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WO1998032862A2 - L-alanin dehydrogenase von mycobacterium marinum - Google Patents

L-alanin dehydrogenase von mycobacterium marinum Download PDF

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WO1998032862A2
WO1998032862A2 PCT/EP1998/000484 EP9800484W WO9832862A2 WO 1998032862 A2 WO1998032862 A2 WO 1998032862A2 EP 9800484 W EP9800484 W EP 9800484W WO 9832862 A2 WO9832862 A2 WO 9832862A2
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WO
WIPO (PCT)
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tuberculosis
aladh
mar3
strains
dna sequence
Prior art date
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PCT/EP1998/000484
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French (fr)
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WO1998032862A3 (de
WO1998032862A9 (de
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Leopold Flohe
Mahavir Singh
Bernd Hutter
Arend Kolk
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Original Assignee
Individual
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Publication of WO1998032862A3 publication Critical patent/WO1998032862A3/de
Publication of WO1998032862A9 publication Critical patent/WO1998032862A9/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the 40 kD antigen treated in this work represents an interesting object for detailed studies in many ways.
  • the antigen had already been cloned into an expression vector for Escherichia coli (Konrad & Singh, unpublished).
  • the expression and purification of the recombinant protein should therefore be optimized.
  • the decisive biochemical parameters of the enzyme should then be determined with a homogeneous protein fraction.
  • Experience has shown that such data can be used to draw conclusions about the physiological function of an enzyme.
  • tuberculosis and M.bovis BCG strains using the mAb HBT-10 enables methods to be developed which can distinguish an infection from a vaccination. This is not possible with the usual screening methods, the PPD or the Mantoux test (Bass Jr. et al., 1990; Huebner et al., 1993).
  • the basis should be created to enable rational process development for such a test. It should also be investigated whether the presence of a functional enzyme correlates with any other parameters. Particular emphasis was placed on taxonomic and virulent relationships. Certain natural lifestyles or the start of certain growth phases could also be related to alanine dehydrogenase. These questions should be investigated.
  • the Escherichia coli strain was used to optimize the expression of the recombinant 40 kD antigen (Table 2.1). In addition, mycobacterial antigens that had already been cloned were overproduced (Table 2.2).
  • E. coli M15 (pHISK16 Verbonefa /. (1992) 16 kD antigen, Ap IPTG
  • E. coli POP (pKAM2101) J. van Embden 70 kD antigen, Ap heat M. tuberculosis
  • E.coli POP (pRIB1300) Tholee / a /. (1987) 65 kD antigen, Ap heat from Edenef a /. (1988) M.bovis BCG
  • E.CO//TB1 (pKAM1101) diGuanefa /. (1987) MBP-36 kD antigen, Ap heat ainaefa /. (1988) M.leprae Tholee a /. (1990) Tab. 2.2 (22): Producers of mycobacterial antigens and their characteristics
  • the mouse macrophage Zelünie J774 was used. This cell line was originally established from a tumor in a female BALB / c mouse (Ralph & Nakoinz, 1975). J774 is used for phagocytosis assays, for the production of IL-1 and for various biochemical studies. It has receptors for immunoglobulins and complement. Furthermore, J774 produces lysozyme in large quantities and secretes IL-1 constitutively (Ralph & Nakoinz, 1976; Snyderman et al., 1977). Bacteria are absorbed by phagocytosis. Direct cytolysis of foreign organisms is relatively rare.
  • Fig. 2.1 The plasmid pJLA604Not and its relevant functional sections
  • This 4.9 kb plasmid a derivative of pJLA 604 (Schauder et a /., 1987), was used as the expression vector (Fig. 2.1).
  • the plasmid pJLA604Not (Konrad & Singh, unpublished) differs from pJLA604 in that the Nde ⁇ - Interface removed, and a / pref interface was installed instead.
  • the reading frame of the translation begins with the ATG codon of the Sp ⁇ l interface.
  • the transcription starts on the lambda promoters PR and PL, but is effectively repressed at temperatures of 28-30 ° C by the cl ts8 5 7 gene product. Induction is achieved by increasing the temperature to 42 ° C.
  • the temperature-sensitive lambda repressor becomes inactive and can no longer repress the transcription.
  • the transcription ends at the fd terminator.
  • the vector has the E. coli afpE translation initiation region (TIR). This section is very useful for the initiation of translation because it has only a few disturbing secondary structures and thus ensures a high expression rate (McCarthy et al., 1986).
  • TIR E. coli afpE translation initiation region
  • the plasmid has the ß-lactamase gene, which codes for ampicillin resistance.
  • PJLA603 was also used as negative control plasmid, which is identical to pJLA604 except for a few bases in the cloning site.
  • Fig. 2.2 The plasmid pMSK12 and its relevant functional sections This is a derivative of the plasmid pJLA604Not, in which between the Sp ⁇ I and the
  • the 40 kD antigen of Mycobacterium tuberculosis was cloned at the l / o l interface (Fig. 2.2; Konrad & Singh, unpublished).
  • oligonucleotides (Tab. 2.5) were produced by Ms. Astrid Hans (GBF, Braunschweig) on a 394 DNA / RNA synthesizer (Applied Biosystems). The oligonucleotides were cleaned using an oligonucleotide purification cartridge (Applied Biosystems).
  • Fig. 2.3 The veiv / ended oligos and their location on the AlaDH gene
  • Antibiotics were added to the liquid media from stock solutions shortly before use. When producing solid media, the addition was waited until the solution was lukewarm after autoclaving. The antibiotics listed in Table 2.6 were used. Tab.2.6: Antibiotics used and concentrations used
  • TAE autoclave 40mM Tris acetate, 1mM EDTA, pH 8.0
  • TBE 89 mM Tris base, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0, autoclave
  • TBS Autoclave 50mM Tris base, 137mM NaCl, 3mM KCl, pH 7.4
  • TBS-TWEEN TBS + 0.05% Tween-20
  • PBS autoclave 137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na 2 HP0 4 , 2 mM KH 2 PO 4 , pH 7.0 2.6.4 Alanine Dehydrogenase Assays
  • Fig.2.4 Principle of the alanine dehydrogenase assay
  • the purple end product is very easy to see with the naked eye.
  • This assay was used on the one hand to rapidly screen FPLC fractions and on the other hand to demonstrate AlaDH activity in native protein gels.
  • the basis of this assay is a reaction mix consisting of 1/2 vol. 0.5 M glycine-KOH, pH 10.2 and 1/8 vol. 0.5 M L-alanine, 6.25 mM NAD + , 2.4 each mM NBT and 0.64 M PMS.
  • the substrate mix was mixed 1: 1 with the solution to be tested. After electrophoresis, native gels were incubated directly in 10 ml of substrate mix.
  • This assay was used to study AlaDH activity in mycobacteria.
  • the mycobacteria were grown on Löwenstein medium. Bacteria were removed from the slant agar tubes with the inoculation loop, resuspended in water and adjusted to a turbidity equivalent to a McFarland Standard No. 5. To separate cell aggregates, the suspensions were treated in an ultrasound bath for 10 min.
  • the cells were then mixed 1: 1 with reaction mix (see 2.6.4.1) and incubated for 10 min at RT. After centrifugation at 20,000 g for two minutes, the absorption of the supernatant was measured against the blank value.
  • the standard reaction batches have a volume of 1 ml.
  • the composition is shown in Table 2.7.
  • the absorption was monitored over 10 min at 37 ° C and 340 nm.
  • the extinction coefficient ⁇ of NADH is 6.22 x 10 6 cm 2 / mol at 340 nm.
  • An AlaDH unit is defined as the amount of enzyme that catalyzes the formation of 1 ⁇ mol NADH in the oxidative deamination in one minute.
  • composition of the reaction batch for the oxidative deamination is shown on the left, that for the reductive amination on the right.
  • Densitometry was used to quantify the expression level of AlaDH. Furthermore, the signals of the epitope mapping were quantified and related to each other.
  • the implementation was carried out with a personal densitometer (Molecular Dynamics) with the software Image Quant (Molecular Dynamics).
  • AlaDH activity is the exception rather than the rule in the microbial world, it was interesting to question whether this enzyme is ubiquitous within the mycobacteria or whether it is restricted to certain species and strains. This in turn allows conclusions to be drawn on questions such as:
  • the strains examined can be divided into three groups.
  • the first group is that of the strongly positive strains (Tab. 3.11).
  • This group summarizes the strains which have an AlaDH activity of more than 0.5 ⁇ A 5 9 5 units in the test system used.
  • the second group that of the moderately positive strains, includes those with an activity between 0.1 and 0.5 ⁇ Asgs units (Tab. 3.12).
  • Fig.3.16 AlaDH activity in the realm of mycobacteria
  • ⁇ M.tuberculosis can be distinguished from the M.bovis BCG vaccine strain by means of AlaDH activity.
  • the lack of measurable activity can to some extent be explained by the fact that not all strains were in exactly the same growth phase, since it is very difficult to attract all strains in parallel, at the same stage. But the lack of activity could also be due to the fact that genetic changes affect the expression of the gene. These changes could have occurred in the coding or in the regulatory area.
  • AlaDH gene from various strains was attempted to be fully or partially amplified by means of PCR. Served as primers for this oligonucleotides based on the sequence of M.tuberculosis H37R V (Andersen et al., 1992; see section 2.2.2, table 2.5).
  • the primer pairs used to detect the AlaDH, the length of the products to be expected and the A ⁇ nea // t7g temperatures used in the PCR are summarized in Table 3.14.
  • Fig.3.17 PCR of different strains with the primer pair Annabel
  • Lane 1 M.tuberculosis H37R V Lane 6: M.bovis BCG 4 Lane 2: M.tuberculosis H37R a Eahn 7: M.af canu 1 Lane 3: M.tuberculosis 1 Eahn 8: M.microti 1 Lane 4: M .bovis 3 lane 9: M.marinum 3 lane 5: M.bovis BCG 2 lane 10: M.chelonae 7
  • this second fragment was also part of the AlaDH gene, which was created by the addition of the primer AlaDH-RM at a further C-terminal site.
  • This second fragment was suppressed by increasing the> 4nnea // t7g temperature during PCR from 65 to 69 ° C (see Fig. 3.18, lanes 2 and 3).
  • Fig. 3.18 PCR products of the M.tuberculosis H37R V strain
  • the range amplified by all strains of the M. tuberculosis complex comprises 1260 bp. It contains the complete coding section for the AlaDH, as well as a further 75 bp upstream and 63 bp dov / nstream. This area was completely sequenced by all strains of the M.tuberculosis Complex (Fig.3.19). Only in the last 20 or so bases inaccuracies creep in. However, the entire remaining area is secured by multiple sequencing.
  • H37Ra 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
  • mice 1 ATGCGCGTCG GTATTCCC-AC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
  • mice Micl 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
  • H37Rv 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
  • H37Ra 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
  • BCG2 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
  • Bov3 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
  • mice 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
  • Fig. 3.19 (1/5): Alignment of the AlaDH gene and the flanking regions from different strains of the M.tuberculosis Complex
  • Tubl 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 3C0
  • H37Rv 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
  • H37Ra 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
  • 3CG4 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG C-C-ATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
  • BCG2 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCC-ACACGGG C-C-ATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
  • 3ov3 2 1 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG C-GAT'CTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
  • Afrl 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCC-ACACGGG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
  • mice 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCC-ACACGGG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
  • mice Micl 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
  • mice 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
  • H37Rv 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
  • ECC-4 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
  • Keel 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 4S0
  • Fig. 3.19 (2/5): Alignment of the AlaDH gene and the flanking regions from different strains of the M. tuberculosis complex
  • H37Rv 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CA7CGCCAAC GGCATGGGCG CGACCG77AC GGTTCTAGAC 6C3
  • mice 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CATCGCCAAC GGCATGGGCG CGACCG7TAC GGTTCTAGAC 600
  • Tubl 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
  • H37Rv 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCC-AGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
  • H37Ra 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
  • BCG4 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCC-GAT CCACACTCGC 660
  • BCG2 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGGAT CCACACTCGC 660
  • Bov3 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCC-GAT CCACACTCGC £ 60
  • Afrl 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCC-GAT CCACACTCGC 660
  • mice 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGGAT CCACACTCGC ££ 0
  • Tubl 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAC-GGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
  • H37Ra 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAC-GGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
  • BCC-4 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAGGGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
  • Bov3 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
  • Tubl 781 AAACCAGGTG CC-GTACTGGT C-GATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTG7TT CGAAGGCTCA 640
  • Afrl 781 AAACCAGGTG CGGTACTGGT GGATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTG77T CGAAGGCTCA 6 0
  • Fig. 3.19 (3/5): Alignment of the AlaDH gene and the flanking regions from different strains of the M.tuberculosis Complex
  • H37RV 901 GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
  • 3ov3 901 GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
  • mice 901 GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG S60
  • 3CG4 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC C-CACGAAC-C-G GCGTTACTGT CCGAACGGGT GGCCACCGAC 1080
  • Fig. 3.19 (4/5): Alignment of the AlaDH gene and the flanking regions from different strains of the M.tuberculosis Complex
  • H37Rv 11 1 GCCGAGCA.CA CG7CGGGAGT AAGGGAAGCG ATGATGTCGG CCG 1165
  • H37Ra 1141 GCCGAGCACA CGTCGGGAGT AAC-C-G.AAGCG ATGA 1185
  • Bov3 1141 GCCGAGCACA CGTCGGGAGT AAGGGAAGCG ATGATGTCGG CC 11S5
  • mice 1141 GCCGAGCACA CGTCGGGAGT AAGGGAAGCG ATGATGTCGG CC 1135
  • Fig. 3.19 Alignment of the AlaDH gene and the flanking regions from different strains of the M.tuberculosis Complex
  • Stop codons are also marked above the sequence.
  • the bases in bold at the end of the sequence are sequencing inaccuracies.
  • the third different site is Base 272. At this site, with the exception of three strains, there is an adenine residue. This base is deleted from these three strains, M.bovis and two strains from M.bovis BCG. This deletion results in a frame shift that affects the entire following part of the resulting protein. This reading frame shift occurs at the bases 404 to 406 an opa / stop signal. This means that the product of this gene is only about a third the size of the functional AlaDH of the other strains.
  • M.bovis and M.bovis BCG are the only strains of the M.tuberculosis Complex that show no activity. All other strains were classified as moderately or strongly positive. The observed deletion is the reason for the lack of a functional AlaDH.
  • the truncated protein cannot be detected with the mAb HBT-10 (the epitope of HBT-10 is in the range before the reading frame shift), it can be assumed that the truncated protein does not exist at all, or only in very small, quantities not detectable with the mAb HBT-10.
  • H37RV TTCCGACCGAGACCAAAAACAACGAATTCCAATTCCGGGTGGCCATCACCCCGGCCGGCG
  • H37RV TCGCGGAACTAACCCGTCGTGGCCATGAGGTGCTCATCCAGGCAGGTGCCGGAGAGGGCT
  • H37RV GCCGCCTGCGACACGGGCAGATCTTGTTCACGTTCTTGCATTTGGCCGCGTCACGTGCTT
  • Fig.3.20 (1/2): Alignment of the AlaDH genes from M.marinum and M.tuberculosis H37R * ,
  • H37RV CAGCCCGCATCGCCAACGGCATGC-GCGCG .-. CCGTTACGGTTCTAGACATCAACATCGACA
  • Fig. 3.20 Alignment of the AlaDH genes from M.marinum and M.tuberculosis H37R V
  • a total of 682 bases of this gene could be determined (Fig. 3.20), which makes up about 60% of the complete gene. These 682 bases encode the N-terminal region of the protein. Only the first 35 bases after the start codon are missing.
  • the derived peptide of the M. marinum gene sequence (Fig. 3.21) shows 85.3% identity and 92.0%) similarity to the protein of M. tuberculosis H37R V. Homologies to other proteins in the Swiss Prot database are shown in Table 3.15 (status: 9/1996, Release 33).
  • the AlaDH of M. tuberculosis has 53% identity to the enzymes of B.sphaericus and B.stearothermophilus (Andersen et al., 1992).
  • M. Marinum's Al ⁇ DH identifies 51% identity with the enzyme from B.sphaericus and 50% with the enzyme from B.stearothermophilus (Table 3.15).
  • H37RV 14 FRVAITPAGVA ⁇ LTr.
  • Fig.3.21 Alignment of the AlDH's from M.marinum and M.tuberculosis H37R V
  • the Swiss Prot database was searched with the FASTA software (http: / ⁇ w ⁇ V.embl- ebi.ac.uk) (status: 9/1996, Release 33).
  • amino acid residues Gly165, G! Y167, GIy170 and Asp198 are considered essential for the binding of the cofactor of the AlaDH of M.tuberculosis H37R V.
  • These four amino acid residues represent a characteristic of the ⁇ secondary structure of NAD (H) binding sites (Wierenga et al., 1986; Bork & Grunwald, 1990). These four residues are conserved in the enzyme of M.marinum, as with all other AlaDHs in Tab. 3.14.
  • the corresponding section of the epitope of the mAb HBT-10 in the AlaDH from M. marinum has the sequence AISDADFKAAG, and thus differs only in the third position from the sequence of M. tuberculosis H37R V. Due to the consensus epitope of the antibody determined in this work (Tab. 3.9), this should also react with the AlaDH from M.marinum. In fact, this strain is the only one with which a cross-reaction has been observed (Andersen et al., 1992). The sequence determined also coincides with this observation.
  • AlaDH activity in mycobacteria The measured AlaDH activities allow some interesting observations regarding the lifestyle of organisms with positive activity.
  • strains with high activity are all pathogenic. It is interesting that two of the four in this group. falling strains are pathogenic to fish (Austin & Austin, 1987). Both of them, M.marinum and M.chelonae, can also be human
  • M.chelonae is a comparatively fast growing, non-chromogenic bacterium. Human infections often occur as secondary wound infections after surgery (Cooper ef al., 1989). M.marinum is a slow growing organism that forms a yellow pigment when it grows in light. Infections with M. marinum have been detected in more than 50 warm species (reptiles, amphibians, fish) (Clark & Shepard, 1963). In humans, the bacterium usually manifests itself in the elbow or knee area.
  • the other two strains with strong positive AlaDH activity are representatives of the M. tuberculosis complex. These are the tuberculosis reference strain M.tuberculosis H37R V , and the strain M.microti, which is regarded as the phylogenetic link between M.tuberculosis and M.bovis.
  • M.smegmatis Except for M.smegmatis, all strains classified as moderately positive are also pathogenic. The majority of these strains include clinical isolates from M. tuberculosis. Pathogenic variants of tuberculosis strains generally appear to have AlaDH activity. However, two isolates were also found that have no AlaDH activity. The only non-pathogenic organism with AlaDH activity is the fast growing strain M.smegmatis. However, M.smegmatis is characterized by an unusually strong NAD + -reducing background activity, and is therefore very easy to distinguish from all other strains with AlaDH activity. Furthermore, no AlaDH activity was found in the M.smegmaits 1-2c strain, a mycobacterial expression strain. Within the 44 mycobacterial strains tested, and this is by far the majority of all known strains, the following conclusion is therefore permitted:
  • the AlaDH gene in mycobacteria was identified in all strains of the M. tuberculosis complex and in the M. marinum strain.
  • AlaDH gene identified that of M. marinum, is significantly different at DNA level from the genes of the M. tuberculosis complex. However, four out of five bases (80.4%) are still identical on average when comparing these sequences. This value is even higher at the protein level (85.3% identity, 92.0% similarity).
  • AlaDH activity was also found in a number of other species, it can be assumed that the corresponding genes, owing to the lack of homology to the primers used, could not be amplified under the conditions used. A more detailed study on this point should also be able to find these genes. A comparison of all these sequences could allow further conclusions to be drawn about the role of the enzyme.
  • a PCR method should be able to be developed on the basis of such a sequence comparison, with which one can distinguish mycobacteria which have an AlaDH gene from one another.
  • it is the strains that are important for humans that have an AlaDH gene.
  • the possibility of being able to distinguish the M.tuberculosis pathogen from the M.bovis BCG vaccine strain with such a PCR assay makes such a project appear interesting.
  • Outlook The 40 kD antigen treated in this work represents a worthwhile object for further investigations in several respects. One point that was not considered further in this work is the possible use of this enzyme in medical diagnostics.
  • a PCR assay should also be able to be established for the M. marinum strain, which is not insignificantly different from the M. tuberculosis complex at the gene level.
  • a PCR assay based on the amplification of part of the gene sequence coding for the 16S rRNA has hitherto been used for this purpose (Knibb et al., 1993). This is of great importance given the increasing number of M. marinum infections in fish farms in recent years (Knibb et al., 1993). Infections in humans have also been reported frequently in recent years (Harris et al., 1991; Kullavanijaya et al., 1993; Slosarek et al., 1994).
  • the disclosure of the present application also includes the disclosure of the accompanying EP 97 101 339-6, in particular the literature cited therein.
  • the disclosure also includes all conceivable combinations of disclosed individual features.

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Abstract

Die Tuberkulose ist eine Infektionskrankheit, der jährlich über 3 Millionen Menschen zum Opfer fallen. Es gibt zwar sowohl einen Imptstoff, als auch verschiedene Diagnose- und Therapieverfahren, doch die Effektivität all dieser Maßnahmen bedarf, angesichts der wieder steigenden Zahl der Erkrankungsfälle, dringend einer Verbesserung. Ein Forschungsschwerpunkt liegt auf der Charakterisierung von Antigenen, die frühzeitig während einer Infektion sekretiert werden, da diese den ersten Kontakt des Immunsystems mit dem Erreger herstellen. Das in dieser Arbeit behandelte 40 kD-Antigen liegt in vivo als Hexamer vor, und ist trotz des hohen Molekulargewichts und des Fehlens einer Signalsequenz bereits nach wenigen Tagen des Wachstums extrazellulär zu finden. Es stellt funktionell eine L-Alanin Dehydrogenase dar und reagiert mit dem gegen dieses Protein gerichteten monoklonalen Antikörper HBT-10. HBT-10 war der erste bekannte Antikörper, der spezifisch für ein Protein von M. tuberculosis ist und nicht mit dem Impfstamm M. bovis BCG kreuzreagiert.

Description

L-ALANIN DEHYDROGENASE VON MYCOBACTERIUM MARINUM
Das in dieser Arbeit behandelte 40 kD-Antigen stellt in vielerlei Hinsicht ein interessantes Objekt für eingehende Studien dar.
Das Antigen war bereits in einen Expressionsvektor für Escherichia coli kloniert worden (Konrad & Singh, unveröffentlicht). Es sollte deshalb die Expression und die Aufreinigung des rekombinanten Proteins optimiert werden. Mit einer homogenen Proteinfraktion sollten dann die entscheidenden biochemischen Parameter des Enyzms bestimmt werden. Aus solchen Daten lassen sich erfahrungsgemäß Rückschlüsse auf die physiologische Funktion eines Enzyms ziehen. Es stellte sich hierbei die Frage, ob die hypothetische Aufgabe des Enzyms bei der Zellwandbiosynthese unterstrichen oder widerlegt werden kann. Im Falle einer Widerlegung sollten andere mögliche Funktionen eruiert werden.
Zudem können sich aus der Biochemie Ansatzpunkte für eine gezielte Beeinflußung des Enzyms in vivo ergeben. In diesem Zusammenhang ist erneut die physiologische Funktion der Schlüsselpunkt aller Anstrengungen. Wenn das Antigen für das Bakterium eine essentielle Rolle spielen sollte, dann könnten sich durch gezielte Versuche das Gen oder das Protein auszuschalten Möglichkeiten ergeben, den Tuberkulose-Erreger an einem definierten Punkt am Wachstum zu hindern. Das Protein wäre dann ideales drug target. Sollte das 40 kD-Antigen zudem, wie postuliert (Delforge et al., 1993), einen Virulenzfaktor darstellen, dann könnte durch solche Unternehmungen Einfluß auf die natürliche Virulenz des Bakteriums genommen werden. Durch verschiedene Ansätze sollte deshalb auch dieser Punkt überprüft werden. Die Möglichkeit, mittels des mAb HBT-10 die Stämme M. tuberculosis und M.bovis BCG zu diskriminieren, ermöglicht es Verfahren zu entwickeln, die eine Infektion von einer Impfung unterscheiden können. Dies ist mit den gebräuchlichen Screeningverfahren, dem PPD- oder dem Mantoux-Test, nicht möglich (Bass Jr. et al., 1990; Huebner et al., 1993). Durch die Analyse der Verbreitung des Gens bzw. des Genprodukts sollte die Grundlage dafür geschaffen werden, eine rationelle Verfahrensentwicklung für einen solchen Test zu ermöglichen. Zudem sollte untersucht werden, ob das Vorhandensein eines funktioneilen Enzyms mit irgendwelchen anderen Parametern korreliert. Insbesondere auf taxonomische und virulente Zusammenhänge wurde hierbei Wert gelegt. Auch bestimmte natürliche Lebensweisen oder der Eintritt in bestimmte Wachstumsphasen könnten mit der Alanin Dehydrogenase in Zusammenhang stehen. Diesen Fragen sollte auf den Grund gegangen werden.
2. Materialien und Methoden
2.1 Lebendes Material
2.1.1 Bakterien
2.1.1.1 E.coli Stämme
Der Stamm Escherichia coli wurde verwendet um die Expression des rekombinanten 40 kD-Antigens zu optimieren (Tab. 2.1). Zudem wurden in ihm bereits klonierte mykobakterielle Antigene überproduziert (Tab. 2.2).
Tab. 2.1 : Benutzte Expressionsstämme und deren relevante Eigenschaften
Stamm Genotyp und relevanter Phänotyp Herkunft / Referenz
E.coli CAG 629 /ac(am) pΛo(am) tVp(am) s-/pCts rps a/(am) Ion C.Gross
Figure imgf000005_0001
E.coli DH5α sυpE44 Δ/acU169(φ80 lad Δ 15) ΛscfR17 ΛecA1 Hanahan (1983) en A1 gyrA96 thi- , re!M
E.coli TG2 supE hsdA5 thiA{lac-proAB) Δ(srf-recA)306::Tn10(TetR) Sambrook ef al. (1989) F'( -aD36 proA+ lacP /acZM15)
E.coli SURE hsdR merk mcrB mvr eπcA s-/pE44 thiA λ- σyrA96 Stratagene re/A1 lac recB recJ εbcC umuC uvrC (F'proAB /aclqZ ΔM15 Tn10(TetR))
E.CO// BL 321 rnd 05 nac/B+ puri+ Studier (1975)
E.coli N 4830 s-/° his ilv galKAQ AchlD-pgl (λ ΔBam N+ clls857 ΔHI) Gottesman ef al. (1980)
E.coli 538 Genotyp unbekannt Bayer AG ~ab.2.2 (1/2) : Produzenten mykobakteπeller Antigene und deren Charakteπstika
Es ist angegeben, welches Antigen von den jeweiligen Stämmen produziert wird. Die beiden letzten Spalten geben die Anzuchtbedingungen wieder (siehe auch 2.5.2).
Stamm Herkunft/ Referenz(en) Produkt Antibiotika Induktion
E.CO//BL21 (pKAM1301) J. van Embden GST-36 kD-Antigen, Ap IPTG M.leprae
E.coli BL21/p!ys5 J. van Embden 70 kD-Antigen, Ap + Cm IPTG
(pKAM3601) M.leprae
E.coli CAG629 (p S9-2) Singh etal. (1992) 38 kD-Antigen, Ap Hitze M.tuberculosis
Eco//CAG629(pMS14-1) Cherayil&Young(1988) 28 kD-Antigen, Ap Hitze
Dale&Patki(1990) M.leprae
Singh et al. (unveröff.)
E.coli M15(pHISK16 Verbonefa/. (1992) 16 kD-Antigen, Ap IPTG
+ pREP4) Vordermeier et al. (1993) M.tuberculosis
Eco// 1697 V. Mehra His-30 kD-Anligen, Ap + Km IPTG M.tuberculosis
E.CO// 1698 V. Mehra His-30 kD-Antigen, Ap + Km IPTG M.leprae
E.coli POP (pKAM2101) J. van Embden 70 kD-Antigen, Ap Hitze M.tuberculosis
E.coli POP (pRIB1300) Tholee/a/. (1987) 65 kD-Antigen, Ap Hitze van Edenef a/. (1988) M.bovis BCG
E.coli POP (pZW1003) Mehra etal. (1986) 65 kD-Antigen, Ap Hitze van der Zee et al. (unveröff.) M.leprae
E.CO//TB1 (pKAM1101) diGuanefa/. (1987) MBP-36 kD-Antigen, Ap Hitze ainaefa/. (1988) M.leprae Tholee a/. (1990) Tab. 2.2 (22) : Produzenten mykobakteπeller Antigene und deren Charakteristika
Es ist angegeben, welches Antigen von den jeweiligen Stämmen produziert wird. Die beiden letzten Spalten geben die Anzuchtbedingungen wieder (siehe auch 2.5.2).
Stamm Herkunft / Referenz(en) Produkt Antibiotika Induktion
Eco//TB1 (pKAM4101) J. van Embden MBP-2nd 65 kD- Ap Hitze Antigen, M.leprae
E.CO//TB21-8/2 Khanolar-Young et al. (1992) MBP-10 kD-Antigen, Ap IPTG Mehra er al. (1992) M.tuberculosis
E.CO//TG2 - 50/55 Sal C.Espitia; M. Singh 50/55 kD, large frag., Ap IPTG large M.tuberculosis
2.1.1.2 Mykobakterielle Stämme
Tab. 2.3 (1/3) : Benutzte Mykobaktenen und deren Herkunft
Stamm Abkürzung Genaue Bezeichnung, Herkunft
M.af canυm 1 Afr1 M.africanum nr.5544, RIV
M.asiaticum 1 Asi1 M.asiaticum 3250, Portaals
M.avium 1 Avi1 M'.avium Myc 3875, Serotype 2, RIV
M.bovis 3 Bov3 M.bovis nr.8316, RIV
M.bovis BCG 2 BCG2 M.bovis Copenhagen, Serumsinstitut Copenhagen
M.bovis BCG 4 BCG4 M.bovis BCG P3, RIV
M.chelonae 7 Che7 M.chelonei 1490, P.Dirven
M.flavescens 1 Fla1 M.flavescens ATCC 14474, RIV
M.fortuitum 11 For11 M.fortuitum ATCC 6841, RIV
M.gastri 1 Gas1 M.gastri ATCC 25220, RIV
M.gordonae 3 Gor3 M.gordonae 8960, Portaals Tab. 2.3 (2/3) : Benutzte Mykobaktenen und deren Herkunft
Stamm Abkürzung Genaue Bezeichnung, Herkunft
M.intracellulare 1 In» M.intracellulare 6997, ATCC 15985, Portaals
M.intracellulare 5 Int5 M.intracellulare IWG MT3, RIV
M.kansasii 1 Kan1 M.kansasii Myc 1012, RIV
M.lufυ 1 Luf1 M.lufu 219, RIV
M.marinum 3 Mar3 M.marinum L66, Portεals
M.microti 1 Mid M.microti
Figure imgf000008_0001
Portaals
M.nonchromogenium 1 Non1 M.nonchromogenium ATCC 25145, RIV
M.parafortuitum 1 Paf1 M.parafortuitum nr.6999, Portaals
M.peregrinum 1 Perl M.peregrinum, Patient Bakker, TB6849, Antonie Ziekenhuis
M.phlei 1 Phl1 M.pΛ/e/ 258 (P ), Portaals
M.phlei 4 Phl4 M.phlei Weybridge R82, Tony Eger
M.scrofulaceu 1 Scr1 M.scrofulaceum Myc 3442, RIV
M.scrofulaceum 8 Scrδ M.scrofulaceum Myc 6672, RIV
M.simiae 1 Sim1 M.simiae 784, Tony Ecer
M.smegmatis 1 Sme1 M.smegmatis ATCC 14460, RIV
M.smegmatis 3 Sme3 M.smegmatis 8070, Portaals
M.terrae l Ter2 M.terrae, RIV
M.thermoresistibile 1 The1 M.thermoresistibile nr.7001, Portaals
M. triviale 1 Tri1 M.triviale 8067, Portaals
M.tuberculosis H37RV H37RV M.tuberculosis H37RV, RIV
M.tuberculosis H37Ra H37Ra M.tuberculosis H37Ra, nr.19529, RIV
M.tuberculosis 1 Tub1 M.tuberculosis 4514, RIV
M.tuberculosis 49 Tub49 M.tuberculosis Cy Sang-Hae Cho, Südkorea
M.tuberculosis 60 Tub60 M.tuberculosis S2, Sang-Hae Cho, Südkorea Tab. 2.3 (3/3) : Benutzte Mykobaktenen und deren Herkunft
Stamm Abkürzung Genaue Bezeichnung, Herkunft
M.tuberculosis 118 Tub118 M.tuberculosis Myc 16293, Hannoufi
M.tuberculosis 130 Tub130 M.fuberc.//os/s,patient yy, Strichcode 3.1265, Dr.BijImer,
Den Haag
M.tuberculosis 132 Tub132 M.tuberculosis Myc 16770, RIV
M.tuberculosis 145 Tub145 M.tuberculosis 416138N, Patient N.Wielaart, Reg.Nr. 7.796.267, WKZ, Utrecht
M.tuberculosis 146 Tub146 M.tuberculosis, Abdi Hussein
M.tuberculosis 163 Tub163 M.tuberculosis 925, Patientenisolat Nr. 32, INH>1, StrR, RifS, EthS
M.ulcerus 1 Uld M.ulcerus 932, Portaals
M.vaccae 3 Vac3 M.vaccae ATCC 25950, RIV
M.xenopi 7 Xen7 M.xenopi code 132, Patient Alois Necas, H.Kristanpul, Prag
2.1.1.3 Andere Bakterieπstämme
Tab. 2.4 : Weitere benutzte Bakterienstämme
Stamm Herkunft
Listεria monocytogenes EGB Andreas Lignau
Listeria innocua Andreas Lignau
Nocardia asteroides 702774 Juul Bruins
Rodococcus equi πr.10P388 VMDC, Utrecht -ff-
2.1.2 Zellkultur
Benutzt wurde die Mäuse Makrophagen Zelünie J774. Diese Zellinie war ursprünglich aus einem Tumor einer weiblichen BALB/c Maus etabliert worden (Ralph & Nakoinz, 1975). J774 wird für Phagozytose-Assays, zur Produktion von IL-1 und für vielfältige biochemische Untersuchungen benutzt. Sie besitzt Rezeptoren für Immunglobuline und Komplement. Desweiteren produziert J774 Lysozym in großen Mengen und sekretiert IL-1 konstitutiv (Ralph & Nakoinz, 1976; Snyderman et al., 1977). Die Aufnahme von Bakterien erfolgt durch Phagozytose. Direkte Zytolyse von Fremdorganismen ist relativ selten.
2.2 Nukleinsäuren
2.2.1 Plasmide
pJLA604Not
Figure imgf000010_0001
Abb. 2.1 : Das Plasmid pJLA604Not und seine relevanten funktionellen Abschnitte
Dieses 4,9 kb große Plasmid, ein Derivat von pJLA 604 (Schauder et a/.,1987), wurde als Expressionsvektor verwendet (Abb. 2.1). Das Plasmid pJLA604Not (Konrad & Singh, unveröffentlicht) unterscheidet sich von pJLA604 dadurch, daß die Nde\- Schnittstelle entfernt, und statt dessen eine /Vorf-Schnittstelle eingebaut wurde. Das Leseraster der Translation beginnt mit dem ATG-Codon der SpΛl-Schnittstelle. Die Transkription startet an den Lambda-Promotoren PR und PL, wird jedoch bei Temperaturen von 28-30°C durch das clts857-Genprodukt effektiv reprimiert. Induktion wird durch Erhöhung der Temperatur auf 42°C erreicht. Bei dieser Temperatur wird der temperatursensible Lambda-Repressor inaktiv und kann die Transkription nicht mehr reprimieren. Die Transkription endet am fd-Terminator. Zudem besitzt der Vektor die afpE Translations-Initiationsregion (TIR) von E.coli. Dieser Abschnitt ist sehr nützlich für die Initiation der Translation, da er nur wenig störende Sekundärstrukturen besitzt und dadurch eine hohe Expressionsrate gewährleistet (McCarthy et al., 1986). Als Selektionsmarker verfügt das Plasmid über das ß-Lactamase-Gen, das für eine Ampicillinresistenz codiert.
Als negatives Kontrollplasmid wurde auch pJLA603 verwendet, das bis auf wenige Basen in der Klonierungsstelle mit pJLA604 identisch ist.
pMSK12
Figure imgf000011_0001
fd - Transkription- Terminator
Abb. 2.2 : Das Plasmid pMSK12 und seine relevanten funktioneilen Abschnitte Dies ist ein Derivat des Plasmids pJLA604Not, bei dem zwischen die SpΛI- und die
Λ/o l-Schnittstelle das 40kD-Antigen von Mycobacterium tuberculosis kloniert wurde (Abb. 2.2; Konrad & Singh, unveröffentlicht).
2.2.2 Oligonukleotide
Sämtliche Oligonukleotide (Tab. 2.5) wurden von Frau Astrid Hans (GBF, Braunschweig) an einem 394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems) hergestellt. Gereinigt wurden die Oligonukleotide mit einer Oligonucleotide Purification Cartridge (Applied Biosystems).
Tab. 2.5 : Verwendete Oligonukleotide
Bezeichnung Sequenz Orientierung
AlaDH-F1 S'-ATGCGCGTCGGTATTCCG-S' forward
AlaDH-F1 + 5'-GCGCGTCGGTATTCCGACCG-3' forward
AlaDH-F2 5'-GAGACCAAAAACAACGAA-3' forward
AlaDH-F4 S'-GAATTCCCATCAGCAATCTTGCAGA-S' forward
AlaDH-F5 5'-GCCCCGATGAGCGAAGTC-3' forward
AlaDH-F6 5'-GGGGCCGTCCTGGTGCC-3' forward
AlaDH-F7 5'-GACGTCGACCTACGCGCTGAC-3' forward
AlaDH-R1 5'-CTCGGTGAACGGCACCCC-3' reverse
AlaDH-R2 5'-GGCCAGCACGCTGGCGGG-3' reverse
AlaDH-R3 5'-CACCCGTTCGGACAGTAA-3' reverse
AlaDH-R4 5'-CGCGGCCGACATCATCGC-3' reverse
AlaDH-R5 5'-GGCCGACATCATCGCTTCCC-3' reverse
AlaDH-R6 5'-CGAGACTAATTTGGGTGCCTTGGC-3' reverse
AlaDH-R7 5'-A"TTTGGGTGCCTTGGC-3, reverse
AlaDH-RM 5'-GGCGGCGAGTCGACCGGC-3' reverse O 98/32862
- 71 - ie Lokalisation der Oligos auf dem AlaDH-Gen ist in Abb. 2.3 schematisiert.
Figure imgf000013_0001
ttccgggtgg ccatcacccc ggccggcςtc gcggaactaa cccgtcgtgg ccatgaggtg 105 ctcatccagg cεggtgccgg agagggctcg gctatcaccg acgcggattt caaggcggca 165 ggcgcgcaac tςgtcggcac cgccgaccag gtgtgggccg acgctgattt attgctcaag 225 gtcaaagaac cgatagcggc gcaatacgoc cgcctgcgac acgggcagat cttgttcacg 285 ttcttgcatt tggccgcgtc acgtgcttcc accgatgcgt tgttggattc cςgcaccacg 345
F5 > tcaattgcct accagεccgt ccagaccσcc gacggcgcac tscccctgct tgccccgatg 405
F5 ≠ RM agcgaagtcg cccgtcgact cgccgcccag gttggcgctt accacctgat gccaacccaa 465 gggggccgcg gtgtgctgat gggcggggtg cccggcgtcg aaccggccga cgtcctggtg 525 atcggcgccg gcaccgccgg ctacaacgca gcccgcatcg ccaacggcat gg cgcgacc 585 gttacggttc tagacatcaa catcgacaaa cttcggcaac tcgacgccga gttctgcggc 645 cggatccaca ctcσctactc atcggcctac cagctcgagg gtgccσtcaa acgtcccgac 705
F6 > — - R7 -RS ctggtgattg gggccgtcct ggtgccaggc ςccaaggcac ccaaattagt ctccaattca 765 cttgtcgcgc atatgεascc aggtgcggta ctσgtcgata tagccatcga ccagg cgσc 825 tgtttcgaag σctcaccacc gaccacctac gaccacccga cgttcgccgt gcacgacacg 885 ctgttttact gcctggccaa catgcccgcc tccgtgccca agacgtcgac ctacccgctg 945 accaacgcga cgatgccgta tgtgctcgag cttgccgacc atggctggcg ggccccgtgc 1005
< R3 cggtccaatc cggcactacc caaacgtctt tcgacgcacσ aagσggcott actctcccaa 1065
< — R3 -ζ r — '- — '• '-R2 ~ cgggtggcca ccςacctggg gctgccgttc accgagcgcg ccagcgtgct ggcctgactc 1125
"^ < " R5 R4 tcggccgctc gttacgccσa ccacacgtcg ggagtaaggg aagcgatgat gtcggccgcg 1185
Abb. 2.3 : Die veiv/endeten Oligos und ihre Lage auf dem AlaDH-Gen
2.3 Rezepturen
Alle unter diesem Punkt beschriebenen Lösungen wurden v/eitestgehend nach Sambrook et al. (1989) hergestellt.
2.3.1 Nährmedien
kB
10 g Bacto-Trypton (Difco), 5 g Bacto-Hefeextrakt (Difco), 10 g NaCI ad 1000 ml H20, pH 7,0, autoklavieren -1JI -
Iß
12 g Bacto-Trypton (Difco), 24 g Bacto-Hefeextrakt (Difco), 4 ml Glycerin (87 %), 2,31 g
KH2PO4, 12,54 g K2HPO4 ad 1000 ml H2O, die Phosphatlösungen werden getrennt von den anderen
Komponenten autoklaviert und hinterher zugemischt
SOC
2 % Bacto-Trypton (Difco), 0,5 % Bacto-Hefeextrakt (Difco), 10 mM NaCI, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCI2ι 10 mM MgS04) 20 mM Glucose ad 1000 ml H20, pH 7,0, die Glucose wird getrennt von den anderen Komponenten autoklaviert und hinterher zugegeben
LÖWENSTEIN
Benutzt wurden gebrauchsfertige Coletsos Ossein Schrägagarröhrchen (Sanofi
Diagnostics Pasteur).
FESTMEDIEN :
Zur Herstellung von Platten (90 mm, Greiner) der oben beschriebenen Nährmedien wurde der jeweiligen Rezeptur 1,5% Agar beigemischt.
ANTIBIOTIKA
Antibiotika wurden den Flüssigmedien kurz vor Gebrauch aus Stammlösungen zugegeben. Bei Herstellung von Festmedien wurde mit der Zugabe gewartet, bis die Lösung nach dem Autoklavieren handwarm war. Benutzt wurden die in Tab. 2.6 aufgeführten Antibiotika. Tab. 2.6 : Benutzte Antibiotika und eingesetzte Konzentrationen
Antibiotika Endkonzeπtration gelöst in
Ampicillin 100 μg/ml Wasser
Chloramphenicol 20 μg/ml Ethanol
Gentamicin 100 μg/ml gebrauchsfertig (Sigma)
Kanamycin 30 μg/ml Wasser
2.3.2 Pufferlösungen
L-PUFFER : 50 mM Tris base, 10 mM EDTA, pH 6,8, autoklavieren
TE : 10 mM Tris base, 1 mM EDTA, pH 7,4, autoklavieren
TAE : 40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA, pH 8,0, autoklavieren
TBE : 89 mM Tris base, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8,0, autoklavieren
TBS : 50 mM Tris base, 137 mM NaCl, 3 mM KCl, pH 7,4, autoklavieren
TBS-TWEEN : TBS +0,05% Tween-20
PBS : 137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na2HP04, 2 mM KH2PO4, pH 7,0, autoklavieren 2.6.4 Alanin Dehydrogenase Assays
2.6.4.1 Quantitativer Assay
Der qualitative Nachweis der AlaDH beruht auf einer Reihe von Redoxreaktionen, gemäß folgendem Reaktionsschema (Inagaki et al., 1986; Andersen et al., 1992) :
L- Alanin
'
AlaDH
Figure imgf000016_0001
Pyruvat
Abb. 2.4 : Prinzip des Alanin Dehydrogenase - Assays
Das violette Endprodukt ist hierbei sehr gut mit dem bloßen Auge zu erkennen. Dieser Assay wurde einerseits zum schnellen Screening von FPLC-Fraktionen und andererseits zur Demonstration von AlaDH-Aktivität in nativen Proteingelen benutzt.
Basis dieses Assay ist ein Reaktionsmix bestehend aus 1/2 Vol. 0,5 M Glycin-KOH, pH 10,2 und je 1/8 Vol. 0,5 M L-Alanin, 6,25 mM NAD+, 2,4 mM NBT und 0,64 M PMS.
Zur Analyse von Proteinfraktionen wurde der Substratmix 1 :1 mit der zu testenden Lösung versetzt. Native Gele wurden nach der Elektrophorese direkt in 10 ml Substratmix inkubiert.
Eine positive Reaktion ist nach spätestens 5 min zu erkennen. WO 98/32862
- 15 -
2.6.4.2 Semiquantitativer Assay
Dieser Assay wurde zur Untersuchung von AlaDH-Aktivitäten in Mykobaktenen verwendet.
Die Mykobaktenen wurden auf Löwenstein-Medium angezogen. Mit der Impföse wurden Bakterien von den Schrägagar-Röhrchen abgenommen, in Wasser resuspendiert und auf eine Trübung äquivalent zu einem McFarland Standard Nr.5 eingestellt. Zur Trennung von Zellaggregaten wurden die Suspensionen für 10 min im Ultraschallbad behandelt.
Anschließend wurden die Zellen 1:1 mit Reaktionsmix (siehe 2.6.4.1) versetzt und 10 min bei RT inkubiert. Nach zweiminütiger Zentrifugation bei 20.000 g wurde die Absorption des Überstandes gegen den Blindwert gemessen.
Als Referenzmessung diente ein Ansatz, dem kein L-Alanin zugesetzt war.
Eine Absorptionsänderung von einer Einheit pro Minute in diesem Test entspricht etwa einer Absorptionsänderung von drei Einheiten pro Minute beim quantitativen Assay (Messung bei 340 nm, siehe 2.6.4.3).
2.6.4.3 Quantitativer Assay
Bei diesem Assay wurde direkt die quantitative Änderung des NADH-Gehaltes bei 340 nm gemessen.
Die Standardreaktionsansätze harten ein Volumen von 1 ml. Die Zusammensetzung ist in Tab. 2.7 gezeigt. Die Absorption wurde über 10 min hinweg bei 37°C und 340 nm verfolgt. Der Extinktionskoeffizient ε von NADH beträgt bei 340 nm 6,22 x 106 cm2/mol.
Die Standardansätze wurden zur Bestimmung der biochemischen Eigenschaften des Enzyms wie jeweils im Text angegeben variiert. Jeder dargestellte Meßpunkt stellt den Mittelwert aus mindestens zwei, in der Regel aber drei, unabhängigen Messungen dar. - \ 6 -
Eine AlaDH-Einheit ist als die Enzymmenge definiert, die in einer Minute die Bildung on 1 μmol NADH in der oxidativen Desaminierung katalysiert.
Tab. 2.7 : Zusammensetzung des quantitativen AlaDH-Assays
Die Zusammensetzung des Reaktionsansatzes für die oxidative Desaminierung ist links, die für die reduktive Aminierung rechts gezeigt.
Oxidative Desaminierung Reduktive Aminierung
125 mM GIycin KOH, pH 10,2 1 NH4CI / NH4OH, pH 7,4
100 mM L-Alanin 20 mM Pyruvat
1 ,25 mM NAD+ 0,5 mM NADH
2.6.5 Densitometrie
Densitometrie wurde benutzt um eine Quantifizierung des Expressionslevels der AlaDH zu machen. Desweiteren wurden hiermit die Signale der Epitopkartierung quantifiziert und ins Verhältnis zueinander gesetzt.
Die Durchführung erfolgte mit einem Personal Densitometer (Molecular Dynamics) mit der Software Image Quant (Molecular Dynamics).
- 1? -
3.5 Die Verbreitung der Alanin Dehydrogenase innerhalb der Mykobaktenen
Sowohl auf Gen-, als auch auf Proteinebene, sollte als nächstes untersucht werden, in welchen Mykobaktenen eine Alanin Dehydrogenase vorhanden ist. Ausgehend von der Virulenz war hierbei die Fragestellung, ob die AlaDH-Aktivität mit dieser Eigenschaft korreliert.
3.5.1 In vivo AlaDH-Aktivität
Da AlaDH-Aktivität in der Mikrobenwelt eher die Ausnahme als die Regel darstellt, war es interessant zu hinterfragen, ob dieses Enzym innerhalb der Mykobaktenen ubiquitär ist, oder ob es auf bestimmte Spezies und Stämme beschränkt ist. Dadurch können dann wiederum Rückschlüsse auf Fragen gezogen werden wie :
^ Haben AlaDH produzierende Stämme Gemeinsamkeiten in der Lebensweise ?
^ Induziert eine bestimmt Wachstumsweise oder - phase die AlaDH-Produktion ?
^ Wie erfolgt die Regulation der AlaDH ?
^ Können andere Stoffwechselwege die von der AlaDH katalysierte Reaktion
ersetzen ?
"^ Welchen Phänotyp müssten AlaDH Mutanten zeigen ? Es wurden deshalb alle verfügbaren Stämme auf Produktion von AlaDH-Aktivität hin untersucht. Das Repertoir umfasste insgesamt 44 mykobakterielle Stämme, die 29 verschiedene Spezies repräsentieren. Zudem wurden die beiden mit den Mykobaktenen eng verwandten Stämme Nocardia asteroides und Rhodococcus equi getestet.
Um die im Testsystem gemessenen Aktivitäten miteinander vergleichen zu können, wurden alle Bakteriensuspensionen auf eine Dichte eingestellt, die der Trübung eines McFarland Standards Nr.5 entspricht. Die Stämme befanden sich zum Zeitpunkt der Messung in der späten exponentiellen Phase.
Neben der AlaDH-Messung wurde auch eine Messung durchgeführt, bei der im Reaktionsansatz L-Alanin fehlte. Die Aktivität dieses Ansatzes ist ein Maß für andere parallel ablaufende NAD+-reduzierende Prozesse. Die Differenz zwischen diesem Ansatz und dem Standardansatz entspricht der Netto-AlaDH-Aktivität (ΔAsgs-Wert).
Gemäß der gemessen Aktivitäten lassen sich die untersuchten Stämme in drei Gruppen einteilen. Die erste Gruppe ist die der stark-positiven Stämme (Tab.3.11). In dieser Gruppe sind die Stämme zusammengefasst, die eine AlaDH-Aktivität von mehr als 0,5 ΔA595-Einheiten im benutzen Testsystem aufweisen.
Tab 3.11 : Stämme mit stark-positiver AlaDH-Aktivität
Die Durchführung dieses Assays ist in 2.6.4.2 beschrieben.
Stamm AI; aDH-Aktivität [ΔA595]
M.marinum 3 2,327
M.chelonae 7 1 ,842
M.microti 1 0,919
M.tuberculosis H37RV 0,592 -'9-
Als stark-postiv klassifiziert wurden die beiden für Fische pathogenen Stämme M.chelonae und M.marinum, sowie die beiden ebenfalls pathogenen Stämme M.microti und M.tuberculosis H37RV, letzteres ein virulenter Tuberkulose-Referenzstamm.
Die zweite Gruppe, die der mäßig-positiven Stämme, umfasst jene mit einer Aktivität zwischen 0,1 und 0,5 ΔAsgs-Einheiten (Tab.3.12).
Tab.3.12 : Stämme mit mäßig-positiver AlaDH-Aktivität
Die Durchführung dieses Assays ist in 2.6.4.2 beschrieben.
Stamm AlaDH-Aktivität Stamm AlaDH-Aktivität iΔAsgsl [ΔA595]
M.smegmatis 3 0,375 M.fuöerc-//os/s 49 0,138
M.ulcerus 1 0,369 M.tuberculosis 130 0,118
M.afήcanum 1 0,287 M.smegmatis 1 0,116
M.f-/berc-//os/s 118 0,210 M.tuberculosis 132 0,111
M.tuberculosis 145 0,190 M.tuberculosis 146 0,111
M.intracellulare 1 0,155 M.tuberculosis 1 0,110
In dieser Gruppe finden sich, außer M.smegr atis, nur pathogene, klinische Isolate von M.tuberculosis und anderen Mykobaktenen wieder. Beide getesteten Stämme von M.smegmatis zeigen jedoch auch sehr hohe NAD+-reduzierende Aktivitäten in Abwesenheit von L-Alanin. Es ist an dieser Stelle noch wichtig zu erwähnen, daß der Stamm M.smegmatis 1-2c (ein Derivat von M.smegmatis mc26; Zhang et al., 1991 ; Garbe et al., 1994; von Dr. Peadar 0 Gaora, St.Mary's Hospital, London), ein Stamm für genetische Arbeiten in Mykobaktenen, keine AlaDH-Aktivität zeigt, aber ebenfalls über eine hohe Hintergrundaktivität verfügt. In der letzten Gruppe schließlich sind alle Stämme aufgeführt, die als für AlaDH- ktivität negativ befunden wurden, d.h. die eine Aktivität von weniger als 0,1 ΔA595- inheiten aufweisen (Tab.3.13).
Tab.3.13 : Stämme ohne AlaDH-Aktivität
Die Durchführung dieses Assays ist in 2.6.4.2 beschrieben.
Stamm AlaDH-Aktivität Stamm AlaDH-Aktivität [ΔA595] [ΔA595]
N. asteroides 1 0,048 M.bovis BCG 4 0,001
M.flavescens 1 0,042 M.terrae 2 0,001
M.tuberculosis H37Ra 0,032 M.tuberculosis 60 0
M.nonchromogenium 1 0,026 M.tuberculosis 163 0
M.fo uitum 11 0,022 M.gastri 1 0
M.asiaticum 1 0,021 M.gordonae 3 0
M.bovis BCG 2 0,013 M.kansasii 1 0
M.lufu 1 0,013 M.parafortuitum 1 0
R.equi l 0,011 M.perigrinυm 1 0
M.bovis 3 0,010 M.phlei 1 0
M.scrofulaceum 1 0,009 M.phlei 4 0
M.intracellulare 5 0,007 M.scrofulaceum 8 0
M.thermosresistibile 1 0,006 M.simiae 1 0
M.avium 1 0,002 M.vaccae 3 0
M.triviale 1 0,002 M.xenopi 7 0
Diese weitaus größte Gruppe umfaßt vor allem opportunistische und nicht-pathogene Stämme, sowie die beiden mit den Mykobaktenen verwandten Stämme Nocardia asteroides und Rhodococcus equi. Ausnahme waren zwei klinische Tuberkulose- Isolate, sowie der Erreger der Rinder-Tb, M.bovis, aber auch die beiden untersuchten Impfstämme von M.bovis BCG.
Eine graphische Darstellung der AlaDH-Aktivitäten ist in Abb. 3.16 nach phylogenetischen Gesichtspunkten geordnet wiedergegeben.
Figure imgf000023_0001
M.terrae verwandte tvUυbercυbsis Complex .foriυitυm verήs
MAIS co i≤x Complex Stimme Complex St£τ,
langsam wachsende Stamme schnell eisende nich'.-rny obakterie'le S'.βrr.rre Stamme
Abb. 3.16 : AlaDH-Aktivität im Reich der Mykobaktenen
Die genaue Bezeichnung der einzelnen Stämme ist in Tab. 2.3 wiedergegeben. Die Angaben schnell wachsend bzw. langsam wachsend dürfen nicht streng genommen werden, sondern stellen vielmehr eine Tendenz innerhalb der gezeigten Gruppen dar.
Zusammenfassend läßt sich die Verbreitung von AlaDH-Aktivität innerhalb der Welt der Mykobaktenen so beschreiben :
© Die mit Abstand höchste Aktivität zeigen die beiden für Fische pathogenen Stämme M.chelonae und M.marinum. 2) Innerhalb der Stämme von M.tuberculosis ist eine Tendenz vorhanden, nach der mit abnehmender Virulenz auch die AlaDH-Aktivität abnimmt (H37RV > klinische Isolate > H37Ra).
D Alle als positiv klassifizierten Stämme sind virulent. Einzige Ausnahme ist M.smegmatis, das aber anhand seiner hohen Hintergrundaktivität leicht zu unterscheiden ist.
© Nicht alle virulenten Stämme sind AlaDH positiv.
© M.tuberculosis läßt sich mittels AlaDH-Aktivität vom Impfstamm M.bovis BCG unterscheiden.
3.5.2 Das Gen für die Alanin Dehydrogenase
3.5.2.1 Die ersten PCR-Fragmente
Nachdem nun die AlaDH-Aktivitäten innerhalb der verschiedenen Stämme quantifiziert worden waren, stellte sich als nächstes die Frage, warum einige Stämme das Enzym produzieren, andere aber nicht. Auch das Ausmaß der Expression unterscheidet sich selbst zwischen eng verwandten Arten teilweise deutlich.
Das Fehlen meßbarer Aktivität kann bis zu einem gewissen Grad eine Erklärung darin finden, daß sich nicht alle Stämme in der exakt selben Wachstumsphase befanden, da es sehr schwer ist alle Stämme parallel, im gleichen Stadium befindlich anzuziehen. Aber das Ausbleiben von Aktivität könnte auch einen Grund darin haben, daß sich genetische Änderungen auf die Expression des Gens auswirken. Diese Änderungen könnten im kodierenden oder im regulatorischen Bereich aufgetreten sein.
Um diese Tatsache zu überprüfen wurde versucht das AlaDH-Gen aus verschiedenen Stämmen mittels PCR ganz oder teilweise zu amplifizieren. Als Primer dienten hierzu auf der Sequenz von M.tuberculosis H37RV basierende Oligonukleotide (Andersen et al., 1992; siehe Abschnitt 2.2.2, Tab. 2.5).
Die zum Nachweis der AlaDH verwendeten Primerpaare, die jeweils zu erwartende Länge der Produkte und die jev/eils benutzten Aπnea//t7g-Temperaturen der PCR sind in Tab. 3.14 zusammengefasst.
Tab.3.14 : Primerpaare zurDetektion der AlaDH in Mykobaktenen
Die Sequenzen der Primer sind in Tab. 2.5 wiedergegeben.
Bezeichnung Primer #1 Primer#2 Produkt Temperatur
Annabel AIaDH-F1 AlaDH-RM 433 bp 65°C
Beatrice AlaDH-F1 AlaDH-R2 1102 bp 45°C
Claυdette AlaDH-F1 AlaDH-R3 1120 bp 55βC
Dέsirέe AlaDH-F1 AlaDH-R6 1072 bp 45βC
Eleonore AlaDH-F1 + AlaDH-R1 1099 bp 55°C
Francoise AlaDH-F1 + AlaDH-R2 1117 bp 50°C
Giselle AlaDH-F2 AlaDH-R7 757 bp 35βC
Helen AlaDH-F4 AlaDH-RM 1080 bp 55βC
Isabelle AlaDH-F4 AlaDH-R6 1050 bp 55°C
Jeanette AlaDH-F5 AlaDH-R1 507 bp 45°C
Karen AlaDH-F5 AlaDH-R4 . 834 bp 45°C
Laπssa AlaDH-F6 AlaDH-R4 786 bp 55βC
Melanie AlaDH-F6 AlaDH-R5 405 bp 55°C
Die ersten Versuche das Gen für die AlaDH in verschiedenen mykobakteriellen Spezies zu detektieren erfolgte mit dem Primerpaar Annabel. Das hierbei erhaltene Ergebnis war einigermaßen überraschend. Alle Stämme des M.tuberculosis Complex „,„„ „ O 98/32862
- A n zeigten das erwartete Fragment von 433 bp. Darüber hinaus war bei all diesen Stämmen ein zusätzliches Fragment von etwa 900 bp amplifiziert worden (Abb.3.17).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figure imgf000026_0001
Abb. 3.17 : PCR verschiedener Stämme mit dem Primerpaar Annabel
Gefahren wurden bei diesen PCR's jeweils 40 Zyklen mit der Abfolge : melting 2 min bei 96"C, annealing 2 min bei 65CC und exlension 3 min bei 72°C. Die MgCI2-Konzentration betrug 1,5 mM.
Bahn 1 : M.tuberculosis H37RV Bahn 6 : M.bovis BCG 4 Bahn 2 : M.tuberculosis H37Ra Eahn 7 : M.af canu 1 Bahn 3 : M.tuberculosis 1 Eahn 8 : M.microti 1 Bahn 4 : M.bovis 3 Bahn 9 : M.marinum 3 Bahn 5 : M.bovis BCG 2 Bahn 10 : M.chelonae 7
Wie sich herausstellen sollte, war dieses zweite Fragment ebenfalls ein Teil des AlaDH-Gens, das durch Anlagerung des Primers AlaDH-RM an einer weiter C-terminal gelegenen Stelle entstanden ist. Durch Erhöhung der >4nnea//t7g-Temperatur bei der PCR von 65 auf 69°C konnte dieses zweite Fragment unterdrückt werden (siehe Abb. 3.18, Bahn 2 und 3).
Das eigentlich erstaunliche war jedoch das Erscheinen des amplifiziεrten Fragments in allen Stämmen des M.tuberculosis Complex, unabhängig vom Vorhandensein von AlaDH-Aktivität. Auch bei einigen anderen Stämmen konnte mit dem Primerpaar Annabel eines oder mehrere Fragmente amplifiziert werden. Allerdings waren die amplifizierten Banden meist nicht besonders stark, so daß sie in Anbetracht der 40 PCR-Zyklen als Hintergrund betrachtet werden können. Es handelt sich vermutlich um schwache unspezifische Reaktionen. Jedoch ist auch nicht auszuschliessen, daß aufgrund mangelnder Homologie zwischen den verschiedenen Spezies die PCR-Primer nicht optimal an die Zielsequenz binden konnten.
Die beiden fischpathogenen Stämme mit starker AlaDH-Aktivität, M.marinum und M.chelonae, zeigten bei der PCR mit dem Primerpaar Annabel ein deutlich unterschiedliches Verhalten. Während M.marinum ein Produkt von etwa 540 bp lieferte, war bei den gewählten Bedingungen mit dem Primerpaar Annabel bei M.chelonae kein Fragment zu erhalten (Abb. 3.17, Bahn 9 und 10).
3.5.2.2 Das AlaDH-Gen des M.tuberculosis Complex
Da die Präsenz des Gens für die AlaDH nun in allen Stämmen des M.tuberculosis Complex nachgewiesen worden war, stellte sich die Frage, wie man sich die Diskrepanz zu den gemessenen Aktivitäten erklaren sollte.
Aus diesem Grunde wurde damit begonnen größere Fragmente des Gens zu amplifizieren. Aus M.tuberculosis H37RV konnten alle in Tab. 3.15 aufgeführten Fragmente amplifiziert werden (ein Teil dieser Fragmente ist in Abb. 3.18 gezeigt). Von den anderen Stämmen des M.tuberculosis Complex sind ebenfalls alle PCR- Reaktionen aus Tab. 3.15 die ausprobiert wurden, positiv verlaufen. Es wurde jedoch nicht mit jedem Stamm jede Reaktion nachvollzogen. - i6 -
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Figure imgf000028_0001
Abb. 3.18 : PCR-Produkte des Stammes M.tuberculosis H37RV
Gefahren wurden bei diesen PCR's jeweils 40 Zyklen wie in Abb. 3.17 angegeben. Die anπea/Z/ig-Temperaturen sind, mit Ausnahme von Bahn 2 und 3, in Tab. 3.14 wiedergegeben. Die gCI -Konzentration beim Primerpaar Annabel betrug 1 ,5 mM, die aller anderen Reaktionen 3 mM.
Bahn 1 : KBL Bahn 7 : Giselle Bahn 2 : Annabel, 65CC Eahn 8 : Helen Bahn 3 : Annabel, 69CC Bahn 9 : Isabelle Bahn : Dέsirέe Bahn 10 : La ssa Bahn 5 : Eleonore Bahn 11 : Melanie Bahn 6 : Francoise Bahn 12 : KBL
Der von allen Stämmen des M.tuberculosis Complex amplifizierte Bereich umfasst 1260 bp. Er beinhaltet den kompletten kodierenden Abschnitt für die AlaDH, sowie weitere 75 bp upstream und 63 bp dov/nstream. Dieser Bereich wurde von allen Stämmen des M.tuberculosis Complex komplett durchsequenziert (Abb. 3.19). Lediglich bei den letzten etwa 20 Basen schleichen sich Ungenauigkeiten ein. Der komplette restliche Bereich ist jedoch durch mehrfache Sequenzierungen abgesichert.
Es ist festzustellen, daß sämtliche Sequenzen bis auf drei Stellen komplett mit der publizierten Sequenz der AlaDH des λAA65-Klons (Andersen et al., 1992) identisch sind. - zi -
40kD -60 ATCTTGCAGA TTAATCC-AAC TTTCTTCACA CTGAAGCC-TA CAGTA7CGAG AC-C-GGTAATC - i
Tubl -60 ATCTTGCAGA TTAATCC-AAC TTTCTTCACA CTGAAGCGTA CAGTA.TCGA3 AGGGGTAATC -1
K37 v -60 ATCTTGCAGA TTAATCGAAC TTTCTTCATA CTGAAGCGTA CAGTATCGAG AGGGGTAATC -
H37Ra -60 ATCTTGCAGA TTAATCC-AAC TTTCTTCATA CTGAAGCGTA CAGTATC AG AGGGGTAATC - 1
BCG4 -60 ATCTTGCAGA TTAATCGAAC TTTCTTCACA CTGAAGCGTA CAGTATCGAG AGGGGTAATC -2
BCG2 -60 ATCTTGCAGA TTAATC-AAC TTTCTTCACA CTGAAGCGTA CAGTATCGAG AGGGGTAATC -1
Bov3 -60 ATCTTGCAGA TTAATCC-AAC TTTCTTCACA CTGAAGCGTA CAGTATCGAG AGGGGTAATC -1
Afrl -60 ATCTTGCAGA TTAATCC-AAC TTTCTTCACA CTGAAGCGTA CAGTATCGAG AGGGGTAATC - 1
Kiel -60 ATCTTGCAGA TTAATCC-AAC TTTCTTCACA CTGAAGCGTA CAGTATCGAG AGGGGTAATC -1
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40kD 1 ATGCGCGTCG GTATTCCC-AC CGAGACCAAA AACAACGAAT TCCAATTCCG GGTGGCCATC eo
Tubl 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG - — AT7CCG GGTGGCCATC 60
H37Rv 1 ATGCGCGTCG GTATTCCC-AC CGAGACCAAA AACAACG - - -AA.TTCCG GGTGGCCATC 60
H37Ra 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
BCG4 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
BCG2 1 ATGCGCGTCG GTATTCCC-AC CGAGACCAAA AACAACG AA.TTCCG GGTGGCCATC 60
Bov3 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
Afrl 1 ATGCGCGTCG GTATTCCGAC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
Micl 1 ATGCGCGTCG GTATTCCC-AC CGAGACCAAA AACAACG AATTCCG GGTGGCCATC 60
40kD 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
Tubl 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
K37RV 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
H37Ra 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
BCG4 61 ACCCCGGCCG C-CGTCGCGC-A ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
BCG2 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
Bov3 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
Afrl 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
Micl 61 ACCCCGGCCG GCGTCGCGGA ACTAACCCGT CGTGGCCATG AGGTGCTCAT CCAGGCAGGT 120
40kD 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGGCGC C-CAACTGGTC 1E0
Tubl 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGGCGC GCAACTGGTC ιεo
H37RV 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGC-CC-C C-CAACTGGTC lεo
K37Ra 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGGC C GCAACTGGTC ISO
BCG4 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAC-C-CGC GCAACTGGTC ISO
BCG2 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGGCGC C-CAACTGGTC lεo
Bov3 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGGCGC C-CAACTGGTC IEO
Afrl 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGGCGC GCAACTGGTC 180
Kiel ■ 121 GCCGGAGAGG GCTCGGCTAT CACCGACGCG GATTTCAAGG CGGCAGGCGC GCAACTGGTC ieo
40kD 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
Tubl 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
H37Rv 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
H37Ra 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
BCG4 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
BCG2 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
Bov3 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
Afrl 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
Micl 181 GGCACCGCCG ACCAGGTGTG GGCCGACGCT GATTTATTGC TCAAGGTCAA AGAACCGATA 240
Abb. 3.19 (1/5): Alignment des AlaDH-Gens und den flankierenden Regionen aus verschiedenen Stämmen des M.tuberculosis Complex
Siehe Legende Seite 101. 40kD 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
Tubl 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 3C0
H37Rv 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
H37Ra 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
3CG4 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG C-C-ATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
BCG2 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCC-ACACGGG C-C-ATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
3ov3 2 1 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCGACACC-GG C-GAT'CTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
Afrl 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCC-ACACGGG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
Micl 241 GCGGCGGAAT ACGGCCGCCT GCC-ACACGGG CAGATCTTGT TCACGTTCTT GCATTTGGCC 300
40kD 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
Tubl 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
H37Rv 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG C-ATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
H37Ra 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
BCG4 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
BCG2 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG C-ATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
Bov3 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
Afrl 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG C-ATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
Micl 301 GCGTCACGTG CTTGCACCGA TGCGTTGTTG GATTCCGGCA CCACGTCAAT TGCCTACGAG 360
40kD 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
Tubl 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
H37Rv 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
H37Ra 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
BCG4 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
BCG2 361 ACCGTCCAGA CCGCCGAAGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
Bov3 361 ACCGTCCAGA CCGCCGAAGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
Afrl 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
Micl 361 ACCGTCCAGA CCGCCGACGG CGCACTACCC CTGCTTGCCC CGATGAGCGA AGTCGCCGGT 420
40kD 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 4S0
Tubl 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
H37Rv 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
H37Ra 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
ECC-4 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
BCG2 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 480
3ov3 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 4εo
Afrl 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 4E0
Kiel 421 CGACTCGCCG CCCAGGTTGG CGCTTACCAC CTGATGCGAA CCCAAGGGGG CCGCGGTGTG 4S0
40kD 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
Tubl 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
H37Rv 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
H37P.a 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
BCG4 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
BCG2 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
3ov3 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
Afrl 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
Micl 481 CTGATGGGCG GGGTGCCCGG CGTCGAACCG GCCGACGTCG TGGTGATCGG CGCCGGCACC 540
Abb. 3.19 (2/5) : Alignment des AlaDH-Gens und den flankierenden Regionen aus verschiedenen Stämmen des M.tuberculosis Complex
Siehe Legende Seite 101. - Z ~
40kD 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CA7CGCCAAC GGCATGGGCG CGACCG77AC GGTTCTAGAC eco
Tubl 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CA7C3CCAAC GGCATGGGCG CGACCGTTAC GGTTCTAGAC 6C0
H37Rv 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CA7CGCCAAC GGCATGGGCG CGACCG77AC GGTTCTAGAC 6C3
K37Ra 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG GGCATGGGCG CGACCG7TAC GGTTCTAGAC 6C0
BCG4 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CA7CGCCAAC GGCATGGGCG CGACCG77AC GGTTCTAGAC 600
BCG2 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CATCGCCAAC GGCATGGGCG CGACCG77AC GGTTCTAGAC 600
Bov3 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CATCGCCAAC GGCATGGGCG CGACCG7TAC GGTTCTAGAC £30
Afrl 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CATCGCCAAC GC-CATC-GGCG CGACCG7TAC GGTTCTAGAC 600
Micl 541 GCCGGCTACA ACGCAGCCCG CATCGCCAAC GGCATGGGCG CGACCG7TAC GGTTCTAGAC 600
CkD 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
Tubl 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
H37Rv 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCC-AGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
H37Ra 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGG.AT CCACACTCGC 660
BCG4 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCC-GAT CCACACTCGC 660
BCG2 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGGAT CCACACTCGC 660
Bov3 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCC-GAT CCACACTCGC £60
Afrl 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCC-GAT CCACACTCGC 660
Micl 601 ATCAACATCG ACAAACTTCG GCAACTCGAC GCCGAGTTCT GCGGCCGGAT CCACACTCGC ££0
40kD 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAC-GGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
Tubl 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAC-GGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
K37Rv 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAGG3TGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
H37Ra 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAC-GGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
BCC-4 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAGGGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
BCG2 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAC-GGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
Bov3 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
Afrl 651 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAC-GGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
Micl 661 TACTCATCGG CCTACGAGCT CGAGGGTGCC GTCAAACGTG CCGACCTGGT GATTGGGGCC 720
40kD 721 GTCCTGGTGC CAGGCGCCAA GGCACCCAAA TTAGTCTCGA ATTCACTTGT CGCGCATATG 7S0
Tubl 721 GTCCTGC-TGC CAGGCGCCAA GGCACCCAAA TTAGTCTCGA ATTCACT7GT CGCGCATATG 7E0
H37 v 721 GTCCTGGTGC CAGGCGCCAA GGCACCCAAA TTAGTCTCGA ATTGACTTGT CGCGCATATG 7£0
K37Ra 721 GTCCTGGTGC CAGGCGCCAA GGCACCCAAA TTAGTCTCGA A.TTCACT7GT CGCGCATATG 780
BCG4 721 GTCCTGGTGC CAGGCGCCAA GGCACCCAAA TTAGTCTCGA ATTCACT7GT CGCGCATATG 7S0
BCG2 721 GTCCTGGTGC CAGGCGCCAA GGCACCCAAA TTAGTCTCGA ATTCACT7GT CGCGCATATG 7E0
Bov3 721 GTCCTGGTGC CAGGCGCCAA GGCACCCAAA TTAGTCTCGA ATTCACT7GT CGCGCATATG 780
Afrl 721 GTCCTGGTGC CAGGCGCCAA GGCΛCCCAAA TTAGTCTCGA ATTCACT7GT CGCGCATATG 7 = 0
Micl 721 GTCCTGGTGC CAGGCGCCAA GGCACCCAAA TTAGTCTCGA ATTCACTTGT CGCGCATATG 780
40kD 781 AAACCAGGTG CGGTACTGGT GGATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTG7TT CGAAGGCTCA 840
Tubl 781 AAACCAGGTG CC-GTACTGGT C-GATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTG7TT CGAAGGCTCA 640
H3 Rv 781 AAACCAGGTG CGGTACTGGT GGATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTG77T CGAAGGCTCA 840
H37Ra 781 AAACCAGGTG CC-GTACTGGT C-GATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTG77T CGAAGGCTCA 840
BCG4 781 AAACCAGGTG CGGTACTGGT GGATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTG7TT CGAAGGCTCA £40
BCG2 781 AAACCAGGTG CGGTACTGGT C-GATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTC-7TT CGAAGGCTCA 840
Bov3 781 AAACCAGGTG CC-GTACTGGT GGATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTG77T CGAAGGCTCA 640
Afrl 781 AAACCAGGTG CGGTACTGGT GGATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTG77T CGAAGGCTCA 6 0
Micl 781 AAA.CCAGGTG CGGTACTGGT GGATATAGCC ATCGACCAGG GCGGCTG77T CGAAGGCTCA 840
Abb. 3.19 (3/5) : Alignment des AlaDH-Gens und den flankierenden Regionen aus verschiedenen Stämmen des M.tuberculosis Complex
Siehe Legende Seite 101. 40kD 841 CGACCGACCA CC7ACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTACTGCGTG 900
Tubl 841 CGACCGACCA CC7ACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT T7ACTGCGTG 900
K37RV 841 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTACTGCGTG 900
K37Ra £41 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTACTGCGTG 900
BCG4 841 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTACTGCGTG 900
BCG2 841 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTACTGCGTG 900
Bov3 641 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTACTGCGTG 900
Afrl 841 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTACTGCGTG 900
Micl 641 CGACCGACCA CCTACGACCA CCCGACGTTC GCCGTGCACG ACACGCTGTT TTACTGCGTG 900
40kD SOI GCGAA.CATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG S60
Tubl 901 GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
H37RV 901 GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
H37Ra 90 GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
BCG4 SO GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
BCG2 901 GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
3ov3 901 GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
Afrl 901 GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAA.GACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG 960
Micl 901 GCGAACATGC CCGCCTCGGT GCCGAAGACG TCGACCTACG CGCTGACCAA CGCGACGATG S60
40kD 961 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CC-ACCATGC-C TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
Tubl 961 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCA GGC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
K37Rv S61 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATGGC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
H37Ra 961 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATC-GC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
BCG4 961 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATC-GC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
BCG2 961 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATGGC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
Eσv3 961 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATC-GC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
Afrl 961 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATC-GC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
Micl 961 CCGTATGTGC TCGAGCTTGC CGACCATGGC TGGCGGGCGG CGTGCCGGTC GAATCCGGCA 1020
40kD 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC GCACGAAGGG GCGTTACTGT CCGAACGGGT GGCCACCGAC 1080
Tubl 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC GCACGAAC-GG GCGTTACTGT CCGAACGC-GT GGCCACCGAC 1080
H37Rv 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC GCACGAAGGG GCGTTACTGT CCGAACGGGT GGCCACCGAC 1080
K37Ra 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC GCACGAAGGG GCGTTACTGT CCGAACGC-GT GGCCACCGAC 1080
3CG4 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC C-CACGAAC-C-G GCGTTACTGT CCGAACGGGT GGCCACCGAC 1080
BCG2 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC GCACGAAGGG GCGTTACTGT CCGAACGGGT GGCCACCGAC 1080
3ov3 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC GCACGAAGGG GCGTTACTGT CCGAACGC-GT GGCCACCGAC 1080
Afrl 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC GCACGAAGGG GCGTTACTGT CCGAACGGGT GGCCACCGAC 1080
Micl 1021 CTAGCCAAAG GTCTTTCGAC GCACGAAC-GG GCGTTACTGT CCGAACGGGT GGCCACCGAC 1080
Stop
40kD 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
Tubl 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
H37Rv 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
K37Ra 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
BCG4 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
BCG2 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
Bov3 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
Afrl 1081 CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
Micl 1081 . CTGGGGGTGC CGTTCACCGA GCCCGCCAGC GTGCTGGCCT GACTCTCGGC CGCTCGTTAC 1140
Abb. 3.19 (4/5) : Alignment des AlaDH-Gens und den flankierenden Regionen aus verschiedenen Stämmen des M.tuberculosis Complex
Siehe Legende Seite 101. 40kD 11 1 GCCGAGCACA CC-TCGGGAGT AAGGGAAGCG ATGATGTCGG CCGCG -. -. B 3
Tubl 1141 GCCGAGCACA CNTCGGGAGT AANGGAAGCG ATGATGTCGN C 1185
H37Rv 11 1 GCCGAGCA.CA CG7CGGGAGT AAGGGAAGCG ATGATGTCGG CCG 1165
H37Ra 1141 GCCGAGCACA CGTCGGGAGT AAC-C-G.AAGCG ATGA 1185
BCG4 11 1 GCCGANCACA CGTCGGGAGT AAGGGAAGCG ATGATGTCGG CC 11S5
BCG2 11 1 GCCGAGCACA CGTCNGGAGT AAGGGAAGCG ATGATG lies
Bov3 1141 GCCGAGCACA CGTCGGGAGT AAGGGAAGCG ATGATGTCGG CC 11S5
Afrl 1141 GCCGAGCNCA CC-TCG
Micl 1141 GCCGAGCACA CGTCGGGAGT AAGGGAAGCG ATGATGTCGG CC 1135
Abb. 3.19 (5/5) : Alignment des AlaDH-Gens und den flankierenden Regionen aus verschiedenen Stämmen des M.tuberculosis Complex
Die mit "40kD" bezeichnete Zeile gibt die Sequenz von Andersen ef al. (1992) wieder. Sequenzunterschiede sind jeweils mit einem "*" über der Sequenz gekennzeichnet. Das Start- und das
Stopcodon sind ebenfalls über der Sequenz markiert. Bei den fett gedruckten Basen am Ende der Sequenz handelt es sich um Sequenzierungenauigkeiten.
Die erste Stelle an der sich die Sequenzen unterscheiden ist Base -32, also upstream des Translations-Startsignals. Interessanterweise unterscheiden sich an dieser Stelle die in dieser Arbeit bestimmten Sequenzen von M.tuberculosis H37RV und H37Ra von der Sequenz von Andersen und Mitarbeitern (Andersen et al., 1992). Alle anderen Sequenzen die in dieser Arbeit untersucht wurden, einschließlich die des dritten getesteten Stammes von M.tuberculosis, stimmen mit der Sequenz von Andersen überein.
Dies ist insofern verwunderlich, als daß die ursprünglich publizierte Sequenz auf dem Klon einer λgt11-Bank beruht, die aus dem Stamm M.tuberculosis H37RV hergestellt worden war. Es wurde deshalb der Frage nachgegangen, ob eventuell durch die PCR ein Fehler eingeführt worden war. Dies bestätigte sich jedoch nicht. Es könnte jedoch auch möglich sein, daß der in dieser Arbeit benutzte Stamm von M.tuberculosis H37RV einen anderen Ursprung hat als der von Andersen. Ähnliche kleine Varianzen sind auch bei verschiedenen Stämmen unterschiedlichen Ursprungs von M.bovis BCG bekannt.
An der zweiten Stelle unterscheiden sich alle Stämme des M.tuberculosis Complex von der publizierten Sequenz der AlaDH von M.tuberculosis H37RV. Es handelt sich um die Region der Basen 38 bis 49. Innerhalb dieser zwölf Basen wird die Sequenz •AATTCC- wiederholt, die Basen 44 bis 49 stellen also ein direct repeat der Basen 38 bis 43 dar. In allen acht sequenzierten Stämmen ist dieses Muster jedoch jeweils nur einmal zu finden. Es ist also davon auszugehen, daß sich bei der von Andersen et al. (1992) bestimmten Sequenz ein Sequenzierungs- oder Lesefehler eingeschlichen hat. Die Gensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz ändert sich hierdurch folgendermaßen :
Andersen etal., 1992:
Gensequenz A A C G A A T T C C A A T T C C G G G T G Proteinsequenz Asn GIu Phe Gin Phe Arg Val
Diese Arbeit :
Gensequenz A A C G A A T T C C G G G T G
Proteinsequenz Asn GIu Phe - - Arg Val
Es handelt sich also effektiv um den 'Verlust' der beiden Aminosäuren Glutamin und Phenylalanin. Nach dieser Deletion setzt sich die Sequenz wie von Andersen et al. (1992) publiziert fort.
Dieser Sachverhalt wurde durch die N-terminale Sequenzierung des Proteins bestätigt. Weder im nativen Protein von M.tuberculosis H37RV, noch im rekombinanten Protein aus E.coli, waren die beiden Aminosäuren zu finden.
Bei der dritten unterschiedlichen Stelle handelt es sich um Base 272. An dieser Stelle befindet sich, mit der Ausnahme dreier Stämmen, ein Adeninrest. Bei diesen drei Stämmen, M.bovis und zwei Stämme von M.bovis BCG, ist diese Base deletiert. Diese Deletion führt zu einer Leserasterverschiebung, die den gesamten folgenden Teil des resultierenden Proteins betrifft. Durch diese Leserasterverschiebung tritt an den Basen 404 bis 406 ein opa/-Stopsignal auf. Damit ist das Produkt dieses Gens nur etwa ein Drittel so groß wie die funktioneile AlaDH der anderen Stämme.
Das entscheidende bei dieser dritten Abweichung in der Gensequenz ist die Tatsache, daß sie genau in den drei Stämmen auftritt, die keine AlaDH-Aktivität zeigen. M.bovis und M.bovis BCG sind die einzigen Stämme des M.tuberculosis Complex, die keine Aktivität zeigen. Alle anderen Stämme wurden als mäßig oder stark positiv klassifiziert. Die beobachtete Deletion ist also der Grund für das Fehlen einer funktioneilen AlaDH. Da jedoch mit dem mAb HBT-10 auch nicht das verkürzte Protein nachgewiesen werden kann (das Epitop von HBT-10 liegt im Bereich vor der Leserasterverschiebung), ist davon auszugehen, daß das verkürzte Protein erst gar nicht, bzw. nur in sehr kleinen, mit dem mAb HBT-10 nicht detektierbaren, Mengen, produziert wird.
3.5,2.3 Das AlaDH-Gen von M.marinum
Außer den Mitgliedern des M.tuberculosis Complex, war es in erster Linie der Stamm M.marinum, bei dem bei der PCR mit dem Primerpaar Annabel ein Fragment gewonnen werden konnte (Abb. 3.17), das sich bei der späteren Sequenzierung als AlaDH erwies. Wie sich zeigen sollte war dies insofern ein Glücksfall, als daß die meisten anderen PCR's mit den Primerpaaren aus Tab. 3.15 keine, oder zumindest nicht die erwarteten, Fragmente mit diesem Stamm lieferten. Lediglich die PCR mit dem Primerpaar Giselle verlief ebenfalls positiv. Wie sich später herausstellte war der Grund hierfür die mangelnde Homologie zwischen den Genen innerhalb der verschiedenen Spezies. 50 60 70
Mar3 ATTCCGGTTAGCGATCACCCCGGCCGGCG
MIMIII I II IIIMMIIMIIMI
H37RV TTCCGACCGAGACCAAAAACAACGAATTCCAATTCCGGGTGGCCATCACCCCGGCCGGCG
80 90 100 110 120 130
Mar3 TCGCCGCCTTGACCAAGCGCGGCCACGAGGTGCTGATCCAGGCCGGTGCCGGAGAAGGCT
UM I I IM II MIM MIMIII MIMIII MM
H37RV TCGCGGAACTAACCCGTCGTGGCCATGAGGTGCTCATCCAGGCAGGTGCCGGAGAGGGCT
140 150 160 170 180 190
Mar3 CCGCCATCTCCGACGCCGACTTCAAGGCCGCCGGTGCCCAGCTGATCAGCACCGCCGACC
I II IM II MUMM II II II II MI II IIIMMMIM
H37RV CGGCTATCACCGACGCGGATTTCAAGC-CGGCAGGCGCGCAACTGGTCGGCACCGCCGACC
200 210 220 230 240 250
Mar3 AGGTGTGGGCGGATGCGGACCTGCTGCTCAAGGTCAAGGAACCGATCGAGTCCGAGTACG
IMIMIMI II II II I MMMMIMM MIMIII I I I II MM
H37Rv AGGTGTGGGCCGACGCTGATTTATTGCTCAAGGTCAAAGAACCGATAGCC-GCGGAATACG
2G0 270 280 290 300 310
Mar3 GCCGGCTGCGCCGGGGCCAGACCCTGTTCACCTACCTGCACCTGGCCGCCTCGCGCCCCT
MM MIM I II Uli I I I MM M I I
H37RV GCCGCCTGCGACACGGGCAGATCTTGTTCACGTTCTTGCATTTGGCCGCGTCACGTGCTT
320 330 340 350 360 370
Mar3 GCACCGATGCCCTGCTGAAGTCCGGCÄCCACGTCCATCGCCTACGAGACGGTGCAGACCG
IMIIMIM II II I MIMMMIMM II II NIMM
H37RV GCÄCCGÄTGCGTTGTTGGATTCCGGCACCACGTCAATTGCCTACGÄGACCGTCCAGACCG
380 390 400 410 420 430
Mar3 CCGACGGCGCATTGCCGCTGCTGGCCCCCATGAGCGAGGTCGCCGGGCGCCTGTCCGCCC I II MIM MIM MIMIII MIMIII II II MIM!
H37Rv CCGACGGCGCACTACCCCTGCTTGCCCCGATGAGCGAAGTCGCCGGTCG.-.CTCGCCGCCC
440 450 460 470 480 490
Mar3 AAGCTGGGGCCTACCACCTGATGCGCACCCACGGCGGTCGCGGCGTGCTGATGGGCGGCG
I I IM II lllll-ll II MIM I
H37Rv AGGTTGGCGCTTACCACCTGATGCGAACCCAAGGGGGCCGCGGTGTGCTGATGGGCGGGG
500 510 520 530 540 550
Mar3 TCCCCGGCGTCAAGCCTGCCGACGTCGTGGTGATCGGCGCGGGCACGGCCGGATACAACG
I I II MIMMIMMMMMMMI MIM MIM
H37Rv TGCCCGGCGTCGAACCGGCCGACGTCGTGGTGATCGGCGCCGGCACCGCCGGCTACAACG
Abb.3.20 (1/2): Alignment der AlaDH Gene von M.marinum und M.tuberculosis H37R*,
Das Screening der Datenbank und das Alignment wurden mit der FASTA-Software {titp:/Λvww.embl- ebi.ac.uk/) durchgeführt (Sensitivität ktup=6). Ein "|" kennzeichnet ein identisches Eaεenpaar. - 3S -
560 570 ΞSO 590 600 610 Mar3 CCGCCCGCGTCGCCAACGGCATGC-GCC-CC-ATGGTCACCGTGCTGG^~GTCi^CATC^ziC^
I II II II II II II M ι ι I IΪΪ I I I I Ϊ M
H37RV CAGCCCGCATCGCCAACGGCATGC-GCGCG.-.CCGTTACGGTTCTAGACATCAACATCGACA
620 630 540 650 660 670
Mar3 AGCTCCGCCAGATCGACGCGGAGTTCGGCGGTCGCGTCCGGACCCGCTACTCGTCG CCC l l l l l l l I I I I I I M M I I I M | | | | | M l 'l l
H37Rv AACTTCGGCAACTCGACGCCGAGTTCTGCGGCCGGATCCACACTCGCTACTCATCGGCCT
680 690 700 710 720 Mar3 TCGACCTCGAGGATGCGGCAGTCCACGCCGACATGGTGATCGGGGCCGTCCT
M I I M I I I I M M
H37Rv ACGAGCTCGAGGGTGCCGTCAAACGTGCCGACCTGGTGATTGGGGCCGTCCTGGTGCCAG
Abb. 3.20 (2/2): Alignment der AlaDH Gene von M.marinum und M.tuberculosis H37RV
Das Screening der Datenbank und das Alignment wurden mit der FASTA-Sofiware (http://www.embl- ebi.ac.uk/) durchgeführt (Sensitivität ktup=6). Ein " | " kennzeichnet ein identisches Basenpaar.
Insgesamt konnten 682 Basen dieses Gens bestimmt werden (Abb. 3.20), was etwa 60% des kompletten Gens ausmacht. Diese 682 Basen kodieren den N-terminalen Bereich des Proteins. Es fehlen lediglich die ersten 35 Basen nach dem Startcodon.
Der sequenzierte Abschnitt der AlaDH von M.marinum zeigt 80,4% Identität mit dem entsprechenden Abschnitt von M.tuberculosis H37RV. Die Sequenzunterschiede sind relativ gleichmäßig über den gesamten Abschnitt verteilt.
Das abgeleitete Peptid der M.marinum Gensequenz (Abb. 3.21) zeigt 85,3% Identität und 92,0%) Ähnlichkeit mit dem Protein von M.tuberculosis H37RV. Homologien zu anderen Proteinen der Swiss Prot-Datenbank sind in Tab. 3.15 wiedergegeben (Stand : 9/1996, Release 33). Als Vergleich sei erwähnt, daß die AlaDH von M.tuberculosis 53% Identität zu den Enzymen von B.sphaericus und B.stearothermophilus aufweist (Andersen et al., 1992). Bei der AlεDH von M.marinum ist eine Identität von 51% mit dem Enzym von B.sphaericus bzw. von 50% mit dem Enyzm von B.stearothermophilus festzustellen (Tab. 3.15). ** ******** ** ****** **#*•»***++ _ ***+ *+*+*** ************** Mar3 14 FRIΛITPAGVAALTJ- GHΞVLICAGAGΞGΞAISDADfKAAGAQLISTA-DQV A AD L 73
H37RV 14 FRVAITPAGVAΞLTr. GHΞVLIQAGAC-ΞGSAITDADFKAAGAQ VGTADQ"AJDADLLLK 73
***** _ *+**++ ** *** , ******* ****** ************************ Mar3 74 VKΞPIESΞYGRLRRGQTLFTYLHI-A^?.?CTDAiLKSGTTΞIAYETVQTA )GALP I-APM 123
H37RV 74 VTEPIAAΞYGR F-IGQILFTF KI.AA.≤R^CTDAI.LDSGTTSIAYET^QTAJ -.ALP LAPM 123
******* ** ******** ************* # ****************** _****** Mar3 134 SEVAGRLSAQAGAYHlJ-ST:-:GGRGVI-.MGGVPGVKPADV VIGAGTAGYKAAF.VANGMGAl 183 H37RV 134 SEVAGRLAAQVGAYHIJ^TQGGRGVL GGVPGVEPADVVVIGAGTAGYKA.ARIANGMGAT 183
+****_**_+***.**** **. ***** . ** * **.****+
Mar3 184 VTV DVT^IN"iRQIDAΞFGGRVRTRYSSTLDLΞDAAVKADIWIGAV 229 H37RV 184 VTVLDINIDK RQ DASFCGRIKTRY≤SAYELΞGAλKRADLVIGAV 229
Abb.3.21 : Alignment derAlaDH's von M.marinum und M.tuberculosis H37RV
Ein "»" zeigt eine identische, ein "." eine funktionell verwandte Aminosäuren an. Das Screening der Datenbank und das Alignment wurden mit der FASTA-Software (http://wvΛv.embl-ebi.ac.ukή durchgeführt (Sensitivität ktup=2).
Tab.3.15 : Proteine mit Homologie zur AlaDH von M.marinum
Die Swiss Prot- Datenbank wurde mit der FASTA-Software (http:/ΛwΛV.embl- ebi.ac.uk) durchsucht (Stand : 9/1996, Release 33).
Protein Organismus Identität Ähnlichkeit
AlaDH M.tuberculosis 85,3 % 92,0 %
AlaDH B.sphaericus 50,9 % 69,0 %
AlaDH B.εiearo'hermophilus 50,0 % 67,7 %
AlaDH B.subtilis 48,7 % 68,6 %
PNT Rind, mitochondrial 33,7 % 51,4%
PNT E.coli 30,7 % 50,0%
PNT Haemophilυs influenzae 28,8 % 43,2 %
Als essentiell für die Bindung des Cofaktors der AlaDH von M.tuberculosis H37RV werden die Aminosäurereste Gly165, G!y167, GIy170 und Asp198 betrachtet. Diese vier Aminosäurereste stellen ein Charakteristikum der ßαß-Sekundärstruktur von NAD(H)-Bindungsstelien dar (Wierenga et al., 1986; Bork & Grunwald, 1990). Im Enzym von M.marinum, genauso wie bei sämtlichen anderen AlaDH's in Tab. 3.14, sind diese vier Reste konserviert.
Der entsprechende Abschnitt des Epitops des mAb HBT-10 bei der AlaDH von M.marinum hat die Sequenz A I S D A D F K A A G, und unterscheidet sich damit lediglich an der dritten Stelle von der Sequenz von M.tuberculosis H37RV. Aufgrund des in dieser Arbeit bestimmten Konsensusepitops des Antikörpers (Tab. 3.9), müsste dieser auch mit der AlaDH von M.marinum reagieren. Tatsächlich ist dieser Stamm auch der einzige, mit dem eine Kreuzreaktion beobachtet werden konnte (Andersen et al., 1992). Die ermittelte Sequenz stimmt also auch mit dieser Beobachtung überein.
AlaDH-Aktivität in Mykobaktenen. Die gemessenen AlaDH-Aktivitäten lassen einige interessante Beobachtungen bezüglich der Lebensweise der Organismen mit positiver Aktivität zu.
Die Stämme mit starker Aktivität sind allesamt pathogen. Interessant ist hierbei, daß zwei der vier in diese Gruppe . fallenden Stämme pathogen für Fische sind (Austin & Austin, 1987). Alle beide, M.marinum und M.chelonae, können jedoch auch Menschen
infizieren (Wallace et al., 1983; Johnston & Izumi, 1987). Im Gegensatz zur Tuberkulose lösen sie jedoch meist krankhafte Infektionen der oberen Hautschichten aus, die meist relativ unproblematisch zu behandeln sind.
M.chelonae ist ist ein vergleichsweise schnell wachsendes, nicht-chromogenes Bakterium. Infektionen beim Menschen treten oft als sekundäre Wundinfektionen nach Operationen auf (Cooper ef al., 1989). M.marinum ist ein langsam wachsender Organismus, der bei Wachstum an Licht ein gelbes Pigment bildet. In mehr als 50 wechselwarmen Spezies (Reptilien, Amphibien, Fische) wurden Infektionen mit M.marinum nachgewiesen (Clark & Shepard, 1963). Beim Menschen manifestiert sich das Bakterium meist im Ellbogen- oder Kniebereich.
Die beiden anderen Stämme mit stark-positiver AlaDH-Aktivität sind Vertreter des M.tuberculosis Complex. Es sind dies der Tuberkulose-Referenzstamm M.tuberculosis H37RV, sowie der Stamm M.microti, der als phylogenetisches Bindeglied zwischen M.tuberculosis und M.bovis betrachtet wird.
Bis auf M.smegmatis sind auch alle als mäßig-positiv klassifizierten Stämme pathogen. Der Großteil dieser Stämme umfasst klinische Isolate von M.tuberculosis. Pathogene Varianten von Tuberkulose-Stämmen scheinen also in der Regel AlaDH- Aktivität zu besitzen. Es wurden jedoch auch zwei Isolate gefunden, die keine AlaDH- Aktivität aufweisen. Der einzige nicht-pathogene Organismus mit AlaDH-Aktivität ist der schnell wachsende Stamm M.smegmatis. M.smegmatis weist sich jedoch durch eine ungewöhnlich starke NAD+-reduzierende Hintergrundaktivität aus, und ist deshalb sehr leicht von allen anderen Stämmen mit AlaDH-Aktivität zu unterscheiden. Desweiteren wurde im Stamm M.smegmaits 1-2c, ein mykobakterieller Expressionsstamm, keine AlaDH-Aktivität gefunden. Innerhalb der 44 getesteten Mykobakterien-Stämme, und dies ist bei weitem der Großteil aller bekannten Stämme, ist deshalb die Folgerung erlaubt :
»»«fr- Ein langsam wachsendes Mykobakterium mit positiver AlaDH-Aktivität ist virulent.
Der Umkehrschluß dieser Feststellung ist jedoch falsch. Unter den Stämmen ohne AlaDH-Aktivität sind etliche virulente. Trotzdem kommt man nicht umhin eine, wenn auch nicht feste, Tendenz festzustellen, nach der die AlaDH-Aktivität mit steigender Pathogenität eines Stammes zunimmt. Insbesondere durch die Aktivitäten der verschiedenen Stämme von M.tuberculosis wird diese These unterstrichen. Die mit Abstand höchste Aktivität hat der Stamm H37RV, der als Referenzstamm für alle Tuberkulose-Laboratorien dient, und eine bekannt hohe Infektiösität besitzt. Ganz am Ende rangiert das avirulente Derivat von H37RV, der Stamm H37R2. Zwischen diesen beiden Polen rangieren die klinischen Tuberkulose-Isolate, die mal etwas mehr und mal etwas weniger Aktivität zeigen.
Das AlaDH-Gen in Mykobaktenen. Das Gen für die Alanin Dehydrogenase konnte in allen untersuchten Stämmen des M.tuberculosis Complex und im Stamm M.marinum identifiziert werden.
Der entscheidene Punkt beim Vergleich der Sequenzen innerhalb des M.tuberculosis Complex ist die Deletion der Base 272, die bei den untersuchten Stämmen von M.bovis und M.bovis BCG zu einer Leserasterverschiebung und letztendlich zu einem verkürzten, nicht-funktionellen Protein führt. Bei diesen Stämmen ließ sich auch in Zellextrakten keine AlaDH-Aktivität nachweisen. Diese Daten stimmen auch mit den Ergebnissen von Andersen et al. (1992) überein, die in Southern Blots zwar Signale mit diesen Stämmen erhielten, aber in Western Blots kein Protein nachweisen konnten.
Durch die Amplifikation und Sequenzierung des Gens konnte in dieser Arbeit die Ursache hierfür gefunden werden. Es muß jedoch auch in Betracht gezogen werden, daß noch weitere Änderungen in den regulatorischen Genabschnitten für das Fehlen des verkürzten Proteins verantwortlich sein können. Dies könnte eine Maßnahme der Zelle sein, keine Energie in ein nicht funktionsfähiges Protein zu investieren. Allgemein ist über regulatorische Gensequenzen bei Mykobaktenen noch nicht viel bekannt (Dale & Patki, 1990; Gupta et al. 1993). Es scheint jedoch, daß, nach dem Prinzip von Enhancern, auch weiter weg gelegene Abschnitte die Genexpression nicht unerheblich beeinflußen können. Die für eine Einstellung der Produktion des Proteins nötigen Mutationen müssen also nicht zwangsläufig auf dem in dieser Arbeit sequenzierten Bereich liegen.
Das andere identifizierte AlaDH-Gen, jenes von M.marinum, ist auf DNA-Ebene deutlich unterschiedlich von den Genen des M.tuberculosis Complex. Immerhin vier von fünf Basen (80,4%) sind beim Vergleich dieser Sequenzen jedoch durchschnittlich noch identisch. Dieser Wert ist auf Proteinebene noch höher (85,3% Identität, 92,0% Ähnlichkeit). Da AlaDH-Aktivität jedoch auch in einer Reihe weiterer Spezies gefunden wurde, ist davon auszugehen, daß sich die entsprechenden Gene, mangels Homologie zu den benutzten Primern, bei den benutzten Bedingungen nicht εmplifizieren ließen. Eine eingehendere Studie betreffs dieses Punktes müsste auch diese Gene auffinden können. Ein Vergleich all dieser Sequenzen könnte weitere Rückschlüsse auf die Rolle des Enzyms zulassen.
Desweiteren ist denkbar, daß sich anhand eines solchen Sequεnzvergleiches ein PCR- Verfahren entwickeln lassen müsste, mit dem man Mykobaktenen, die ein AlaDH- Gen besitzen, voneinander unterscheiden kann. Und wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, sind es eben die für den Menschen bedeutenden Stämme, die ein AlaDH-Gen besitzen. Besonders die Möglichkeit, mit einem solchen PCR-Assay den Erreger M.tuberculosis vom Impfstamm M.bovis BCG unterscheiden zu können, lassen ein solches Vorhaben interessant erscheinen. Ausblick. Das in dieser Arbeit behandelte 40 kD-Antigen stellt in mehrererlei Hinsicht ein lohnenswertes Objekt für weitergehende Untersuchungen dar. Ein Punkt, der in dieser Arbeit nicht weiter berücksichtigt wurde, ist die mögliche Anv/εndung dieses Enzyms in der medizinischen Diagnostik. So wurden bereits für die Enzyme Dipeptidase (Ito er al., 1984), γ-Glutamyltransferase (Kondo et al., 1992) und γ-GIutamyl Cyclotransferase (Takahashi et al., 1987) Assays beschrieben, die auf einer AlaDH basieren. Alle drei genannten Enzyme sind bei verschiedenen Krankheiten in veränderten Urin-, Serum- bzw. Blutkonzentrationen vorzufinden.
Das Hauptaugenmerk liegt jedoch auf dem Einsatz des 40 kD-Antigens bei der Tuberkulose. Ansatzpunkte sind hierbei an mehreren Stellen denkbar.
Allein bei der Diagnostik sind mehrere Möglichkeiten vorstellbar, v/ie das 40 kD- Antigen, bzw. das ihm zugrundeliegende Gen, genutzt werden könnte. Da das rekombinante Protein nun leicht aus dem überproduzierenden E.coli Stamm gewonnen werden kann, erscheint es lohnenswert, die Nützlichkeit dieses Proteins in der Serologie zu überprüfen. Zudem könnten sich diagnostische Verfahren entwickeln lassen, die auf dem direkten Nachweis von AlaDH-Aktivität oder, wie bereits erwähnt, auf der Amplifikation spezifischer Teile des Gens beruhen. Die Deletion der Base 272 in den Stämmen M.bovis und M.bovis BCG kann hierbei als Ansatzpunkt der Diskriminierung dieser beiden Stämme von M.tuberculosis dienen.
Ein PCR-Assay müsste sich auch für den Stamm M.marinum etablieren lassen, der sich ja auf Genebene nicht unerheblich vom M.tuberculosis Complex unterscheidet. Bislang wird zu diesem Zweck ein PCR-Assay, beruhend auf der Amplifikation eines Teils der für die 16S rRNA kodierenden Gensequenz, eingesetzt (Knibb et al., 1993). Dies ist, in Anbetracht der in den letzten Jahren steigenden Zahl von Infektionen mit M.marinum in Fischfarmen (Knibb et al., 1993), von großer Bedeutung. Auch Infektionen beim Menschen werden in den letzten Jahren gehäuft vermeldet (Harris et al., 1991 ; Kullavanijaya et al., 1993; Slosarek et al., 1994).
Die Beobachtung, daß die Virulenz eines Stammes von M.tuberculosis sehr gut mit seiner AlaDH-Aktivität korreliert, wirft erneut die Frage auf, ob das Enzym einen Virulenzfaktor darstellt. Zur Beantwortung dieser Frage sind Ansätze denkbar, wie der knock-out des Gens in M.tuberculosis oder die Überexpression des Gens in einem Stamm mit niedriger Virulenz. In beiden Fällen kann die Virulenz im Tiermodεll überprüft werden.
Die Offenbarung der vorliegenden Anmeldung umfaßt auch die Offenbarung der anliegenden EP 97 101 339-6, insbesondere die darin angeführte Literatur. Die Offenbarung umfaßt auch sämtliche denkbaren Kombinationen offenbarter Einzelmerkmale.

Claims

5. ZusammenfassungDie Tuberkulose ist eine Infektionskrankheit, der jährlich über 3 Millionen Menschen zum Opfer fallen. Es gibt zwar εov/ohl einen Impfstoff, als auch verschiedene Diagnose- und Therapieverfahren, doch die Effektivität all dieser Maßnahmen bedarf, angesichts der wieder steigenden Zahl der Erkrankungsfälle, dringend einer Verbesserung.Ein Forschungsschwerpunkt liegt auf der Charakterisierung von Antigenen, die frühzeitig während einer Infektion sekretiert werden, da diese den ersten Kontakt des Immunsystems mit dem Erregers herstellen. Das in dieser Arbeit behandelte 40 kD-Antigen liegt in vivo als Hexamer vor, und ist trotz des hohen Molekulargewichts und des Fehlens einer Signalsequenz bereits nach wenigen Tagen des Wachstums extrazellulär zu finden. Es stellt funktioneil eine L-Alanin Dehydrogenase dar und reagiert mit dem gegen dieses Protein gerichteten monoklonalen Antikörper HBT-10. HBT-10 war der erste bekannte Antikörper, der spezifisch für ein Protein von M.tuberculosis ist und nicht mit dem Impfstamm M.bovis BCG kreuzreagiert.
1. Das für das 40 kD-Antigen kodierende Gen war bereits in einen Plasmidvektor für E.coli kloniert und die Expression des resultierenden Plasmids optimiert worden. In dieser Arbeit wurde eine komplett neue Methode etabliert, die es ermöglicht, das hexamere Protein in einem Zwei-Schritt-Verfahren in löslicher und aktiver Form aufzureinigen.
2. Alle wesentlichen biochemischen Parameter des rekombinanten Enzyms wurden bestimmt. Die ermittelten Eigenschaften stehen in Einklang mit denen anderer beschriebener L-Alanin Dehydrogenasen. Das Enzym von M.tuberculosis ist die Alanin Dehydrogenase mit dem niedrigsten bekannten pH-Optimum für die reduktive Aminierung.
3. Die ermittelten biochemischen Daten sprechen stark für eine Rolle des Enzyms bei einem frühen Schritt der Peptidoglycansynthese. Es stellt hierbei L-Alanin, das auch die Vorstufe von D-Alanin ist, für die Synthese der Penta- bzw. Tetrapeptidketten der Λ/-GlycoIylmuraminsäure zur Verfügung. Dies ist die erste Beschreibung dieser Aufgabe für eine L-Alanin Dehydrogenase.
4. Eine postulierte Kreuzreaktion des monoklonalen Antikörpers HBT-10 mit der PNT wurde widerlegt. Der These, das 40 kD-Antigen interveniere in das kritische Gleichgewicht zwischen NADH und NADPH, wurde dadurch eine Grundlage entzogen. Auch auf die Fähigkeit des intrazellulären Überlebens in Makrophagen hat das 40kD-Antigen, zumindest in Abwesenheit anderer mykobakteheller Proteine, keinen Einfluß.
5. Über 40 mykobakterielle Stämme wurden auf das Vorhandensein von AlaDH- Aktivität hin untersucht. Alle Stämme die AlaDH-Aktivität aufweisen, sind virulent. M.bovis BCG zeigt keinerlei Aktivität. Zudem scheint das Ausmaß der Aktivität mit dem Grad der Virulenz eines M.tuberculosis-Siz mes zu korrelieren.
6. Das Gen für die Alanin Dehydrogenase wurde aus acht Stämmen des M.tuberculosis Complex komplett sequenziert. In den Stämmen M.bovis und M.bovis BCG wurde eine Deletion gefunden, die zu einer Leserasterverschiebung führt und für das Fehlen von meßbarer Aktivität in diesen Stämmen verantwortlich ist.
7. Das AlaDH-Gen aus M.marinum wurde identifiziert und ein Großteil der Sequenz bestimmt. Das Gen besitzt etwa 80% Identität mit dem Gen von M.tuberculosis.
7. Anhänge
Abkürzungsverzeichnis
A präexponentieller Faktor oder Stoßfaktor
Axxx Absorption bei einer Wellenlänge von xxx nm
AlaDH L-Alanin Dehydrogenase (E.C. 1.4.1.1.)
AMC Academic Medical Centre, Amsterdam, Niederlande
Ap Ampicillin
AP Alkalische Phosphatase app. apperent
AS Aminosäure
ATCC American Type Culture Collection, Rockville, USA
ATP Adenosin-Triphosphat
BCG Bacille Calmette Guerin
BCIG 5-Bromo- -ChIoro-3-lndolyl-ß-D-Galactopyranosid
BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-lndolylphosphat
Boc ferf-Butoxycarbonyl bp Basenpaar(e)
cfu colony forming units
Cm Chloramphenicol
Conc Konzentration
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMF Dimethylformamid
DMSO Dimεthylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DTNB Dithiobisnitrobenzoesäure
DTT Dithiothreitol
Ea Aktivierungsenergie
EDTA Ethylendiamintetraacetat
Eth Ethionamid - -
F Farad
FBS Fötales Rinderserum
FCS Fötales Kalbsserum
Fmoc 9-Flourenylmethoxycarbonyl
FPLC Fast Protein Liquid Chromatography frag. Fragment
9 Fallbeschleunigung
GBF Gesellschaft für biotechnologische Forschung mbl
GIcNAc Λ/-AcetylgIucosamin
Gm Gentamicin
GOGAT Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase
GS Glutamin-Synthetase
GST Glutathion-S-Transferase
h Stunde(n)
HBSS Hank's Balanced Salt Solution
HIV Human Immunodeficiency Virus
HOBt Hydroxybenzotriazol
HRP Horseradish Peroxidase
Hεp Hitzeschockproteine
ig Immunglobulin
IL Interleukin
INH Isonicotinsäurehydrazid, Isoniazid
IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactosid
k Umsatzrate eines Enzyms kb Kilobasen
KBL Kilobasenleiter kD, kDa Kilodalton
KIT Royal Tropical Institute, Amsterdam, Niederlande
KM Michaelis-Konstante
Km Kanamycin
MΦ Makrophage(n) mAb monoklonaler Antikörper
MAIS M.avium - M.intracellulare - M.scrofulaceum Com MBP maitose binding protein
MCAC Metallchelat-Affinitätschromatographie mesoDAP meso Diaminopimelinsäure min Minute(n) m.o.i. multiplicity of infection
MRC Medical Research Council, Tuberculosis and Related Infections Unit, London, England
MTT Thiazolylbluetetrazoliumbromid
MurNAc Λ/-Acetylmuraminsäure
MurNGI Λ/-Glycolylmuraminsäure
NAD+ Nicotinamidadenindinucleotid, oxidierte Form
NADH Nicotinamidadenindinucleotid, reduzierte Form
NADP+ Nicotinamidadenindinucleotidphosphat, oxidierte Form
NADPH Nicotinamidadenindinucleotidphosphat, reduzierte Form n.b. nicht bestimmt
NBT Nitrobluetetrazoliumchlorid
Nr. Nummer
NTP beliebiges Nucleosid in Form eines Triphosphats
oD oxidative Desaminierung
ORF open reading frεme, offenes Leseraster
OtBu rerf-Butylester
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese pac protein antigen c, alte Bezeichnung für das 40 kD-Antigen
PCR polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion
Pfp Pentaflourphenyl
PMA Phorbolmyristatacetat
Pmc Pentamethylchroman
PMS Phenazinmethosulfat
PNT Pyridinnukleotid-Transhydrogenase
PPD Purified protein derivative
PVDF Poiyvinylidendiflourid
R Rydberg-Konstante oder Resistenz (wenn Buchstabe hochgestellt) rA reduktive Aminierung rec rekombinant Rha Rhamnose -4J-
Rif Rifampicin
RIV National Institute of Public Health and the Environment, Bilthoven, Niederlande
RNA Ribonukleinsäure
RNI reaktive nitrogen intermediates, reaktive Stickstoff-Intermediate
ROI reaktive oxygen intermediates, reaktive Sauerstoff-Intermediate rpm rounds per minute, Umdrehungen pro Minute rRNA ribosomale Ribonukleinsäure
RT Raumtemperatur
SDS Natriumdodecylsulfat sec Sekunde(n) Str Streptomycin
Tb Tuberkulose
TEMED Λ/./V.Λ .ΛT-Tertamethylethylendiamin
TIR Tranεlations-Initiationsregion
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
Trt Trityl ts tempεratur-sensitiv
Tween Polyoxyethylensorbitanmonolaurat
U Unit(s) ÜN über Nacht unveröff. unveröffentlicht
vmax maximale Reaktionsgeschwindigkeit
VMDC Veterinär/ Microbiological Diagnostic Centre, Utrecht, Niederlande
Vol. Volumen
WHO World Health Organization, Weltgesundheitsorganisation
WKZ Academisch Ziekenhuis, Utrecht, Niederlande
z.A. zur Analyse, von höchstem Reinheitsgrad Abkürzungen für Aminosäuren und Nukleotide
Aminosäure 3-Buchstab«
Alanin Ala A
Arginin Arg R
Asparagin Asn N
Aspartat Asp D
Cystein Cys C
Glutamin Gin Q
Glutamat GIu E
Glycin Gly G
Histidin His H
Isoleucin He
Leucin Leu L
Lysin Lys K
Methionin Met M
Phenylalanin Phe F
Prolin Pro P
Serin Sεr S
Threonin Thr T
Tryptophan T w
Ty rosin Tyr Y
Valin Val V
Base Nukleosid / Nukleotid Abkürzung
Adenin Adenosin A
Cytosin Cytidin C
Guanin Guanosin G
Uracil Uridin U
Thymin Thymidin T
DNA-Seσuenz von Mycobacterium marinum und Verwendung
P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. DNA-Sequenz (I) von Mycobacterium marinum der folgenden Formel, dazu komplementäre DNA-Sequenz, doppelsträngige DNA-Sequenz aus der DNA-Sequenz (I) und ihrem komplementären Strang, deren Teilsequenzen und mit ihnen vorzugsweise bei einer Temperatur von mindestens 20 C und insbesondere bei einer Konzentration von 1 M NaCl und einer Temperatur von mindestens 25 C hybridisierbare DNA-Sequenzen:
50 60 70
Mar3 AATTCCGGTTAGCGATCACCCCGGCCGGCG
H37RV ^TGG^AGG&AGAGGA AAAΘ e&AA--Te€ AT eeGSβTGGe ATeAeeeeGΘeeGQeG-
80 90 100 110 120 130
Figure imgf000054_0001
140 150 160 170 180 190 Mar3 CCGCCATCTCCGACGCCGACTTCAAGGCCGCCGGTGCCCAGCTGATCAGCACCGCCGACC
I II IM II MIMIII II II II II IM II IIMIMIMM
1137Rv ΘGGG-TA^JrGAeGGAGGGG&A-T-T-TGAAGGGGGeAGGGGeGeAA^-TGG-T-GGGGAGgGGeGAGG-
200 210 220 230 240 250
Mar3 AGGTGTGGGCGGATGCGGACCTGCTGCTCAAGGTCAAGGAACCGATCGAGTCCGAGTACG
IMIIMIM II II II II II II
PG-TGGGGG&AGGGg^^TΦΦTGG-TGAAGGTGA^AGAA-GGGAΦAGGGGGGGAAΦGG-
260 270 280 290 300 310
Mar3 GCCGGCTGCGCCGGGGCCAGACCCTGTTCACCTACCTGCACCTGGCCGCCTCGCGCCCCT
MM MIM I II MM I I I MM II II I I
-Hβ^Hϊ^^GeGG eΦGΘGAeAGGGGGAGATe -T Φ GAGG^Tβ TGeA-T^TGGGCGGGTGAG&TGGT-Φ-
320 330 340 350 360 370
Mar3 GCACCGATGCCCTGCTGAAGTCCGGCACCACGTCCATCGCCTACGAGACGGTGCAGACCG
IIIMIMM II II I MMIMMIMM II IMMMMII II IIIMM
-»3-7-Rv—GGAGGGA-T^ββ-T-TG-T^GGA-T-T-GSGGGAGGAGGΦGAA^TGGGΦAGGAGAGGG-TGCAGACCG--—
380 390 400 410 420 430 Mar3 CCGACGGCGCATTGCCGCTGCTGGCCCCCATGAGCGAGGTCGCCGGGCGCCTGTCCGCCC
MMMMMI I II MIM MIM MIMIII MMMM II II
"II3'7'Rv — e€&AeΘSeβeAGTAeeeeTGeTTGeeee&ATGAGeGAAΘT€GG€GG-T-eGAG GGGGGGGΘ—
440 450 460 470 480 490
Mar3 AAGCTGGGGCCTACCACCTGATGCGCACCCACGGCGGTCGCGGCGTGCTGATGGGCGGCG
-S-W- v — AGG^TGΘ€SeJi^e AeeTβ ^IX-^&A^eeeA^GGGGGC ΪCGGTGTσCTGATGGGOGG G^ —
500 510 520 . 530 540 550
Mar3 TCCCCGGCGTCAAGCCTGCCGACGTCGTGGTGATCGGCGCGGGCACGGCCGGATACAACG
I IMIMIM I II MIIIMMMMMMMMM MIM MIM
-ιiD7'R — »TθeeGGθeGseGAAeeG eeGAeGTeGTGGTGAT-eGGe-GeeGGeAeeGecGGG-T eÄeG--
560 570 580 590 600 610 Mar3 CCGCCCGCGTCGCCAACGGCATGGGCGCGATGGTCACCGTGCTGGATGTCAACATCAACA
I II II II II II IM -Ή-3'7RV — eAG^eeβeAτeGeeAA:eGGGA7GGGeβeGAeeGττAeβ© τe^AGAe-eAeA eGA A'~
620 630 640 650 660 670 Mar3 AGCTCCGCCAGATCGACGCGGAGTTCGGCGGTCGCGTCCGGACCCGCTACTCGTCGACCC
I II II II MM II MI II IM II -AAe^^eGGeAeresAeGeeG^β^^eTöesGeeGβ ^eeAeAe eGe Ae CA eGSceT —
680 690 700 710 720
Mar3 TCGACCTCGAGGATGCGGCAGTCCACGCCGACATGGTGATCGGGGCCGTCCT fr)
•II37RV A€eA^eψeβ-AβΘβ-β€€o-re-AAA€Θ? 6e€ΘAe fββΥQ.¥F-TβGGβeCGT C C TβG-Tβ€-€Aβ-
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man mit ihrer Hilfe Alanindehydrogenase herstellen oder gewinnen und
(i) zur Diagnose von Tuberkulose in Menschen und Tieren und/oder
(ii) zur Diagnose von anderen mycobakteriellen Infektionen in Menschen und Tieren verwenden kann, die insbesondere durch Mycobacterium marinum verursacht werden.
3. RNA als Transkript einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, insbesondere zur Verwendung
(i) bei Diagnose von Tuberkulose in Menschen und Tieren und/oder
(ii) bei der Diagnose von anderen mycobakteriellen Infektionen in Menschen und Tieren, die insbesondere durch Mycobacterium marinum verursacht werden.
4. Protein, das durch eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 kodiert wird und insbesondere Alanindehydrogenase entspricht und
(i) zur Diagnose von Tuberkulose in Menschen und Tieren und/oder
(ii) zur Diagnose von anderen mycobakteriellen Infektionen in Menschen und Tieren verwendet werden kann, die insbesondere durch Mycobacterium marinum verursacht werden.
5. Protein der folgenden Sequenz (II)
**t******** **_*****************_******+****_ **************
Mar3 14 FRLAITPAGVAALTKRGHEVLIQAGAGEGSAISDADFKAAGAQLISTADQVADAD LK 73 •H37RV 14 F VΛITrAαVΛE'T RσHΞVLIQβAβgβ5A^^AB-F^-A^ QLVΘTDQVWftBDI.L K 73--
***** ****** ** *** ******* ****** ************************
Mar3 74 VKEPIESEYGRLRRGQT FTYLHIiAASRPCTDALL SGTTS IAYETVQTADGALPL APM 123 1137 V 7 VKEPIAAΞYGR RHCQI FTFLH AASRΛCTDΛLL&SCTTfi IAYπTVQTΛDCALPLI_APM-12β ■
******* ** ******** *****+******+ _ ****************** ******
Mar3 134 SEVAGRLSAQAGAYHLMRTHGGRGVLMGGVPGVKPADWVIGAGTAGYNAARVANGMGAM 183 1137Rv-134 CEyAC IjAQVC IIOIRTQCC G l3M &VΕ> y^^
*****_**_**** **** **_ ***** _** * **#*****
Mar3 184 VTVLDVNINLRQIDAΞFGGRVRTRYSST D ΞDAAVHAD VIGAV 229 •H37Rv 184 yTi.T>INIDKR8LDΛSgCGR-*CTR^SA^^^ 239 sowie Oligopeptid, das von einer DNA-Sequenz kodiert wird, die mit einer DNA-Sequenz, die das Protein der Formel (II) kodiert, vorzugsweise bei einer Temperatur von mindestens 20 C und insbesondere bei einer Konzentration von 1 M NaCl und einer Temperatur von mindestens 25 C, hybridisierbar ist, sowie Oligopeptid, das von einer Teilsequenz der hybridisierbaren DNA-Sequenz kodiert wird.
6. Spezifisches und empfindliches Verfahren zur Identifizierung von Mycobakterien in einem Medium, dadurch gekennzeichnet , daß man
(i) Zellen, Stämme oder Spezies von Mycobakterien isoliert, (ii) rohe oder gereinigte genomische DNA oder RNA gewinnt, (iii) die genomische DNA oder RNA oder ein cDNA-Fragment identifiziert, deren Sequenz mit dem des Alanindehydrogenase- Gens von Mycobacterium tuberculosum (Fig. 3.20) identisch oder praktische identisch ist, indem man vorzugsweise mit Hilfe einer Primer-Sequenz auf Basis der Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 1 amplifiziert, (iv) wonach man die DNA mit einem Restriktionsenzym, vorzugsweise Bglll, verdaut und einer Gelelektrophorese unterwirft (v) und/oder die DNA-Sequenz der amplifizierten DNA bestimmt.
7. Verwendung von Alanindehydrogenase aus Mycobacterium marinum (Wildtyp) für die Diagnose von Tuberkulose durch Messen der Enzymaktivität oder durch eine immunologische Methode.
8. Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Alanindehydrogenase, dadurch gekennzeichnet , daß man mit Hilfe einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 in Bakterien, Hefe, Pilzen, höheren Eucaryoten oder Zellinien die rekombinante Alanindehydrogenase bildet und gewinnt.
9. Verwendung der gemäß Anspruch 8 gewonnenen rekombinanten Alanindehydrogenase zur Diagnose von mycobakteriellen Infektio- nen, insbesondere Tuberkulose und der Schwimmer-Krankheit (swimmer's disease) in Menschen und Tieren.
10. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 und/oder von nativer oder rekombinanter Alanindehydrogenase von Mycobacterium marinum zum direkten Nachweis und zur Diagnose von Tuberkulose und anderen mycobakteriellen Infektionen in Menschen und Tieren in klinischen Proben.
11. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 und/oder von nativer oder rekombinanter Alanindehydrogenase von Mycobacterium marinum
(i) bei der Bekämpfung von Epidemien und/oder
(ii) nach Vakzinierung (follow-up) von Menschen und Tieren.
12. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 und/oder von nativer oder rekombinanter Alanindehydrogenase von Mycobacterium marinum zur Ermittlung, zum Testen, Gewinnen und Herstellen von Substanzen, die Erreger von Tuberkulose oder anderen mycobakteriellen Erkrankungen beim Menschen und Tieren inhibieren.
13. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 und/oder nativer oder rekombinanter Alanindehydrogenase von Mycobacterium marinum für Biotransformationsreaktionen, die für L-Alanin spezifisch sind.
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