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WO1999060117A2 - Polypeptide prax-1 - Google Patents

Polypeptide prax-1 Download PDF

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Publication number
WO1999060117A2
WO1999060117A2 PCT/FR1999/001070 FR9901070W WO9960117A2 WO 1999060117 A2 WO1999060117 A2 WO 1999060117A2 FR 9901070 W FR9901070 W FR 9901070W WO 9960117 A2 WO9960117 A2 WO 9960117A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
gct
prax
sequence
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1999/001070
Other languages
English (en)
Other versions
WO1999060117A3 (fr
Inventor
Pierre Casellas
Sylvaine Galiegue
Omar Jbilo
Gérard Le Fur
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis France
Original Assignee
Sanofi Synthelabo SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Synthelabo SA filed Critical Sanofi Synthelabo SA
Priority to AU35285/99A priority Critical patent/AU3528599A/en
Publication of WO1999060117A2 publication Critical patent/WO1999060117A2/fr
Publication of WO1999060117A3 publication Critical patent/WO1999060117A3/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • PRAX-1 polypeptide The invention relates to a new nucleic acid sequence and the corresponding protein sequence.
  • the invention also relates to the prophylactic, therapeutic and diagnostic applications thereof.
  • the authors of the present invention have identified the transcript of a new gene as well as the corresponding protein.
  • This PRAX-1 gene was isolated by the double hybrid technique as coding for a protein interacting specifically with the peripheral benzodiazepine receptor (PBR).
  • PBR peripheral benzodiazepine receptor
  • the present invention therefore relates to a purified protein PRAX-1, or biologically active fragments thereof.
  • the invention also relates to isolated nucleic acid sequences encoding said protein or its biologically active fragments and to specific oligonucleotides obtained from this sequence. It further relates to the cloning and / or expression vectors containing at least one of the nucleotide sequences defined above, and the host cells transfected with these cloning and / or expression vectors under conditions permitting repiication. and / or the expression of one of said nucleotide sequences.
  • Methods of producing recombinant PRAX-1 proteins or its biologically active fragments by transfected host cells are also part of the invention.
  • the invention also includes antibodies or antibody derivatives specific for the proteins defined above.
  • the invention also relates to any inhibitor or activator of the specific activity of PRAX-1, but also of any protein-protein interaction involving PRAX-1.
  • oligonucleotide sequences specific for the above nucleic acid sequences, which can modulate the expression of the PRAX-1 gene in vivo. It relates to oligonucleotide sequences defined from the nucleic acid sequences above, probe or primer usable in the diagnosis of pathologies where PRAX-1 is involved.
  • the invention finally relates to the use in a method of gene therapy of a nucleotide sequence according to the invention, in which vectors such as for example inactivated viral vectors capable of transferring coding sequences for a protein according to the invention are injected into cells deficient for this protein.
  • vectors such as for example inactivated viral vectors capable of transferring coding sequences for a protein according to the invention are injected into cells deficient for this protein.
  • the subject of the present invention is a purified polypeptide whose amino acid sequence is the sequence SEQ ID No. 2 or any biologically active sequence derived from SEQ ID No. 2.
  • - PRAX-1 protein a polypeptide comprising an amino acid sequence chosen from the sequence SEQ ID No. 2 or any fragment or derivative thereof biologically active.
  • - biologically active capable of interacting with the peripheral benzodiazepine receptor.
  • immunologically related capable of being recognized by the antibodies specific for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 and / or capable of inducing antibodies which recognize this polypeptide.
  • the manufacture of derivatives can have different objectives, including in particular that of improving its production rates, of increasing its resistance to proteases, of modifying its biological activities or of imparting to it new pharmaceutical and / or biological properties.
  • the invention relates to a polypeptide comprising the interaction domain with PBR of one of the preceding polypeptides.
  • This domain corresponds to the sequence between residue 1564 and residue 1857 of the sequence SEQ ID No. 2.
  • Genban with access number AF039571.
  • the present invention also relates to the nucleic acid sequences coding for a PRAX-1 protein or biologically active fragments or derivatives thereof.
  • the subject of the invention is isolated nucleic acid sequences chosen from: a) the sequence SEQ ID No. 1, b) the sequence complementary to the sequence SEQ ID No. 1, c) the acid sequences nucleic acid capable of specifically hybridizing to the sequence SEQ ID No. 1 or their complementary sequences, or of hybridizing specifically to their proximal sequences, d) the sequences derived from the sequences a), b) and c), owing to the fact degeneration of the genetic code.
  • the subject of the invention is the nucleotide sequence SEQ ID No. 1 corresponding to the cDNA of the human protein of sequence SEQ ID No. 2.
  • the different nucleotide sequences of the invention can be of artificial origin or not. They may be DNA or RNA sequences, obtained by screening of sequence banks using probes prepared on the basis of the sequence SEQ ID No. 1. Such libraries can be prepared by conventional techniques. molecular biology, known to those skilled in the art.
  • nucleotide sequences according to the invention can also be prepared by chemical synthesis, or also by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening libraries. These nucleotide sequences allow the production of nucleotide probes, capable of hybridizing strongly and specifically with a nucleic acid sequence, of a genomic DNA or of a messenger RNA, coding for the polypeptide according to the invention or a biologically fragment active of it. Such probes are also part of the invention.
  • polypeptides of the invention can be used as an in vitro diagnostic tool for the detection, by hybridization experiments, of specific transcripts of the polypeptides of the invention in biological samples or for the detection of aberrant syntheses or genetic anomalies at the level nucleic acid sequences encoding a polypeptide as defined above such as loss of heterozygosity or genetic rearrangement, resulting from polymorphism, mutations or different splicing.
  • a nucleotide probe according to the invention is brought into contact with a biological sample under conditions allowing the formation of a hybridization complex between the probe and the nucleotide sequence of interest, possibly after a preliminary step of amplification of said nucleotide sequence; the hybridization complex possibly formed is detected and the nucleotide sequence forming the hybridization complex with the probe of the invention is optionally sequenced.
  • the nucleotide sequences of the invention can also be used for the manufacture of a medicament useful in gene therapy.
  • the probes of the invention comprise at least 10, preferably at least 16 nuciototides, and at most comprise the entire sequence of the PRAX-1 gene or of its cDNA contained for example in a cosmid.
  • the appropriate hybridization conditions correspond to the stringent conditions usually used by those skilled in the art, in particular of high stringency as defined by Sambrook et al. in Molecular Cloning, a laboratory manual, 2 edition,
  • the temperature used is preferably between T m -5 ° C to T m -30 ° C, more preferably between Tm -5 ° C and T m -10 ° C, T being the temperature melting point, the temperature at which 50% of the paired DNA strands separate.
  • the hybridization conditions used are as follows - temperature: 65 ° C., - hybridization buffer: BSA 1%, SDS 7% NaH2 ⁇ 4 0.5M, EDTA 1 mM, as described in the example VII.
  • these probes are represented by the following oligonucleotides as well as the corresponding complementary sequence nucleotides:
  • SEQ ID No. 20 TCC GGG TCA CAG GCT ATG CCA T
  • SEQ ID No. 26 CCA GTG AGG TAG AGG AGC TGG
  • SEQ ID No. 27 TCC ATT CCC CAG CCT TGC CGG GG
  • SEQ ID No. 28 GCT CGA AGA ACA GTG CCG CAG CC
  • SEQ ID # 30 GCT GGA ATC GGA GCT CAG CAA G
  • SEQ ID No. 36 ATG GAG CCA TGG GCA CTG CCC
  • the probes of the invention are marked, prior to their use. For this, several techniques are within the reach of those skilled in the art
  • the in vitro diagnostic methods in which these nucleotide probes are used are included in the subject of the present invention. These methods relate, for example, to the detection of abnormal syntheses (eg accumulation of transcripts) or genetic abnormalities, such as loss of heterozygosity and genetic rearrangement, and point mutations in the nucleotide sequences of nucleic acids. coding for a protein
  • nucleotide sequences of the invention are also useful for the manufacture and use of oligonucleotide primers for specific sequencing or amplification reactions according to the so-called PCR technique or any variant thereof (Ligase Chain Reaction (LCR) ), .
  • Preferred pairs of primers are constituted by primers advantageously of at least 16 nucleotides, chosen from the nucleotide sequence:
  • SEQ ID No. 1 human sequence of 7033 nuciotides.
  • these primers are represented by the following pairs: - couple n ° 1: sense primer: GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC (SEQ ID n ° 3) antisense primer: AAC TTG AAT CCA ATG AGC AA (SEQ ID n ° 4)
  • sense primer TCT GCT GAC CTG AAA GCT CC (SEQ ID n ° 5)
  • antisense primer TCC TCC TGA GGA GCT GCT TC (SEQ ID n ° 8)
  • sense primer TTG ACC AAG GTC ACT GAG CC (SEQ ID n ° 10) antisense primer: AAC TTG AAT CCA ATG AGC AA (SEQ ID n ° 4)
  • sense primer GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC (SEQ ID n ° 3) antisense primer: GCC ATC GGC ATC CTT GTC CC (SEQ ID n ° 12)
  • sense primer GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC (SEQ ID n ° 3)
  • antisense primer TCC TCC TGA GGA GCT GCT TC (SEQ ID n ° 8) "sense" primers ranging from 5 'to 3 'and the 3' to 5 '"anti-sense” primers.
  • PRAX-1 as a new protein can be considered according to the invention as a new element integrating gene therapy.
  • the nucleotide sequences encoding the PRAX-1 protein can be transferred to target cells via inactivated viral vectors.
  • the prospect of using this protein in a gene therapy treatment comes first from the chromosomal localization of the human gene coding for this protein. Located on chromosome 17 in the q22-q23 region, this gene is associated with markers of serious pathologies affecting the central nervous or immune system (neuroblastomas or leukemias).
  • this protein in gene therapy is also entirely possible according to the invention if we consider the particular expression of this protein associated with three major systems in the body: - the central nervous system, the expression of this new protein is predominant in the brain. Its expression is associated with certain well-defined brain regions.
  • the expression profile of the protein in the thymus is quite remarkable.
  • nucleotide sequences according to the invention can moreover be used for the production of PRAX-1 recombinant proteins, according to the definition which has been given to this term.
  • proteins can be produced from the nucleotide sequences defined above, according to techniques for the production of recombinant products known to those skilled in the art.
  • the nucleotide sequence used is placed under the control of signals allowing its transcription and expression in a cellular host.
  • An efficient system for producing a recombinant protein requires a vector, for example of plasmid or viral origin, and a compatible host cell.
  • the cell host can be chosen from prokaryotic systems, such as bacteria, or eukaryotic systems, such as, for example, yeasts, insect or mammalian cells, in particular CHO (Chinese hamster ovary cells) or any other system advantageously available.
  • a preferred cellular host for the expression of the proteins of the invention consists of the bacterium E. coli, in particular the strain MC 1061 (Clontech).
  • the vector must include a promoter, translation initiation and termination signals, as well as the appropriate regions for transcription regulation. It must be able to be maintained stably in the cell and may possibly have particular signals specifying the secretion of the translated protein. These different control signals are chosen according to the cellular host used.
  • nucleotide sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or integrative vectors of the chosen host.
  • vectors will be prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods, such as, for example, electroporation.
  • Cloning and / or expression vectors containing at least one of the nucleotide sequences defined above also form part of the present invention.
  • a cloning and expression vector used is the plasmid pZeoSV2 (+) (Invitrogen, V850-01) which contains both the elements necessary for its use as a cloning vector in E. coli (origin of replication in E. coli and Zeocin resistance gene), and as an expression vector in animal cells (promoter, polyadenylation signal, origin of replication of the SV40 virus), as well as the elements allowing its single-strand copying for the purpose of sequencing ( origin of replication of phage f1).
  • the proteins of the invention are in the form of fusion proteins, in particular in the form of protein fused with glutathione S-transferase (GST).
  • GST glutathione S-transferase
  • An expression vector designated in this case is represented by the plasmid vector pGEX-4T-2 (Pharmacia ref-27.4581 -01).
  • the invention further relates to host cells transfected with these preceding vectors. These cells can be obtained by introducing into host cells a nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then culturing said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.
  • These cells can be used in a method for producing a recombinant polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 or any fragment or biologically active derivative thereof.
  • the method for producing a polypeptide of the invention in recombinant form is itself included in the present invention, and is characterized in that the transfected cells are cultured under conditions allowing the expression of a recombinant polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 or any biologically active fragment or derivative thereof, and that said recombinant polypeptide is recovered.
  • the purification methods used are known to those skilled in the art.
  • the recombinant polypeptide can be purified from cell lysates and extracts, from the culture medium supernatant, by methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immunoaffinity techniques using '' specific mono or polyclonal antibodies, etc.
  • a preferred variant consists in producing a recombinant polypeptide fused to a "carrier" protein (chimeric protein).
  • carrier chimeric protein
  • the polypeptides of the invention are fused with glutathione S-transferase in the N-terminal position ("GST" Pharmacia system).
  • GST glutathione S-transferase
  • the fusion product is in this case detected and quantified thanks to the enzymatic activity of GST.
  • the color reagent used is a glutathione acceptor, a substrate for GST.
  • the recombinant product is purified on a chromatography support to which glutathione molecules have previously been coupled.
  • Mono or polyclonal antibodies specifically directed against a PRAX-1 protein according to the definition given above also form part of the invention.
  • Polyclonal antibodies can be obtained from the serum of an animal immunized against the protein, produced for example by genetic recombination according to the method described above, according to the usual procedures.
  • the monoclonal antibodies can be obtained according to the conventional method of culture of hybridomas described by Kôhler and Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497.
  • Advantageous antibodies are antibodies directed against epitopes located in the region between residue 1564 and residue 1857 for the sequence SEQ ID No. 2.
  • the antibodies according to the invention can be in the form of immunoconjugates or labeled antibodies.
  • the antibodies of the invention in particular the monoclonal antibodies, can also be used for the detection of these polypeptides in a biological sample. They thus constitute a means of immunocytochemical or immunohistochemical analysis of the expression of the protein PRAX-1 on sections of specific tissues, for example by immunofluorescence, gold labeling, enzyme immunoconjugates.
  • the antibodies of the invention can be advantageously used in any situation where the expression of a PRAX-1 protein must be observed.
  • the invention therefore also relates to a method of in vitro diagnosis of pathological conditions correlated with an abnormal expression or accumulation of PRAX-1 proteins, from a biological sample, characterized in that at least one contact is made an antibody of the invention with said biological sample, under conditions allowing the possible formation of specific immunological complexes between a PRAX-1 protein and the said antibody or antibodies and in that the specific immunological complexes possibly formed are quantitatively detected.
  • the invention also relates to a kit for the in vitro diagnosis of an abnormal expression or accumulation of the protein PRAX-1 in a biological sample and / or for the measurement of the level of expression thereof in said sample comprising: - at least one antibody specific for the PRAX-1 protein, optionally attached to a support,
  • the invention also relates to any method of diagnosis by the demonstration in the serum of an individual, of autoantibodies directed against the protein PRAX-1.
  • Such an early diagnosis method is characterized in that a serum sample taken from an individual is brought into contact with a polypeptide of the invention, optionally attached to a support, under conditions allowing the formation of specific immunological complexes between said polypeptide and the autoantibodies possibly present in the serum sample, and in that the specific immunological complexes possibly formed are detected.
  • the PRAX-1 protein can indeed be considered as a diagnostic element for pathologies occurring in the systems where it is expressed and finds its functionality, in particular the immune, central nervous and endocrine systems.
  • the invention also relates to a method for determining an allelic variability, a mutation, a deletion, an insertion, a loss of heterozygosity or a genetic abnormality of the PRAX-1 gene. , which can be involved in pathologies, characterized in that it uses at least one nucleotide sequence described above.
  • a method comprising a preferred method is preferred.
  • the PRAX-1 protein can finally be envisaged according to the invention as a new pharmacological target by its function involving the peripheral benzodiazepine receptor (PBR). It can in fact be the target of molecules defined to interfere, to modulate the ability of this protein to interact with PBR and thus modify its function.
  • PBR peripheral benzodiazepine receptor
  • the invention also includes pharmaceutical compositions comprising as active ingredient a polypeptide corresponding to the preceding definitions, preferably in soluble form, associated with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • compositions are intended to be administered to subjects having an expression deficient in protein PRAX-1, associated with pathological conditions or having a pathological condition involving PRAX-1 or its receptor.
  • the pharmaceutical compositions of the invention may also contain an inhibitor or inactivator of the activity of PRAX-1 and of any protein-protein interaction involving PRAX-1, in particular a polypeptide derived from a polypeptide as defined above.
  • compositions can be administered systemically, preferably intravenously, intramuscularly, intradermally or orally.
  • dosages and dosage forms can be determined according to the criteria generally taken into account in establishing a therapeutic treatment adapted to a patient such as for example the patient's age or body weight, the severity of general condition, tolerance to treatment and observed side effects, etc.
  • the double hybrid technique is a method of cloning by interaction in vivo in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the object of this technique is to detect protein-protein interactions in vivo and search for the protein partners of a given protein used as bait.
  • the bait used is defined on the protein sequence of PBR. Definition of PBR bait should be limited to regions hydrophilic protein according to the constraints of the double hybrid technique. As the PBR protein is strongly hydrophobic, with 5 transmembrane regions, located on the external mitochondrial membrane, we define the PBR bait from the C-terminal motif of the protein, a region demonstrated cytosolic and accessible to possible protein partners by l existence of an anti-PBR monoclonal antibody directed against this region of the protein. A PBR bait constructed on the basis of this C-terminal motif, by juxtaposition three times of the 14 C-terminal amino acids of PBR was selected.
  • the PBR bait is a synthetic construct which juxtaposes three times the C-terminal motif of PBR, domain aa156 to 169, separated by glycine linkers: protein sequence bait:
  • the nucleotide sequence coding for the PBR bait is cloned into the vector pGBT9 (Clontech) at EcoRI and Xhol sites.
  • the HF7c line is first transformed by the bait plasmid then by the chosen fusion bank (fetal brain, Matchmaker library, Clontech) according to the method defined by Schiestl et al. Curr. Genet., 1989, 16, 339-346.
  • the double hybrid screening is carried out on 2.10 cells.
  • the HIS + and LacZ + clones are identified and tested for their specificity by replacing the PBR bait with other non-relevant constructions. Selection and specificity tests, carried out under the conditions defined in
  • the insert contained in each of the clones is sequenced with the ABI PRISM Dye Terminator cycle sequencing Ready reaction Kit, according to the instructions defined in the protocol of use, on an Applied sequencer.
  • Biosystems model 373A The 4 clones contain an identical 2152bp sequence containing a polyA tail, a STOP codon, unknown in the databases.
  • PRAX-1 for Peripheral benzodiazepine Receptor Associated Protein 1.
  • the sequence isolated by double hybrid encodes a polypeptide of 294 amino acids and is incomplete: it lacks the ATG codon coding for the initial methionine in 5 ′. Obtaining the complete sequence of PRAX-1 is described in Example II.
  • the selected library is a lamda Zap cDNA frontal cortex library
  • the bank clones are spread on LB agar medium, 0.2% maltose, 10 mM MgSO 4 (150 diameter petri dishes) coated with Hybond membranes (Amersham). After one night at 37 ° C., the clones are transferred by contact to new membranes. The latter are treated by placing them on Whatman 3 mm paper soaked with the following solutions: NaOH 0.5 N, NaCI 1.5 M for 2 minutes then Tris HCI 0.5 M pH 8, NaCI 1.5 M for 5 minutes, finally 30 sec on Tris HCI 0 , 2M pH 7.5, SSC 2X. The membranes are dried and then incubated in a vacuum oven at 80 ° C for 2 hours. c) Preparation of PRAX-1 probes
  • the probes are labeled with P using the RTS Rad Prime DNA labeling System kit (Gibco BRL). The probes are prepared o with a specific activity of 5 10 dpm / ⁇ g on average. d) Prehybridization and hybridization
  • the membranes prepared in b) are prehybridized for 30 minutes at 42 ° C in 6 x SSC, 5 x Denhart's, 0.1% SDS and then hybridized overnight in the same buffer supplemented with the probe prepared in c) at a rate of 10 6 dpm / ml. e) Washing and exposure of membranes
  • the membranes are washed twice at room temperature in the buffer 2 x SSC / SDS 0.1% then one hour at 56 ° C in 6 x SSC / SDS 0.1%.
  • the hybrid clones are revealed by autoradiography and selected after multiple screening.
  • the sequential screening of the lambda Zap library made it possible to isolate clones containing the cDNA coding for the whole protein PRAX-1.
  • the sequence is obtained using the ABI PRISM Dye Terminator cycle sequencing Ready reaction Kit, according to the instructions defined in the operating protocol, on the Applied Biosystems model 373A sequencer.
  • the complete nucleotide sequence coding for PRAX-1 is 7033 bp, presented in the appendix. It codes for a polypeptide of 1857 amino acids, of molecular weight 200 kDa.
  • the portion isolated by double hybrid is the C-terminal end of 294 C-terminal amino acids, corresponding on the coding sequence SEQ ID No. 1 to the region 4887 to 7033.
  • the portion of PRAX-1 isolated in the double screening hybrid is referenced PRAX-1 (2H) and corresponds to the domain extending from amino acids 1564 to 1857 in SEQ ID No. 2.
  • a recombinant clone was cultured at 37 ° C. in one liter of LB culture medium (bacterotryptone 10 g / l, yeast extract 5 g / l, NaCl 10 g / I) + ampicillin 100 ⁇ g / ml.
  • LB culture medium bacterotryptone 10 g / l, yeast extract 5 g / l, NaCl 10 g / I
  • the expression is induced with 0.5mM IPTG for 2 h at 37 ° C.
  • the cell pellet is taken up in cold PBS and then sonicated by ultrasound. After centrifugation at 12000 g, for 10 min at 4 ° C, the supernatant is recovered.
  • the purification is then carried out on a glutathione sepharose 4B affinity chromatography column. Fixation and washing are carried out in PBS buffer and elution is carried out by competition with reduced glutathione.
  • Jurkat cells are transfected by electroporation using the Biorad Gene Module device (Biorad), 320V, 250 ⁇ Fr, 5ms.
  • Biorad Biorad Gene Module device
  • the selection of the transfected clones is carried out with Zéocin 500 ⁇ g / ml in RPMI 1640 medium, 20% FCS.
  • the transfected cells are cultured in RPMI1640 medium, 20% FCS, Zéocin 500 ⁇ g / ml.
  • the production of recombinant HA-PRAX-1 (2H) protein is verified using the anti-HA (Boerhinger Mannheim) or anti-PRAX-1 antibody.
  • Immunogenic peptides of 20 amino acids are selected from the protein sequence PRAX-1 SEQ ID No. 2, in the hydrophilic portions of the protein. 5 mg of each KLH coupled peptide are used to immunize 2 rabbits (male from 1.5 to 2 kg approximately, New Zealand). Four immunizations were carried out 15 days apart according to the protocol described by Vaitukaitis, Methods in enzymology, 1981, 73, 46. The sera are collected one month after the first immunization then 2 times successively at 1 month and 15 days after interval. Each serum collected is tested in western immunoblotting for the recognition of the PRAX-1 protein. The immune sera are purified on an Affigel affinity column (Biorad).
  • the cell lines were cultivated, as described in the "Catalog of cell lines and hybridomas, 7th edition, 1992" of the ATCC (American Type Culture Collection).
  • Human lines U373 (astrocyte line), SHSY5Y (neuroblastoma), NHA (normal astrocytes), Jurkat, Molt-4 (T leukemia), Daudi, U937 (B lymphoma), SW480 (colon adenocarcinoma), DU145 (prostatic carcinoma) , Hacat, SVK14, WS1, NCTC2544, A431, VA ES BJ (keratinocytes).
  • Murine line J744-A1 (monocytes-macrophage).
  • Rat line C62b (Glioma).
  • PRAX-1 (2H) is prepared as a reticulocyte lysate with the TNT T7 / T3 Coupled reticulocyte Lysate System kit (Promega ref. L5010) according to the protocol of use defined in the kit.
  • the plasmid used in this system is a plasmid pBluescript-PRAX-1 (2H) constructed by insertion of the coding sequence for PRAX-1 (2H) (nuciéotides 4887 to 7033 on SEQ ID No. 1) in the vector pBluescript (Stratagene) in BamHI site.
  • the cells are washed with PBS and then lysed in the lysis buffer (6M urea, 50mM Tris HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 100mM DTT, 0.1% bromophenol blue).
  • the lysates are sonicated by ultrasound at 4 ° C for 2 min, heated 10 min at 100 ° C and stored at -20 ° C.
  • the samples calibrated for their protein content are deposited on 4-12% or 4-20% SDS-PAGE gel and then electrotransfered onto a nitrocellulose membrane.
  • the membrane is incubated for at least 1 h in TBST blocking buffer (Tris HCI 10mM pH 8, NaCl 150mM, 0.1% Tween 20) added with 10% milk at room temperature.
  • TBST blocking buffer Tris HCI 10mM pH 8, NaCl 150mM, 0.1% Tween 20
  • the membrane is successively placed in the presence of the anti-PRAX-1 antibody in the same buffer, for 3 h at room temperature, washed 3 times for 10 min with TBST, then incubated for 45 min with a second anti-immunoglobulin antibody.
  • SIGMA rabbit coupled to peroxidase
  • Figure in annex The immunoblots obtained with the anti-PRAX-1 antibody show that it specifically recognizes the recombinant proteins and endogenous. Analysis of human cell lines shows an expression of the PRAX-1 protein detected in all of the lines tested.
  • the chromosomal localization of the PRAX-1 gene was carried out by in situ hybridization according to the procedure described by Heng et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA (1992), 89, 9509-9513 and Chromosoma (1993), 102, 325-332.
  • the cDNA probe used is a 3.5Kb probe defined on the sequence SEQ ID No. 1, comprising the 3 ′ end of the cDNA isolated by double hybrid. 100 mitoses were analyzed, 73 mitotic images show double spots located on a pair of chromosomes. The results make it possible to locate the PRAX-1 gene in the q22-q23 region on chromosome 17.
  • the results show a majority expression of the PRAX-1 transcript in the human brain.
  • the visible majority transcript is 7.5Kb in agreement with the size of the cDNA determined after screening of the cDNA libraries.
  • the PRAX-1 transcript therefore exhibits strong expression in the central nervous system, with expression varying according to the regions of the brain.
  • the thymus and the pituitary gland are distinguished from other tissues where expression is weaker.
  • the fetal brain gives a strong signal, followed by the heart, kidney, thymus, and lung.
  • EXAMPLE 9 The PRAX-1 / PBR interaction was demonstrated in animals by the co-localization of PRAX-1 and PBR in the thymus, the adrenal gland and the skin.
  • the promoter of the human gene encoding PRAX-1 is known. Its characterization reveals the existence of potential sites for regulating the expression of PRAX-1.
  • the human PRAX-1 gene is around 26Kb and is divided into 32 exons separated by 31 introns, the size of the exons varies from 21 to 840bp while the size of the introns ranges from 79 to 3300bp.
  • the 2.6Kb analysis preceding the translation initiation site shows the presence of potential modulation sites for gene transcription: 3 Sp 1 sites, 1 AP-1 site, 3 AP-2 sites, 2 SRE, 10 GRE, 1 Zre site, 15 CACCC sites, 5 CT boxes and binding sites for different regulatory factors MAZ (two), C / EBP ⁇ (one), c-Ets-2 (one), Puf (three), GATA -1 (one), MyoD (one), USF (three), GC rich binding factor (one), SRY (three) and SOX-5 (one).
  • Sp1 sites are part of the basic transcription machinery and provide a level of expression. Growth factors can modulate the expression of PRAX-1 through the SRE sites.
  • AP-2 sites are involved in particular during the development of the central nervous system, proliferation and oncogenesis phenomena.
  • GRE sites are glucocorticoid response sites and are either activators or repressors. They frequently act in conjunction with other related factors. USF is an activator of ubiquitous transcription.
  • Puf is involved in the removal of tumors.
  • the CACCC sites have in particular been described active on blood cells.
  • the factor C / EBPcc is involved in energy phenomena, cell multiplication and differentiation.
  • Other factors have specific expressions: MyoD is involved in myogenesis, MAZ, GATA-1, c-ets-2 are involved in hematopoiesis and lymphocyte maturation, the SRY and SOX-5 sites are particularly active during development and embryogenesis.
  • a construct is also available containing a PRAX-1 mouse insert of 1410 bp corresponding to the N terminal end of PRAX-1, cloning into the vector pcDNA3.

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Abstract

Cette invention concerne un polypeptide purifié, comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi: a) la séquence SEQ ID n°2; b) une séquence biologiquement active dérivée de SEQ ID n°2, et c) un fragment de la séquence SEQ ID n°2 ayant une activité biologique de même nature que celle du polypeptide de séquence SEQ ID n°2, ou immunologiquement apparenté au polypeptide de séquence SEQ ID n°2.

Description

"Polypeptide PRAX-1 " L'invention concerne une nouvelle séquence d'acides nucléiques et la séquence protéique correspondante.
L'invention concerne également les applications prophylactiques, thérapeutiques et diagnostiques de celles-ci.
Les auteurs de la présente invention ont identifié le produit de transcription d'un nouveau gène ainsi que la protéine correspondante. Ce gène PRAX-1 a été isolé par la technique du double hybride comme codant pour une protéine interagissant spécifiquement avec le récepteur périphérique des benzodiazépines (PBR). La présente invention est donc relative à une protéine purifiée PRAX-1 , ou des fragments biologiquement actifs de celle-ci.
L'invention concerne également des séquences d'acides nucléiques isolées codant pour ladite protéine ou ses fragments biologiquement actifs et des oligonucléotides spécifiques obtenues à partir de cette séquence. Elle vise en outre les vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant au moins l'une des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, et les cellules hôtes transfectees par ces vecteurs de clonage et/ou d'expression dans des conditions permettant la répiication et/ou l'expression de l'une desdites séquences nucléotidiques.
Les méthodes de production de protéines recombinantes PRAX-1 ou de ses fragments biologiquement actifs par les cellules hôtes transfectees font également partie de l'invention.
L'invention comprend également des anticorps ou des dérivés d'anticorps spécifiques des protéines définies ci-dessus.
L'invention concerne également tout inhibiteur ou activateur de l'activité spécifique du PRAX-1 , mais aussi de toute interaction protéine-protéine faisant intervenir le PRAX-1.
Elle concerne aussi des séquences oligonucléotidiques antisens, spécifiques des séquences d'acides nucléiques ci-dessus, pouvant moduler in vivo l'expression du gène PRAX-1. Elle concerne des séquences oligonucléotidiques définies à partir des séquences d'acides nucléiques ci-dessus, sonde ou amorce utilisable en diagnostic de pathologies où le PRAX-1 est impliqué.
L'invention a enfin pour objet l'utilisation dans une méthode de thérapie génique d'une séquence nucléotidique selon l'invention, dans laquelle des vecteurs tels que par exemple des vecteurs viraux inactivés capables de transférer des séquences codantes pour une protéine selon l'invention sont injectés dans des cellules déficientes pour cette protéine. La présente invention a pour objet un polypeptide purifié dont la séquence d'acides aminés est la séquence SEQ ID n°2 ou toute séquence biologiquement active dérivée de SEQ ID n°2.
Dans la description de l'invention, on utilise les définitions suivantes : - protéine PRAX-1 : un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés choisie entre la séquence SEQ ID n° 2 ou tout fragment ou dérivé de celui-ci biologiquement actif.
- dérivé : tout polypeptide variant du polypeptide de séquence SEQ ID n°2 ou toute molécule résultant d'une modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence SEQ ID n° 2 c'est-à-dire obtenue par mutation, délétion, addition, substitution et/ou modification chimique d'un seul ou d'un nombre limité d'acides aminés, ainsi que toute séquence isoforme, c'est-à-dire une séquence identique à la séquence SEQ ID n° 2 à l'un de ses fragments ou séquences modifiées, contenant un ou plusieurs acides aminés sous la forme d'énantiomère D, lesdites séquences variantes, modifiées ou isoformes ayant conservé au moins l'une des propriétés les rendant biologiquement actives et/ou lesdites séquences étant immunologiquement apparentées à la séquence SEQ ID n° 2.
- biologiquement actif : capable d'interagir avec le récepteur périphérique des benzodiazépines. - immunologiquement apparenté : capable d'être reconnu par les anticorps spécifiques du polypeptide de séquence SEQ ID n°2 et/ou capable d'induire des anticorps qui reconnaissent ce polypeptide.
La fabrication de dérivés peut avoir différents objectifs, dont en particulier celui d'améliorer ses taux de production, d'augmenter sa résistance à des protéases, de modifier ses activités biologiques ou de lui conférer de nouvelles propriétés pharmaceutiques et/ou biologiques.
Avantageusement, l'invention vise un polypeptide comprenant le domaine d'interaction avec PBR de l'un des polypeptides précédents.
Ce domaine correspond à la séquence comprise entre le résidu 1564 et le résidu 1857 de la séquence SEQ ID n°2.
Une publication faisant référence à l'invention est apparue le 29 janvier 1999 dans la revue Journal of Biological Chemistry, volume 274, n°5, 2938-2952. Elle s'intitule : Cloning and Characterization of PRAX-1 - A new protein that specifically interacts with the peripheral benzodiazepine receptor par S. Galliegue et al. La séquence nucléotidique correspondant à l'invention est accessible dens
Genban avec le numéro d'accès AF039571. La présente invention a également pour objet les séquences d'acides nucléiques codant pour une protéine PRAX-1 ou des fragments ou dérivés de celle-ci biologiquement actifs.
Plus préférentiellement, l'invention a pour objet des séquences d'acides nucléiques isolées choisies parmi : a) la séquence SEQ ID n° 1 , b) la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID n° 1 , c) les séquences d'acides nucléiques capables de s'hybrider spécifiquement à la séquence SEQ ID n° 1 ou à leurs séquences complémentaires, ou de s'hybrider spécifiquement à leurs séquences proximales, d) les séquences dérivées des séquences a), b) et c), du fait de la dégénérescence du code génétique.
Selon un mode de réalisation préféré, l'invention a pour objet la séquence nucléotidique SEQ ID n° 1 correspondant à l'ADNc de la protéine humaine de séquence SEQ ID n° 2.
Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences d'ADN ou d'ARN, obtenues par criblage de banques de séquences au moyen de sondes élaborées sur la base de la séquence SEQ ID n° 1. De telles banques peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculaire, connues de l'homme de l'art.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ces séquences nucléotidiques permettent la réalisation de sondes nucléotidiques, capables de s'hybrider fortement et spécifiquement avec une séquence d'acides nucléiques, d'un ADN génomique ou d'un ARN messager, codant pour le polypeptide selon l'invention ou un fragment biologiquement actif de celui-ci. De telles sondes font également partie de l'invention. Elles peuvent être utilisées comme outil de diagnostic in vitro pour la détection, par des expériences d'hybridation, de transcrits spécifiques des polypeptides de l'invention dans des échantillons biologiques ou pour la mise en évidence de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques au niveau des séquences d'acides nucléiques codant pour un polypeptide tel que défini ci-dessus telles que la perte d'hétérozygotie ou le réarrangement génétique, résultant d'un polymorphisme, de mutations ou d'un épissage différent.
A cet effet, une sonde nucléotidique selon l'invention est mise en contact avec un échantillon biologique dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation entre la sonde et la séquence ncuiéotidique d'intérêt, éventuellement après une étape préalable d'amplification de ladite séquence nucléotidique ; le complexe d'hybridation éventuellement formé est détecté et la séquence nucléotidique formant le complexe d'hybridation avec la sonde de l'invention est éventuellement séquence. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent également être utilisées pour la fabrication d'un médicament utile en thérapie génique.
Les sondes de l'invention comportent au moins 10, de préférence au moins 16 nuciéotides, et au maximum comportent la totalité de la séquence du gène PRAX-1 ou de son ADNc contenu par exemple dans un cosmide. Parmi les sondes les plus courtes, c'est-à-dire d'environ 10 à 20 nuciéotides, les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions stringentes usuellement utilisées par l'homme de métier, notamment de forte stringence telles que définies par Sambrook et al. dans Molecular Cloning, a laboratory manual, 2 édition,
ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989. La température utilisée est de préférence comprise entre Tm -5° C à Tm -30° C, de préférence encore entre Tm -5° C et Tm -10° C, T étant la température de fusion, température à laquelle 50 % des brins d'ADN appariés se séparent.
De manière avantageuse, les conditions d'hybridation utilisées sont les suivantes - température : 65° C, - tampon d'hybridation : BSA 1 %, SDS 7% NaH2 θ4 0,5M, EDTA 1 mM, telles que décrites dans l'exemple VII.
Avantageusement, ces sondes sont représentées par les oligonucléotides suivants ainsi que les nuciéotides de séquence complémentaire correspondants :
SEQ ID n° 3 : GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC SEQ ID n° 4 : AAC TTG AAT CCA ATG AGC AA
SEQ ID n° 5 : TCT GCT GAC CTG AAA GCT CC
SEQ ID n° 6 : CCA TCA GGG GGC ACA GGC TC
SEQ ID n° 7 : TGG GCC TTG TAC CCC CAG CT
SEQ ID n° 8 : TCC TCC TGA GGA GCT GCT TC SEQ ID n° 9 : CCC CTG CCC GGA AGG GCA GC
SEQ ID n° 10 : TTG ACC AAG GTC ACT GAG CC
SEQ ID n° 1 1 : GGG CCT GCT GGC CCC TGT AA
SEQ ID n° 12 : GCC ATC GGC ATC CTT GTC CC
SEQ ID n° 13 : CCT CTC CGG TCT CTG TTG CCC G SEQ ID n° 14 : AGG CCC AGG GGG CCT CCG AAG GC
SEQ ID n° 15 : CGC TGC CCG CCT CCT GCT CAT CCT C
SEQ ID n° 16 : TCC TCC AGG GCT GGA GAC TGC CT
SEQ ID n° 17 : GGT TCC AGG ACT TGC TCC TTC CAG AAG SEQ ID n° 18 : CAG CTC CCT CAC TGG CCA AG
SEQ ID n° 19 : TGG CTC CGG CCA GCC TGC C
SEQ ID n° 20 : TCC GGG TCA CAG GCT ATG CCA T
SEQ ID n° 21 : CC CAG TAC CTA CTG GGC CAC CT SEQ ID n° 22 : GCT TCC ATA TCT GTG TGA ATG GG
SEQ ID n° 23 : GGT AAG GCA CGG CAG GAG GCT C
SEQ ID n° 24 : GCT GGC TCC TTC TCA CAC TG
SEQ ID n° 25 : GGA GAG CTC ATG GAT GGC CGA AG
SEQ ID n° 26 : CCA GTG AGG TAG AGG AGC TGG SEQ ID n° 27 : TCC ATT CCC CAG CCT TGC CGG GG
SEQ ID n° 28 : GCT CGA AGA ACA GTG CCG CAG CC
SEQ ID n° 29 : TCG CAA GAG CCA GGG CCT GCA GA
SEQ ID n° 30 : GCT GGA ATC GGA GCT CAG CAA G
SEQ ID n° 31 : CCC GTG ATT CTA GGG GAG CCA GAG SEQ ID n° 32 : GAG TGC AGG GAG CTG CAG GCC A
SEQ ID n° 33 : GGC TGA AGC GGA AGA ACG CCG AG
SEQ ID n° 34 : CAA TCT GGA GCT GCT GAG GG
SEQ ID n° 35 : TGA GGT CTG AGG AGA GTT CCA AG
SEQ ID n° 36 : ATG GAG CCA TGG GCA CTG CCC Préférentiellement, les sondes de l'invention sont marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier
(marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent, enzymatique, etc.).
Les méthodes de diagnostic in vitro dans lesquelles ces sondes nucléotidiques sont mises en oeuvre, sont incluses dans l'objet de la présente invention. Ces méthodes concernent par exemple la détection de synthèses anormales (ex. accumulation de produits de transcription) ou d'anomalies génétiques, telles que la perte d'hétérozygotie et le réarrangement génétique, et les mutations ponctuelles au niveau des séquences nucléotidiques d'acides nucléiques codant pour une protéine
PRAX-1 , selon la définition donnée précédemment. Les séquences nucléotidiques de l'invention sont également utiles pour la fabrication et l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques pour des réactions de séquençage ou d'amplification spécifique selon la technique dite de PCR ou toute variante de celle-ci (Ligase Chain Reaction (LCR),...).
Des paires d'amorces préférées sont constituées par des amorces avantageusement d'au moins 16 nuciéotides, choisies sur la séquence nucléotidique :
SEQ ID n° 1 : séquence humaine de 7033 nuciéotides.
Avantageusement, ces amorces sont représentées par les couples suivants: - couple n°1 : amorce sens : GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC (SEQ ID n°3) amorce antisens : AAC TTG AAT CCA ATG AGC AA (SEQ ID n°4)
- couple n°2 : amorce sens : TCT GCT GAC CTG AAA GCT CC (SEQ ID n°5) amorce antisens : TCC TCC TGA GGA GCT GCT TC (SEQ ID n°8)
- couple n° 3 : amorce sens : TTG ACC AAG GTC ACT GAG CC (SEQ ID n°10) amorce antisens : AAC TTG AAT CCA ATG AGC AA (SEQ ID n°4)
- couple n° 4 : amorce sens : GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC (SEQ ID n°3) amorce antisens : GCC ATC GGC ATC CTT GTC CC (SEQ ID n°12)
- couple n° 5 : amorce sens : GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC (SEQ ID n°3) amorce antisens : TCC TCC TGA GGA GCT GCT TC (SEQ ID n°8) les amorces "sens" allant de 5' en 3' et les amorces "anti-sens" de 3' en 5'.
Ces amorces correspondent aux séquences respectivement comprises entre les :
- nucléotide n° 5091 et nucléotide n° 5110 sur SEQ ID n° 1 pour SEQ ID n° 3
- nucléotide n° 6700 et nucléotide n° 6719 sur SEQ ID n°1 pour SEQ ID n° 4.
- nucléotide n° 5475 et nucléotide n° 5494 sur SEQ ID n° 1 pour SEQ ID n°5 - nucléotide n° 5939 et nucléotide n°5958 sur SEQ ID n°1 pour SEQ ID n°8
- nucléotide n° 6226 et nucléotide n° 6245 sur SEQ ID n° 1 pour SEQ ID n°10
- nucléotide n° 5188 et nucléotide n° 5207 sur SEQ ID n° 1 pour SEQ ID n°12
Ainsi, PRAX-1 en tant que nouvelle protéine peut être considérée selon l'invention comme un nouvel élément intégrant une thérapie génique. Les séquences nucléotidiques codant pour la protéine PRAX-1 peuvent être transférées à des cellules cibles par le biais de vecteurs viraux inactivés. La perspective d'employer cette protéine dans un traitement de thérapie génique provient d'abord de la localisation chromosomique du gène humain codant pour cette protéine. Localisé sur le chromosome 17 dans la région q22-q23, ce gène se trouve associé à des marqueurs de pathologies graves affectant le système nerveux central ou immuniatire (neuroblastomes ou leucémies). Une application de cette protéine en thérapie génique est aussi tout à fait envisageable selon l'invention si l'on considère l'expression particulière de cette protéine associée à trois systèmes majeurs dans l'organisme : - le système nerveux central, l'expression de cette nouvelle protéine est majoritaire dans le cerveau. Son expression est associée à certaines régions cérébrales bien définies.
- le système immuniataire, le profil d'expression de la protéine dans le thymus est tout à fait remarquable.
- le système endocrinien avec une expression dans les glandes surrénales, l'hypophyse, le rein, la peau.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent par ailleurs être utilisées pour la production de protéines recombinantes PRAX-1 , selon la définition qui a été donnée à ce terme.
Ces protéines peuvent être produites à partir des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, selon des techniques de production de produits recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence nucléotidique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant sa transcription et son expression dans un hôte cellulaire.
Un système efficace de production d'une protéine recombinante nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible.
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme par exemple les levures, cellules d'insectes, de mammifères, notamment CHO (cellules d'ovaires de hamster chinois) ou tout autre système avantageusement disponible. Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par la bactérie E. coli, notamment la souche MC 1061 (Clontech). Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que les régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple Pélectroporation. Les vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant au moins l'une des séquences nucléotidiques définies ci-dessus font également partie de la présente invention.
Un vecteur de clonage et d'expression employé est le plasmide pZeoSV2(+) (Invitrogen, V850-01) qui comporte à la fois les éléments nécessaires pour son utilisation comme vecteur de clonage dans E.coli (origine de réplication dans E. coli et gène de résistance à la Zeocin), et comme vecteur d'expression dans les cellules animales (promoteur, signal de polyadenylation, origine de réplication du virus SV40), ainsi que les éléments permettant sa copie en simple brin dans un but de séquençage (origine de réplication du phage f1 ).
L'intégration des ADNc provenant des séquences d'acides nucléiques de l'invention est par ailleurs décrite dans les exemples ci-après.
Selon un mode de réalisation préféré, les protéines de l'invention sont sous forme de protéines de fusion, notamment sous forme de protéine fusionnée avec la glutathione S-transférase (GST). Un vecteur d'expression désigné dans ce cas est représenté par le vecteur plasmidique pGEX-4T-2 (Pharmacia ref-27.4581 -01 ).
L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectees par ces vecteurs précédents. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Ces cellules sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide recombinant de séquence SEQ ID n° 2 ou de tout fragment ou dérivé biologiquement actif de celui-ci. La méthode de production d'un polypeptide de l'invention sous forme recombinante est elle-même comprise dans la présente invention, et se caractérise en ce que l'on cultive les cellules transfectees dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant de séquence SEQ ID n°2 ou de tout fragment ou dérivé biologiquement actif de celui-ci, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant. Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono ou polyclonaux spécifiques, etc. Une variante préférée consiste à produire un polypeptide recombinant fusionné à une protéine "porteuse" (protéine chimère). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in vitro et/ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand spécifique.
Avantageusement, les polypeptides de l'invention sont fusionnés avec la glutathion S-transférase en position N-terminale (système "GST" Pharmacia). Le produit de fusion est dans ce cas détecté et quantifié grâce à l'activité enzymatique de la GST. Le réactif colorimétrique utilisé est un accepteur de glutathion, substrat de la GST. Le produit recombinant est purifié sur un support de chromatographie auquel ont été préalablement couplées des molécules de glutathion.
Les anticorps mono ou polyclonaux spécifiquement dirigés contre une protéine PRAX-1 selon la définition donnée précédemment font également partie de l'invention. Des anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre la protéine, produite par exemple par recombinaison génétique suivant la méthode décrite ci-dessus, selon les modes opératoires usuels.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497.
Des anticorps avantageux sont des anticorps dirigés contre des épitopes localisés dans la région comprise entre le résidu 1564 et le résidu 1857 pour la séquence SEQ ID n° 2.
Les anticorps selon l'invention peuvent se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués.
Par ailleurs, outre leur utilisation pour la purification des polypeptides recombinants, les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent également être utilisés pour la détection de ces polypeptides dans un échantillon biologique. Ils constituent ainsi un moyen d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique de l'expression de la protéine PRAX-1 sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoconjugués enzymatiques.
Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression d'une protéine PRAX-1 doit être observée. L'invention concerne donc également un procédé de diagnostic in vitro d'états pathologiques corrélés à une expression ou une accumulation anormale de protéines PRAX-1 , à partir d'un prélèvement biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact au moins un anticorps de l'invention avec ledit prélèvement biologique, dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre une protéine PRAX-1 et le ou lesdits anticorps et en ce que l'on détecte quantitativement les complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés. L'invention concerne également un kit pour le diagnostic in vitro d'une expression ou une accumulation anormale de la protéine PRAX-1 dans un prélèvement biologique et/ou pour la mesure du taux d'expression de celle-ci dans ledit prélèvement comprenant : - au moins un anticorps spécifique de la protéine PRAX-1 , éventuellement fixé sur un support,
- des moyens de révélation de la formation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre la protéine PRAX-1 et ledit anticorps et/ou des moyens de quantification de ces complexes. L'invention vise également toute méthode de diagnostic par la mise en évidence dans le sérum d'un individu, d'auto-anticorps dirigés contre la protéine PRAX-1.
Une telle méthode de diagnostic précoce est caractérisée en ce que l'on met en contact un échantillon de sérum prélevé chez un individu avec un polypeptide de l'invention, éventuellement fixé sur un support, dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques spécifiques entre ledit polypeptide et les auto-anticorps éventuellement présents dans l'échantillon de sérum, et en ce que l'on détecte les complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés.
La protéine PRAX-1 peut en effet être considérée comme élément de diagnostic de pathologies intervenant dans les systèmes où elle est exprimée et trouve sa fonctionnalité, en particulier les systèmes immunitaire, nerveux central et endocrinien.
L'invention a également pour objet une méthode de détermination d'une variabilité allélique, d'une mutation, d'une delétion, d'une insertion, d'une perte d'hétérozygotie ou d'une anomalie génétique du gène PRAX-1 , pouvant être impliquées dans des pathologies, caractérisée en ce qu'elle utilise au moins une séquence nucléotidique décrite ci-dessus. Parmi les méthodes de détermination d'une variabilité allélique, d'une mutation, d'une delétion, d'une insertion, d'une perte d'hétérozygotie ou d'une anomalie génétique du gène PRAX-1 , on préfère une méthode comprenant au moins une étape d'amplification par PCR de la séquence nucléique cible de PRAX-1 susceptible de présenter un polymorphisme, une mutation, une delétion ou une insertion à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques définies ci-dessus, une étape au cours de laquelle on procède au traitement des produits amplifiés à l'aide d'enzymes de restriction appropriées et une étape au cours de laquelle on procède à la détection ou au dosage d'au moins l'un des produits de la réaction enzymatique. La protéine PRAX-1 peut enfin être envisagée selon l'invention comme une nouvelle cible pharmacologique par sa fonction faisant intervenir le récepteur périphérique des benzodiazépines (PBR). Elle peut en effet être la cible de molécules définies pour interférer, moduler la capacité qu'a cette protéine d'interagir avec PBR et ainsi modifier sa fonction. Elle peut aussi être la cible de molécules capables de moduler les niveaux d'expression de cette protéine. Des éléments de régulation de l'expression de la protéine PRAX-1 sont reconnus sur le promoteur du gène humain codant pour PRAX-1. En régulant, soit par induction ou inhibition, la transcription du gène en ARNm, ces éléments modulent indirectement l'expression de la protéine PRAX-1.
L'invention comprend également des compositions pharmaceutiques comprenant comme principe actif un polypeptide répondant aux définitions précédentes, préférentiellement sous forme soluble, associé à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Ces compositions pharmaceutiques sont destinées à être administrées à des sujets ayant une expression déficiente en protéine PRAX-1 , associée à des états pathologiques ou encore présentant un état pathologique impliquant PRAX-1 ou son récepteur. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent également contenir un inhibiteur ou inactivateur de l'activité de PRAX-1 et de toute interaction protéine- protéine faisant intervenir PRAX-1 , notamment un polypeptide dérivé d'un polypeptide tel que défini précédemment.
Préférentiellement, ces compositions peuvent être administrées par voie systemique, de préférence par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale.
Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc.
L'invention est illustrée par les exemples suivants pour lesquels on se référera à la figure annexée qui est une représentation schématique avec une carte de restriction partielle du plasmide pZeoSV2(+) contenant le PRAX-1 (2H) humain.
EXEMPLE 1
Isolement et identification de PRAX-1 1) Stratégie double hybride
La technique du double hybride est une méthode de clonage par interaction in vivo chez la levure Saccharomyces cerevisiae. L'objet de cette technique est de détecter in vivo les interactions protéine-protéine et rechercher les partenaires protéiques d'une protéine donnée utilisée comme appât. L'appât utilisé est défini sur la séquence protéique de PBR. La définition de l'appât PBR doit se limiter aux régions hydrophiles de la protéine selon des contraintes de la technique du double hybride. Comme la protéine PBR est fortement hydrophobe, avec 5 régions transmembranaires, localisée sur la membrane mitochondriale externe, nous définissons l'appât PBR à partir du motif C-terminal de la protéine, région démontrée cytosolique et accessible à d'éventuels partenaires proteiques par l'existence d'un anticorps monoclonal anti-PBR dirigé contre cette région de la protéine. Un appât PBR construit sur la base de ce motif C-terminal, par juxtaposition trois fois des 14 acides aminés C-terminaux de PBR a été sélectionné.
2) Construction de l'appât PBR
L'appât PBR est une construction synthétique qui juxtapose trois fois le motif C- terminal de PBR, domaine aa156 à 169, séparé par des linkers de glycine : séquence protéique appât :
RDNHGWHGGRRLPE-gly-gly-RDNHGWHGGRRLPE-gly-gly-RDNHGWHGGRRLPE soit 46 acides aminés.
La séquence nucléotidique codant pour l'appât PBR est clonée dans le vecteur pGBT9 (Clontech) en sites EcoRI et Xhol.
3) Criblage des banques de fusion La lignée HF7c est d'abord transformée par le plasmide appât puis par la banque de fusion choisie (cerveau foetal, Matchmaker library, Clontech) selon la méthode définie par Schiestl et al. Curr. Genêt., 1989, 16, 339-346. Le criblage double hybride est réalisée sur 2.10 cellules. Les clones HIS+ et LacZ+ sont repérés et testés pour leur spécificité en remplaçant l'appât PBR par d'autres constructions non relevantes. Les tests de sélection et de spécificité, réalisés dans les conditions définies dans
Matchmaker Library User Manuel (Clontech), permettent d'isoler 4 clones positifs.
4) Identification de PRAX-1
L'insert contenu dans chacun des clones est séquence avec le kit de séquençage ABI PRISM Dye Terminator cycle sequencing Ready reaction Kit, selon les instructions définies dans le protocole d'utilisation, sur séquenceur Applied
Biosystems model 373A. Les 4 clones contiennent une séquence identique de 2152pb contenant une queue polyA, un codon STOP, inconnue dans les banques de données.
Cette séquence a été baptisée PRAX-1 pour Peripheral benzodiazepine Receptor Associated Protein 1. La séquence isolée par double hybride code pour un polypeptide de 294 acides aminés et est incomplète : il manque le codon ATG codant pour la méthionine initiale en 5'. L'obtention de la séquence complète de PRAX-1 est décrite dans l'exemple II. EXEMPLE 2
Obtention de la séquence entière et clonage de l'ADNc de la protéine humaine PRAX-1 1) Criblage de la banque a) La banque La banque sélectionnée est une banque lamda Zap cDNA cortex frontal
(Stratagène). b) Préparation des membranes
Les clones de la banque sont étalés sur du milieu LB gélose, maltose 0,2%, MgS04 10mM (boîtes de pétri diamètre 150) revêtu de membranes Hybond (Amersham). Après une nuit à 37°C, les clones sont transférés par contact sur de nouvelles membranes. Ces dernières sont traitées en les déposant sur du papier Whatman 3 mm imbibé des solutions suivantes : NaOH 0.5 N, NaCI 1.5 M pendant 2 minutes puis Tris HCI 0.5 M pH 8 , NaCI 1.5 M pendant 5 minutes, enfin 30 sec sur Tris HCI 0,2M pH 7,5, SSC 2X. Les membranes sont séchées puis incubées au four sous vide à 80°C pendant 2 heures. c) Préparation des sondes PRAX-1
Différentes sondes PRAX-1 sont successivement employées définies sur la
32 séquence nucléotidique SEQ ID n°1. Les sondes sont marquées au P en utilisant le kit RTS Rad Prime DNA labeling System (Gibco BRL). Les sondes sont préparées o avec une activité spécifique de 5 10 dpm/μg en moyenne. d) Préhybridation et hybridation
Les membranes préparées en b) sont préhybridées 30 minutes à 42°C dans 6 x SSC, 5 x Denhart's, 0,1 % SDS puis hybridées pendant la nuit dans le même tampon additionné de la sonde préparée en c) à raison de 106 dpm/ml. e) Lavage et exposition des membranes
Les membranes sont lavées deux fois à température ambiante dans le tampon 2 x SSC/SDS 0.1 % puis une heure à 56°C en 6 x SSC/SDS 0.1 %. Les clones hybrides sont révélés par autoradiographie et sélectionnés après multiple screening.
2) Séquençage des clones obtenus PRAX-1
Le criblage séquentiel de la banque lambda Zap a permis d'isoler des clones contenant l'ADNc codant pour la protéine entière PRAX-1. La séquence est obtenue à l'aide du kit ABI PRISM Dye Terminator cycle sequencing Ready reaction Kit, selon les instructions définies dans le protocole d'utilisation, sur séquenceur Applied Biosystems model 373A.
La séquence nucléotidique complète codante pour PRAX-1 est de 7033pb, présentée en annexe. Elle code pour un polypeptide de 1857 acides aminés, de poids moléculaire 200 kDa. La portion isolée par double hybride est l'extrémité C-terminale, de 294 acides aminés C-terminaux, correspondant sur la séquence codante SEQ ID n°1 à la région 4887 à 7033. La portion de PRAX-1 isolée dans le screening double hybride est référencée PRAX-1 (2H) et correspond au domaine s'étendant des acides aminés 1564 à 1857 sur SEQ ID n°2.
EXEMPLE 3
1) Production de protéine recombinante PRAX-1 dans E. Coli a) Construction du plasmide d'expression
Elle consiste à insérer la séquence codante pour la portion 2H de PRAX-1 (294 acides aminés C-terminaux de PRAX-1) en phase avec la glutathione S-transférase (GST) dans le vecteur pGEX 4T2 (Pharmacia). Pour cela l'insert correspondant (pb 4887 à 7033) est clone en site Smal dans le vecteur pGEX 4T2. L'insert et le plasmide sont digérés puis purifiés après migration sur gel d'agarose 1 % à l'aide du kit Geneclean (Bio101 ). Après ligation avec 100ng d'insert et 10ng de vecteur déphosphorylé et transformation par choc thermique, les clones E. coli recombinants sont vérifiés par séquençage à l'aide du kit Applied Biosystem (Perkin Elmer). b) Expression et purification de la protéine de fusion GST-PRAX-1 (2H) Cette étape a été réalisée en utilisant le kit " Bulk GST purification module "
(Pharmacia).
Un clone recombinant a été mis en culture à 37°C dans un litre de milieu de culture LB (bactotryptone 10g/l, extrait de levure 5g/l, NaCI 10g/I) + ampicilline 100μg/ml. A Dθ600nm 0.8, l'expression est induite avec 0,5mM d'IPTG pendant 2h à 37°C. Après centrifugation, le culot cellulaire est repris dans du PBS froid puis soniqué par ultrasons. Après centrifugation à 12000g, pendant 10 min à 4°C, on récupère le surnageant. La purification est ensuite réalisée sur une colonne de chromatographie d'affinité glutathion sepharose 4B. La fixation et le lavage sont réalisés en tampon PBS et l'élution est réalisée par compétition avec du glutathion réduit. La concentration finale en protéine de fusion GST-PRAX-1(2H) est variable entre 0,5 et 1 mg/ml selon les préparations.
2) Production de protéine recombinante PRAX-1 dans les cellules Jurkat a) Construction du plasmide d'expression L'insert codant pour l'extrémité C-terminale de PRAX-1 est sorti du plasmide de la banque cerveau foetal pActll-PRAX-1 (2H) par digestion par Bglll. Cette digestion permet de laisser en 5' de l'insert codant pour PRAX-1 (2H), la séquence codante pour l'épitope HA (hémagglutinine). L'insert ainsi digéré est clone dans pZeo SV2+ en site BamHI. Le vecteur de clonage linéarisé et l'insert sont ligués. Des bactéries "choc thermique" compétentes sont transfectees par cette construction. La construction est vérifiée par séquençage (Cf. figure en annexe). b) Cellules Jurkat Les cellules Jurkat (leucémie humaine T) sont cultivées dans le milieu RPMI
1640 (Gibco) suppléménté avec 50mg/ml de gentamycine et de 10% de sérum de veau foetal (Gibco). c) Transformation des cellules Jurkat
Les cellules Jurkat sont transfectees par électroporation à l'aide de l'appareil Biorad Gène Puiser (Biorad), 320V, 250μFr, 5ms. La sélection des clones transfectes est réalisée par Zéocin 500μg/ml en milieu RPMI 1640, 20% SVF. d) Les cellules transfectees sont mises en culture en milieu RPMI1640, 20% SVF, Zéocin 500μg/ml. La production de protéine recombinante HA-PRAX-1 (2H) est vérifiée en utilisant l'anticorps anti-HA (Boerhinger Mannheim) ou anti-PRAX-1.
EXEMPLE 4
Préparation d'anticorps spécifiques polyclonaux
Des peptides immunogènes de 20 acides aminés sont sélectionnés sur la séquence protéique PRAX-1 SEQ ID n°2, dans les portions hydrophiles de la protéine. 5mg de chaque peptide couplé KLH sont utilisés pour immuniser 2 lapins (mâle de 1 ,5 à 2kg environ, New Zealand). Quatre immunisations ont été effectuées à 15 jours d'intervalle selon le protocole décrit par Vaitukaitis, Methods in enzymology, 1981 , 73, 46. Les sérums sont recueillis un mois après la première immunisation puis 2 fois successivement à 1 mois et 15 jours d'intervalle. Chaque sérum recueilli est testé en western immunoblotting pour la reconnaissance de la protéine PRAX-1. Les sérums immuns sont purifiés sur colonne d'affinité Affigel (Biorad). La spécificité de reconnaissance de PRAX-1 par les anticorps a été vérifiée par déplacement du marquage obtenu, en présence du peptide immunogène correspondant. Un anticorps polyclonal a ainsi été obtenu. Sa cible est le peptide AA1772-1792 sur la séquence SEQ ID n°2.
EXEMPLE 5
Détection de la protéine PRAX-1 par western immunoblotting (immunoempreinte) 1) Matériels utilisés pour l'immunoempreinte a) Lignées cellulaires utilisées pour l'immunoempreinte
Les lignées cellulaires ont été cultivées, comme décrit dans le " Catalogue of cell lines and hybridomas, 7 édition, 1992 " de l'ATCC (American Type Culture Collection). Lignées humaines : U373 (lignée astrocytaire), SHSY5Y (neuroblastome), NHA (astrocytes normaux), Jurkat, Molt-4 (leucémie T), Daudi, U937 (lymphome B), SW480 (adénocarcinome de colon), DU145 (carcinome prostatique), Hacat, SVK14, WS1 , NCTC2544, A431 , VA ES BJ (kératinocytes). Lignée murine : J744-A1 (monocytes-macrophage). Lignée de rat : C62b (Gliome). b) E. coli exprimant GST-PRAX-1 (2H) ou protéine PRAX-1 (2H) traduite in vitro La protéine de fusion GST-PRAX-1 (2H) est préparée comme indiquée dans l'exemple III. PRAX-1 (2H) est préparée en lysat de réticulocytes avec le kit TNT T7/T3 Coupled reticulocyte Lysate System (Promega réf. L5010) selon le protocole d'utilisation défini dans le kit. Le plasmide employé dans ce système est un plasmide pBluescript-PRAX-1 (2H) construit par insertion de la séquence codante pour PRAX- 1 (2H) (nuciéotides 4887 à 7033 sur SEQ ID n°1 ) dans le vecteur pBluescript (Stratagène) en site BamHI.
2) Préparation des échantillons proteiques à partir des cultures cellulaire
Après culture, les cellules sont lavées avec du PBS puis lysées dans le tampon de lyse (6M urée, 50mM Tris HCI pH 6,8, 2% SDS, 10% glycérol, 100mM DTT, 0,1% bleu de bromophénol). Les lysats sont soniqués par ultrasons à 4°C pendant 2min, chauffés 10min à 100°C et conservés à -20°C.
3) Western Blot
Les échantillons calibrés pour leur contenu protéique sont déposés sur gel SDS- PAGE 4-12% ou 4-20% puis electrotransférés sur une membrane de nitrocellulose.
4) Révélation par l'anticorps anti-PRAX- 1
La membrane est incubée pendant 1 h minimum dans le tampon de blocage TBST (Tris HCI 10mM pH 8, NaCI 150mM, 0,1% Tween 20) additioné de 10% de lait à température ambiante. La membrane est successivement mise en présence de l'anticorps anti-PRAX-1 dans le même tampon, pendant 3 h à température ambiante, lavée 3 fois pendant 10 min avec du TBST, puis incubée pendant 45 min avec un second anticorps anti-immunoglobuline de lapin couplé à la peroxidase (SIGMA) dans du tampon TBST lait 5%. Après 3 lavages en TBST de 15min, la révélation est réalisée en utilisant le kit ECL (Amersham) par chimioluminescence.
5) Résultats
Figure en annexe : Les immunoempreintes obtenues avec l'anticorps anti PRAX-1 montrent que celui-ci reconnaît spécifiquement les protéines recombinantes et endogènes. L'analyse des lignées cellulaires humaines montre une expression de la protéine PRAX-1 détectée dans toutes les lignées testées.
EXEMPLE 6 Localisation chromosomique
La localisation chromosomique du gène PRAX-1 a été réalisée par hybridation in situ selon la procédure décrite par Heng et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA (1992), 89, 9509-9513 et Chromosoma (1993), 102, 325-332. La sonde cDNA employée est une sonde de 3,5Kb définie sur la séquence SEQ ID n°1 , comprenant l'extrémité 3' du cDNA isolé par double hybride. 100 mitoses ont été analysées, 73 images mitotiques montrent des doubles spots localisés sur une paire de chromosome. Les résultats permettent de localiser le gène PRAX-1 dans la région q22-q23 sur le chromosome 17.
EXEMPLE 7
Expression de l'ARNm PRAX-1 humain
L'analyse de l'expression de l'ARNm PRAX-1 a été réalisée sur membrane Multiple Tissue Northern Blot et RNA Master Blot (Clontech) portant des ARN poly A+ de tissus humains séparés par électrophorèse ou déposés en dot. Les membranes sont préhybridées 1 h à 65°C en tampon Church (BSA 1%, SDS
7%, NaHPθ4 0,5M, EDTA 1 mM), hybridées dans le même tampon contenant la sonde cDNA PRAX-1 , à 65°C pendant la nuit. Les membranes sont lavées pendant 5 min en tampon SDS 5%, BSA 0,5%, NaH2Pθ4 40mM, EDTA 1 mM. Les marquages sont révélés par autoradiographie après 24h d'exposition. Une sonde PRAX-1 de 837pb est préparée par PCR en utilisant les amorces SEQ ID n°3 et SEQ ID n°8. La sonde purifiée sur gel par geneClean (Bio101 ) est
32 radiomarquée au P avec le kit Radprime labeling kit (Gibco) dans les conditions définies par le protocole de marquage du kit.
Les résultats montrent une expression majoritaire du transcrit PRAX-1 dans le cerveau humain. Le transcrit majoritaire visible est de 7,5Kb en accord avec la taille du cDNA déterminée après criblage des banques cDNA.
Le transcrit PRAX-1 présente donc une forte expression dans le système nerveux central, avec une expression variable selon les régions du cerveau. En périphérie le thymus, l'hypophyse se distinguent des autres tissus où l'expression est plus faible. Parmi les tissus foetaux, le cerveau foetal donne un signal fort, suivi par le coeur, le rein, le thymus et le poumon. EXEMPLE 8
Fonctionalité de la protéine PRAX-1
De nouvelles pistes concernant la fonctionalité de cette protéine ont été apportées par des expériences montrant des modulations de son expression. Les expériences ont été réalisées sur lignées cellualires et sur tissus. Des modulations de l'expression de la protéine PRAX-1 ont été observées associées à des processus prolifératifs sur cellules PBL, associées à des lésions neurologiques suite à traitement au kaïnate ou ischémie focale sur tissus. Chez des rats traités au Kaïnate (11 mg/kg en I.P), on observe 9 jours plus tard une diminution drastique de l'expression de PRAX-1 dans cette région hippocampique. Une diminution est également apparente dans les autres régions cérébrales sensibles au kaïnate comme l'amygdale, le cortex piriforme ou le cortex cérébral.
EXEMPLE 9 La démonstration de l'interaction PRAX-1/PBR a été faite chez l'animal par la colocalisation de PRAX-1 et de PBR dans le thymus, le glande surrénale et la peau.
Le promoteur du gène humain codant pour PRAX-1 est connu. Sa caractérisation nous révèle l'existence de sites potentiels de régulation de l'expression de PRAX-1. Le gène humain PRAX-1 fait environ 26Kb et est divisé en 32 exons séparés par 31 introns, la taille des exons varie de 21 à 840pb tandis que la taille des introns varie de 79 à 3300pb. L'analyse des 2,6Kb précédant le site d'initiation de la traduction montre la présence de sites de modulation potentiels de la transcription du gène : 3 sites Sp 1 , 1 site AP-1 , 3 sites AP-2, 2 SRE, 10 GRE, 1 site Zre, 15 sites CACCC, 5 boites CT et des sites de fixation de différents facteurs régulateurs MAZ (deux), C/EBPα (un), c-Ets-2 (un), Puf (trois), GATA-1 (un), MyoD (un), USF (trois), GC rich binding factor (un), SRY (trois) et SOX-5 (un). Les sites Sp1 font partie de la machinerie transcriptionnelle basique et assurent un niveau d'expression. Des facteurs de croissance peuvent moduler l'expression de PRAX-1 par l'intermédiaire des sites SRE. Les sites AP-2 interviennent notamment au cours du développement du système nerveux central, la prolifération et les phénomènes d'oncogenese. Les sites GRE sont des sites de réponse aux glucocorticoïdes et sont soit activateurs soit répresseurs. Ils agissent fréquemment en collaboration avec d'autres facteurs proches. USF est un activateur de la transcription ubiquitaire. Puf intervient dans les suppressions de tumeurs. Les sites CACCC ont notamment été décrits actifs sur cellules sanguines. Le facteur C/EBPcc intervient dans les phénomènes énergétiques, la multiplication cellulaire et la différenciation. D'autres facteurs ont des expressions spécifiques : MyoD intervient dans la myogénèse, MAZ, GATA-1 , c-ets-2 sont impliqués dans l'hématopoïèse et la maturation lymphocytaire, les sites SRY et SOX-5 sont notamment actifs au cours du développement et de l'embryogenèse.
Différentes constructions sont possibles permetteant l'expression de la protéine entière : - CFP-PRAX-1 , expression dans un système cellulaire sous forme de protéine de fusion associée GFP. Clonage dans pEGFP-C1 Clontech ref 6084-1 et p-EGFP-N2, Clontech ref 6081 -1. La transfection de cellules U937 et THP1 par ces plasmides est réalisée selon les conditions définies dans l' EXEMPLE 3 de la présente demande.
- Bluescript-PRAX-1 , expression in vitro de la protéine entière PRAX-1. L'expression de la protéine est réalisée en utilisant des kits de transcription/traduction in vitro (kit Riboprobe Promega, kit Flexi-rabbit Promega).
Une construction est aussi disponible contenant un insert PRAX-1 souris de 1410pb correspondant à l'extrémité N terminale de PRAX-1 , clonage dans le vecteur pcDNA3.

Claims

REVENDICATIONS
I . Polypeptide purifié, comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi : a) la séquence SEQ ID n° 2 ; b) une séquence biologiquement active dérivée de SEQ ID n°2 ; et c) un fragment de la séquence SEQ ID n° 2 ayant une activité biologique de même nature que celle du polypeptide de séquence SEQ ID n° 2, ou immunologiquement apparenté au polypeptide de séquence SEQ ID n° 2.
2. Polypeptide selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend la séquence comprise entre : le résidu 1564 et le résidu 1857 de SEQ ID n° 2.
3. Polypeptide selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il résulte d'un épissage alternatif de l'ARN messager du gène correspondant.
4. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide recombinant produit sous la forme d'une protéine de fusion.
5. Séquence d'acides nucléiques isolée codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes.
6. Séquence d'acides nucléiques isolée selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi : a) la séquence SEQ ID n° 1 ; b) la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID n° 1 ; c) les séquences d'acides nucléiques capables de s'hybrider spécifiquement à la séquence SEQ ID n° 1 , ou à leurs séquences complémentaires, ou de s'hybrider spécifiquement à leurs séquences proximales. d) les séquences dérivées des séquences a), b) et c), du fait de la dégénérescence du code génétique, de mutation, de delétion, d'insertion, d'un épissage alternatif ou d'une variabilité allélique.
7. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 5 et 6.
8. Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pZeoSV2+.
9. Cellule hôte transfectée par un vecteur selon la revendication 7 ou 8.
10. Cellule hôte transfectée selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'il s'agit de E. coli MC 1061.
I I . Séquence nucléotidique utilisable comme sonde ou amorce caractérisée en ce qu'elle s'hybride spécifiquement avec l'une quelconque des séquences selon les revendications 5 et 6 ou leurs séquences complémentaires ou les ARN messagers correspondants ou les gènes correspondants.
12. Séquence nucléotidique selon la revendication 11 utilisable comme sonde ou amorce, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins 16 nuciéotides.
13. Séquence nucléotidique selon la revendication 12 utilisable comme sonde, caractérisée en ce qu'elle comprend l'intégralité de la séquence du gène codant pour l'un des polypeptides de la revendication 1.
14. Sonde ou amorce nucléotidique choisie parmi les oligonucléotides suivants ou leurs complémentaires : SEQ ID n° 3 : GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC
SEQ ID n° 4 : AAC TTG AAT CCA ATG AGC AA
SEQ ID n° 5 : TCT GCT GAC CTG AAA GCT CC
SEQ ID n° 6 : CCA TCA GGG GGC ACA GGC TC
SEQ ID n° 7 : TGG GCC TTG TAC CCC CAG CT SEQ ID n° 8 : TCC TCC TGA GGA GCT GCT TC
SEQ ID n° 9 : CCC CTG CCC GGA AGG GCA GC
SEQ ID n° 10 : TTG ACC AAG GTC ACT GAG CC
SEQ ID n° 1 1 : GGG CCT GCT GGC CCC TGT AA
SEQ ID n° 12 : GCC ATC GGC ATC CTT GTC CC SEQ ID n° 13 : CCT CTC CGG TCT CTG TTG CCC G
SEQ ID n° 14 : AGG CCC AGG GGG CCT CCG AAG GC
SEQ ID n° 15 : CGC TGC CCG CCT CCT GCT CAT CCT C
SEQ ID n° 16 : TCC TCC AGG GCT GGA GAC TGC CT
SEQ ID n° 17 : GGT TCC AGG ACT TGC TCC TTC CAG AAG SEQ ID n° 18 : CAG CTC CCT CAC TGG CCA AG
SEQ ID n° 19 : TGG CTC CGG CCA GCC TGC C
SEQ ID n° 20 : TCC GGG TCA CAG GCT ATG CCA T
SEQ ID n° 21 : CC CAG TAC CTA CTG GGC CAC CT
SEQ ID n° 22 : GCT TCC ATA TCT GTG TGA ATG GG SEQ ID n° 23 : GGT AAG GCA CGG CAG GAG GCT C
SEQ ID n° 24 : GCT GGC TCC TTC TCA CAC TG
SEQ ID n° 25 : GGA GAG CTC ATG GAT GGC CGA AG
SEQ ID n° 26 : CCA GTG AGG TAG AGG AGC TGG
SEQ ID n° 27 : TCC ATT CCC CAG CCT TGC CGG GG SEQ ID n° 28 : GCT CGA AGA ACA GTG CCG CAG CC
SEQ ID n° 29 : TCG CAA GAG CCA GGG CCT GCA GA
SEQ ID n° 30 : GCT GGA ATC GGA GCT CAG CAA G
SEQ ID n° 31 : CCC GTG ATT CTA GGG GAG CCA GAG SEQ ID n° 32 : GAG TGC AGG GAG CTG CAG GCC A SEQ ID n° 33 : GGC TGA AGC GGA AGA ACG CCG AG SEQ ID n° 34 : CAA TCT GGA GCT GCT GAG GG SEQ ID n° 35 : TGA GGT CTG AGG AGA GTT CCA AG SEQ ID n° 36 : ATG GAG CCA TGG GCA CTG CCC
15. Utilisation d'une séquence selon l'une quelconque des revendications 5 et 6 pour la fabrication d'amorces oligonucléotidiques pour des réactions de séquençage ou d'amplification spécifique selon la technique de PCR ou toute variante de celle-ci.
16. Couples d'amorces nucléotidiques choisies parmi les séquences suivantes
- couple n°1 : amorce sens : GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC (SEQ ID n°3) amorce antisens : AAC TTG AAT CCA ATG AGC AA (SEQ ID n°4)
- couple n°2 : amorce sens : TCT GCT GAC CTG AAA GCT CC (SEQ ID n°5) amorce antisens : TCC TCC TGA GGA GCT GCT TC (SEQ ID n°8)
- couple n° 3 : amorce sens : TTG ACC AAG GTC ACT GAG CC (SEQ ID n°10) amorce antisens : AAC TTG AAT CCA ATG AGC AA (SEQ ID n°4)
- couple n° 4 : amorce sens : GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC (SEQ ID n°3) amorce antisens : GCC ATC GGC ATC CTT GTC CC (SEQ ID n°12)
- couple n° 5 : amorce sens : GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC (SEQ ID n°3) amorce antisens : TCC TCC TGA GGA GCT GCT TC (SEQ ID n°8)
17. Utilisation d'une séquence selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, pour la fabrication d'un médicament utilisable en thérapie génique.
18. Utilisation d'une séquence selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, pour la réalisation de sondes ou d'amorces nucléotidiques de diagnostic, ou de séquences antisens utilisables pour la fabrication d'un médicament utilisable en thérapie génique.
19. Utilisation d'amorces nucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 11 et 12 pour le séquençage.
20. Utilisation d'une sonde ou amorce selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, comme outil de diagnostic in vitro pour la détection, par des procédures d'hybridation, de séquences d'acides nucléiques codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans des échantillons biologiques, ou pour la mise en évidence de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques.
21. Méthode de diagnostic in vitro pour la détection de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques au niveau des séquences d'acides nucléiques codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact d'une sonde nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 11 à 16 avec un échantillon biologique dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et ladite séquence nucléotidique, éventuellement après une étape préalable d'amplification de ladite séquence nucléotidique ;
- la détection du complexe d'hybridation éventuellement formé ;
- éventuellement, séquençage de la séquence nucléotidique formant le complexe d'hybridation avec la sonde de l'invention.
22. Utilisation d'une séquence d'acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, pour la production d'un polypeptide recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
23. Méthode de production d'une protéine recombinante PRAX-1 ou fragment ou dérivé biologiquement actif de celle-ci ou fragment immunologiquement apparenté à celle-ci, caractérisée en ce que l'on cultive des cellules transfectees selon la revendication 9 ou 10 dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant de séquence SEQ ID n°2 ou fragment ou dérivé biologiquement actif de celui-ci, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
24. Anticorps mono ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont spécifiquement dirigés contre un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
25. Utilisation des anticorps selon la revendication précédente, pour la purification ou la détection d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans un échantillon biologique.
26. Procédé de diagnostic in vitro de pathologies corrélées à une expression ou une accumulation anormale de protéines PRAX-1, à partir d'un prélèvement biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact au moins un anticorps selon la revendication 24 avec ledit prélèvement biologique, dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques spécifiques entre une protéine PRAX-1 et le ou lesdits anticorps et en ce que l'on détecte les complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés.
27. Kit pour le diagnostic in vitro d'une expression ou une accumulation anormale de protéines PRAX-1 dans un prélèvement biologique et/ou pour la mesure du taux d'expression de celles-ci dans ledit prélèvement comprenant :
- au moins un anticorps selon la revendication 24, éventuellement fixé sur un support,
- des moyens de révélation de la formation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre une protéine PRAX-1 et ledit anticorps et/ou des moyens de quantification de ces complexes.
28. Méthode de détermination d'une variabilité allélique, d'une mutation, d'une delétion, d'une insertion, d'une perte d'hétérozygotie ou d'une anomalie génétique du gène PRAX-1 caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre au moins un nucléotide ayant une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6.
29. Composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
30. Composition pharmaceutique selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide selon la revendication 2.
31. Composition pharmaceutique contenant un inhibiteur ou un activateur de l'activité du PRAX-1 et de toute interaction protéine-protéine faisant intervenir PRAX-1.
32. Composition pharmaceutique contenant un polypeptide dérivé d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il est un inhibiteur ou un activateur de PRAX-1 , ou de toute interaction protéine-protéine faisant intervenir PRAX-1.
PCT/FR1999/001070 1998-05-15 1999-05-06 Polypeptide prax-1 Ceased WO1999060117A2 (fr)

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