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JP2003235600A - 遊離脂肪酸（ｎｅｆａ）の測定用液状試薬 - Google Patents

遊離脂肪酸（ｎｅｆａ）の測定用液状試薬

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JP2003235600A
JP2003235600A JP2002032918A JP2002032918A JP2003235600A JP 2003235600 A JP2003235600 A JP 2003235600A JP 2002032918 A JP2002032918 A JP 2002032918A JP 2002032918 A JP2002032918 A JP 2002032918A JP 2003235600 A JP2003235600 A JP 2003235600A
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reagent
liquid reagent
stabilizing
cyclodextrin
nefa
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JP2002032918A
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Masaharu Takayama
正治 高山
Naoto Matsuyama
直人 松山
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Azwell Inc
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 液状で長期間安定なＮＥＦＡ測定用試薬およ
びそれを用いた簡便且つ正確なＮＥＦＡ測定方法の提
供。 【解決手段】 ＣｏＡ、ＡＣＳおよびＡＴＰを含む液状
試薬であって、当該試薬の安定化に有効な量の１種以上
のキレート剤、並びに当該試薬の安定化に有効な量の、
置換α-CD、マンニトール及びトレハロースからなる群
より選択される１種以上の化合物をさらに含有する、安
定化された液状試薬。ＡＣＯ、ペルオキシダーゼ、ペル
オキシダーゼの発色性基質である水素供与体およびＮＥ
Ｍを含み、ＮＥＭの安定化に有効なｐＨを有する液状試
薬であって、当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並
びに当該試薬の安定化に有効な量のＤＴＤＮ及び／又は
フェロシアン化カリウムをさらに含有する、安定化され
た液状試薬。該第１及び第２液状試薬を安定化する方
法。該第１及び／又は第２液状試薬を含んでなるＮＥＦ
Ａ測定用キット、及び該キットを用いたＮＥＦＡ測定方
法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、液状で長期保存可
能であり、かつ遊離脂肪酸（以下、ＮＥＦＡという）を
測定可能である、コエンザイムＡ（以下、ＣｏＡとい
う）、アシルコエンザイムＡシンテターゼ（以下、ＡＣ
Ｓという）及びＡＴＰを含む第１の液状試薬、並びにア
シルコエンザイムＡオキシダーゼ（以下、ＡＣＯとい
う）、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基
質である水素供与体及びＮ−エチルマレイミド（以下、
ＮＥＭという）を含む第２の液状試薬、それらの製造に
おける安定化方法、それらを備えるＮＥＦＡ測定用キッ
ト、並びにそれらを用いたＮＥＦＡ測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来の自動分析試薬の市販キットは、凍
結乾燥品と溶解液の組み合わせとして供給され、使用時
に溶解して測定に用いてきた。ところが、凍結乾燥品の
場合、試薬調製の煩雑さに加えて、調製時のミスにより
誤った測定結果が得られたり、溶解後の有効期間が短い
（安定性に欠ける）といった問題があった。従って、最
近の臨床検査においては、そのような問題を回避すべ
く、液状試薬の使用が主流となってきている。
【０００３】ＮＥＦＡの定量法として、まず第一試薬中
で、Ｍｇ++やＭｎ++等の２価金属イオンおよびアデノシ
ン５'-三リン酸（以下、ＡＴＰという）の共存下でＡＣ
Ｓの作用により、ＣｏＡと試料中のＮＥＦＡからアシル
ＣｏＡを産生させる第一工程、および第二試薬中で、Ａ
ＣＯの作用によりアシルＣｏＡを酸化することにより生
じる過酸化水素を、ＮＥＭの存在下でペルオキシダーゼ
と発色性基質とを組み合わせて定量する第二工程からな
る方法が広く採用されている。
【０００４】しかしながら、ＮＥＦＡ測定試薬には不安
定な成分が多く含まれるため、液状化は困難であるとさ
れてきた。例えば、ＣｏＡを含む従来公知のＮＥＦＡ測
定用第一試薬は、一旦溶解してしまうと、その有効期間
は冷蔵で５〜１５日程度であった。さらに、ＮＥＭは中
性付近より高ｐＨの領域では不安定となり、またＡＣＯ
はＮＥＭによって変性を受けるため、一旦ＮＥＭとＡＣ
Ｏとを中性付近の溶液中で共存させると、両者とも急激
に安定性が低下してしまう。そのため、ＮＥＭとＡＣＯ
の共存溶液は、長期間にわたって測定試薬としての性能
を維持することが困難であるとされ、従来はＮＥＭを強
酸性溶液中に保存し、ＡＣＯは凍結乾燥して保存すると
いうように、ＮＥＭとＡＣＯを別々に保存してそれらの
安定性を確保するのが一般的であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、酵素を用い
たＮＥＦＡ測定法において、第一試薬及び第二試薬を安
定化し、長期間にわたって測定の性能を維持できる安定
なＮＥＦＡ測定用液状試薬を提供することを目的とす
る。さらに、本発明は、これらの試薬を用いて、より簡
便且つ正確なＮＥＦＡ測定方法を提供することを目的と
する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、キレート
剤、並びに置換α−シクロデキストリン、マンニトール
及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の
化合物を第一試薬に共存させることにより、第一試薬を
安定化できることを見出した。また、本発明者らは、Ａ
ＣＯ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基
質である水素供与体及びＮＥＭを含み、ＮＥＭの安定化
に有効なｐＨを有する第二試薬に、フラビンアデニンジ
ヌクレオチド（以下、ＦＡＤという）、並びに6,6'-ジ
チオジニコチン酸（以下、ＤＴＤＮという）及び／又は
フェロシアン化カリウムをさらに含有させることで第二
試薬をさらに安定化することにも成功して、本発明を完
成するに至った。
【０００７】即ち、本発明は、従来成し得なかった長期
の保存が可能である、以下の（１）〜（４）の第１の液
状試薬、及び（５）〜（８）の第２の液状試薬を提供す
る。 （１）コエンザイムＡ、アシルコエンザイムＡシンテタ
ーゼおよびＡＴＰを含む液状試薬であって、当該試薬の
安定化に有効な量の１種以上のキレート剤、並びに当該
試薬の安定化に有効な量の、置換α−シクロデキストリ
ン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択
される１種以上の化合物をさらに含有する、安定化され
た液状試薬。 （２）キレート剤としてジエチレントリアミン-N,N,N',
N'',N''-五酢酸を少なくとも含む、上記（１）記載の液
状試薬。 （３）置換α−シクロデキストリンを少なくとも含む、
上記（１）又は（２）記載の液状試薬。 （４）置換α−シクロデキストリンが2,6-ジ-O-メチル-
α-シクロデキストリン及び／又は6-O-α-D-マルトシル
-α-シクロデキストリンである、上記（３）記載の液状
試薬。 （５）アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与
体およびＮ−エチルマレイミドを含み、Ｎ−エチルマレ
イミドの安定化に有効なｐＨを有する液状試薬であっ
て、当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに当該
試薬の安定化に有効な量の6,6'-ジチオジニコチン酸及
び／又はフェロシアン化カリウムをさらに含有する、安
定化された液状試薬。 （６）フェロシアン化カリウムの濃度が0.12mg/100mL以
上である、上記（５）記載の液状試薬。 （７）6,6'-ジチオジニコチン酸の濃度が0.4mmol/L以上
である、上記（５）又は（６）記載の液状試薬。 （８）陰イオン性界面活性剤をさらに含有する、上記
（５）〜（７）のいずれかに記載の液状試薬。
【０００８】また、本発明は、従来成し得なかった長期
の保存が可能である、以下の遊離脂肪酸測定用キットを
提供する。 （９）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の液状試
薬、並びにアシルコエンザイムＡを定量するための試薬
を含む、遊離脂肪酸測定用キット。 （１０）アシルコエンザイムＡを定量するための試薬
が、上記（５）〜（８）のいずれかに記載の液状試薬で
ある、上記（９）記載のキット。 （１１）遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに変換する
反応用の試薬、並びに上記（５）〜（８）のいずれかに
記載の液状試薬を含む、遊離脂肪酸測定用キット。
【０００９】また、本発明は、試薬の製造における以下
の試薬安定化法を提供する。 （１２）コエンザイムＡ、アシルコエンザイムＡシンテ
ターゼおよびＡＴＰを含む試薬溶液に、当該試薬の安定
化に有効な量の１種以上のキレート剤、並びに当該試薬
の安定化に有効な量の、置換α−シクロデキストリン、
マンニトール及びトレハロースからなる群より選択され
る１種以上の化合物を添加することを特徴とする、該試
薬溶液を遊離脂肪酸測定用液状試薬として使用し得る程
度に安定化する方法。 （１３）キレート剤としてジエチレントリアミン-N,N,
N',N'',N''-五酢酸を少なくとも含む、上記（１２）記
載の方法。 （１４）少なくとも置換α−シクロデキストリンを添加
する、上記（１２）又は（１３）記載の方法。 （１５）置換α−シクロデキストリンが2,6-ジ-O-メチ
ル-α-シクロデキストリン及び／又は6-O-α-D-マルト
シル-α-シクロデキストリンである、上記（１４）記載
の方法。 （１６）アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、ペルオキ
シダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供
与体およびＮ−エチルマレイミドを含む試薬溶液に、当
該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに当該試薬の
安定化に有効な量の6,6'-ジチオジニコチン酸及び／又
はフェロシアン化カリウムを添加し、且つ当該溶液をＮ
−エチルマレイミドの安定化に有効なｐＨに調整するこ
とを特徴とする、該試薬溶液を遊離脂肪酸測定用液状試
薬として使用し得る程度に安定化する方法。 （１７）フェロシアン化カリウムの濃度が0.12mg/100mL
以上である、上記（１６）記載の方法。 （１８）6,6'-ジチオジニコチン酸の濃度が0.4mmol/L以
上である、上記（１６）又は（１７）記載の方法。 （１９）陰イオン性界面活性剤をさらに添加することを
特徴とする、上記（１６）〜（１８）のいずれかに記載
の方法。
【００１０】さらに、本発明は、以下の遊離脂肪酸の測
定方法を提供する。 （２０）試料に、上記（１）〜（４）のいずれかの液状
試薬、及びアシルコエンザイムＡを定量するための試薬
を順次添加し、アシルコエンザイムＡ量を計測すること
を特徴とする、試料中の遊離脂肪酸の測定方法。 （２１）アシルコエンザイムＡを定量するための試薬
が、上記（５）〜（８）のいずれかの液状試薬である、
上記（２０）記載の方法。 （２２）試料に、遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに
変換する反応用の試薬、及び上記（５）〜（８）のいず
れかに記載の液状試薬を順次添加し、ペルオキシダーゼ
の反応による発色を計測することを特徴とする、試料中
の遊離脂肪酸の測定方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の第１液状試薬は、Ｃｏ
Ａ、ＡＣＳ、ＡＴＰ及び１種以上のキレート剤に加え、
置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハ
ロースからなる群より選択される１種以上の化合物をさ
らに含有する。第１液状試薬は、ＣｏＡ、ＡＣＳ、ＡＴ
Ｐ及び１種以上のキレート剤でも安定化が可能である
が、置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びト
レハロースからなる群より選択される１種以上の化合物
をさらに含有することで格別に安定化される。ＣｏＡの
濃度は、該溶液が使用される酵素反応に適した範囲であ
れば特に制限はない。本発明に使用されるキレート剤と
しては、一般的に用いられる任意のキレートが使用され
るが、好ましくは、例えば、ジエチレントリアミン-N,
N,N',N'',N''-五酢酸（以下、ＤＴＰＡという）、トリ
エチレンテトラミン-N,N,N',N'',N''',N'''-六酢酸およ
びO,O'-ビス(2-アミノエチル)エチレングリコール-N,N,
N',N'-四酢酸等が使用される。キレート剤としては、１
種の化合物を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合
わせて用いてもよい。より好ましくは、本発明に使用さ
れるキレート剤は少なくともＤＴＰＡを含むものであ
る。キレート剤の濃度は、ＣｏＡを安定化するのに有効
な量であれば特に制限はなく、使用するキレート剤の種
類によっても異なるが、例えば、ＤＴＰＡ単独の場合、
0.1mmol/L以上で且つ保存温度で析出しない濃度が挙げ
られる。ＤＴＰＡは、ＮＥＦＡ測定用の第１液状試薬の
調製に用いられる場合、同時に添加される２価金属イオ
ンより低い濃度であればよい。より好ましくは、ＤＴＰ
Ａの使用濃度は0.25〜10mmol/Lである。
【００１２】第１液状試薬中に含まれる置換α−シクロ
デキストリンの濃度は、0.1〜10g/100mL、好ましくは1
〜5g/100mLである。同様に、マンニトールの濃度は、0.
1〜10g/100mL、好ましくは1〜5g/100mLであり、トレハ
ロースの濃度は、0.1〜10g/100mL、好ましくは1〜5g/10
0mLである。本発明の第１液状試薬に使用される置換α
−シクロデキストリンとしては、１以上の置換基を有す
る任意のα−シクロデキストリンが挙げられる。置換基
としては、炭化水素基（例えば、アルキル、アルケニ
ル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、
シクロアルキニル）、芳香族基（複素環基等を含む）、
糖（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖等（鎖状又は分枝状
でもよい））、アミノ酸（ペプチドを含む）及び脂質等
の任意の天然又は合成化合物の置換基が挙げられるがこ
れらに限定されない。好ましくは、置換α−シクロデキ
ストリンは、2,6-ジ-O-メチル-α-シクロデキストリン
又は6-O-α-D-マルトシル-α-シクロデキストリンであ
る。これら置換α−シクロデキストリン、マンニトール
及びトレハロースは、第１液状試薬中に単独で存在して
もよいし、組み合わされて存在してもよい。尚、ここで
第１液状試薬に関して「安定化に有効な量」とは、例え
ば、実用試験において、液状試薬を苛酷条件下（３７
℃，１６日間）で保存後も液状試薬としての性能を担保
し得るのに有効な量を意味する。また、第１液状試薬に
関して「安定化された」とは、実用試験において液状試
薬を上記苛酷条件下で保存後、調製直後の約６０％、よ
り好ましくは約６５％以上の反応性残存率を保持するこ
とをいい、特に約６５％以上の反応性残存率を保持する
場合に「格別に安定化された」という。この「安定化に
有効な量」は、各化合物に対して個別に考慮されるべき
ではなく、第１液状試薬がそれぞれ異なった量の複数の
化合物を含む場合、それら各化合物の効果の総和により
第１液状試薬の「安定化」が達成されれば「安定化に有
効な量」と解釈する。
【００１３】本発明の第１液状試薬のｐＨは、ＡＣＳの
反応に適した範囲であり、ＣｏＡおよび他の含有成分に
悪影響を及ぼさず、且つキレート剤、並びに置換α−シ
クロデキストリン、マンニトール及びトレハロースから
なる群より選択される１種以上の化合物による該試薬の
安定化に適した範囲である限り特に制限はない。例え
ば、ｐＨは、６．５〜８．０であり、リン酸緩衝液、ト
リス緩衝液、クエン酸緩衝液、グッド(Good's)緩衝液等
のこの範囲に緩衝能を有する緩衝液に各成分を溶解する
ことにより、所望のｐＨを有する第１液状試薬を得るこ
とができる。
【００１４】本発明第１液状試薬中に含まれるＡＣＳお
よびＡＴＰの濃度は、試料中のＮＥＦＡをアシルＣｏＡ
に変換するのに十分な量であれば特に制限はない。ま
た、ＡＣＳは２価カチオン要求性であるので、本発明の
ＮＥＦＡ測定用第一試薬は、Ｍｇ++、Ｍｎ++等の２価金
属イオンをさらに含有する。該２価金属イオンの濃度は
ＣｏＡ含有溶液に添加されるキレート剤よりも高濃度で
あって、ＡＣＳがＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換するの
に十分な濃度であれば特に制限はない。
【００１５】本発明の第２液状試薬は、ＡＣＯ、ペルオ
キシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素
供与体及びＮＥＭを含み、ＮＥＭの安定化に有効なｐＨ
を有し、そして当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、
並びに当該試薬の安定化に有効な量のＤＴＤＮ及び／又
はフェロシアン化カリウムをさらに含有する。第２液状
試薬は、ＡＣＯ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ
の発色性基質である水素供与体及びＮＥＭを含み、ＮＥ
Ｍの安定化に有効なｐＨを有し、そしてＦＡＤを含むこ
とで安定化が可能であるが、ＤＴＤＮ及び／又はフェロ
シアン化カリウムをさらに含有することで格別に安定化
される。ＡＣＯの濃度は、該溶液が使用される酵素反応
に適した範囲であれば特に制限はなく、例えば、１〜２
００Ｕ／ｍＬである。
【００１６】ペルオキシダーゼは過酸化水素を利用して
発色性基質である水素供与体を酸化し得る酵素であれば
特に制限はなく、例えば、西洋ワサビ由来ペルオキシダ
ーゼ（以下、ＨＲＰという）等が挙げられる。水素供与
体はペルオキシダーゼによって酸化され４−アミノアン
チピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリンなどの適
当なカップラーとともに発色物質を生成するものであれ
ば特に制限はなく、例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプ
ロピル−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ
−スルホプロピル−アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−メチル
−Ｎ−スルホプロピル−アニリン、Ｎ−ブチル−Ｎ−ス
ルホプロピル−アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−
スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡ
ＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジ
メチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホ
プロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−
Ｎ−スルホプロピル−ｏ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ
−スルホプロピル−ｐ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシ
ジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキ
シアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルア
ニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯ
Ｓ）、Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＨＡＬＰＳ）、ｐ
−クロロフェノール、ｐ−ブロモフェノール、２，４−
ジクロロフェノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、３，
３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｎ−（３−
スルホプロピル）３，３’，５，５’−テトラメチルベ
ンジジン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−ス
ルホプロピル）−４，４’、４”−トリアミノトリフェ
ニルメタンなどが挙げられる。
【００１７】ＮＥＭの濃度は、ペルオキシダーゼによる
発色の退色防止に有効な量であり、ＡＣＯの反応に悪影
響を及ぼさない限り特に制限はなく、例えば0.1〜20mmo
l/Lである。本発明の第２液状試薬のｐＨは、第２液状
試薬安定化剤を配合することにより酸性側に拡がったＡ
ＣＯの安定ｐＨ範囲内で、ＮＥＭの安定化に有効なｐＨ
に調整される。好ましくは、本発明の第２液状試薬のｐ
Ｈは５．５〜６．８、より好ましくは５．８〜６．４で
あり、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、
グッド(Good's)緩衝液等のこの範囲に緩衝能を有する緩
衝液に各成分を溶解することにより、所望のｐＨを有す
る第２液状試薬を得ることができる。尚、ここで「ＮＥ
Ｍを安定化するのに有効なｐＨ」とは、後述する第２液
状試薬の安定化を達成し得るに十分な程度にＮＥＭの安
定性を担保し得るｐＨを意味する。
【００１８】本発明の第２液状試薬は、必須の安定化剤
としてＦＡＤを含有する。ＦＡＤの使用濃度は第２液状
試薬を安定化するのに有効な量であれば特に制限はない
が、例えば、10μmol/L以上、より好ましくは100〜2000
μmol/Lの濃度が挙げられる。尚、ここで第２液状試薬
に関して「安定化に有効な量」とは、例えば、実用試験
において、液状試薬を苛酷条件下（３７℃，１６日間、
２２日間又は２９日間）で保存後も液状試薬としての性
能を担保し得るのに有効な量を意味する。また、第２液
状試薬に関して「安定化された」とは、実用試験におい
て、液状試薬を３７℃で１６日間保存後、調製直後の約
７０％、好ましくは約７５％、より好ましくは約８０％
以上の反応性残存率を保持することをいい、特に、約７
５％以上の反応性残存率を保持する場合に「格別に安定
化された」という。また、３７℃で２２日間保存後で
は、調製直後の約７０％、好ましくは約７５％、より好
ましくは約８０％以上の反応性残存率を保持することを
いい、特に、約７５％以上の反応性残存率を保持する場
合に「格別に安定化された」という。また、３７℃で２
９日間保存後では、調製直後の約６０％、好ましくは約
６５％以上の反応性残存率を保持することをいい、特
に、約６５％以上の反応性残存率を保持する場合に「格
別に安定化された」という。この「安定化に有効な量」
は、ＦＡＤ単独の効果として考慮されるべきではなく、
第２液状試薬にともに含有されるＤＴＤＮ及び／又はフ
ェロシアン化カリウム（必要に応じてさらに界面活性
剤）との効果の総和により第２液状試薬の「安定化」が
達成されれば「安定化に有効な量」と解釈する。
【００１９】本発明の第２液状試薬は、ＦＡＤに加えて
ＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウムを安定化剤
としてさらに含有する。ＤＴＤＮの使用濃度は、第２液
状試薬を安定化するのに有効な量であれば特に制限はな
く、例えば、0.4mmol/L以上、より好ましくは0.8〜5mmo
l/Lである。フェロシアン化カリウムの使用濃度も第２
液状試薬を安定化するのに有効な量であれば特に制限は
なく、例えば、0.12mg/100mL以上、より好ましくは0.35
〜2.8mg/100mLである。ここで「安定化に有効な量」と
は、上記ＦＡＤについて定義したのと同様であり、これ
らの量は各化合物単独の効果として捉えるべきではな
く、第２液状試薬にともに含有されるＦＡＤとの効果の
総和により、また、ＤＴＤＮとフェロシアン化カリウム
をともに含む場合にはこれら両者とＦＡＤとの効果の総
和により、さらに界面活性剤を含有する場合はさらに界
面活性剤の効果との総和により、第２液状試薬の安定化
が達成されれば、各安定化剤はそれぞれ「安定化に有効
な量」であると解するものとする。
【００２０】好ましくは、本発明の第２液状試薬は、Ｆ
ＡＤに加えてＤＴＤＮとフェロシアン化カリウムの両方
を安定化剤として含有する。
【００２１】好ましい実施態様においては、第２液状試
薬は界面活性剤をさらに含有する。界面活性剤の共存に
より第２液状試薬の安定性がより高められる。界面活性
剤の種類はＡＣＯ及びペルオキシダーゼの反応を阻害し
ない限り特に限定されないが、好ましくは陰イオン性界
面活性剤、より好ましくは、ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンアルキルフェニル
エーテル硫酸、ポリオキシエチレンジアルキルアリルエ
ーテル硫酸、ポリオキシエチレンアルケニルアリルエー
テル硫酸およびそれらの塩であり、これらのうちの１種
を単独で使用してもよいし、２種以上を混合して使用し
てもよい。より具体的には、ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル硫酸塩［例：ハイテノール１８Ｅ（第一工業
製薬（株）製）；エマール２０Ｃおよび２０Ａ，レベノ
ールＷＸ（以上、花王（株）製）］、ポリオキシエチレ
ンアルキルフェニルエーテル硫酸塩［例：ハイテノール
Ｎ−１７（第一工業製薬（株）製）；エマールＮＣ，レ
ベノールＷＺ（以上、花王（株）製）］、ポリオキシエ
チレンジアルキルアリルエーテル硫酸塩［例：ハイテノ
ールＮＥ−１５（第一工業製薬（株）製）］、ポリオキ
シエチレンアルケニルアリルエーテル硫酸塩［例：ハイ
テノールＮＦ−１３（第一工業製薬（株）製）］等が挙
げられる。界面活性剤の使用濃度も第２液状試薬を安定
化するのに有効な量で且つＡＣＯ及びペルオキシダーゼ
の反応及び測定に悪影響を及ぼさない範囲であれば特に
制限はなく、界面活性剤の種類によっても異なるが、例
えば、ハイテノール１８Ｅの場合、50mg/100mL以上、好
ましくは100〜1000mg/100mLである。
【００２２】界面活性剤の添加により、同時に溶液の濁
り防止が達成される。例えば、ハイテノール１８Ｅを用
いた場合、濁り防止効果は50mg/100mL以上で達成され
る。
【００２３】本発明のＮＥＦＡ測定用キットは、本発明
の第１液状試薬、および／または第２液状試薬を含む。
本発明の第１液状試薬または第２液状試薬のいずれか一
方のみを含む場合には、本発明のＮＥＦＡ測定用キット
は、例えば、従来公知のＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換
する反応用の試薬、又は従来公知のアシルＣｏＡを定量
するための試薬とそれぞれ組み合わせてキット化するこ
とができる。従来公知のＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換
する反応用の試薬は、ＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換す
るいかなる試薬でもよいが、ＡＣＳを含有する試薬が好
ましい。また、従来公知のアシルＣｏＡを定量するため
の試薬は、アシルＣｏＡを定量可能であるいかなる試薬
でもよいが、ＡＣＯを含有する試薬が好ましい。この場
合、ＡＣＯの反応により生成する過酸化水素を測定する
ことによりＮＥＦＡの測定が可能となる。過酸化水素は
酸素を消費するセンサーを用いて直接測定してもよい
し、シュウ酸ジエステルを用いた化学発光、あるいはル
ミノールとペルオキシダーゼを用いた化学発光によって
測定してもよい。
【００２４】また、本発明は、試薬溶液をＮＥＦＡ測定
用液状試薬として使用し得る程度に安定化する方法を提
供する。第１液状試薬を安定化する方法は、ＣｏＡ、Ａ
ＣＳ及びＡＴＰを含む試薬溶液に、安定化に有効な量の
１種以上のキレート剤、並びに安定化に有効な量の置換
α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロー
スからなる群より選択される１種以上の化合物を添加す
ることを特徴とする。これらキレート剤、並びに置換α
−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロース
を任意の順番で別々に添加してもよいし、又は一旦他の
溶液中にこれらを溶解し、その後に試薬溶液に添加して
もよい。また添加量は、これらの安定化剤が全体として
試薬溶液を安定化する限り特に制限はなく、例えば、本
発明の第１液状試薬に関して上記したような量が好まし
く用いられる。
【００２５】本発明の第２液状試薬を安定化する方法
は、ＡＣＯ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発
色性基質である水素供与体及びＮＥＭを含む試薬溶液
に、安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに安定化に有効な
量のＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウムを添加
し、且つ当該溶液をＮＥＭの安定化に有効なｐＨに調整
することを特徴とする。これらＦＡＤ、ＤＴＤＮ及びフ
ェロシアン化カリウムを任意の順番で別々に添加しても
よいし、又は一旦他の溶液中にこれらを溶解し、その後
に試薬溶液に添加してもよい。また添加量は、これらの
安定化剤が全体として試薬溶液を安定化する限り特に制
限はなく、例えば、本発明の第２液状試薬に関して上記
したような量が好ましく用いられる。また、ｐＨの調整
は、添加前でも添加後でもよい。
【００２６】本発明のＮＥＦＡ測定方法は、試料に、Ｎ
ＥＦＡをアシルＣｏＡに変換する反応用の試薬、好まし
くは本発明のＮＥＦＡ測定用第１液状試薬を添加して、
試料中のＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換し、次いで、ア
シルＣｏＡを定量するための試薬、好ましくはアシルＣ
ｏＡを酸化して過酸化水素を生成する試薬及び生成した
過酸化水素を定量するための試薬を含んでなる試薬、よ
り好ましくは本発明のＮＥＦＡ測定用第２液状試薬を該
反応液に添加し、生成したアシルＣｏＡ（過酸化水素）
を定量することを特徴とする（但し、少なくとも本発明
のＮＥＦＡ測定用の第１または第２液状試薬のいずれか
一方を使用する）。本発明のＮＥＦＡ測定用の第１また
は第２液状試薬を使用しない場合、ＮＥＦＡをアシルＣ
ｏＡに変換する反応用の試薬、並びにアシルＣｏＡを定
量するための試薬は、それぞれ従来公知のＮＥＦＡ測定
用の第１および第２液状試薬であってよい。
【００２７】本発明のＮＥＦＡ測定の対象となる試料
は、ＮＥＦＡを含有すると考えられる任意の試料であ
る。この試料が、ＮＥＦＡ測定の阻害因子、又は感度、
正確性若しくは再現性を低下させる因子を含む場合、試
料は、かかる因子を除去するために前処理されてもよ
い。この試料としては、血液、血清、血漿、リンパ液、
胆汁、尿、糞便、唾液、体液（精液、膣液、汗、涙液等
を含む）、羊水、滑液、歯肉滲出液、胸膜液、脳室液及
び脳脊髄液等の生体試料、生体組織から抽出により得ら
れた液体試料、並びに生体以外から得られる任意の試料
が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範
囲を何ら限定するものではない。
【００２９】（実施例１ 糖類及びシクロデキストリン
添加による第１液状試薬の安定化）ＮＥＦＡ値 約2300
μEq/Lのコントロール血清〔セラクリアLP（(株)アズウ
ェル製）にＮＥＦＡを添加することにより調製したも
の〕を実用試験のサンプルとして使用した。試験用ＮＥ
ＦＡ測定第１液状試薬として、60mmol/L トリスヒドロ
キシメチルアミノメタン（以下、Trisという）、1.1mmo
l/L 4-アミノアンチピリン、1.2mmol/L アデノシン5'-
三リン酸二ナトリウム三水和物（オリエンタル酵母(株)
製）、1.2mmol/L コエンザイムＡ三リチウム（オリエ
ンタル酵母(株)製）、0.25U/mL ＡＣＳ（旭化成(株)
製）、1mmol/L ＤＴＰＡ（同仁化学(株)製）、1.25mmol
/L 塩化マグネシウムおよび2g/100mLの各種の糖類又は
シクロデキストリンを含有するｐＨ７．６の溶液を調製
し、３７℃で１６日間保存した。ＮＥＦＡ測定第２液状
試薬として、ネスコートNEFA-V2（ＮＥＦＡ測定自動分
析用キット；(株)アズウェル製）のＲ２を、能書に従っ
て用事調製して用いた。各種糖類又はシクロデキストリ
ンを添加した試験用第１液状試薬の反応性は、日立７１
７０自動分析装置を用いて以下のようにして測定した。
試料3μlに第１液状試薬200μlを添加し、３７℃で５分
間反応後、ネスコートNEFA-V2のＲ２ 50μlを添加し
て、さらに３７℃、５分間反応させ、主波長５４６ｎ
ｍ、副波長７００ｎｍで、測光ポイント１６から３４の
吸光度変化を求めた。試験用第１液状試薬の調製当日
と、３７℃にて１６日間保存後のものについて上記操作
により試料を測定し、調製当日の試験用第１液状試薬の
反応性を１００％として、３７℃にて１６日間保存後の
ものの反応率（％）を求めた。結果を表１に示す。表１
の結果から、2,6-ジ-O-メチル-α-シクロデキストリ
ン、6-O-α-D-マルトシル-α-シクロデキストリン等の
置換α-シクロデキストリン、マンニトール及びトレハ
ロースが無添加のコントロールと比較して高い反応性残
存率を保持していることが明らかになった。
【００３０】
【表１】
【００３１】（実施例２ フェロシアン化カリウム添加
による第２液状試薬の安定化）ＮＥＦＡ値 約2300μEq/
Lのコントロール血清〔セラクリアLP（(株)アズウェル
製）にＮＥＦＡを添加することにより調製したもの〕を
実用試験のサンプルとして使用した。ＮＥＦＡ測定第１
液状試薬として、ネスコートNEFA-V2（ＮＥＦＡ測定自
動分析用キット；(株)アズウェル製）のＲ１を、能書に
従って用事調製して用いた。試験用ＮＥＦＡ測定第２液
状試薬として、10mmol/Lリン酸緩衝液、6mg/mL ＴＯＯ
Ｓ、4mmol/L ＮＥＭ、2mmol/L ＦＡＤ、500mg/100mL ハ
イテノール18E、1U/mL ＨＲＰ（東洋紡績(株)製）、60U
/mL ＡＣＯ（旭化成(株)製）、及び0.12〜2.80mg/100mL
フェロシアン化カリウムを含有するｐＨ６．０の溶液
を調製し、３７℃で１６日間保存した。試料3μlにネス
コートNEFA-V2のＲ１ 200μlを添加し、３７℃で５分間
反応後、試験用ＮＥＦＡ測定第２液状試薬50μlを添加
して、さらに３７℃、５分間反応させ、主波長５４６ｎ
ｍ、副波長７００ｎｍで測定ポイント１６から３４の吸
光度変化を求めた。試験用第２液状試薬の調製当日と、
３７℃にて１６日間保存後のものについて上記操作によ
り試料を測定し、調製当日の試験用第２液状試薬の反応
性を１００％として、３７℃にて１６日間保存後のもの
の反応率（％）を求めた。結果を表２に示す。表２の結
果から、フェロシアン化カリウムを第２液状試薬に添加
すると、用量依存的な様式で安定性を向上することが明
らかとなった。
【００３２】
【表２】
【００３３】（実施例３ フェロシアン化カリウム存在
下の各種の化合物添加による第２液状試薬の安定化）Ｎ
ＥＦＡ値 約2300μEq/Lのコントロール血清〔セラクリ
アLP（(株)アズウェル製）にＮＥＦＡを添加することに
より調製したもの〕を実用試験のサンプルとして使用し
た。ＮＥＦＡ測定第１液状試薬として、ネスコートNEFA
-V2（ＮＥＦＡ測定自動分析用キット；(株)アズウェル
製）のＲ１を、能書に従って用事調製して用いた。試験
用ＮＥＦＡ測定第２液状試薬として、10mmol/Lリン酸緩
衝液、6mg/mL ＴＯＯＳ、4mmol/L ＮＥＭ、2mmol/L Ｆ
ＡＤ、500mg/100mL ハイテノール18E、2.80mg/100mL フ
ェロシアン化カリウム、1U/mL ＨＲＰ（東洋紡績(株)
製）、60U/mL ＡＣＯ（旭化成(株)製）、及び1mmol/L
各種の化合物を含有するｐＨ６．０の溶液を調製し、３
７℃で２２日間保存した。試験用ＮＥＦＡ測定第２液状
試薬の反応性を実施例２に記載の方法で測定した。試験
用第２液状試薬の調製当日と、３７℃にて２２日間保存
後のものについて上記操作により試料を測定し、調製当
日の試験用第２液状試薬の反応性を１００％として、３
７℃にて２２日間保存後のものの反応率（％）を求め
た。結果を表３に示す。表３の結果は、ＤＴＤＮの添加
のみが第２液状試薬の安定性を向上させたことを示す。
従って、ＤＴＤＮの上記のような優れた長期間の安定化
効果についてさらに検討した。
【００３４】
【表３】
【００３５】（フェロシアン化カリウム存在下の第２液
状試薬に対するＤＴＤＮの用量依存的な安定化効果）Ｎ
ＥＦＡ値 約2300μEq/Lのコントロール血清〔セラクリ
アLP（(株)アズウェル製）にＮＥＦＡを添加することに
より調製したもの〕を実用試験のサンプルとして使用し
た。ＮＥＦＡ測定第１液状試薬として、ネスコートNEFA
-V2（ＮＥＦＡ測定自動分析用キット；(株)アズウェル
製）のＲ１を、能書に従って用事調製して用いた。試験
用ＮＥＦＡ測定第２液状試薬として、10mmol/Lリン酸緩
衝液、6mg/mL ＴＯＯＳ、4mmol/L ＮＥＭ、2mmol/L Ｆ
ＡＤ、500mg/100mL ハイテノール18E、2.80mg/100mL フ
ェロシアン化カリウム、1U/mL HRP（東洋紡績(株)
製）、60U/mL ＡＣＯ（旭化成(株)製）、及び0.2〜5.0m
mol/L ＤＴＤＮを含有するｐＨ６．０の溶液を調製し、
３７℃で２９日間保存した。試験用ＮＥＦＡ測定第２液
状試薬の反応性を実施例２に記載の方法で測定した。試
験用第２液状試薬の調製当日と、３７℃にて２９日間保
存後のものについて上記操作により試料を測定し、調製
当日の試験用第２液状試薬の反応性を１００％として、
３７℃にて２９日間保存後のものの反応率（％）を求め
た。結果を表４に示す。表４の結果から、ＤＴＤＮが用
量依存的に第２液状試薬を安定化することが明らかにな
った。特に、ＤＴＤＮは、第２液状試薬中、約1.0〜3.0
mmol/Lの濃度で顕著な安定化効果を示すことが明らかと
なった。
【００３６】
【表４】
【００３７】
【発明の効果】上述のように、第１液状試薬安定化剤と
して、１種以上のキレート剤、並びに置換α−シクロデ
キストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群
より選択される１種以上の化合物を第１液状試薬に添加
することにより、ＮＥＦＡ測定における第１液状試薬の
性能を液状で長期にわたって安定化することができる。
また、第２液状試薬安定化剤として、ＦＡＤ、並びにＤ
ＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウムを第２液状試
薬に添加することによりＮＥＦＡ測定における第２液状
試薬の性能を液状で長期にわたって安定化することがで
きる。さらにこれら第１及び第２液状試薬を用いること
により、液状で長期間安定なＮＥＦＡ測定用キットを提
供することが可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 BA11 BB29 BB52 BB54 CA25 CA26 CB01 CB03 CB04 CB07 CB11 CB12 CB14 CB15 DA60 FB01 FB11 GC10 2G054 AA06 AA07 AA08 BA03 BB13 CA21 CE02 CE08 EA01 EA04 EB02 4B063 QA01 QQ22 QQ23 QQ61 QQ73 QQ89 QQ92 QR02 QR03 QR41 QR47 QR50 QR65

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 コエンザイムＡ、アシルコエンザイムＡ
    シンテターゼおよびＡＴＰを含む液状試薬であって、当
    該試薬の安定化に有効な量の１種以上のキレート剤、並
    びに当該試薬の安定化に有効な量の、置換α−シクロデ
    キストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群
    より選択される１種以上の化合物をさらに含有する、安
    定化された液状試薬。
  2. 【請求項２】 キレート剤としてジエチレントリアミン
    -N,N,N',N'',N''-五酢酸を少なくとも含む、請求項１記
    載の液状試薬。
  3. 【請求項３】 置換α−シクロデキストリンを少なくと
    も含む、請求項１又は２記載の液状試薬。
  4. 【請求項４】 置換α−シクロデキストリンが2,6-ジ-O
    -メチル-α-シクロデキストリン及び／又は6-O-α-D-マ
    ルトシル-α-シクロデキストリンである、請求項３記載
    の液状試薬。
  5. 【請求項５】 アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、ペ
    ルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である
    水素供与体およびＮ−エチルマレイミドを含み、Ｎ−エ
    チルマレイミドの安定化に有効なｐＨを有する液状試薬
    であって、当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並び
    に当該試薬の安定化に有効な量の6,6'-ジチオジニコチ
    ン酸及び／又はフェロシアン化カリウムをさらに含有す
    る、安定化された液状試薬。
  6. 【請求項６】 フェロシアン化カリウムの濃度が0.12mg
    /100mL以上である、請求項５記載の液状試薬。
  7. 【請求項７】 6,6'-ジチオジニコチン酸の濃度が0.4mm
    ol/L以上である、請求項５又は６記載の液状試薬。
  8. 【請求項８】 陰イオン性界面活性剤をさらに含有す
    る、請求項５〜７のいずれかに記載の液状試薬。
  9. 【請求項９】 請求項１〜４のいずれかに記載の液状試
    薬、並びにアシルコエンザイムＡを定量するための試薬
    を含む、遊離脂肪酸測定用キット。
  10. 【請求項１０】 アシルコエンザイムＡを定量するため
    の試薬が、請求項５〜８のいずれかに記載の液状試薬で
    ある、請求項９記載のキット。
  11. 【請求項１１】 遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに
    変換する反応用の試薬、並びに請求項５〜８のいずれか
    に記載の液状試薬を含む、遊離脂肪酸測定用キット。
  12. 【請求項１２】 コエンザイムＡ、アシルコエンザイム
    ＡシンテターゼおよびＡＴＰを含む試薬溶液に、当該試
    薬の安定化に有効な量の１種以上のキレート剤、並びに
    当該試薬の安定化に有効な量の、置換α−シクロデキス
    トリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より
    選択される１種以上の化合物を添加することを特徴とす
    る、該試薬溶液を遊離脂肪酸測定用液状試薬として使用
    し得る程度に安定化する方法。
  13. 【請求項１３】 キレート剤としてジエチレントリアミ
    ン-N,N,N',N'',N''-五酢酸を少なくとも含む、請求項１
    ２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 少なくとも置換α−シクロデキストリ
    ンを添加する、請求項１２又は１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 置換α−シクロデキストリンが2,6-ジ
    -O-メチル-α-シクロデキストリン及び／又は6-O-α-D-
    マルトシル-α-シクロデキストリンである、請求項１４
    記載の方法。
  16. 【請求項１６】 アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、
    ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質であ
    る水素供与体およびＮ−エチルマレイミドを含む試薬溶
    液に、当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに当
    該試薬の安定化に有効な量の6,6'-ジチオジニコチン酸
    及び／又はフェロシアン化カリウムを添加し、且つ当該
    溶液をＮ−エチルマレイミドの安定化に有効なｐＨに調
    整することを特徴とする、該試薬溶液を遊離脂肪酸測定
    用液状試薬として使用し得る程度に安定化する方法。
  17. 【請求項１７】 フェロシアン化カリウムの濃度が0.12
    mg/100mL以上である、請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 6,6'-ジチオジニコチン酸の濃度が0.4
    mmol/L以上である、請求項１６又は１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 陰イオン性界面活性剤をさらに添加す
    ることを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれかに記
    載の方法。
  20. 【請求項２０】 試料に、請求項１〜４のいずれかに記
    載の液状試薬、及びアシルコエンザイムＡを定量するた
    めの試薬を順次添加し、アシルコエンザイムＡ量を計測
    することを特徴とする、試料中の遊離脂肪酸の測定方
    法。
  21. 【請求項２１】 アシルコエンザイムＡを定量するため
    の試薬が、請求項５〜８のいずれかに記載の液状試薬で
    ある、請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 試料に、遊離脂肪酸をアシルコエンザ
    イムＡに変換する反応用の試薬、及び請求項５〜８のい
    ずれかに記載の液状試薬を順次添加し、ペルオキシダー
    ゼの反応による発色を計測することを特徴とする、試料
    中の遊離脂肪酸の測定方法。
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