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WO1999022001A1 - Procede de regulation de la differenciation/ proliferation des cellules souches hematopoietiques - Google Patents

Procede de regulation de la differenciation/ proliferation des cellules souches hematopoietiques Download PDF

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WO1999022001A1
WO1999022001A1 PCT/JP1998/004884 JP9804884W WO9922001A1 WO 1999022001 A1 WO1999022001 A1 WO 1999022001A1 JP 9804884 W JP9804884 W JP 9804884W WO 9922001 A1 WO9922001 A1 WO 9922001A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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gene
cells
differentiation
hematopoietic stem
stem cells
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP1998/004884
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English (en)
French (fr)
Inventor
Masatake Osawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kirin Brewery Co Ltd
Original Assignee
Kirin Brewery Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Kirin Brewery Co Ltd filed Critical Kirin Brewery Co Ltd
Priority to AU96498/98A priority Critical patent/AU9649898A/en
Publication of WO1999022001A1 publication Critical patent/WO1999022001A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a method for regulating the differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells and / or hematopoietic progenitor cells, and to vectors and cells used in the method.
  • Hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells can be used for blood cell transplantation instead of bone marrow transplantation and cord blood transplantation, or for gene therapy.
  • BACKGROUND ART Mature blood cells flowing in the living body have a short life span (about 120 days for red blood cells and about 7 days for platelets in humans), and mature blood cells are differentiated and proliferated daily from hematopoietic progenitor cells. Maintains homeostasis of peripheral blood mature blood cells.
  • the number of mature blood cells supplied to peripheral blood is 200 billion cells / day for red blood cells and 700 billion cells / day for neutrophils in humans.
  • the progenitor cells of each of these differentiation lineages proliferate while differentiating from undifferentiated hematopoietic stem cells to form a system in which peripheral blood cells do not constantly die (Tsuda Suda, Blood Stem Cells Destiny, Sheepsha, 199 2).
  • hematopoietic stem cells pluripotency
  • hematopoietic stem cells pluripotency
  • a transplantation experiment system using irradiated mice, and an in vitro (in vitro) colony formation method (Bradley, TR, J. Exp. Med., 44: 287-299). , 1966), and knowledge on the differentiation of hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells has been accumulated.
  • the transplantation experiment system using irradiated mice is the most direct way to analyze the properties of hematopoietic stem cells.
  • Transplantation of bone marrow cells isolated from another mouse (Donna 1) into a mouse (recipient) that has damaged the hematopoietic system by irradiation may reconstitute the donor-derived hematopoietic system in the recipient mouse. it can.
  • Various differentiation antigens expressed on hematopoietic cells (Spangrude, GJ, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Bone marrow cells were fractionated using substances (Rhl23, Hoechst 33342) (Wolf, NS, Exp. Hematol., 21:61 4-622, 1993) and the transplantation experiments described above were performed. Attempts have been made to identify hematopoietic stem cells.
  • hematopoietic stem cells can differentiate into lymphoid cells and myeloid cells by transplanting a single cell, and hematopoietic stem cells can be transplanted for a long time It has also been demonstrated that systems can be constructed (Osawa, M., Science, 273: 242-245, 1996). Hematopoietic stem cells can survive over a long period of time in the recipient individual and supply differentiated blood cells. On the other hand, in transplantation experiments using hematopoietic progenitor cells, the cells transplanted from the recipient individual disappear in a short period of time and cannot undergo hematopoiesis for a long period of time (Osawa, M., Science, 278: 242- 245, 1996).
  • hematopoietic progenitor cells can only differentiate into mature blood cells of a limited lineage even in the presence of many cytokins, hematopoietic stem cells that can build a long-term hematopoietic system in transplanted mice It is possible to differentiate into many cell lineages. From these results, the differentiation from hematopoietic stem cells to mature blood cells flowing in peripheral blood is interpreted as follows.
  • Hematopoietic stem cells can be differentiated into various lineages It is capable of self-replication while maintaining this pluripotency property (pluripotency). Hematopoietic stem cells self-renew and partially differentiate, are affected by various site forces, gradually narrow the lineage of cells that can be differentiated, differentiate and proliferate into hematopoietic progenitor cells that can only differentiate into a limited number of cell types, It eventually becomes a mature blood cell (Hematopoietic Stem Cell, Levitt, D., Marcel Dekker, Inc., 1995). Bone marrow transplantation and umbilical cord blood transplantation are therapies to transplant hematopoietic cells to patients. It depends on what you can do.
  • hematopoietic stem cells are considered to be an optimal target because they can survive for a long time in the transplant recipient as described above.
  • gene therapy that complements the genetic deficiency of hematopoietic stem cells is considered to be a fundamental treatment for the disease.
  • hematopoietic stem cells have been clinically recognized, and it has been an issue how to grow hematopoietic stem cells without differentiation.
  • Attempts have been made to expand hematopoietic stem cells using cytokin-blood cell stimulating factors, but have not succeeded in efficiently expanding hematopoietic stem cells (Trevisan, M., Blood, 88: 4149, 1996).
  • hematopoietic stem cells are differentiated and proliferation of hematopoietic progenitor cells is dominant. Therefore, if the differentiation of hematopoietic stem cells could be suppressed, hematopoietic stem cells could be expanded in the presence of cytokines and hematopoietic cell stimulating factors.
  • Notch / Delta has been shown by genetic analysis to be involved in the formation of various organs such as nerves and wings during embryo development in Drosophila (Artavanis-T sakonas, S., Science, 268: 225, 1995).
  • the ligand, Delta protein binds to the receptor, Notch protein, and transmits signals through Notch to suppress differentiation.
  • homologous genes to the Notch / Delta gene family are known (Blaumueller, CM, Perspectives on Developmental Neurobiology, 4: 325, 1997).
  • the regulation of differentiation by the Notch signaling system in neural cell differentiation is considered as follows (Artavanis-Tsakonas, S., Science, 268: 225, 1995; Simpson, P., Perspectives on Developmental Neurobiology, 4). : 297, 1997).
  • the dorsal-ventral axis and anterior-posterior axis are determined during embryonic development, neuroblasts appear in the ectoderm and proneural clusters that can differentiate into epidermal cells appear.
  • the Notch / Delta signaling system plays an important role in selecting cells capable of differentiating into neurons from this cell cluster.
  • the cells present in this cell cluster express Notch equally, but some cells begin to express Notch ligand, which suppresses neighboring cells from differentiating into neural cells ( Lateral suppression). Cells that express Notch ligand differentiate into neuroblasts, and undergo terminal differentiation under various stimuli to achieve terminal differentiation into functional neurons. On the other hand, cells in which the Notch / Delta signaling system has been activated by binding to Notch ligand cannot differentiate into neurons, but differentiate into epidermal cells.
  • Notch is activated by binding to Delta, Interacts with the nuclear localization protein RBP-J / c (CBF-1, also called KBF-2) through the region (Honjo, T., Genes to Cells, 1: 1, 1996).
  • RBP-J / translocates into the nucleus following Notch activation and induces expression of the HLH (helix-loop-helix) transcription factor HES-1 (Ryuichiro Kageyama, Biochemistry, 67: 1093, 1995) I do.
  • An HLH-type transcription factor is a transcription factor having a three-domain structure, that is, 1) a helix-one-loop part that forms a three-dimensional structure of one helix, which binds to itself or interacts with other HLH-type transcription factors. It comprises a binding portion for forming a homodimer or a heterodimer by binding, 2) a portion capable of binding to basic DNA, and 3) a portion having a transcription promoting activity.
  • a characteristic of HLH-type transcription factors is that their DNA binding ability is regulated by the partner that forms the heterodimer.
  • Mash-1 and MATH are known as HLH-type transcription factors that positively regulate the differentiation of nerve cells. Both Mash-1 and MATH are HLH-type transcription factors that form heterodimers with the ubiquitous HLH-type transcription factor E12 / E47, and recognize specific nucleotide sequences to promote neuronal cell differentiation. Activating genes (Johnson, JE, Proc. Natl. Acc. Sci. USA, 89: 3596, 1992).
  • HES-1 binds to Mash-1 and MATH in a competitive manner with E12 / E47 and suppresses its DM binding activity, thereby inhibiting the expression of genes that promote differentiation into nerve cells, and It is thought to suppress the differentiation of cells (Sasai, Y., Genes Dev., 6: 2620, 1992).
  • HES-1 plays an important role in regulating the differentiation of the Notch / Delta system by inhibiting the activity of transcription factors that positively regulate differentiation at the final stage. Similar regulatory mechanisms have been inferred for the HES-1 similar genes HES-3 and HES-5. (Ryuichiro Kageyama, Biochemistry, 67: 1093, 19995)
  • the differentiation of the skeletal muscle system is regulated by the Notch / Delta system, but even if the HES-1 gene is directly introduced into and expressed in skeletal myoblasts, differentiation into skeletal muscle cells is suppressed.
  • a different regulation mechanism from the signal transduction system from RBP-Jc to the HES family gene has been speculated (Shawber, C., Development, 122: 3765, 1996). In other words, differentiation control is not performed through HES-1 in all cell types.
  • Notch-1 gene also known as TAN-1
  • T cell leukemia Ellison, LW, Cell, 66: 649, 1991; Reynolds, TC, Cell, 50: 107, 1987.
  • transgenic mice transfected with an activated Notch gene are involved in the control of T cell proliferation because leukemia with immature T cell properties is produced (Pear, WS, J. Exp. Med., 183: 2283, 1996).
  • the Notch gene has been reported to be expressed in hematopoietic stem cells (Milner, LA, Blood, 83: 2057, 1994), but during the process of differentiating hematopoietic stem cells into various differentiated cells.
  • the Notch / Delta feature has not been reported.
  • Dll-1 Choitnis, A., Nature, 375: 761, 1995
  • Dll-3 Dunwoodie, SL, Development, 124: 3065, 1997)
  • Jagge d-1 Lidsell , CE, Cell, 80: 909, 1995
  • Jagged-2 Jagged-2
  • DLK also called SCP-1 or Pref-1
  • DLK When DLK is expressed in stromal cells that support hematopoietic cells and cocultured with hematopoietic stem cell fractions, activity to support the proliferation of hematopoietic progenitor cells has been confirmed. However, no activity has been observed when DLK, a membrane protein, is solubilized and DLK acts directly on hematopoietic stem cells. Therefore, it is not clear whether DLK exerts its activity of inhibiting differentiation by directly acting on hematopoietic progenitor cells. Furthermore, because DLK has low homology to Delta, it is unclear at this time whether DLK signals through Notch.
  • the present invention has been made in view of the above, and provides a method for suppressing the differentiation of hematopoietic stem cells and / or hematopoietic progenitor cells, and a method for allowing the cells to survive and preferably further proliferate in a state where the differentiation is suppressed. And to provide means used for these methods.
  • Notch / Delta-based molecules could be used to control the differentiation of hematopoietic stem cells.
  • Notch-l, Notch-2, Notch-3, Notch-4 and Notch-4 were actually used in hematopoietic cells including hematopoietic stem cells.
  • HES-1, HES-3 and HES-5 were examined in detail.
  • Notch and HES genes were widely expressed in hematopoietic cells at various stages of differentiation. From this expression status, it was speculated that the signaling system of the Notch / Delta system plays an important role also in cell differentiation from hematopoietic stem cells.
  • the present invention provides a method for enhancing the expression of a differentiation-suppressing gene in mammalian hematopoietic stem cells and causing a blood cell stimulating factor to act thereon, whereby the hematopoietic stem cells and / or hematopoietic progenitor cells differentiated from the hematopoietic stem cells are activated. It is a method of regulating the differentiation and proliferation of the plant.
  • the present invention also provides a gene transfer vector in which a differentiation-suppressing gene has been incorporated into a viral vector.
  • the present invention further provides mammalian hematopoietic stem cells in which the expression of the differentiation inhibitory gene is enhanced.
  • the present invention provides a hematopoietic stem cell characterized by culturing a mammalian hematopoietic stem cell in which the expression of a differentiation inhibitory gene is enhanced or a hematopoietic progenitor cell differentiated from the hematopoietic stem cell while allowing a blood cell stimulating factor to act. And / or provide a method for producing hematopoietic progenitor cells.
  • a hematopoietic stem cell is a cell having a pluripotency capable of differentiating into all differentiation lineages of blood cells, and a cell capable of self-renewal while maintaining the pluripotency.
  • CFU-Emix colony containing cell types of multiple differentiating lineages including erythrocytes in an in vitro Atsushi system. These cells are thought to contain cells that self-renew in vivo and survive for long periods of time.
  • Hematopoietic progenitor cells are blood cells that have been slightly differentiated from hematopoietic stem cells, and have the ability to differentiate into single or two types of lineages.
  • the differentiation inhibitory gene refers to a gene that encodes a transcription factor having an activity of suppressing the differentiation of a cell when expressed in a cell capable of differentiating.
  • Blood cell stimulating factors are biological factors such as so-called site force in, inuichi leukin, growth stimulating factor, interferon, chemokine, etc.
  • a stimulator that causes a change in activity is so-called site force in, inuichi leukin, growth stimulating factor, interferon, chemokine, etc.
  • the source of hematopoietic stem cells used in the present invention may be, for example, umbilical cord blood, fetal liver, bone marrow, fetal bone marrow, peripheral blood, peripheral blood, cytokine and / or peripheral mobilized stem cells by administration of an anticancer agent in mammals such as humans and mice.
  • Examples include a cell group derived from blood and peripheral blood, and any tissue may be used as long as it contains hematopoietic stem cells.
  • Hematopoietic stem cells can be obtained from these tissues according to Seaberg, L.A., “Weir's Handbook of Experimental Imlunology, 5th edition, Blackwell Science Inc. 1997. That is, an anti-CD34 antibody It can be immunologically stained using an anti-CD33 antibody, an anti-CD38 antibody, or the like, and can be separated by the staining property of these antibodies using a cell sorter.
  • the differentiation inhibitory gene used in the present invention examples include the HES-1, HES-3, and HES-5 genes. As shown in the Examples below, by enhancing the expression of the HES-1 gene in hematopoietic stem cells, the differentiation and proliferation of the hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells differentiated from the hematopoietic stem cells can be regulated. .
  • the effect of HES-1 gene expression on hematopoietic stem cells is also similar to that of HES-1 similar proteins, HES-3 (Ryuichiro Kageyama, Biochemistry, 67: 1093, 1995), HES-5 (Ryuichiro Kageyama, Chemistry, 6 7: 1093, 1995).
  • HES-1 gene human-derived one is also called HRY
  • HES-3 gene and HES-5 gene are all known genes, and are described in Sasai et al. (Genes Dev., 6: 2620, 1992; mouse-derived HES- 1 and HES-3), disclosed by Akazawa et al. (J. Biol. Chem., 267: 21879, 1992; HES-5 derived from mouse) and Feder et al. (Genomics, 20: 56, 1994; HES-1 derived from human) It can be obtained by amplifying a DNA fragment containing each gene by PCR (polymerase chain, reaction) using oligo nucleotides prepared based on the given sequence.
  • PCR polymerase chain, reaction
  • to enhance the expression of a differentiation inhibitory gene in a hematopoietic stem cell means to operate the hematopoietic stem cell so that the expression level of the differentiation inhibitory gene in the hematopoietic stem cell is higher than the normal expression level for at least a certain period of time. That means.
  • the expression level of the differentiation-suppressing gene does not need to be always high, but may be high as long as the present invention can increase the level of differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells.
  • a differentiation inhibitory gene is incorporated in a form that can be expressed in a vector for mammalian cells, and the obtained recombinant vector is introduced into hematopoietic stem cells.
  • the expression suppressor gene in an expressible form can be obtained by ligating an expression control factor such as a promoter upstream of the coding sequence of the differentiation suppressor gene.
  • the expression of the differentiation inhibitory gene is regulatable.
  • the differentiation inhibitory gene is expressed only during culture, and it is not preferable to express the cells even after transplanting the cells into a living body. Therefore, it is preferable that the expression can be regulated as needed.
  • expression control include an expression control system using tetracycline (Gossen, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547, 1992) and an expression control system using the insect hormone ecdysone (No. Natl. Acad. Sci.
  • IPTG isoprovir 1 /?-D-thiogalactobilanoside
  • the above vectors include retrovirus vector, adenovirus vector (Neering, SJ, Blood, 88: 1147, 1996), herpesvirus vector (Dilloo, D., Blood, 89: 119, 1997), and HIV vector.
  • adenovirus vector Neering, SJ, Blood, 88: 1147, 1996)
  • herpesvirus vector Dilloo, D., Blood, 89: 119, 1997)
  • HIV vector HIV vector.
  • the gene transfer vector of the present invention can be obtained.
  • the transferred gene exists outside the chromosome and disappears after transient gene expression.
  • the use of such a transient expression vector is advantageous in that the differentiation inhibitory gene can be expressed only during culture.
  • the expression level of the differentiation inhibitory gene on the chromosomal DNA of hematopoietic stem cells may be increased.
  • the expression control sequence such as bromo allyl specific to the differentiation control gene on the chromosomal DNA of hematopoietic stem cells
  • the strong expression control sequence By inserting the gene upstream, the expression level of the gene can be increased.
  • Replacement and insertion of the expression control sequence can be performed by homologous recombination or the like.
  • hematopoietic stem cells and / or hematopoietic progenitor cells differentiated from the hematopoietic stem cells are increased.
  • hematopoietic stem cells and / or hematopoietic progenitor cells can be expanded by culturing hematopoietic stem cells with enhanced expression of differentiation-suppressing genes or hematopoietic progenitor cells differentiated from the hematopoietic stem cells while allowing them to act on blood cell stimulating factors. Can be done.
  • Blood cell stimulating factors are added to the culture medium to promote the growth of hematopoietic stem cells, and include so-called cytokines, interleukins, growth stimulating factors, interferon, chemokines, development-related gene products, etc. (See The Cytokine Factsbook, Callard, RE, Academic Press, 1994 for site power-in). Specific examples of blood cell stimulating factors include SCF (stem cell factor), IL-3 (interleukin-13), IL-6 (interleukin-16), and GM-CSF (requested).
  • SCF stem cell factor
  • IL-3 interleukin-13
  • IL-6 interleukin-16
  • GM-CSF GM-CSF
  • Granulocyte macrophage colony stimulating factor Granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • TP0 thrombopoetin
  • EP0 erythropoietin
  • Wnt Thimoth, AW, Blood, 89: 3624-3635, 1997)
  • culture conditions favorable for the growth of hematopoietic stem cells can be improved to be more effective.
  • culture may be performed by adding a culture supernatant of stromal cells capable of maintaining hematopoietic stem cells.
  • the culture medium used for the culture is not particularly limited as long as the growth and survival of hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells are not impaired.
  • MEM-G medium GEBCO BRL
  • SF-02 medium Sanko Pure Chemical
  • Opti-MEM medium GIBCO BRL
  • IMDM medium GIBCO BRL
  • PRMI 1640 medium PRMI 1640 medium
  • Materials added to the culture medium include fetal calf serum, human serum, poma serum, insulin, transferrin, lactoferrin, ethanolamine, sodium selenite, sodium monothioglycerol, Melka but-ethanol, ⁇ shea serum albumin, pyruvic Sanna door Li Umm, polyethylene grayed recall, various vitamins, various amino acids, C0 2 is, usually, is a 4 ⁇ , arbitrariness preferred 5%.
  • the hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells produced as described above can be used as a transplant for blood cell transplantation instead of conventional bone marrow transplantation and umbilical cord blood transplantation.
  • Construction Blood stem cell transplantation can improve conventional blood cell transplantation therapy because the transplant is semi-permanently engrafted.
  • Hematopoietic stem cell transplantation can be used for various diseases in addition to these treatments when performing systemic X-ray therapy or advanced chemotherapy for leukemia.
  • a treatment that causes bone marrow suppression as a side effect such as chemotherapy or radiation therapy
  • bone marrow is collected before the operation, and hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells are expanded in vitro.
  • hematopoietic disorders due to side effects can be recovered early, and stronger chemotherapy can be performed, and the therapeutic effect of chemotherapy can be improved.
  • hematopoietic insufficiency caused by bone marrow hypoplasia exhibiting anemia such as aplastic anemia can be improved.
  • Other diseases for which hematopoietic stem cell transplantation by the method of the present invention is effective include chronic granulomatosis, double immunodeficiency syndrome, agammaglobulinemia, Wiskott-Aldrich syndrome, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), and the like.
  • Immunodeficiency syndrome group thalassemia, hemolytic anemia due to enzyme deficiency, congenital anemia such as sickle cell disease, lysosomal storage disease such as Gaucher disease and mucopolysaccharidosis, adrenal white matter degeneration, various cancers or tumors, etc.
  • congenital anemia such as sickle cell disease
  • lysosomal storage disease such as Gaucher disease and mucopolysaccharidosis
  • adrenal white matter degeneration various cancers or tumors, etc.
  • Transplantation of hematopoietic stem cells may be performed in the same manner as conventional bone marrow transplantation or umbilical cord blood transplantation, except for the cells used.
  • hematopoietic stem cells that may be used for hematopoietic stem cell transplantation as described above is not limited to bone marrow, and stem cells can be obtained by administering fetal liver, fetal bone marrow, peripheral blood, cytokines, and / or anticancer drugs as described above. Mobilized peripheral blood, umbilical cord blood, and the like can be used.
  • the transplant may be a composition containing a buffer solution or the like in addition to the hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells produced by the method of the present invention.
  • hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells produced by the present invention can be used for ex vivo gene therapy.
  • a foreign gene (therapeutic gene) is introduced into hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells, and the resulting transfected cells are used. Done.
  • the foreign gene to be introduced is appropriately selected depending on the disease.
  • Diseases targeted by gene therapy targeting blood cells include chronic granulomatosis, double immunodeficiency syndrome, agammaglobulinemia, Wiskott-Aldrich syndrome, and acquired immune deficiency syndrome (AIDS).
  • Examples include immunodeficiency syndrome, thalassemia, hemolytic anemia due to enzyme deficiency, congenital anemia such as sickle cell disease, lysosomal storage diseases such as Gaucher disease and mucopolysaccharidosis, adrenal leukemia, various cancers and tumors, etc. .
  • retrovirus vector such as Moroni murine leukemia virus, adenovirus vector, adeno-associated virus (AAV) Vectors, simple herpes virus vectors, vector vectors for animal cells used in gene therapy for viruses derived from HIV vectors, etc.
  • AAV adeno-associated virus
  • retrovirus vectors see Verma, I.M. , Nature, 389: 239, 1997), calcium phosphate coprecipitation method, DEAE-dextran method, electoral poration method, liposome method, lipofection method, microinjection method, and the like.
  • a retrovirus vector, an adeno-associated virus vector, or an HIV vector is preferable, since the gene can be expected to be permanently expressed by being integrated into the chromosomal DNA of the target cell.
  • an adeno-associated virus (AAV) vector can be constructed as follows. First, 293 cells were transfected with a vector plasmid containing a therapeutic gene inserted between the ITRs (inverted termina 1 repeats) at both ends of the wild-type adeno-associated virus DNA, and helper plasmid for complementing the viral proteins. I do. Subsequently, when infected with an adenovirus of a helper virus, virus particles containing the AAV vector are produced. Alternatively, instead of adenovirus, a plasmid expressing an adenovirus gene responsible for helper function may be transfected.
  • the obtained virus particles are used to infect hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells. It is preferable to insert an appropriate promoter and enhancer upstream of the target gene in the vector DNA, and to regulate the expression of the gene by these. Furthermore, when a marker gene such as a drug resistance gene is used in addition to the therapeutic gene, it becomes easy to select cells into which the therapeutic gene has been introduced. Therapeutic genes are sense sense It may be a gene or an antisense gene.
  • the composition for gene therapy may be a composition containing a buffer, a novel active substance, and the like, in addition to the hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells produced by the method of the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram showing a construction procedure of pFLAG-CMV2-HES-1.1.
  • FIG. 2 is a diagram showing a procedure for constructing pFLAG-CMV2-HES-1.2.
  • FIG. 3 is a diagram showing a procedure for constructing pEGFP-CI-HES-1.
  • FIG. 4 is a diagram showing a procedure for constructing pMSCV-EH. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • all antibodies used for cell separation were purchased from Pharmingen.
  • All the restriction enzymes used for gene recombination were purchased from Behringer Mannheim. Separation of each blood cell was generally carried out by Sea, L.A., "Weir, s Handbook of Experimental Immunology, 5th edition", Blackwell Science Inc. 1997.
  • Bone marrow cells, spleen cells, and thymocytes are separated from 6- to 8-week-old C57B1 / 6 mice (purchased from Nippon Charls River Co., Ltd.), and mononuclear cells and granulocytes are obtained using Celso overnight. , Mature T cells, immature T cells, mature B cells, hematopoietic progenitor cells, and hematopoietic stem cells.
  • Anti-CD32 antibody was added to bone marrow cells removed from mouse femur bone marrow and placed on ice. After standing for 10 minutes, FITC-labeled anti-Mac-1 antibody and PE-labeled anti-Gr-1 antibody were added, and reacted on ice for 30 minutes.
  • the cells were washed twice with a staining buffer (PBS (phosphate buffered saline), 5% FCS (CS fetal serum), 0.05% NaN 3 ), suspended in the staining buffer, and then suspended in a cell sorter (FACS Vantage, Mononuclear cells (Mac-1 positive 'Gr-1 negative cells) and granulocytes (Mac-1 positive and Gr-1 positive cells) were separated using Becton Dickinson.
  • a staining buffer PBS (phosphate buffered saline), 5% FCS (CS fetal serum), 0.05% NaN 3
  • FACS Vantage Mononuclear cells (Mac-1 positive 'Gr-1 negative cells) and granulocytes (Mac-1 positive and Gr-1 positive cells) were separated using Becton Dickinson.
  • the thymocyte suspension is overlaid on a high-density cell separation solution (Nycomed, Lymphoprep), centrifuged at 1500 rpm for 30 minutes at 25 ° C, and cells collected at the interface between the suspension and Lymphoprep are removed. Collected. After the cells were washed twice with a staining buffer, an anti-CD32 antibody, a FITC-labeled anti-CD4 antibody, and a PE-labeled anti-CD8 antibody were added, and reacted on ice for 30 minutes. After the reaction, the cells were washed twice with a staining buffer and suspended in a staining buffer. Then, immature T cells (CD4 negative ⁇ CD8 negative cells and CD4 positive ⁇ CD8 positive cells) and mature T cells (CD4 positive ⁇ CD8-negative cells and CD4-negative and CD8-positive cells).
  • a staining buffer an anti-CD32 antibody, a FITC-labeled anti-CD4 antibody, and
  • the suspension of spleen cells was overlaid on Lymphoprep (Nycomed) and centrifuged at 1500 rpm at 25 ° C for 30 minutes to collect the cells collected at the interface. Wash the cells twice with staining buffer, add anti-CD32 antibody, and leave on ice for 10 minutes, then add FITC-labeled anti-B220 antibody and PE-labeled anti-mouse IgM antibody, and on ice for 30 minutes Reacted. After the reaction, the cells were washed twice with the staining buffer, suspended in the staining buffer, and then mature B cells (B220-positive-IgM-positive cells) were separated using a cell sorter.
  • the bone marrow cell suspension was overlaid on Lymphoprep (Nycomed) and centrifuged at 1500 rpm at 25 C for 30 minutes to collect cells that had collected at the interface. After washing the cells twice with the staining buffer, the cells were washed twice with PBS and suspended in the staining buffer.
  • An antibody against the biotinylated differentiation antigen marker ie, an anti-CD4 antibody, an anti-CD8 antibody, an anti-B220 antibody, an anti-Gr-1 antibody, and an anti-Tell19 antibody, were added to the cell suspension, and the mixture was left on ice for 30 minutes.
  • avidin-coated magnetic beads (Avidinma Gnet beads (Perseptive)) and left on ice for 30 minutes.
  • avidin magnet beads were collected using a magnet, and the cells presenting the differentiation antigen were removed to obtain differentiated antigen-negative cells (Lin-).
  • a FITC-labeled anti-CD34 antibody, a PE-labeled anti-Sea-1 antibody, a Texas red-labeled avidin, and an APC-labeled anti-C-Kit antibody were added to the differentiation antigen-negative cell solution, and left on ice for 30 minutes.
  • hematopoietic progenitor cells (Sea-1 negative, C-kit positive cells and CD34 positive, Sca-1 positive, C-kit positive cells) and hematopoietic stem cells (Selso overnight) CD34 negative to weak positive ⁇ Sea-1 positive ⁇ c-kit positive cells).
  • RNA was obtained according to the instructions for use of the reagent.
  • 5 units of DNase RNase free (GI BCO-BRL) were added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes to digest and degrade the mixed genomic DNA.
  • RNA was obtained. From this MA, cDNA was synthesized using oligo dT as a primer. That, RNA corresponding to 10 5 cells to prepare a reaction liquid so as to correspond to 20 micro liters reaction.
  • the composition of the reaction solution used was that recommended in the instruction manual for reverse transcriptase (Superscript IK GIBCO-BRL). The reaction was carried out at 42 ° C. for 60 minutes, and then the reverse transcriptase activity was inactivated by keeping the temperature at 72 ° C. for 10 minutes.
  • sequences and annealing temperatures of the various primers used in the PCR reaction are as follows.
  • Table 2 shows the results of evaluating the expression level based on the intensity of the amplified band.
  • the symbols in the table are as follows.
  • Notch- and Notch-2 were expressed in all of the examined hematopoietic cells.
  • Notch-3 is confirmed to be cell type-specific expression in immature T cells, mature T cells, and B cells.
  • Notch-4 was not expressed in hematopoietic cells.
  • HES-1 HES-3 which is present downstream of the Notch / Delta signaling system, was expressed in all the cells examined.
  • HES-5 was expressed in a cell type-specific manner in cells other than hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells.
  • HES-1 Monitor expression and localization of HES-1 in cells transfected with retrovirus
  • a vector was constructed so that HES-1 and a fluorescent protein, EGFP (Enhanced green fluorescent fluorescence protein, Clontech) were expressed as a fusion protein (see FIGS. 1 to 4).
  • EGFP Enhanced green fluorescent fluorescence protein, Clontech
  • PSV2CMVHES-1 (Kyoto University, distributed by Dr. Ryuichiro Kageyama, see Sasai, Y., Genes Dev., 6: 2620, 1992) is digested with EcoRI and EcoRI digested with pFLAG-CMV2 vector (Kodak)
  • a subcloned PFLAG-CMV2-HES-1.1 (Fig. 1) was prepared in the same direction as the FLAG transfer direction.
  • the translation initiation codon of HES-1 was changed, and the translation initiation codon of HES-1 was modified so that EGFP and HES-1 were expressed as a fusion protein, and changed to the Bglll site.
  • a synthetic oligonucleotide (SEQ ID NO: 15) having a sequence that changes the translation start point ATG to Bglll, and an antisense oligonucleotide at a site located downstream from the Pstl site in the HES-1 gene. (SEQ ID NO: 16) was used as a primer, and PCR was performed using PSV2CMVHES-1 as type II. A fragment containing the HES-1 gene obtained by digesting this PCR product with Bglll and Pstl was cloned into Bglll and Pst-1 sites of pFLAG-CMV2-HES-1.1 described above. This brassmid was named PFLAG-CMV2-HES-1.2 (Fig. 2).
  • a fragment containing HES-1 obtained by digesting PFLAG-CMV2-HES-1.2 with Bgll I and EcoRI was cloned into the Bglll / EcoRI site of pEGFP-CI (Clontech), and pEGFP-CI-HES- 1 ( Figure 3).
  • a gene was constructed in which EGFP and HES-1 were on one transcription unit.
  • a fragment containing HES-1 obtained by digesting pEGFP-CI-HES-1 with Eco47III and Sail was extracted from Hpal and Xhol using a PMSCV2.1 vector (obtained from Dr. R. Hawley, University of Toronto, Hawley , RG, Gene Ther., 1: 136, 199).
  • This vector was named pMSCV-EH (Fig. 4). Thereafter, this plasmid was used for producing a retrovirus for HES-1 infection.
  • a retrovirus vector into which only the EGFP gene was transferred was constructed.
  • a fragment containing EGFP obtained by digesting pEGFP-CI with Eco47III and Sail was inserted into a PMSCV2.1 vector digested with Hpal and Xhol. This vector was pMSCV-E.
  • mice Pregnant C57B1 / 6 mice were purchased from Nippon Charls River Inc. On the 14th day of pregnancy, the mouse was laparotomized and the fetus was aseptically removed. After carefully separating the fetal liver from contaminating other tissues, the cells were dispersed with a syringe fitted with a 21-gauge injection needle and layered on Lymphoprep (Nycomed). This was centrifuged at 1500 rpm at 25 ° C. for 30 minutes to collect cells collected at the interface. After washing the cells twice with PBS, the cells were suspended in a staining buffer (PBS, 5% FCS ⁇ 0.05% NaN 3 ).
  • a staining buffer PBS, 5% FCS ⁇ 0.05% NaN 3
  • the cell suspension was incubated with the differentiation antigen, which was biotinylated, that is, anti-CD8 antibody, anti-B220 antibody, anti-GII-l antibody, and anti-Terll9 antibody. And left on ice for 30 minutes. Then, after washing twice with a staining buffer, avidin magnet beads were added, and the mixture was left on ice for 30 minutes. After washing twice with the staining buffer again, remove the cells presenting the differentiation antigen using a magnet. Then, differentiated antigen-negative cells (Lin-) were obtained.
  • the differentiation antigen which was biotinylated, that is, anti-CD8 antibody, anti-B220 antibody, anti-GII-l antibody, and anti-Terll9 antibody.
  • FITC-labeled anti-CD34 antibody PE-labeled anti-Sca-1 antibody, Texas Red-labeled avidin, and APC-labeled anti-c-kit antibody were added to the differentiation antigen-negative cell solution, and left on ice for 30 minutes. After washing twice with the staining buffer, Lin-Sea-1 + c-kit + cells were selected on a cell saw.
  • the cells were collected and examined for colony forming ability (the colony forming ability was determined by adding 0.9% methylcellulose, 30% FCS, 0.1% serum albumin, and 10 ng / ml SCF
  • the culture was performed in the presence of I-3, IL-6, EP0, TP0, and 0.5 mg / ml G418.
  • the morphology and number of emerging colonies were detected.
  • the various hematopoietic factors used in the above are all recombinant and pure.
  • Table 3 shows the results under the above conditions.
  • the numbers in the table are the number of colonies per 2,000 infected hematopoietic stem cells.
  • Table 3 Morphology of infected lettuce wiwi colonies (/ 2,000 hematopoietic stem cells)
  • the number of colonies shown in the table is a colony resistant to G418, and indicates only the EGFP gene alone or only the cell into which the EGFP-HES-1 fusion gene has been introduced. Furthermore, the expression of the target gene in these colonies was also confirmed by observing the expression of EGFP under a fluorescence microscope. In cells transfected with the EGFP gene alone, the entire cytoplasm fluoresced, and no localization in the nucleus was confirmed. On the other hand, in the strain into which the EGFP-HES-1 fusion gene was introduced, it was confirmed by fluorescence microscopy that the nucleus emitted specific fluorescence, and this HES-1 was normally expressed and functioned in the nucleus. Was speculated to be.
  • hematopoietic stem cells differentiate and only hematopoietic progenitor cells GM-CFC, G-CFC, and M-CFC appear.
  • HES-1 hematopoietic progenitor cells
  • undifferent hematopoietic cells were maintained, and the differentiation of hematopoietic stem cells was successfully regulated by HES-1 gene transfer.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, hematopoietic stem cells and / or hematopoietic progenitor cells can survive and proliferate in a state where differentiation is suppressed.

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Description

明现曞 造血幹现胞の分化 ·増殖調節方法 技術分野 本発明は、 造血幹现胞及び/たたは造血前駆现胞の分化および増殖を調節する 方法、 及びその方法に甚いるベクタヌ及び现胞に関する。 造血幹现胞及び造血前 駆现胞は、 骚髄移怍や臍垯血移怍に代わる血液现胞移怍、 あるいは遺䌝子治療に 甚いるこずができる。 背景技術 生䜓内を流れる成熟血液现胞は、 短期間の寿呜 ヒトでは赀血球で玄 1 2 0日、 血小板で玄 7日 しかなく、 成熟血液现胞は造血前駆现胞から毎日分化増殖する こずによっお、 末梢血の成熟血液现胞の恒垞性を保っおいる。 末梢血に䟛絊され る成熟血液现胞の数は、 ヒ卜の堎合赀血球で 2 0 0 0億個/日、 奜䞭球で 7 0 0 億個/日にもなる。 これらの各分化系列の前駆现胞は、 さらに未分化な造血幹现 胞から分化しながら増殖するこずで恒垞的に末梢血液现胞が枯枎しないようなシ ステムができおいる 須田幎生、 血液幹现胞の運呜、 矊土瀟、 1 9 9 2 ) 。
このような血液现胞の分化系に぀いおは、 マりスを甚いた実隓系においおその 性質が明らかにされおきた。
末梢血を流れる皮々の成熟血液现胞が、 骚髄に存圚する造血幹现胞に由来する こずが明らかにされたのは、 Ti l lず McCul lochの研究によるTi l l , J . E. Rad. Res . , 14 : 213-222, 1961 )。 攟射線を照射しお骚髄の造血系を砎壊したマりスに他 のマりス由来の骚髄现胞を移怍したずころ、 脟臓に血液现胞からなるコロニヌの 圢成CFU-S ; colony- forming- unit spleen)が確認された。 このコロニヌの数は移 怍する骚髄现胞の数に比䟋するこず、 さらに䞀個の现胞に由来するコロニヌの䞭 に倚くの血球系の现胞の存圚が確認されるこずから、 倚くの血液现胞皮に分化で きる倚分化胜を持぀造血幹现胞 倚胜性幹现胞 が骚髄䞭に存圚するこずが明ら かにされたのである。 その埌、 造血现胞の性質を解析する手段ずしお攟射線照射マりスを甚いた移怍 実隓系、 さらには、 in vitro (むンビトロ のコロニヌ圢成法Bradley, T.R., J. Exp. Med., 44: 287-299, 1966)が開発され、 造血幹现胞および、 造血前駆现 胞の分化に関する知芋が蓄積されおきた。
攟射線照射マりスを甚いた移怍実隓系は、 最も盎接的に造血幹现胞の性質を解 析する手法である。 攟射線照射し造血系に障害を䞎えたマりス レシピ゚ント に、 他のマりス ドナ䞀 から分離した骚髄现胞を移怍するず、 レシピ゚ントマ りス䞭にドナヌ由来の造血系を再構築するこずができる。 造血现胞に発珟される 各皮分化抗原Spangrude, G.J., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 87:7433-7437, 1 990; Visser, J.M.W. , 「Flow cytometry in hematology」 Academic Press, p 9-29 1992)を利甚しお、 あるいは、 造血现胞の倧きさJones, R.J., Nature, 3 47: 188-189, 1990)を利甚しお、 あるいは、 现胞の性質、 状態によっお染色性の 異なる蛍光物質等Rhl23 Hoechst 33342) (Wolf, N.S., Exp. Hematol., 21:61 4-622, 1993)を甚いお、 骚髄现胞を分画し䞊蚘の移怍実隓を行うこずで、 骚髄现 胞䞭の造血幹现胞を同定する詊みがなされおきた。 これたでの知芋から、 造血幹 现胞は䞀個の现胞を移怍しただけでも、 リンパ球系の现胞にも骚髄球系の现胞に も分化するこずができ、 か぀、 長期にわたり移怍先個䜓の䞭で造血系を構築する こずができるこずも明らかにされおいる Osawa, M., Science, 273: 242-245, 1996)。 造血幹现胞は、 移怍先の個䜓で長期間にわたり生着し、 分化血球を䟛絊す るこずができるのである。 䞀方、 造血前駆现胞を甚いた移怍実隓では、 短期間に 移怍先個䜓から移怍した现胞矀が消倱しおゆき長期にわたり造血をになうこずが できない (Osawa, M. Science, 278: 242-245, 1996) 。
近幎、 皮々のサむ トカむンが取埗され、 in vitroで圢成されるコロニヌ圢態か ら、 血液现胞の性質を解析できるようになった Ogawa, M. Blood, 81:2844-28 53, 1993)。 造血前駆现胞は、 倚くのサむ ト力むンが存圚しおも、 限られた分化系 列の成熟血液现胞にしか分化するこずはできないが、 移怍マりスで長期の造血系 を構築できる造血幹现胞は、 倚くの现胞分化系列に分化するこずが可胜である。 これらの結果から、 造血幹现胞から末梢血を流れる成熟血液现胞たでの分化は、 以䞋のように解釈されおいる。 造血幹现胞は、 各皮分化系列に分化可胜な倚分化 胜を有しおおり、 か぀、 この倚分化胜の性質 分化倚胜性 を保持したたた自己 耇補するこずが可胜である。 造血幹现胞は、 自己耇補するずずもに䞀郚は分化し、 各皮サむ ト力むンの䜜甚を受け、 次第に分化できる现胞系列が狭たり、 限られた 现胞皮ぞしか分化できない造血前駆现胞ぞず分化増殖し、 最終的に成熟血液现胞 になる (Hematopoietic Stem Cel ls, Levitt, D . , Marcel Dekker, Inc. , 1995 ) 。 骚髄移怍療法、 臍垯血移怍療法は患者に造血现胞を移怍する治療法であるが、 移怍埌長期に治療効果が持続するかは、 前述のように移怍した造血幹现胞が移怍 先の患者に生着できるかに関わる。
先倩性の遺䌝子疟患患者に察し、 欠倱あるいは、 倉異遺䌝子を盞補する遺䌝子 治療の詊みがなされおいる 倧橋十也、 実隓医孊、 1 2 : 3 3 3、 1 9 9 4 ) 。 このような遺䌝子治療においおは、 造血幹现胞は、 前述のように移怍先個䜓で長 期に生存しうるこずから、 最適な暙的ずしお考えられおいる。 すなわち、 造血幹 现胞の遺䌝的な欠損を補完する遺䌝子治療は、 疟患の根本的な治療になるず考え られおいる。
このように、 造血幹现胞の有甚性が臚床的に認識されおおり、 造血幹现胞をい かに未分化のたたで増殖させるかが課題ずなっおいる。 造血幹现胞をサむ トカむ ンゃ血液现胞刺激因子を甚いお増殖させる詊みがなされおきたが、 効率的に造血 幹现胞を増殖させるこずに成功するに至っおいない Trevisan, M. , Blood, 88 : 4149 , 1996 ) 。 これらの培逊系では造血幹现胞が分化し、 造血前駆现胞の増殖が 優䜍になっおいる。 そこで、 造血幹现胞の分化を抑制するこずができれば、 サむ トカむン、 造血现胞刺激因子の存圚䞋で造血幹现胞を増殖させるこずも可胜にな るず思われる。
造血系の现胞の分化を人為的に調節しょうずするずき、 造血系以倖の现胞の分 化の制埡様匏を調べるこずも重芁ず考えられる  Morrison, S . J . , Cel l , 88 :28 7, 1997)。 近幎、 ショりゞペりバ゚の発生分化の研究を通しお、 分化の調節を行 う分子矀が存圚するこずが明らかにされおきた。 Notch/Del ta (ノッチ/デル倕 を介したシグナル䌝達系はこれら分化調節をになうシグナル䌝達系の 1぀である。
Notch/Deltaは、 ショりゞペりバ゚の胚発生時の神経、 翅などの皮々の噚官の圢 成に関わっおいるこずが遺䌝孊的な解析により明らかにされおきたArtavanis-T sakonas, S. Science, 268 : 225 , 1995 )。 リガンドである Delta (デルタ 蛋癜質 は受容䜓である Notch (ノッチ 蛋癜質ず結合し、 Notchを通しお分化を抑制する ようなシグナルを䌝達する。 たた、 哺乳類においおも、 Notch/Delta遺䌝子フアミ リヌの盞同遺䌝子が知られおいる  Blaumuel ler, C . M. , Perspectives on Dev elopmental Neurobiology, 4 : 325 , 1997) 。 さらには、 Notch/Deltaのシグナル䌝 達を现胞内で担う分子に぀いおも、 ショりゞペりバ゚の盞同遺䌝子が哺乳類にお いおも芋出されおおり Artavanis- Tsakonas, S. Science, 268 : 225 , 1995) 、 Notch/Delta系の分化調節機構は、 基本的には昆虫から哺乳類たでほが䌌通った経 路で行われるものず考えられる。
神経现胞分化における Notchシグナル䌝達系による分化制埡は、 以䞋のように考 えられおいる (Artavanis - Tsakonas, S. Sci ence, 268 : 225 , 1995 ; Simpson, P . , Perspectives on Developmental Neurobiology, 4 : 297, 1997) 。 胚発生時に 背腹軞、 前埌軞が決定されおくるず、 倖胚葉に神経芜现胞、 及び衚皮现胞に分化 が可胜な现胞集塊 proneural cluster) が出珟する。 この现胞集塊の䞭から神経 现胞に分化可胜な现胞が遞別される際に、 Notch/Delta系のシグナル䌝達系が重芁 な圹割を果たす。 この现胞集塊に存圚する现胞は等しく Notchを発珟しおいるが、 䞀郚の现胞が Notchリガンドを発珟するようになり、 その现胞は隣接する现胞が神 経现胞に分化するこずを抑制する 偎方抑制 。 Notchリガンドを発珟する现胞は、 神経芜现胞ぞず分化し、 さらに皮々の刺激を受けお分化を続けるこずで機胜的な 神経现胞ぞ終末分化を遂げる。 䞀方、 Notchリガンドず結合するこずで Notch/Del taシグナル䌝達系が掻性化された现胞は、 神経现胞に分化するこずができず、 è¡š 皮现胞ぞず分化しおいく。
Notch/Deltaシグナル䌝達系が機胜できない倉異を持぀個䜓では、 神経现胞ぞの 分化が抑制されないため、 神経现胞が過圢成されるこずになる。 逆に、 现胞倖領 域がほずんど欠倱しおいる、 あるいは现胞領域内のみが倕ンパクずしお発珟する ようになった掻性化型 Notch/Deltaを発珟する個䜓では神経现胞ぞの分化が抑制さ れおいる Artavanis-Tsakonas, S. Sci ence , 268 : 225 , 1995) 。
さらに、 现胞内における Notch/Delta系のシグナル䌝達に぀いおは以䞋のように 考えられおいる。 Notchは、 Deltaず結合するこずで掻性化され、 Notchの现胞内領 域を介しお、 栞移行タンパクである RBP- J/c(CBF- 1、 KBF-2ずもいう ず盞互䜜甚 する Honjo, T. Genes to Cells, 1:1 1996)。 RBP- J/ は、 Notch掻性化にした がい栞内ぞ移行し、 HLH (ヘリックス—ルヌプ䞀ヘリックス 転写因子である HES- 1 (圱山 韍䞀郎、 生化孊、 67 : 1093、 1995) の発珟を誘導する。 HLH 型の転写因 子は、 3぀のドメむン構造からなる転写因子で、 ぀たり、 1 ) ヘリ ックス䞀ルヌプ 䞀ヘリックスの立䜓構造を圢成する郚分で自身ずの結合あるいは他の HLH型の転写 因子ずの結合により、 ホモダむマ䞀あるいはヘテロダむマ䞀を圢成するための結 合郚分、 2 ) 塩基性の DNAずの結合胜を有する郚分、 3 ) 転写促進掻性を有する郚 分、 よりなる。 HLH型転写因子の特城は、 DNA結合胜がヘテロダむマ䞀を圢成する 盞手によっお調節されるこずにある。
䞀方、 神経现胞の分化を正に調節する HLH型転写因子ずしお、 Mash- 1、 MATHが知 られおいる。 これら Mash-1、 MATHはずもに HLH型の転写因子で、 普遍的に存圚する HLH型転写因子 E 12/E47ずぞテロダむマヌを圢成し、 特異な塩基配列を認識しお神 経现胞の分化を促進する遺䌝子矀を掻性化する Johnson, J.E., Proc. Natl. Ac ad. Sci. U.S.A., 89:3596, 1992)。 HES- 1は、 E12/E47ず拮抗的に Mash-1、 MATHず 結合しその DM結合掻性を抑制するこずで、 神経现胞ぞの分化を促進する遺䌝子の 発珟を阻害するこずによっお、 神経现胞ぞの分化を抑制するものず考えられおい る Sasai, Y. Genes Dev., 6:2620, 1992)。
䞊蚘のように、 HES-1は、 Notch/Delta系の分化調節においお最終段階で分化を 正の方向に調節する転写因子の掻性を阻害するずいう重芁な圹割を果たしおいる。 HES- 1類䌌遺䌝子である HES-3、 HES-5にも同様な調節機構が類掚されおいる。 圱 å±± 韍䞀郎、 生化孊、 67 1093、 1 99 5 )
䞀方、 骚栌筋系の分化では Notch/Delta系による分化の調節がなされおいるが、 HES-1遺䌝子を骚栌筋芜现胞に盎接導入し発珟させおも、 骚栌筋现胞ぞの分化は抑 制されず、 RBP-J cから HESフアミ リ䞀遺䌝子ぞのシグナル䌝達系ずは異なった分 化調節機構が掚枬されおいる (Shawber, C. Development, 122 3765, 1996)。 ぀たり、 党おの现胞皮においお、 HES-1を介しお分化制埡が行われおいるのではな い。
血液现胞における Notch遺䌝子の機胜の解析は、 Notch- 1遺䌝子の転座により现 胞倖領域のほずんどが欠倱した Notch-1遺䌝子 TAN-1ずもいう が T现胞の癜血 病化を匕き起こすこずが明らかずなったこずに始たる Ellison, L.W., Cell, 6 6:649, 1991; Reynolds, T. C, Cell, 50:107, 1987) 。 そしお、 掻性化型の No tchを導入されたトランスゞ゚ニックマりスでは、 未熟な T现胞の性質を持぀癜血 病が生じるこずから、 T现胞の増殖制埡に関䞎するこずが報告されおいる Pear, W. S., J. Exp. Med. ,183:2283, 1996)。 その埌 T现胞の分化の過皋で、 実際に Notchが CD4+CD8—、 CD4— CD8+の衚珟圢を持぀成熟 T现胞の分化決定に関わるこずも 明らかにされた Robey, E. Cell, 87:483, 1996)。 さらに、 前骚髄球现胞株の 分化を Notchシグナル䌝達系が阻害するこずが報告されおいる Milner, L. Pro c. Natl. Acad. Sci. USA, 93:13014, 1997) 。
䞀方、 造血幹现胞では、 Notch遺䌝子が造血幹现胞で発珟されおいるこずは報告 されおいるがMilner, L. A. Blood, 83:2057, 1994)、 造血幹现胞から各皮の分 化现胞に分化する過皋での Notch/Deltaの機胜に぀いおは今たで報告はない。
Deltaの哺乳類の盞同遺䌝子には Dll-1 (Chitnis, A., Nature, 375: 761, 199 5) 、 Dll-3 (Dunwoodie, S.L., Development, 124: 3065, 1997) ならびに Jagge d-1 (Lindsell, C.E., Cell, 80: 909 1995) 、 Jagged-2 (Shauber, C. Dev. Biolo., 180: 370, 1996) が報告されおいるが、 その造血幹现胞に察する䜜甚の 報告はない。 䞀方、 Deltaに䜎いながら盞同性を有する分子ずしお、 Delta-like protein DLK (SCP - 1、 Pref - 1ずもいう) (Laborda, J., Jounal of Biological Chemistry, 268:3817, 1993)が造血系の现胞に䜜甚するずいう報告がある Moor e, K. A. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94:4011, 1997; W097/31647) 。 DLK を造血现胞を支持するス トロヌマ现胞に発珟させ、 造血幹现胞分画ず共培逊を行 なうず、 造血前駆现胞の増殖を支持する掻性が確認されおいる。 しかし、 膜タン パクである DLKを可溶化型にしお、 DLKを盎接造血幹现胞に䜜甚させおも掻性は認 められない。 したがっお、 DLKが造血前駆现胞に盎接䜜甚しお分化を抑制する掻性 を発揮しおいるのかは明らかでない。 さらに、 DLKは Deltaずの盞同性が䜎いこず から、 DLKが Notchを介しおシグナル䌝達を行なうのかに぀いおも、 今のずころ䞍 明である。 発明の開瀺 本発明は、 䞊蚘芳点からなされたものであり、 造血幹现胞及び/たたは造血前 駆现胞の分化を抑制する方法、 ならびに分化を抑制した状態で生存させ、 奜たし くはさらに増殖させる方法及びこれらの方法に甚いる手段を提䟛するこずを課題 ずする。
本発明者は、 造血幹现胞の分化制埡に Notch/Delta系の分子を利甚できないかず 考え、 たず、 実際に造血幹现胞を含む造血现胞で Notch-l、 Notch-2, Notch-3、 Notch- 4及び、 HES- 1、 HES-3、 HES- 5が発珟しおいるかを詳现に調べた。 その結果、 Notch, HES遺䌝子が、 皮々の分化段階における造血现胞で広汎に発珟しおいるこ ずを䞖界で初めお確認した。 そしお、 この発珟状況から Notch/Del ta系のシグナル 䌝達系が造血幹现胞からの现胞分化にも重芁な圹割を果たしおいるず掚枬した。 そこで、 HES-1遺䌝子を造血幹现胞に導入するこずで造血幹现胞を未分化な状態に 留めお眮くこずも可胜ず考え、 造血幹现胞の分化調節に HES- 1を利甚するこずを 怜蚎した。 その結果、 HES- 1を造血幹现胞に匷制発珟させるこずで造血幹现胞の 分化を抑制するこずに成功し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、 哺乳動物の造血幹现胞䞭で分化抑制遺䌝子の発珟を匷化す るず共に、 血液现胞刺激因子を䜜甚させるこずにより、 前蚘造血幹现胞及び/た たは前蚘造血幹现胞から分化した造血前駆现胞の分化および増殖を調節する方法 である。
本発明はたた、 分化抑制遺䌝子がりィルスベクタヌに組蟌たれた、 遺䌝子導入 ベクタヌを提䟛する。
本発明はさらに、 分化抑制遺䌝子の発珟が匷化された哺乳類の造血幹现胞を提 䟛する。
たた本発明は、 分化抑制遺䌝子の発珟が匷化された哺乳類の造血幹现胞又はこ の造血幹现胞から分化した造血前駆现胞を、 血液现胞刺激因子を䜜甚させ぀぀培 逊するこずを特城ずする造血幹现胞及び/たたは造血前駆现胞の生産方法を提䟛 する。
本明现曞においお甚いる甚語に぀き、 以䞋の通り定矩する。 造血幹现胞ずは、 血球の党おの分化系列に分化し埗る倚分化胜を有する现胞で あり、 か぀、 その倚分化胜を維持したたた自己耇補ができる现胞である。 造血幹 现胞の評䟡系では、 in vitroのアツセィ系で赀血球を含む耇数の分化系統の现胞 皮を含むコロニヌ CFU- Emix) を圢成し埗る现胞ずしお識別される。 これらの现 胞は生䜓内で自己耇補し、 長期にわたり生存する现胞を含むず考えられる。
造血前駆现胞ずは、 造血幹现胞よりやや分化した血液现胞であり、 単䞀あるい は、 2皮類の分化系列に分化する胜力を持぀。
分化抑制遺䌝子ずは、 分化胜を持぀现胞内においお発珟させた時に、 その现胞 の分化を抑制する掻性を持぀転写因子をコヌドする遺䌝子をいう。
血液现胞刺激因子ずは、 いわゆるサむ ト力むン、 むン倕䞀ロむキン、 増殖刺激 因子、 むンタヌフェロン、 ケモカむンなど造血现胞に察し増殖胜、 サむ ト力むン 産生胜、 分化胜、 遊走胜などの生物孊的掻性の倉化をもたらす刺激因子のこずを 指す。
以䞋、 本発明を詳现に説明する。
本発明で甚いる造血幹现胞の採取源ずしおは、 ヒト及びマりス等の哺乳動物の 臍垯血、 胎児肝臓、 骚髄、 胎児骚髄、 末梢血、 サむ トカむンおよび/たたは抗癌 剀の投䞎によっお幹现胞を動員した末梢血、 及び末梢血由来の现胞矀等が挙げら れ、 造血幹现胞を含む組織であればいずれであっおもよい。 これらの組織からの 造血幹现胞の取埗は、 Herzenberg, L . A. 「Wei r' s Handbook of Experimental Im lunology, 5th editionj, Blackwel l Science Inc . 1997に埓い実斜するこずがで きる。 すなわち、 抗 CD34抗䜓、 抗 CD33抗䜓、 抗 CD38抗䜓などを甚いお免疫孊的に 染色し、 セル゜䞀タヌを甚いおこれらの抗䜓の染色性により分離するこずができ る。
本発明に甚いる分化抑制遺䌝子ずしお、 具䜓的には HES- 1遺䌝子、 HES- 3遺䌝子、 HES-5遺䌝子等が挙げられる。 埌述の実斜䟋に瀺されるように、 造血幹现胞䞭で H ES-1遺䌝子の発珟を匷化するこずによっお、 この造血幹现胞及びこの造血幹现胞 から分化した造血前駆现胞の分化および増殖を調節するこずができる。 造血幹现 胞における HES-1遺䌝子発珟の効果は、 同様に HES- 1類䌌の蛋癜質である HES-3 (圱 å±± 韍䞀郎、 生化孊、 67 : 1093、 1995 ) 、 H E S - 5 (圱山 韍䞀郎、 生化孊、 6 7 : 1093、 1995) をコヌドする遺䌝子を発珟させるこずによ぀おも埗られるず掚枬 される。
HES-1遺䌝子 ヒト由来のものは HRYずもいう 、 HES-3遺䌝子及び HES-5遺䌝子 はいずれも公知の遺䌝子であり、 Sasaiら Genes Dev., 6: 2620, 1992 マりス 由来 HES-1ず HES-3) 、 Akazawaら (J. Biol. Chem., 267:21879, 1992 ;マりス由 来 HES- 5) および Federら Genomics, 20: 56, 1994 ヒト由来 HES- 1) に開瀺され おいる配列に基づいお䜜補したォリゎヌクレオチドを甚いた PCR (ポリメラ䞀れ · チェむン  リアクション により各遺䌝子を含む DNA断片を増幅するこずによっお、 取埗するこずができる。
本発明においお、 造血幹现胞䞭で分化抑制遺䌝子の発珟を匷化するずは、 造血 幹现胞䞭の分化抑制遺䌝子の発珟量を、 少なく ずも䞀定期間、 通垞の発珟量より も高くなるように造血幹现胞を操䜜するこずをいう。 尚、 分化抑制遺䌝子の発珟 量は垞に高い必芁はなく、 本発明により造血幹现胞および造血前駆现胞の分化お よび増殖を調節する際に高くするこずができればよい。
造血幹现胞䞭で分化抑制遺䌝子の発珟を匷化する方法ずしお具䜓的には、 哺乳 動物现胞甚のベクタ䞀に発珟可胜な圢態で分化抑制遺䌝子を組み蟌み、 埗られる 組換えべクタ䞀を造血幹现胞に導入する方法が挙げられる。 発珟可胜な圢態の分 化抑制遺䌝子は、 プロモヌタヌ等の発珟調節因子を分化抑制遺䌝子のコヌド配列 の䞊流に連結するこずにより埗られる。 分化抑制遺䌝子の発珟は、 調節可胜であ るこずが奜たしい。 すなわち、 本発明を利甚しお増殖された造血幹现胞又は造血 前駆现胞を移怍に甚いる堎合には、 分化抑制遺䌝子は培逊時にのみ発珟し、 生䜓 に现胞を移怍しおからも発珟するこずは奜たしくないため、 必芁に応じお発珟を 調節できるこずが奜たしい。 そのような発珟調節ずしおは、 テトラサむクリンに よる発珟調節系 (Gossen, M. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:5547, 1992) 、 昆虫ホルモン .ェクダむ゜ンを甚いる発珟調節系 No D. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:3346, 1996) 、 IPTG (む゜プロビル䞀/?— D—チォガラク トビ ラノシド を甚いる発珟調節系 Biard, D.S., Biochem. Biophys. Acta., 1130 :68, 1992) 等が挙げられる。
䞊蚘ベクタヌずしおは、 レトロりむルスベクタ䞀、 アデノりむルスベクタ䞀 (Neering, S.J., Blood, 88:1147, 1996) 、ヘルぺスりィルスベクタ䞀 Dilloo, D. Blood, 89:119, 1997) 、 HIVベクタヌが挙げられる。 このようなベクタヌに 分化抑制遺䌝子を組み蟌むこずにより、 本発明の遺䌝子導入ベクタヌが埗られる。 特にアデノりィルスベクタヌ、ヘルぺスりィルスベクタ䞀は、 移入された遺䌝子は 染色䜓倖に存圚し、 䞀過性に遺䌝子の発珟を行なった埌消倱しおゆく。 このよう な䞀過性発珟ベクタヌを甚いるこずは、 分化抑制遺䌝子を培逊時にのみ発珟させ るこずができる点で、 優䜍性がある。
たた、 造血幹现胞䞭で分化抑制遺䌝子の発珟を匷化するには、 造血幹现胞の染 色䜓 DNA䞊の分化抑制遺䌝子の発珟量を増加させおもよい。 䟋えば、 造血幹现胞の 染色䜓 DNA䞊の分化抑制遺䌝子固有のブロモ䞀倕䞀等の発珟調節配列を、 これより も匷力な発珟調節配列で眮換するこずによっお、 あるいは匷力な発珟調節配列を 分化抑制遺䌝子の䞊流に挿入するこずによっお、 該遺䌝子の発珟量を増加させる こずができる。 発珟調節配列の眮換、 挿入は、 盞同組換え等によっお行うこずが できる。
䞊蚘のようにしお造血幹现胞䞭で分化抑制遺䌝子の発珟を匷化するず共に、 血 液现胞刺激因子を䜜甚させるこずにより、 前蚘造血幹现胞及び/たたは前蚘造血 幹现胞から分化した造血前駆现胞の分化および増殖を調節するこずができる。 䟋 えば、 分化抑制遺䌝子の発珟が匷化された造血幹现胞又はこの造血幹现胞から分 化した造血前駆现胞を、 血液现胞刺激因子を䜜甚させ぀぀培逊するこずにより、 造血幹现胞及び/たたは造血前駆现胞を増殖させるこずができる。
血液现胞刺激因子は、 造血幹现胞の増殖を促進するために培地に添加されるも のであり、 いわゆるサむ トカむン、 むンタ䞀ロむキン、 増殖刺激因子、 むンタ䞀 プロン、 ケモカむン、 発生関連遺䌝子産物などが挙げられる サむ ト力むンに ぀いおは、 The Cytokine Factsbook, Callard, R.E. , Academic Press, 1994参 照 。 血液现胞刺激因子ずしお具䜓的には、 S CF (幹现胞成長因子stem cell factor)) 、 IL-3(むンタヌロむキン䞀 3 ) 、 IL-6 (むンタ䞀ロむキン䞀 6) 、 G M-CSF (頌粒球マクロファヌゞコロニヌ刺激因子 、 TP0 (スロンボポェチン 、 EP0 (゚リスロポ゚チン 、 Wnt(Thimoth A. W., Blood, 89:3624-3635, 1997)や Notch/Delta系の遺䌝子産物である Dll-1、 Dll-3、 Jagged-1, Jagged - 2、 および D LKなどが挙げられる。
䞊蚘血液现胞刺激因子を培地に添加する際に、 その濃床を調節するこずで、 造 血幹现胞の生育に良い培逊条件をさらに有効なものに改善できる。 さらに、 造血 幹现胞を維持できるストロヌマ现胞の培逊䞊枅を添加しお培逊しおもよい。
造血幹现胞たたは造血前駆现胞を培逊するにあたっおは、 いわゆる培逊甚のシ ダヌレ、 フラスコを甚いた培逊法が可胜であるが、 培地組成、 pHなどを機械的に 制埡し、 高密床での培逊が可胜なバむオリアクタ䞀によっお、 その培逊系を改善 するこずもできるSchwartz, Proc . Natl . Acad. Sci . U. S. A. , 88 : 6760, 1991 ; Kol le r M. R. , Bio/Technology, 11 : 358, 1993 ; Kol ler, M䞄 Blood, 82 : 378, 1993  Palsson, B . O . , Bio/Technology, 11 : 368, 1993 )。
培逊に甚いる培地ずしおは、 造血幹现胞たたは造血前駆现胞の増殖、 生存が害 されない限り特に制限されないが、 䟋えば MEM-ひ培地 GIBCO BRL) 、 SF-02培地 (䞉光玔薬 、 Opti- MEM培地 GIBCO BRL ) 、 IMDM培地 GIBCO BRL) 、 PRMI 1640 培地 GIBCO BRL) 、 が奜たしいものずしお挙げられる。 培逊枩床は、 通垞 25〜3 9°C、 奜たしくは 33〜39°Cである。 たた、 培地に添加する物質ずしおは、 ゥシ胎児 血枅、 ヒ ト血枅、 ゥマ血枅、 むンシュリン、 トランスフェリ ン、 ラク トプリン、 ゚タノヌルァミン、 亜セレン酞ナ ト リ りム、 モノチォグリセロヌル、 2—メルカ ブト゚タノヌル、 ゥシ血枅アルブミ ン、 ビルビン酞ナ ト リ りム、 ポリ゚チレング リコヌル、 各皮ビタミン、 各皮アミノ酞、 C02は、 通垞、 4〜^であり、 5%が奜た しい。
本発明においお、 「造血幹现胞及び前蚘造血幹现胞から分化した造血前駆现胞 の分化および増殖を調節する」 ずは、 具䜓的には䟋えば、 造血幹现胞及び/又は この造血幹现胞から分化した造血前駆现胞を、 少なく ずも䞀郚が倚分化胜を維持 したたた生存、 奜たしくは増殖させるこずをいう。 倚分化胜を維持したたた増殖 させるこずにより、 造血幹现胞又は造血前駆现胞を生産するこずができる。 さら に、 これら造血幹现胞又は造血前駆现胞の分化を誘導するこずにより、 各皮血液 现胞を生産するこずができる。
䞊蚘のようにしお産生される造血幹现胞たたは造血前駆现胞は、 埓来の骚髄移 怍ゃ臍垯血移怍に代わる血液现胞移怍甚の移怍片ずしお甚いるこずができる。 造 血幹现胞の移怍は、 移怍片が半氞久的に生着させられるこずから、 埓来の血液现 胞移怍治療を改善するこずができる。
造血幹现胞の移怍は、 癜血病に察する党身 X線療法や高床化孊療法を行う際に、 これらの治療ず組み合わせる他、 皮々の疟患に甚いるこずができる。 䟋えば、 固 圢癌患者の化孊療法、 攟射線療法等の骚髄抑制が副䜜甚ずしお生じる治療を実斜 する際に、 斜術前に骚髄を採取しおおき、 造血幹现胞、 造血前駆现胞を詊隓管内 で増幅し、 斜術埌に患者に戻すこずで、 副䜜甚による造血系の障害から早期に回 埩させるこずができ、 より匷力な化孊療法を行えるようになり、 化孊療法の治療 効果を改善する事ができる。 たた、 本発明により埗られる造血幹现胞ならびに造 血前駆现胞を各皮血液现胞に分化させ、 それらを患者の䜓内に移入するこずによ り、 各皮血液现胞の䜎圢成により䞍党な状況を呈しおいる患者の改善を図るこず ができる。 たた、 再生䞍良性貧血などの貧血を呈する骚髄䜎圢成に起因する造血 䞍党症を改善するこずができる。 その他、 本発明の方法による造血幹现胞の移怍 が有効な疟患ずしおは、 慢性肉芜腫症、 重耇免疫䞍党症候矀、 無ガンマグロプリ ン血症、 Wiskott-Aldri ch症候矀、 埌倩性免疫䞍党症候矀 AIDS) 等の免疫䞍党症 候矀、 サラセミア、 酵玠欠損による溶血性貧血、 鎌状赀血球症等の先倩性貧血、 Gaucher病、 ムコ倚糖症等のリ゜ゟヌム蓄積症、 副腎癜質倉性症、 各皮の癌たたは 腫瘍等が挙げられる。
造血幹现胞の移怍は、 甚いる现胞以倖は、 埓来行われおいる骚髄移怍や臍垯血 移怍ず同様に行えばよい。
䞊蚘のような造血幹现胞移怍に甚いられる可胜性のある造血幹现胞の由来は、 骚髄に限られず、 前述したような胎児肝臓、 胎児骚髄、 末梢血、 サむ トカむンぉ よび/たたは抗癌剀の投䞎によっお幹现胞を動員した末梢血、 及び臍垯血等を甚 いるこずができる。
移怍片は、 本発明の方法によっお産生した造血幹现胞及び造血前駆现胞の他に、 緩衝液等を含む組成物ずしおもよい。
たた、 本発明により産生される造血幹现胞たたは造血前駆现胞は、 ex vivoの遺 䌝子治療に甚いるこずができる。 この遺䌝子治療には、 造血幹现胞たたは造血前 駆现胞に倖来遺䌝子 治療甚遺䌝子 を導入し、 埗られる遺䌝子導入现胞を甚い お行われる。 導入される倖来遺䌝子は、 疟患によっお適宜遞択される。 血液现胞 を暙的现胞ずする遺䌝子治療の察象ずなる疟患ずしおは、 慢性肉芜腫症、 重耇免 疫䞍党症候矀、 無ガンマグロブリン血症、 Wiskott-Aldrich症候矀、 埌倩性免疫䞍 党症候矀 AIDS) 等の免疫䞍党症候矀、 サラセミア、 酵玠欠損による溶血性貧血、 鎌状赀血球症等の先倩性貧血、 Gaucher病、 ムコ倚糖症等のリ゜ゟヌム蓄積症、 副 腎癜質倉性症、 各皮の癌たたは腫瘍等が挙げられる。
造血幹现胞たたは造血前駆现胞に治療甚遺䌝子を導入するには、 通垞動物现胞 の遺䌝子導入に甚いられる方法、 䟋えば、 モロニ䞀マりス癜血病りィルス等のレ トロりィルスベクタ䞀、 アデノりむルスベクタヌ、 アデノ随䌎りィルス AAV) ベ クタ䞀、 単玔ぞルぺスりィルスベクタ䞀、 HIVベクタヌ等のりィルス由来の遺䌝子 治療に甚いられる動物现胞甚べクタ䞀 遺䌝子治療甚べクタ䞀に぀いおは、 Verm a, I . M. , Nature, 389 : 239, 1997 参照 を甚いる方法、 リン酞カルシりム共沈法、 DEAE-デキス トラン法、 ゚レク ト口ポレヌシペン法、 リポ゜䞀ム法、 リポプクシ ペン法、 マむクロむンゞェクション法等を甚いるこずができる。 これらの䞭では、 暙的现胞の染色䜓 DNAに組み蟌たれお恒久的に遺䌝子の発珟が期埅できるずいう点 から、 レトロりむルスベクタ䞀、 アデノ随䌎りィルスベクタ䞀たたは HIVベクタ䞀 が奜たしい。
䟋えば、 アデノ随䌎りィルス AAV) ベクタ䞀は、 次のようにしお䜜補するこず ができる。 たず、 野生型アデノ随䌎りィルス DNAの䞡端の ITR ( inverted termina 1 repeat) の間に治療甚遺䌝子を挿入したベクタヌブラスミ ドず、 りィルスタン パク質を補うためのぞルパヌプラスミ ドを 293现胞にトランスプクシペンする。 続いおヘルパヌりィルスのアデノりィルスを感染させるず、 AAVベクタ䞀を含むゥ ィルス粒子が産生される。 あるいは、 アデノりむルスの代わりに、 ヘルパヌ機胜 を担うアデノりむルス遺䌝子を発珟するプラスミ ドを トランスプクシペンしお もよい。 次に、 埗られるりィルス粒子を造血幹现胞たたは造血前駆现胞に感染さ せる。 ベクタヌ DNA䞭においお、 目的遺䌝子の䞊流には、 適圓なプロモ䞀倕䞀及び ェンハンサヌを挿入し、 これらによっお遺䌝子の発珟を調節するこずが奜たしい。 さらに、 治療甚遺䌝子に加えお薬剀耐性遺䌝子等のマヌカヌ遺䌝子を甚いるず、 治療甚遺䌝子が導入された现胞の遞択が容易ずなる。 治療甚遺䌝子は、 センス遺 䌝子であっおもアンチセンス遺䌝子であっおもよい。
遺䌝子治療甚組成物は、 本発明の方法によっお産生された造血幹现胞及び造血 前駆现胞の他に、 緩衝液、 新芏の掻性物質等を含む組成物ずしおもよい。 図面の簡単な説明 図 1は、 pFLAG- CMV2-HES- 1. 1の構築手順を瀺す図である。
図 2は、 pFLAG- CMV2-HES- 1.2の構築手順を瀺す図である。
図 3は、 pEGFP-CI - HES- 1の構築手順を瀺す図である。
図 4は、 pMSCV-EHの構築手順を瀺す図である。 発明を実斜するための最良の圢態 以䞋に、 実斜䟋により本発明をさらに具䜓的に説明する。 尚、 以䞋の実斜䟋に おいお、 现胞分離に甚いた抗䜓は党お Pharmingen瀟より賌入した。 遺䌝子組み換 えに甚いた制限酵玠は、 党おべ䞀リンガヌマンハむム瀟より賌入した。 たた、 各 血球现胞の分離は、 おおむね、 Herzenberg, L .A. 「Weirs Handbook of Experim ental Immunology, 5th edition」 Blackwel l Science Inc . 1997 【こ埓 、実斜し た。 実斜䟋 1 Notch/Del ta関連遺䌝子の造血现胞における発珟 造血现胞における Notch/Delta関連遺䌝子の果たす圹割を知る目的で、 RT-PCR法 により Notch、 HES遺䌝子の造血现胞における発珟を確認した。
< 1 >造血现胞の分離
6- 8週霢の C57B1/6マりス日本チダ䞀ルスリバ䞀株匏䌚瀟より賌入 より骚髄现 胞、 脟臓现胞、 胞腺现胞をそれそれ分離し、 セル゜䞀倕䞀を甚いお単栞球、 顆粒 球、 成熟 T现胞、 未熟 T现胞、 成熟 B现胞、 造血前駆现胞、 および造血幹现胞を 遞別した。
( 1 ) 単栞球、 頌粒球现胞の分離法
マりス倧腿骚骚髄より取り出した骚髄现胞に察し、 抗 CD32抗䜓を添加し氷䞭に お 10分攟眮した埌、 FITC暙識抗 Mac-1抗䜓、 PE暙識抗 Gr-1抗䜓を加え、 氷䞭にお 3 0分間反応させた。 反応埌、 染色バッファ䞀 PBS (リン酞緩衝生理食塩氎 、 5% FCS (ゥシ胎児血枅 、 0.05% NaN3 ) で 2回掗い、 染色バッファヌに懞濁した埌、 セル゜ヌタヌ FACS Vantage , Becton Di ckinson瀟 により単栞球 Mac-1陜性 ' Gr-1陰性现胞 、 および頌粒球 Mac-1陜性 · Gr-1陜性现胞 を分離した。
( 2 ) T现胞の分離法
胞腺现胞の懞濁液を、 现胞分離甚高密床溶液 Nycomed瀟、 Lymphoprep) に重局 し、 1500 rpm、 25°C、 30分間遠心し、 懞濁液ず Lymphoprepずの界面に集たった现 胞を回収した。 现胞を染色バッファ䞀で 2回掗浄した埌、 抗 CD32抗䜓、 FI TC暙識 抗 CD4抗䜓、 PE暙識抗 CD8抗䜓を加え、 氷䞭にお 30分間反応させた。 反応埌、 染色 バヅファヌで 2回掗い、 染色バッファヌに懞濁した埌、 セル゜ヌ倕䞀により未熟 T现胞 CD4陰性 · CD8陰性现胞および CD4陜性 · CD8陜性现胞 、 および成熟 T现 胞 CD4陜性 · CD8陰性现胞および CD4陰性 · CD8陜性现胞 を分離した。
( 3 ) B现胞の分離法
脟臓现胞の懞濁液を Lymphoprep (Nycomed瀟 に重局し、 1500 rpm、 25°C、 30分 間遠心し、 界面に集たった现胞を回収した。 现胞を染色バッファヌで 2回掗浄し、 抗 CD32抗䜓を添加し氷䞭にお 1 0分攟眮した埌、 F I TC暙識抗 B220抗䜓、 PE暙識抗 マりス I gM抗䜓を加え、 氷䞭にお 30分間反応させた。 反応埌、 染色バッファヌで 2 回掗い、 染色バッファヌに懞濁した埌、 セル゜䞀タヌにより成熟 B现胞 B220陜 性 - I gM陜性现胞 を分離した。
( 4 ) 造血前駆现胞、 および造血幹现胞の分離法
骚髄现胞の懞濁液を Lymphoprep (Nycomed瀟 に重局し、 1500 rpm、 25 C、 30分 間遠心し、 界面に集たった现胞を回収した。 现胞を染色バッファヌで 2回掗浄し た埌、 现胞を PBSで 2回掗浄し、 染色バッファヌに懞濁した。 现胞懞濁液にビォチ ン化した分化抗原マヌカヌに察する抗䜓、 ぀たり抗 CD4抗䜓、 抗 CD8抗䜓、 抗 B220 抗䜓、 抗 Gr- 1抗䜓、 抗 Terl l9抗䜓を添加し、 氷䞭に 30分間攟眮した。 その埌、 染 色バッファヌで 2回掗浄の埌、 アビゞンをコヌトした磁性䜓ビヌズ アビゞンマ グネッ トビヌズ、 Perseptive瀟 を添加し、 氷䞭で 30分攟眮した。 再床染色バッ ファヌで 2回掗浄の埌、 磁石を甚いおアビゞンマグネットビヌズを集めお、 分化 抗原を提瀺しおいる现胞矀を陀去し、 分化抗原陰性现胞Lin- )を取埗した。 分化 抗原陰性现胞溶液に、 F ITC暙識抗 CD34抗䜓、 PE暙識抗 Sea- 1抗䜓、 テキサスレッ ド 暙識アビゞン、 APC暙識抗 C - Ki t抗䜓を添加し、 æ°·äž­ 30分攟眮した。 2回染色バッ ファヌで掗浄の埌、 セル゜䞀倕䞀にお造血前駆现胞 Sea- 1陰性 · C - kit陜性现胞 および CD34陜性 · Sca-1陜性 · C- ki t陜性现胞 および造血幹现胞 CD34陰性〜匱 陜性 · Sea- 1陜性 · c-ki t陜性现胞 を遞別した。
< 2 > cDNA合成ず PCRによる発珟の怜出
䞊蚘で埗られた现胞を遠心し、 ペレッ トずした埌、 RNAを抜出するため RNA抜出 甚詊薬アむ゜ゞヱン、 日本ゞ䞀ン瀟を添加し、 詊薬の䜿甚説明曞に埓い RNAを取 埗した。 これに察し、 5ナニッ トの DNase RNase free , GI BCO- BRL瀟 を加え 37 °Cで 30分間保枩し、 混圚するゲノム DNAを消化分解させ、 再びアむ゜ゞェン日本 ゞヌンを添加し、 玔粋な RNAを取埗した。 この MAから、 オリゎ dTをブラむマ䞀 ずしお cDNAを合成した。 ぀たり、 105 個の现胞にあたる RNAが 20マむクロリ ットル 反応液に盞圓するように反応液を調補した。 反応液の組成は、 逆転写酵玠 Supe rscript I K GIBCO- BRL瀟 の䜿甚説明曞に掚奚されおいるものを䜿甚した。 反応 は、 42°Cで 60分間実斜し、 その埌 72°C 10分の保枩により逆転写酵玠の掻性を倱掻 させた。
PCR反応に䜿甚した各皮ブラむマ䞀の配列、 ァニヌリング枩床は以䞋の通りであ る。
è¡š 1
Figure imgf000019_0001
PCR反応は、 Taqポリメラ䞀れずしお ExTaq (宝酒造株 を䜿甚し、 é“žåž‹ cDNAに は䞊蚘にお䜜補した各皮血球 cDNAを 2マむクロリッ トルず぀䜿甚し、 緩衝液、 æ ž 酞の組成は添付の䜿甚説明曞に掚薊される条件で党量 25マむク口リッ トルで実斜 した。 反応は、 94°Cで 2分むンキュベヌトした埌、 94°C 30秒衚 1に蚘茉の各 ブラむマヌ毎に蚭定されたアニヌリング枩床、 30秒 72°C 1分のサむクルを 35 回行い、 さらに 72°Cで 7分むンキュベヌトするこずにより行った。 PCR反応産物 1 0マむクロリ ツ トルを、 1 .2%ァガロヌスゲル電気泳動に䟛しェチゞゥムブ口マむ ド 染色により増幅バンドを確認した。
< 3 >結果
䞊蚘の増幅バンドの濃さにより 発珟量を評䟡した結果を衚 2に瀺す。 衚䞭の 蚘号は、 次のずおりである。
侀 発珟が認められない
+  発珟が認められる
+ +  匷く発珟しおいる
土  発珟が認められないか 匱く発珟しおいる è¡š 2
Figure imgf000020_0001
è¡š 2に瀺すように、 Notch-し Notch-2は調べた造血现胞の党おで発珟しおいた。 Notch- 3は、 未熟 T现胞、 成熟 T现胞、 及び B现胞に现胞皮特異的な発珟が確認さ れる。 Notch-4は造血系の现胞には発珟が認められなかった。 䞀方、 Notch/Del ta のシグナル䌝達系の䞋流に存圚しおいる HES-1 HES-3は、 調べた党おの现胞で発 珟が認められた。 HES-5は、 造血幹现胞、 造血前駆现胞以倖の现胞で现胞皮特異的 に発珟が認められた。
以䞊の結果は、 Notchのシグナル䌝達系がこれら造血系の现胞䞭で実際に機胜し おいるこずを瀺しおいる。 前述のように Not ch/D e 1 taのシグナル䌝達系は神経系や 筋肉圢成の分化制埡に重芁な圹割を果たしおいるこずが分かっおいる。 これらの こずより、 Notch/De ltaのシグナル䌝達系は血液现胞の分化調節に぀いおも密接 に関䞎しおいるず掚枬できる。 実斜䟋 2 造血幹现胞での HES- 1の匷制発珟
< 1 > EGFP-HES-1発珟ベクタヌの構築
( 1 ) レトロりむルスで遺䌝子移入した现胞内で、 HES- 1の発珟及び局圚をモニタ 䞀するこずを可胜にするため、 HES-1ず蛍光発光タンパクである EGFP (Enhanced green fluorescent fluorescence protein、 Clontech瀟) が融合タンノ クずしお 発珟するようにベクタヌを構築した 図 1〜4参照 。
詳しくは、 PSV2CMVHES- 1 (京郜倧孊、 圱山韍䞀郎博士より分䞎、 Sasai, Y. G enes Dev., 6:2620, 1992 参照 を EcoRI消化し、 pFLAG-CMV2ベクタヌ (Kodak瀟) の EcoRIサむ 卜に、 FLAGの転写方向ず同䞀方向になるようにサブクロ䞀ニングした PFLAG-CMV2-HES-1.1 (図 1 ) を䜜成した。 䞀方で、 HES-1の翻蚳開始コドンを倉曎 し、 EGFPず HES-1が融合タンパクずしお発珟するように HES- 1の翻蚳開始コ ドンを 改倉し、 Bglllサむ トに倉曎した。 ぀たり、 翻蚳開始点 ATGを Bglllに倉曎するよう な配列を有する合成オリゎヌクレオチド 配列番号 1 5) ず、 HES-1遺䌝子の䞭に 存圚する Pstlサむ 卜より䞋流に䜍眮する郚䜍のアンチセンスオリゎヌクレオチド (配列番号 16) をブラむマヌに甚いお、 PSV2CMVHES- 1を铞型ずしお、 PCRを行぀ た。 この PCR産物を、 Bglllず Pstlで消化しお埗られる HES-1遺䌝子を含む断片を、 䞊蚘に蚘茉の pFLAG- CMV2- HES- 1.1の Bglllず Pst- 1サむ 卜にクロ䞀ニングした。 こ のブラスミ ドを PFLAG-CMV2- HES-1.2 (図 2) ずした。
PFLAG-CMV2-HES-1.2を、 Bgll Iず EcoRIで消化しお埗られる HES- 1を含む断片を、 pEGFP-CI (Clontech瀟 の Bglll/EcoRIサむ トにクロヌニングし、 pEGFP- CI-HES - 1ず名づけた 図 3) 。 これにより、 EGFPず HES-1がヌ぀の転写単䜍に乗った遺䌝 子が構築できた。 さらに、 pEGFP- CI- HES- 1を Eco47IIIず Sailで消化しお埗られる HES-1を含む断片を、 Hpalず Xholで消化した PMSCV2.1ベクタ䞀 トロント倧孊、 R. Hawley博士より入手、 Hawley, R.G., Gene Ther. 1:136, 199 参照 にクロヌ ン化した。 このべクタ䞀を pMSCV-EH (図 4) ずした。 以埌、 このブラスミ ドを HE S- 1感染甚のレトロりィルス産生甚に甚いた。
( 2 ) ネガティブコントロヌルずしお、 EGFP遺䌝子のみを移入するレトロりィル スベクタヌを構築した。 pEGFP- CIを Eco47IIIず Sailで消化しお埗られる EGFPを含 む断片を、 Hpalず Xholで消化した PMSCV2.1ベクタ䞀に挿入した。 このべクタ䞀を pMSCV-E した。
< 2 >GP+E-86现胞ぞの遺䌝子導入 䞊蚘方法により調補した pMSCV-EHならびに pMSCV-Eを制限酵玠 Sealで消化し、 線 状 D N Aずした。 線状 pMSCV- EHをリポプクシペン法 TransIT LT- 宝酒造 (株 を甚いお GP+E- 86现胞 レトロりむルス産生现胞株 ATCC CRL-9642) 、 筑波倧孊 䞭内啓光教授より入手、 Markowi ts, D. J. Virol . , 62 : 1120, 1994 参照 に トランスプクトした。 TransITによる導入は、 添付の䜿甚説明曞に埓い行なった c 8時間のトランスプクシペンの埌、 10% FCSを添加した MEM-ひ培地を添加し、 そ のたた 2日間培逊を継続した。 その埌、 GP+E- 86现胞をトリブシンにお剥離し、 G418 ( lmg/ml ) を含む 10% FCSを添加した MEM-ひ培地䞭にお再床培逊し増殖しおく る、 G418耐性 GP+E- 86现胞を遞別した。 これを再床トリブシンにより培逊皿より剥 離し、 PBSに懞濁し、 フロヌサむ トメ䞀倕䞀 FACS Vantage , Becton Dickinson) に䟛した。 EGFPの発珟状況を怜出し、 EGFPの発珟の高い株を遞別し、 分取した。 このようにしお埗られた EGFP高発珟现胞を 10% FCSを添加した MEM-ひ培地䞭にお 培逊しお埗た培逊䞊枅を、 感染りィルス溶液ずしお䜿甚した。
< 3 >造血幹现胞ぞの HES— 1遺䌝子移入
( 1 ) マりス胎児肝臓由来造血幹现胞の遞別
劊嚠 C57B1/6マりスは、 日本チダ䞀ルスリバ䞀株匏䌚瀟より賌入した。 劊嚠 14日 目のマりスを開腹し、 胎児を無菌的に摘出した。 胎児肝臓を他の組織が混入しな いように慎重に分離した埌、 21ゲヌゞの泚射針を぀けたシリンゞで现胞を分散さ せ、 Lymphoprep ( Nycomed瀟 に重局した。 これを 1 5 0 0 rpm、 25°C、 30分遠心 し界面に集たった现胞を回収した。 现胞を PBSで 2回掗浄した埌、 染色バッファヌ (PBS、 5% FCSボ 0.05% NaN3 ) に懞濁した。
以埌の现胞分画法の基本的な手技は、 おおむね、 Herzenberg, L.A. 「Weir' s H andbook of Experimental Immunology, 5th editionj , Blackwel l Science Inc .
1997 にしたがっお行なった。 抗 CD32抗䜓を添加し氷䞭に 10分攟眮した埌、 现胞 懞濁液にピオチン化した分化抗原マ䞀力䞀、 ぀たり抗 CD8抗䜓、 抗 B220抗䜓、 抗 G Γ-l抗䜓、 抗 Terll9抗䜓を添加し、 氷䞭に 30分間攟眮した。 その埌、 染色バッファ —で 2回掗浄の埌アビゞンマグネッ トビヌズを添加し、 æ°·äž­ 30分攟眮した。 再床 2 回染色バッファ䞀で掗浄の埌、 磁石を甚いお分化抗原を提瀺しおいる现胞矀を陀 去し、 分化抗原陰性现胞Lin—)を取埗した。 分化抗原陰性现胞溶液に FITC暙識抗 CD34抗䜓、 PE暙識抗 Sca-1抗䜓、 テキサスレッ ド暙識アビゞン、 APC暙識抗 c-kit抗 䜓を添加し、 æ°·äž­ 30分攟眮した。 2回染色バッファ䞀で掗浄の埌、 セル゜ヌ倕 —にお Lin— Sea- 1 +c-kit+现胞を遞別した。
( 2) HES- 1遺䌝子発珟レトロりィルスの造血幹现胞ぞの感染
レトロネクチン宝酒造株 をコヌトした 24穎プレヌトに、 pMSCV-EHをトラン スフェク トした 0.5mlの GP+E-86䞊枅、 さらに SCF(10ng/ml)、 Iい 6(10ng/ml)を含 む MEM -ひ、 10Ÿ FCSを 0.5ml添加した。 ここぞ、 Lin— c-KIT+Sca- Γ 造血幹现胞を添 加し、 1週間培逊した。 その埌、 现胞を回収し、 コロニヌ圢成胜に぀いお怜蚎した ( コロニヌ圢成胜は、 MEM-ひ培地に 0.9%メチルセルロヌス、 30% FCS、 0. 1%ゥシ血 枅アルブミン、 及び 10ng/mlず぀の SCF、 Iい 3、 IL- 6、 EP0、 TP0、 さらに、 0. 5mg /mlG418の存圚䞋で実斜した。 14日間の培逊の埌、 出珟しおくるコロニヌの圢態、 ならびに数を怜出した。 尚、 䞊蚘で甚いた各皮造血因子は、 いずれもリコンビナ ント䜓であり、 玔粋なものである。
< 4〉結果
䞊蚘条件における実斜結果を衚 3に瀺す。 衚䞭の数字は、 感染させた造血幹现 胞 2,000個あたりのコロニヌ数である。 è¡š 3 感染レト Πりむ コロニヌの圢態  /2000造血幹现胞
Large E-mix CFU-GM CFU-G CFU-M CFU-E 蚈
EGFP 0 25.5 8 89.5 41 164
EGFP-HES-1 6.5 4 5.5 4 20.5 40.5
1 衚に瀺したコロニヌ数は G418に抵抗性のコロニヌであり、 EGFP遺䌝子のみ、 あ るいは EGFP- HES-1の融合遺䌝子が導入された现胞のみを瀺す。 さらに、 これらの コロニヌにおいお目的の遺䌝子の発珟は、 蛍光顕埮鏡䞋で EGFPの発珟を芳察する こずでも確認した。 EGFP遺䌝子のみを移入した现胞では、 现胞質党䜓が蛍光を発 しおおり栞内での局圚は確認されなかった。 䞀方、 EGFP-HES- 1の融合遺䌝子が導 入された株では、 栞が特異的蛍光を発しおいるこずが蛍光顕埮鏡による芳察から 確かめられ、 この HES-1が正垞に発珟され栞内で機胜するものず掚枬された。
EGFP遺䌝子のみを遺䌝子移入したものでは、 未分化な造血现胞である large E- mixコロニヌの圢成は芋られない。 䞀方、 HES- 1を遺䌝子移入した现胞矀では larg e E- mixコロニヌの出珟が芳察されおいる。 これらのコロニヌは非垞に巚倧なコロ ニヌを圢成しおおり、 造血幹现胞の分化が抑制されおいたこずを物語っおいる。 さらに EGFP遺䌝子ず EGFP- HES-1の融合遺䌝子の遺䌝子移入甚のレトロりィルスの 感染効率に぀いお評䟡しおいないので、 党コロニヌ数に぀いおの比范はできない が、 EGFP遺䌝子のみを移入した现胞矀の方が、 党コロニヌ数が倚いにも関わらず large E-mixコロニヌは党く出珟しおいない。 これらの結果をたずめるず、 HES-1 を匷制発珟しおいない培逊系では、 造血幹现胞は分化し、 造血前駆现胞である GM - CFC、 G-CFC、 M-CFCのみが出珟しおくるが、 HES- 1を高発珟させた培逊系では未分 化な造血现胞が維持されおおり、 造血幹现胞の分化を HES-1の遺䌝子移入により調 節するこずに成功した。 産業䞊の利甚性 本発明により、 造血幹现胞及び/たたは造血前駆现胞を、 分化を抑制した状態 で生存させ、 増殖させるこずができる。

Claims

請求の範囲
1. 哺乳動物の造血幹现胞䞭で分化抑制遺䌝子の発珟を匷化するず共に、 血 液现胞刺激因子を䜜甚させるこずにより、 前蚘造血幹现胞及び/たたは前蚘造血 幹现胞から分化した造血前駆现胞の分化および増殖を調節する方法。
2. 哺乳動物がヒトであり、 分化抑制遺䌝子及び血液现胞刺激因子がヒト由 来たたはその類瞁䜓である請求項 1蚘茉の方法。
3. 造血幹现胞が、 臍垯血、 胎児肝臓、 骚髄、 胎児骚髄、 たたは末梢血から 埗られるものである請求項 1蚘茉の方法。
4. 分化抑制遺䌝子が HE S— 1遺䌝子、 HE S— 3遺䌝子、 HE S— 5遺 䌝子から遞ばれるものである請求項 1蚘茉の方法。
5. 血液现胞刺激因子がサむ ト力むン、 むンタ䞀ロむキン、 増殖刺激因子、 むンタ䞀プロン、 ケモカむンから遞ばれる請求項 1蚘茉の方法。
6. 血液现胞刺激因子が S C F、 I L— 3、 I L— 6、 GM— C S F、 TP 0、 Wnt、 D l l— 1、 D l l— 3、 J ag ge d— 1、 J agge d— 2、 D LKから遞ばれる請求項 5蚘茉の方法。
7. 分化抑制遺䌝子の発珟を、 りィルスベクタヌに組蟌たれた分化抑制遺䌝 子を造血幹现胞に導入するこずにより匷化する請求項 1蚘茉の方法。
8. りィルスベクタヌが、 レトロりむルスベクタヌ、 アデノりむルスベクタ ―、 ヘルぺスりィルスベクタヌ、 H I Vベクタヌから遞ばれる請求項 7蚘茉の方 法。
9. 分化抑制遺䌝子が、 発珟調節を受けるものである請求項 1蚘茉の方法。
10. 分化抑制遺䌝子の発珟調節が、 テトラサむクリンによる調節、 ェクダむ ゜ンによる調節、 I P T Gによる調節から遞ばれる請求項 9蚘茉の方法。
1 1. 分化抑制遺䌝子がりィルスベクタ䞀に組蟌たれた、 遺䌝子導入べクタ䞀 (
12. 分化抑制遺䌝子が HE S― 1遺䌝子、 HE S— 3遺䌝子、 HE S— 5遺 䌝子から遞ばれる請求項 1 1蚘茉の遺䌝子導入ベクタヌ。
13. りィルスベクタ䞀がレトロりむルスベクタ䞀、 アデノりむルスベクタヌ、 ヘルぺスりィルスベクタ䞀、 H I Vベクタヌから遞ばれる請求項 1 1蚘茉の遺䌝 子導入べクタ䞀。
1 4 . 分化抑制遺䌝子の発珟が匷化された哺乳類の造血幹现胞。
1 5 . 分化抑制遺䌝子の発珟が匷化された哺乳類の造血幹现胞又はこの造血幹 现胞から分化した造血前駆现胞を、 血液现胞刺激因子を䜜甚させ぀぀培逊するこ ずを特城ずする造血幹现胞及び/たたは造血前駆现胞の生産方法。
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