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WO2000077507A1 - Vorrichtung zur probenaufgabe - Google Patents

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WO2000077507A1
WO2000077507A1 PCT/EP2000/005204 EP0005204W WO0077507A1 WO 2000077507 A1 WO2000077507 A1 WO 2000077507A1 EP 0005204 W EP0005204 W EP 0005204W WO 0077507 A1 WO0077507 A1 WO 0077507A1
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WO
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sample
channel
volume
section
separation
Prior art date
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PCT/EP2000/005204
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English (en)
French (fr)
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WO2000077507A8 (de
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Friedhelm Eisenbeiss
Bernd Stanislawski
Thomas Greve
Renate Bender
Roland HERGENRÖDER
Günther Weber
Benedikt Grass
Andreas Neyer
Matthias JÖHNCK
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Der Spektrochemie und Angewandten Spektroskopie Ev Gesell zur Forderung
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Der Spektrochemie und Angewandten Spektroskopie Ev Gesell zur Forderung
Merck Patent GmbH
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Publication date
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Priority to EP00942016A priority patent/EP1185859A1/de
Priority to JP2001503515A priority patent/JP2003502635A/ja
Priority to JP2001503518A priority patent/JP4387624B2/ja
Priority to EP00938793A priority patent/EP1194769A1/de
Priority to AU54051/00A priority patent/AU5405100A/en
Priority to PCT/EP2000/005518 priority patent/WO2000077511A1/de
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Publication of WO2000077507A8 publication Critical patent/WO2000077507A8/de
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    • G01N35/1095—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices for supplying the samples to flow-through analysers

Definitions

  • the invention relates to a device for sample application for planar, miniaturized analysis systems.
  • ITP isotachophoresis
  • Electrophoretic separation processes such as the ITP are also suitable for use in miniaturized analysis systems (MAS), so that the equipment required for the analyzes can be greatly reduced.
  • MAS miniaturized analysis systems
  • the device for sample application In addition to the analysis device itself, one of the most important components of a miniaturized system is the device for sample application. Since methods such as the ITP are very variable with regard to the nature and amount of the sample, the type of sample application determines which sample volume and which type of sample can be analyzed. In macroscopic analysis systems, mechanical feed devices for feeding a defined sample volume can be used, similar to devices for high-pressure liquid chromatography or devices for isotachophoresis. Figure 4 shows an example of such a feeding device from the prior art. The devices mostly consist of complex cock systems, some with integrated feed loops. These devices cannot be transferred to miniaturized analysis systems because rotatable taps or other mechanical devices, such as closable valves, cannot be miniaturized accordingly.
  • FIG. 3 A schematic structure of such a device from the prior art is shown in Figure 3.
  • Crossed or offset crossed capillary structures define a sample volume by first filling a channel with sample. This can be done electro-osmotically, for example, by applying a voltage. The electrodes on the filled channel are then switched to the same potential and a voltage is applied to the separating channel system perpendicular to it. In this way, the sample volume, which is located at the interface of the two channel systems, is transported into the separation channel system. The sample volume generated in this way is in the range of a few nanoliters or less.
  • sample application can be carried out with a sufficiently large channel cross section by hydrodynamic injection from a sample vessel. Part of the sample is created by time-controlled application of a sample vessel.
  • a direct, electrophoretic injection from an external sample vessel (without utilizing the electroosmotic flow), as it is also used in commercial devices, is in principle not suitable for giving up defined volumes, since no volume flow is generated in the sample solution, but only Ions are transferred electrophoretically into the separation system.
  • the object of the present invention is therefore to develop a device for sample application which makes it possible to introduce defined variable sample volumes between 0.01 to 100 ⁇ l in a miniaturized analysis system.
  • a feed device consisting of a channel system and fluid connections for liquid transport enables large sample volumes to be fed in planar systems.
  • a specific channel section is filled with the sample solution.
  • the volume of the channel section and thus the sample volume applied is determined by the geometry of the channel section, but is otherwise freely selectable.
  • the invention therefore relates to a device for feeding defined sample volumes over 0.01 ⁇ l for miniaturized analysis systems, comprising mainly at least one channel section, at the ends of which there are fluid connections.
  • Another preferred embodiment is a feed device that contains at least two channel sections located one behind the other, each of which is delimited by fluid connections. If both channel sections are directly adjacent to one another, a total of three fluidic connections are provided.
  • a preferred embodiment is also a feed device which contains a channel system with at least two parallel channel sections which are delimited independently of one another by fluid connections.
  • a preferred embodiment is a device which has micromixer valves and micropumps or tightly closing micropumps as fluidic connections.
  • Figure 1 shows a feed device according to the invention.
  • Figure 2 shows a possible procedure for filling a miniaturized analysis system with a feed device according to the invention.
  • FIG. 3 shows a feeding device for miniaturized analysis systems from the prior art.
  • Figure 4 shows a feeding device for macroscopic analysis systems from the prior art.
  • the channel system is opened at two points during the sample application.
  • One opening serves to introduce the liquid, ie for example the sample solution
  • the other opening allows the liquid or air previously in the system to escape.
  • the application device according to the invention is the displacement of a liquid or gas volume located in a specific channel section by the sample solution.
  • Liquid is displaced in the intermediate channel section or the intermediate channel section is filled.
  • the liquid in any adjacent side channels that may be present is not exchanged, since there are no open inlet or outlet openings in the side channels, and so the liquid is not moved in these areas by pressure or suction.
  • Losses or dilutions due to liquid flows at the contact surfaces to side channels are small in relation to the total sample volume, which is typically in the ⁇ l range. With a suitable constant dosing speed, the sample application can be reproduced very well. This is a great advantage over methods in which very small sample volumes of a few nanoliters are applied.
  • a feed device according to the invention is also suitable for task volumes of less than 50 nl. However, compromises are then necessary with regard to precision and accuracy.
  • the sample liquid can be transported via tightly connected pumps, syringes, micromixers, electro-osmosis or hydrostatic pressure, preferably via micropumps and valves.
  • These devices can preferably be attached outside, as close as possible to the chip.
  • the escaping liquid does not have to be pumped out additionally. It is displaced sufficiently effectively by the pressure of the replacement fluid injected.
  • This type of filling avoids the disadvantages of electroosmotic injection, ie the filling is largely independent of the sample composition, pH value and the material of the analysis system. Any disruptive fluid movement, such as hydrostatic pressure differences or electro-osmosis, is prevented by the existing valves or tightly closing pumps.
  • fluid connections all valves, pumps or micropumps, tight-closing micropumps, micromixers or other connections of the device according to the invention which serve to fill the channel system are referred to as fluid connections.
  • the feed device according to the invention can be used for any type of planar miniaturized analysis system. These can be systems for analysis or systems that additionally contain separation or derivatization units. Corresponding miniaturized systems are known to the person skilled in the art.
  • Viscosity and ionic strength of the sample solution or the solution to be displaced have little influence on the dosage or the filling speed. It is possible to fill in suspensions, emulsions, liquids containing particles and cells.
  • the choice of material for the construction of the analysis device is subject to, i.e. in particular, the nature of the walls of the channel system of the device for sample application according to the invention has no restriction. Pressure fluctuations, pulsations, start-up or stop effects during the introduction of the sample also have no influence on the dosing accuracy.
  • the device according to the invention has wide limits with regard to the task volume due to the system.
  • the volume of the sample liquid that can be injected is determined solely by the volume of the channel section determined, which is located between the openings.
  • sample volumes adapted to the analytical problem can be determined in advance. It is also possible to implement sections of different sizes in parallel and / or in series, so that the volume of the section to be displaced by the sample solution can be varied.
  • An analysis system for using the device according to the invention is therefore preferably provided with a plurality of channel sections of different dimensions, which can be used for the sample application via independent fluid connections.
  • sample volumes between 0.01 ⁇ l and 100 ⁇ l, preferably between 0.05 and 30 ⁇ l, can be injected in different increments as required.
  • variation coefficients of approximately 5%, typically below 2%, are typically achieved when sample volumes from 1 ⁇ l are applied.
  • Figure 1 shows an example of a possible arrangement of the channel system of the feed device according to the invention.
  • the channel system is divided into two channel sections 1A and 1 B with different volumes. Adjacent to this is the separation channel 1 C.
  • the separation channel 1 C Adjacent to this is the separation channel 1 C.
  • the sample in section 1 C is separated by applying a voltage. If only section 1A has been filled with the sample, section 1B can also be used as a separating section so that the separating section can be extended if necessary.
  • Figure 2 shows a possible procedure for filling a miniaturized analysis system.
  • a channel system is shown consisting of three reservoirs R1 to R3, the channel sections K1 to K4, the fluid connections F1 to F6 and a branching point Vz.
  • the system shown in the figure has a channel section K1 for sample application.
  • the separation can take place along the channel section K2 and K3 or K2 and K4.
  • the system must be filled with a sample and appropriate buffers.
  • the sample volume must be in contact with a buffer (leading buffer) on one side in the direction of the separation section and with another buffer (terminating buffer) on the other side.
  • Vz of the channel system it is possible to fill in different leading buffers via the reservoirs R2 and R3. Separated components can be removed from the sample via the fluid connection F3.
  • the fluid connections F2 (outlet), F4, F5 and F6 (inlets) are first opened as shown schematically under A in the figure, and the channel system via the three reservoirs with the both leading buffers (above R2 and R3, shown hatched or dotted) and the terminating buffer (above R1, shown in vertical stripes). Excess buffer can escape through the fluid connection F2. In this way, channel section K1 fills with terminating
  • section K4 with leading buffer (LE1) over R3 and channel section K2 contains a mixture of the two leading buffers.
  • the fluid connections F1 and F3 remain closed in this step.
  • the channel section K2 can optionally be filled with leading buffers via R2 or R3.
  • K2 represents the first section of the separation section
  • Part B of the figure shows how the sample is introduced into the channel section K1 and how the channel section K2 is filled with a leading buffer via R3.
  • the fluid connections F5 and F6 are closed and no further terminating buffer is pumped via R1 and no further leading buffer (LE2) is pumped via R2.
  • Fluid connection F4 is open and channel section K2 is filled with leading buffer (LE1) via R3.
  • the fluid connection F1 is open and the sample is fed via F1 (shown as wavy lines). Excess sample and excess leading buffer (LE1) can escape via the opened fluidic connection F2. Because the leading buffer (LE1) and the sample volume are simultaneously pumped against each other, a particularly precise filling of the channel sections K1 and K2 is achieved. In this way it is also possible to carry out an exact filling with pumps that have a low pulsation.
  • the fluid connections are closed.
  • a closed system without hydrodynamic flow is obtained in which the separation can be carried out reproducibly.
  • the sample can be whole or in fractions over the
  • Channel sections K2 and K3 or via the channel sections K2 and K4 are separated. As soon as the sample or a selected fraction has migrated through the channel section K2 and has reached the junction Vz, it can be decided whether the separation should be carried out in the direction of K4 or K3. This is done by switching the anode potential from F4 to F6 continuously or temporarily.
  • the following table shows an overview of the switching of the fluid connections during the individual steps of the sample application:
  • Figure 3 shows a possibility for electrokinetic sample application in miniaturized analysis systems according to the prior art.
  • Pictures A, B, C and D show the individual steps of the sample application.
  • Picture A shows schematically a crossed channel structure.
  • the electrodes E1 to E4 are located at the ends of the channels.
  • a channel is filled with sample by applying a voltage between electrode E1 (0 V) and E2 (+ 500 V).
  • the sample volume located at the interface of the two channel systems is transported into the separation channel system ( Figure D).
  • the sample volume generated in this way is in the range of a few nanoliters or less.
  • Figure 4 shows an option for sample application in macroscopic analysis systems, such as the Isotachophoresencing ItaChrom ® EA 101 of the company I + M, analytical measurement and control technology, Germany.
  • the pictures A1 / A2, B1 / B2 and C1 / C2 show the different stages of the sample application, the pictures A1, B1 and C1 showing a side view of the application device, the pictures A2, B2 and C2 a view from above.
  • This mechanical device for sample application consists of a tap K which is surrounded by a casing U. Both the casing U and the tap K have multiple channels.
  • the tap K can be rotated in the casing U in such a way that specific channels are connected in the tap and casing and liquids from storage vessels reach the connected isotachophoresis device by the device shown.
  • the storage container and the ITP device are not shown in the figure, but are only indicated by arrows.
  • Figures A1 / A2 the tap is turned so that a connection of the duct pieces 3, 4 and 5, and 2 and 6.
  • Channel piece 5 in the interior of the tap is thereby filled with sample solution from a storage vessel which is connected to channel 3.
  • the channel system of the isotachophoresis device is filled with one of the two separation buffers (buffer 1) necessary for an ITP via a storage vessel on channel 2.
  • a second step (Fig. B1 / B2) the tap K is turned so that the sewer connections existing in Fig. A1 / A2 are interrupted. Instead, a connection of the channel pieces 1 and 7 is established. In this way, the channel system behind the feed device is filled with a second buffer (buffer 2). Finally, in picture C1 / C2 the tap K is turned again so that the duct sections 1, 5 and 2 are connected. Channel 2 is filled with buffer 1, channel 5 with the sample solution and channel 1 with buffer 2. In this way, a volume of the sample solution defined by the dimensions of channel 5 is embedded between the two buffers necessary for the ITP. The separation can now be started by applying a voltage.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Probenaufgabe für miniaturisierte Analysensysteme. Durch gezieltes Design des Kanalsystems und Verdrängen des Flüssigkeitsvolumens eines bestimmen Kanalabschnitts können definierte Volumina von 0,01 mu l bis zu 100 mu l aufgegeben werden. Die erfindungsgemässe Vorrichtung eignet sich insbesondere für eine anschliessende Analyse der Proben mittels Isotachophorese.

Description

Vorrichtung zur Probenaufgabe
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Probenaufgabe für planare, miniaturisierte Analysensysteme.
In Bereichen wie der Lebensmittelanalytik, Umweltanalytik oder auch der industriellen Qualitätskontrolle besteht zunehmend Bedarf an Analysensystemen, die schnell und ohne großen apparativen Aufwand die genaue und quantitative Analyse komplexer Gemische ermöglichen. Neben Sensoren oder Schnelltests, die auf spezifischen chemischen Reaktionen basieren und daher keine universellen Verfahren darstellen, werden hauptsächlich chromatographische und elektrophoretische Trennverfahren eingesetzt. Im Gegensatz zu den meisten chromatographischen und elektrophoretischen Verfahren bietet die Isotachophorese (ITP) die Möglichkeit, große Probenmengen bei hoher Trennselektivität ohne vorherige Aufarbeitung zu analysieren. Elektrophoretische Trennverfahren wie die ITP eignen sich zudem auch zum Einsatz in miniaturisierten Analysensystemen (MAS), so daß der apparative Aufwand für die Analysen stark reduziert werden kann. Ein wesentlicher Vorteil des Einsatzes von MAS besteht darin, daß diese nach einer Kontaminierung verworfen werden können. Um diesen Vorteil zu realisieren, muß die Reproduzierbarkeit von Analysen in der Serie und zwischen verschiedenen MAS gleichen Types sichergestellt sein.
Neben der Analysenvorrichtung selbst ist einer der wichtigsten Bestandteile eines miniaturisierten Systems die Vorrichtung zur Probenaufgabe. Da Verfahren wie beispielsweise die ITP bezüglich der Beschaffenheit und der Menge der Probe sehr variabel sind, wird durch die Art der Probenaufgabe bestimmt, welches Probenvolumen und welche Art von Probe analysiert werden kann. In makroskopischen Analysensystemen können ähnlich wie bei Geräten für die Hochdruckflüssigkeitschromatographie oder Geräten für die Isotacho- phorese mechanische Aufgabevorrichtungen zur Aufgabe eines definierten Probenvolumens verwendet werden. In Abbildung 4 wird beispielhaft eine derartige Aufgabevorrichtung aus dem Stand der Technik näher beschrieben. Die Vorrichtungen bestehen zumeist aus komplex aufgebauten Hahnsystemen, teilweise mit integrierten Aufgabeschleifen. Auf miniaturisierte Analysensysteme lassen sich diese Vorrichtungen nicht übertragen, da drehbare Hähne oder sonstige mechanische Vorrichtungen, wie beispiels- weise verschließbare Ventile, nicht entsprechend miniaturisiert werden können.
Deswegen finden sich bei miniaturiserten Analysenvorrichtungen auf Basis von Kapillarelektrophorese (CE) oder ITP Vorrichtungen, bei denen die Probenaufgabe elektrokinetisch unter Ausnutzung des elektroosmotischen Flusses erfolgt. Dies wird im folgenden elektroosmotische Probenaufgabe genannt. Ein schematischer Aufbau einer solchen Vorrichtung aus dem Stand der Technik ist in Abbildung 3 gezeigt. Durch gekreuzte oder versetzt gekreuzte Kapillarstrukturen wird ein Probenvolumen dadurch definiert, daß zunächst ein Kanal mit Probe befüllt wird. Dies kann beispielsweise elektro- osmotisch durch Anlegen einer Spannung erfolgen. Anschließend werden die Elektroden an dem befüllten Kanal auf gleiches Potential geschaltet und eine Spannung an dem senkrecht dazu liegenden Trennkanalsystem angelegt. Auf diese Weise wird das Probenvolumen, das sich an der Schnittstelle der beiden Kanalsysteme befindet, in das Trennkanalsystem transportiert. Das so erzeugte Probenvolumen liegt im Bereich einiger Nanoliter oder weniger.
Auf diese Weise ist es zwar möglich, ein durch die Schnittstelle der Kanäle definiertes Probenvolumen aufzugeben, aber die Volumenelemente, in denen durch Diffusion Stoffaustausch mit den Seitenkanälen stattfindet, sind bezogen auf das durch das Schnittvolumen vorgegebene Proben- volumen sehr groß. Somit ist das tatsächlich eingebrachte Probenvolumen starken Schwankungen unterworfen. Da nur sehr kleine Probenmengen untersucht werden können, sinkt zudem die Konzentration bestimmter Analyte im Detektionsbereich schnell unter die Nachweisgrenze oder das entnommene Probenvolumen kann nicht als repräsentativ für die Probengesamtheit angesehen werden.
Weiterhin kann die Probenaufgabe bei ausreichend großem Kanalquerschnitt durch hydrodynamische Injektion aus einem Probengefäß erfolgen. Dabei wird ein Teil der Probe durch zeitlich gesteuertes Anlegen eines
Druckunterschiedes aus dem externen Probengefäß an den Anfang der Trennkapillare transportiert. Nachteil dieser Technik ist eine starke Abhängigkeit des Probenvolumens von der Beschaffenheit der Probe (z.B. Viskosität), aber auch von der erreichbaren Genauigkeit der Druck- Steuerung. Schon dadurch ist die Aufgabe eines exakt definiertes
Probenvolumen nicht möglich. Zusätzlich bestehen auch hier Probleme durch diffusiven bzw. konvektiven Stoffaustausch an den Grenzflächen zwischen Probevolumen und angrenzenden Volumeneinheiten. Bei kommerziellen, nicht miniaturisierten Systemen ist die hydrodynamische Injektion Stand der Technik, für miniaturisierte Systeme bietet sie keine
Vorteile gegenüber der oben beschriebenen elektrokinetischen Injektion unter Ausnutzung des elektroosmotischen Flusses.
Eine direkte, elektrophoretische Injektion aus einem externen Probengefäß (ohne Ausnutzung des elektroosmotischen Flusses), wie sie ebenfalls in kommerziellen Geräten eingesetzt wird, ist schon vom Prinzip her nicht geeignet, definierte Volumina aufzugeben, da hierbei in der Probelösung kein Volumenfluß erzeugt wird, sondern nur Ionen elektrophoretisch in das Trennsystem überführt werden.
Ein weiterer grundsätzlicher Nachteil aller elektroosmotischen Verfahren ergibt sich aus der eingeschränkten Materialauswahl. Da der Proben- transport an das Auftreten eines elektroosmotischen Flusses gebunden ist, muß eine hohe Ladungsdichte an der Materialoberfläche vorhanden sein. Zudem erfolgt schon während der Aufgabe eine elektrophoretische Auftrennung der Probe, so daß ein inhomogenes Injektionsprofil entsteht.
Da mittels ITP problemlos größere Probenvolumina analysiert werden können, wird die Analyseleistung der derzeitigen miniaturisierten Analysensysteme größtenteils durch die ungenügende Möglichkeit zur Aufgabe großer, definierter Probenvolumina eingeschränkt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung zur Probenaufgabe zu entwickeln, die es ermöglicht, definierte variable Probenvolumina zwischen 0,01 bis 100 μl in ein miniaturisiertes Analysensystem einzubringen.
Es wurde gefunden, daß eine Aufgabevorrichtung bestehend aus einem Kanalsystem sowie Fluidikanschlüssen zum Flüssigkeitstransport die Aufgabe großer Probenvolumina in planaren Systemen ermöglicht. Durch Öffnen des Systems am Ende eines Kanalabschnitts und gleichzeitiges Befüllen des Kanalabschnitts mit der Probenlösung am anderen Ende wird ein bestimmter Kanalabschnitt mit der Probenlösung gefüllt. Das Volumen des Kanalabschnitts und somit das aufgegebene Probenvolumen ist durch die Geometrie des Kanalabschnitts bestimmt, ansonsten aber frei wählbar.
Gegenstand der Erfindung ist daher eine Vorrichtung zur Aufgabe definierter Probenvolumina über 0,01 μl für miniaturisierte Analysensysteme, umfassend in der Hauptsache mindestens einen Kanalabschnitt, an dessen Enden jeweils Fluidikanschlüsse vorhanden sind.
in einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung können
Probenvolumina zwischen 0,05 und 30 μl aufgegeben werden. Bevorzugte Ausführungsform ist weiterhin eine Aufgabevorrichtung, die mindestens zwei hintereinanderliegende Kanalabschnitte enthält, die jeweils von Fluidikanschlüssen begrenzt werden. Wenn beide Kanalab- schnitte direkt aneinander grenzen, so sind insgesamt drei Fluidik- anschlüsse vorgesehen.
Bevorzugte Ausführungsform ist auch eine Aufgabevorrichtung, die ein Kanalsystem mit mindestens zwei parallelen Kanalabschnitten enthält, die unabhängig voneinander von Fluidikanschlüssen begrenzt werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist eine Vorrichtung, die als Fluidik- anschlüsse MikromischerNentile und Mikropumpen oder dichtschließende Mikropumpen besitzt.
Abbildung 1 zeigt eine erfindungsgemäße Aufgabevorrichtung.
In Abbildung 2 ist eine mögliche Vorgehensweise zum Befüllen eines miniaturisierten Analysensystems mit einer erfindungsgemäßen Aufgabevorrichtung gezeigt.
Abbildung 3 zeigt eine Aufgabevorrichtung für miniaturisisierte Analysensysteme aus dem Stand der Technik.
Abbildung 4 zeigt eine Aufgabevorrichtung für makroskopische Analysensysteme aus dem Stand der Technik.
Im Gegensatz zu anderen Aufgabemethoden wird bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung das Kanalsystem während der Probenaufgabe an zwei Stellen geöffnet. Eine Öffnung dient zur Einleitung der Flüssigkeit, d.h. beispielsweise der Probenlösung, die andere Öffnung ermöglicht den Austritt der vorher im System befindlichen Flüssigkeit oder Luft. Prinzip der erfindungsgemäßen Aufgabevorrichtung ist demnach das Verdrängen eines in einem bestimmten Kanalabschnitt befindlichen Flüssigkeits- oder Gas-Volumens durch die Probenlösung.
Durch geeignete Wahl der Eintritts- und Austrittsöffnung wird lediglich die
Flüssigkeit in dem dazwischenliegenden Kanalabschnitt verdrängt bzw. der dazwischenliegende Kanalabschnitt gefüllt. Die Flüssigkeit in eventuell vorhandenen angrenzenden Seitenkanälen wird nicht ausgetauscht, da sich in den Seitenkanälen keine geöffneten Eintritts- oder Austritts- Öffnungen befinden und so die Flüssigkeit in diesen Bereichen weder durch Druck noch durch Sog bewegt wird. Verluste bzw. Verdünnungen durch Flüssigkeitsströme an den Kontaktflächen zu Seitenkanälen sind im Verhältnis zum gesamten Probenvolumen, das typischerweise im μl- Bereich liegt, gering. Bei geeigneter konstanter Dosiergeschwindigkeit kann die Probenaufgabe sehr gut reproduzierbar erfolgen. Dies ist ein großer Vorteil gegenüber Methoden, bei denen sehr kleine Probenvolumina von wenigen Nanolitern aufgegeben werden. Eine erfindungsgemäße Aufgabevorrichtung ist prinzipiell auch für Aufgabenvolumina von weniger als 50 nl geeignet. Jedoch sind dann bezüglich Präzision und Genauigkeit Kompromisse notwendig.
Der Transport der Probenflüssigkeit kann über dicht angeschlossene Pumpen, Spritzen, Mikromischer, Elektroosmose oder hydrostatischen Druck erfolgen, bevorzugt über Mikropumpen- und Ventile.
Diese Vorrichtungen können bevorzugt außerhalb, möglichst dicht am Chip, angebracht werden.
Die austretende Flüssigkeit muß nicht zusätzlich abgepumpt werden. Sie wird durch den Druck der injizierten Ersatzflüssigkeit hinreichend effektiv verdrängt. Durch diese Art des Befüllens werden die Nachteile der elektroosmotischen Injektion vermieden, d.h. die Befüllung ist weitgehend unabhängig von Probenzusammensetzung, pH-Wert und dem Material des Analysensystems. Durch die vorhandenen Ventile oder dichtschließenden Pumpen wird jede störende Flüssigkeitsbewegung, wie beispielsweise durch hydrostatische Druckdifferenzen oder Elektroosmose, unterbunden.
Erfindungsgemäß werden alle Ventile, Pumpen bzw. Mikropumpen, dichtschließende Mikropumpen, Mikromischer oder sonstigen Anschlüsse der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die zum Befüllen des Kanalsystems dienen, als Fluidikanschlüsse bezeichnet.
Die erfindungsgemäße Aufgabevorrichtung kann für jede Art von planarem miniaturisiertem Analysensystem eingesetzt werden. Es kann sich dabei um Systeme für die Analytik handeln oder auch um Systeme, die zusätzlich Trenn- oder Derivatisierungseinheiten enthalten. Dem Fachmann sind entsprechende miniaturisierte Systeme bekannt.
Viskosität und lonenstärke der Probenlösung oder der zu verdrängenden Lösung, d.h. z.B. eines Transportpuffers, haben nur geringen Einfluß auf die Dosierung oder die Einfüllgeschwindigkeit. Es ist möglich, Suspensionen, Emulsionen, partikel- und zellhaltige Flüssigkeiten einzufüllen. Genauso unterliegt die Wahl des Materials zum Aufbau der Analysenvorrichtung, d.h. besonders die Beschaffenheit der Wände des Kanalsystems der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Probenaufgabe keiner Einschränkung. Auch Druckschwankungen, Pulsationen, Anlaufoder Stopeffekte während des Einbringens der Probe haben auf die Dosiergenauigkeit keinen Einfluß.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung besitzt bezüglich des Aufgabevolumens systembedingt weite Grenzen. Das Volumen der Probeflüssigkeit, die injiziert werden kann, wird allein durch das Volumen des Kanalabschnitts bestimmt, der sich zwischen den Öffnungen befindet. Durch Variation der geometrischen Abmessungen dieses Abschnitts bei dem Design des Kanalsystems der Analysevorrichtung lassen sich vorab an das analytische Problem angepasste Probenvolumina festlegen. Genauso ist es möglich, verschieden große Abschnitte parallel und/oder in Reihe zu implementieren, so daß das Volumen des durch die Probenlösung zu verdrängenden Abschnitts variiert werden kann. Bevorzugterweise wird deshalb ein Analysesystem zur Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit mehreren Kanalabschnitten unterschiedlicher Dimension versehen, die über jeweils unabhängige Fluidikanschlüsse für die Probenaufgabe verwendet werden können. Dadurch können Probenvolumina zwischen 0,01 μl und 100 μl , bevorzugt zwischen 0,05 und 30 μl in unterschiedlicher Abstufung je nach Bedarf injiziert werden. Dabei werden üblicherweise Variationskoeffizienten bei der Aufgabe von Probenvolumina ab 1 μl von etwa 5%, typischerweise unter 2% erreicht.
Auf diese Weise können quantitativ reproduzierbare und leicht handhabbare repräsentative Probenmengen eines flüssigen Analyten in jedes mikrostrukturierte System eingebracht werden. Besonders bevorzugt ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung für die ITP, da damit die
Möglichkeit gegeben ist, kleinste Mengen von Analyten aus großen Probenvomunina anzureichern und zu separieren.
Abbildung 1 zeigt beispielhaft eine mögliche Anordnung des Kanalsystems der erfindungsgemäßen Aufgabevorrichtung. Das Kanalsystem ist in zwei Kanalabschnitte 1A und 1 B mit unterschiedlichem Volumen unterteilt. Daran angrenzend befindet sich der Trennkanal 1 C. Über die Fluidikanschlüsse 11 , 12 und 13 kann entweder der Kanalabschnitt 1A (Bei Öffnen der Anschlüsse 11 und 12) oder der Kanalabschnitt 1 B (Bei Befüllen über die Anschlüsse 12 und 13) oder die beiden Kanalabschnitte zusammen (bei Befüllen über die Anschlüsse 11 und 13) mit der Proben- lösung gefüllt werden. Nach Befüllen der Aufgabeabschnitte wird durch Anlegen einer Spannung die Probe in Abschnitt 1 C aufgetrennt. Falls nur Abschnitt 1A mit der Probe befüllt wurde, kann auch Abschnitt 1 B als Trennstrecke genutzt werden, so daß die Trennstrecke bei Bedarf verlängert werden kann.
Abbildung 2 zeigt eine mögliche Vorgehensweise bei der Befüllung eines miniaturisierten Analysensystems. Dargestellt ist ein Kanalsystem bestehend aus drei Reservoiren R1 bis R3, den Kanalabschnitten K1 bis K4, den Fluidikanschlüssen F1 bis F6 und einer Verzweigungsstelle Vz.
Das in der Abbildung gezeigte System besitzt einen Kanalabschnitt K1 zur Probenaufgabe. Die Trennung kann entlang des Kanalabschnitts K2 und K3 oder K2 und K4 erfolgen. Zur Durchführung einer isotachophoretischen Trennung muß das System mit einer Probe und entsprechenden Puffern befüllt werden. Dabei muß das Probevolumen an einer Seite in Richtung der Trennstrecke mit einem Puffer (Leading-Puffer) und an der anderen Seite mit einem anderen Puffer (Terminating-Puffer) in Kontakt sein. Durch die Verzweigung Vz des Kanalsystems besteht die Möglichkeit, über die Reservoire R2 und R3 unterschiedliche Leading-Puffer einzufüllen. Das Ausschleusen von aufgetrennten Komponenten aus der Probe kann über den Fluidikanschluß F3 erfolgen.
Um die gewünschte Anordnung von Probe und Puffern im Kanalsystem zu erreichen, werden zunächst, wie unter A in der Abbildung schematisch dargestellt, die Fluidikanschlüsse F2 (Auslaß), F4, F5 und F6 (Einlasse) geöffnet und das Kanalsystem über die drei Reservoirs mit den beiden Leading-Puffern (über R2 und R3, schräg schraffiert bzw. gepunktet dargestellt) und dem Terminating-Puffer (über R1 , senkrecht gestreift dargestellt) gefüllt. Überschüssiger Puffer kann durch den Fluidikanschluß F2 austreten. Auf diese Weise füllt sich Kanalabschnitt K1 mit Terminating-
Puffer, der Abschnitt K3 mit Leading-Puffer (LE2) über R2, Abschnitt K4 mit Leading-Puffer (LE1 ) über R3 und Kanalabschnitt K2 enthält eine Mischung der beiden Leading-Puffer. Die Fluidikanschlüsse F1 und F3 bleiben bei diesem Schritt geschlossen.
Der Kanalabschnitt K2 kann wahlweise mit Leading-Puffern über R2 oder R3 gefüllt werden. K2 stellt den ersten Abschnitt der Trennstrecke dar
In Teil B der Abbildung wird gezeigt, wie die Probe in den Kanalabschnitt K1 eingebracht wird und der Kanalabschnitt K2 mit einem Leading-Puffer über R3 gefüllt wird. Die Fluidikanschlüsse F5 und F6 sind geschlossen und es wird kein weiterer Terminating-Puffer über R1 sowie kein weiterer Leading-Puffer (LE2) über R2 gepumpt. Fluidikanschluß F4 ist geöffnet und Kanalabschnitt K2 wird mit Leading-Puffer (LE1) über R3 gefüllt. Gleichzeitig ist der Fluidikanschluß F1 geöffnet und die Probe wird über F1 zugeführt (dargestellt als Wellenlinien). Über den geöffneten Fluidik- anschluß F2 kann überschüssige Probe und überschüssiger Leading-Puffer (LE1 ) austreten. Dadurch, daß der Leading-Puffer (LE1) und das Probevolumen simultan gegeneinander gepumpt werden, wird eine besonders präzise Füllung der Kanalabschnitte K1 und K2 erreicht. Auf diese Weise ist es möglich auch mit Pumpen, die eine geringe Pulsation besitzen, eine exakte Befüllung vorzunehmen.
Nach Beendigung des Füllvorganges werden die Fluidikanschlüsse geschlossen. Man erhält so ein abgeschlossenes System ohne hydrodynamischen Fluß, in dem die Trennung reproduzierbar durchgeführt werden kann. Die Probe kann ganz oder in Fraktionen über die
Kanalabschnitte K2 und K3 oder über die Kanalabschnitte K2 und K4 getrennt werden. Sobald die Probe oder eine gewählte Fraktion durch den Kanalabschnitt K2 gewandert ist und an der Verzweigung Vz angekommen ist, kann entschieden werden, ob die Trennung weiter in Richtung K4 oder K3 geführt werden soll. Dies geschieht durch dauerndes oder zeitweises Umschalten der Anodenpotentials von F4 auf F6. Die folgende Tabelle zeigt nochmals im Überblick die Schaltung der Fluidikanschlüsse während der einzelnen Schritte der Probenaufgabe:
Figure imgf000013_0001
Nach Beendigung des Füllvorganges werden die Fluidikanschlüsse (F1-F6) geschlossen.
Im folgenden werden beispielhaft einige Schaltvorgänge für verschiedene analytische Prozesse auf einer Analyseeinheit entsprechend Abbildung 2 aufgeführt:
(Die Spannung wird jeweils hinter den Fluidikanschlüssen angelegt)
1.) Einfache Trennung (Trennkanäle K2 und K4)
Anode : F4 Kathode : F5
2.) 2-stufige Trennung (Ausschleusung in internen Kanal K3) a.) Trennung in K2 Anode : F4 Kathode : F5
(Umschalten, wenn Probenkomponente kurz vor Vz) b.) Trennung in K3 Anode : F6 Kathode : F5
3.) 2-stufige Trennung (Ausschleusung und Überführung in externen Kanal) a.) Trennung in K2 Anode : F4 Kathode : F5
(Umschalten, wenn Probenkomponente kurz vor Vz) b.) Überführung nach außen über F3 Anode : F3 Kathode : F5 77507 . -| 2 - PCT/EPOO/05204
Abbildung 3 zeigt eine Möglichkeit zur elektrokinetischen Probenaufgabe in miniaturisierten Analysensystemen nach dem Stand der Technik. Die Bilder A, B, C und D zeigen die einzelnen Schritte der Probenaufgabe. Bild A zeigt schematisch eine gekreuzte Kanalstruktur. An den Enden der Kanäle befinden sich die Elektroden E1 bis E4. Zunächst wird, wie in Bild B verdeutlicht, durch Anlegen einer Spannung zwischen Elektrode E1 (0 V) und E2 (+ 500 V) ein Kanal mit Probe befüllt. Anschließend werden, wie in Bild C gezeigt, die Elektroden an dem befüllten Kanal auf gleiches Potential geschaltet (z.B. E1 und E2 beide auf + 400 V) und eine Spannung an dem senkrecht dazu liegenden Trennkanalsystem angelegt (E3 = 0 V und E4 = + 2,5 kV). Auf diese Weise wird das Probenvolumen, das sich an der Schnittstelle der beiden Kanalsysteme befindet, in das Trennkanalsystem transportiert (Bild D). Das so erzeugte Probenvolumen liegt im Bereich einiger Nanoliter oder weniger.
Abbildung 4 zeigt eine Möglichkeit zur Probenaufgabe in makroskopischen Analysensystemen, wie beispielsweise dem Isotachophoresegerät ItaChrom® EA 101 der Firma I + M, Analytische Meß- und Regeltechnik, Deutschland. Die Bilder A1/A2, B1/B2 und C1/C2 zeigen die unterschiedlichen Stufen der Probenaufgabe, wobei die Bilder A1 , B1 und C1 eine Seitenansicht der Aufgabevorrichtung zeigen, die Bilder A2, B2 und C2 eine Ansicht von oben. Diese mechanische Vorrichtung zur Probenaufgabe besteht aus einem Hahn K, der von einer Ummantelung U umgeben ist. Sowohl die Ummantelung U, wie auch der Hahn K sind mehrfach von Kanälen durchbrochen. Der Hahn K kann in der Ummantelung U derart gedreht werden, daß jeweils bestimmte Kanäle in Hahn und Ummantelung verbunden werden und so Flüssigkeiten aus Vorratsgefäßen durch die gezeigte Vorrichtung definiert in das angeschlossene Isotachophoresegerät gelangen. Vorratsbehälter und das ITP-Gerät sind in der Abbildung nicht gezeigt, sondern lediglich durch Pfeile angedeutet. In den Abbildungen A1/A2 ist der Hahn derart gedreht, daß eine Verbindung der Kanalstücke 3, 4 und 5, sowie 2 und 6 besteht. Dadurch wird Kanalstück 5 im inneren des Hahns mit Probelösung aus einem Vorratsgefäß gefüllt, das mit Kanal 3 verbunden ist. Außerdem wird über ein Vorratsgefäß an Kanal 2 das Kanalsystem des Isotachophoresegeräts mit einem der beiden für eine ITP notwendigen Trennpuffer (Puffer 1) gefüllt.
In einem zweiten Schritt (Bild B1/B2) wird der Hahn K so gedreht, daß die in Bild A1/A2 bestandenen Kanalverbindungen unterbrochen werden. Statt dessen wird eine Verbindung der Kanalstücke 1 und 7 hergestellt. Auf diese Weise wird das hinter der Aufgabevorrichtung liegende Kanalsystem mit einem zweiten Puffer (Puffer 2) gefüllt. In Bild C1/C2 wird schließlich der Hahn K erneut gedreht, so daß eine Verbindung der Kanalstücke 1 , 5 und 2 entsteht. Kanal 2 ist mit Puffer 1 gefüllt, Kanal 5 mit der Probenlösung und Kanal 1 mit Puffer 2. Auf diese Weise ist ein durch die Abmessungen von Kanal 5 definiertes Volumen der Probenlösung zwischen den für die ITP notwendigen zwei Puffern eingebettet. Durch Anlegen einer Spannung kann nun die Trennung begonnen werden.
Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.
Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, sowie der korrespondierenden Anmeldung DE 199 27 534, eingereicht am 16.06.1999, ist durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.

Claims

Ansprüche
1. Vorrichtung zur Aufgabe definierter Probenvolumina über 0,01 μl für miniaturisierte Analysensysteme umfassend mindestens einen Kanalabschnitt, an dessen Enden jeweils mindestens ein
Fluidikanschluß vorhanden ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das
Probenvolumen zwischen 0,05 und 30 μl beträgt.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kanalsystem mindestens zwei hintereinanderliegende Kanalabschnitte enthält, die jeweils von Fluidikanschlüssen begrenzt werden.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kanalsystem mindestens zwei parallele Kanalabschnitte enthält, die unabhängig voneinander von Fluidikanschlüssen begrenzt werden.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluidikanschlüsse dichtschließende Mikropumpen dienen.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluidikanschlüsse Mikromischer, Ventile und
Mikropumpen dienen.
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