WO2001089582A1

WO2001089582A1 - Preventives and remedies for pulmonary hypertension

Info

Publication number: WO2001089582A1
Application number: PCT/JP2001/004381
Authority: WO
Inventors: Kensuke Egashira; Yoshikazu Yonemitsu; Katsuo Sueishi; Yasuhiro Ikeda; Yoshiyuki Inada
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2001-05-25
Publication date: 2001-11-29
Anticipated expiration: 2002-11-26
Also published as: AU2001258836A1; US7309693B2; US20030162737A1

Description

明細書肺高血圧症予防 ·治療剤技術分野

本発明は、新規な肺高血圧予防 ·治療剤などに関する。背景技術

MCP— 1 (Monocyte c emoat tract ant protein- 1：マクロファ一ジ走化性因子）は C-Cケモカインファミリーに属し、動脈硬化症（ァテローム性動脈硬化症など）の病変部に多く発現していることが知られている（Takeya, M. et. al., H 腹. Pathol. 24:534-539 (1993) ； Yla-Herttuala, S. et. al. , Proc. Natl. Ac a d. Sci. USA, 88:5252-5257 (1991)) 。

一方、原発性肺高血圧症（primary pulmonary hypertension： PH) は予後不良の疾患であり、現在のところ、心肺移植が唯一の効果的な治療方法である。しかし、心肺移植療法はドナーが少なく現実的は治療方法としてはかなり問題がある

発明の開示

かかる状況に鑑み、心肺移植をすることなく、肺高血圧症（特に原発性肺高血圧症）を治療することを可能たらしめる肺高血圧症の治療剤の開発が期待されている。

MCP- 1 (Monocyte chemoattractant protein- 1：マクロファージ走化性因子）は C-Cケモカインファミリ一に属し、動脈硬化症（ァテローム性動脈硬化症など）の病変部に多く発現していることが知られている（Takeya, M. et. al., H urn. Pathol. 24:534-539 (1993) ； Yla-Herttuala, S. et. al. , Proc. Natl. Ac a d. Sci. USA, 88:5252-5257 (1991)) 。

一方、原発性肺高血圧症では、その初期に肺小動脈の炎症（単球/マクロファ —ジを主体として炎症反応）が生じ、ついで中膜肥厚による肺血管抵抗の増加、右心室肥大などが起るが、本発明者らは上記 MC P— 1の作用を抑制する作用を有する MCP— 1の拮抗阻害型ムティン等（本明細書において「拮抗阻害型ムテイン」とは、「ドミナントネガティブムティンまたはミュータント」と同意義に用いられる場合がある）が、予想外にも原発性肺高血圧症の予防 ·治療剤として用いられることを見出した。さらに研究を進めることにより、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、

(1) MCP—1の拮抗阻害型ムティンもしくはその塩、 MCP— 1の拮抗阻害型ムティンをコードする塩基配列を有する DNAまたは MCP— 1に対する中和抗体を含有してなる肺高血圧症予防 ·治療剤、

(2) MCP— 1の拮抗阻害型ムティンが 7ND— MCP— 1である上記（1) 記載の剤、

(3) 肺高血圧症が原発性肺高血圧症である上記（1) 記載の剤、

(4) 肺高血圧症予防 ·治療作用を有する医薬を製造するための上記（1) 記載の MCP— 1の拮抗阻害型ムティンもしくはその塩、 MCP— 1の拮抗阻害型ムティンをコードする塩基配列を有する DNAまたは MCP— 1に対する中和抗体の使用、および

(5) 上記（1) 記載の MCP—1の拮抗阻害型ムティンもしくはその塩、 MC P— 1の拮抗阻害型ムティンをコードする塩基配列を哺乳動物に投与することを特徴とする肺高血圧症予防 ·治療方法のなどに関する。本発明の M CP— 1の拮抗阻害型ムティン（以下、単に本発明のムティンと称する場合がある）は MCP— 1 (Rollins, B.J. Chemokines. Blood. 90:909-92 8 (1997)) ；配列番号： 1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）の有する作用（例えば、単球/マクロファージ走化（遊走）作用など）を抑制する作用を有していれば、いかなるものであってもよいが、具体的には、

(1) MCP— 1の N末端から 2〜76番目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、

(2) MCP— 1の N末端から 3〜76番目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、

(3) MCP— 1の N末端から 4〜76番目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、

(4) MCP— 1の N末端から 5〜76番目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、

(5) MCP— 1の N末端から 6〜76番目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、

(6) MCP—1の N末端から 7〜76番目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、

(7) MCP— 1の N末端から 8〜76番目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、

(8) MCP— 1の N末端から 9〜76番目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、

(9) MCP— 1の N末端から 10〜76番目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、

(10) MCP— 1の N末端から 11〜76番目の部分アミノ酸配列からなるムティン、

(11) MCP— 1の N末端から 2〜8番目のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列（配列番号： 2) からなるムティン（本明細書においては、「7ND— MC P— 1」と称する）、

(12) MCP- 1の N末端から 3番目の As pが A 1 aに置換されたムティン

(13) MCP— 1の N末端から 22番目の V a 1が A s pに置換されたムテイン、

(14) MCP- 1の N末端から 24番目の A r gが L e uに置換されたムテインなどがあげられ、特に、 7ND—MCP— 1が好ましく用いられる。

本発明のムティンは、例えば、ヒ卜ゃ温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニヮトリ、ゥサギ、ブ夕、ヒッジ、ゥシ、ゥマ、サルなど) のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、滕臓 j3細胞、骨髄細胞、メサンギゥム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、 Τ細胞、 Β 細胞、ナチュラルキラ一細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など ) 、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底核、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膝臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸、十二指腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質のムティンであってもよく、また合成タンパク質であつてもよい。

また、本発明のムティンとしては、 M C P— 1の有する作用（例えば、単球 Ζ マクロファージ走化（遊走）作用など）を抑制する作用を有しているかぎり、配列番号： 2と実質的に同一のアミノ酸配列を有していてもよく、配列番号： 2と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と約 4 0 %以上、好ましくは 6 0 %以上、より好ましくは約 8 0 %以上、さらに好ましくは約 9 0 %以上、最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するァミノ酸配列などがあげられる。

また、本発明のムティンには、 ①配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上（例えば 1〜 2 0個程度、好ましくは 1〜9個程度、さらに好ましくは数（例、 1〜5 ) 個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上（例えば 1〜2 0個程度、好ましくは.1〜9個程度、さらに好ましくは数（例、 1〜5 ) 個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2 個以上（例えば 1〜2 0個程度、好ましくは 1〜9個程度、さらに好ましくは数 (例、 1〜5 ) 個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または④それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するムティンも含まれる。

上記のようにアミノ酸配列が欠失または置換されている場合、その欠失または置換の位置としては、特に限定されない。

本発明のムティンは、ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端（ァミノ末端 ) 、右端が C末端（力ルポキシル末端）である。配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列からなるムテインをはじめとする、本発明のムティンは、 C末端が通常力ルポキシル基（― C O OH) またはカルポキシレート（一 C O O ) であるが、 C末端がアミド（― C O NH₂) またはエステル（― C O O R) であってもよい。

ここでエステル基の Rとしては、例えば、メチル、ェチル、 n—プロピル、ィソプロピルもしくは n—ブチルなどのアルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロへキシルなどの C ₃ _ ₈シクロアルキル基、例えば、フエニル、 —ナフチルなどの C ₆— _{1 2}ァリール基、例えば、ベンジル、フエネチルなどのフエ二ルー — 2アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどのひ一ナフチルー（^— ₂ アルキル基などの C ₇ _ i ₄ァラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるビバロイルォキシメチル基などが用いられる。

本発明のムテインが C末端以外に力ルポキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のムティンに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。

さらに、本発明のムティンには、上記したムティンにおいて、 N末端のァミノ酸残基のァミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、ァセチル基などの <3卜₆アルカノィルなどのァシル基など）で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したダル夕ミル基がピ口グルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、 ― OH、 ― S H、アミノ基、イミダゾ一ル基、ィンド一ル基、グァニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、ァセチル基などの Cェ― ₆アルカノィルなどの Cェ _ ₆ァシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。

本発明のムティンの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）または塩基（例、アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。

本発明のムティンまたはその塩は、前述したヒ卜や温血動物の細胞または組織から自体公知の夕ンパク質の精製方法によって M C P— 1を製造した後、自体公知の方法に準じて、アミノ酸残基または部分アミノ酸配列を欠失させるなどすることによって製造することもできるし、後述するムティンをコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによつても製造することができる。また、後述のタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。

ヒトゃ温血動物の組織または細胞から M C P— 1を製造する場合、ヒトゃ温血動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィ一を組み合わせることにより精製単離することができる。

本発明のムティンの合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルァミン樹脂、アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4 —ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、 4— (2'， 4' -ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル）フエノキシ樹脂、 4 - (2'， 4' -ジメ卜キシフエ二ルー Fmocアミノエチル）フエノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするムティンの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からムティンを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のムティンまたはそれらのアミド体を取得する。

上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルポジイミド類がよい。カルポジィミド類としては、 DC Ν, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν-ェチル - Ν' - (3- ジメチルァミノプロリル）カルポジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、 HOB t, HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物または HOB tエステルあるいは HOOB tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なったのちに樹脂に添加することができる。保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、 N， N—ジメチルホルムアミド、 N—メチルピロリドン、クロ口ホルム、トリフルォロエタノール、ジメチルスルホキシド、 DMF、ジメチルスルホキシド、ピリジン、クロ口ホルム、ジォキサン、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ァセトニ卜リル、酢酸ェチル、 N-メチルピロリドンあるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は夕ンパク質結合形成反応に使用され得ることがしられている範囲から適宜選択され、通常約— 2 0 〜 5 0 の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテス卜の結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応ァミノ酸をァセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。

原料のァミノ基の保護基としては、例えば、 Z、 Boc、ターシャリーアミルォキシカルボニル、イソポルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォキシ力ルポニル、 C I- Z、 Br- Z、ァダマンチルォキシカルポニル、トリフルォロアセチル、フタリル、ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエ二ル、ジフエニルホスフイノチオイル、 Fmocなどが用いられる。

カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル（例えば、メチル、ェチル、プ口ピル、ブチル、夕ーシャリーブチル、シクロペンチル、シクロへキシル、シク口へプチル、シクロォクチル、 2 _ァダマンチルなどのエステル基) 、ベンジルエステル、 4一二トロべンジルエステル、 4—メトキシベンジルエステル、 4一クロ口べンジルエステル、ベンズヒドリルエステル、フエナシンエステル、ベンジルォキシカルポニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルポニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどに導くことによつて保護することができる。

セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、ァセチル基などの低級アルカノィル基、ベンゾィル基などのァロイル基、ベンジルォキシカルポニル基、エトキシカルポニル基などの炭素から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、 t-ブチル基などである。

チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、例えば、 Bz l、 Cl ₂-Bzl、 2—二トロベンジル、 Br- Z、ターシャリーブチルなどが用いられる。

ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、 Tos、 4 -メトキシ- 2， 3 ， 6-トリメチルベンゼンスルホニル、蕭、ベンジルォキシメチル、 Bum, Boc、 Tr t、 Fmocなどが用いられる。

原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール (例えば、ペンタクロロフエノール、 2, 4, 5-トリクロロフエノ一ル、 2， 4-ジニトロフエノール、シァノメチルアルコール、パラニトロフエノール、 H0NB、 N -ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロキシフタルイミド、 HOBt) とのエステル〕などが用いられる。原料のァミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。

保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、 Pd-黒あるいは Pd-炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルォロメタンスルホン酸、トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルェチルァミン、トリェチルァミン、ピペリジン、ピぺラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約一 2 0 °C〜 4 0 °Cの温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、ァニソ一ル、フエノ —ル、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、 1, 4 -ブタンジチオール、 1, 2_エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2， 4 -ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1，.2 -エタンジチオール、 1， 4 - ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナ卜リウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。

原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。

本発明のムティンのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルポキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にぺプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖の Ν末端のひ— ァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質と C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法によりすベての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のムティンのアミド体を得ることができる。

本発明のムテインのエステル体を得るには、カルポキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基を所望のアルコ一ル類と縮合しアミノ酸エステルとした後、本発明のムティンのアミド体と同様にして、所望のエステル体を得ることができる。本発明のムティンは、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは M C P 一 1を適当なぺプチダーゼで切断することによって製造することができる。ぺプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良レ^ すなわち、本発明のムティンを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的の本発明のムティンを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の①〜⑤に記載された方法が挙げられる。

(DM. Bodanszkyおよび M. A. Onde t t i, ペプチド ·シンセシス（Pept ide Synt e s is) , Intersc ience Publ ishers, New York (1966年)

② Schroederおよび Luebke、ザ ·ペプチド（The Pept ide)， Academic Press, New York (1965年）

③泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善 (株）（1975年）

④矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タンパク質の化学 IV、 205、 ( 1977年）

⑤矢島治明監修、続医薬品の開発第 14巻ペプチド合成広川書店また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラフィ一 ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明のムティンを精製単離することができる。上記方法で得られる本発明のムティンが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。

本発明のムテインをコードする D NAとしては、前述した本発明のムテインをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノム D NA、ゲノム D NAライブラリー、前記した細胞 ·組織由来の c D N A、前記した細胞 ·組織由来の c D NAライブラリー、合成 D NAのいずれでもよい。ライブラリ一に使用するべクタ一は、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファ.一ジミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞 ·組織より mR NA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymera se Chain React ion (以下、 R T- P C R法と略称する）によって増幅することもできる。

具体的には、配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列をからなる M C P— 1をコードする D NAとしては、例えば、配列番号： 3で表わされる塩基配列を有する D NA、配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列をからなる 7 ND— M C P— .1をコードする D NAとしては、例えば、配列番号： 4で表わされる塩基配列を有する D N Aなどが用いられる。

本発明のムテインをコ一ドする D NAのクローニングの手段としては、本発明のムティンをコードする DNAの部分塩基配列を有する合成 DNAプライマーを用いて、 PCR法によって铸型となる DNAを増幅するか、または適当なベクタ —に組み込んだ DN Aを本発明のムティンの一部あるいは全領域を有する DNA 断片もしくは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイプリダイゼ一シヨンによつて選別することができる。.ハイブリダィゼーシヨンの方法は、例えば、モレキユラ一 ·クローニング（Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。

DNAの塩基配列の変換（欠失 ·付加 ·置換）は、公知のキット、例えば、 Mu

ΤΜ TM

tan -G (宝酒造（株））、 Mutan - K (宝酒造（株））などを用いて、 Gapped dup 1 ex法や Kimke 1法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。

クローン化された本発明のムテインをコ一ドする DNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカ一を付加したりして使用することができる。該 DNAはその 5'末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、また 3'末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAG を有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成 DN Aアダプタ一を用いて付加することもできる。

本発明のムティンをコードする DNAの発現べクタ一は、例えば、（ィ）本発明のムテインをコードする DNAから目的とする DN A断片を切り出し、（口）該 DN A断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。

ベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例、 PBR 322, p BR 325, pUC 12, pUC13) 、枯草菌由来のプラスミド（例、 pUB 110， pTP 5, pC194) 、酵母由来プラスミド（例、 pSHl 9， p S HI 5) 、 λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウィルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 11、 X Tl、 pRc/CMV、 pRc/RSV、 p c DNA I /N e oなどが用いられる。

用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、 SR«プロモー夕一、 SV40プロモーター、 LTRプロモー夕一、 CMV (サイトメガロウィルス）プロモーター、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、 CMVプロモーター、 SRひプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモ一夕一、 l a cプロモーター、 r e cAプロモータ一、 λ PLプロモ一夕一、 1 ppプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモーター、 S P〇 2プロモーター、 · p e n Pプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、 AOX1プロモータ一、 PH05プロモ一ター、 PGKプロモーター、 G A Pプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ましい。発現ベクターには、以上の他に、所望によりェン八ンサ一、スプライシングシダナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカー、 SV40複製オリジン（以下、 S V40 o r iと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、 dh f r と略称する場合がある）遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子（以下、 Amp ¹"と略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、 Ne oと略称する場合がある、 G41 8耐性）等が用いられる。 dh f r遺伝子はメソトレキセート（M

TX) 耐性を、 Ne oは G41 8耐性を付与する。特に、 dh f r遺伝子欠損チャィニーズハムスター細胞 CHOを用いて d h f r遺伝子を選択マ一カーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても目的とする遺伝子を選択することができる。

また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、タンパク質の N端末側に付加する。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シグナル配列、 OmpA •シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミラーゼ -シグナル配列、サブチリシン ·シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、 Μ F ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばィンシュリン ·シグナル配列、 α—インターフェロン ·シグナル配列、抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。

このようにして構築された本発明のムティンをコードする DN Αを含有するべクタ一を細胞に導入することによって形質転換体を製造することができる。

宿主としては、例えば、ェシエリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。

ェシエリヒア属菌としては、例えば、ェシエリヒア ·コリ（Escherichia col i ) Kl 2 · DH1 〔プロシージングズ.ォブ ·ザ ·ナショナル .アカデミー .ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. US A) ， 60巻， 160 (1968)〕， JM103 〔ヌクイレック ·ァシッズ'リサーチ，（Nucleic Acids Research) ， 9巻， 309 (1981)〕， J A221 〔ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー（Journal of Molecular Bio logy) 〕， 120巻， 517 (1978)〕， HB101 〔ジャーナル 'ォブ 'モレキユラ一 'バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕 , C 600 〔ジエネテイツクス（Genetics) ， 39巻， 440 (1954)〕などが用いられる。

バチルス属菌としては、例えば、バチルス ·サチルス (Bacillus subtilis) M I 114 〔ジーン， 24巻， 255 (1983)] ， 207 - 21 〔ジャーナル •ォブ ·バイオケミストリ一（Journal of Biochemistry) , 95巻， 87 (19 84) 〕などが用いられる。

酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレピシェ（Sacclmromyces cere visiae) AH 22, AH22R―， NA87 - 11 A, DKD— 5D， 20 B- 12、シゾサッカロマイセスボンべ（Schizosacclmromyces pombe) NCYC

1913, NGYC2036、ピキアパストリス（Pictiia pastoris) KM 7

1などが用いられる。

昆虫細胞としては、例えば、ウィルスが Ac NPVの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞）、 Tric oplusia niの中腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five^TM細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ゥィルスが BmNPVの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N； BmN細胞）などが用いられる。該 S f細胞としては、例えば、 S f 9細胞（ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞（以上、 Vaughn, J.L.ら、イン 'ヴィトロ（in Vitro) , 13, 21 3-217, (1977)) などが用いられる。

昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチヤー (Nature) , 315巻， 592 (1985)〕。

動物細胞としては、例えば、サル細胞 COS— 7， Vero, チャイニーズハムスター細胞 CH〇（以下、 CHO細胞と略記） , dh f r遺伝子欠損チヤィニ一ズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r ~) 細胞と略記），マウス L 細胞，マウス At T— 20，マウスミエローマ細胞，ラット GH3, ヒト FL細胞、 293細胞、 C 127細胞、 B A L B 3 T 3細胞、 S p— 2細胞などが用いられる。これらの中でも、 CHO細胞、 CHO (dh f r ~) 細胞、 293細胞などが好ましい。

ェシエリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ ·ォブ ·ザ •ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69巻， 2110 ( 1972)やジーン（Gen e) ， 17卷， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうことができるバチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー ·アンド ·ジエネラル ·ジエネティックス（Molecular & General Genetics) , 168巻， 111 ( 1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。

酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ ·イン ·ェンザィモロジ一（Meth ods in Enzymology) ， 194巻， 182— 187 (1991) 、プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ · ユーエスェ一（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 (1978 ) などに記載の方法に従って行なうことができる。

昆虫細胞や昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ/テクノロジー（Bio/Te chnology) , 6, 47-55 (1988)) などに記載の方法に従って行なうことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロトコ一ル. 263— 267 (1995) (秀潤社発行）、ヴイロロジー（Virolo gy) , 5 2巻， 4 5 6 ( 1 9 7 3 )に記載の方法に従って行なうことができる。発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法〔Gr a am, F. L. and van der Eb, A. J.ヴイロロジ一（Virology) 52, 456-467 (1 973) 〕電気穿孔法〔Nuemaim, E. et al. ェンポ ·ジャーナル（EMBO J. ) 1， 841-845 (1982) 〕等が用いられる。

このようにして、本発明のムティンをコードする D NAを含有する発現べクタ —で形質転換された形質転換体を得ることができる。

なお、動物細胞を用いて、本発明のムティンを安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現べクタ一が染色体に組み込まれた細胞をク口 —ン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカ一を指標にして形質転換体を選択することができる。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のムテインの高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、 d h ί r遺伝子を選択マーカ一として用いた場合、 MT X濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、 d h f r遺伝子とともに、本発明のムティンをコ一ドする D NAを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。

上記の形質転換体を本発明のムティンをコードする D NAが発現可能な条件下で培養し、本発明のムティンを生成、蓄積せしめることによって、本発明のムティンを製造することができる。

宿主がェシエリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が^当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニゥム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ ·リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、パレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシゥムなどがそれぞれ用いられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含む M 9培地〔ミラー（Miller) ，ジャーナル.ォプ ·ェクスペリメンッ •イン ·モレキュラー 'ジェネティックス (Journal of Experiments in Mo 1 ecu lar Genetics) , 431— 433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] が好ましい。ここに必要によりプロモー夕一を効率よく働かせるために、例えば 3 /3—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がェシエリヒア属菌の場合、培養は通常約 15~43°Cで約 3〜24時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行なレ、必要により通気や撹拌を加えることもできる。 '

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホ一ルダー（Burkholder) 最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ *ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1980)〕や 0. 5%カザミノ酸を含有する SD培地〔Bitter, G. A. ら、プロシ一ジングズ -ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォプ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 81巻， 5330 (1984) 〕が挙げられる。培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好ましい。培養は通常約 20 °C〜35°Cで約 24〜72時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。

宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、 Grace's Inse ct Medium (Grace, T. C. C.，ネィチヤ一 (Nature) , 195, 788 (1962)) に非動化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地の pHは約 6. 2-6. 4に調整するのが好ましい。培養は通常約 27 で約 3〜5日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約 5 〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地〔サイエンス（Science) , 122巻， 501 (1952)〕， DMEM培地〔ヴイロロジー（Virology) ， 8巻， 396 (1959)〕， RPMI 1640培地〔ジャーナル 'ォブ ·ザ ·アメリカン · メティカレ *アソシエーション (The Journal of the American Medical Associ at ion) 199巻， 519 (1967)〕， 199培地〔プロシージング ·ォブ- ザ 'ソサイエティ ·フォー ·ザ ·バイオロジカル'メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73巻, 1 (1950)〕などが用いられる。 pHは約 6〜 8であるのが好ましい。培養は通常約 30° (：〜 40°C で約 15~72時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。

特に、 CHO (dh f r ^_) 細胞および d h f r遺伝子を選択マーカーとして用いる場合、チミジンをほとんど含まない透析ゥシ胎児血清を含む D M E M培地を用いるのが好ましい。

上記培養物から本発明のムティンを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。

本発明のムテインを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壤したのち、遠心分離やろ過により本発明のムテインの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク変性剤や、トリトン

TM

X- 100 などの界面活性剤が含まれていてもよい。

培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のムティンの精製は、自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、および SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、ァフィ二ティ一クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。かくして得られる本発明のムティンが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。

なお、組換え体が産生する本発明のムティンを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、アルギニルエンドべプチダ一ゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。

かくして生成する本発明のムティンの存在は、特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどにより測定することができる。

M C P— 1に対する中和抗体（以下、本発明の抗体と称することがある）は M C P— 1を中和する作用を有し、 M C P— 1を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。

本発明の抗体は、 M C P— 1を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。

〔モノクローナル抗体の作製〕

( a ) モノクロナール抗体産生細胞の作製

M C P— 1は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、計 2〜1 0回程度行なうことができる。温血動物としては、例えば、サル、ゥサギ、ィヌ、モルモット、マウス、ラッ卜、ヒッジ、ャギ、ニヮトリが用いられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。

モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクロ一ナル抗体産生ハイプリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケ一ラーとミルス夕インの方法〔ネィチヤ一（Nature), 256、 495 (1975)] に従い実施できる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくは PEGが用いられる。 ■

骨髄腫細胞としては、例えば、 NS— 1、 P3U1、 S P 2/0, AP— 1などの温血動物由来の骨髄腫細胞が用いられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG600 0 ) が 10〜 80 %程度の濃度で添加され、 20〜 40 °C、好ましくは 30〜 3 7 で 1〜 10分間ィンキュベ一トすることにより効率よく細胞融合を実施することができる。

モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリ一ニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリド一マ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテイン Αを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが用いられる。

モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常 HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、 1〜20%、好ましくは 10〜20%の牛胎児血清を含む RPMI 16 40培地、 1〜10%の牛胎児血清を含む G I T培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリド一マ培養用無血清培地（SFM— 101、日水製薬（株） ) などを用いることができる。培養温度は、通常 20〜40°C、好ましくは約 37 である。培養時間は、通常 5日〜 3週間、好ましくは 1週間〜 2週間である。培養は、通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

( b ) モノクロナール抗体の精製

モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、ィオン交換体（例、 D E A E ) による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。

〔ポリクローナル抗体の作製〕

ポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）とキャリア一蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物からポリクローナル抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。

温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア一蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ゥシ血清アルブミンやゥシサイログロブリン、へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、約 0 . 1 〜2 0、好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。

また、ハプテンとキャリア一の力プリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバン卜や不完全フロイン卜アジュバン卜を投与してもよい。投与は、通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、計約 3〜1 0回程度行なうことができる。ポリクロ一ナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。

抗血清中のポリク口一ナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができる。

上記の本発明のムテイン、本発明のムテインをコ一ドする塩基配列を有する D NAまたは本発明の抗体は、例えば、肺高血圧症、より具体的には、原発性肺高血圧症の予防 ·治療剤として用いることができる。

本発明のムティンをコードする塩基配列を有する D NAを上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、該 D NAを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクタ一などの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従ってヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明の D NAは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲル力テーテルのような力テーテルによつて投与できる。

本発明のムテインを上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、少なくとも 9 0 %、好ましくは 9 5 %以上、より好ましく 9 8 %以上、さらに好ましくは 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。

本発明のムティンまたは本発明の抗体を上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイク口カプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のムティンを生理学 ¾に認められる担体、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。

錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、ァカモノ油またはチェリ一のような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど) 、ポリアルコール (例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルべ一ト 8

0 、 H C O— 5 0など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニゥム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコ一ルなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フエノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。

上記の D NAが挿入されたべクタ一も上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。

このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラッ卜、マウス、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、ブ夕、ゥシ、ゥマ、ネコ、 .ィヌ、サルなど）に対して投与することができる。

また、上記の本発明のムティンをコードする D NA、上記の D NAを含有してなるベクター等は、肺高血圧症（特に、原発性肺高血圧症）の遺伝子治療に用いることができる。本発明の予防 ·治療剤の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、原発性肺高血圧症患者に本発明のムティン、本発明の DNAまたは本発明の抗体を注射剤の形で成人（体重 60 kgとして）に投与する場合、一日につき有効成分として約 0. 01〜30mg程度、好ましくは約 0. 1〜20111 程度₁、より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算した量を投与することができる。

本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC- I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またァミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければ L体を示すものとする。

DNA デォキシリポ核酸

c DNA 相補的デォキシリポ核酸

A アデニン

T チミン

G グァニン

C

RNA リポ核酸

mRNA リポ核酸

d ATP 三リン酸

dTTP デォキシチミジン三リン酸

dGTP デォキシグアノシン三リン酸

dCTP デォキシシチジン三リン酸

ATP アデノシン三リン酸

EDTA エチレンジァミン四酢酸

SD S ドデシル硫酸ナトリウム

G 1 y グリシン

A 1 a ァラニン Va 1 バリン

Le u ロイシン

I 1 e

S e r セリン

Th r スレオニン

Cy s

Me t メチォニン

G 1 u グルタミン酸

As p ァスパラギン酸

L y s リジン

A r g アルギニン

H i s ヒスチジン

P h e フエ二ルァラニン

Ty r チロシン

T r p トリプ卜ファン

P r o プロリン

A s n ァスパラギン

G 1 n グルタミン

p G 1 u ピログルタミン酸また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。

Me ：メチル基

E t ：ェチル基

B u ：ブチル基

P h ：フエニル基

TC ：チアゾリジン一 4 (R) —カルポキサミド基

To s ： ρ—トルエンスルフォニル

CHO ：ホルミル B z 1 ベンジル

Cl2Bzl ： 2, 6—ジクロ口べンジル

Bom

Z ベンジルォキシカルポニル

C 1 -Z 2一クロ口べンジルォキシカルポニル

B r -Z 2一ブロモベンジルォキシカルポニル

B o c t一ブトキシカルポニル

DNP ジニトロフエノール

T r t 卜 Uチル

Bum t一ブトキシメチル

Fm o c N— 9—フルォレニルメトキシカルボニル

HOB t 1—ヒドロキシベンズトリアゾール

HOOB t 3， 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシ一 4—ォキソ一

1, 2, 3—べンゾ卜リアジン

HONB 1 -ヒドロキシ- 5-ノルボルネン- 2, 3-ジカルボキシイミド DCC 本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。

〔配列番号： 1〕

MCP- 1のアミノ酸配列を示す。

〔配列番号： 2〕

7ND— MCP— 1のアミノ酸配列を示す。

〔配列番号： 3〕

MCP- 1をコードする DN Aの塩基配列を示す。

〔配列番号： 4〕

7ND-MCP- 1をコードする DNAの塩基配列を示す。以下に、実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。実施例 1

モノクロ夕リン (MCT)誘発ラット肺高血圧症モデルにおける MCP-1の拮抗阻害型ムテインの作用

方法：正常ラッ卜（市販の雄性正常血圧ラット（6〜 8週齢)）を 4群に分けた。第 1群は無処置対照群、第 2群は MCT (60mg/kg, s. c. )処置対照群、第 3群は MCT処置 + 7ND- MCP- 1の 1回投与群 (MCT処置と同時投与)および第 4群は MCT処置 + 7ND- MCP- 1 の 2回投与群 (MCT処置時と MCT処置 2週間後）とした。すなわち、遺伝子導入 3日前にマーカイン 1をラット両側大腿四頭筋に注入し、その 3日後に、 MCT (60mg /kg, s. c. )処置対照群のラットには、 MCT 60mg/kgを皮下注射した。 7ND- MCP- 1の 1 回投与群のラットには、 MCT 60mg/kgと同時に 7ND- MCP- 1発現プラスミド 500 g を数箇所に分けて両側大腿四頭筋に注入した。 MCT処置 + 7ND-MCP-1の 2回投与群のラットには、 MCT 60mg/kgと同時に 7ND- MCP-1発現プラスミド 500 gを数箇所に分けて両側大腿四頭筋に注入した後、 14日目に 7ND- MCP- 1発現プラスミド 500 gを数箇所に分けて両側大腿四頭筋に注入した。 MCT処置 1、 2、 3および 4週間目に、心ェコ一による心室の形態および内腔サイズの変化および右心室内圧、 4週目に摘出した心臓について、心重量、右心室壁厚および心室内腔サイズを、また肺について形態学的解析を行った。

なお、 7ND-MCP- 1発現プラスミドは、 MCP- l c DNAを錡型として、自体公知の PCR により 7ND- MCP- 1 c DNAを取得し（7ND- MCP-1の 3，末端には FLAG配列が付加していてもよい）、該 7ND- MCP- lcDNAを p C D NA 3発現プラスミドの BamHIサイトと No t lサイ卜の間に 5'端が BamHIサイ卜側、 3，端が Notlサイトになるように導入することにより、作製した。

結果を以下に示す。

1 . 肺高血圧に対する作用

右心室圧は無処置対照群で 26. 2 士 4. 7 顏 Hgであったのが MCT処置 4週間後に 69 . 7 + 2. 1 匪 Hgと上昇していたが、 7ND- MCP- 1 (M C P— 1の拮抗阻害型ムティン ) の 1回投与で 37. 3 ± 4. 6 mmHg, 2回投与でそれぞれ 45. 6 ± 9. 8 匪 Hgと有意に血圧低下作用が確認された。

2 . 心重量、心臓の形態変化に対する作用 MCT処置群では、右心室の肥大、特に右心室壁厚の肥厚および内腔拡大が認められたが、 7ND- MCP - 1の投与でこれらの変化が抑制されていた。

3 . 血管および肺に対する作用

右心室の小動脈において、 MCT投与群では中膜の有意な肥厚が認められたが、 7 ND - MCP- 1の投与でこれらの変化が抑制された。また、 MCT処置群では肺胞腔内を中心に多数のマクロファ一ジと単核球の浸潤を認めたが、 7ND-MCP-1の投与でこれらの変化が抑制された。

7ND- MCP- 1投与によるラッ卜におけるモノクロタリン誘発肺高血圧症とそれに附随して進展する肺動脈ならびに心室壁のリモデリングから、 MCP- 1の拮抗阻害型ムティンは、肺高血圧症（特に、原発性肺高血圧症）に対する予防 ·治療剤となりうる。産業上の利用可能性

本発明の M C P— 1の拮抗阻害型ムティン、 M C P— 1の拮抗阻害型ムティンをコードする塩基配列を有する D NAまたは M C P— 1に対する中和抗体を含有してなる剤は、肺高血圧症（特に、原発性肺高血圧症）の予防 ·治療のための医薬として有用である。

Claims

請求の範囲

1. MCP— 1の拮抗阻害型ムティンもしくはその塩、 MCP— 1の拮抗阻害型ムティンをコードする塩基配列を有する DNAまたは MCP— 1に対する中和抗体を含有してなる肺高血圧症予防 ·治療剤。

2. MCP— 1の拮抗阻害型ムティンが 7ND— MCP— 1である請求項 1記載の剤。

3. 肺高血圧症が原発性肺高血圧症である請求項 1記載の剤。

4. 肺高血圧症予防 ·治療作用を有する医薬を製造するための請求項 1記載の MCP- 1の拮抗阻害型ムティンもしくはその塩、 MC P— 1の拮抗阻害型ムテインをコードする塩基配列を有する DNAまたは MCP— 1に対する中和抗体の使用。

5. 請求項 1記載の M CP— 1の拮抗阻害型ムティンもしくはその塩、 MCP 一 1の拮抗阻害型ムテインをコ一ドする塩基配列を哺乳動物に投与することを特徵とする肺高血圧症予防 ·治療方法。