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WO1999011766A1 - Procede de luminescence pour systeme de luciferine/luciferase et reactif luminescent - Google Patents

Procede de luminescence pour systeme de luciferine/luciferase et reactif luminescent Download PDF

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WO1999011766A1
WO1999011766A1 PCT/JP1998/003833 JP9803833W WO9911766A1 WO 1999011766 A1 WO1999011766 A1 WO 1999011766A1 JP 9803833 W JP9803833 W JP 9803833W WO 9911766 A1 WO9911766 A1 WO 9911766A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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luciferase
luciferin
luminescence
solution
carbon dioxide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1998/003833
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masayuki Ryufuku
Hozumi Tanaka
Hideyuki Takeuchi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Artience Co Ltd
Original Assignee
Toyo Ink Mfg Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyo Ink Mfg Co Ltd filed Critical Toyo Ink Mfg Co Ltd
Priority to JP51658199A priority Critical patent/JP3679134B2/ja
Priority to EP98940595A priority patent/EP0957163B1/en
Priority to DE69832152T priority patent/DE69832152T2/de
Priority to US09/297,335 priority patent/US6060261A/en
Publication of WO1999011766A1 publication Critical patent/WO1999011766A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/02—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for disorders of the vagina
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase

Definitions

  • the present invention relates to a luciferin Z luciferase-based luminescence method and a luciferase Atsushi reagent which stabilize a luminescence reaction.
  • the luciferin / luciferase-based luminescence method and luciferase enzyme reagent of the present invention are applied to any atsey system using a luciferase enzyme as a reporter and a signal.
  • the luminescent substrate luciferin contained in the luminescent reagent is susceptible to oxidation in solution during storage, and that oxylluciferin inhibits the enzyme reaction of luciferase.
  • oxidation in solution during storage and that oxylluciferin inhibits the enzyme reaction of luciferase.
  • oxylluciferin inhibits the enzyme reaction of luciferase.
  • deterioration of luminescent activity due to luciferin oxidation has become a major problem, which has hindered further expansion of the use of Atsushi using luciferase as a reporter. Therefore, development of a new stabilization method is expected.
  • An object of the present invention is to provide a luciferin ../ luciferase-based luminescence method having an extended half-life of a luminescence reaction, and a luciferase-azetsee reagent.
  • Another object of the present invention is to provide a luciferin-Z luciferase-based luminescence method that can expect a stable luminescence reaction while suppressing degradation of luminescence activity, and a lucifera-zeatssey reagent. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a luciferin Z luciferase-based luminescence method, which comprises reacting a luciferin-containing solution with an increased amount of dissolved carbon dioxide with luciferase.
  • the present invention provides the above-mentioned luciferin Z luciferase-based luminescence method, wherein the pH of the luciferin-containing solution is adjusted within a range of 5.0 to 8.5.
  • the present invention relates to a method for producing a luciferin-containing solution by adding dry ice. It is intended to provide a luminescence method of the above-mentioned luciferin Z lucifer Xase system wherein the dissolved amount of carbon dioxide is increased.
  • the present invention provides the above-described luciferin / luciferase-based luminescence method, wherein the luciferin-containing solution is obtained by blowing carbon dioxide gas to increase the dissolved amount of carbon dioxide.
  • the present invention provides a luciferase Atssay reagent provided with a luciferin-containing solution containing an increased amount of dissolved carbon dioxide.
  • the present invention provides a luciferase Atsushi reagent comprising a first component containing dried luciferin and a second component comprising a solution having an increased dissolved amount of carbon dioxide.
  • luciferase includes all kinds of luciferases involved in bioluminescence, such as firefly luciferase, luciferase luciferase, and luciferase luciferase.
  • luciferin means a luminescent substrate corresponding to a luciferase that fights bioluminescence, such as firefly luciferase, chip pansy (Ren i1a) luciferase, and red firefly luciferase.
  • a method for increasing the amount of dissolved carbon dioxide in the luciferin solution which is the luminescent reagent for luciferase of the present invention a method of adding carbon dioxide gas or dry ice is preferable.
  • a method of adding an inorganic compound that generates a gas by adding to water such as sodium bicarbonate is also exemplified.However, it does not hinder organisms such as micro-organisms, It is preferable to use carbon dioxide gas or dry ice, which does not cause the generation of gas.
  • methods for controlling the pH of the luminescent solution include inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and boric acid, acetic acid, tartaric acid, malic acid, propionic acid, mucous acid, benzoic acid, maleic acid, succinic acid, and fumaric acid.
  • Organic acids such as acids, or inorganic alkaline compounds such as caustic soda, caustic potash, aqueous ammonia, sodium carbonate, potash carbonate, aniline, pyridine, imidazole, monomethylamine, dimethylamine, trimethylamine, monoethylamine, getylamine, triethylamine.
  • Add an organic base such as ethanolamine, diethanolamine or triethanolamine.
  • the luminescence reaction is extremely inhibited outside the pH range of 5.0 to 8.5, but within this range, high luminescence is obtained when the pH is high, but the half-life is shortened.
  • the combination of PH and its buffer component gives It is possible to adjust the luminescence amount and luminescence half-life of the luminescence solution of the same composition to some extent ii.
  • the buffer component that controls PH may be any component that does not inhibit luciferase activity, including tris.
  • buffer component reduces luminescence by half from the start of luminescence. It is sufficient to maintain P II within the specified range until the time required .
  • the luciferase-Atsey reagent of the present invention starts a reaction when mixed with a sample containing luciferase, and a component such as a luminescent substrate that participates in the luminescence reaction is measured at a concentration sufficient to cause luciferase to emit light.
  • a component such as a luminescent substrate that participates in the luminescence reaction is measured at a concentration sufficient to cause luciferase to emit light.
  • luminescent reagents There are kits for frozen products and freeze-dried products as luminescent reagents.
  • Frozen products include luciferin, ATP, CoA, buffer components, This is a frozen component containing shim ions, etc. Forcibly dissolves carbon dioxide into solution before freezing. Store the frozen product at about 17 CTC and allow it to cool to room temperature after thawing.
  • the lyophilized kit consists of a first component obtained by freeze-drying a solution containing luciferin, ATP, and CoA, and a second component consisting of a buffer solution and a solution containing magnesium ions. And the second component.
  • carbon dioxide is forcibly dissolved in the solution as the second component, and sealed and stored.
  • the lyophilized product and the solution components should be stored frozen and returned to room temperature before mixing.
  • Both frozen and freeze-dried forms should be stored in solution for 24 hours at room temperature and for 1 month in refrigerated (4 ° C) with almost no loss of luminescence performance. be able to.
  • the GTA buffer with pH adjusted to 6.7 in 10 mi of Luciferase assay reagent of "Pitka Gene luminescence kit (manufactured by Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd .: product number PG L100)" was adjusted to a final concentration of 10 OmM. Added. Next, add 1 g of dry ice to 1 Om1 of the luminescent reagent to completely evaporate the dry ice. Subsequently, glycerol was added as a luciferase stabilizer to a final concentration of 1%, and mixed well to prepare a luminescent solution.
  • the citrate buffer prepared by adjusting ⁇ to 6.3 in 1 Oml of luciferase assay reagent of “Pitka Gene Light Emission Kit (manufactured by Toyo Ink Mfg. Co., Ltd .: product number GLGL100)” is adjusted to a final concentration of 1 OOmM. Added. Subsequently, 1 g of dry ice was added to 10 ml of the luminescent reagent, and the dry ice was completely vaporized. Subsequently, glycerol was added as a stabilizer for luciferase to a final concentration of 1%, and mixed well to prepare a luminescent solution.
  • the luciferase enzyme solution was diluted and added in the range of 1 Ong to 1 fg, the luciferase enzyme was detected up to 1 Ofg by the above luminescent solution.
  • Table 1 shows the measurement results in the examples and comparative examples. Compared with the conventional method, good results were obtained for the luminescence persistence and stability. Time-dependent change of light emission amount and residual ratio of light emission i
  • the detection sensitivity of luciferase is lis and the luminescence half-life is 5 minutes. With a period of 20 times or more and a low pH, the detection sensitivity is 10 Ofg and a half-life of 90 times or more can be achieved, and the luminescence stability is dramatically improved.

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Description

明 細 書 ルシフヱリン Zルシフヱラーゼ系の発光方法および発光試薬 技術分野
本発明は、 発光反応を安定化させたルシフェリン Zルシフェラ一ゼ系 の発光方法およびルシフェラーゼアツセィ試薬に閲する。 本発明のルシ フェリン/ルシフヱラーゼ系の発光方法およびルシフェラ一ゼアツセィ 試薬は、 ルシフェラーゼ酵素をレポーターおよびシグナルとしたあらゆ るアツセィ系に適用される。 背景技術
従来、 in vitroでのルシフヱリン/ルシフヱラーゼによる発光反応に おいては、 その発光パターンはフラッシュ状に観察されるものであった 。 このため、 試薬注入の特別な機構を持つ装置を用いなければ発光反応 を正確に測定することができなかった。 しかし、 K.V.Woodらは反応系に CoA (コェンザィム A ) を添加することによって、 発光の半減期が 5分 間と比較的長い発光系を確立した （Wood.K.V. Recent advantage and p rospects for beetle 1 uc i f erase as genetic reporters . In： Biolumi nescence and Chem i I um i nescence current status . Proceeding of the th International Symposium on Biolumi nescence and Chemi lurnines oence , Cambridge, September 1990. .543. Ed. by P.Stanley and L . J.Kricka.)D これによりルシフヱリン /ルシフェラ一ゼ系におけるる発 光量の正確な測定が試薬の自動注入装置を持たないルミノメーターや液 休シンチレーションカウンターによっても可能となった。 これにより、 培養細胞の中でレポーターとして発現されたルシフェラ一ゼを高感度で 測定するレポーターアツセィ法が広く用いられるようになった。 しかし 、 薬剤の開発に向けた H i gh Through- Pu t スクリーニング等にレポータ 一アツセィを適用する場合、 5分間の発光半減期では十分ではなく、 咧 えば 9 6ゥエルを用いた多検体のサンプルには依然、 発光試薬を多数回 添加してその度ごとに測定をしなければならない等、 操作および測定上 さまざまな制約が生じている。
また、 発光試薬に含まれる発光基質のルシフェリンは、 保存中に溶液 中で酸化を受け易く、 これによつて生じるォキシルシフエリンはルシフ エラ一ゼの酵素反応を阻害してしまうことが広く知られている。 これま でのルシフェリンを発光基質として含む ¾光試薬では、 ルシフヱリンの 酸化による発光活性の劣化が大きな問題となっており、 ルシフェラーゼ をレポ一ターとしたアツセィのさらなる用途の拡大を妨げている。 この ため、 新しい安定化法の開発が期待されている。
本発明は、 発光反応の半減期を延長したルシフエリン.. /ルシフェラー ゼ系の発光方法、 およびルシフェラ一ゼアツセィ試薬の提供を目的とす る。
本発明はさらに、 発光活性の劣化を仰制し、 安定した発光反応を期待 できるルシフヱリン Zルシフヱラ一ゼ系の発光方法、 およびルシフエラ —ゼアツセィ試薬の提供を目的とする。 発明の開示
本発明は、 二酸化炭素の溶存量を増加させたルシフェリン含有溶液と ルシフヱラーゼとを反応させることを特徴とするルシフヱリン Zルシフ エラ一ゼ系の発光方法を提供する。
更に本発明は、 ルシフェリン含有溶液の P Hを 5 . 0から 8 . 5の範 囲に調整する上記ルシフェリン Zルシフ ラーゼ系の発光方法を提供す る。
更に本発明は、 ルシフェリン含有溶液が、 ドライアイスの添加により 二酸化炭素の溶存量を増加させたものである上記ルシフエリン Zルシフ Xラーゼ系の発光方法を提供する。
更に本発明は、 ルシフ リン含有溶液が、 二酸化炭素ガスを吹込み二 酸化炭素の溶存量を増加させたものである上記ルシフエリン /ルシフエ ラ一ゼ系の発光方法を提供する。
更に本発明は、 二酸化炭素の溶存量を増加させたルシフ Xリン含有溶 液を備えたルシフェラーゼアツセィ試薬を提供する。
更に本発明は、 乾燥ルシフェリンを含む第 1成分と二酸化炭素の溶存 量を増加させ溶液からなる第 2成分とを備えたルシフェラーゼアツセィ 試薬を提供する。 発明を実施するための最良の形態
本発明においてルシフェラ一ゼとは、 ホタル .ルシフエラ一ゼを始め 、 シ '一パンジー（Ren i I l a ) ' ルシフェラ一ゼ、 ゥミホタル ' ルシフェラ —ゼ等生物発光に関わるあらゆるルシフェラーゼを含む。
木発明においてルシフエリンとは、 ホタル ·ルシフエラーゼを始め、 シ一パンジー（Ren i 1 l a) ' ルシフェラーゼ、 ゥミホタル ' ルシフェラ一 ゼ等生物発光に鬨ゎるルシフエラーゼに対応する発光基質を意味する。 本発明のルシフェラーゼの発光試薬であるルシフエリン溶液中の溶存 二酸化炭素量を増加させる方法としては、 炭酸ガスあるいはドライアイ スを添加する方法が好ましい。 重炭酸ソ一ダなど水に添加することによ りガスを発生する無機の化合物をも添加する方法も例示されるが、 微生 物等の生物に障害を与えることが少なく、 また化学反応等が生じること がない炭酸ガスあるいはドライアイスの使用が好ましい。
炭酸ガスの使用によりルシフ ラーゼの発光反応は長時間にわたり持 続し、 同時に溶液中の発光基質ルシフェリンを溶存酸素による酸化劣化 から保護することができる。 本発明において発光溶液の P Hの制御方法としては、 塩酸、 硫酸、 リン酸、 ホウ酸等の無機酸、 酢酸、 酒石酸、 リンゴ酸、 プロピオン酸、 粘液酸、 安息香酸、 マレイン酸、 コハク酸、 フマール酸等の有機酸、 又 は苛性ソーダ、 苛性カリ、 アンモニア水、 炭酸ソーダ、 炭酸カリ等の無 機アルカリ性化合物、 ァニリン、 ピリジン、 イ ミダゾール、 モノメチル ァミン、 ジメチルァミン、 トリメチルァミン、 モノェチルァミン、 ジェ チルァミン、 卜リエチルァミン、 エタノールァミン、 ジエタノールアミ ン、 トリエタノールァミンなどの有機塩基を添加する。 P H 5〜8. 5 の好ましい P H値に制御することにより、 発光反応の経過でアル力リ側 へのシフトを仰えルシフヱラ一ゼの酵素活性保持に寄与させることがで きる。
発光反応は、 P H 5 . 0〜8. 5の範囲外では極端に阻害されてしま うが、 この範囲内では P Hが高い場合には強い発光量が得られるが半減 期は短くなり、 反対に低い P Hの場合は究、}(、 !.：.//·' fii t、 ： , I!', の発光半 減期を得ることができる。 つまり、 P Hとその緩衝成分との組み合わせ により、 同一組成の発光溶液による発光量と発光の半減期をある程度調 iiすることが可能である。 なお P Hを制御する緩衝液成分はルシフェラ —ゼ活性を阻害しないものならいずれでもよく、 これにはトリス一硫酸 、 クェン酸、 コハク酸、 など一般的な緩衝剤を始め、 H E P E Sや M E Sなどのグッド緩衝剤、 GTAなどの広域緩衝剤も含まれる。 緩衝成分 の濃度は、 発光の開始から発光が半減する時間まで十分に P IIを所定範 囲に保ちうる澳度であればよい。
本発明のルシフェラーゼアツセィ試薬は、 ルシフヱラ一ゼを含むサン プルと混合した際に反応が開始され、 発光反応に鬨与する発光基質等の 成分が測定されるルシフェラーゼを発光させるに十分な濃度であるよう にする。 発光試薬としては凍結品と凍結乾燥品のキットがある。
凍結品としてはルシフヱリン、 AT P、 C o A、 緩衝液成分、 マグネ シゥムイオン等を含む成分を凍結したもので、 凍結前に溶液へ二酸化炭 素を強制的に溶存させる。 凍結品は約一 7 CTCで保存し、 解凍後十分に 室温に戻した後に使用する。
凍結乾燥品のキットは、 ルシフヱリン、 A T P、 C o Aを含む溶液を 凍結乾燥した第 1成分と、 緩衝液成分、 マグネシウムイオンを含む溶液 からなる第 2成分とからなり、 使用直前に第 1成分と第 2成分を混合す る。 この場合は、 第 2成分である溶液に二酸化炭素を強制的に溶存させ 、 密封して保存する。 凍結乾燥品と溶液成分は冷凍保存し、 室温に戻し てから混合して使用する。
凍結品、 凍結乾燥品のどちらの形態のものであっても、 溶液の状態と して室温で 2 4時間、 冷蔵（4 °C) で 1 ヶ月間は、 ほとんど発光性能を 失うことなく保存させることができる。
次に、 本発明を実施例を挙げてさらに詳細に説明する。
実施例 1
「ピツカジーン発光キット （東洋ィンキ製造株式会社製：製品番号 PG L100 ) 」 のルシフェラ一ゼアツセィ試薬 1 0 m iに p Hを 6 . 7に調製し た G T A緩衝液を終濃度 1 0 O mM となるように加えた。 続いてドライ アイスを発光試薬 1 O m 1に対して 1 g加え、 ドライアイスを完全に気 化させる。 続いてルシフェラーゼの安定剤として、 グリセロールを終濃 度 1 %となるように加え、 よく混和し発光溶液を調製した。
ルシフヱラーゼを 1 0 O ng/m l含む酵素溶液を、 ル'ミノメーター （ Ber tlid d製 LB9506)用の測定キュベットに 1 0〃1 採った。 続いて、 調製 した上記の発光溶液を 1 0 0 1 添加し、 即座にルミノメーターにセッ 卜し、 試薬添加直後 （ 0分） から 7時間（4 2 0分） 後まで、 経時の発 光量を測定した。 上記発光試薬による発光反応では、 開始してから 5分 後に発光 i(RLU/ 秒） は上昇傾向にはあるがほぼ一定値を取って安定化 し、 3 0分後にピークを迎え徐々に減衰する。 その後 2時間を経過した 時点で最大発光量の 50 %となり半減期を迎えた。
なおルシフェラーゼ酵素溶液を希釈し、 1 Ong ( 10-9g ) から lfg ( 10"15g ) の範囲で添加したところ、 上記発光溶液によって 1 Ofg までのルシフヱラーゼ酵素が検出できた。
また調製した発光溶液を 3回の凍結解凍を行ったところ、 発光活性の 低下はほとんど認められなかった。 また 4 で 1ヶ月保存したものにつ いても ί舌性の低下は生じなかった。
実施例 2
「ピツカジーン発光キット （東洋インキ製造株式会社製：製品番号 Ρ GL100 ) 」 のルシフヱラーゼアツセィ試薬 1 Omlに ρ Ηを 6. 3に調製 したクェン酸緩衝液を終溏度 1 OOmMとなるように加えた。 続いてドラ ィアイスを発光試薬 10m 1に対して 1 g加え、 ドライアイスを完全に 気化させた。 続いてルシフヱラ一ゼの安定剤として、 グリセロールを終 濃度 1 %となるように加え、 よく混和し発光溶液を調製した。
ルシフェラ一ゼを 10 Ong/tnl含む酵素溶液を、 ルミノメータ一 （Ber thold製 LB9506)用の測定キュべッ卜に 10〃1採取した。 続いて、 調製 した上記の発光溶液を 100 1添加し、 即座にルミノメーターにセッ 卜し、 試薬添加直後 （ 0分〉から 7時間（420分） 後まで、 経時の発光 量を測定した。 上記発光試薬による発光反応では、 開始してから 10分 後に発光量（RLU/秒） はほぼ一定値を取って安定化し、 60分後にピ一 クを迎え徐々に減衰した。 その後 7時間を経過した時点でも最大発光量 の 67%の発光量を維持した。
なおルシフヱラーゼ酵素溶液を希釈し、 1 Ongから lfgの範囲で添加 したところ、 上記発光溶液によって 10 Ofgのルシフェラーゼ酵素が検 出できた。
また調製した発光溶液を 3回の凍結解凍を行ったところ、 発光活性の 低下はほとんど認められない。 また 4°Cで 1ヶ月保存したものについて も活性の低下は生じなかった。
実施例 3
「ピツカジーン発光キット 〈東洋インキ製造株式会社製：製品番号 P GL100 ) 」 のルシフヱラーゼアツセィ試薬 1 Omlに P Hを 6. 7に調製 した GTA緩衝液を終瀵度 10 OmM となるように加える。 続いて炭酸 ガスをガス導入管を用いて流量 2 Oml/minで試薬溶液の中に軽くバブリ ングして約 3分間吹き込んだ。 ルシフヱラーゼの安定剤として、 グリセ ロールを終濃度 1 %となるように加え、 よく混和し発光溶液を調製した ルシフェラーゼを 10 Ong/ml含む酵素溶液を、 ルミノメータ一 （ Ber thold製 LB9506)用の測定キュべットに 10〃1採取した。 続いて、 調製 した上記の発光溶液を 100 I添加し、 即座にルミノメータ一にセッ 卜し、 試薬添加直後 （ 0分）から 7時間（420分）後まで、 経時の発光 量を測定した。 上記発光試薬による発光反応では、 開始してから 5分後 に発光量 (RLU/秒） は上昇傾向ではあるがほぼ一定値を取って安定化し 、 30分後にピークを迎え徐々に減衰した。 その後 2時間を経過した時 点で最大発光量の 50 %となり半減期を迎えた。
なおルシフェラ一ゼ酵素溶液を希釈し、 1 Ongから l fgの範囲で添加 したところ、 上記発光溶液によって 1 Ofgまでのルシフヱラ一ゼ酵素が 検出できた。
また調製した発光溶液を 3回の凍結解凍を行ったところ、 発光活性の 低下はほとんど認められなかった。 また 4ECで 1ヶ月保存したものにつ いても活性の低下は生じなかった。
比較例 1
ルシフヱラーゼを lOOns/ml含む酵素溶液を、 ルミノメータ一 （Bertho Id製 LB9506)用の測定キュベットに 10 1採取し、 従来の発光試薬とし て 「ピツカジーン発光キット （東洋インキ製造株式会社製：製造番号 P GL100 ) 」 を調整し 100 1をこれに添加した。 即座に測定キュベットを ルミノメーターにセットし、 試薬添加直後 （ 0分） から 7時間（420 分） 後まで、 経時の発光量を測定した。 発光反応の開始から非常に高い 発光量が得られるが、 およそ 5分間で半減期を迎え、 反応開始 2時間を 経過した時点で最大発光量 (RLU/秒）の 1. 4 %まで減衰し、 7時間を 経過した時点で最大発光量 (RLU/秒）の 0. 17%にまで減衰した。 また 調製した発光溶液を 3回の凍結解凍を行ったところ、 発光活性は 90% に低下した。 さらに 4 で 1ヶ月保存したものについては活性は 10% 以下に低下した。
実施例および比較例における測定結果を表 1に示した。 従来の方法と 比較して、 発光の持続性と安定性について良好な結果を得ることができ た。 発光量の経時変化および発光 iの残存率
経過時間 比較例 1 実施例 1 実施例 2 実施例 3
0時間 2,270,882 698,851 44,725 701,274
蘭 画 画 蘭
0.5時間 689,060 716 ,254 42,541 712,527
30.3¾ 102.5¾ 95.1¾ 101.6%
1時間 149,067 581.821 42,839 582,496
6.6¾ 83.3% 95.8¾ 83. Π
2時間 31.283 357.833 40,710 358,285
1.41 51.2¾ 91.0¾ 51.1¾
3時間 17,178 200.816 38,503 201,224
0.8¾ 28.7¾ 86.1¾ 28.7¾
5時間 7,433 79,764 33,771 80,012
0.3¾ 11.4% 75.5¾ 11.4¾
8時間 3.935 38.641 28,940 38,851
0.21 5.5¾ 64.7¾ 5.5¾ 注： 1 n gZl 0〃 1のルシフヱラーゼ溶液に対し、 各々 100〃 1 の発光試薬を添加し、 反応開始直後からの経時発光量を Berthold社製 L B 9506ルミノメータ一で測定し、 単位秒あたりの相対発光量 （RL U/s ) を測定した。 産業上の利用可能性
本発明により調製した発光溶液を用いた場合、 ルシフェラ一ゼの検出 感度が lis、 発光半減期が 5分間である従来のものと較べ、 高い Ρ Ηに 設定したものでは検出感度が 1 Ofgで半減期が 20倍以上、 低い p Hに 設定したもので検出感度が 10 Ofgで半減期が 90倍以上を達成でき、 発光の安定性が飛躍的に向上される。
以上のように、 本発明によれば、 迅速性と高感度を特徴としていた従 来のルシフェラーゼの発光測定法に代わり、 持続性と安定性に ί憂れた発 光測定法が提供される。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 二酸化炭素の溶存量を増加させたルシフェリン含有溶液とルシフ エラ一ゼとを反応させることを特徴とするルシフ リン zルシフヱラ一 ゼ系の発光方法。
2 . ルシフヱリン含有溶液の p Hを 5 . 0から 8 . 5の範囲に調整す ることを特徴とする請求の範囲第 1項記載のルシフヱリン zルシフ ラ ーゼ系の発光方法。
3 . ルシフヱリン含有溶液が、 ドライアイスの添加により二酸化炭素 の溶存量を増加させたものであることを特徴とする請求の範囲第 1項記 載のルシフヱリン /ルシフヱラーゼ系の発光方法。
4 . ルシフェリン含有溶液が、 二酸化炭素ガスを吹込み二酸化炭素の 溶存量を増加させたものであることを特徴とする請求の範囲第 1項記載 のルシフヱリン Zルシフヱラーゼ系の発光方法。
5 . 二酸化炭素の溶存量を増加させたルシフ リン含有溶液を備えた ことを特徴とするルシフヱラーゼアツセィ試薬。
6 . 乾燥ルシフエリンを含む第 1成分と二酸化炭素の溶存量を増加さ せた溶液からなる第 2成分とを備えたことを特徴とするルシフェラーゼ アツセィ試薬。
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