WO1999010526A1 - Methodes de quantification de cholesterol des lipoproteines de haute densite - Google Patents

Description

明 細 書 高比重リポタンパクコレステロールの定量法 技 術 分 野

本発明は、 遠心分離などの操作の必要がなく、 少ない試料で簡便な操 作により効率良く高比重リポタンパク （H D L) 中のコレステロールの みを HD L以外のリポタンパク中のコレステロールと分離して定量する ことのできる方法に関する。 背 景 技 術

コレステロール等の脂質は、 血清中においてアポタンパクと結合し、 リポタンパク質を形成している。 リポタンパク質は物理的な性状の違い により、 カイロミクロン、 超低比重リポタンパク （V L D L) 、 低比重 リポタンパク （ L D L) 、 高比重リポタンパク （H D L) 等に分類され る。 これらのリポタンパク質のうち、 L D Lは動脈硬化を引き起こす原 因物質の一つであり、 一方 H D Lは抗動脈硬化作用を示す事が知られて いる。

疫学的には、 H D L中のコレステロール値は動脈硬化性疾患の発症頻 度と逆相関を示す事が知られており、 今日では、 虚血性心疾患の予防や 診断を目的として H D L中のコレステロールの測定が広く行われている。 H D L中のコレステロールの測定法としては、 たとえば超遠心分離によ つて H D Lを他のリポタンパクと分離した後、 コレステロール測定に供 する方法や、 電気泳動によって分離した後に脂質の染色を行って、 その 発色強度を測定する方法が知られている。 しかしながら、 これらの方法 は、 いずれも、 操作が煩雑であったリ、 多数の検体を処理できないなど の問題があり、 日常的にほとんど用いられていなかった。

現在臨床検査の領域で一般に広く用いられている、 H D L中のコレス テロールの測定方法は、 検体に沈殿剤を加えて H D L以外のリポタンパ クを凝集させ、 これを遠心分離によって取り除き、 分離された H Dしの みを含む上清中のコレステロールを測定する沈殿法である。 この方法 は、 超遠心法や電気泳動法に比較して簡便であるものの、 沈殿剤を加え て分離する操作を含むために、 比較的多量の検体量を要し、 又、 分析誤 差を生じる可能性も高く、 全分析工程を完全に自動化することはできな かった。

—方、 酵素的に H D L中のコレステロールを分別定量する方法も検討 されている。 たとえば、 胆汁酸塩及び非イオン系界面活性剤の存在下に、 酵素反応を行う方法 （特開昭 6 3— 1 2 6 4 9 8号公報） が知られてい る。 この方法は、 反応初期の酵素反応は L D L濃度に比例し、 その後 H D L中のコレステロール濃度に比例することを利用したものであるが、 H D L中のコレステロールと他のリポタンパク質の中のコレステロール の反応を完全に分別することはできず、 正確性に問題があった。

また、 H D L以外のリポタンパク質をあらかじめ凝集させておき、 H D L中のコレステロールのみを酵素的に反応させた後に、 酵素を失活さ せると同時に凝集を再溶解して吸光度を測定するという方法 （特開平 6 - 2 4 2 1 1 0号） が知られている。 しかしながら、 この方法は少なく とも 3回の試薬を添加する操作が必要であるため、 限定された自動分析 装置にしか適用できず、 汎用性の点で問題があった。 また、 沈殿の再溶 解に際しては、 高濃度の塩を使う等、 分析器機に対するダメージや試薬 廃棄の点でも満足できるものではなかった。

更に、 特許第 2 6 0 0 0 6 5号では、 通常の沈殿法に用いられる、 H

D L以外のリポタンパクを沈殿させる沈殿試薬と一般的なコレステロ一 ル測定試薬を組み合わせて使用し、 沈殿しない H D L中のコレステロ一 ルを測定する方法が開示されている。 しかし、 この特許の実施例に従 つて H D L中のコレステロールを測定することは不可能であり、 発明を 構成する要素を錯誤によリ欠落させた特許と考えられるものであって、 先行技術になリ得ないものである。 発 明 の 開 示

本発明者らは血清中のリポタンパク中のコレステロールの測定につい て種々検討していたところ、 リポタンパクを溶解する特定の界面活性剤 の存在下で血清とコレステロール測定用酵素試薬との反応を行えば、 ま ず最初に H D Lコレステロールのみが反応し、 次いで H D Lの反応に遅 れて V L D L中のコレステロールが反応し、 最後にかなり遅れて L D L 中のコレステロールが反応することを知った。

そして、 更に研究を行った結果、 最初の H D Lコレステロール濃度に 依存する反応を測定できるよう測定ポィントを適宜選択することにより、 H D Lコレステロールのみを測定できること、 および系内に血清リポタ ンパク内のコレステロールとコレステロール測定用酵素との反応を阻害 する物質を存在せしめることによリ、 H D Lコレステロールの濃度のみ に依存した反応を長時間にわたって維持できること、 更にこれらの方法 は自動分析装置にも適用できることを見出し、 本発明を完成した。

すなわち、 本発明は、 血清に対し、 ポリオキシエチレンアルキレンフ ェニルエーテル及びポリオキシェチレンアルキレントリベンジルフエ二 ルェ一テルから選ばれる界面活性剤、 ならびにコレステロール測定用酵 素試薬を添加し、 リポタンパク質のうち、 H D L中のコレステロールが 優先的にコレステロール測定用酵素試薬と反応する時間内にそのコレス 亍ロールの反応量を測定することを特徴とする H D Lコレステロールの 定量法を提供するものである。

また、 本発明は、 上記 H D Lコレステロールの定量法において、 更に 血清リポタンパク質中のコレス亍ロールとコレステロール測定用酵素試 薬との反応を阻害する効果を有する物質を加えた方法を提供するもので ある。

更に本発明は、 上記各方法を有利に実施しうる測定用試薬および試薬 キッ トを提供するものである。 図面の簡単な説明

図 1 は、 実施例 1 における本発明方法と沈殿法の分析値の相関関係を 示す図面であり、 図 2は、 実施例 2における本発明方法と沈殿法の分析 値の相関関係を示す図面である。 発明を実施するための最良の形態

本発明方法で用いられるポリォキシエチレンアルキレンフエニルエー テル及びポリォキシエチレンアルキレントリベンジルフエ二ルエーテル から選ばれる界面活性剤 （以下、 「溶解促進性活性剤」 という） は、 リ ポタンパク質を溶解する作用を有する界面活性剤である。 このうち前 者の市販品の例としてはェマルゲン A— 6 0 (花王社製） などが、 後者 の市販品の例としてはェマルゲン B 6 6 (花王社製） 等があげられる。 かかる界面活性剤は、 単独で又は 2種以上を組み合わせて用いる事が できる。 またその使用量は化合物によって異なり、 特に制限されるも のではないが、 試薬を適用すべき分析装置毎に、 望ましい測定時間内に H D Lコレステロールが検出できる感度となるよう、 実験的に定めるこ とができ、 通常は 0 . 0 1 — 5重量％の濃度にて使用するのが好ましし、。 また、 本発明の測定方法においては、 血清リポタンパク質のコレステ ロールとコレス亍ロール測定用酵素試薬との反応を阻害する効果を有す る物質 （以下、 「反応阻害物質」 ） の存在下で行うことが好ましく、 そ うすることにより存在しない場合に比較して、 よリ長時間 H D Lコレス 亍ロールの濃度のみに依存した反応を維持することができる。

本発明で用いられる反応阻害物質としては、 リポタンパク質に結合親 和性を示す物質やリポタンパク質を溶解しない界面活性剤が挙げられ、 それぞれ単独であるいは複数の物質を組み合わせて用いることができる。 リポタンパク質に結合親和性を示す物質 （以下、 「結合性物質」 とい う） の例としては、 ポリア二オンと 2価金属塩を生成する物質の組み合 わせを挙げることができる力 これは H D Lとも結合し沈殿を生じるよ うな物質であってもかまわない。 具体的なポリア二オンの例としては、 デキストラン硫酸、 リンタングステン酸、 へパリン等が、 2価金属塩を 生成する物質の例としては、 M g C I ₂、 C a C I ₂、 M n C I ₂、 N i C I ₂等の 2価金属の塩化物やこれらの水和物等が挙げられる。 これら の結合性物質は、 単独で又は 2種以上を組み合わせて用いることができ、 またその使用量は物質の種類によって異なり、 特に限定されるものでは ないが、 反応終濃度として、 ポリア二オンの場合には 0 . 0◦ 2— 1 0 重量％、 2価金属塩を生成する物質の場合には 0 . 0 1 — 5重量％とな る範囲で用いるのが望ましい。

また、 リポタンパク質を溶解しない界面活性剤 （以下、 「溶解阻害性 活性剤」 という） としては、 例えばポリオキシエチレンアルキルエーテ ル、 ポリオキシエチレンアルキルフエニル一テル、 ポリオキシエチレン —ポリオキシプロピレン縮合物、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル 硫酸塩、 アルキルベンゼンスルホン酸塩等から選ばれる界面活性剤が挙 げられる。

これらのうち、 ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、 ポリ ォキシエチレンセチルエーテル （市販品としてはェマルゲン 2 2 0 (花 王社製） 等） が； ポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテルとして は、 ポリオキシエチレンノニルフエニルェ一テル （市販品としてはエマ ルゲン 9 1 3 (花王社製） 等） が； ポリオキシエチレン一ポリオキシプ ロピレン縮合物としてはプル口ニック F— 8 8 (旭電化社製） が； ポリ ォキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩としてはポリォキシエチレンラ ゥリルエーテル硫酸ナトリウム （市販品としてはエマール 2 0 C (花王 社製） 等） が； アルキルベンゼンスルホン酸塩としてはドデシルペンゼ ンスルホン酸ナトリゥ厶が好ましい。

これらの溶解阻害性活性剤は、 1種又は 2種以上を組み合わせて用い る事ができ、 その使用量は特に限定されないが、 試料と混合したときの 濃度が 0 . 0 1 — 5重量％、 特に 0 . 0 5— 1重量％になるような範囲で 用いるのが望ましい。

溶解促進性活性剤とコレステロール測定用酵素試薬 （以下、 「コレス テロール試薬」 という） を検体である血清へ添加するに際しては、 それ ぞれを別途添加しても、 また混合物として同時に添加してもよい。 ま た、 反応阻害物質は、 溶解促進性活性剤とコレステロール試薬のいずれ かまたはこれらの混合物に添加して用いることができる。 更に、 複数の 反応阻害物質を使用する場合は、 混合して単独の場合と同様に用いられ るほか、 溶解促進性活性剤とコレス亍ロール試薬にそれぞれ別に添加し て用いてもよい。

本発明のコレステロールの測定のために用いるコレステロール試薬と しては、 公知の酵素試薬、 例えばコレステロールエステラーゼ及ぴコレ ステロ一ルォキシダ一ゼの組み合わせ、 コレステロールエステラーゼ及 ぴコレステロールデヒ ドロゲナーゼの組み合わせ等が挙げられる。 これ らのうち、 コレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダ一 ゼの組み合わせが好ましい。

更に、 これらのコレステロール試薬を添加した後、 最終的にコレス亍 ロールの反応量を測定するために用いる方法は特に制限されず、 例えば パーォキシダーゼと色原体をさらに組み合わせて行う吸光度分析、 補酵 素や過酸化水素を直接検出する方法等が挙げられる。

本発明方法においては、 H D Lのコレステロールが優先的にコレス亍 口一ル測定用酵素試薬と反応する時間内にその反応を検出する必要があ るが、 そのためには溶解促進性活性剤とコレステロール試薬と試料とを 混合した後の、 進行する反応を動力学的にモニターする方法や、 H D L コレステロールの反応を反応終末点法で測定してブランク値にて補正す る方法 （2ポイント法） 等を用いることができる。 また、 H D Lの反応 をより長くモニターする必要がある場合には、 反応阻害物質を添加し、 コレステロールの検出反応を遅延させる事によって、 H D Lコレステロ ール濃度のみに依存する反応を延長させることができる。

本発明方法を有利に実施するために利用される試薬ないし試薬キッ 卜 としては、 例えば次のものを挙げることができる。

( 1 ) 次の 2成分 （ィ） および （口） を含有するもの。

(ィ） 溶解促進性活性剤

(口） コ レステロール試薬

( 2 ) 次の成分 （ィ） 〜 （ハ） 、

(ィ） 溶解促進性活性剤

(口） 反応阻害物質 （結合性物質、 溶解阻害性活性剤）

(ハ） コレステロール試薬

このような試薬や試薬キッ トには、 前記の溶解促進性活性剤、 コレス 亍ロール試薬 （コレステロールエステラーゼ、 コレステロールォキシダ —ゼ、 コレステロールエステラーゼ、 コレステロールデヒ ドロゲナーゼ 等） 、 反応阻害物質 （結合性物質、 溶解阻害性活性剤） 、 バーオキシダ ーゼ、 色原体、 補酵素等の他、 適当な P H緩衝剤、 酸化防止剤、 担体等 を組み合わせることができる。 また、 試薬や試薬キッ トの形状として も、 液体状のものの他、 これを凍結乾燥したもの等が利用できる。 実 施 例

次に、 実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、 本発明はこれに何 ら制約されるものではない。 実 施 例 1

リポタンパク質を含む 5 0例の血清検体について、 以下の本発明方法 及び従来の沈殿法により、 H D L中のコレステロールを定量し、 これら の測定値を比較した。

本発明方法は、 各血清検体 3 I に、 1 00 1\1の[\1£ 3緩衝液 （第 一試薬 p H 6. 5 ) 3 0 0 ju I を添加し、 約 5分後に、 ェマルゲン B - 6 6 1 %、 コ レステロールエステラーゼ 1 UZm I 、 コ レステロ一 ルォキシダーゼ 1 U m I 、 パーォキシダ一ゼ 5 U Zm I 及びジスル フホブチルメタ トルイジン 〇. 0 4 <½、 4ーァミノアンチピリン 0. 0 0 4 %を含む 1 0 0 m Mの M E S緩衝液 （p H 6 . 5 ) 力、らなるコレス 亍ロール測定試薬 （第二試薬） 1 0 0 I を加え、 第二試薬直前と添加 後 5分後の 6 0 0 n m (副波長 7 0 0 n m) における吸光度を測定し、 その差より血清検体中の H D Lコレステロール濃度を求めた （2ポイン ト法） 。 また、 較正用物質として濃度既知のコントロール血清を用い た。 なお、 以上の操作は、 日立フ 1 5 0型自動分析装置を用いて行つ た。

—方、 沈殿法により H D L中のコ レステロールを測定するには、 デキ ストラン硫酸 0. 3%及び塩化マグネシウム 2%を含む水溶液 200 μ I を検体 200 I と混和し、 3000 r p mで 1 0分間遠心分離 を行った。 この上清 50 μ I を採取し、 T r i t o n X— 1 00 1 %、 コレステロールエステラーゼ 1 UZm i 、 コレステロールォキシダー ゼ 1 UZm I 、 パー才キシダーゼ 5 U/m I 及びジスルフホブチルメ タ トルイジン 0. 04%、 4一ァミノアンチピリン 0. 004%を含む 1 00 mMの M E S緩衝液 （ p H 6. 5) 力、らなるコレステロール測定 試薬 3 m I と混合し、 37 °Cで 1 0分間インキュベートした後、 600 n mにおける吸光度を測定し、 H D L中のコレステロール濃度を求めた。 本発明法と沈殿法による結果の相関図を図 1 に示すが、 本発明方法は 簡便な操作であるにもかかわらず、 従来の沈殿法と極めて良好な相関を 示していた。 実 施 例 2

第二試薬中のエマルゲン B— 66の代わりにェマルゲン A— 60 1

%を添加した以外は実施例 1 と同一の試薬を用い、 同一の方法でリポタ ンパク質を含む 50例の血清検体について、 H D L中のコレステロ一ル を定量した。

即ち、 検体 3 μ I に第一試薬 300 ^ 1 を添加し、 約 5分後、 第二試 薬 1 00 ;u l を加えた。 第 2試薬添加後、 1 2秒後から 24秒後まで の 546 n m (副波長 660 n m) における吸光度変化を測定し、 血 清検体中の H D Lコレステロール濃度を求めた。 また、 較正用物質と しては濃度既知の 2種類のコントロール血清 （低濃度と高濃度） を使用 した。 なお、 以上の操作は、 日立 7 1 50型自動分析装置を用いて行 つた。

また、 同じ検体について、 従来の沈殿法で実施例 1 と同様に、 H D L 中のコレステロールを定量し、 これらの測定値を比較した。 この結果 を図 2に示す。

図 2の結果から、 本発明方法は簡便な操作であるにもかかわらず、 従 来の沈殿法と良好な相関を示した。 実 施 例 3

実施例 2において用いたのと同一の第二試薬と、 下記の第一試薬を用 し、、 リポタンパク質を含む 50例の血清検体について、 本発明方法及び 従来の沈殿法により、 H D L中のコレステロールを定量し、 これらの測 定値を比較した。 なお、 第一試薬 A (実施例 2と同じ） は対照として 加えた。

[ 第一試薬 ]

第一試薬 A ：

1 00 mMの M E S緩衝液 （ p H 6. 5 )

第一試薬 B _:

プル口ニック F— 88 (旭電化社製） 0. 2%水溶液

第一試薬 C ：

リンタングステン酸ナトリウム 0. 2%及び塩化マグネシウム 1 00m Mを含む水溶液 （ p H 6. 4 )

第一試薬 D ：

プル口ニック F— 8 8 0. 2%、 リンタングステン酸ナトリウム 0. 20/₀及び塩化マグネシウム 1 O OmMを含む水溶液 （ p H 6. 4) 吸光度の測定は、 反応阻害物質の添加の効果を確認するため、 日立 7 50を用いて第二試薬添加後 1 2秒から 24秒後、 1 2秒後から 1 6 8秒後及び 1 2秒後から 3 1 2秒後のそれぞれ異なる測光時間を用いて 測定を行った。

一方、 沈殿法による H D Lの測定は実施例 1 と同様に行い、 各条件で の本発明方法との相関関係を調べた。 この相関係数を表 1 に示す。

表 1

この結果に示されるように、 反応阻害物質を含まない第一試薬では、 反応初期の吸光度測定でのみ良好な結果を示した。 一方、 反応阻害物 質を含むプル口ニック F— 88 (旭電化社製） 0. 2%水溶液、 リンタ ングステン酸ナトリウム 0. 2 %及び塩化マグネシウム 1 00mMを 含む水溶液 （P H 6. 4) 並びにプル口ニック F— 8 8 0. 2%、 リン タングステン酸ナトリウム 0. 2%及び塩化マグネシウム 1 00mM を含む水溶液 （p H 6. 4) をそれぞれ第一試薬として用いた測定結果 では、 長時間の測定でいずれも良好な相関 （ 1 に近いほど相関性が高 し、） を示し、 反応阻害物質が、 H D Lコ レステロール量に依存する反応 を延長する効果があることが確認された。 産業上の利用可能性

本発明によれば、 遠心分離などの前処理の必要がなく、 簡便な操作で 効率良く H D L中のコレステロールを定量する事ができる。 また、 少 ない試料で、 簡便な操作により、 特異的な測定が可能であるため、 種々 の自動分析装置に適用でき、 臨床検査の領域において極めて有用である _c

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 血清に対し、 ポリオキシエチレンアルキレンフヱニルエーテル及 びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフエ二ルェ一テルから選 ばれる界面活性剤、 ならびにコレステロール測定用酵素試薬を添加し、 リポタンパク質のうち、 高比重リポタンパク質中のコレステロールが優 先的にコレステロール測定用酵素試薬と反応する時間内にそのコレステ ロールの反応量を測定することを特徴とする高比重リポタンパク質コレ ステロールの定量法。

2 . 血清に対し、 ポリ才キシエチレンアルキレンフエニルエーテル及 びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフエニルェ一テルから選 ばれる界面活性剤、 血清リポタンパク質中のコレステロールとコレス亍 ロール測定用酵素試薬との反応を阻害する効果を有する物質、 ならびに コレステロール測定用酵素試薬を添加し、 リポタンパク質のうち、 高比 重リボタンパク質中のコレス亍ロールが優先的にコレステロール測定用 酵素試薬と反応する時間内にそのコレス亍ロールの反応量を測定するこ とを特徴とする高比重リポタンパク質コレステロールの定量法。

3 . 血清リポタンパク質中のコレステロールとコレステロ一ル測定用 酵素試薬との反応を阻害する効果を有す物質がリポタンパク質を溶解し ない界面活性剤又はポリア二オンと 2価金属イオンを生成する物質の組 み合わせである請求項 2記載の高比重リポタンパク質コレステロールの 定量法。

4 . 次の成分 （ィ） および （口） 、

(ィ） ポリォキシエチレンアルキレンフヱニルエーテル及びポリオキ シエチレンアルキレントリベンジルフエニルェ一テルから選ばれ る界面活性剤

(口） コレステロール測定用酵素試薬 を含有する高比重リポ蛋白質コレステロール測定用試薬もしくは試薬キ ッ 卜。

5 . 次の成分 （ィ） ~ (ハ） 、

(ィ） ポリオキシエチレンアルキレンフエニルエーテル及びポリオキ シエチレンアルキレントリベンジルフヱニルェ一テルから選ばれ る界面活性剤

(口） 血清リポタンパク質中のコレステロールとコレステロール測定 用酵素との反応を阻害する効果を有する物質

(ハ） コ レステロール測定用酵素試薬

を含有する高比重リポ蛋白質コレステロール測定用試薬もしくは試薬キ ッ 卜。