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WO1996005312A1 - Nouvel antigene de trypanosoma cruzi, et gene codant pour cette derniere; leur application a la detection de la maladie de chagas - Google Patents

Nouvel antigene de trypanosoma cruzi, et gene codant pour cette derniere; leur application a la detection de la maladie de chagas Download PDF

Info

Publication number
WO1996005312A1
WO1996005312A1 PCT/FR1995/001071 FR9501071W WO9605312A1 WO 1996005312 A1 WO1996005312 A1 WO 1996005312A1 FR 9501071 W FR9501071 W FR 9501071W WO 9605312 A1 WO9605312 A1 WO 9605312A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sequence
protein
seq
trypanosoma cruzi
nucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1995/001071
Other languages
English (en)
Inventor
Glaucia Paranhos-Baccala
Mylène LESENECHAL
Michel Jolivet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9466385&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO1996005312(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Priority to BRPI9506314A priority Critical patent/BRPI9506314B8/pt
Priority to EP95927775A priority patent/EP0723589A1/fr
Priority to CA002173957A priority patent/CA2173957C/fr
Priority to AU31691/95A priority patent/AU3169195A/en
Publication of WO1996005312A1 publication Critical patent/WO1996005312A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa

Definitions

  • the subject of the present invention is a new genetic material coding for a new protein recognized by anti-Trypanoso-ma cruzi antisera, and relates to the use of said gene and protein, in particular for diagnostic, pharmaceutical and therapeutic purposes.
  • Trypanosoma cruzi is a flagellated protozoan parasite, member of the order of Kinetoplastida and of the family of Trypanosomatidae, responsible for the disease of
  • Trypanosoma cruzi occurs in two forms: one mobile thanks to its flagellum or trypomastigote, not dividing; the other aflagellate, or intracellular amastigote, multiplying by binary division.
  • insects will complete the parasite's cycle by ingesting the host's trypomastigote forms during the blood meal. These are different in epimastigote forms in the vector intestine and finally infectious metacyclic trypomastigotes in the posterior intestine.
  • the acute phase occurs after contamination of the transfusion, congenital or vector type and lasts a few weeks. It is characterized by a large number of parasites circulating in the blood and corresponds to an exponential division of the protozoan.
  • the acute phase is most often asymptomatic. However, in infants infected with their mother, the acute phase, which is marked by acute heart disease, can be critical.
  • the chronic phase can last for many years. In some individuals this phase is asymptomatic. On the other hand, other patients have tissue damage in the heart or manifestations of the digestive type. In any case, the clinical diagnosis must always be confirmed by tests to demonstrate either antibodies directed against parasitic antigens, or the parasite itself.
  • This disease is becoming a global problem due to contamination by blood transfusion. It therefore became essential to have diagnostic tests which make it possible to determine the presence of the parasite in individuals.
  • Different serological tests are available, such as direct agglutination, indirect immunofluorescence (IFI), complement fixation tests (RFC), ELISA tests (Enzyme Linked Immunosorbent Assay).
  • IFI indirect immunofluorescence
  • ROC complement fixation tests
  • ELISA tests Enzyme Linked Immunosorbent Assay.
  • the Trypanosoma cruzi antigens used for serological tests originate from a total lysate of the noninfecting stage of the parasite or from partially purified protein fractions. However, these fractions do not allow the obtaining of antigens in sufficient quantity and quality for the development of a reliable serological diagnostic test.
  • the phage lrtrt allows the insertion of foreign DNA with a maximum size of 7Kb into the EcoRI site located in the lac Z gene, under the control of the lac promoter.
  • the product obtained is a recombinant protein in fusion with betagalactosidase, inducible by IPTG (isopropyl thio beta D galactoside).
  • H49 antigen (Paranhos et al., 1994 (1)).
  • this antigen does not allow a sensitivity of serological detection of 100% of patients in the acute or chronic phase. It has therefore been envisaged to combine the H49 antigen with the CRA antigen (Cytoplasmic Repetitive Antigen) (Lafaille et al., (1989) (2)) without thereby solving this problem.
  • CRA antigen Cytoplasmic Repetitive Antigen
  • the present inventors have identified and obtained for the first time a new genetic material coding for a new protein, recognized by anti-sera anti-Trypanosoma cruzi, which overcomes the above disadvantages.
  • the genetic material can be used to produce proteins or polypeptides for the production of diagnostic tests, or for the preparation of vaccine or pharmaceutical compositions, or be used either itself as a probe, or for the determination of specific probes usable in nucleic acid hybridization assays for the detection of Trypanosoma cruzi infections.
  • the protein or any corresponding polypeptide can be used for the production of antibodies specific to the parasite, for diagnostic or passive protection purposes.
  • the subject of the present invention is a DNA or RNA molecule, constituted by at least one strand comprising a nucleotide sequence represented in the identifier SEQ ID N01, or a complementary, or antisense, or equivalent sequence. to said sequence identified in the identifier SEQ ID N01, and in particular a sequence having, for any series of 100 contiguous monomers, at least 50%, preferably at least 60%, or better still, at least 85% with homology said sequence.
  • nucleotide sequence is meant either a strand of DNA or its complementary strand, or a strand of RNA or its antisense strand or their corresponding complementary DNA.
  • the DNA sequence as represented in the identifier SEQ ID N01 corresponds to the sequence of the messenger RNA ⁇ it being understood that the thymine (T) in the DNA is replaced by the uracil (U) in the RNA .
  • two nucleotide sequences are said to be equivalent to each other, or to a reference sequence, if functionally the corresponding biopolymers can play substantially the same role, without being identical, with respect to for the application or use under consideration, or in the technique in which they operate; are in particular equivalent two sequences obtained due to natural variability, in particular spontaneous mutation of the species from which they have been identified, or induced, as well as homologous sequences, the homology being defined below.
  • variability any modification, spontaneous or induced of a sequence, in particular by substitution, and / or insertion, and / or deletion of nucleotides and / or nucleotide fragments, and / or extension and / or shortening of the sequence to at least one of the ends; unnatural variability may result from the genetic engineering techniques used; this variability can result in modifications of any starting sequence, considered as reference, and which can be expressed by a degree of homology with respect to said reference sequence.
  • Homology characterizes the degree of identity of two nucleotide (or peptide) fragments compared; it is measured by the percentage of identity which is notably determined by direct comparison of nucleoditic (or peptide) sequences, compared with reference nucleotide (or peptide) sequences.
  • nucleotide fragment is said to be equivalent to a reference fragment, if it has a nucleotide sequence equivalent to the reference sequence; according to the preceding definition, are in particular equivalent to a reference nucleotide fragment: a) any fragment capable of hybridizing at least partially with the complement of the reference fragment, b) any fragment whose alignment with the reference fragment leads to highlight identical contiguous bases, in greater number than with any other fragment from another taxonomic group.
  • the invention also relates to DNA or RNA fragments whose nucleotide sequence is identical, complementary, antisense, or equivalent to any of the following sequences: - that starting at nucleotide 1232 and ending at nucleotide 2207 of SEQ ID N01
  • the subject of the invention is also a protein, called PTclOO by the Applicant, having an apparent molecular mass of approximately 100 kDa, recognized by anti-sera anti-Trypa-nosoroa cruzi, or an immunological equivalent of this protein; and their fragments.
  • the amino acid sequence of this protein is represented in the sequence identifier SEQ ID N02.
  • immunological equivalent any polypeptide or peptide capable of being immunologically recognized by the antibodies directed against said protein PTclOO.
  • the invention also relates to any fragment of the PTclOO protein.
  • a particular protein fragment has a sequence starting at amino acid 323 and ending at amino acid 520 of the sequence defined in the identifier SEQ ID N02, said fragment being specifically recognized by antisera ant i-Trypanosoma cruzi; the invention also relates to any immunological equivalent of said fragment.
  • the PTclOO protein and said protein fragments may include modifications, in particular chemical modifications, which do not alter their immunogenicity.
  • the present invention also relates to a functional expression cassette, in particular in a cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism, allowing the expression of DNA coding for the whole or a fragment of the protein PTclOO, in particular of a DNA fragment as defined above, placed under the control of the elements necessary for its expression; said protein and said protein fragments being recognized by anti-Trypanosoma cruzi antisera.
  • any cell originating from a prokaryotic or eukaryotic organism can be used in the context of the present invention.
  • Such cells are known to those skilled in the art.
  • a eukaryotic organism such as cells from a mammal, in particular CHO cells (Chinese Hamster Ovarian); insect cells; cells originating from a fungus, in particular single-celled or from a yeast, in particular from the strain Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces and very particularly selected from the group consisting of Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces sloofiae, Schizosaccharomyces octosporus.
  • E coli Escherichia coli
  • enterobacteria cells of enterobacteria.
  • ATCC Rockville, MA, USA
  • AFRC Agriculture & Food Research Council, Norfolk, UK.
  • the cell can be wild type or mutant. The mutations are described in the literature accessible to those skilled in the art.
  • E cell For the purposes of the present invention, an E cell is used.
  • coli DH5a (sold by CLONTECH under the reference: C2007-1).
  • the expression cassette of the invention is intended for the production of the PTclOO protein or for fragments of said protein produced by the above-mentioned E. coli cell, and recognized by human antisera.
  • antisera come from patients who have acquired a recent or old infection with Trypanosoma cruzi, and contain immunoglobulins specifically recognizing PTclOO.
  • the PTclOO protein can also be recognized by other antibodies, such as, for example, monoclonal or polyclonal antibodies obtained by immunization of various species with the aforementioned natural protein, the recombinant protein, their fragments or peptides.
  • protein PTclOO means the cytoplasmic antigen of natural Trypanosoma cruzi, or produced in particular by the techniques of genetic recombination described in the present application, or any fragment or mutant of this antigen provided that it is immunologically reactive with antibodies directed against the protein PTclOO of this parasite.
  • such a protein has an amino acid sequence having a degree of homology of at least 70%, preferably at least 85% and, most preferably, at least 95% by relative to the sequence identified in the identifier SEQ ID N02.
  • an equivalent can be obtained by deletion, substitution and / or addition of one or more amino acids of the native or recombinant protein. It is within the reach of ordinary skill in the art to effect these modifications by known techniques without affecting immunological recognition.
  • the PTclOO protein can be modified in vitro, in particular by deletion or addition of chemical groups, such as phosphates, sugars or myristic acids, so as to improve its stability or the presentation of one or more several epitopes.
  • the expression cassette according to the invention allows the production of a PTclOO protein (having an amino acid sequence as specified above) and of fragments of said protein, fused to an exogenous element which can help with its stability, its purification, its production or its recognition.
  • an exogenous element is within the reach of those skilled in the art. It can in particular be a hapten, an exogenous peptide or a protein.
  • the expression cassette according to the invention comprises the elements necessary for the expression of said DNA fragment in the cell considered.
  • elements necessary for expression is meant all of the elements which allow the transcription of the DNA fragment into messenger RNA (mRNA) and the translation of the latter into protein.
  • mRNA messenger RNA
  • the present invention also extends to a vector comprising an expression cassette according to the invention. It may be a viral vector and in particular a vector derived from a baculovirus, more particularly intended for expression in insect cells, or a vector derived from an adenovirus for expression in mammalian cells.
  • It can also be a plasmid vector with autonomous replication and in particular a multiplier vector.
  • the present invention also relates to a cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism, comprising an expression cassette, either in a form integrated into the cell genome, or inserted into a vector.
  • a cell has been defined previously.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a PTclOO protein, or of fragments of said protein, according to which:
  • a cell from a prokaryotic or eukaryotic organism, comprising the expression cassette according to the invention, is cultured under appropriate conditions;
  • the present invention also relates to one or more peptides, the amino acid sequence of which corresponds to part of the sequence of the PTclOO protein, and which, alone or in admixture, reacts with all of the sera from individuals or animals infected with Trypanosoma cruzi.
  • the peptides can be obtained by chemical synthesis, lysis of the protein PTclOO, or by genetic recombination techniques.
  • the invention also relates to monoclonal or polyclonal antibodies obtained by immunological reaction of a human or animal organism with a munogenic agent i constituted by the natural protein PTclOO, recombinant and their fragments, or by a peptide, as defined above.
  • a munogenic agent i constituted by the natural protein PTclOO, recombinant and their fragments, or by a peptide, as defined above.
  • the present invention also relates to a reagent for the detection and / or monitoring of a Trypanosoma cruzi infection, which comprises, as reactive substance, a PTclOO protein as defined above, or its fragments, a peptide or a mixture of peptides such as defined above, or at least one monoclonal or polyclonal antibody as described above.
  • the above reagent can be attached directly or indirectly to an appropriate solid support.
  • the solid support may in particular be in the form of a cone, a tube, a well, a ball, or the like.
  • the term "solid support” as used herein includes all materials on which a reagent can be immobilized for use in diagnostic testing.
  • Natural, synthetic materials, chemically modified or not, can be used as solid supports, in particular polysaccharides such as cellulose-based materials, for example paper, cellulose derivatives such as cellulose acetate and nitrocellulose; polymers such as vinyl chloride, polyethylene, polystyrenes, polyacrylate or copolymers such as polymers of vinyl chloride and propylene, polymers of vinyl chloride and vinyl acetate; copolymers based on styrene, natural fibers such as cotton and synthetic fibers such as nylon.
  • the solid support is a polystyrene polymer or a butadiene-styrene copolymer.
  • the support is a polystyrene or a styrene-based copolymer comprising between approximately 10 and 90% by weight of styrene units.
  • the fixing of the reagent on the solid support can be carried out directly or indirectly. Directly, two approaches are possible: either by adsorption of the reagent on the solid support, that is to say by non-covalent bonds (mainly of hydrogen, Van der Walls or ionic type), or by establishment of covalent bonds between the reactive and support.
  • an “anti-reagent” compound capable of interacting with the reagent can be fixed beforehand (by adsorption or covalence) capable of interacting with the reagent so as to immobilize the assembly on the solid support.
  • an anti-PTclOO antibody on the condition that it is immunologically reactive with a part of the protein different from that involved in the reaction for recognition of sera antibodies; a ligand-receptor system, for example by grafting on the protein PTclOO a molecule such as a vitamin, and immobilizing on the solid phase the corresponding receptor (for example the biotin-streptavidin system).
  • indirect way is also meant the prior grafting or fusion by genetic recombination of a protein, or a fragment of this protein, or of a polypeptide, at one end of the PTclOO protein, and the immobilization of the latter on the solid support by passive adsorption or covalence of the grafted or fused protein or polypeptide.
  • the invention also relates to a method for the detection and / or monitoring of a Trypanosoma cruzi infection in a biological sample, such as a blood sample from an individual or an animal likely to have been infected with Trypanosoma cruzi, characterized in that said sample is brought into contact with a reagent as defined above, under conditions allowing a possible immunological reaction, and the presence of an immune complex is then detected with said reagent.
  • a biological sample such as a blood sample from an individual or an animal likely to have been infected with Trypanosoma cruzi
  • sandwich-type detection method in one or more stages, as described in particular in patents FR 2 481 318 and FR 2 487 983, which consists in reacting a first monoclonal antibody or polyclonal specific for a desired antigen, fixed on a solid support, with the sample, and to demonstrate the possible presence of an immune complex thus formed by a second antibody labeled with any suitable marker known to man of the profession, in particular a radioactive isotope, an enzyme for example peroxidase or alkaline phosphatase or the like; by so-called competition techniques well known to those skilled in the art.
  • the subject of the invention is also an active immunotherapeutic composition, in particular a vaccine preparation, which comprises, as active principle, a natural, recombinant PTclOO protein or their fragments, or the peptides identified above, the active principle being optionally conjugated with a pharmaceutically acceptable carrier, and optionally an excipient and / or a suitable adjuvant.
  • a vaccine preparation which comprises, as active principle, a natural, recombinant PTclOO protein or their fragments, or the peptides identified above, the active principle being optionally conjugated with a pharmaceutically acceptable carrier, and optionally an excipient and / or a suitable adjuvant.
  • the present invention also covers a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of a Trypanosoma cruzi infection in a human or animal, comprising a therapeutically effective amount of an expression cassette, a vector, a cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism as defined above, from a PTclOO protein according to the invention, or from its fragments, or from an antibody of the invention.
  • the present invention also relates to probes and primers specific for T. cruzi, and their uses in diagnostic tests.
  • probe refers to DNA or RNA comprising at least one strand having a nucleotide sequence allowing hybridization to nucleic acids having a nucleotide sequence as represented in the identifier SEQ ID N01, or a sequence complementary, or antisense, or equivalent to said sequence, and in particular a sequence having, for any continuation from 5 to 100 contiguous monomers, at least 50%, preferably at least 60%, or better still, at least 85% homology to SEQ ID N01, to its fragments, or to a synthetic oligonucleotide allowing such hybridization, unmodified or comprising one or more modified bases such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base.
  • modified bases such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine, dimethylamino-5-deoxyuridine
  • these probes can be modified at the sugar level, namely the replacement of at least one deoxyribose by a polyamide (PE NIELSEN et al. (1991) (13)), or at the phosphate group, for example its replacement with esters, in particular chosen from esters of diphosphate, of alkyl and arylphosphonate and of phosphorothioate.
  • a polyamide PE NIELSEN et al. (1991) (13)
  • esters in particular chosen from esters of diphosphate, of alkyl and arylphosphonate and of phosphorothioate.
  • probes can be much shorter than the sequence identified in the identifier SEQ ID N01.
  • probes comprise at least 5 monomers, advantageously from 8 to 50 monomers, having a specificity for hybridization under determined conditions to form a hybridization complex with DNA or RNA having a nucleotide sequence such as previously defined.
  • a probe according to the invention can be used for diagnostic purposes, as a capture and / or detection probe, or for therapy purposes.
  • the capture probe can be immobilized on a solid support by any suitable means, that is to say directly or indirectly, for example by covalence or passive adsorption.
  • the detection probe is marked by means of a marker chosen from radioactive isotopes, enzymes notably chosen from peroxidase and alkaline phosphatase, and those capable of hydrolyzing a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate, chromophoric chemical compounds, chromogenic, fluorigenic or luminescent compounds, nucleotide-based analogs, and biotin.
  • the probes of the present invention used for diagnostic purposes can be used in all known hybridization techniques, and in particular the so-called "Dot-Blot” techniques (Maniatis et al. (1982) (14)), Southern Blot (Southern EM (1975) (15)), Northern Blot, which is a technique identical to the Southern Blot technique but which uses RNA as target, the sandwich technique (Dunn AR et al. (1977) (16) ).
  • the sandwich technique is used comprising a specific capture probe and / or a specific detection probe, it being understood that the capture probe and the detection probe must have an at least partially different nucleotide sequence.
  • Another application of the invention is a therapy probe for treating infections due to Trypanosoma cruzi, said probe being capable of hybridizing in vivo on the DNA or RNA of the parasite to block the phenomena of translation and / or transcription and / or replication.
  • a primer is a probe comprising from 5 to 30 monomers, having a specificity of hybridization under predetermined conditions, for the initiation of an enzymatic polymerization, for example in an amplification technique such as PCR (Polymerase Chain Reaction) , in an elongation process such as sequencing, in a reverse transcription method or the like.
  • a preferred probe or primer will comprise a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID N07, SEQ ID N08, SEQ ID N09, SEQ ID N010, SEQ ID N012.
  • the invention also relates to a reagent for detecting and / or identifying Trypanosoma cruzi in a biological sample, comprising at least one probe as defined above, in particular a capture probe and a detection probe, one and / or the another that meets the definition above.
  • the invention therefore provides a method for selectively detecting and / or identifying Trypanosoma cruzi in a biological sample, according to which the RNA, extract of the parasite and possibly denatured, or the DNA, denatured extract, or the DNA obtained is exposed. from the reverse transcription of the RNA, to at least one probe as defined above and the hybridization of said probe is detected.
  • FIG. 1 represents the restriction map of the TclOO gene, deduced by Southern blot from different fragments obtained after digestion of Trypanosoma cruzi DNA with restriction endonucleases.
  • Figure 2 is a schematic representation of the three overlapping regions of the TclOO cDNA.
  • the numbered arrows represent the oligonucleotides used as primers for PCR amplification.
  • An expression library was constructed from fragments of genomic DNA from Trypanosoma cruzi.
  • the DNA of T. cruzi, strain G (YOSHIDA. N, (1983) (17)), isolated from metacyclic trypomastigote stage was digested with the enzyme DNase I. After selection of the fragments according to their size, these were ligated to synthetic coRI adapters and cloned into the EcoRI site of the DNA of the vector lambda gtll (Young and Davis , 1983 (3); Cotrim et al., 1990) (4).
  • Tc50 The clone, named Tc50 by the Applicant, was isolated from the bank by immunological screening, using a mixture of sera from patients with Chagas disease in chronic phase.
  • the phage clone Tc50 was purified, amplified and the insert was highlighted by the PCR ("Polymerase Chain Reaction") technique, using the primers:
  • the DNA of the Tc50 clone was sequenced in this same vector, using specific primers located 3 'and 5' from the pGEX cloning site, according to the chain termination technique (Sanger et al ., 1977 (5)) and following the supplier's protocol (USB-Amersham).
  • the nucleotide sequence of the 594 bp Tc50 fragment, as well as its deduced amino acid sequence (198 aa) are represented in the identifiers SEQ ID NOI and SEQ ID N02, respectively.
  • the nucleotide sequence of the 594 bp Tc50 fragment begins at nucleotide (nt) 1232 and ends at nucleotide 1825.
  • the corresponding amino acid sequence begins at amino acid 323 and ends at amino acid 520 of SEQ ID NO2
  • pGEX-Tc50 synthesizes, in the bacterium DH5alpha, a protein in fusion with GST ("Glutathione S Transferase"), of apparent molecular mass of 50 kDa, demonstrated by electrophoresis on polyacrylamide gel SDS- PAGE (SDS: Dodecyl Sodium Sulfate) (Laem li, 1970 (6)).
  • the reactivity of the protein towards chagas humans has been confirmed by the Western blot technique (Towbin et al., 1979 (7)), using the same mixture of chronic phase chagas used for screening. from the bank in lambda gtll.
  • GST-Tc50 obtained after lysis of the bacterial extracts by ultrasound was purified by affinity chromatography on a column of agarose glutathione (Sigma), according to the method of Smith and Johnson, (1988) (8).
  • the antigenic properties of the GST-Tc50 recombinant antigen were tested by ELISA (Voiler et al, 1975 (9)).
  • microtiter plates Maxisorp (trade name), Nunc) were sensitized with 100 ng / ml of the GST-Tc50 antigen in 100 mM NaHC03 (pH 9.6). After incubation with the sera of patients, the immune complexes were detected using an anti-human IgG goat serum, coupled with peroxidase.
  • Example 3 Identification of the native protein of T. cruzi. presenting the anti ⁇ èni ⁇ ues determinants of the Tc50 clone
  • the nuclear DNA of T. cruzi, strain G was digested with different restriction endonucleases (BamHI, EcoRI, HindIII, Pstl, PvuII, Sacl, BamHI / EcoRI, BamHI / PvuII, EcoRI / HindIII, EcoRI / Pstl, EcoRI / PvuII, EcoRI / Sacl, Pstl / Sacl, Pstl / PvuII, PvuII / Sac,
  • the primer SEQ ID N05 is located in the previously sequenced part of the 594 bp fragment of Tc50.
  • the primer SEQ ID N06 corresponds to the primer of the phage lambda gt10.
  • This 1041 bp fragment which begins at nucleotide 1403 and ends at nucleotide 2443 of SEQ ID N01, has an open reading frame, in phase with the sequence of the 594 bp fragment of Tc50.
  • the cDNA was synthesized from total RNA of T epimastigotes. cruzi, strain G.
  • the TclOO cDNA was amplified by the PCR technique, in three different fragments: a fragment A corresponding to the 5 'region of 1459 bp, a fragment B corresponding to the central region of 942 bp, a fragment C corresponding to the 3 ′ region of 1406 bp of the TclOO cDNA, as shown diagrammatically in FIG. 2.
  • SEQ ID N07 corresponds to a part of the consensus sequence of 35 nucleotides present in 5 ′ of mRNAs in trypanosomatids and called "Spliced leader" (Parsons et al. 1984 (11)).
  • SEQ ID NO 08 corresponds to the complementary sequence of part of the predetermined sequence of the 594 bp fragment, and begins at nucleotide 1442 and ends at nucleotide 1459 of SEQ ID N01, according to the numbering of the coding strand.
  • the total cDNA of T. cruzi was amplified by PCR using the primers:
  • sequence ID NO9 which corresponds to a part of the predetermined 594 bp sequence of the TclOO gene, begins at nucleotide 1266 and ends at nucleotide 1287 of SEQ ID NO1.
  • sequence SEQ ID N010 corresponds to the complementary sequence of a part of the previously described sequence of 1041 bp of the TclOO gene. This sequence SEQ ID NO10 begins at nucleotide 2187 and ends at nucleotide 2207 of SEQ ID NO1, according to the numbering of the coding strand.
  • the fragment obtained 942 bp in length, was cloned into the plasmid pCRII and sequenced.
  • the sequence shown in the identifier SEQ ID N01 begins at nucleotide 1266 and ends at nucleotide 2207.
  • the total cDNA of T. cruzi was synthesized using the hybrid primer oligo dT) - ⁇ adapter:
  • the 3 'region of the TclOO cDNA was amplified using the adapter primer and the following pair of primers:
  • sequence SEQ ID N012 corresponds to a part of the previously described sequence 1041 bp of the TclOO gene, starting at nucleotide 1997 and ending at nucleotide 2017.
  • sequence SEQ ID N011 corresponds to the arbitrary sequence of the adapter represented in SEQ ID N011.
  • TclOO cDNA 3402 bp in size, was completely sequenced. It has an open reading frame of 2745 bp, and the deduced amino acid sequence is 915. The methionine codon is in position 266 and the stop codon in position 3011.
  • the TclOO gene of Trypanosoma cruzi codes for the new protein PTclOO, with a theoretical molecular mass of 100 kDa.
  • AAAGCCCATT CATGCGGTGA AGTTTGTGAA TTACCGCAGT AACGTCGCAG CATCGGCTGG
  • REPLACEMENT FEWUE REOE 261 TGCGAAGCGG AAGGCAACAA TGCCAGATTC TTCTCTTCAC GCCACGAGCT CCTTTCAAGG
  • GCTACACGGC GGAATCGACC ATTTTATTAT TATTATTATT GTCTTTAGTA TTATGTTTTT
  • 3370 3380 3390 3400 TTATCCTTAA AAGGAAGAGA GACCAAAAAAAAAA AA
  • RECTIFIED SHEET (RULE 91) 1 INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3 li CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE: liA LENGTH: 24 bases liB TYPE: nucleic acid liC NUMBER OF STRANDS: simple liD CONFIGURATION: linear lii TYPE OF MOLECULE: DNA (phage)

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Abstract

La présente invention concerne un nouvel antigène de Trypanosoma cruzi, dénommé PTc100, et un gène code codant pour ce dernier, dénommé Tc100. Selon l'invention, on a déterminé et décrit les séquences nucléotidiques de Tc100 et d'acides aminés de PTc100. PTc100 et Tc100, ou leurs fragments, modifiés ou non, peuvent être utilisés directement ou indirectement pour la détection de Trypanosoma cruzi, ou le suivi de l'infection générée par ce dernier, chez l'homme ou l'animal.

Description

Nouvel antigène de Trypanosoma Cruzi . et gène codant pour cette dernière ; leur application à la détection de la maladie de Chagas
La présente invention a pour objet un nouveau matériel génétique codant pour une protéine nouvelle reconnue par des antisera anti-Trypanoso-ma cruzi, et concerne l'utilisation desdits gène et protéine, notamment à des fins diagnostique, pharmaceutique et thérapeutique.
Trypanosoma cruzi est un parasite protozoaire flagellé, membre de l'ordre des Kinetoplastida et de la famille des Trypanosomatidae, responsable de la maladie de
Chagas qui affecte naturellement des millions de personnes, principalement en Amérique Latine.
Chez l'hôte vertébré, Trypanosoma cruzi se présente sous deux formes : l'une mobile grâce à son flagelle ou trypomastigote, ne se divisant pas; l'autre aflagellée, ou amastigote intracellulaire, se multipliant par division binaire.
La transmission chez l'homme du protozoaire se fait par l'intermédiaire d'insectes hématophages de la famille des réduviidés, lors d'un repas sanguin suivi de déjections à l'endroit de la piqûre. L'insecte vecteur libère ainsi les formes trypomastigotes métacycliques infectieuses qui, par la voie de la circulation sanguine, vont coloniser de nombreux types cellulaires. Trypanosoma cruzi infecte les cellules musculaires cardiaques et squelettiques, les cellules gliales et celles du système phagocytaire mononucléé. Après pénétration passive dans la cellule hôte, la forme trypomastigote du parasite se différencie en forme amastigote, se divise activement, puis il s'en suit une libération des formes trypomastigotes provoquant ainsi une nouvelle invasion cellulaire.
Les insectes vont compléter le cycle du parasite en ingérant, lors du repas sanguin, les formes trypomastigotes de l'hôte. Ces dernières se différencient en formes épimastigotes dans l'intestin moyen du vecteur et enfin trypomastigotes métacycliques infectieuses dans 1'intestin postérieur.
On distingue deux phases dans la maladie de Chagas: la phase aiguë et la phase chronique. La phase aigiie survient après une contamination de type transfusionnel, congénital ou vectoriel et dure quelques semaines. Elle se caractérise par un nombre important de parasites circulant dans le sang et correspond à une division exponentielle du protozoaire. La phase aigiie est le plus souvent asymptomatique. Toutefois, chez les nourrissons contaminés par leur mère, la phase aigiie, qui est marquée par une cardiopathie aigiie, peut être critique. La phase chronique peut s'étendre sur de nombreuses années. Chez certains individus cette phase est asymptomatique. Par contre d'autres patients présentent des lésions tissulaires au niveau du coeur ou des manifestations de type digestif. En tout état de cause, le diagnostic clinique doit toujours être confirmé par des tests de mise en évidence soit d'anticorps dirigés contre les antigènes parasitaires, soit du parasite lui-même.
Cette maladie devient un problème mondial en raison de la contamination par transfusion sanguine. 11 devenait donc indispensable de disposer de tests de diagnostic qui permettent de déterminer la présence du parasite chez les individus. On dispose de différents tests sérologiques, tels que l'agglutination directe, l'immunofluorescence indirecte (IFI) , les tests de fixation du complément (RFC) , les tests ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) . Les antigènes de Trypanosoma cruzi utilisés pour les tests sérologiques proviennent d'un lysat total du stade non infectant du parasite ou de fractions protéiques partiellement purifiées. Toutefois, ces fractions ne permettent pas l'obtention d'antigènes en quantité et qualité suffisantes pour l'élaboration d'un test fiable de diagnostic sérologique. De plus, la complexité du parasite et le polymorphisme antigénique souche à souche introduisent une difficulté supplémentaire dans la reproductibilité des différentes préparations. Enfin, il existe de nombreux risques de réactivité croisée avec d'autres protozoaires, plus particulièrement avec Trypanosoma rangeli , parasite non pathogène, et la famille des - eis--ma-nie. Un autre désavantage de ces techniques est l'absence de détermination de la phase de la maladie qui permettrait un traitement dès la phase aigiie. Pour résoudre ces divers problèmes, il a été envisagé d'élaborer un kit de diagnostic sérologique composé de protéines recombinantes qui seraient spécifiques de Trypanosoma cruzi .
Différents groupes de recherche ont criblé des banques d'expression d'ADN génomique ou d'ADN complémentaire de Trypanosoma cruzi dans le vecteur lgrtll, par des sera de patients atteints de la maladie de Chagas. Le phage lçrtll permet l'insertion d'ADN étranger d'une taille maximale de 7Kb dans le site EcoRl localisé dans le gène lac Z , sous contrôle du promoteur lac. Le produit obtenu est une protéine recombinante en fusion avec la bétagalactosidase, inductible par l'IPTG (isopropyl thio béta D galactoside) .
Divers gènes de Trypanosoma cruzi , codant pour des protéines reconnues par les sera chagasiques ont ainsi été caractérisés. Parmi les antigènes recombinants décrits, on peut citer l'antigène H49 (Paranhos et al., 1994 (1)). Toutefois, cet antigène ne permet pas une sensibilité de détection sérologique de 100 % des malades en phase aigiie ou chronique. Il a donc été envisagé d'associer l'antigène H49 à l'antigène CRA (Cytoplasmic Répétitive Antigen) (Lafaille et al., (1989) (2)) sans pour autant résoudre ce problème.
Les présents inventeurs ont identifié et obtenu pour la première fois un matériel génétique nouveau codant pour une protéine nouvelle, reconnue par des anti-sera anti-Trypanosoma cruzi, qui permet d'obvier les désavantages précités. Le matériel génétique peut être utilisé pour produire des protéines ou des polypeptides pour la production de tests de diagnostic, ou pour la préparation de compositions vaccinales ou pharmaceutiques, ou être utilisé soit lui même comme sonde, soit pour la détermination de sondes spécifiques utilisables dans des essais d'hybridation d'acides nucléiques pour la détection des infections par Trypanosoma cruzi . De même, la protéine ou tout polypeptide correspondant peuvent être utilisés pour la production d'anticorps spécifiques du parasite, à des fins de diagnostic ou de protection passive.
Ce gène a été dénommé Te 100 par la Demanderesse. Par conséquent, la présente invention a pour objet une molécule d'ADN ou d'ARN, constituée par au moins un brin comprenant une séquence nucléotidique représentée dans l'identificateur SEQ ID N01, ou une séquence complémentaire, ou anti-sens, ou équivalente à ladite séquence identifiée dans l'identificateur SEQ ID N01, et notamment une séquence présentant, pour toute suite de 100 monomères contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou mieux encore, au moins 85 % d'homologie avec ladite séquence.
Par séquence nucléotidique, on entend soit un brin d'ADN ou son brin complémentaire, soit un brin d'ARN ou son brin anti-sens ou leurs ADN complémentaires correspondants. La séquence d'ADN telle que représentée dans l'identificateur SEQ ID N01 correspond à la séquence de l'ARN messager^ étant entendu que la thymine (T) dans l'ADN est remplacée par l'uracile (U) dans l'ARN.
Selon l'invention, deux séquences nucléotidiques sont dites équivalentes l'une par rapport à l'autre, ou par rapport à une séquence de référence, si fonctionnellement les biopolymères correspondants peuvent jouer sensiblement le même rôle, sans être identiques, vis-à-vis de l'application ou utilisation considérée, ou dans la technique dans laquelle elles interviennent ; sont notamment équivalentes deux séquences obtenues du fait de la variabilité naturelle, notamment mutation spontanée de l'espèce à partir de laquelle elles ont été identifiées, ou induite, ainsi que des séquences homologues, l'homologie étant définie ci-après.
Par variabilité, on entend toute modification, spontanée ou induite d'une séquence, notamment par substitution, et/ou insertion, et/ou délétion de nucléotides et/ou de fragments nucléotidiques, et/ou extension et/ou racourcissement de la séquence à l'une au moins des extrémités ; une variabilité non naturelle peut résulter des techniques de génie génétique utilisées ; cette variabilité peut se traduire par des modifications de toute séquence de départ, considérée comme référence, et pouvant être exprimées par un degré d'homologie par rapport à ladite séquence de référence.
L'homologie caractérise le degré d'identité de deux fragments nucléotidiques (ou peptidiques) comparés; elle se mesure par le pourcentage d'identité qui est notamment déterminé par comparaison directe de séquences nucléoditiques (ou peptidiques) , par rapport à des séquences nucléotidiques (ou peptidiques) de référence.
Tout fragment nucléotidique est dit équivalent d'un fragment de référence, s'il présente une séquence nucléotidique équivalente à la séquence de référence ; selon la définition précédente, sont notamment équivalents à un fragment nucléotidique de référence : a) tout fragment susceptible de s'hybrider au moins partiellement avec le complément du fragment de référence, b) tout fragment dont l'alignement avec le fragment de référence conduit à mettre en évidence des bases contigues identiques, en nombre plus important qu•avec tout autre fragment provenant d'un autre groupe taxonomique. c) tout fragment résultant ou pouvant résulter de la variabilité naturelle de l'espèce, à partir de laquelle il est obtenu, d) tout fragment pouvant résulter des techniques de génie génétique appliquées au fragment de référence, e) tout fragment, comportant au moins 30 nucléotides contiguε, codant pour un peptide homologue ou identique au peptide codé par le fragment de référence, f) tout fragment différent du fragment de référence, par insertion, délétion, substitution d'au moins un monomère, extension, ou raccourcissement à l'une au moins de ses extrémités; par exemple tout fragment correspondant au fragment de référence flanqué à l'une au moins de ses extrémités par une séquence nucléotidique ne codant pas pour un polypeptide.
L'invention concerne par ailleurs des fragments d'ADN ou d'ARN dont la séquence nucléotidique est identique, complémentaire, anti-sens, ou équivalente à l'une quelconque des séquences suivantes: - celle commençant au nucleotide 1232 et se terminant au nucleotide 2207 de SEQ ID N01
- celle commençant au nucleotide 1232 et se terminant au nucleotide 1825 de SEQ ID N01
- et celle commençant au nucleotide 1266 et se terminant au nucleotide 2207, et notamment les fragments d'ADN ou d'ARN dont la séquence présente, pour toute suite de 30 monomères contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou mieux encore, au moins 85 % d'homologie avec l'une quelconque desdites séquences.
L'invention a aussi pour objet une protéine, dénommée PTclOO par la Demanderesse, présentant une masse moléculaire apparente d'environ 100 kDa, reconnue par des anti-sera anti-Trypa-nosoroa cruzi , ou un équivalent immunologique de cette protéine; et leurs fragments. La séquence en acides aminés de cette protéine est représentée dans l'identificateur de séquence SEQ ID N02.
Par équivalent immunologique, on entend tout polypeptide ou peptide susceptible d'être immunologiquement reconnu par les anticorps dirigés contre ladite protéine PTclOO.
L'invention concerne aussi tout fragment de la protéine PTclOO. Un fragment protéique particulier présente une séquence commençant à l'acide aminé 323 et se terminant à l'acide aminé 520 de la séquence définie dans l'identificateur SEQ ID N02, ledit fragment étant spécifiquement reconnu par des antisera ant i-Trypanosoma cruzi; l'invention concerne aussi tout équivalent immunologique dudit fragment. La protéine PTclOO et lesdits fragments protéiques peuvent comporter des modifications, notamment chimiques, n'altérant pas leur immunogénicité.
Par ailleurs, la présente invention a également pour objet une cassette d'expression fonctionnelle, notamment dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'ADN codant pour la totalité ou un fragment de la protéine PTclOO, en particulier d'un fragment d'ADN tel que défini précédemment, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression ; ladite protéine et lesdits fragments protéiques étant reconnus par des antisera anti- Trypanosoma cruzi .
D'une façon générale, toute cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote peut être utilisée dans le cadre de la présente invention. De telles cellules sont connues de l'homme de l'art. A titre d'exemples, on peut citer les cellules issues d'un organisme eucaryote, telles que -les cellules issues d'un mammifère, notamment les cellules CHO (Chinese Hamster Ovarian) ; les cellules d'insectes; les cellules issues d'un champignon, notamment unicellulaire ou d'une levure, notamment de la souche Pichia , Saccharomyces, Schizosaccharomyces et tout particulièrement sélectionnée dans le groupe constitué de Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe , Schizosaccharomyces malidevorans , Schizosaccharomyces sloofiae , Schizosaccharomyces octosporus . De même, parmi les cellules issues d'un organisme procaryote, on peut avoir recours, sans que cela constitue une limitation, aux cellules d'une souche de Escherichia coli (E coli ) ou à des cellules d'entérobactéries. Un grand nombre de ces cellules sont disponibles commercialement dans les collections, telles que l'ATCC (Rockville, MA, USA) et l'AFRC (Agriculture & Food Research Council, Norfolk, UK) . La cellule peut être de type sauvage ou mutante. Les mutations sont décrites dans la littérature accessible à l'homme du métier.
Aux fins de la présente invention, on utilise une cellule d'-E. coli DH5a (commercialisée par la société CLONTECH sous la référence : C2007-1) .
La cassette d'expression de l'invention est destinée à la production de la protéine PTclOO ou à des fragments de ladite protéine produits par la cellule E. coli précitée, et reconnus par des antisera humains. De tels antisera proviennent de patients ayant contracté une infection récente ou ancienne par Trypanosoma cruzi, et contiennent des immunoglobulines reconnaissant spécifiquement la PTclOO. Bien entendu, la protéine PTclOO peut également être reconnue par d'autres anticorps, comme par exemple des anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par immunisation d'espèces variées avec la protéine précitée naturelle, la protéine recombinante, leurs fragments ou peptides.
Par protéine PTclOO on entend l'antigène cytoplasmique de Trypanosoma cruzi naturel, ou produit notamment par les techniques de recombinaison génétique décrites dans la présente demande, ou tout fragment ou mutant de cet antigène à la condition qu'il soit immunologiquement réactif avec des anticorps dirigés contre la protéine PTclOO de ce parasite.
De manière avantageuse, une telle protéine possède une séquence en acides aminés présentant un degré d'homologie d'au moins 70 %, de préférence d'au moins 85 % et, de manière tout à fait préférée, d'au moins 95 % par rapport à la séquence identifiée dans 1 ' identificateur SEQ ID N02. En pratique, un tel équivalent peut être obtenu par délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés de la protéine native ou recombinante. Il est à la portée de l'homme de l'art d'effectuer par des techniques connues ces modifications sans affecter la reconnaissance immunologique.
Dans le cadre de la présente invention, la protéine PTclOO peut être modifiée in vitro, notamment par délétion ou addition de groupements chimiques, tels que des phosphates, sucres ou acides myristiques, de manière à améliorer sa stabilité ou la présentation d'un ou de plusieurs épitopes. La cassette d'expression selon l'invention permet la production d'une protéine PTclOO (ayant une séquence en acides aminés telle que spécifiée précédemment) et de fragments de ladite protéine, fusionnés à un élément exogène pouvant aider à sa stabilité, sa purification, sa production ou sa reconnaissance. Le choix d'un tel élément exogène est à la portée de l'homme de l'art. Il peut notamment s'agir d'un haptène, d'un peptide exogène ou d'une protéine.
La cassette d'expression selon l'invention comprend les éléments nécessaires à l'expression dudit fragment d'ADN dans la cellule considérée. Par "éléments nécessaires à l'expression", on entend l'ensemble des éléments qui permettent la transcription du fragment d'ADN en ARN messager (ARNm) et la traduction de ce dernier en protéine. La présente invention s'étend également à un vecteur comprenant une cassette d'expression selon l'invention. Il peut s'agir d'un vecteur viral et notamment d'un vecteur dérivé d'un baculovirus, plus particulièrement destiné à l'expression dans les cellules d'insectes, ou d'un vecteur dérivé d'un adénovirus pour l'expression dans les cellules de mammifères.
Il peut également s'agir d'un vecteur plasmidique à réplication autonome et en particulier d'un vecteur multiplicateur.
La présente invention concerne également une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, comprenant une cassette d'expression, soit sous forme intégrée dans le génome cellulaire, soit insérée dans un vecteur. Une telle cellule a été définie précédemment.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une protéine PTclOO, ou de fragments de ladite protéine, selon lequel :
(i) on cultive dans des conditions appropriées une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, comprenant la cassette d'expression selon l'invention; et
(ii) on récupère la protéine exprimée issue de l'organisme précité.
La présente invention concerne aussi un ou plusieurs peptides, dont la séquence en acides aminés correspond à une partie de la séquence de la protéine PTclOO, et présentant seuls ou en mélange une réactivité avec la totalité des sera d'individus ou d'animaux infectés par Trypanosoma cruzi . Les peptides peuvent être obtenus par synthèse chimique, lyse de la protéine PTclOO, ou par des techniques de recombinaison génétique.
L'invention concerne également des anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par réaction immunologique d'un organisme humain ou animal à un agent i munogène constitué par la protéine PTclOO naturelle, recombinante et leurs fragments, ou par un peptide, tel que défini précédemment.
La présente invention concerne aussi un réactif pour la détection et/ou la surveillance d'une infection par Trypanosoma cruzi , qui comprend à titre de substance réactive une protéine PTclOO telle que définie précédemment, ou ses fragments, un peptide ou un mélange de peptides tels que définis ci-dessus, ou au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que décrit précédemment.
Le réactif ci-dessus peut être fixé directement ou indirectement sur un support solide approprié. Le support solide peut être notamment sous la forme d'un cône, d'un tube, d'un puits, de bille, ou analogues. Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé un réactif pour une utilisation dans les tests de diagnostic. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés chimiquement ou non peuvent être utilisés comme supports solides, notamment des polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ; des polymères tels que chlorure de vinyle, polyéthylène, polystyrènes, polyacrylate ou copolymères tels que polymères de chlorure de vinyle et de propylène, polymères de chlorure de vinyle et acétate de vinyle ; copolymères à base de styrène, des fibres naturelles telles que le coton et les fibres synthétiques telles que le nylon. De préférence, le support solide est un polymère de polystyrène ou un copolymère de butadiène-styrène. Avantageusement, le support est un polystyrène ou un copolymère a base de styrène comprenant entre environ 10 et 90 % en poids de motifs styrène. La fixation du réactif sur le support solide peut être réalisée de manière directe ou indirecte. De manière directe, deux approches sont possibles: soit par adsorption du réactif sur le support solide, c'est à dire par des liaisons non covalentes (principalement de type hydrogène, Van der Walls ou ionique) , soit par établissement de liaisons covalentes entre le réactif et le support. De manière indirecte, on peut fixer préalablement (par adsorption ou covalence) sur le support solide un composé "anti-réactif" capable d'interagir avec le réactif de façon à immobiliser l'ensemble sur le support solide. A titre d'exemple, on peut citer un anticorps anti-PTclOO, à la condition qu'il soit immunologiquement réactif avec une partie de la protéine différente de celle intervenant dans la réaction de reconnaissance des anticorps des sera; un système ligand-récepteur, par exemple en greffant sur la protéine PTclOO une molécule telle qu'une vitamine, et en immobilisant sur la phase solide le récepteur correspondant (par exemple le système biotine- streptavidine) . Par manière indirecte, on entend également le greffage au préalable ou fusion par recombinaison génétique d'une protéine, ou un fragment de cette protéine, ou d'un polypeptide, à une extrémité de la protéine PTclOO, et l'immobilisation de cette dernière sur le support solide par adsorption passive ou covalence de la protéine ou du polypeptide greffé ou fusionné.
L'invention concerne également un procédé pour la détection et/ou la surveillance d'une infection par Trypanosoma cruzi dans un échantillon biologique, tel qu'un échantillon de sang d'un individu ou d'un animal susceptible d'avoir été infecté par Trypanosoma cruzi , caractérisé en ce qu'on met en contact ledit échantillon et un réactif tel que défini ci-dessus, dans des conditions permettant' une éventuelle réaction immunologique, et on détecte ensuite la présence d'un complexe immun avec ledit réactif. A titre d'exemple non limitatif, on peut citer le procédé de détection de type sandwich en une ou plusieurs étapes, tel que notamment décrit dans les brevets FR 2 481 318 et FR 2 487 983, qui consiste à faire réagir un premier anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique d'un antigène recherché, fixé sur un support solide, avec l'échantillon, et à mettre en évidence la présence éventuelle d'un complexe immun ainsi formé par un second anticorps marqué par tout marqueur approprié connu de l'homme du métier, notamment un isotope radioactif, une enzyme par exemple la péroxydase ou la phosphatase alcaline ou analogues; par les techniques dites de compétition bien connues de l'homme du métier.
L'invention a aussi pour objet une composition immunothérapeutique active, notamment une préparation vaccinale, qui comprend à titre de principe actif, une protéine PTclOO naturelle, recombinante ou leurs fragments, ou les peptides identifiés ci-dessus, le principe actif étant éventuellement conjugué avec un support pharmaceutiquement acceptable, et éventuellement un excipient et/ou un adjuvant approprié.
La présente invention couvre également une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention d'une infection par Trypanosoma cruzi chez un homme ou un animal, comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'une cassette d'expression, d'un vecteur, d'une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote tel que défini précédemment, d'une protéine PTclOO selon l'invention, ou de ses fragments, ou d'un anticorps de l'invention.
La présente invention a aussi pour objet des sondes et amorces spécifiques de T. cruzi, et leurs utilisations dans des tests de diagnostic.
Le terme sonde tel qu'utilisé dans la présente invention fait référence à l'ADN ou l'ARN comportant au moins un brin présentant une séquence nucléotidique permettant l'hybridation aux acides nucléiques présentant une séquence nucléotidique telle que représentée dans l'identificateur SEQ ID N01, ou une séquence complémentaire, ou anti-sens, ou équivalente à ladite séquence, et notamment une séquence présentant, pour toute suite de 5 à 100 monomères contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou mieux encore, au moins 85 % d'homologie à SEQ ID N01, à ses fragments, ou à un oligonucléotide de synthèse permettant une telle hybridation, non modifié ou comprenant une ou plusieurs bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5- désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5- désoxyuridine ou toute autre base modifiée. De même, ces sondes peuvent être modifiées au niveau du sucre, à savoir le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P.E NIELSEN et al. (1991) (13)), ou au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters, notamment choisis parmi les esters de diphosphate, d'alkyle et arylphosphonate et de phosphorothioate.
Les sondes peuvent être beaucoup plus courtes que la séquence identifiée dans l'identificateur SEQ ID N01. En pratique, de telles sondes comprennent au moins 5 monomères, avantageusement de 8 à 50 monomères, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec l'ADN ou l'ARN ayant une séquence nucléotidique telle que définie précédemment.
Une sonde selon l'invention peut être utilisée à des fins de diagnostic, comme sonde de capture et/ou de détection, ou à ,des fins de thérapie.
La sonde de capture peut être immobilisée sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption passive. La sonde de détection est marquée au moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes notamment choisies parmi la peroxydase et la phosphatase alcaline, et celles susceptibles d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de base nucléotidique, et la biotine.
Les sondes de la présente invention utilisées à des fins de diagnostic peuvent être mises en oeuvre dans toutes les techniques d'hybridation connues, et notamment les techniques dites "Dot-Blot" (Maniatis et al. (1982) (14)), Southern Blot (Southern E.M. (1975) (15)), Northern Blot, qui est une technique identique à la technique Southern Blot mais qui utilise de l'ARN comme cible, la technique sandwich (Dunn A.R. et al. (1977) (16)). Avantageusement, on utilise la technique sandwich comprenant une sonde de capture spécifique et/ou une sonde de détection spécifique, étant entendu que la sonde de capture et la sonde de détection doivent présenter une séquence nucléotidique au moins partiellement différente.
Une autre application de l'invention est une sonde de thérapie pour traiter les infections dues à Trypanosoma cruzi , ladite sonde étant susceptible de s'hybrider in vivo sur l'ADN ou l'ARN du parasite pour bloquer les phénomènes de traduction et/ou de transcription et/ou de réplication.
Une amorce est une sonde comprenant de 5 à 30 monomères, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions prédéterminées, pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction), dans un procédé d'élongation tel que le séquençage, dans une méthode de transcription inverse ou analogue. Une sonde ou amorce préférentielle comportera une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N07, SEQ ID N08, SEQ ID N09, SEQ ID N010, SEQ ID N012. L'invention concerne aussi un réactif pour détecter et/ou identifier Trypanosoma cruzi dans un échantillon biologique, comprenant au moins une sonde telle que définie précédemment, en particulier une sonde de capture et une sonde de détection, l'une et/ou l'autre répondant à la définition ci-dessus.
L'invention apporte donc un procédé pour détecter sélectivement et/ou identifier Trypanosoma cruzi dans un échantillon biologique, selon lequel on expose l'ARN, extrait du parasite et éventuellement dénaturé, ou l'ADN, extrait dénaturé, ou l'ADN obtenu à partir de la transcription inverse de l'ARN, à au moins une sonde telle que définie précédemment et on détecte l'hybridation de ladite sonde.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre faite en référence aux figures annexées dans lesquelles:
La figure 1, représente la carte de restriction du gène TclOO, déduite par Southern blot de différents fragments obtenus après digestion d'ADN de Trypanosoma cruzi par des endonucléases de restriction.
La figure 2, est une représentation schématique des trois régions chevauchantes de l'ADNc TclOO. Les flèches numérotées représentent les oligonucléotides utilisés comme amorces pour l'amplification PCR.
Exemple 1:Isolement du clone Tc50
Une banque d'expression a été construite à partir de fragments d'ADN genomique de Trypanosoma cruzi . L'ADN de T. cruzi , souche G (YOSHIDA. N, (1983) (17)), isolé du stade trypomastigote métacyclique a été digéré par l'enzyme DNase I. Après sélection des fragments suivant leur taille, ceux-ci ont été ligués à des adaptateurs synthétiques coRI et clones dans le site EcoRI de l'ADN du vecteur lambda gtll (Young et Davis, 1983 (3) ; Cotrim et al. , 1990) (4) .
Le clone, dénommé Tc50 par la Demanderesse, a été isolé de la banque par criblage immunologique, à l'aide d'un mélange de sera de patients atteints de la maladie de Chagas en phase chronique.
Le clone phagique Tc50 a été purifié, amplifié et l'insert a été mis en évidence par la technique PCR ("Polymerase Chain Reaction"), à l'aide des amorces :
SEQ ID N03 5' (GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG)3' 24 , et SEQ ID N04 5' (TTGACACCAGACCAACTGGTAATG)3' 24 correspondant, respectivement, à la séquence nucléotidique des bras gauche et droit de l'ADN du phage lambda gtll.
Le fragment d'ADN Tc50 de 594 paires de bases
(pb) , après digestion par EcoRI, a été sous-cloné dans le vecteur d'expression pGEX (Pharmacia) linéarisé par EcoRI.
Le séquençage de l'ADN du clone Tc50 a été réalisé dans ce même vecteur, à l'aide d'amorces spécifiques situées en 3' et 5' du site de clonage du pGEX, selon la technique de terminaison des chaines (Sanger et al., 1977(5)) et suivant le protocole du fournisseur (USB-Amersham) .
La séquence nucléotidique du fragment Tc50 de 594 pb, ainsi que sa séquence déduite en acides aminés (198 aa) sont représentées dans les identificateurs SEQ ID NOI et SEQ ID N02,respectivement. La séquence nucléotidique du fragment Tc50 de 594 pb commence au nucleotide (nt) 1232 et se termine au nucleotide 1825. La séquence en acides aminés correspondante commence à l'acide aminé 323 et se termine à l'acide aminé 520 de la SEQ ID N02 Exemple 2: Expression du clone Tc50 chez Escherichia coli
La construction pGEX-Tc50 (198 aa) synthétise, dans la bactérie DH5alpha, une protéine en fusion avec la GST ("Glutathion S Transférase") , de masse moléculaire apparente de 50 kDa, mise en évidence par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS-PAGE (SDS: Dodecyl Sulfate de Sodium) (Laem li, 1970(6)). La réactivité de la protéine vis à vis des sera humains chagasiques a été confirmée par la technique de Western blot (Towbin et al., 1979(7)), à l'aide du même mélange de sera chagasiques de phase chronique utilisé pour le criblage de la banque en lambda gtll. La fraction soluble de la protéine recombinante
GST-Tc50 obtenue après lyse des extraits bactériens par ultrasons a été purifiée par chromatographie d'affinité sur colonne de glutathion agarose (Sigma) , selon la méthode de Smith et Johnson, (1988) (8). Les propriétés antigéniques de l'antigène recombinant GST-Tc50 ont été testées par ELISA (Voiler et al, 1975 (9)) . Pour cela, des plaques de microtitrage (Maxisorp (nom commercial) , Nunc) ont été sensibilisées avec 100 ng/ml de l'antigène GST-Tc50 en lOOmM NaHC03 (pH 9,6). Après incubation avec les sera de patients, les immuncomplexes ont été détectés à l'aide d'un sérum de chèvre anti IgG humaines, couplé à la péroxydase.
Les résultats sont présentés dans le tableau annexé et montrent que la totalité des sera humains chagasiques testés réagissent spécifiquement avec la protéine recombinante. Aucune réactivité croisée n'a été observée sur 7 sera de malades atteints de leishmaniose cutanée ou viscérale. Exemple 3: Identification de la protéine native de T. cruzi . présentant les déterminants antiσèniσues du clone Tc50
La mise en évidence de la protéine native de T. cruzi a été effectuée après immunopurification d'un mélange de sera humains chagasiques sur la protéine recombinante corespondante dénommée par la Demanderesse PTc50. L'éluat d'anticorps polyclonaux monospécifiques obtenu a été utilisé comme sonde, en Western blot, sur des extraits protéiques totaux des différents stades du parasite. Les anticorps sélectionnés ont spécifiquement réagi avec une protéine de masse moléculaire apparente de 100 kDa, dénommée PTclOO par la Demanderesse, exprimée dans toutes les souches testées du parasite.
Exemple 4: Analyse moléculaire du gène TclOO
-Southern blots
Afin d'établir la carte de restriction du gène TclOO (figure 1), l'ADN nucléaire de T. cruzi , souche G, a été digéré par différentes endonucléases de restriction (BamHI, EcoRI, HindIII , Pstl , PvuII , Sacl , BamHI /EcoRI , BamHI /PvuII , EcoRI /HindIII , EcoRI/ Pstl , EcoRI/ PvuII , EcoRI/ Sacl , Pstl/Sacl , Pstl/PvuII , PvuII/ Sac ,
PvuII / HindIII) , séparé sur gel d'agarose puis transféré sur filtre de nylon d'après la technique de Southern. L'hybridation des Southern blots a été réalisée avec l'ADN de Te 50 de 594 pb, qui est un fragment de l'ADN de TclOO décrit précédemment, radiomarqué au 32P par incorporation aléatoire (Amersham) .
- Clonage d'un fragment genomique TclOO de 3500 pb D'après les résultats obtenus en Southern blot, l'ADN genomique de T. cruzi , souche G, a été digéré par l'enzyme EcoRI puis séparé sur gel d'agarose. Les fragments de restriction EcoRI d'environ 3500 pb (figure 1) ont été clones dans le vecteur lambda gtlO (Huynh et al., 1984(10)) linéarisé par EcoRI. Le clone phagique contenant l'insert genomique TclOO de 3500 pb a été isolé à l'aide de la sonde radiomarquée de 594 pb décrite ci- dessus. Un fragment de 1041 pb situé dans la région 3' de l'insert genomique TclOO de 3500 pb a été séquence. Ce séquençage a été effectué progressivement à l'aide des amorces suivantes:
SEQ ID N05 5' (TCGGGCACTGACGCGGCG) 3' 18 SEQ ID N06 5' (CTTATGAGTATTTCTTCCAGGGTA) 3' 24
L'amorce SEQ ID N05 est située dans la partie séquencée préalablement du fragment de 594 pb de Tc50. L'amorce SEQ ID N06 correspond à l'amorce du phage lambda gtlO.
Ce fragment de 1041 pb, qui commence au nucleotide 1403 et se termine au nucleotide 2443 de la SEQ ID N01, présente un cadre ouvert de lecture, en phase avec la séquence du fragment de 594 pb de Tc50.
Exemple 5: Clonage de l'ADNc TclOO
L'ADNc a été synthétisé à partir d'ARN totaux d'épimastigotes de T . cruzi , souche G. L'ADNc TclOO a été amplifié par la technique PCR, en trois différents fragments: un fragment A correspondant à la région 5' de 1459 pb, un fragment B correspondant à la région centrale de 942 pb, un fragment C correspondant à la région 3' de 1406 pb de l'ADNc de TclOO, comme représenté schématiquement sur la figure 2.
- Clonage du fragment A de l'ADNc TclOO L'ADNc total synthétisé par la transcriptase inverse de l'AMV ("avian myeloblastosis virus"), à l'aide d'hexanucléotides aléatoires (Boehringer Mannheim) , a été amplifié, par PCR, grâce au couple d'amorces suivant :
SEQ ID N07 5 ' (AACGCTATTATTAGAACAGTT) 3 ' 21 , et SEQ ID N08 5' (TGCAGCAGCGGCAGAAGT) 3 ' 18
La SEQ ID N07 correspond à une partie de la séquence consensus de 35 nucléotides présente en 5' des ARNm chez les trypanosomatides et appelée "Spliced leader" (Parsons et al. 1984(11)).
La SEQ ID N08 correspond à la séquence complémentaire d'une partie de la séquence prédéterminée du fragment de 594 pb, et commence au nucleotide 1442 pour se terminer au nucleotide 1459 de la SEQ ID N01, selon la numérotation du brin codant.
Après vérification en Southern blot à l'aide de la sonde de 594 pb radiomarquée préalablement décrite, le fragment d'ADNc de 1459 pb correspondant à la région 5' de TclOO a été clone dans le plasmide nommé pCRII (nom commercial) (Invitrogen") , et séquence. La séquence représentée dans l'identificateur SEQ ID N01 commence au nucleotide 1 et se termine au nucleotide 1459. - Clonage du fragment B de l'ADNc TclOO
L'ADNc total de T. cruzi a été amplifié par PCR à l'aide des amorces :
SEQ ID N09 : 5' (CAGCCGACGGTAGCTGCGTCCT) 3 ' 22, et SEQ ID N010 : 5' (ACATAATGGCCTCGTTCACAC) 3 ' 21
La séquence ID N09 qui correspond à une partie de la séquence prédéterminée de 594 pb du gène TclOO, commence au nucleotide 1266 et se termine au nucleotide 1287 de la SEQ ID NOl.
La séquence SEQ ID N010 correspond à la séquence complémentaire d'une partie de la séquence préalablement décrite de 1041 pb du gène TclOO. Cette séquence SEQ ID NO10 commence au nucleotide 2187 et se termine au nucleotide 2207 de la SEQ ID NOl, selon la numérotation du brin codant.
Le fragment obtenu, d'une longueur de 942 pb a été clone dans le plasmide pCRII et séquence. La séquence représentée dans l'identificateur SEQ ID N01 commence au nucleotide 1266 et se termine au nucleotide 2207.
- Clonage du fragment C de l'ADNc TclOO
Afin d'isoler la partie 3' de l'ADNc TclOO, l'ADNc total de T. cruzi a été synthétisé à l'aide de l'amorce hybride oligo dT)-^ adaptateur :
SEQ ID N011: 5' (GACTCGCTGCAGATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT) 3 ' 34, suivant le protocole RACE ("Rapid Amplification of cDNA Ends") (Frohman et., 1988(12)).
La région 3' de l'ADNc TclOO a été amplifiée grâce à l'amorce adaptateur et au couple d'amorces suivant:
SEQ ID N012 : 5 ' (CGAAGAGACCATGAACAACTT) 3 ' 21, et SEQ ID N013 : 5' (GACTCGCTGCAGATCGAT) 3 ' 18
La séquence SEQ ID N012 correspond à une partie de la séquence 1041 pb précédemment décrite du gène TclOO, commençant au nucleotide 1997 et se terminant au nucleotide 2017.
La séquence SEQ ID N011 correspond à la séquence arbitraire de l'adaptateur représentée dans la SEQ ID N011.
Après contrôle en Southern blot à l'aide du fragment radiomarqué de 1041 pb, décrit précédemment, le fragment 3' de l'ADNc TclOO, long de 1423 pb, a été clone en pCRII et séquence. La séquence représentée dans l'identificateur SEQ ID NOl commence au nucleotide 1997 et se termine au nucleotide 3402.
L'ADNc complet TclOO, d'une taille de 3402 pb, a été entièrement séquence. Il présente un cadre ouvert de lecture de 2745 pb, et la séquence déduite en amino-acides est de 915. Le codon methionine est en position 266 et le codon stop en position 3011.
Le gène TclOO de Trypanosoma cruzi code pour la nouvelle protéine PTclOO, de masse moléculaire théorique de 100 kDa. Bien entendu, puisque la séquence d'ADN du gène a été entièrement identifiée, il est possible de produire l'ADN correspondant entièrement par synthèse chimique, puis d'insérer l'ADN dans des vecteurs d'ADN disponibles commercialement, en utilisant des techniques connues de la technologie relative à la recombinaison génétique.
TABLEAU
Figure imgf000026_0001
NOMBRE DE SEQUENCES:13
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR:3402 liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: double liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE:ADN complémentaire
lvi ORIGINE:T. cruzi lviA ORGANISME:T. cruzi lviB SOUCHE: G
IviD STADE DE DEVELOPPEMENT: épimastigote lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE:TclOO
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 1
10 20 30 40 50 60
AACGCTATTA TTAGAACAGT TTCTGTACTA TATTGTCATT TGGGGAGGGG GGAAAGGGGG
70 80 90 100 110 120 GAAGTACTTG CCGTTTTGTG TGGGTGACGA GACAACACAC ATCGAGCGGG AAGAAAAAAA
130 140 150 160 170 180 AAAAGGAAAT AAATTAAATT AAATTATTTG TTCTTTGAAT AGGCAAAGAA GAAGAAGAAG
190 200 210 220 230 240 AAAAGGTGCT GGGGAGGGAG GAGAAAGCGA CACACACACA AAAAAAAAAA AAGGAATTGC
250 260 270 280 290 300 GGAAATAACA ACGCAAGGCG CGGACATGAC CGTGACGGTG GATTTGTTCA ATCATGCGAA
310 320 330 340 350 360 GCCGAGCAAC AATGAGGGCC GCGTGTGGTC TGTGGACGCC GCGACATTTA ACGAGGTGCC 370 380 390 400 410 420
TGAGGCGCAG CGTGTGCTGG CGGATTCGCA GTTTTATCTT GCCTACACCA TGAAGCGGCG
430 440 450 460 470 480
TCACGTGCTG CGTGTGGTGA AGCGCTCGAA CCTTTTGAAG GGCACCGTGC GGGCACACTC
490 500 510 520 530 540
AAAGCCCATT CATGCGGTGA AGTTTGTGAA TTACCGCAGT AACGTCGCAG CATCGGCTGG
550 560 570 580 590 600 GAAGGGGGAG TTCTTCGTGT GGGTTGTGAC GGATGAAACG GAGGCGAGCA ACGGCAAGCC
610 620 630 640 650 660 GGATCTCGCA GCCCGCCTCA CAGTGAAGGT GTACTTTAAG CTTCAGGATC CTGTCACAAT 670 680 690 700 710 720
TCCATGCTTT TCTTTCTTTA TCAACGCCGA GAGTCAGCGG CCTGATCTGC TTGTCCTTTA
730 740 750 760 770 780
CGAAACGCAG GCGGCAATTC TTGACAGCTC CTCCCTCATT GAGCGCTTTG ACGTGGAATC
790 800 810 820 830 840
ACTGGAGGCA ACACTACAGC GGAATTGCAC AACCCTGCGA ACCCTGACTC AACCGGTTAG
850 860 870 880 890 900 TGAGAACAGT TTATGCTCCG TTGGCTCTGG CGGATGGTTC ACCTTTACCA CGGAACCAAC
910 920 930 940 950 960
AATGGTAGCG GCATGCACAT TACGAAACCG CAGCACTCCA TCATGGGCGT GTTGCGAGGG 970 980 990 1000 1010 1020
TGAGCCAGTG AAGGCATTGC ATCTCCTTGA CGCAACCGTT GAGGAAAATG TCAGTGTTCT
1030 1040 1050 1060 1070 1080
CGTGGCCGCA TCTACAAAAG GGGTGTACCA ATGGCTCCTT ACGGGTGTAG CAGAACCAAA
1090 1100 1110 1120 1130 1140
CTTGTTGCGC AAGTTTGTCA TTGATGGATC TATTGTCGCG ATGGAAAGCT CACGAGAAAC
1150 1160 1170 1180 1190 1200 GTTTGCCGTG TTTGACGACA GGAAGCAGCT GGCGCTGGTG AACATGCATT CCCCTCATAA
1210 1220 1230 1240 1250 1260 CTTTACCTGC ACACACTACA TGATGCCTTG TCAGGTACAG CGTAACGGCT TTTGCTTCAA 1270 1280 1290 1300 1310 1320
TCGTACAGCC GACGGTAGCT GCGTCCTGGC TGACATGTCG AATCGATTGA CGATCTTCCA
1330 1340 1350 1360 1370 1380
TCTCCGGTCC TCCCGCAGGG AAGAACAGCA GCCAGGCCAA AAAACATCGG TAGTGGCGAC
1390 1400 1410 1420 1430 1440
GGCGAAACCG GGGTGTGTGT CCTCGGGCAC TGACGCGGCG AGTAGCAGTC ATACCAATAC
1450 1460 1470 1480 1490 1500
GACTTCTGCC GCTGCTGCAT CCCCTGCATC ACCCCCTGTT TCAGCGCCAG CGAAGGCAGC
1510 1520 1530 1540 1550 1560
CGCGCCTCCT GCCGCGGCGC GATCGGCTGA GCCGCACGTG GGGAGCAAGA TCATTGCTAA
1570 1580 1590 1600 1610 1620
TCTAGTGAAT CAGCTGGGGA TTAATGTCAC CCAAAGGAGC GTCGTCAGCA CTGGAGCGCC
1630 1640 1650 1660 1670 1680
GGCCACGACG AGGTCTACGG CGGTGACGTC CACGACTACC GCCCCGCAGC GAACAAGTCC
1690 1700 1710 1720 1730 1740
ATACGGGCAC AATGGCCGAC CTGTGACGGC TGGATTGGTG GCAGCTAATA GTGGTGCCAG
1750 1760 1770 1780 1790 1800
CGCGGCCTCG TCTCCCACAG CCGCGGCGAA ACCAACAGGA GAAGAAAAGG CCTCCGCGGC
1810 1820 1830 1840 1850 1860
ATGTGAAACG AGCTCCGTGG CGATAAATGC GACACGCCCG GCGCTTCACA ACGCCTCTCT
1870 1880 1890 1900 1910 1920
CCCGCAGGCG CCAACGGATG GCGTTTTGGC GGCAGCAGTA TACCAGTCGG AGGGCGAGGT
1930 1940 1950 1960 1970 1980 TCATCAGTCG CTGGAGCGGC TGGAGTCCGT CATAACCAAC ACGTCTCGGG TTCTGAAGTT
1990 2000 2010 2020 2030 2040
GCTCCCTGAC ACCATTCGAA GAGACCATGA ACAACTTCTG AATCTGGGTT TAGAGGCACA 2050 2060 2070 2080 2090 2100
GATGACAGAG CTGCAGCAGA GCCGTCCAAC ACCGCAAACA CAGCCGAGAG ACACAAGCTC
2110 2120 2130 2140 2150 2160 CGCGAAATCA TCCGTGTTTG AGACGTACAC CCTTGTTCTC ATTGCGGATT CCCTCTCTCG
2170 2180 2190 2200 2210 2220 CAACATCACG AAGGGGGTGA AGCGTGGTGT GAACGAGGCC ATTATGTTGC ATCTCGACCA
2230 2240 2250 2260 2270 2280 TGAGGTGCGG CACGCCATAG GGAACCGGCT TCGGCAAACA CAAAAGAACA TCATCAAGAG
2290 2300 2310 2320 2330 2340
CCGCCTCGAT GAAGCGTTGA AGGAAAGCAC TACACAGTTT ACGGCTCAAT TGACGCAAAC
2350 2360 2370 2380 2390 2400
GGTGGAGAAT CTGGTGAAGC GCGAGCTTGC CGAGGTGCTT GGTAGCATCA ACGGCTCCCT
2410 2420 2430 2440 2450 2460
CACTTCTCTC GTGAAGGAAA ATGCCTCATT ACAGAAAGAG TTGAATTCCA TAATGTCTAG
2470 2480 2490 2500 2510 2520
TGGGGTGTTG GATGAAATGC GTCGTATGCG GGAAGAGCTG TGCACATTGC GAGAGTCCGT
2530 2540 2550 2560 2570 2580
FEWUE DE REMPLACEMENT (REOE 261 TGCGAAGCGG AAGGCAACAA TGCCAGATTC TTCTCTTCAC GCCACGAGCT CCTTTCAAGG
2590 2600 2610 2620 2630 2640
AAGAAGGTCT GCGCCCGAGA CAATTCTTGC AACCGCGTTA TCGATGGTGC GAGAGCAGCA
2650 2660 2670 2680 2690 2700
ATACCGTCAG GGACTGGAAT ACATGTTGAT GGCTCAGCAG CCCTCTCTCC TCCTGCGGTT
2710 2720 2730 2740 2750 2760 CCTCAGCATA CTTACAAGGG AAAACGAAAA CGCCTACTCG GAACTTATTG AAAATGTAGA
2770 2780 2790 2800 2810 2820
GACGCCGAAT GACGTGTGGT GTTCGGTTCT GTTGCAACTC ATAGAGGCCG CGGCGACGGA 2830 2840 2850 2860 2870 2880
GGCTGAGAAG GAGGTGGTTG TTGGCGTCGC CATTGATATT CTCTCCGAGC GCGATCAAAT
2890 2900 2910 2920 2930 2940 TGCTCAGAAC GGCGCACTCG GCTCGAAACT CACCACCGCC ATGCGAGCCT TTGAGCGACA
2950 2960 2970 2980 2990 3000 GGCAAGGTCG GAGACAACGA GCAGGTCATT CTTGCAATGC CTGAAGAACC TGGAAAAGCT
3010 3020 3030 3040 3050 3060 TCTGCAATCA TGATAATAAA AAGAACTCAA CGAATACAGT TGTTGATTAT TAAGGAAGGG
3070 3080 3090 3100 3110 3120
AAAAGAGAGA AAGAGAGAGA GAGAGAGAGA AATGTAATGG GCGTTTAGTT ACGGTAGAAA 3130 3140 3150 3160 3170 3180
GAAAACGTGT GGATAAGAAG GAGGGGTTTT GTGTGCGACC AGGAATTACT GGGGAACGCT
3190 3200 3210 3220 3230 3240
GCTACACGGC GGAATCGACC ATTTTATTAT TATTATTATT GTCTTTAGTA TTATGTTTTT
3250 3260 3270 3280 3290 3300 TCTTGTGTGT GTGTGTGTGT GTTTGTGTGT GTGCGGTTAT TTTGTATCCG TTTGCTCCCG
3310 3320 3330 3340 3350 3360 CCCCTGCCCC CCATCACCCG AGGAGAAAGT AGAATAAGAC ACATACGATT GTTGTTTTTG
3370 3380 3390 3400 TTATCCTTAA AAGGAAGAGA GACCAAAAAA AAAAAAAAAA AA
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR:915 liB TYPE: protéique lie NOMBRE DE BRINS: simple
lvi ORIGINE:--1, cruzi lviA ORGANISME:T. cruzi lviB SOUCHE:G lvii SOURCE IMMEDIATE: lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE: clOO
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 2
2 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO :
2i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
2iA LONGUEUR : 915 acides aminés 2iB TYPE : protéique
2iC NOMBRE DE BRINS : simple
2vi ORIGINE : T . cruzi 2viA ORGANISME : T. cruzi 2viB SOUCHE : G
2vii SOURCE IMMEDIATE : 2viiA BIBLIOTHEQUE : 2VUB CLONE : TclOO
2xi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 9' 6/05312 PCI7FR95/01071
31
5 10 15 20
Met Thr Val Thr Val Asp Leu Phe Asn His Ala Lys Pro Ser Asn Asn Glu Gly Arg Val
25 30 35 40
Trp Ser Val Asp Ala Ala Thr Phe Asn Glu Val Pro Glu Ala Gin Arg Val Leu Ala Asp 45 50 55 60
Ser Gin Phe Tyr Leu Ala Tyr Thr Met Lys Arg Arg His Val Leu Arg Val Val Lys Arg
65 70 75 80
Ser Asn Leu Leu Lys Gly Thr Val Arg Ala His Ser Lys Pro Ile His Ala Val Lys Phe
85 90 95 100 Val Asn Tyr Arg Ser Asn Val Ala Ala Ser Ala Gly Lys Gly Glu Phe Phe Val Trp Val
105 110 115 120
Val Thr Asp Glu Thr Glu Ala Ser Asn Gly Lys Pro Asp Leu Ala Ala Arg Leu Thr Val
125 130 135 140
Lys Val Tyr Phe Lys Leu Gin Asp Pro Val Thr Ile Pro Cys Phe Ser Phe Phe Ile Asn 145 150 155 160
Ala Glu Ser Gin Arg Pro Asp Leu Leu Val Leu Tyr Glu Thr Gin Ala Ala Ile Leu Asp
165 170 175 180
Ser Ser Ser Leu Ile Glu Arg Phe Asp Val Glu Ser Leu Glu Ala Thr Leu Gin Arg Asn
185 190 195 200 Cys Thr Thr Leu Arg Thr Leu Thr Gin Pro Val Ser Glu Asn Ser Leu Cys Ser Val Gly
205 210 215 220
Ser Gly Gly Trp Phe Thr Phe Thr Thr Glu Pro Thr Met Val Ala Ala Cys Thr Leu Arg
225 230 235 240
Asn Arg Ser Thr Pro Ser Trp Ala Cys Cys Glu Gly Glu Pro Val Lys Ala Leu His Leu 245 250 255 260
Leu Asp Ala Thr Val Glu Glu Asn Val Ser Val Leu Val Ala Ala Ser Thr Lys Gly Val
265 270 275 280
Tyr Gin Trp Leu Leu Thr Gly Val Ala Glu Pro Asn Leu Leu Arg Lys Phe Val Ile Asp
285 290 295 300 Gly Ser Ile Val Ala Met Glu Ser Ser Arg Glu Thr Phe Ala Val Phe Asp Asp Arg Lys
305 310 315 320
Gin Leu Ala Leu Val Asn Met His Ser Pro His Asn Phe Thr Cys Thr His Tyr Met Met
325 330 335 340
Pro Cys Gin Val Gin Arg Asn Gly Phe Cys Phe Asn Arg Thr Ala Asp Gly Ser Cys Val 345 350 355 360
Leu Ala Asp Met Ser Asn Arg Leu Thr Ile Phe His Leu Arg Ser Ser Arg Arg Glu Glu
365 370 375 380
Gin Gin Pro Gly Gin Lys Thr Ser Val Val Ala Thr Ala Lys Pro Gly Cys Val Ser Ser
385 390 395 400 Gly Thr Asp Ala Ala Ser Ser Ser His Thr Asn Thr Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ser Pro
405 410 415 420
Ala Ser Pro Pro Val Ser Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Ala Ala Arg Ser
425 430 435 440
Ala Glu Pro His Val Gly Ser Lys Ile Ile Ala Asn Leu Val Asn Gin Leu Gly Ile Asn 445 450 455 460
Val Thr Gin Arg Ser Val Val Ser Thr Gly Ala Pro Ala Thr Thr Arg Ser Thr Ala Val
465 470 475 480
Thr Ser Thr Thr Thr Ala Pro Gin Arg Thr Ser Pro Tyr Gly His Asn Gly Arg Pro Val
485 490 495 500 Thr Ala Gly Leu Val Ala Ala Asn Ser Gly Ala Ser Ala Ala Ser Ser Pro Thr Ala Ala
505 510 515 520
Ala Lys Pro Thr Gly Glu Glu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Glu Thr Ser Ser Val Ala Ile
525 530 535 540
Asn Ala Thr Arg Pro Ala Leu His Asn Ala Ser Leu Pro Gin Ala Pro Thr Asp Gly Val 545 550 555 560
Leu Ala Ala Ala Val Tyr Gin Ser Glu Gly Glu Val His Gin Ser Leu Glu Arg Leu Glu
565 570 575 580
Ser Val Ile Thr Asn Thr Ser Arg Val Leu Lys Leu Leu Pro Asp Thr Ile Arg Arg Asp 585 590 595 600
His Glu Gin Leu Leu Asn Leu Gly Leu Glu Ala Gin Met Thr Glu Leu Gin Gin Ser Arg
605 610 615 620
Pro Thr Pro Gin Thr Gin Pro Arg Asp Thr Ser Ser Ala Lys Ser Ser Val Phe Glu Thr
625 630 635 640 Tyr Thr Leu Val Leu Ile Ala Asp Ser Leu Ser Arg Asn Ile Thr Lys Gly Val Lys Arg
645 650 655 660
Gly Val Asn Glu Ala Ile Met Leu His Leu Asp His Glu Val Arg His Ala Ile Gly Asn
665 670 675 680
Arg Leu Arg Gin Thr Gin Lys Asn Ile Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ala Leu Lys Glu 685 690 695 700
Ser Thr Thr Gin Phe Thr Ala Gin Leu Thr Gin Thr Val Glu Asn Leu Val Lys Arg Glu
705 710 715 720
Leu Ala Glu Val Leu Gly Ser Ile Asn Gly Ser Leu Thr Ser Leu Val Lys Glu Asn Ala
725 730 735 740 Ser Leu Gin Lys Glu Leu Asn Ser lie Met Ser Ser Gly Val Leu Asp Glu Met Arg Arg
745 750 755 760
Met Arg Glu Glu Leu Cys Thr Leu Arg Glu Ser Val Ala Lys Arg Lys Ala Thr Met Pro
765 770 775 780
Asp Ser Ser Leu His Ala Thr Ser Ser Phe Gin Gly Arg Arg Ser Ala Pro Glu Thr Ile 785 790 795 800
Leu Ala Thr Ala Leu Ser Met Val Arg Glu Gin Gin Tyr Arg Gin Gly Leu Glu Tyr Met
805 810 815 820
Leu Met Ala Gin Gin Pro Ser Leu Leu Leu Arg Phe Leu Ser Ile Leu Thr Arg Glu Asn
825 830 835 840 Glu Asn Ala Tyr Ser Glu Leu Ile Glu Asn Val Glu Thr Pro Asn Asp Val Trp Cys Ser
845 850 855 860
Val Leu Leu Gin Leu Ile Glu Ala Ala Ala Thr Glu Ala Glu Lys Glu Val Val Val Gly
865 870 875 880
Val Ala Ile Asp Ile Leu Ser Glu Arg Asp Gin lie Ala Gin Asn Gly Ala Leu Gly Ser 885 890 895 900
Lys Leu Thr Thr Ala Met Arg Ala Phe Glu Arg Gin Ala Arg Ser Glu Thr Thr Ser Arg
905 910 915
Ser Phe Leu Gin Cys Leu Lys Asn Leu Glu Lys Leu Leu Gin Ser
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 24 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (phagique)
lui HYPOTHETIQUE : non
liv ANTI-SENS : non
lv TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucleotide de synthèse lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 3
GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG 24
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 24 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (phagique)
lui HYPOTHETIQUE : non
liv ANTI-SENS : oui
lv TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucleotide de synthèse lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 4
TTGACACCAGACCAACTGGTAATG 24
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 18 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique)
lui HYPOTHETIQUE : non
liv ANTI-SENS : non
lv TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucleotide de synthèse lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 5
TCGGGCACTGACGCGGCG 18
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 24 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (phagique lambda g lO)
lui HYPOTHETIQUE : non
liv ANTI-SENS : oui
lv TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucleotide de synthèse lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 6
CTTATGAGTATTTCTTCCAGGGTA 24
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 21 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADNc
lui HYPOTHETIQUE : non
liv ANTI-SENS : non
IV TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucleotide de synthèse lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 7
AACGCTATTATTAGAACAGTT 21
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 18 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique)
lui HYPOTHETIQUE : non
liv ANTI-SENS : oui
lv TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucleotide de synthèse vii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 8
TGCAGCAGCGGCAGAAGT 18
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 22 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique)
lui HYPOTHETIQUE : non
liv ANTI-SENS : non
lv TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucleotide de synthèse lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 9
CAGCCGACGGTAGCTGCGTCCT 22
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 21 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique)
lui HYPOTHETIQUE : non
liv ANTI-SENS : oui
lv TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucleotide de synthèse lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 10
ACATAATGGCCTCGTTCACAC 21
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 3< bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADNc
lui HYPOTHETIQUE : non
liv ANTI-SENS : oui
lv TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucleotide de synthèse lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 11
GACTCGCTGCAGATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT 34
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 21 bases liB TYPE: acide nucléique lie NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique)
lui HYPOTHETIQUE : non
liv ANTI-SENS : non
lv TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucleotide de synthèse lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 12
CGAAGAGACCATGAACAACTT 21
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13 li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 18 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN
lui HYPOTHETIQUE : non
liv ANTI-SENS : oui
lv TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucleotide de synthèse lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 13
GACTCGCTGCAGATCGAT 18
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Claims

REVENDICATIONS 1- Molécule d'ADN ou d'ARN, caractérisée en ce qu'elle est constituée par au moins un brin comprenant une séquence nucléotidique identique, complémentaire, anti- sens, ou équivalente à la séquence identifiée dans l'identificateur SEQ ID NOl, et notamment une séquence présentant, pour toute suite de 100 monomères contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou mieux encore, au moins 85 % d'homologie avec ladite séquence 2- Fragment d'ADN ou d'ARN, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique identique, complémentaire, anti-sens, ou équivalente à la séquence commençant au nucleotide 1232 et se terminant au nucleotide 2207 de la SEQ ID N01, et notamment une séquence présentant, pour toute suite de 30 monomères contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou mieux encore, au moins 85 % d'homologie avec ladite séquence.
3- Fragment d'ADN ou d'ARN, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique identique, complémentaire, anti-sens, ou équivalente à la séquence commençant au nucleotide 1232 et se terminant au nucleotide 1825 de la séquence SEQ ID N01, et notamment une séquence présentant, pour toute suite de 30 monomères contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou mieux encore, au moins 85 % d'homologie avec ladite séquence.
4- Fragment d'ADN ou d'ARN, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique identique, complémentaire, anti-sens, ou équivalente à la séquence commençant au nucleotide 1266 et se terminant au nucleotide 2207 de la SEQ ID N01, et notamment une séquence présentant, pour toute suite de 30 monomères contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou mieux encore, au moins 85 % d'homologie avec ladite séquence. 5- Substance protéique reconnue par des anti-sera anti Trypanosoma cruzi , caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe comprenant :
- une protéine de masse moléculaire apparente d'environ 100 kDa, reconnue par des antisera anti-
Trypanosoma cruzi
- tout équivalent immunologique de ladite protéine
- et tout fragment de ladite protéine.
6- Substance protéique, selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe comprenant :
- une protéine ayant une séquence en acides aminés, identifiée dans l'identificateur SEQ ID N02
- tout fragment de ladite protéine. 7- Fragment protéique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence en acides aminés commençant à l'acide aminé 323 et se terminant à l'acide aminé 520 de la SEQ ID N02, ou tout équivalent immunologique dudit fragment. 8- Cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'ADN codant pour un fragment protéique selon la revendication 7 ou d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6. 9- Cassette d'expression selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est fonctionnelle dans les cellules issues d'un organisme eucaryote, notamment les cellules issues d'un mammifère, les cellules d'insectes, les cellules issues d'un champignon, les cellules issues d'une levure.
10- Cassette d'expression selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est fonctionnelle dans les cellules issues d'un organisme procaryote, notamment les cellules issues d'une souche d'E. coli ou les cellules issues d'entérobactéries. 11- Cassette selon la revendication 10, caractérisée en ce que la cellule issue d'un organisme procaryote est une cellule de la souche d'E. coli DH5a.
12- Cassette d'expression selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisée en ce que l'ADN code pour une protéine reconnue par des anti-sera anti- Trypanosoma cruzi , ayant la séquence identifiée dans l'identificateur de séquence SEQ ID N02, débutant à l'acide aminé +1 et se terminant à l'acide aminé +915, ou tout équivalent immunologique de ladite protéine.
13- Cassette d'expression selon l'une des revendications 8 à il, caractérisée en ce que l'ADN code pour une protéine spécifique de Trypanosoma cruzi , ayant la séquence identifiée dans l'identificateur de séquence SEQ ID N02, débutant à l'acide aminé 323 et se terminant à l'acide aminé 520.
14- Vecteur comprenant une cassette d'expression selon l'une des revendications 8 à 13.
15- Cellule issue d'un organisme eucaryote ou procaryote comprenant une cassette d'expression selon l'une des revendications 8 à 13 ou un vecteur selon la revendication 14.
16- Procédé de préparation d'une protéine selon la revendication 5 ou 6, ou d'un fragment protéique selon la revendication 7 selon lequel:
(i) on cultive dans des conditions appropriées une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote selon la revendication 15, et
(ii) on récupère ladite protéine produite par ladite cellule issue dudit organisme.
17- Peptide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence peptidique appartenant à la protéine selon la revendication 5 ou 6, ou" à un fragment protéique selon la revendication 7, et en ce qu'il présente une réactivité avec des sera d'individus ou d'animaux infectés par T. cruzi . 18- Composition peptidique, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de peptides, selon la revendication 17.
19- Anticorps monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par réaction immunologique d'un organisme humain ou animal à un agent immunogène constitué par une protéine selon la revendication 5 ou 6, ou à un fragment protéique selon la revendication 7, ou un peptide selon la revendication 17. 20- Réactif pour la détection et/ou la surveillance d'une infection par Trypanosoma cruzi , caractérisé en ce qu'il comprend, à titre de substance réactive, au moins un anticorps selon la revendication 19.
21- Réactif pour la détection et/ou la surveillance d'une infection par Trypanosoma cruzi , caractérisé en ce qu'il comprend, à titre de substance réactive, une protéine selon la revendication 5 ou 6, ou un fragment protéique selon la revendication 7, ou un peptide selon la revendication 17, ou une composition peptidique selon la revendication 18.
22- Moyen de détection et/ou de surveillance d'une infection par Trypanosoma cruzi , caractérisé en ce qu'un réactif selon l'une des revendications 20 ou 21, est fixé sur un support solide compatible avec ledit réactif. 23- Procédé pour la détection et/ou la surveillance d'une infection par Trypanosoma cruzi dans un échantillon biologique, tel qu'un échantillon de sang d'un individu ou d'un animal susceptible d'avoir été infecté par Trypanosoma cruzi , caractérisé en ce qu'on met en contact ledit échantillon et un réactif selon la revendication 20 ou 21, dans des conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, et on détecte ensuite la présence d'un complexe immun avec ledit réactif.
24- Sonde pour l'identification de Trypanosoma cruzi , caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique permettant l'hybridation à un acide nucléique dont la séquence nucléotidique correspond à tout ou partie de la séquence représentée dans l'identificateur SEQ ID NOl, ou de la séquence complémentaire, anti-sens, ou équivalente à ladite séquence, et notamment une séquence présentant, pour toute suite de 5 à 100 monomères contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou mieux encore, au moins 85 % d'homologie avec ladite séquence.
25- Sonde selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de 5 à 100, en particulier de huit à 50 nucléotides.
26- Sonde de thérapie pour le traitement des infections dues à Trypanosoma cruzi , caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique permettant l'hybridation à un acide nucléique dont la séquence nucléotidique correspond à tout ou partie de la séquence représentée dans l'identificateur SEQ ID N01, ou de la séquence complémentaire, anti-sens, ou équivalente à ladite séquence, et notamment une séquence présentant, pour toute suite de 5 à 100 monomères contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou mieux encore, au moins 85 % d'homologie avec ladite séquence.
27- Amorce pour l'amplification d'une séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique permettant l'hybridation à un acide nucléique dont la séquence nucléotidique correspond à tout ou partie de la séquence représentée dans l'identificateur SEQ ID N01, ou de la séquence complémentaire, anti-sens, ou équivalente à ladite séquence', et notamment une séquence présentant, pour toute suite de 5 à 100 monomères contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou mieux encore, au moins 85 % d'homologie avec ladite séquence.
28- Amorce selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique d'au moins cinq nucléotides. 29- Amorce selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N07, SEQ ID N08, SEQ ID N09 , SEQ ID N010 et SEQ ID N012. 30- Composition pharmaceutique pour prévenir ou traiter les infections dues à Trypanosoma cruzi , caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif une quantité thérapeutiquement active d'une substance protéique selon la revendication 5 ou 6, d'un fragment protéique selon la revendication 7, d'une cassette selon l'une des revendications 8 à 13, d'un vecteur selon la revendication 14, d'une cellule selon la revendication 15, ou un d'anticorps selon la revendication 19. 31- Réactif pour détecter et/ou identifier
Trypanosoma cruzi dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une sonde dite de capture et/ou une sonde de détection selon la revendication 24 ou 25, ladite sonde de capture et ladite sonde de détection, si présentes toutes les deux, ayant respectivement des séquences nucléotidiques au moins partiellement différentes.
32- Réactif selon la revendication 31, caractérisé en ce que la sonde de capture est fixée sur un support solide directement ou indirectement.
33- Réactif selon la revendication 31, caractérisé en ce que la sonde de détection est marquée au moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes notamment choisies parmi la peroxydase et la phosphatase alcaline et celles susceptibles d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, des composés fluorigènes, luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et la biotine. 34- Réactif selon la revendication 31, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une amorce selon l'une des revendications 27 à 29.
35- Procédé de détection et/ou d'identification de Trypanosoma cruzi dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on expose l'ADN extrait et dénaturé de Trypanosoma cruzi, ou l'ADN obtenu par transcription inverse de l'ARN, à au moins une sonde selon la revendication 24 ou 25, puis on détecte l'hybridation de ladite sonde.
36- Procédé de détection et/ou d'identification de Trypanosoma cruzi dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on expose l'ARN extrait et éventuellement dénaturé de Trypanosoma cruzi à au moins une sonde selon la revendication 24 ou 25, puis on détecte l'hybridation de ladite sonde.
37- Procédé selon la revendication 35 ou 36, caractérisé en ce que, avant d'exposer l'ADN ou l'ARN à ladite sonde, on réalise une amplification dudit ADN ou ARN, en présence d'un système enzymatique approprié, et avec au moins une amorce selon l'une des revendications 27 à 29.
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