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WO1999041265A1 - Nouvelles substances kf-1040 et leur procede de fabrication - Google Patents

Nouvelles substances kf-1040 et leur procede de fabrication Download PDF

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WO1999041265A1
WO1999041265A1 PCT/JP1998/000614 JP9800614W WO9941265A1 WO 1999041265 A1 WO1999041265 A1 WO 1999041265A1 JP 9800614 W JP9800614 W JP 9800614W WO 9941265 A1 WO9941265 A1 WO 9941265A1
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WO
WIPO (PCT)
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substance
culture
producing
present
substances
Prior art date
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PCT/JP1998/000614
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English (en)
French (fr)
Inventor
Satoshi Omura
Hiroshi Tomoda
Rokuro Masuma
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Kitasato Institute
Original Assignee
Kitasato Institute
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to a novel KF-140 substance having lipid metabolism inhibitory activity and a method for producing the same.
  • Conventional technology a novel KF-140 substance having lipid metabolism inhibitory activity and a method for producing the same.
  • sphingomyelin a lipid that is a component of biological membranes
  • cytokines such as interleukin-11 and tumor necrosis factor-H
  • Triacylglycerolemia is also thought to increase trisylglycerol synthesis in the intestine and liver, causing lipoproteinemia containing high triacylglycerol in the blood. Therefore, a substance that inhibits diacylglycerol-acyltransferase, which controls the selective synthesis of triacylglycerol, is expected to suppress the accumulation of triacylglycerol and be effective for such diseases. Under such circumstances, providing a substance having an activity of inhibiting diacylglycerol-acyltransferase is useful for treating various adult diseases such as obesity and hyperlipidemia and arteriosclerosis based thereon. It is.
  • the present inventors have continued various studies on metabolites produced by microorganisms and found that diasylglycerol was contained in a culture of KF-140 strain newly isolated from seaweed. It has been found that a substance having an inhibitory activity on acyltransferase and an inhibitory activity on sphingomyelinase is produced. Next, as a result of separating and purifying these active substances that inhibit lipid metabolism from the culture, substances having the chemical structures represented by the following formulas (I) and (II) were found, and these have been completely known. Each of these substances
  • KF-1 040 A and B substances will be referred to as KF-1 040 substances.
  • the present invention has been completed based on this finding, and has the following formula (I)
  • the present invention further provides a method for culturing a microorganism belonging to the genus Gliocladium and capable of producing a KF-1040A substance and / or a KF-1040B substance in a culture medium. Accumulate KF-104 OA substance and / or KF-104B substance in the nutrient solution. From the culture, KF-104A substance and Z or KF-104B Sampling KF—related to the production of 140 substances.
  • the present invention also relates to a microorganism belonging to the genus Gliocladium and capable of producing the KF_104A substance and the Z or KF-140B substance, wherein the microorganism is a Gliocladium sp. KF-104 (G liocladi um s p.KF-1 0 4
  • KF-140 substance producing bacterium is Glio cladium.
  • KF-140 strain isolated by the present inventors is an example of a strain most effectively used in the present invention.
  • the bacteriological properties of the KF-1040 strain are as follows.
  • This strain is relatively good on potato-glucose agar medium, corn-meal agar medium, wort agar medium, Miura agar medium, seawater starch agar medium containing 50% seawater (salinity 3.4%).
  • the conidium grows well.
  • the conidiophores of verticillate (25 to 50 m in length) are erect from the basal hyphae, and are cut off from the long flask at the tip or branch, and become filiaride (3. From 0 to 5.0 X 17 to 25 m), a conidium mass is formed independently.
  • the conidia are colorless in penici 11 ate and have an elliptic shape ranging in size from 2.5 to 3.0 X 3.0 to 5.0 / m to an oblong shape, and one end is slightly pointed.
  • the vertici 1 ate is a colorless ellipse to an oblong, measuring 2.5-3.0 X 6.0-8.5 ⁇ m.
  • the optimal growth conditions for this strain are pH 4-8, temperature 17-27 ° C, and seawater concentration 0-50%.
  • the growth range of this strain is pH 3 ⁇ 10, temperature 9 ⁇ 32 ° C, * seawater concentration 0 ⁇ 200%.
  • KF-140 substance-producing bacterium used in the present invention include the above-described glioblast sp.
  • KF-140 strain and include naturally-occurring mutants, X-ray irradiation, ultraviolet irradiation, and N-methyl- It belongs to the genus Gliocladium, including artificial mutants, cell fusions, and genetically engineered strains that can be obtained by mutagenesis of N'-nitro-N-nitrosogazine, 2-aminopurine, etc. All strains producing the KF-140 substance represented by [II] (hereinafter collectively referred to as "KF-140 substance" unless otherwise specified) can be used in the present invention.
  • KF-1040 substance producing bacterium belonging to the genus Gliocladium is cultured in a medium.
  • Nutrient sources suitable for the production of the above KF-1040 substances include a carbon source that can be assimilated by microorganisms, a nitrogen source that can be digested, and a nutrient medium containing inorganic salts and vitamins as necessary. used.
  • a carbon source sugars such as glucose, fructose, maltose, lactose, galactose, dextrin, starch, etc., and vegetable oils such as soybean oil are used alone or in combination.
  • a nitrogen source peptone, yeast extract, meat extract, soybean flour, cottonseed flour, corn steep liqueur, malt extract, casein, amino acids, urea, ammonium salts, nitrates, etc. are used alone or in combination. .
  • salts such as phosphate, magnesium salt, calcium salt, sodium salt, potassium salt, etc.
  • Heavy metal salts such as iron salts, manganese salts, copper salts, cobalt salts, and zinc salts, vitamins, and other substances suitable for the production of the KF-140 substance are appropriately added.
  • an antifoaming agent such as a liquid paraffin, an animal oil, a vegetable oil, a silicone, or a surfactant may be added as necessary.
  • the medium may be liquid or solid as long as it contains the above-mentioned nutrient source. In the case of small-scale production, culturing using a flask is preferable.
  • aeration-agitation culture In order to industrially produce the target substance in large quantities, it is preferable to carry out aeration-agitation culture similarly to other fermentation products.
  • aeration-agitation culture When cultivating in a large tank, in order to prevent the growth of the bacteria from delaying during the production process, first inoculate the culture with a relatively small amount of the culture, and then transfer the culture to a large tank. Therefore, production culture is preferred.
  • the composition of the medium used for the culture and the medium used for the production culture may be the same, or both may be changed if necessary.
  • known methods such as stirring with a propeller or other machine, rotation or shaking of a meter, pumping, and air blowing are appropriately used. Use sterilized air for ventilation.
  • the culture temperature can be appropriately changed within a range in which the present KF-140 substance producing bacterium produces the present KF-140 substance, but it is usually 20 to 30 and preferably 27 ° C. It is better to culture before and after.
  • the culture pH is usually 5 to 8, preferably around 7.
  • the culturing time varies depending on the culturing conditions, but is usually about 10 to 20 days.
  • the KF-140 substance thus obtained is present in the cultured cells and the culture filtrate.
  • the product is extracted with a water-miscible organic solvent such as acetone, and the extract is distilled under reduced pressure to remove the organic solvent, and then the residue is extracted with a water-immiscible organic solvent such as ethyl acetate.
  • a water-miscible organic solvent such as acetone
  • a water-immiscible organic solvent such as ethyl acetate
  • known methods used for collecting fat-soluble substances for example, adsorption chromatography, gel filtration chromatography, thin-layer chromatography, centrifugal countercurrent distribution chromatography, high-performance liquid chromatography, etc. are appropriately combined, or By repeating, the KF-140 substance can be separated and purified into each component.
  • the physicochemical properties of the KF-140A substance according to the present invention are as follows.
  • the physicochemical properties of the KF-1040B substance according to the present invention are as follows.
  • this KF-1004B substance has a chemical structure represented by the following formula [II]. Was determined to be.
  • the diacylglycerol-acyltransferase activity was determined by the method of Mayorek and Bar-Tana (Journal 'Ob' Biological Chemistry 1, 260, 6528-6532, 198). 5 years) with some modifications. That is, using the microsomal fraction prepared from rat liver as an enzyme source, 175 mM Tris-HCl containing 8 mM MgC12.1 mg Zm1 ⁇ serum albumin and 2.5 mM diisopropylfluorophosphate (pH 8. 0) carbonochloridate Ffa to 0.
  • the result of calculating the concentration that inhibits the production of triacylglycerol by 50% was 10 g / nU for the present KF-104 OA substance and 10 g / m1 for the present KF_104B substance. .
  • the effect on neutral sphingomyelinase from rat brain was Mi and Arima's method (Journal of Ob'Neurochemistry I, 52, 611-16-1618, 1989) was carried out with a modification. That is, the membrane fraction prepared from rat brain as an enzyme source, 2 0 mM HEP ES- Na_ ⁇ _H buffer (pH 7. 4), 6. 5mM MgC l 2, 0. 1% Triton X- l 0 0, 25 ⁇ M [N- methyl-3 H] Sufui Ngomieri down the (0. 0 0 6 / zC i ) was added and the total volume of 5 0 a 1.
  • the novel substance according to the present invention exhibits an inhibitory activity on diasylglycerol-acyltransferase and an inhibitory activity on sphingomyelinase, and thus is related to arteriosclerosis, obesity, thrombosis, inflammation and immune function. It is useful for prevention and treatment of illness.
  • FIG. 1 shows the ultraviolet absorption spectrum (in methanol) of the KF-1040A substance of the present invention.
  • FIG. 2 shows the infrared absorption spectrum (KBr method) of the KF-104OA substance of the present invention.
  • FIG. 3 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum (in heavy methanol) of the KF-1040A substance of the present invention.
  • FIG. 4 shows the 13 C nuclear magnetic resonance spectrum (in heavy methanol) of the KF-104 OA substance of the present invention.
  • FIG. 5 shows the ultraviolet absorption spectrum (in methanol) of the KF-1040B substance of the present invention.
  • FIG. 6 shows the infrared absorption spectrum (KBr method) of the KF-1040B substance of the present invention.
  • FIG. 7 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum (in heavy methanol) of the KF-1040B substance of the present invention.
  • FIG. 8 shows a 13 C nuclear magnetic resonance spectrum (in heavy metal) of the KF-1040B substance of the present invention.
  • Gliocladium sp. KF-140 strain (G liocladium sp. KF-104, FERM BP-625), cultured on an agar slant medium, shows glucose 2.0%, polypeptone (Japan) Pharmaceutical company) 0.5%, Yeast extract (Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.2%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05%, potassium dihydrogen phosphate 0.1%, agar 0.1 Liquid medium (PH 6.0) dissolved in 50% natural seawater was dispensed in 100 ml aliquots into two 500 ml Erlenmeyer flasks. The cells were cultured with shaking for 4 days.
  • PH 6.0 Liquid medium
  • a liquid medium prepared by dissolving 100 g of potatoes and 1.0% of glucose in 50% natural seawater was added to 60 bottles of 100 ml Rubin. After 0 ml was charged, sterilized and cooled, the seeded culture solution was aseptically transplanted into each rubin in 3 ml portions, and cultured at 27 ° C. for 16 days. After adding 18 liters of acetone to the obtained whole culture solution and stirring well, the mixture was concentrated under reduced pressure, extracted again with ethyl acetate, and concentrated under reduced pressure to obtain 2.2 g of a crude substance.
  • the novel KF-1040 substance according to the present invention exhibits an inhibitory activity against diasylglycerol-transyltransferase and an inhibitory activity against sphingomyelinase. It is expected to be useful for prevention and treatment of function-related diseases.

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Description

明 細 書 新規 KF - 1 0 4 0物質およびその製造法 発明の属する技術分野
本発明は、 脂質代謝阻害活性を有する新規 KF - 1 0 4 0物質およびその製 造法に関するものである。 従来の技術
従来、 いくつかの抗肥満薬や高脂血症薬物が知られている。 例えば中枢性食 欲抑制剤は、 食欲を抑えることにより脂質生合成を減少させるものであるが、 食 欲を減退させるためにかえって健康を害する場合がある。 それ故、 副作用のない 新しい抗肥満薬や高脂血症治療薬の開発が望まれている。 一方、 生体膜成分である脂質の 1つスフィンゴミエリンの加水分解反応は、 インターロイキン一 1 や腫瘍壊死因子—ひなどのサイトカインによる細胞内情 報伝達 （Y. A. Ha n n u n、 ジャーナル 'ォブ 'バイオロジカルケミストリ 一、 2 6 9巻、 3 1 25— 3 1 2 8頁、 1 9 9 4年； R. Ko l e s n i c kと D. W. G 0 1 d e、 セル、 7 7巻、 325— 3 2 8頁、 1 9 9 4年） や T細胞 の活性化における細胞内情報伝達 （L. M. B o u c h e rら、 ジャーナル -ォ ブ 'イクスメンタルメディスン、 1 8巻、 20 5 9— 2 0 6 8頁、 1 9 9 5年； 越智厚雄、 メディシナルイ厶ノロジィ一、 2 8巻、 3 9 7— 4 0 1頁、 1 9 9 4 年） に関与しており、 動脈硬化、 炎症、 血栓症などの疾患や免疫調節機構などに 働いていることが最近明らかにされてきた。 しかし、 このスフイ ンゴミエリンの 加水分解酵素であるスフィンゴミエリナーゼを特異的にかつ強力に阻害する薬剤 からの当該疾患に対する予防、 治療薬は未だ実用化されていない。 発明が解決しょうとする課題
近年、 食生活の向上に伴い、 トリァシルグリセロールの蓄積に起因した肥満 症や高脂血症の患者が増加する傾向にあり、 種々の病変の原因ないし誘因として 治療医学および予防医学上大きな問題を提示している。 トリァシルグリセ口一ル 蓄積による肥満症や高脂血症と併発しやすい病気として、 動脈硬化症、 脂肪肝、 高血圧症、 糖尿病等があり、 現在これらの患者数は増加する傾向にある。 肥満症は身体の貯蔵脂肪、 主としてトリグリセリ ドが過剰に蓄積した状態で あり、 トリァシルグリセロールの合成が増加し、 脂肪細胞内に異常に脂肪が蓄積 することに起因する。 トリァシルグリセロール血症もまた、 腸や肝臓でのトリア シルグリセロール合成が亢進し、 血中に高トリアシルグリセ α—ルを含んだリポ タンパク血症を惹起すると考えられている。 したがって、 トリァシルグリセロー ルの選択的な合成を司るジァシルグリセロールァシル転移酵素を阻害する物質は 、 トリァシルグリセロールの蓄積を抑制し、 かかる疾病に有効であることが期待 される。 かかる実情において、 ジァシルグリセロールァシル転移酵素阻害活性を有す る物質を提供することは、 肥満症や高脂血症さらにそれに基く動脈硬化などの種 々の成人病の治療上有用なことである。
また、 生体膜成分脂質であるスフィンゴミエリンを分解するスフィンゴミエ リナ一ゼを阻害することにより今までにない新しい作用に基づく抗動脈硬化剤、 抗血栓剤、 抗炎症剤や免疫抑制剤として利用できることが期待される。 課題を解決するための手段
本発明者らは、 微生物の生産する代謝産物について種々研究を続けた結果、 新たに海藻から分離した K F— 1 0 4 0菌株の培養物中にジァシルグリセロール ァシル転移酵素阻害活性とスフィ ンゴミエリナーゼ阻害活性を有する物質が産生 されることを見出した。 次いで、 該培養物からこれら脂質代謝を阻害する活性物 質を分離、 精製した結果、 後記の式 〔I〕 および 〔 I I〕 で示される化学構造を 有する物質を見出し、 これらは従来全く知られていないことから、 各々本物質を
KF- 1 040 A及び B物質と称することにし、 その総称を KF— 1 040物質 と称することにした。 本発明はかかる知見に基づいて完成されたものであって、 下記式 〔I〕
Figure imgf000005_0001
で表される KF— 1 040 A物質および下記式 〔I I〕
Figure imgf000005_0002
で表される KF— 1 040 B物質からなる KF— 1 040物質に関するものであ る。 本発明は更に、 グリオクラジウム属に属し、 KF— 1 040 A物質および/ または KF— 1 040 B物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、 培 養液中に KF— 1 0 4 O A物質および/または KF— 1 0 4 0 B物質を蓄積せし め、 該培養物から KF— 1 0 4 0 A物質および Zまたは KF— 1 0 4 0 B物質を 採取する KF— 1 0 4 0物質の製造法に関するものである。 本発明はまた、 グリオクラジウム属に属し、 KF_ 1 0 4 0 A物質および Z または KF— 1 0 4 0 B物質を生産する能力を有する微生物が、 グリオクラジゥ ム エスピー KF— 1 0 4 0 (G l i o c l a d i um s p. KF - 1 0 4
0、 FERM BP— 6 2 5 1 ) である KF— 1 0 4 0物質の製造法に関するも のである。 本発明は更にまた、 グリオクラジウム属に属し、 KF— 1 0 4 O A物 質および または KF— 1 0 4 0 B物質を生産する能力を有する微生物に関する ものである。 前記の式 〔 I〕 および 〔 I I〕 で表される KF— 1 0 4 0物質を 産する能 力を有する微生物 （以下、 「KF— 1 0 4 0物質生産菌」 と称する） は、 グリオ クラジウム属に属するが、 例えば本発明者らが分離したグリオクラジウム エス ピー KF— 1 0 4 0菌株は、 本発明において最も有効に使用される菌株の一例 である。 本 KF— 1 0 4 0菌株の菌学的性状を示すと、 以下の通りである。
1. 形態的性質
本菌株は、 海水 （塩分濃度 3. 4 %) を 5 0 %含むバレイショ · ブドウ糖寒 天培地、 コーン · ミール寒天培地、 麦芽汁寒天培地、 三浦寒天培地、 海水澱粉寒 天培地などで比較的良好に生育し、 分生子の着生も良好である。
コーン ' ミール寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると、 菌糸は 透明で隔壁を有している。 分生子柄は、 ほうき状 （p e n i c i 1 1 a t e) と 輪生 (v e r t i c i l l a t e) とが混在している。 p e n i c i 1 1 a t e の分生子柄 （長さ 1 0 0〜2 0 0 ) は基底菌糸より直立または分岐し、 先端 または分岐上でほうき状に輪生した大きさ 2. 5 3. 0 X 1 0〜23 /mの数 本のフィアラィド上に分生子塊を形成する。 一方、 ve r t i c i l l a t eの分生子柄 （長さ 25〜 50 m) は基底 菌糸より直立し、 先端または分岐上で長フラスコ形からきり状で先端に向かって 先細となったフィアライド （大きさは 3. 0〜5. 0 X 1 7〜25 m) から単 独で分生子塊が形成される。 分生子は、 p e n i c i 1 1 a t eでは無色で大き さ 2. 5〜3. 0 X 3. 0〜5. 0 /mの楕円形から長楕円形で一端がわずかに 尖るものがある。 v e r t i c i 1 1 a t eでは、 無色の楕円形から長楕円形で 大きさ 2. 5〜3. 0 X 6. 0〜8. 5〃mである。
2. 培養上の諸性状
本菌株を各種培地上で 25で、 1 4日間培養した場合の肉眼的に観察した結 果は、 下記の第 1表に示したとおりである。 なお、 これらの培地において、 菌核 または菌核様の構造は形成されなレ、。
第 1表 培地 培地上の生育状態 コロニー表 コロニー裏 可溶性
(コロニーの直径） 面の色調 面の色調 色素 バレイショ · 良好 （28〜30隱） 明灰色 明灰色 無し ブドウ糖寒天 羊毛状、 平坦
培地 コーン . ミー 良好 （24〜30 mm) 明灰色 明灰色 無し ル寒天培地 羊毛状、 帯状 入 J3 i T V tV ノ t-i t_j J /\ レ 培地 羊毛状、 平坦
—— iffl 人 }入 t M IK ci 照レ 培地 羊毛状、 ややしわ状 海 iWフノ」\ (¾¾粉 rJ X .好J
Figure imgf000008_0001
m 1111m11ノ すし口 t
寒天培地 羊毛状、 平坦
3. 生理的、 生態的性状
( 1 ) 最適生育条件
本菌株の最適生育条件は、 p H 4〜 8、 温度 1 7〜 27 °C、 * 海水濃度 0〜 50 %である。
* ：塩分濃度 3. 4 %の天然海水を使用
(2) 生育範囲
本菌株の生育範囲は、 p H 3〜 1 0、 温度 9〜 32 °C、 * 海水濃度 0〜 20 0 %である。
* :塩分濃度 3. 4%の天然海水を使用
( 3 ) 好気性、 嫌気性の区別 好気性 以上のように、 本菌株 KF - 1 040株の形態的特徴、 培養性状および生理 的性状に基づき、 既知菌種との比較を試みた結果、 本菌株はグリオクラジウム （ G 1 i 0 c 1 a d i urn) 属に属するー菌株と同定し、 グリオクラジウム エス ピ一 KF— 1 040と命名した。 なお、 本菌株はグリオクラジウム エスピー KF- 1 040 (G l i o c l a d i um s p. KF - 1 040 ) として、 平成 1 0年 2月 6日に工業技術院生命工学工業技術研究所に FERM P - 1 6 6 2 9として寄託され、 平成 1 0年 2月 1 2日に日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号に所在する通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に原寄託より ブ夕ぺスト条約に基づく寄託への移管請求により FERM BP— 6 25 1 とし て寄託されている。 本発明で使用される KF— 1 0 4 0物質生産菌としては、 前述のグリオクラ ジゥム エスピー KF— 1 0 4 0菌株が挙げられるが、 自然変異株、 X線照射 、 紫外線照射、 N—メチル—N' —ニトロ— N—二トロソグァ二ジン、 2—アミ ノプリン等の変異処理により取得できる人工変異株、 細胞融合株、 遺伝子操作株 も含め、 グリオクラジウム属に属し、 前記式 〔 I〕 および 〔 I I〕 で表される K F- 1 0 4 0物質 （以下、 特記しない限り 「KF— 1 0 4 0物質」 と総称する） を生産する菌株は、 全て本発明において使用することができる。 本発明を実施するに当たっては、 先ずグリオクラジウム属に属する KF— 1 0 4 0物質生産菌を培地に培養することにより行われる。 上記 KF— 1 0 4 0物 質生産に適した栄養源としては、 微生物が同化し得る炭素源、 消化し得る窒素源 、 さらには必要に応じ無機塩、 ビタミ ン等を含有させた栄養培地が使用される。 炭素源としては、 グルコース、 フラク ト一ス、 マルトース、 ラク トース、 ガラク トース、 デキストリン、 澱粉等の糖類、 大豆油等の植物性油脂類が単独または組 み合わせて用いられる。 窒素源としては、 ペプトン、 酵母エキス、 肉エキス、 大豆粉、 綿実粉、 コー ン ·スチープ · リカ一、 麦芽エキス、 カゼィン、 アミノ酸、 尿素、 アンモニゥム 塩類、 硝酸塩類等が単独または組み合わせて用いられる。 その他必要に応じてリ ン酸塩、 マグネシウム塩、 カルシウム塩、 ナトリウム塩、 カリウム塩等の塩類、 鉄塩、 マンガン塩、 銅塩、 コバルト塩、 亜鉛塩等の重金属塩類やビタミン類、 そ の他本 K F— 1 0 4 0物質の生産に好適なものが適宜添加される。 培養するに当たり、 発泡の激しいときには、 必要に応じて液体パラフィン、 動物油、 植物油、 シリ コン等、 界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。 上記の 培養は、 上記栄養源を含有すれば、 培地は液体でも固体でもよいが、 通常は液体 培地を用い、 培養するのがよい。 少量生産の場合にはフラスコを用いる培養が好 適である。 目的物質を大量に工業生産するには、 他の醱酵生産物と同様に、 通気 攪拌培養するのが好ましい。 培養を大きなタンクで行う場合、 生産工程において、 菌の生育遅延を防止す るため、 はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、 次に培養物を大 きなタンクに移して、 そこで生産培養するのが好ましい。 この場合、 俞培養に使 用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、 両者ともに同一であっても よいし、 必要があれば両者を変えてもよい。 培養を通気攪拌条件で行う場合、 例えばプロペラやその他機械による攪拌、 ファメーターの回転または振とう、 ポンプ処理、 空気の吹き込み等既知の方法が 適宜使用される。 通気用の空気は滅菌したものを使用する。
培養温度は、 本 K F— 1 0 4 0物質生産菌が本 K F - 1 0 4 0物質を生産する 範囲内で適宜変更し得るが、 通常は 2 0〜3 0で、 好ましくは 2 7 °C前後で培養 するのがよい。 培養 p Hは、 通常は 5〜8、.好ましくは 7前後で培養するのがよ レ、。 培養時間は培養条件によっても異なるが、 通常は 1 0〜2 0日程度である。 このようにして得られた本 K F - 1 0 4 0物質は、 培養菌体および培養濾液 に存在する。 培養物から目的とする K F— 1 0 4 0物質を採取するには、 全培養 物をァセトン等の水混和性有機溶媒で抽出し、 抽出液を減圧下有機溶媒を留去後 、 続いて残渣を酢酸ェチル等の水不混和性有機溶媒で抽出することによって行わ I 上記の抽出法に加え、 脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、 例えば吸 着クロマトグラフィー、 ゲル濾過クロマトグラフィー、 薄層クロマトグラフィー 、 遠心向流分配クロマトグラフィー、 高速液体クロマトグラフィー等を適宜組合 わせ、 あるいは繰り返すことにより、 KF— 1 0 4 0物質を各成分に分離、 精製 することができる。 本発明による KF— 1 0 4 0 A物質の理化学的性状は次のとおりである。
( 1 ) 性状： 白色粉末
(2) 分子量： 7 7 6 (高速原子衝撃質量分析による）
(3) 分子式： C40H72〇14
(4) 比旋光度： [ひ] D 25二 + 6 2° (c = 0. 1、 メタノール）
(5) 紫外部吸収極大 （メタノール中） ：第 1図に示すとおり、 2 0 3 ηπι (ε = 24 9 0 0) 、 22 0 nm (ε = 1 8 0 0 0) 、 2 7 5 nm (ε = 1 2 0 0) に極大吸収を有する。
( 6) 赤外部吸収極大 （KB r錠） ：第 2図に示すとおり、 1 6 3 7、 34 34 cm 1に極大吸収を有する。
(7) プロトン核磁気共鳴スぺク トル （重メタノール中） ：第 3図に示すとおり c
(8) 13C核磁気共鳴スぺク トル （重メタノール中） ：第 4図に示すとおり。
(9) 溶剤に対する溶解性： メタノール、 ベンゼン、 クロ口ホルム、 酢酸ェチル に可溶。 水、 へキサンに難溶。
( 1 0) 呈色反応：硫酸、 リンモリブデン酸に陽性。
( 1 1 ) 酸性、 中性、 塩基性の区別： 中性物質 以上のように、 本 KF— 1 0 4 0 A物質の各種理化学的性状やスぺク トルデ 一夕を検討した結果、 本 KF— 1 0 4 OA物質は下記式 〔 I〕 で表される化学構 造であることが決定された。
Figure imgf000012_0001
本発明による KF— 1 0 4 0 B物質の理化学的性状は次のとおりである。
( 1 ) 性状：白色粉末
(2) 分子量： 8 1 8 (高速原子衝撃質量分析による）
(3) 分子式： C42H74〇15
(4) 比旋光度： [ひ] 。 25 = + 1 2 0° (c = 0. 1、 メタノール）
(5) 紫外部吸収極大 （メタノール中） ：図 5に示すとおり、 204 nm (e = 4 3 0 0 0) 、 2 1 8 nm (£ = 3 0 3 0 0) 、 272 nm (ε = 2 9 0 0) に極大吸収を有する。
(6) 赤外部吸収極大 （KB r錠） ：第 6図に示すとおり、 1 6 3 3、 34 1 7 cm 1に極大吸収を有する。
(7) プロトン核磁気共鳴スぺクトル （重メタノール中） ：第 7図に示すとおり <
(8) 13C核磁気共鳴スぺクトル （重メタノール中） ：図 8に示すとおり。
( 9 ) 溶剤に対する溶解性： メタノール、 ベンゼン、 クロ口ホルム、 酢酸ェチ ルに可溶、 水、 へキサン難溶
( 1 0) 呈色反応：硫酸、 リンモリブデン酸に陽性
( 1 1 ) 酸性、 中性、 塩基性の区別：中性物質 以上のように、 本 KF— 1 04 0 B物質の各種理化学的性状やスぺク トルデ 一夕を検討した結果、 本 KF— 1 04 0 B物質は下記式 〔 I I〕 で表される化学 構造であることが決定された。
Figure imgf000013_0001
上記したように、 本 KF— 1 0 4 0 A物質および KF— 1 0 4 0 B物質の各 種理化学的性状について詳述したが、 このような性質に一致する化合物はこれま でに全く報告されておらず、 それ故、 本発明による KF— 1 0 4 0物質は新規物 質であると決定した。 次に本 KF— 1 0 4 OA及び B物質の生物学的性状について詳細に述べる。 ( 1 ) ラッ ト由来ジァシルグリセロールァシル転移酵素に対する
阻害作用
ジァシルグリセロールァシル転移酵素活性は、 Ma y o r e kと B a r— T a n aの方法 （ジャーナル 'ォブ 'バイオロジカルケミストリ一、 2 6 0巻、 6 5 28— 6 5 3 2頁、 1 9 8 5年） を一部改変して则定した。 すなわち、 ラッ ト肝より調製したミクロソーム画分を酵素源として用い、 8 mM Mg C 12 . 1 mgZm 1ゥシ血清アルブミン、 2. 5 mMジイソプロピ ルフルォロリン酸を含む 1 7 5mMトリス塩酸 （p H 8. 0 ) ノくッファーに 0. 7 5 mMジォレオイルグリセロール、 30 M [ 1—14 C] パルミ トイル— C o A ( 0. 0 2〃 C i ) を加え、 全容量 20 0〃 1 とし、 23 °Cで 1 5分間反応さ せ、 総脂質をクロ口ホルム ： メタノール （ 1 ： 2) 混合液で抽出後、 TLC (キ ーゼルゲル GF 254 、 展開溶媒として石油エーテル： ジェチルエーテル：酢酸、 8 0 : 2 0 : 1 ) で各脂質を分離後、 R I ラジオスキャナ一 （アンビス社製） で トリァシルグリセ口一ル画分の放射活性を計測し、 ジァシルグリセロールァシル 転移酵素活性を測定した。
本酵素を 5 0 %阻害する薬剤濃度を算定した結果は、 本 KF - 1 0 4 O A物 質は 1 6 g/m 1、 本 KF— 1 0 4 0 B物質は 9. 0 n g/m 1であった。
( 2) ヒ ト由来細胞 （ヒトバーキッ トリ ンパ腫由来の R a j i細胞） に
おけるトリアシルグリセロール生成に対する阻害作用
トリァシルグリセロール生成に対する影響は、 供田らの方法 （ジャーナル - ォブ ·バィォロジカルケミストリ一、 2 6 6巻、 4 2 1 4— 4 2 1 9頁、 1 9 9 1年） に従い、 ヒト由来系細胞 （ヒトバーキッ トリ ンパ腫由来 R a j i細胞） を 用いて行った。
2. 7 X 1 06 c e 1 1 s Zm 1の R a j i細胞液 [ 1 — 14C] ォレイン酸 ( 0. 0 2 C i ) を全容量 2 0 0 1 とし、 3 7 °Cで 3 0分間反応させ、 総脂 質をクロ口ホルム ： メタノール （ 2 ： 1 ) 混合液で抽出後、 以下ラッ ト由来ジァ シルグリセロールァシル転移酵素系に対する阻害作用において行った同様の方法 で測定した。
トリァシルグリセロール生成に対する 5 0 %阻害する濃度を算定した結果は 、 本 KF - 1 0 4 O A物質は 1 0 g/nU、 本 KF_ 1 0 4 0 B物質は 1 0 g/m 1であった。
( 3) ラッ ト脳由来中性スフィ ンゴミエリナーゼ阻害作用
ラッ ト脳由来の中性スフィ ンゴミエリナ一ゼに対する影響は、 Mu r a k a m i と A r i m aの方法 （ジャーナル ·ォブ 'ニューロケミストリ一、 5 2巻、 6 1 1— 6 1 8頁、 1 9 8 9年） を改変して行った。 すなわち、 ラッ ト脳より調製した膜画分を酵素源として、 2 0mM HEP ES— Na〇H緩衝液 （pH 7. 4) 、 6. 5mM MgC l 2 、 0. 1 %トリ トン X— l 0 0、 25〃M [N—メチルー3 H] スフイ ンゴミエリ ン （0. 0 0 6 /zC i ) を加え、 全量を 5 0 a 1 とした。 3 7 °Cで 3 0分反応後、 クロ口ホル ム ： メタノール （ 1 : 2、 vZv) 混合液を 2 0 0 1加え、 原料の [3 H] ス フィ ンゴミエリンと反応生成物の [3 H] ホスホコリンを分離する。 上層を 5 0 II 1をバイアルにとり、 液体シンチレーションカウンターで [3 H] ホスホコリ ンの量を定量し、 中性スフィ ンゴミエリナーゼ活性を測定した。
本酵素を 5 0 %阻害する1<?_ 1 0 4 0物質の濃度を算定した結果は、 本 K F— 1 0 4 O A物質で 4. 2 / gZm 1、 本 KF _ 1 0 4 0 B物質で 6. 1 g /m 1であった。
(4) ヒト胎盤由来酸性スフィ ンゴミエリナーゼに対する影響
ヒト胎盤由来の酸性スフィ ンゴミエリナーゼに対する影響は、 J o n e sら の方法 （バイオケミカルジャーナル、 1 9 5巻、 3 7 3— 3 8 2頁、 1 9 8 1年 ) を一部改変して行った。 すなわち、 ヒト胎盤由来の酸性スフイ ンゴミエリナーゼ （シグマ社製） を酵 素源として、 25 OmM酢酸ナトリウム緩衝液 （pH 5. 0) 、 0. 1 %NP- 4 0 (シグマ社製） 、 2 5〃M [N—メチルー3 H] スフィ ンゴミエリ ン （0. 0 0 6 C i ) を加え、 全量を 5 0 1 とした。 3 7 °Cで 3 0分反応後、 クロ口 ホルム ： メタノール （2 : 1、 v/v) 混合液を 2 0 0 1加え、 [3 H] スフ ィ ンゴミエリンと反応生成物 [3 H] ホスホコリンを分離する。 上層を 5 0 a 1 をバイアルにとり、 液体シンチレ一シヨンカウン夕一で [3 H] ホスホコリンを 定量し、 酸性スフイ ンゴミエリナ一ゼ活性を測定した。
本酵素を 5 0 %阻害する1：?ー 1 0 4 0物質の濃度を算出した結果、 本 KF - 1 0 4 0 A物質で 4 8 a g/m 1、 本 KF— 1 0 4 0 B物質で 2 4 n g/m 1 であった。 以上のように本発明による新規物質は、 ジァシルグリセロールァシル転移酵 素に対する阻害活性およびスフイ ンゴミエリナ一ゼに対する阻害活性を示すこと から、 動脈硬化、 肥満、 血栓症、 炎症や免疫機能に関連した疾患の予防や治療に 有用である。 図面の簡単な説明
第 1図は本発明の KF— 1 0 4 0 A物質の紫外部吸収スぺク トル （メタノー ル中） を示したものである。
第 2図は本発明の KF— 1 0 4 O A物質の赤外部吸収スぺク トル （KB r法 ) を示したものである。
第 3図は本発明の KF— 1 0 4 0 A物質のプロ トン核磁気共鳴スぺク トル （ 重メタノール中） を示したものである。
第 4図は本発明の KF— 1 0 4 O A物質の13 C核磁気共鳴スぺク トル （重メ 夕ノール中） を示したものである。
第 5図は本発明の KF— 1 0 4 0 B物質の紫外部吸収スぺク トル （メタノ一 ル中） を示したものである。
第 6図は本発明の KF— 1 0 4 0 B物質の赤外部吸収スぺク トル （KB r法 ) を示したものである。
第 7図は本発明の KF— 1 0 4 0 B物質のプ π トン核磁気共鳴スぺク トル （ 重メタノール中） を示したものである。 第 8図は本発明の KF— 1 0 4 0 B物質の13 C核磁気共鳴スぺクトル （重メ 夕ノール中） を示したものである。 実施例
寒天斜面培地で培養したグリオクラジウム エスピー KF - 1 0 4 0菌株 (G l i o c l a d i um s p. KF— 1 0 4 0、 FERM BP - 6 2 5 1 ) より、 グルコース 2. 0%、 ポリペプトン （日本製薬社製） 0. 5 %、 酵母ェ キス （オリエンタル酵母工業社製） 0. 2%、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 0 5 %、 リン酸二水素カリウム 0. 1 %、 寒天 0. 1 %を 5 0 %天然海水で溶解し た液体培地 （PH 6. 0) を 1 0 0m lづっ分注した 5 0 0 m l容三角フラスコ 2本に 1白金耳づっ接種し、 2 7°Cで 4日間振とう培養した。 そして、 それを種培養液として、 ポテト 1 0 0 g/ とグルコース 1. 0 % を 5 0 %天然海水で溶解した液体培地を 6 0本の 1 0 0 0 m l容のル一ビンに 3 0 0m lづっ仕込み、 滅菌冷却後、 種培養した培養液を 3m 1づっ各ルービンに 無菌的に移植し、 2 7°Cで 1 6日間静置培養した。 得られた全培養液に 1 8 リッ トルのアセトンを加えて良く攪拌した後、 減圧 濃縮し、 これを再び酢酸ェチルで抽出し減圧濃縮後、 2. 2 gの粗物質を得た。 これを少量のァセトニトリルに溶解し、 3 0 %ァセトニトリル水で充塡した OD Sカラム （20 0 g、 センシユー科学、 ODS— S S— 1 0 2 0 T) にかけ、 5 0 %ァセトニトリル水で洗浄後、 6 0 %ァセトニトリル水、 さらに 70 %ァセト 二トリル水で溶出し、 減圧濃縮によりそれぞれの溶出液より粗物質 Aは 8 7 m g および粗物質 Bは 1 0 4mgを得た。 続いてそれぞれ粗物質を高速液体クロマトグラフィー （Sh i s e i d o カプセルパック ODS— SGカラム、 2 0 x 2 5 0 mm、 流速 6. 0 m 1 Z分 、 検出、 UV 2 1 5 nm、 溶出溶媒 7 0 %ァセトニトリル水） を行い分画した。 粗物質 Aからは 1 7分に溶出する画分を、 また粗物質 Bからは 2 3分に溶出する 溶出画分をそれぞれ集め、 有機溶媒を除き、 水層を酢酸ェチルで抽出することに より、 KF— 1 0 4 0 A物質を 1 6mg、 KF— 1 0 4 0 B物質を 4 Omgそれ ぞれ得た。 発明の効果
以上のことから本発明による新規 KF— 1 0 4 0物質は、 ジァシルグリセ口 ールァシル転移酵素に対する阻害活性およびスフィゴミエリナ一ゼに対する阻害 活性を示すことから、 動脈硬化、 肥満、 血栓症、 炎症や免疫機能に関連した疾患 の予防および治療に有用であると期待される。

Claims

求 の 範 囲
1. 下記式 〔 I〕
Figure imgf000019_0001
で表される化合物である KF— 1 04 OA物質および下記式 〔 I I〕
Figure imgf000019_0002
で表される化合物である KF— 1 040 B物質からなる新規 KF— 1 040物質 c
2. グリオクラジウム属に属し、 KF— 1 04 OA物質および/または KF- 1 040 B物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、 培養液中 に KF— 1 04 OA物質および または KF— 1 040 B物質を蓄積せしめ、 該 培養物から KF— 1 04 OA物質および Zまたは KF— 1 040 B物質を採取す ることを特徴とする新規 KF— 1 040物質の製造法。
3. グリオクラジウム属に属し、 KF— 1 040 A物質および/または KF— 1 040 B物質を生産する能力を有する微生物が、 グリオクラジウム ェ スピ一 KF— 1 040 (G l i o c l a d i um s p. KF— 1 040、 F ERM BP- 6 2 5 1 ) である請求項 2に記載の製造法。
4. グリオクラジウム属に属し、 KF— 1 0 4 0 A物質および/または KF- 1 0 4 0 B物質を生産する能力を有する微生物。
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