WO1999032650A1

WO1999032650A1 - Procede de production de [s,s]-ethylenediamine-n,n'-acide disuccinique

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Publication number: WO1999032650A1
Application number: PCT/JP1998/005826
Authority: WO
Inventors: Osamu Kato; Makoto Kaneko; Takakazu Endo
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1997-12-22
Filing date: 1998-12-22
Publication date: 1999-07-01
Anticipated expiration: 2000-06-22
Also published as: EP1043400A4; JP3526443B2; DE69835903T2; DE69835903D1; US6261798B1; EP1043400B1; EP1043400A1

Description

明細書

[S, S]-ェチレンジアミン - N， N' -ジコハク酸の製造法発明の背景

発明の技術分野

本発明は、 [S, S]-エチレンジァミン- N, N' -ジコハク酸〔以下、 [S， S]- E D D S と略記する〕の製法に関する。具体的には、本発明は、マレイン酸、無水マレイン酸もしくはマレイン酸塩とエチレンジァミンから微生物または酵素の作用によつて [S， S]- E D D S を製造する方法に関する。

関連技術の開示

[S， S]- E D D S は重金属捕捉能が高く、且つ自然界に放出されると容易に生分解される性質があるため、写真用漂白剤、無電解メツキ薬、洗剤用ビルダ—などの用途が期待されている。

本発明者らは、先に、微生物による [S， S]-E D D Sの製造法として、（1)フマル酸とエチレンジァミンから製造する方法（日本国特許出願公開第 9- 140390号、米国特許第 5707836 号、欧州特許出願公開第 0731171 号）および（2)マレイン酸とエチレンジァミンから製造する方法（日本国特許出願公開第 9-289895号）、さらに上記（1) を金属イオンの存在下に行う方法（欧州特許出願公開第 0805211 号、日本国特許出願公開第 10— 52292号）を提案している。

フマル酸はマレイン酸から化学的方法（米国特許第 2816923 号、同 2955136 号、同 2332992 号）による異性化工程を経て工業的に生産されているため、上記（2) の方法は、より安価な [S, S]- E D D Sの製造法として原料面で有利である。なお、上記日本国特許出願公開第 9- 289895号の方法は、基質としてマレイン酸とエチレンジァミンを用いる方法であるが、収率が低く満足し得るものではない。

したがって、本発明は、マレイン酸を原料として高収率で [S， S]- E D D S を得ることを目的とする。

本発明者らは生化学的知見〔W. Scher ら J. Biol. Chem. , 244, 1878-1882 (1969)， Υ. Takamura ら Agr. Biol. Chem.，

33, 718-728 (1969)， T. Kimura ら Agr. Biol. Chem. , 50, 89-94 ( 1986)， T. Nakaj ima-Kambe ら J. Ferment. Bio eng. , 84, 165- 168 ( 1997)] が多く、またァスパラギン酸製造への応用も提案されているマレイン酸ィソメラーゼ（日本国特許第 2664648号、日本国特許出願公開第 8-51989号、欧州特許出願公開第 693557号）を [S，S]-E D D Sの生産にも応用すべく鋭意検討を行った。

その結果、単にマレイン酸とエチレンジアミン溶液にマレィン酸ィソメラーゼ活性を有する微生物とエチレンジアミン- N， N' -ジコハク酸エチレンジァミンリア一ゼ〔以下、 E D D S ァ一ゼと略記する〕活性を有する微生物とを添加しただけでは、 [S， S]- E D D S への変換率が低いこと、しかし、これにアルカリ土類金属等の金属イオンを存在させることによリ初めて、マレイン酸の [S， S]- E D D S への変換率が大幅に上昇することなどを見出し本発明に到達した。発明の概要

すなわち、本発明は、アルカリ土類金属、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、アルミニウム、チタニウムおよびマンガンからなる群から選ばれる少なくとも一種の金属イオンの存在下、マレイン酸、無水マレイン酸またはマレイン酸塩とエチレンジァミンとを含有する基質溶液に、マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物またはその処理物とエチレンジァミン- N， N' -ジコハク酸エチレンジアミンリァ一ゼ活性を有する微生物またはその処理物とを作用せしめ、 [S， S]-ェチレンジァミン - N， N' -ジコハク酸を得ることを特徴とする [S， S]-エチレンジアミン- N， N' -ジコハク酸の製造法を提供する。

本発明においては、マレイン酸をフマル酸に変換する酵素およびフマル酸を [S， S]- E D D S に変換する酵素の両方が、各々の酵素の由来には関係なく、可逆的な平衡反応を触媒するので、単に両酵素を存在させるだけでは高収率で [S， S] - E D D S を得ることは不可能であるところ、アルカリ土類金属等のイオンを存在させて生成する [S， S]-E D D S を金属錯体と成し両酵素の反応系外にもっていくことで反応平衡を生成側へ移動させ、これにより高収率、且つ高濃度で [S， S]- E D D S を反応系内に蓄積させることが可能になるものと推察される。

さらに、マレイン酸からフマル酸、およびフマル酸から [S, S]-E D D Sへの変換反応は弱い発熱反応であり、熱力学的には反応温度が低いほど生成物側（フマル酸生成側）に平衡が傾くので、上記金属イオン非存在下の反応では、収率向上を目的として反応後期に反応温度を下げるなどの操作を行う必要があった。しかし、該金属イオン存在下では温度を下げるなどの操作を行わなくても高い変換収率が得られる。

なお、本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願第 9— 364798号（ 1997年 12月 22 日出願）の明細書に記載される内容の全部または一部を包含する。発明の詳細な説明以下に本発明を詳細に説明する。

本発明における金属のイオンは、アルカリ土類金属、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、アルミニウム、チタニウムおよびマンガンのイオンであり、例えば、 M g ( 11 )、 C a ( I I )、 S r ( I 1)、 B a ( I I ) , F e ( 11)、 F e ( I I I ) 、 Z n ( I I)、 C u ( I I)、 N i ( 11)、 A 1 ( I I I ) 、 T i ( IV)および M n ( I I )イオンならびにこれらの各種錯イオンを挙げることができる。

これら金属のイオン源としては、これら金属の水酸化物、酸化物ならびに硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、炭酸および酢酸等の無機または有機酸塩、さらにこれら金属化合物を含む鉱物や本発明の基質であるマレイン酸やエチレンジァミンとの化合物等を挙げることができる。これらの化合物は 2種以上混合して用いることも可能である。

また、これらの金属化合物中には、水に対し溶解度の低いものあるいは難溶性のものもあるが、これらを飽和濃度以上に、例えば、懸濁状態として存在させた場合でも、 [S， S]- E D D S の配位能によリ相当量が可溶化されるため使用可能である。すなわち、本発明の「金属のイオン」源としての化合物は、金属のイオンが [S, S]- E D D S と配位し、本発明の効果が得られるものである限り使用できる。

本発明に使用されるマレイン酸ィソメラ一ゼ活性を有する微生物としては、マレイン酸を異性化してフマル酸に変換する微生物であれば特に制限はなく、例えば、アルカリゲネス ( A 1 cal i genes) j¾ , シユードモナス ( Pseudomonas) , キサン卜モナス ( Xant omonas) M > ノチノレス（ 5ac/ゾゾ us) 属に属する微生物を挙げることができる。さらに、これらの微生物に由来するマレイン酸ィソメラーゼ遺伝子を組換えた遺伝子操作微生物も用いることができる。具体的な菌株としては、アルカリゲネスフエカリス ( A!c al genes faecal is) IFO 12669 、同 1F0 13111、同 IAM 14 73 、アルカリゲネスュ一トロファス Alcal igenes eut rop hus) IAM 12305、シュ一ドモナスフルォレツセンス seud omonas fluol escens) ATCC 23728 、キサン卜モナスマノレ卜フィリア ( Xantho onas mal tophi 1 ia、 ATCC 13270、ノチソレス sp. MI 105 (FERM BP- 5164)、バチルスステアロザ一モフイラス（Baci l lus s t ear o the rmoph i rus ) MI 101 (FERM BP - 5160) 、同 MI 102 (FERM BP- 5161)、バチルスブレビス（Baci l lus brevis) MI 103 (FERM BP - 5162)、同 MI 104 (FERM BP - 5163)、等を例示することができる力、これらに限定されない。

これらの微生物は、財団法人発酵研究所（ I F O ) (日本）、東京大学分子細胞生物学研究所細胞，機能高分子総合センタ一 I A Mカルチャーコレクション（日本）、およびァメリカン ' タイプカルチヤ一 ' コレクション（ A T C C )

(米国）より容易に入手可能である。

また、本発明に用いられる E D D S ァ一ゼ活性を有する微生物としては、フマル酸とエチレンジアミンから [S， S]- E D D S を生成せしめる微生物であれば特に制限は無く、例えば、ブレブンディモナス ( Brevundimonas 属、ノラコッカス ( Par acoccus) 、スフインゴモナス ( Sph i ngomonas) 属、アンドホラックス Ac i dovorax)^、シユードモナス (^Pseudomonas 属、バークホルデリァ (Burkho!deria)属に属する微生物を挙げることができる。また、これらの微生物に由来する E D D S ァーゼ遺伝子を組換えた遺伝子操作微生物も用いることができる。

これらの具体的な菌株としてはプレブンディモナス s p . TN -3 (FERM BP- 5886)、同 TN- 30 (FERM BP - 5417) 、ノラコッカス sp. KK-6 (FERM BP - 5415)、スフインゴモナス sp. TN- 28 (FERM BP-5419) 、ァシドボラックス sp. TN-51 (FERM B P - 5416) 、シュ一ドモナス sp. TN-131 (FERM BP- 5418) 、ノ —クノナヽノレデリア sp. KK-5 (FERM BP— 5412)、同 KK-9 (FERM BP- 5413)等を、また、遺伝子操作微生物として、上記プレブンディモナス sp. TN-3 由来の E D D S ァーゼをコードする遺伝子 D N Aを大腸菌 JM109(Esherichia col i ATCC 53323)、 Rhodococcus rhodochrous ATCC 17895等に導入した形質転換体、 E. col i JM109/pEDS020(FERM BP - 6161) 、 Rhodococcus r hodochrous ATCC 17895/pSEOOl (FERM BP - 6548) 等を例示することができる力これらに限定されない。

上記の E D D S ァーゼ活性を有する微生物は上記受託番号にて通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1 番 3号）に寄託されている。その菌学的性質は日本国特許出願公開第 9- 140390号、欧州特許出願公開第 0805211 号等に記載されているし、また形質転換体の製法は日本国特許出願公開第 10— 210984号および日本国特許出願第 9-3U046号明細書に記載されており、これらの文献に開示の方法によって目的の形質転換体を得ることができる。

本発明に使用される微生物の培養は、資化し得る炭素源 (グリセロール、グルコース、サッカロース等）、窒素源

(無機のアンモニゥム塩ゃ硝酸塩、カザミノ酸、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカ一等）、各微生物の生育に必須の無機塩（塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸マンガン、塩化鉄、硫酸亜鉛等）、ビタミン、核酸などを含有した通常の培地を用いて行うことができる。また、培地中にマレイン酸および [S， S]- E D D S を添加することは、それぞれ、より高いマレイン酸イソメラ一ゼ活性および E D D S ァーゼ活性が得られることがあり好ましい。

培養は、培養液の p H 4〜 1 0、好ましくは 6 〜 9、培養温度 2 0 〜 9 0 °C、好ましくは 2 5 〜 8 0 °Cの範囲で、 1 〜 1 4 日間好気的に行うことができる。

[S, S]- E D D S生産反応は、マレイン酸、無水マレイン酸またはマレイン酸塩を 0 . 0 1 Mから飽和濃度、好ましくは 0 . 0 2 〜 1 . 2 M、およびエチレンジァミンを 0 . 0 1 〜 2 M、好ましくは 0. 0 1 5〜 l Mを含有する p H 4〜 l 1 、好ましくは p H 6 〜 l 0 の水性媒体に対し、フマラ一ゼ等の副反応に関与する酵素活性を除去したマレイン酸ィソメラ一ゼ活性を有する微生物（菌体）またはその処理物（すなわち、菌体破砕物、粗酵素液、精製酵素液、固定化菌体、固定化酵素、等）、および E D D Sァーゼ活性を有する微生物（菌体）またはその処理物（すなわち、菌体破砕物、粗酵素液、精製酵素液、固定化菌体、固定化酵素、等）を各々 0 . 0 1 〜 5重量％、好ましくは 0 . 1 〜 2重量％添加し、さらに前記の金属化合物を、生成する [S， S]-E D D Sの理論量に対して、通常、金属として 0 . 0 1 〜 2倍モルを添加して、反応温度 5 〜 6 0 °C、好ましくは 1 0 〜 5 5 °Cで 0 . 5 〜 4 8 時間反応させることができる。

反応終了液から [S， S]-E D D Sの金属錯体を回収する場合には、所定の金属のイオンの存在下で反応を行った後、 p H 調整、濃縮、その他の操作により目的化合物を直接得ることができる。

一方、反応終了液から [S， S]- E D D S を採取するには、通常、鉱酸による酸祈が行われる。しかしながら、鉄等の重金属のイオンの存在下に反応を行った場合のように、酸析の p Hで安定な錯体を形成している系においては、酸析以前に該金属のイオンを除去する操作が必要である。したがって、 [S, S] - E D D S を必要とする場合には、酸祈に際し上記のような除去操作を省略できるマグネシウム、カルシウム等のアル力リ土類金属のイオンの存在下に反応を行うことが効率的である。

次に、本発明を以下の実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例

実施例 1

( 1) マレイン酸イソメラ一ゼ活性を有する微生物菌体の調製アルカリゲネスフエカリス IF0 12669、同 IF0 13111、同 IAM 1473 、アルカリゲネスュ一トロファス IAM 12305 およびシュ一ドモナスフルォレツセンス ATCC 23728 株をマレイン酸を含む培地（ 1 L当たり；マレイン酸ナトリウム 5 g、肉エキス 1 0 g、酵母エキス 5 g、金属塩混合物溶液 5 m l 、 5 0 mM燐酸緩衝液、 p H 7 . 0 ) 1 L を用い 3 0 °C、 2 〜 3 日間振とう培養した。菌体を遠心分離（10, 000 rpm、 20分）し、 1 Lの 5 0 mM燐酸緩衝液（ p H 8 . 5 ) で洗浄した後、同緩衝液で 1 0 0 m 1 の菌体懸濁液を調製した。金属塩混合物溶液は以下の組成を有する。

金属塩混合物溶液（ 1 0 0 m 1 当たり）：

塩化マグネシウム · 6 H ₂ 0 8 g

塩化カルシウム 0 . 8 g

硫酸マンガン · 6 H ₂ 0 0 . 6 g

塩化第二鉄 ' 6 H ₂ 0 0 . 1 2 g

硫酸亜鉛 0 . 0 6 g (2) E D D S ァーゼ活性を有する微生物菌体の調製ブレブンディモナス sp. TN-3 を [S， S]- E D D S を含む培地（ 1 L当たり； [S， S]- E D D S 2 g、グルコース 2 g、酵母エキス 1 g、ポリペプトン 0 . 5 g、硫酸マグネシウム -

7 H ₂ 0 l g、硫酸ナトリウム 0 . 2 8 g、金属塩混合物溶液 0 . 5 m 1 、燐酸緩衝液 2 5 m M、 p H 7 . 5 ) 2 L を用いて 3 0 °C、 3 日間振とう培養した。菌体を遠心分離（ 10， 000 rpm、 20分）し、 5 0 0 m l の l O O mMほう酸緩衝液 ( P H 9 . 2 ) に懸濁した後、 4 5 °Cの水浴中に 4時間放置して熱処理を行った。遠心分離（ 10, 000 rpm、 20分）により集菌し、 5 0 0 m l の 5 0 mM燐酸緩衝液（ p H 8 . 5 ) で

1 回洗浄した後、同緩衝液で 1 0 0 m 1 の菌体懸濁液を調製した。

(3) [S,S]-E D P S生産反応

3 0 0 mMマレイン酸、 l O O m Mエチレンジァミン、 1 5 0 m M水酸化マグネシウムを含む 1 0 0 m 1 の基質溶液 ( P H 8. 5 ) に対し、マレイン酸イソメラ一ゼ活性を有する微生物の菌体懸濁液 5 m 1 、および E D D S リア一ゼ活性を有する微生物の菌体懸濁液 5 m l を添加し、 3 5 °C、 1 4 〜 2 0 日間、 [S， S]- E D D Sの生成が停止するまで反応を継続した。比較として、水酸化マグネシウムを含まない基質溶液による同様の実験も行った。

なお、水酸化マグネシウム存在下での [S， S]- E D D S生産反応は反応液の P H低下を伴うので、水酸化ナトリウムを使用し p Hコントローラ一により p H 8 . 3 〜 8 . 8 に調節した。 ( 4) rS, S]-E D D Sの定量および光学純度の分析反応終了液中の不溶物を 15, 000 rpm、 5 °C、 5 分間の遠心分離で除去した後、液体クロマトグラフィー〔カラム； WAK0S IL 5C8 (和光純薬）、溶出液； 10 mM 水酸化テトラ — n — ブチルアンモニゥム、 0.4 mM CuSO ₄ 、 50 mM 燐酸、 pH 2) で定量し、光学純度の分析も液体クロマトグラフィー〔カラム； MCI GEL CRS 10W (三菱化学）、溶出液； 10 mM 硫酸銅〕により行った。また、金属錯塩の定量は不溶物を除去した反応終了液に、終濃度 1 . 5 %の水酸化ナトリウムを添加し室温に 3 0 分放置後、遠心分離で不溶性水酸化物を除去し、燐酸で p H 7 . 5 としてから定量、および光学純度の分析を行った。

( 5) 結果

表 1

† A ：マレイン酸イソメラ一ゼ活性を有する微生物

I B ： E D D S ァーゼ活性を有する微生物 11 [S， S]- E D D S 生成量はアルカリ添加および燐酸添加による反応液希釈分の補正値を示した。実施例 2

( 1) 微生物菌体の調製

実施例 1 と同様にマレイン酸イソメラ一ゼ含有微生物である Alcal igenes faecal i s IFO 12669 および E D D S ァーゼ活性を有する微生物であるバークホルデリア sp. KK-5 、パラコッカス sp. KK-6 、ブレブンディモナス sp. TN-3 、スフインゴモナス sp. TN-28、ァシドボラックス sp. TN-51 およびシュ一ドモナス sp. TN-131 株を各々培養し菌体懸濁液を調製した。

( 2) [S, S]-E D D S生産反応

実施例 1 と同様の基質溶液（ 3 0 O m Mマレイン酸、 1 0 0 m Mエチレンジァミン、 1 5 0 m M水酸化マグネシウム、 p H 8 . 5 ) 1 0 0 m l に対し 5 m l のマレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物（IF0 12669)および 5 m 1 の E D D S ァ一ゼ含有微生物（KK - 5、 KK - 6、 TN - 3、 TN-28 、 TN-51 または TN- 131 ) の懸濁液を添加し、 3 5 °C、 1 4 〜 2 0 曰間、 [S， S]- E D D S の生成が停止するまで反応を継続した。比較として、水酸化マグネシウムを含まない基質溶液による同様の実験も行った。

( 3) [S, S1-E D D Sの定量および光学純度の分析

反応終了液中の不溶物を 15, 000 rpm、 5 °C、 5 分間の遠心分離で除去した後、液体クロマトグラフィー〔カラム； WAK0S IL 5C8 (和光純薬）、溶出液； 10 mM 水酸化テトラ — n — ブチルアンモニゥム、 0.4 mM CuSO ₄ 、 50 mM 燐酸、 pH 2) で定量し、光学純度の分析も液体クロマトグラフィー〔カラム； MCI GEL CRS 10W (三菱化学）、溶出液； 10 mM 硫酸銅〕により行った。また、金属錯塩の定量は不溶物を除去した反応終了液に、終濃度 1 . 5 %の水酸化ナトリウムを添加し室温に 3 0 分放置後、遠心分離で不溶性水酸化物を除去し、燐酸で P H 7 . 5 としてから定量、および光学純度の分析を行った。

( 4) 結果

表 2

† A ：マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物

X B ： E D D S ァーゼ活性を有する微生物 H [S, S]-E D D S 生成量はアル力リ添加および燐酸添加による反応液希釈分の補正値を示した。実施例 3

( 1) 微生物菌体の調製

実施例 1 と同様にマレイン酸イソメラーゼ含有微生物である Alcal igenes faecal is IFO 12669 および E D D S ァ一ゼ含有微生物であるプレブンディモナス sp. TN-3 株を各々培養し菌体懸濁液を調製した。

( 2) [S, S]- E D D S生産反応

3 0 O m Mマレイン酸、 1 0 O m Mエチレンジァミンおよび 1 5 0 m M水酸化物（水酸化マグネシウム、水酸化カルシゥム、水酸化チタニウム、水酸化マンガン、水酸化亜鉛、水酸化アルミニウムまたは水酸化第二鉄）を含む 1 0 O m l の基質溶液（ P H 8 . 5、本 p Hでは水酸化マグネシウム、水酸化カルシウムは可溶性、他の水酸化物は不溶性である）に対し、 IF0 12669 の菌体懸濁液 5 m 1 および TN- 3 の菌体懸濁液 5 m l を各々添加し、 3 5 °C、 1 4〜 2 0 曰間、 [S, S]-E D D Sの生成が停止するまで反応を継続した。比較として、水酸化物を含まない基質.溶液による同様の実験も行った。

(3) [S, S]-E D D Sの定量および光学純度の分析

反応終了液中の不溶物を 15, 000 rpm、 5 °C、 5 分間の遠心分離で除去した後、液体クロマトグラフィー〔カラム； WAK0S IL 5C8 (和光純薬）、溶出液； 10 mM 水酸化テトラー n — ブチルアンモニゥム、 0.4 mM CuSO ₄ 、 50 mM 燐酸、 pH 2 で定量し、光学純度の分析も液体クロマトグラフィー〔カラム； MCI GEL CRS 10W (三菱化学）、溶出液； 10 mM 硫酸銅〕により行った。また、金属錯塩の定量は不溶物を除去した反応終了液に、終濃度 1 . 5 %の水酸化ナトリウムを添加し室温に 3 0 分放置後、遠心分離で不溶性水酸化物を除去し燐酸で p H 7 . 5 としてから定量、および光学純度の分析を ί了った。

( 4) 么士

表 3

H CS, S]-E D D S生成量はアルカリ添加

および燐酸添加による反応液希釈分の

補正値を示した。本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をその全体を参考として本明細書にとリ入れるものとする。また、本発明の思想および範囲を逸脱することなく本発明は種々の変更および変形を含み得ることが当業者には理解されるべきである。

Claims

請求の範囲

1 . アルカリ土類金属、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、アルミ二ゥム、チタニウムおよびマンガンからなる群から選ばれる少なくとも一種の金属イオンの存在下、マレイン酸、無水マレィン酸またはマレイン酸塩とエチレンジアミンとを含有する基質溶液に、マレイン酸イソメラ一ゼ活性を有する微生物またはその処理物とエチレンジァミン- N， N' -ジコハク酸ェチレンジァミンリア一ゼ活性を有する微生物またはその処理物とを作用せしめ、 [S, S]-ェチレンジアミン -N， N' -ジコハク酸を得ることを特徴とする [S， S]-ェチレンジアミン - N， N' -ジコハク酸の製造法。

2 . 前記マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物またはその処理物が、アルカリゲネス ( Aical igenes)属、シュ一ドモナス ( Pseudomonas) ¾ _s キサントモナス ( Xan thomonas) Jh およびバチルス（ ac / i / us)属に属する微生物、その微生物に由来するマレイン酸イソメラーゼ遺伝子を組換えた遺伝子操作微生物、ならびにそれらの微生物の処理物からなる群から選択される、請求項 1 に記載の方法。

3 . 前記エチレンジアミン- N， N' -ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼ活性を有する！ ¾生物またはその処理物が、プレブン丁ィモナス Brevund i monas) 、ノラコッカス ( Paracoccu s) 属、スフインゴモナス（ Sphingo議 as 属、ァシドボラックス c7'i oi oraA 厲、シュードモナス Pseudomonas) ¾およびバークホルデリァ Burkho!deria) に属する微生物、その微生物に由来する E D D S ァ一ゼ遺伝子を組換えた遺伝子操作微生物、ならびにそれらの微生物の処理物からなる群から選択される、請求項 1 に記載の方法。

4 . 前記処理物が、菌体破砕物、粗酵素液、精製酵素液、固定化菌体および固定化酵素からなる群から選択される請求項

1 に記載の方法。

5 . 前記マレイン酸、無水マレイン酸またはマレイン酸塩の濃度が、 0.01Mから飽和濃度までの範囲である、請求項 1 〜のいずれかに記載の方法。

6 . 前記エチレンジァミンの濃度が、 0.01 から 2 Mまでの範囲である、請求項 1 〜 4 のいずれかに記載の方法。

7 . 前記金属イオンが、金属化合物を生成する [S， S]-ェチレンジアミン -N, N' -ジコハク酸の理論量に対して 0.01〜 2倍モル添加される、請求項 1 〜 4 のいずれかに記載の方法。

8 . 反応が p H 4 〜 11 の水性媒体中で行なわれる、請求項 1 〜 4 のいずれかに記載の方法。

9 . 反応温度が 5 〜 60°Cである、請求項 1 〜 4 のいずれかに記載の方法。