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WO2000004380A1 - Ligandenbestimmung für proteine - Google Patents

Ligandenbestimmung für proteine Download PDF

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WO2000004380A1
WO2000004380A1 PCT/EP1999/004951 EP9904951W WO0004380A1 WO 2000004380 A1 WO2000004380 A1 WO 2000004380A1 EP 9904951 W EP9904951 W EP 9904951W WO 0004380 A1 WO0004380 A1 WO 0004380A1
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WO
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molecular surface
ligand
proteins
ligands
determined
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PCT/EP1999/004951
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English (en)
French (fr)
Inventor
Cornelius FRÖMMEL
Robert Preissner
Andrean Goede
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JERINI BIO TOOLS GmbH
Original Assignee
JERINI BIO TOOLS GmbH
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Publication date
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes

Definitions

  • ligands are understood to be biologically active substances of mostly low molecular weight which have a specific effect on the macromolecule by binding to a specific binding site of a macromolecule.
  • the macromolecules in question here can be enzymes, receptors, DNA, RNA, etc.
  • the invention further relates to ligands which are produced by the process according to the invention.
  • the secondary structure elements of a model of the given protein are defined on the basis of hydrogen bonds, depending on the surface area determined in a), adjacent secondary structure elements are additionally combined and large secondary structure elements which protrude beyond the surface area are additionally divided.
  • c) Determination of known similar molecular surface parts to those surface elements which define the binding site for the ligand, the molecular surface parts found having a complementary neighboring element.
  • atoms of each secondary structural element belonging to the surface area defined in a) that are exposed to a surrounding solvent are determined. This defines search areas. The atom is determined by scanning the surface with the model of a water molecule on a Conolly surface.
  • the superposition is carried out according to the number of superimposed atoms, the number of superimposed atoms of the same atom type and the quadratic error deviation.
  • a hit can be evaluated based on the local packing density, which is determined by the comparison of the area found and the given protein.
  • the method according to the invention is preferably carried out in particular after step e) on the basis of a database. It has proven expedient to use the database '' Dictionary of Interfaces in Proteins (DIP) M Journal of Molecular Biology, Vol. 280, pp. 535ff, 1998.
  • the DIP database places areas between secondary structures (SSE) of all structurally known proteins. These interfaces consist of two atomic quantities (patches), which are parts of neighboring secondary structures and together make up the contact between these two structures.
  • the outer surfaces of the secondary structures are to be determined.
  • the outer surfaces that make the contact are the MSP. Similar molecular surface parts are overlaid. After the coordinate transformation, the molecular surface parts found lie on atoms of the binding site.
  • the best potential ligands are the lead compound.
  • the best potential ligands are compared last with a known starting protein plu ⁇ ligand.
  • a complementary binding partner is determined by determining similar elements that already have a binding partner.
  • Another way to find lead compounds is to search databases of low molecular weight compounds.
  • the coordinates of the corresponding suitable peptide or parts thereof are used to search in a corresponding database for the specified overlay method (comparison method). This makes it possible to find lead compounds completely independently of the peptide basic structure.
  • the method according to the invention for the determination of ligands is preferably described for the active centers of enzymes. However, the method can also be applied to other macromolecules (proteins, DNA, RNA), provided that they have suitable surfaces.
  • macromolecules proteins, DNA, RNA
  • Viruses eukaryotic unicellular organisms, parasites
  • the method according to the invention can also be used to determine protein structures. It does not rely on sequence similarity alone, but uses structural similarity of molecular interfaces of secondary structure elements to predict their interaction partners. This takes into account the fact that the same (similar) interfaces can also arise with different sequences.
  • a given primary structure is '' wrapped '' in its full length in a repetitive secondary structure. This means that with standard ⁇ , ⁇ and ⁇ angles, ß-leaflets or helices are calculated over the full length of the primary structure become.
  • the resulting molecular interfaces of these secondary structure elements are clustered and evaluated with an artificial neural network, the input data of which result from the molecular surfaces of the clustered structure elements. The evaluation is carried out with the aim, on the one hand, of confirming whether the given primary structure can be used to design molecular surfaces in the secondary structure element that are representative of the given structural element. If not, the secondary structure is discarded. This results in a new method of secondary structure prediction.
  • the neural network is trained using the known protein structures.
  • the above-mentioned work step results in a series of MPS, the partner element of which is certain or less certain (variant planning). If '' non-solvent '' is predicted, a simple docking algorithm tries in the third step to locate a suitable surface in other secondary structure elements than the one directly considered.
  • the simple docking algorithm is based on the fact that molecular interface partners between secondary structures within one Given the distances between the two focal points or a certain angle of the excellent direction, the quality of the fit is checked with the aid of the molecular density determination (see above, Goede et al.). Once the potential partners have been determined, in a fourth step the principle foldability becomes in compliance with all predicted neighborhoods
  • the secondary elements that form the binding site are determined. It turns out that five elements are involved, with two larger elements determining the binding site.
  • the outer surfaces of these secondary structures are then determined.
  • Similar MSP ⁇ are searched for in the DIP database with the parts of the outer surfaces that make up the contact and comprise 12 to 22 atoms.
  • the similar MSP ⁇ of a certain minimum quality, with at least 70% of the atoms being overlaid and the rm ⁇ value being 1.0A, are overlaid with the starting areas, the amino acids which form the opposite side of the MSP ⁇ being included in the coordinate transformation of the MSPs become.
  • the MSPs found lie on the atoms of the binding site, the opposite sides of the MSP ⁇ in the binding pocket.
  • the mutual sides of the MSPs found, which represent the potential ligands, are checked to see whether they fill the binding pocket and whether the distances to the atoms of the binding pocket are large enough. For this, the local density in the binding pocket is calculated.
  • the best potential ligands form the lead compounds.
  • a comparison of the ten best potential ligands with a proteasome structure of the archaebacterium that is present with ligand shows that the main chain of one of the structures calculated in this way is completely identical to the known inhibitor of the proteasome of the archebacterium.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Liganden für Proteine. Bei diesem Verfahren werden anhand der Sekundärstrukturelemente eines gegebenen Proteins, die den Bindungsort bilden, molekulare Oberflächenteile bestimmt, die mit bereits bekannten molekularen Oberflächenteilen mit Ligand verglichen werden.

Description

Ligandenbestimmung für Proteine
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Liganden für Proteine gemäß den Merkmalen des Patentanspruches 1.
In der Biochemie versteht man unter Liganden biologische aktive Substanzen meist niedermolekularer Art, die durch Bindung an eine spezifische Bindungsstelle eines Makromoleküls eine bestimmte Wirkung auf das Makromolekül ausüben. Bei den hier betreffenden Makromolekülen kann es sich um Enzyme, Rezeptoren, DNA, RNA usw. handeln.
Durch Bindung des Liganden an das Makromolekül können beispielsweise der katalytische Umsatz eines Enzyms, die Aktivierung bzw. Inaktivierung eines Enzyms sowie Konfor ations- änderungen von Makromolekülen bewirkt werden.
In der pharmazeutischen Industrie werden bisher zwei Strategien zur Identifizierung biologischer aktiver Substanzen, d.h. Liganden, angewandt.
Die Unternehmen verfügen in der Regel über große Substanz- sammlungen vieler verschiedener Einzelverbindungen. Diese Substanzen werden in biologischen Systemen, z.B. Zellassays, mittels Hochdurchsatzverfahren in Form von Pipettierstraßen mit automatischer Auswertung auf bestimmte Aktivitäten getestet. Treffer bei diesen Verfahren sind allerdings nur zufällig, sie treten aber mit bestimmten Wahrscheinlichkeiten auf.
Die Alternative dazu ist eine andere Strategie, die mit Hilfe von Computern durchgeführt wird. Unter Berechnung der Kräfte zwischen Molekülen werden am Computer Verbindungen, die an bestimmte Proteinoberflächen binden sollen, virtuell erstellt und dann erst synthetisiert. So werden im Gegensatz zum obigen Verfahren weniger Substanzen synthetisiert und getestet. Es werden auch virtuelle Substanzbibliotheken von Molekülen, die nicht als Substanz vorliegen müssen, im Dockingverfahren am Computer auf eine Bindung an eine bestimmte Proteinoberfläche getestet. Wiederum werden dann nur die Treffer synthe- Atisiert und in biologischen Testsystemen eingesetzt. Verfahren dieser Art sind bereits in den US-Patenten 5,495,423, 5,579,250 und 5,612,895 beschrieben worden.
In der Praxis wurden auch Kombinationen der oben beschriebenen Verfahren angewendet.
Bei diesen Verfahren wurden aber keine in der Natur vorkommenden Interaktionen ausgenutzt. Des weiteren sind viele bekannte Verfahren der Zufälligkeit ausgesetzt und müssen sich oftmals auf die virtuelle Beobachtung stützen. Dieses führt zu beträchtlichen Zeitverlusten und Ungenauigkeiten.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, bei dem die Liganden für Proteine schnell und zuverlässig bestimmt werden können.
Die Aufgabe wird mit einem Verfahren gemäß Patentanspruch 1 gelöst.
Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Auεführungsfor en des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Erfindung betrifft weiterhin Liganden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Liganden für Proteine umfaßt folgende Schritte: a) Bestimmung derjenigen Sekundärstrukturelemente eines ge- . gebenen Proteins, die den Bindungsort für den Liganden bilden. Insbesondere wird ein Oberflächenbereich des gegebenen Proteins bestimmt, der einen Bindungsort für einen vorherzusagenden Liganden bildet.
b) Zerlegung der molekularen Oberfläche eines gegebenen Proteins in molekulare Oberflächenelemente. Insbesondere werden die Sekundärstrukturelemente eines Modelles des gegebenen Proteins anhand von Wasserstoffbrückenverbin- dungen definiert, wobei in Abhängigkeit des in a) bestimmtes Oberflächenbereiches benachbarte Sekundärstrukturelemente zusätzlich zusammengefaßt und große Sekundärstrukturelemente, die über den Oberflächenbereich hinausragen, zusätzlich geteilt werden.
c) Bestimmen von bekannten ähnlichen molekularen Oberflächenteilen zu denjenigen Oberflächenelementen, die den Bindungsort für den Liganden definieren, wobei die gefundenen molekularen Oberflächenteile ein komplementäres Nachbarelement besitzen. Insbesondere werden Atome eines jeden zu dem in a) definierten Oberflächenbereich gehörenden Sekundärstrukturelementes bestimmt, die einem umgebenden Lösungsmittel ausgesetzt sind. Dadurch werden Suchflächen definiert. Die Atombestimmung geschieht durch Abtasten der Oberfläche mit dem Modell eines Wassermole- küles auf einer Conolly-Oberflache .
Dabei wird insbesondere eine Suchdatenbasis generiert, indem Paare miteinander in Kontakt tretender Flächen bestimmt werden anhand aller oder eines Teiles der Proteine oder Proteinkomplexe mit bekannter dreidimensionaler Struktur. Die Modelle der Proteine werden in Sekundärstrukturelemente und Teile der Sekundärstrukturelemente anhand der Wasserstoffbrücken zerlegt und die Atome eines Sekundärstrukturelementes, nämlich die Kontaktfläche, die mit einem anderen oder dem umgebenden Lösungsmittel in Van der Waals-Abstand stehen, werden bestimmt.
Insbesondere werden ähnliche Flächen zu denjenigen Oberflächenelementen bestimmt, die den zu bestimmenden Bindungsort für den Liganden definieren, wobei die gefundenen molekularen Oberflächen ein komplementäres Nachbarelement besitzen. Dabei werden der Schwerpunkt und die Hauptausdehnung aller Suchflächen mit allen oder einem Teil der bestimmten Fläche überlagert. Die Überlagerung wird durch Maximierung der überlagerten Atome und Minimierung der quadratischen Fehlerabweichung optimiert.
d) Koordinatentransformation des gefundenen ähnlichen molekularen Oberflächenteils mit Nachbarelement auf ein Ausgangselement bei einem rmε-Wert unterhalb von 2A. Insbesondere wird eine Koordinatentransformation der gefundenen Fläche in die Suchfläche für gegebene Protein durchgeführt.
e) Beurteilung der Paßfähigkeit des Liganden gemäß lokaler Packungsdichte. Insbesondere wird die Überlagerung nach Anzahl der überlagerten Atome, nach Anzahl der überlagerten Atome gleicher Atomsorte und der quadratischen Fehlerabweichung durchgeführt. Ein Treffer kann anhand der lokalen Packungsdichte bewertet werden, die durch das Gegenüber der gefundenen Fläche und dem gegebenen Protein bestimmt ist.
Der Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens wird anhand des in Fig. 1 gezeigten Fließdiagramms erläutert.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere nach Schritt e) auf der Grundlage einer Datenbank durchgeführt. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die Datenbank ''Dictionary of Interfaces in Proteins (DIP) M Journal of Molecular Biology, Bd. 280, S. 535ff, 1998, zu verwenden. Die Datenbank DIP stellt Flächen zwischen Sekundärstrukturen (SSE) aller strukturell bekannten Proteine zur Verfügung. Diese Interfaces bestehen aus zwei Atommengen (Patches) , die Teile von benachbarten Sekundärstrukturen sind und zusammen den Kontakt dieser beiden Strukturen ausmachen.
Bei der Bestimmung von Liganden, dem sogenannten " drug de- sign", stellt sich die Frage, welche chemische Verbindung zu einer gegebenen Proteinεtruktur paßt. Erfindungsgemäß werden die Sekundärstrukturelemente eines gegebenen Proteins, die den Bindungsort für den Liganden bilden, bestimmt. Dann wird die molekulare Oberfläche eines gegebenen Proteins zunächst in molekulare Oberflächenteile (MSP = molecular surface patches) zerlegt. Zu denjenigen Elementen, die potentiell die Bindungsregion definieren, werden beispielsweise aus der oben beεchriebenen Datenbank ähnliche Flächen herausgesucht. Als Nebenbedingung wird bei dem Screening auf Ähnlichkeit verlangt, daß die gefundenen MSPs bereits ein komplementäres Nachbarelement besitzen. Eine Transformation, beispielsweise Koordinatentransformation, des gefundenen MSP mit Nachbarelement auf das Ausgangselement ist dann ausεichtεreich , wenn der rmε-Wert (mittlerer Fehler) unterhalb von 2A liegt. Vorzugsweise liegt der Wert bei 1,5 A. Für die Beurteilung der Paßfähigkeit des Liganden gegenüber dem Original hat εich die lokale Packungsdichte nach Goede et al., Journal of Computa- tional Chemistry, Bd. 18, Nr. 9, S. 1114ff, 1997, bewährt.
Bei dem erfindυngsgemäßen Verfahren sollen die Außenflächen der Sekundarstrukturen bestimmt werden. Die Außenflächen, die den Kontakt herstellen, sind die MSP. Ähnliche molekulare Oberflächenteile werden überlagert. Nach der Koordinatentransformation liegen die gefundenen molekularen Oberflächenteile auf Atomen des Bindungsortes . Die besten potentiellen Liganden bilden die Leitverbindung. Der Vergleich der besten potentiellen Liganden mit einem bekannten Ausgangsprotein pluε Ligand erfolgt alε letztes. Somit erfolgt erfindungsgemäß die Bestimmung eines komplementären Bindungεpartnerε dadurch, daß ähnliche Elemente bestimmt werden, die bereits einen Bindungspartner besitzen.
Wenn die Liganden, bei denen es sich um Sekundärstrukturelemente aus ca. 10 Aminosäuren handelt, bestimmt sind, müssen sie für den Einsatz als Phar akon noch optimiert werden, da Peptide aus den natürlichen L-Aminosäuren vielen Anforderungen nicht entsprechen.
Es gibt experimentelle Verfahren zur synthetischen Umwandlung von Peptiden in Peptidmi etika , z.B. Peptoide, die vom phar- makologiεchen Standpunkt aus betrachtet, häufig wesentlich günstigere Eigenschaften aufweisen. Die Verbindungen durchlaufen dabei in der Regel verschiedene Opti ierungszyklen, in denen die Moleküle auch wirklich als Substanzen vorliegen.
Eine weitere Möglichkeit, Leitverbindungen zu finden, besteht in der Suche in Datenbanken niedermolekularer Verbindungen. In diesem Falle werden die Koordinaten des entεprechenden passfähigen Peptids oder Teile davon verwendet, um in einer entsprechenden Datenbank nach dem angegebenen Überlagerungε- verfahren (Vergleichεverfahren) zu suchen. Damit ist eε möglich, völlig unabhängig von der peptidischen Grundstruktur Leitverbindungen zu finden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Liganden wird vorzugsweise für die aktiven Zentren von Enzymen beschrieben. Das Verfahren ist allerdings auch auf andere Makromoleküle (Proteine, DNA,RNA) übertragbar, sofern sie geeignete Oberflächen besitzen. Folgende Anwendungsgebiete kommen beispielsweise in Betracht:
* Bindungs- und/oder Nachweiε oleküle in diagnoεtischen Assayε
* Lebensmittelindustrie: Suche von Liganden für Geschmacksrezeptoren und Verwendung als Geεchmackszuεatzstoff * Biotechnologie: Moleküle für die Affinitätsreinigung
* Proteine, die im therapeutischen Bereich gebunden werden müssen: Enzyme, Rezeptoren, DNA, RNA
Zytokine oder Wachstumsfaktoren und ihre
Rezeptoren, insbeεondere diejenigen, die der
Stoffwechselregulation dienen
Zelladhäεionsproteine und ihre Rezeptoren
Proteine der Signaltranεduktionεwege und ihre
Bindungεpartner zytosolische Rezeptoren, Steroidrezeptoren
Proteine der Blutgerinnung
Neurotranεmitter und ihre Rezeptoren
Proteine der Stoffwechselwege
Proteine der Replikation, Transkription und
Translation
Proteine von Krankheitserregern (Bakterien,
Viren, eukaryotische Einzeller, Parasiten)
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auch zur Bestimmung von Proteinstrukturen anwenden. Es ist nicht auf alleinige Sequenzähnlichkeit angewiesen, sondern verwendet Strukturähnlichkeit von molekularen Grenzflächen von Sekundärstruktur- elementen zur Vorhersage ihrer Wechεelwirkungεpartner. Dabei wird der Tatsache Rechnung getragen, daß gleiche (ähnliche) Grenzflächen auch bei unterschiedlichen Sequenzen entstehen können.
Beispielhaft soll im folgenden daε Verfahren der Proteinstrukturbestimmung in seinen Schritten geschildert werden.
Im ersten Schritt wird eine gegebene Pri ärεtruktur in ihrer vollen Länge in eine repetitive Sekundärstruktur ''gewik- kelt". Dies bedeutet, daß mit Standard φ, φ und χ-Winkeln ß- Faltblätter bzw. -Helices über die volle Länge der Primärstruktur errechnet werden. Im zweiten Schritt werden die entstandenen molekularen Grenz-' flächen dieser Sekundärstrukturelemente geclustert und mit einem artifiziellen neuronalen Netz bewertet, dessen Eingangsdaten sich aus den molekularen Oberflächen der ge- clusterten Strukturelemente ergeben. Die Bewertung erfolgt mit dem Ziel, einerseits zu bestätigen, ob überhaupt mit der gegebenen Primärεtruktur molekulare Oberflächen bei dem Sekundärstrukturelement zu gestalten sind, die repräsentativ für das gegebene Strukturelement sind. Wenn nicht, wird die Sekundärstruktur verworfen. Damit ergibt sich ein neues Verfahren der Sekundärεtrukturvorherεage . Das neuronale Netz wird anhand der bekannten Proteinεtrukturen trainiert.
Alternativ zur allgemeinen Strukturbildung auf der Grundlage von Standard φ, <p und χ-Winkeln für Helices bzw. Faltblättern können bekannte Sekundärstrukturvorherεagealgorithmen angewendet werden, εo daß das vorgenannte Verfahren nur auf die vorhergesagten Strukturen (Teile der Sequenz) angewandt wird. In einem weiteren Schritt werden die gefundenen Cluster, die Kontakt zu einem bestimmten Sekundärstrukturelement (oder Solvent) haben, verwendet, um in der Datenbank DIP gleiche oder ähnliche molekulare Oberflächen und deren Nachbarn zu suchen. Dies geschieht mit dem weiter oben schon beschriebenen biaε-freien Überlagerungεalgorith uε für atomare Sets.
Auε dem vorgenannten Arbeitεεchritt ergeben sich eine Reihe von MPS , deren Partnerelement sicher bzw. weniger sicher (Variantenplanung) festliegt. Wird dabei ''nicht-Solvent" vorhergesagt, versucht ein einfacher Docking-Algorith us im dritten Schritt eine pasεende Fläche in anderen Sekundärstrukturelementen alε dem direkt betrachteten zu lokalisieren. Der einfache Docking-Algorithmus beruht auf der Tatsache, daß molekulare Grenzflächenpartner zwischen Sekundarstrukturen innerhalb eines gegebenen Abstandeε der beiden Schwerpunkte bzw. einem beεtimmten Winkel der ausgezeichneten Richtung geεucht werden kann. Die Qualität der Paßfähigkeit wird mit Hilfe der molekularen Dichtebeεtimmung überprüft (siehe oben, Goede et al.). Liegen die potentiellen Partner fest, wird in einem vierten Schritt die prinzipielle Faltbarkeit unter Einhaltung aller vorhergesagten Nachbarschaften
(Solvent, Helix-Helix, Helix-coil, Helix-extended) überprüft und die allgemeine Faltung oder mehrere Varianten von der gegebenen Sequenz angenommen.
Das folgende Beispiel soll das erfindungsgemäße Verfahren erläutern.
Beispiel
Inhibitor-Design für das Proteaso
Ausgehend von einem Bindungsort einer aktiven Untereinheit des Proteaεomε bei Hefe werden die Sekundärelemente bestimmt, die den Bindungsort bilden. Es stellt sich heraus, daß fünf Elemente beteiligt sind, wobei zwei größere Elemente den Bindungsort bestimmen. Anschließend werden die Außenflächen dieser Sekundarstrukturen bestimmt. Mit den Teilen der Außenflächen, die den Kontakt ausmachen und 12 bis 22 Atome umfasεen, werden in der DIP-Datenbank ähnliche MSPε geεucht. Die ähnlichen MSPε von einer bestimmten Mindestgüte, wobei mindeεtens 70% der Atome überlagert εind und der rmε-Wert 1 , 0A beträgt, werden mit den Ausgangsflächen überlagert, wobei die Aminosäuren, die die Gegenseite der MSPε bilden bei der Koordi- natentranεformation der MSPs einbezogen werden. Nach der Ko- ordinatentranεformation liegen die gefundenen MSPs auf den Atomen des Bindungsortes, die Gegenseiten der MSPε in der Bindungstasche .
Die Gegenseiten der gefundenen MSPs, die die potentiellen Liganden darstellen, werden dahingehend überprüft, ob sie die Bindungstasche ausfüllen und ob die Abstände zu den Atomen der Bindungstasche groß genug sind. Dafür wird die lokale Dichte in der Bindungεtaεche berechnet. Die beεten potentiellen Liganden bilden die Leitverbindungen. Ein Vergleich der zehn besten potentiellen Liganden mit einer Proteasom-Struktur des Archaebakteriumε , die mit Ligand vorliegt, ergibt, daß die Hauptkette von einer der auf diese Weise berechneten Strukturen völlig identisch zu dem bekannten Inhibitor des Proteasoms deε Archebakteriums ist.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Beεti mung von Liganden für Proteine, das folgende Schritte umfaßt: a) Bestimmen der Sekundärstrukturelemente eines gegebenen Proteins, die den Bindungsort für den Liganden bilden; b) Zerlegung der molekularen Oberfläche des Proteins in molekulare Oberflächenelemente; c) Bestimmen von ähnlichen Flächen zu denjenigen Oberflächenelementen, die die zu bestimmende Bindungsregion für den Liganden definieren, wobei die gefundenen molekularen Oberflächenteile ein komplementäres Nachbarelement besitzen ; d) Koordinatentransformation des gefundenen molekularen Oberflächenteilε mit Nachbarelement auf ein Auεgangs- element bei einem rms-Wert unterhalb von 2A und e) Beurteilung der Paßfähigkeit des Liganden gemäß lokaler Packungsdichte.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Außenflächen der Sekundarstrukturen bestimmt werden, wobei die Außenflächen, die den Kontakt herstellen, bevorzugt die molekularen Oberflächenteile εind.
3. Verfahren nach Anεpruch 1 oder 2, bei dem die ähnlichen molekularen Oberflächenteile mit den Auεgangεflachen überlagert werden.
4. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem nach der Koordinatentranεformation die gefundenen molekularen Oberflächenteile auf Atomen deε Bindungsortes liegen.
5. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem die besten potentiellen Liganden die Leitverbindung bilden und/oder mit einem bekannten Auεgangsprotein plus Ligand verglichen werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Liganden in Form von Peptiden bestimmt werden, die bevorzugt etwa zehn Aminosäuren umfasεen und bevorzugt anεchließend in ein Peptidmime- tiku umgewandelt wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anεprüche, bei den die Proteine Enzyme εind.
8. Verfahren nach Anεpruch 1, bei dem der rms-Wert 1 , 5Ä beträgt.
9. Verfahren nach einem der vorangegangenen Anεprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Strukturbestimmung von Proteinen angewendet wird.
10. Verwendung eines nach den Ansprüchen 1 bis 12 herge- εtellten Ligandε zur Herstellung eines Pharmakons.
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DE (1) DE19831758A1 (de)
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7102005B2 (en) 2002-05-03 2006-09-05 Molecular Probes, Inc. Compositions and methods for detection and isolation of phosphorylated molecules
US7445894B2 (en) 2002-05-03 2008-11-04 Molecular Probes, Inc. Compositions and methods for detection and isolation of phosphorylated molecules

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008127136A1 (en) * 2007-04-12 2008-10-23 Dmitry Gennadievich Tovbin Method of determination of protein ligand binding and of the most probable ligand pose in protein binding site

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991016683A1 (en) * 1990-04-24 1991-10-31 Scripps Clinic And Research Foundation System and method for determining three-dimensional structures of proteins
WO1993001484A1 (en) * 1991-07-11 1993-01-21 The Regents Of The University Of California A method to identify protein sequences that fold into a known three-dimensional structure
WO1993021206A1 (en) * 1992-04-08 1993-10-28 The Scripps Research Institute Synthetic, stabilized, three-dimension polypeptides
US5495423A (en) * 1993-10-25 1996-02-27 Trustees Of Boston University General strategy for vaccine and drug design
US5557535A (en) * 1993-04-28 1996-09-17 Immunex Corporation Method and system for protein modeling
WO1997026277A2 (en) * 1996-01-22 1997-07-24 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen analogs and methods for producing them

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5331573A (en) * 1990-12-14 1994-07-19 Balaji Vitukudi N Method of design of compounds that mimic conformational features of selected peptides

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991016683A1 (en) * 1990-04-24 1991-10-31 Scripps Clinic And Research Foundation System and method for determining three-dimensional structures of proteins
WO1993001484A1 (en) * 1991-07-11 1993-01-21 The Regents Of The University Of California A method to identify protein sequences that fold into a known three-dimensional structure
WO1993021206A1 (en) * 1992-04-08 1993-10-28 The Scripps Research Institute Synthetic, stabilized, three-dimension polypeptides
US5557535A (en) * 1993-04-28 1996-09-17 Immunex Corporation Method and system for protein modeling
US5495423A (en) * 1993-10-25 1996-02-27 Trustees Of Boston University General strategy for vaccine and drug design
WO1997026277A2 (en) * 1996-01-22 1997-07-24 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen analogs and methods for producing them

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOEDE ET AL: "Voronoi cell: New method for allocation of space among atoms: Elimination of avoidable errors in calculation of atomic volume and density", JOURNAL OF COMPUTATIONAL CHEMISTRY, vol. 18, no. 9, 1997, pages 1113 - 1123, XP000853716 *
PREISSNER ET AL: "Dictionary of Interfaces in proteins (DIP)", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 280, no. 3, 1998, pages 535 - 550, XP000853728 *
PREISSNER R ET AL: "Inverse sequence similarity in proteins and its relation to the three-dimensional fold", FEBS LETTERS, (8 SEP 1997) VOL. 414, NO. 2, PP. 425-429. PUBLISHER: ELSEVIER SCIENCE BV, PO BOX 211, 1000 AE AMSTERDAM, NETHERLANDS. ISSN: 0014-5793., CHARITE, INST BIOCHEM, MONBIJOUSTR 2A, D-10117 BERLIN, GERMANY (Reprint);CHARITE, INST BIOCHEM, D-10117 BERLIN, GERMANY, XP002122575 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7102005B2 (en) 2002-05-03 2006-09-05 Molecular Probes, Inc. Compositions and methods for detection and isolation of phosphorylated molecules
US7445894B2 (en) 2002-05-03 2008-11-04 Molecular Probes, Inc. Compositions and methods for detection and isolation of phosphorylated molecules

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