2 = 2 ： 1、 および F 1 ： F 2 = 1 ： 2に限りなく近いいずれかの状態で標識化されることになる。 したがって、 フローサイトメータを用いた 1粒子ごとに、 前記量比を検出することによって、 これらの複合粒子 8 0、 8 1の存在を確認することができる。 この図 3 ( d ) ( e ) の工程が前記処理工程に相当し、 フローサイトメータによる検出が前記検出工程 に相当する。
さらに、 第 3の実施の形態に係る複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を 用いた複数検査多重化方法の他の例として、 前記抗体 6 8、 7 0に代えて、 発癌 に関連するタンパク質の変異した検査部位に特異的に結合する抗体 6 8、 7 0を 選択し、 変異の有無によって結合の可否が決定されるようにする。
この例では、 そのような抗体群によつて結合された各複合粒子 8 0、 8 1の蛍 光強度を測定することによって、 変異された （発癌に関係する） タンパク質の有 無、 そのタンパク質の種類間の量の相違や比若しくは 1タンパク質あたりの変異 部位の個数の相違や比を検出することができる。
第 4の実施の形態に係る複数検査多重化用懸濁液、 およびその懸濁液を用いた 複数検査多重化方法を、 図 4に基づいて説明する。
本実施の形態は、 第 2の実施の形態として、 図 2で説明した複数検査種類の所 定塩基配列をもつ遺伝物質に、 変異が予想される変異部位を有する遺伝物質が含 まれている場合にその変異の構造をも特定するためのものである。
図 4 ( a ) は、 説明の簡単のために、 検体 D NA 9 0に検査部位として 1塩基 の変異部位 9 1が存在する場合に、 その構造を決定する方法を示す。
前記標識化検出体の各構造体として、 プライマー 9 3の 3 ' 末端もしくはその 近傍 9 5、 9 7であって前記変異部位 9 1に相当する位置において変異が予想さ れる 1塩基 A, G , T , Cを各々有する （図 4では説明の簡単のために Aと Gの みについて図示している) 多数のプライマー 9 3からなる 4種類のプライマー群 9 6、 9 8を液中に懸濁したものを用いる。 各 A， G (T， C) を有する各プライマー群 96、 98に属する各プライマー 93は、 1の種類の標識物質 92、 94とのみ結合し、 各種類ごとに、 前記標識 物質 92， 94と結合した各プライマー群 96、 98は、 予め定めた量比、 例え ば、 プライマー群 96については、 F 1 ： F 2 = 2 ： 1であり、 プライマー群 9 8については F 1 ： F 2 = 1 ： 2である。
なお、 結合物質として、 前記プライマー 93と対をなすプライマー 100を用 いる。 この多数のプライマー 100を有する多数の微粒子 99は微粒子群 101 を構成する。
これらのプライマー群 96、 98、 前記微粒子群 1◦ 1を液中に懸濁させて、 PCR法により増幅し、 前記プライマー群 96、 98のいずれかと結合して微粒 子 99に形成された複合体を検出することによって、 前記変異部位 91の構造を 特定することができる。
図 4 (b) は、 2種類の検体 DNA(l) 102, 検体 DN A (2) 111の各々に 変異部位 103、 112 (説明の簡単上、 1塩基の構造をもっとする） がある場 合に、 その変異部位の構造の当否を決定するものである。
本例では、 標識化検出体として、 標識化されたプライマー 105、 109とを 用意する。 前記プライマー 105、 109は、 例えば、 一端が 2種類の標識物質 (例えば蛍光物質） 92、 94の一方のみと結合したものを多数用意し、 各々プ ライマー群 104と、 プライマー群 1 10とする。
プライマー群 104では、 前記標識物質 92と結合したプライマー 105と、 標識物質 94と結合したプライマー 105との個数の比は、 1対 2であり、 標識 物質 92と結合したプライマー 109と、 標識物質 94と結合したプライマー 1 09との個数の比は 2対 1として互いに異なるように標識化する。
また、 前記結合物質としては、 前記プライマー 105、 109と各々対をなす プライマー 106、 1 13であり、 その 3' 末端もしくはその近傍 107, 11 7の前記変異部位 103、 1 12に相当する位置において、 変異が予想される 1 塩基 A、 Gを各々もつ多数のプライマー 106、 113を有する 2種類の微粒子 99からなる微粒子群 108、 1 15を用意する。
この前記プライマー群 104、 1 10、 検体 DNA(l) 102, DNA(2) 11 1、 微粒子群 1 08、 1 1 5を液中に懸濁させて PC R法で増幅させる。 その結 果、 前記 DNA(l)または DNA(2)の変異部位 103、 1 1 2が該当する塩基を 有する場合のみフローサイトメータで前記量比を持った蛍光が観測され、 前記変 異部位の構造の当否を決定することができる。
図 4 (c) は、 説明の簡単のために、 検体 DNA121に検査部位として 1塩 基の変異部位 1 22が存在する場合に、 その構造を決定する方法を示す。
前記標識化検出体の各構造体として、 プライマー 1 16の 3' 末端もしくはそ の近傍 1 1 7、 1 19であって、 前記変異部位 1 22に相当する位置 1 1 7、 1 1 9において変異が予想される変異が予想される塩基 A， G， T， C (説明の簡 単のため A， Gのみ図示） を各々有する多数のプライマー 1 1 6からなる 4種類 のプライマー群 1 18、 1 20を用いる。 各プライマー群 1 1 8、 1 20に属す る各プライマー 1 16は、 1の種類の標識物質 92、 94とのみ結合し、 各種類 ごとに、 前記標識物質 92、 94と結合した各プライマー群 1 18、 1 20は、 予め定めた量比、 例えば、 プライマー群 1 18については、 F 1 ： F 2 = 2 ： 1 であり、 プライマー群 1 20については F 1 ： F 2 = 1 ： 2である。
また、 第 1の微粒子群の例としては、 前記プライマ一 1 1 6と対をなし、 その 3， 末端もしくはその近傍の前記変異部位 122に相当する位置 124、 125 において、 変異が予想される塩基 A, G (T、 C) を有する多数のプライマー 1 23を結合物質として用いる。 この多数のプライマー 1 23を有する 4種類の微 粒子 99からなる微粒子群 126、 127を用いる。 これらのプライマー群 1 1 8、 1 20、 検体 DNA 1 21, 及び微粒子群 1 26、 127を液中に懸濁させ て PCR法により増幅を行うことにより、 変異部位 1 22の構造に対応する蛍光 強度比が検出されることになる。また、全体としての強度を測定することにより、 その変異部位を有する DN Αが試料中でどの程度の割合で存在するかを解析する ことができる。
第 2の微粒子群の例として、 前記プライマー 1 16と対をなし、 その 3' 末端 もしくはその近傍の前記変異部位 1 22に相当する位置 1 24、 125において、 変異が予想される塩基 A， G (T、 C) を有する多数のプライマー 1 23を結合 物質として用いる。 この 4種類の多数のプライマー 123が同一量比となるよう に有する 1種類の微粒子 9 9からなる微粒子群 1 2 9を用いる。 これらのプライ マー群 1 1 8、 1 2 0、 検体 D NA 1 2 1 , 及ぴ微粒子群 1 2 9を液中に懸濁さ せて P C R法により増幅を行うことにより、 変異部位 1 2 2に対応する蛍光強度 比が検出されることになる。 また、 全体としての強度を測定することにより、 そ の変異部位を有する D N Aが試料中でどの程度の割合で存在するかを解析するこ とができる。
第 3の微粒子群の例として、 前記プライマー 1 1 6と対をなし、 その 3 ' 末端 から離れた内部にあって前記変異部位 1 3 1に相当する位置 1 3 1において、 適 当な塩基、 例えば、 A (G、 T、 Cでも可、 またはイノシン） を有する 1種類の 多数のプライマー 1 3 2を結合物質として用いる。 この多数のプライマー 1 3 2 を有する微粒子 9 9からなる微粒子群 1 3 0を用いる。 この例では、 変異部位に 相当する位置が 3 ' 末端から離れているので、 その変異部位に相当する位置にく る塩基または塩基配列は P C R法による増幅に大きな影響を与えないので、 結合 物質を共通のものを用いることができる。 したがって、 第 3の微粒子群を用いた 場合には第 1の微粒子群の場合に比較して検查処理を簡単化することができる。 なお、 第 1の微粒子群おょぴ第 3の微粒子群を用いることによって、 他の D N A が存在した状態での並行検査が可能となる。
これらのプライマー群 1 1 8、 1 2 0、 検体 D N A 1 2 1 , 及び微粒子群 1 3 0を液中に懸濁させて P C R法により増幅を行うことにより、 変異部位 1 2 2の 構造に対応する蛍光強度比が検出されることになる。 また、 全体としての強度を 測定することにより、 その変異部位を有する D N Aが試料中でどの程度の割合で 存在するかを解析することができる。
以上の実施の形態は、 本発明をより良く理解させるために具体的に説明したも のであって、 別形態を制限するものではない。 したがって、 発明の主旨を変更し ない範囲で変更可能である。 例えば、 以上の説明では、 説明の便宜上、 2検査種 類の検査を、 2種類の標識化検出体を用いて検査を多並行して行い、 2種類の標 識物質によって標識化したものについて説明したが、 この場合に P良られず、 3検 查種類以上の検查、 および 3以上の種類の標識物質を用いて検査を行うことがで さる。 以上の例では、 標識物質が発光物質の場合について説明したが、 標識物質は、 この例に限られず、 磁場、 核スピン状態等、 種々の瞬時に定量可能な物理量をも つ物質であっても良い。 また、 発光物質であっても、 発光波長および発光強度の みならず、 発光偏光度、 発光位相、 発光寿命等を検出するようにしても良い。 以上の検査は、 D N Aに関する多型、 微生物種類の検查、 タンパク質の変異に 関する場合について行われているが、 これらの例に限られることなく、 糖やアミ ノ酸等に関する検査にも用いることができるのはいうまでもない。
また、 抗体以外にも、 レクチン、 その他のタンパク質、 低分子物質など、 検査 物質に特異的に結合する物質を用いることができる。 この場合、 糖、 脂質、 その 他の低分子量および高分子量からなる、 特異的結合が可能な種々の物質の検査を 行うことが可能である。
また、 以上の例では、 変異部位は 1塩基または 2塩基の変異の場合についての み説明したが、 この例に限られることなく、 例えば、 3以上の塩基からなる塩基 配列をもつ変異の場合、 欠失、 揷入がある場合についても適用できることはいう までもない。 さらに、 変異部位の解析方法は、 必ずしも複数検查種類の並行検査 を行う場合に限られず、 1検査種類の検査のみを行う際にも使用することができ る。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 各検査種類間で相互に識別可能となるように標識化された複数検査種類の 標識化検出体群を生成する生成工程と、 少なくとも、 生成された複数検査種類の 標識化検出体群、 および、 各検査種類の検査の内容に応じて検查種類ごとに前記 標識化検出体と結合しまたは結合しないように選ばれた複数検査種類の結合物質 を、 各検査種類ごとに有する複数検査種類の微粒子群を、 液中に懸濁させて処理 を行う処理工程と、 前記検査種類ごとに、 前記微粒子による標識化検出体の保持 の有無またはその程度を検出する検出工程とを有することによって、 複数検査種 類の検査を並行して行うことを特徴とする複数検查多重化方法。
2 . 前記生成工程は、 各検査種類ごとに、 多数の検出体と、 所定の種類が所定 の量比含まれた各検査種類の標識物質とを液中に懸濁させて結合させる工程を有 し、 その種類またはその量比は、 各検査種類ごとに相互に識別可能となるように 異なるものであることを特徴とする請求項 1に記載の複数検査多重化方法。
3 . 前記生成工程において、 各検査種類の標識物質の全体は、 各検査種類ごと の前記標識化検出体の略全てに分配され、 1個の前記標識化検出体は 1種類の標 識物質とのみ結合する工程を有することを特徴とする請求項 2に記載の複数検査 多重化方法。
4 . 複数検査種類の検査対象物の構造の当否を検査する場合には、 前記生成ェ 程において、前記標識化検出体は、各々前記検査対象物を標識化したものであり、 前記検出工程において、 前記結合物質はその検査対象物が所定構造をもつ場合の み結合しうる物質であることを特徴とする請求項 1ないし請求項 3のいずれかに 記載の複数検査多重化方法。
5 . 各検査種類における検査対象物の未知の構造の決定を行う検査の場合には、 前記生成工程において、 前記標識化検出体は、 未知の前記構造が存在する場合に のみ、 前記結合物質との結合が予想される既知の複数種類の構造体であって、 相 互に異なるように標識化されたものであり、 前記結合物質と結合した前記既知の 構造体から前記未知の構想を決定することを特徴とする請求項 1ないし請求項 3 のいずれかに記載の複数検査多重化方法。
6 . 前記検査対象物の存在の有無および存在の程度を検查する場合には、 前記 生成工程および前記検査工程における前記標識化検出体および結合物質は、 前記 検査対象物が存在する場合のみ互いに結合するように選ばれた物質であり、 前記 処理工程においては、 前記検查対象物をも懸濁して処理することを特徴とする請 求項 1ないし請求項 3のいずれかに記載の複数検査多重化方法。
7 . 遺伝物質の複数検査種類の所定検査部位の構造の当否を検査する場合には、 生成工程において、 前記標識化検出体として一本鎖の検査部位が 1検査種類ずつ 含まれるように切断され、かつ、標識化された D N A断片等の遺伝物質を生成し、 各検査種類の前記結合物質は、 正常または異常な構造であれば、 前記遺伝物質の 前記検查部位と結合しまたは結合しないように選ばれた一本鎖の塩基配列を有す る遺伝物質であることを特徴とする請求項 1ないし請求項 3のいずれかに記載の 複数検査多重化方法。
8 . 前記生成工程は、 複数検査種類の検査部位をもつ二本鎖の D NAと、 各検 查種類ごとに、 一端に結合した標識物質で標識化され、 プライマーの 3 ' 末端の 下流側にある検査部位が突出末端となる切断部位をもつ T y p e ll S制限酵素 の認識部位が挿入されたプライマー群と、 それと対をなすプライマー群と、 を混 合して P C Rにより 2本鎖 D N A断片を増幅する増幅工程と、 増幅された前記 D NA断片を T y p e ll S制限酵素で処理することによって、前記標識化検出体と して、 他端に検査部位の突出末端を有する D N A断片を生成する酵素反応工程と を有し、
前記処理工程は、 各検査種類毎に、 前記標識化検出体の突出末端の塩基配列が 正常型である場合に結合可能な塩基配列をもつ突出末端を有する D NA断片を有 する複数検査種類の微粒子群、 および前記標識化検出体群を液中に懸濁して混合 しライゲーション反応を行うものであることを特徴とする請求項 4に記載の複数 検査多重化方法。
9 . 前記生成工程は、 各検査種類ごとに識別可能となるように標識ィヒされ、 各 検査種類ごとに、 未知の多数の D N Aを懸濁する D N A抽出液中にその塩基配列 が存在するか否かの検査の対象となる既知の複数検査種類の D N A合成を開始す るプライマー群と、 それと対をなす複数検査種類のプライマー群を各検査種類ご とに多数有する微粒子とを、 未知の多数の D N Aを懸濁する D N A抽出液中に懸 濁して P C R法により増幅する増幅工程を有することを特徴とする請求項 6に記 載の複数検査多重化方法。
1 0 . 各検査種類における変異が予想される変異部位を有する遺伝物質の塩基 配列を決定する検査の場合には、 前記増幅工程は、 前記標識化検出体の各構造体 として、 前記プライマー 3 ' 末端もしくはその近傍であって前記変異部位に相当 する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しま たは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであって、 その構造が 異なるものを互いに識別可能に標識化させ、 前記結合物質は、 前記プライマーの 3 ' 末端もしくはその近傍もしくは上流側に離れた前記変異部位に相当する位置 において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当 する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーを多数有する微粒子とを、 未知 の多数の D N Aを懸濁する D N A抽出液中に懸濁して P C R法により増幅するこ とを特徴とする請求項 5に記載の複数検査多重化方法。
1 1 . 所定の固定化部位を有する複数検査種類のタンパク質の所定の検査部位 についての構造の当否、 その存在の有無またはその存在の程度を検查する場合に は、 前記生成工程および前記処理工程における前記標識化検出体は、 複数検查種 類のタンパク質であって、 前記検查部位と結合しまたは結合しないように選ばれ た物質を介して前記標識物質で各複数検査種類毎に相互に識別可能となるように 標識化され、 前記結合物質は、 前記固定ィヒ部位と特異的に結合するように選ばれ た物質であることを特徴とする請求項 1ないし請求項 3のいずれかに記載の複数 検査多重化方法。
1 2 . 各検査種類間で相互に識別可能となるように標識化された複数検査種類 の標識化検出体群と、
各検査種類の検査内容に応じて検査種類ごとに前記標識化検出体と結合しまた は結合しないように選ばれた複数検査種類の結合物質を、 各検査種類ごとに有す る複数検査種類の微粒子群とを含む懸濁液であって、
前記検査種類ごとに、 前記微粒子による前記標識化検出体の保持の有無または その程度を検出することによって、 複数検査種類の検査が前記懸濁液を用いて並 行して行われることを特徴とする複数検査多重化用懸濁液。
1 3 . 前記各検査種類の前記標識化検出体は各検査種類の標識物質とのみ結合 することによって標識化され、 各検査種類ごとの前記標識物質の全体は、 所定の 種類が所定の量比含まれたものであって、 その種類またはその量比は、 各検査種 類ごとに相互に識別可能となるように異なることを特徴とする請求項 1 2に記载 の複数検査多重化用懸濁液。
1 4 . 各検査種類ごとの標識物質の全体は、 各検査種類ごとに前記標識化検出 体の略全てに分配され、 1個の標識化検出体は 1種類の標識物質とのみ結合した ものであることを特徴とする請求項 1 3に記載の複数検查多重化用懸濁液。
1 5 . 複数検査種類の検査対象物の構造の当否を検査する場合には、 前記標識 化検出体群は、 その検査種類ごとに異なるように標識化された前記検査対象物群 であり、 前記結合物質群はその標識化検查対象物群が所定構造をもつ場合のみ結 合しうる物質であることを特徴とする請求項 1 2ないし請求項 1 4のいずれかに 記載の複数検査多重化用懸濁液。
1 6 . 各検査種類における検査対象物の未知の構造の決定を行う検査の場合に は、 前記標識化検出体は、 未知の前記構造が存在する場合にのみ、 前記結合物質 との結合が予想され、 相互に異なるように標識化された既知の複数種類の構造体 であって、 前記結合物質と結合した該既知の前記構造体から前記未知の構造の決 定を行うことを特徴とする請求項 1 2ないし請求項 1 4のいずれかに記載の複数 検査多重化用懸濁液。
1 7 . 複数検査種類の検査対象物の存在の有無、 またはその存在の程度を検査 する場合には、 前記標識化検出体および結合物質は、 前記検査対象物を介しての み互いに結合するように選ばれた物質であることを特徴とする請求項 1 2ないし 請求項 1 4のいずれかに記載の複数検査多重化用懸濁液。
1 8 . 遺伝物質の複数検査種類の所定検査部位の構造の当否を検査する場合に は、 前記標識化検出体は、 各々、 一本鎖の検査部位が 1検査種類ずつ含まれるよ うに切断され、 つ、 標識化された D NA断片等の遺伝物質であり、 各検査種類 の前記結合物質は、 正常または異常な構造であれば、 前記遺伝物質の前記検査部 位と結合しまたは結合しないように選ばれた一本鎖の塩基配列を有する遺伝物質 であることを特徴とする請求項 1 5に記載の複数検査多重化用懸濁液。
1 9 . 所定の固定化部位を有する複数検査種類のタンパク質の所定の検查部位 についての構造の当否、 その存在の有無またはその存在の程度を検査する場合に は、 前記標識化検出体は、 前記タンパク質であって、 前記検查部位と特異的に結 合しまたは結合しないように選ばれた物質を介して前記標識物質で各複数検査種 類毎に相互に識別可能となるように標識化され、 前記結合物質は、 前記固定化部 位と特異的に結合するように選ばれた物質であることを特徴とする請求項 1 5ま たは請求項 1 7のいずれかに記載の複数検査多重化用懸濁液。
2 0 . 複数検査種類の所定塩基配列をもつ遺伝物質について、 未知の D N Aを 懸濁する D N A抽出液中での存在の有無、または存在の程度を検査する場合には、 前記標識化検出体群は、 各検査種類ごとに多数含まれ、 各検査種類ごとに識別可 能となるように標識化され、 各検査種類ごとに該当する塩基配列の合成、 増幅を 開始する既知の多数の複数検査種類のプライマー群であり、 前記結合物質は、 そのプライマー群と対をなす複数検査種類のプライマー群であることを特徴とす る請求項 1 7に記載の複数検査多重化用懸濁液。
2 1 . 変異が予想される変異部位を有する遺伝物質の塩基配列を決定する検査 の場合には、 前記標識化検出体の各構造体は、 前記プライマーの 3 ' 末端もしく はその近傍であって前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予 想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有 しないプライマーであって、 その構造の異なるものを互いに識別可能に標識化さ せたものであり、 前記結合物質は、 前記プライマーの 3 ' 末端もしくはその近傍 もしくは上流側に離れた前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入 が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列 を有しないプライマーであり、 前記微粒子は、 前記構造ごとに前記標識化された プライマーを前記プライマーを介して保持することを特^ [とする請求項 1 6に記 載の複数検査多重化懸濁液。
2 2 . 前記微粒子は、 磁場等により遠隔操作可能となるものであることを特徴 とする請求項 1 2ないし請求項 2 1のいずれかに記載の複数検査多重化用懸濁液。
23. 前記標識化検出体は、 複数の検査部位をもつ二本鎖の DNAを、 各検査 部位ごとに認識部位と切断部位とにある塩基が重複せず、 P C Rプライマーに影 響を及ぼさない程度に離れている Ty p ell S制限酵素認識配列を 3'末端の上 流側に設けるとともに、 標識化された複数検査種類のプライマーと、 それと対を なす複数検査種類のプライマーとを用いて Ty p ell S制限酵素で処理するこ とによって得られた一端が標識化され、 他端に検查部位の突出末端を有する D N A断片であることを特徴とする請求項 12、 請求項 1 5または請求項 1 7のいず れかに記載の複数検査多重化用懸濁液。
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